TWI799153B

TWI799153B - 新穎乳酸菌株、及含有新穎乳酸菌株之組成物

Info

Publication number: TWI799153B
Application number: TW111106638A
Authority: TW
Inventors: 渡邊真通; 小阪英樹; 相磯知里
Original assignee: 日商富吉高股份有限公司
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-04-11
Also published as: WO2022185419A1; JPWO2022185419A1; CN117062905A; TW202242092A; JP7035283B1

Abstract

本發明係提供一種新穎乳酸菌株，特別係一種新穎乳脂FC株、及其用途。本發明之乳酸菌株係乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株。

Description

新穎乳酸菌株、及含有新穎乳酸菌株之組成物

本發明係關於一種新穎乳酸菌株。此外本發明係關於含有該乳酸菌株之組成物（種菌、經口組成物）、及使用該乳酸菌株之發酵食品之製造方法等該乳酸菌株之各種用途。

近年，隨著消費者健康意識高漲，對於含有乳酸菌的食品之需要增加，於發酵乳及乳酸菌飲料等之製造中廣泛利用乳酸菌。為乳酸菌之一種之乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris），自古以來已知係使用作為優格或起司等之發酵乳製品之生產菌，前述乳脂菌係具有產生黏多醣之菌種。其中使用由本案申請人分離之乳脂菌（以下，稱為「乳脂FC株」）作為主要發酵乳酸菌所發酵獲得之優格（商品名「裏海優格（カスピ海ヨーグルト）」，申請人註冊商標，日本註冊第5761425號），具有與習知之發酵乳完全不同之特異的黏性，乳脂FC株及由乳脂FC株所產生之黏多醣，據報告具有整腸作用、血糖值上升抑制作用、免疫活化作用、流感病毒感染防禦、過敏抑制及運動狀況改善等各種生理作用（參照非專利文獻1~6）。

因此，期待上述生理作用而不僅開發有發酵乳，亦開發發酵用種菌及營養補充品等含有乳脂FC株之產品，但為了於腸內充分發揮此種生理作用而有持續攝取乳脂FC株之必要。然而，為兼性厭氧菌之乳酸菌，可知其在好氧之條件下及酸性（低pH）條件下之存活性降低，在乳脂FC株亦非例外。因此，不斷尋求開發一種在優格等之酸性食品或乳酸菌營養補充品等乾燥粉末中，可抑制在長期保存中產生之生菌數之降低、維持有用的生理作用之含有乳脂FC株之產品。［先前技術文獻］［非專利文獻］

［非專利文獻1］T. Toda et al., “Effects of fermented milk with Lactococcus lactis subsp. cremoris FC on defecation frequency and fecal microflora in healthy elderly volunteers” J. Jpn. Soc. Food. Sci. 52(6), 243-250 (2005) ［非專利文獻2］M. Mori et al., “Beneficial effect of viscous fermented milk on blood glucose and insulin responses to carbohydrates in mice and healthy volunteers: preventive geriatrics approach by “slow calorie”” Geriatrics. 141-152 (2012) ［非專利文獻3］A. Kosaka et al., “Lactococcus lactis subsp. cremoris FC triggers IFN-γ production from NK and T cells via IL-12 and IL-18” Int. Immunopharmacol. 14(4), 729-733 (2012) ［非專利文獻4］T. Maruo et al., “Oral administration of milk fermented with Lactococcus lactis subsp. cremoris FC protects mice against influenza virus infection” Lett. Appl. Microbiol. 55(2), 135-140 (2012) ［非專利文獻5］Y. Gotoh et al., “Effect of orally administered exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris FC on a mouse model of dermatitis induced by repeated exposure to 2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene” J. Funct. Foods. 35, 43-50 (2017) ［非專利文獻6］Y. Gotoh et al., “Effect of yogurt fermented with Lactococcus lactis subsp. cremoris FC on salivary secretory IgA levels in high school-student long-distance runners” Japanese J. Phys. Fit. Sports Med. 68(6), 407-414 (2019)

［發明所欲解決之技術問題］

本發明之課題，係鑑於前述之習知課題，提供一種新穎乳脂FC株，其係耐酸性（耐低pH性）提升，即使在好氧條件下及乾燥條件下存活性提升，換言之，本發明之課題係提供一種乳脂FC株，其係即使在發酵乳等酸性食品或乾燥粉末狀態中亦具有良好存活性。此外，本發明之課題係提供一種使用該耐酸性及在好氧條件下、乾燥條件下之存活性優異之乳脂FC株的發酵用種菌、營養補充品及發酵食品等經口組成物、以及發酵食品之製造方法。

本發明人等，為了解決上述課題，深入研究後，發現新穎乳脂FC株，該新穎乳脂FC株作為乳脂株，雖與申請人所有之乳脂FC株（Lactococcus lactis subsp. cremoris FC, FERM P-20185）具有相同菌學特性，但相較之下其在耐酸性及於好氧條件下、乾燥條件下之存活性之兩方面具有優異之特性，並進一步地藉由深入研究而完成本發明。再者，以下，將以往習知的乳脂FC株稱為「乳脂FC株」、「既有乳脂FC株」或「親FC株」，為了與此區別將新發現之本發明之乳脂FC株稱為「本乳脂FC株」、「乳脂FC46株」或「FC46株」。［技術手段］

本發明係具有下述實施型態者。（I）新穎乳酸菌乳脂株（本乳脂FC株）（I-1）一種乳酸菌，其係乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株。再者，前述繼代株，與以前述寄存號碼特定之FC46株具有相同菌學性質、形態特徵、生理學特徵、碳源同化性、黏多醣產生性、耐酸性、以及於乾燥條件下及好氧條件之存活性，係相同屬於乳酸乳球菌乳脂亞種之乳酸菌。在本發明及以下之說明書記載中，為FC46株之繼代株之情形亦同。本說明書中，以寄存號碼特定之FC46株、其原株、以及該等之繼代株總稱為「本乳脂FC株」、「乳脂FC46株」或「FC46株」。（I-2）如（I-1）所記載之乳酸菌，其中，其係乾燥狀態。

（II）發酵用種菌（II-1）一種發酵用種菌，其特徵係含有乳酸乳球菌乳脂亞種FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株。（II-2）如（II-1）所記載之發酵用種菌，其中，係進一步含有嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。（II-3）如（II-2）所記載之發酵用種菌，其中，其係乳酸乳球菌乳脂亞種FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株，與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）之共棲體。（II-4）如（II-1）~（II-3）中任一項所記載之發酵用種菌，其中，其係乾燥狀態。

（III）經口組成物（III-1）一種經口組成物，其特徵係含有（I-1）或（I-2）所記載之乳酸菌。（III-2）如（III-1）所記載之經口組成物，其中，其係食品、經口醫藥品、或經口醫藥部外品。（III-3）如（III-1）或（III-2）所記載之經口組成物，其中，其係發酵食品。

（IV）發酵食品之製造方法、及發酵食品（IV-1）一種發酵食品之製造方法，其特徵係進行將（I-1）或（I-2）所記載之乳酸菌、或（II-1）~（II-4）中任一項所記載之發酵用種菌植菌於發酵食品原料，並發酵之步驟。［發明之效果］

本發明之本乳脂FC株，雖具有與既有乳脂FC株相同之菌學性質及有用的生理作用，但與既有乳脂FC株相比，在pH4附近之低pH條件下之存活性及黏性維持效果高，耐酸性優異。此外，本乳脂FC株，與既有乳脂FC株相比，在乾燥條件下及好氧條件下之存活性高，對乾燥及好氧條件下之耐性優異。因此，本乳脂FC株，在優格及乳酸菌飲料等之酸性食品及乾燥狀態之營養補充品等經口組成物中之穩定性優異，以經口組成物之形態下可長期維持並發揮其有用的生理作用。

（I）新穎乳酸菌乳脂株（本乳脂FC株）本乳脂FC株，係屬於具有下述菌學性質之乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）之菌株，其一部分，係國際寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心（日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8第122號室），2020年11月6日，識別標示：Lactococcus lactis subsp. cremoris FC46，寄存號碼：NITE　BP-03310。

（a）菌學性質將本乳脂FC株，使用TY-Glu培養基（1%葡萄糖、0.5% Bacto（TM）胰蛋白腖（Thermo Fisher Scientific公司）、0.5% Bacto（TM）酵母萃取物（Thermo Fisher Scientific公司）、0.5% NaCl）（pH7.0）或MRS培養基（Difco公司製），於好氧條件下靜置培養之情形之菌學性質（形態・生理學特徵、碳源同化性）如以下表1、表2所記載。

［表1］

［表2］

（b）形態特徵細胞之形態：（鏈）球菌菌落形狀：圓形（半球狀）直徑0.5~1.0mm 菌落顏色：白色孢子形成：無

（c）生理學特徵革蘭氏染色：陽性運動性：無過氧化氫酶活性：無葡萄糖代謝之產氣：無乳酸旋光性：L 於10℃之繁殖：可繁殖於45℃之繁殖：不可繁殖最適溫度：25~30℃ 最適pH：pH6~7 乳酸發酵：同型

（d）碳源同化性（糖發酵性）對下述碳源具有同化性 D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、七葉苷。

（e）其他，表徵該微生物之性質以上之各性質，參照K.H.Schleifer et al., “Transfer of Streptococcus lactis and Related Streptococci to the Genus Lactococcus gen. nov.”System. Appl. Microbiol. 6, 183-195 (1985)，以及根據16S rRNA基因之同源性檢索結果，本乳脂FC株與已註冊之既有乳脂FC株（Lactococcus lactis subsp. cremoris FC, FERM P-20185）具有100%之同源性，鑑定為屬於乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）之菌株。將本乳脂FC株之16S rRNA基因之鹼基序列記載於序列表之序列編號1。

本乳脂FC株，除了上述菌學性質，與既有乳脂FC株相同地產生黏多醣。因此可思及，本乳脂FC株與既有乳脂FC株相同地具有整腸作用、血糖上升抑制作用、免疫活化作用、流感病毒感染防禦作用、過敏抑制及運動狀況改善等各種有用的生理作用。

另一方面，本乳脂FC株如後述實施例2及3所示，與既有乳脂FC株相比，具有在pH4附近之低pH條件下之存活性及黏性維持效果高，耐酸性優異之特性。此外，本乳脂FC株，如後述實施例4所示，與既有乳脂FC株相比，具有在乾燥條件下及好氧條件下之存活性高，對乾燥及好氧條件之耐性優異之特性。因此，本乳脂FC株，在優格及乳酸菌飲料等酸性食品及乾燥狀態之營養補充品等經口組成物中之穩定性優異，以經口組成物之形態下可長期維持並發揮其有用的生理作用。

本乳脂FC株，不僅包含國際寄存之寄存號碼：NITE　BP-0331之乳脂FC株（寄存菌）及其原株以外，亦包含其繼代株。本乳脂FC株之繼代，可依照乳酸菌繼代中一般使用之既定方法進行，不特別限制。例如，可列舉以下方法：將加入前述TY-Glu培養基（pH7.0）之試管接種本乳脂FC株，於最適溫度25~30℃左右培養12~48小時左右。經培養而繼代之乳脂FC株，可添加甘油使其最終濃度為10~30w/v%，並保存於-80℃直到使用。

本乳脂FC株之培養基，除了前述TY-Glu培養基，可使用含有碳源、氮源、無機離子、進一步根據需要之有機微量營養素之一般培養基。碳源，只要係含有可同化碳源者即可，例如，可良好地使用D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖及D-乳糖等碳水化合物。氮源，只要係含有可同化氮化合物或含有此者即可，例如，可使用硫酸銨、酪蛋白胺基酸、蛋白腖等。此外，可適當使用磷酸、鐵、鉀、鎂、鋅、錳、銅、鈣等無機鹽類。進一步根據需要，可於培養基中添加於菌繁殖所必要之胺基酸、生物素、核黃素、吡哆醇、菸鹼酸、泛酸、葉酸、硫胺等維生素類等來使用。

本乳脂FC株之培養，可藉由於溫度15℃以上（較佳為25~30℃左右）、ph5以上（較佳為pH6~7左右）進行以促進增殖。本乳脂FC株，可藉由於好氧條件下之靜置培養來進行，但較佳為可藉由於厭氧條件下進行以促進增殖。

本乳脂FC株，由於如前述在乾燥狀態及好氧條件下具有高存活性，從培養基分離後亦可藉由進行真空乾燥或噴霧乾燥等乾燥處理調製為乾燥物，此外亦可與培養基成分或賦形劑等其他成分一同進行乾燥處理而調製為乾燥物。

（II）發酵用種菌本乳脂FC株，可利用其發酵能力，作為在製造發酵食品時所使用之種菌（發酵用種菌，亦稱為「乳酸菌元（starter）」）來使用。發酵食品，可列舉：主原料為乳之乳發酵食品（優格、乳酸菌飲料、起司等）、主原料為豆之豆乳發酵食品（優格、乳酸菌飲料等）、主原料為穀物（米、小麥等）之穀物發酵食品（甜酒、麵包等）、蔬菜果實發酵食品（醃漬物等）。

本發明之發酵用種菌，較佳為使用於以乳或豆乳為主要成分之原料之發酵，藉由該原料之發酵，製造優格或乳酸菌飲料等乳發酵食品、或豆乳發酵食品。於此之以乳或豆乳為主要成分之原料（乳原料、豆乳原料），只要為含有源自乳或豆（較佳為黃豆）之蛋白質者即可，可為乳或豆乳本身，此外亦可為去除或降低脂質者等。再者，本案說明書中，本發明中所使用之「乳」係含有動物乳者，例如可列舉牛乳、山羊乳、羊乳、馬乳等，其形態不特別限定，可使用含有生乳、全脂乳、脫脂乳、全脂乳粉、脫脂乳粉等任一形態之乳者。此外，本發明中所使用之「豆乳」，係所謂含有將黃豆與水磨碎後榨汁所獲得之豆乳者，但不限定於此，亦可為將豆與水配合並液狀化之乳化液（黃豆乳化液），作為原料之豆的種類不特別限定，可為黃豆、紅豆、豌豆、蠶豆、菜豆、綠豆等任何豆。

本發明之發酵用種菌，在製造乳發酵食品或豆乳發酵食品時，較佳為接種至使前述本乳脂FC株之生菌數為1×10 ⁵~1×10 ⁹（cfu/g）左右。因此，在使用時，較佳為預先將本乳脂FC株使用例如乳原料或豆乳原料培養，並調製為該培養物之生菌數為1×10 ⁷~1×10 ⁹（cfu/g）左右（種菌組成物）。具體而言，雖無限制，但可例示例如：將本乳脂FC株接種於預先經殺菌處理之發酵用原料（乳原料、豆乳原料）、或添加有酵母萃取物之前述發酵用原料（例如5~10%脫脂乳粉等）中，以最適溫度培養，並調製為上述菌濃度者。再者，本乳脂FC株之生菌數之測定，可藉由進行使用TY-Glu培養基（pH7.0）之混合稀釋培養法（25℃），並計算繁殖之菌落數來實施（菌落計數）。由於菌數與濁度相關，因此若預先求得菌數與濁度（於波長600nm之吸光度）之相關性，則可藉由測定濁度來計算上述菌數。

本發明之發酵用種菌，亦可為僅由本乳脂FC株所成者，只要不妨礙本發明之效果亦可合併使用具有發酵能力之其他微生物。其他微生物雖無限制，但可例示例如：乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、及乳酸乳球菌乳亞種丁二酮變種（Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis）等屬於乳球菌屬之乳酸菌；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等屬於鏈球菌屬之乳酸菌；以及酪酸乳桿菌酪酸亞種（Lactobacillus casei subsp. casei）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等屬於乳桿菌屬之乳酸菌。此等乳酸菌亦可任意組合使用一種或二種。

與本乳脂FC株合併使用之微生物，較佳為嗜熱鏈球菌（以下，將其稱為「S.嗜熱菌」）。如後述實施例3所示，本乳脂FC株，藉由在低pH條件下與S.嗜熱菌共發酵，相較於單獨發酵，可維持高生菌數（存活性提升）、以及抑制保存後之黏性降低。合併使用本乳脂FC株與S.嗜熱菌之本發明之發酵用種菌（本乳脂FC株與S.嗜熱菌之共棲體）中，兩者之生菌數比，雖無限制，但可例示本乳脂FC株：S.嗜熱菌=1：0.001~1000。較佳可例示為本乳脂FC株：S.嗜熱菌=1：0.01~100，更佳可例示為1：0.1~10。再者，S.嗜熱菌之生菌數之測定，可藉由以使用BCP平板計數瓊脂培養基（日水製藥股份有限公司）之混合稀釋培養法（37℃）之菌落計數來實施。

此外，亦可使用醋酸菌作為與本乳脂FC株合併使用之微生物。醋酸菌雖無限制，但可列舉屬於醋桿菌屬（Acetobactor）、葡萄糖桿菌屬（Gluconobacter）、葡糖酸醋酸桿菌屬（Gluconacetobacter）等醋酸菌。

本發明之發酵用種菌，只要係在用於製造發酵食品時發揮發酵能力者即可，其形狀不特別限制。由衛生方面、品質保持性、及操作性等觀點而言，較佳為經乾燥之固體形狀，更佳為乾燥粉體或乾燥顆粒體。亦可係與培養基成分或賦形劑等之其他成分一同進行乾燥處理而調製為乾燥物者。

本發明之發酵用種菌之發酵條件（培養條件），可列舉培養溫度15℃以上，較佳為25~30℃左右；培養pH5以上，較佳為pH6~7左右；培養時間3小時以上，較佳為8~24小時左右。

（III）經口組成物本發明之經口組成物，其特徵係含有本乳脂FC株。該經口組成物，與一般食品相同地，利用適當之可食性載體（食品原料）調製為食品形態。此外，該經口組成物，利用適當之藥學上容許之賦形劑或稀釋劑等製劑用原料，調製為製劑形態（營養補充品形態、醫藥品形態、醫藥部外品形態）。

本乳脂FC株，期待與既有乳脂FC株相同地，藉由經口攝取，於體內發揮各種生理作用（整腸作用、血糖值上升抑制作用、免疫活化作用、流感病毒感染防禦作用、過敏抑制及運動狀況改善作用等）。該作用，可認為係本乳脂FC株本身、及/或本乳脂FC株所產生之黏多醣之作用。因此，本發明之經口組成物，較佳為含有生菌狀態之本乳脂FC株。然而，係期望含有盡可能多之本乳脂FC株作為生菌，含有死菌狀態之本乳脂FC株亦無妨。

本發明之經口組成物，只要含有本乳脂FC株即可，在此限制中，亦可為本乳脂FC株之培養物、培養物之粗製品或精製品、其等之冷凍乾燥物或噴霧乾燥物。上述培養物，雖無限制，但可例如：使用適合本乳脂FC株之培養基，例如TY-Glu培養基（pH7.0）等，於最適溫度25~30℃左右、培養12~48小時左右來獲得。此外本乳脂FC株之菌體，可在上述培養後，將培養物藉由例如以3,000rpm離心分離10分鐘左右並收集菌體來獲得。此等亦可依照一般方法純化。進一步地，上述菌體亦可進行冷凍乾燥或噴霧乾燥。如此獲得之乾燥菌體亦可作為本發明之經口組成物之有效成分來利用。本說明書中，將本乳脂FC株、其培養物、培養物之粗製品至精製品、及此等之乾燥品總稱為「本乳脂FC株及其培養物」。

本發明之經口組成物中，可根據需要進一步地適量含有適合本乳脂FC株之維持或增殖等之營養成分。該營養成分之具體例，可列舉：用於微生物培養之培養基所利用之例如葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖、甘露糖等碳源；例如酵母萃取物、蛋白腖等氮源；維生素類、礦物質類、微量金屬元素、其他營養成分等各成分。

調製本發明之經口組成物為食品形態、醫藥品形態、及醫藥部外品形態，可依照一般方法。此外適合調製為此等各形態所使用之載體，可為可食性載體至製劑學上容許之賦形劑、稀釋劑等載體中任一者。調製為食品形態及此時可利用之可食性載體之細節，將於後述「食品形態之經口組成物」之項目中描述。

本發明之經口組成物中之本乳脂FC株之調配量，一般而言，可從在本發明之經口組成物中之本乳脂FC株之生菌數為1×10 ⁷~1×10 ¹¹（cfu）左右之量中適當選擇。上述本乳脂FC株之調配量，將上述量作為基準，可根據所調製之本發明之經口組成物之形態、及目標作用效果等來適宜變更。

食品形態之經口組成物食品形態之本發明之經口組成物，只要係作為食品來攝取者即可。雖無限制，但較佳之具體例，可例示：優格等發酵乳或乳酸菌飲料等將乳作為原料所製造之乳發酵食品、以及黃豆優格或發酵豆乳飲料等將黃豆作為原料所製造之豆乳發酵食品。其他，亦包含含有本乳脂FC株之具有固形製劑（錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、微膠囊及膠囊劑等）、及液狀製劑（液劑、懸濁劑、糖漿及乳劑等）等製劑形態之食品。此外，可列舉：含有本發明之本乳脂FC株之口香糖、牛奶糖、軟糖、牛軋糖及巧克力等零食類；發酵蔬菜飲料或發酵果實飲料等發酵食品；布丁及巴伐利亞奶油等上述發酵食品以外之乳製品等。再者，本說明書中，「發酵乳」及「乳酸菌飲料」之用語，係依照舊日本厚生省「關於乳及乳製品成分等之省令」第二條37「發酵乳」及38「乳酸菌飲料」之定義。亦即，「發酵乳」係指用乳酸菌使乳或乳製品發酵後之糊狀或液狀者。據此，該發酵乳中包含飲料形態及優格形態。此外，「乳酸菌飲料」係指將用乳酸菌使乳或乳製品發酵後之糊狀或液狀者作為主要原料，並將此以水稀釋而成之飲料。

（IV）發酵食品之製造方法、及發酵食品本發明之發酵食品之製造方法，其特徵係含有本乳脂FC株。本發明之發酵食品，可依照既定方法製造，例如可藉由將本乳脂FC株植菌於含有本乳脂FC株之營養源之適當的發酵用原料（例如含有牛乳、豆乳（黃豆乳化液）、穀物、蔬菜類、果實類之原料），並培養其使該原料發酵來製造。

使用本乳脂FC株之發酵，較佳係預先準備菌元，並將其接種於發酵用原料使其發酵之方法。於此，菌元可列舉前述之本發明之發酵用種菌。如此之菌元，較佳係本乳脂FC株之生菌數含有1×10 ⁷~1×10 ⁹（cfu/ml）左右。

上述之發酵用原料，可根據需要添加用於使本乳脂FC株良好繁殖之發酵促進物，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖、甘露糖等碳源；酵母萃取物、蛋白腖等氮源；維生素類、礦物質類、微量金屬元素、其他營養成分等。

本乳脂FC株之接種量，例如在使用牛乳為發酵用原料之情形，牛乳中之本乳脂FC株適當係從含有1×10 ⁵（cfu/ml）以上、較佳為1×10 ⁷~1×10 ⁹（cfu/ml）左右之量選擇。培養條件，一般而言，從發酵溫度15℃以上、較佳為25~30℃左右，發酵時間3~24小時左右來選擇。

再者，上述之如此獲得之發酵物，有具有凝乳狀形態（優格或布丁模樣的形態）之情形，此物亦可直接作為固體食品攝取。該凝乳狀形態之發酵物，可藉由將其進一步均質化，成為期望之飲料形態。該均質化，可使用一般的乳化機（均質機）來實施。藉由如此之均質化，可獲得具有滑順口感之飲料。再者，對於該均質化，亦可根據需要適當稀釋，或添加用於調整pH之有機酸類，此外亦可適宜添加醣類、果汁、增黏劑、界面活性劑、香料等於飲料製造中一般使用之各種添加劑。如此獲得之飲料，可無菌充填於適當的容器並製成最終產品。

其攝取（投與）量，係根據攝取其之生物體年齡、性別、體重、疾病程度等適宜決定，不特別限定。一般而言，較佳從本乳脂FC株約1×10 ⁷~1×10 ¹¹（cfu/ml）之範圍中選擇。該組成物，一般可調製成每人每日攝取其約50~1,000mL。

食品形態之本發明之經口組成物之較佳具體例，可列舉營養補充品形態，具體而言為錠劑、丸劑、散劑、顆粒劑、微膠囊及膠囊劑等固形製劑；以及具有液劑、懸濁劑、糖漿及乳劑等之液狀製劑等製劑形態之食品。具有製劑形態之食品，較佳為經乾燥之狀態之固形製劑。

該營養補充品形態之食品，與醫藥形態組成物相同地，作為製劑載體，一般可使用此領域中所使用之充填劑、增量劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等之稀釋劑或賦形劑來製造。

調配於食品形態之經口組成物之本發明之乳酸球菌的量，只要可發揮該乳酸球菌之作用的量即可，在此限制下，可從廣泛範圍中適宜選擇。一般而言，較佳為1攝取（投與）單位形態中含有1×10 ⁷~1×10 ¹¹（cfu）左右。

上述組成物只要係經口攝取者，其投與方法不特別限制，可根據各種形態、對象年齡、性別其他條件、疾病程度等來決定。

上述組成物之攝取量，根據其用法、對象年齡、性別其他條件等適宜選擇，但如前述較佳係以每1攝取（投與）1×10 ⁷~1×10 ¹¹（cfu）左右之比例服用本乳脂FC株。為有效成分之本乳脂FC株之攝取量，可為每日1×10 ⁷（cfu）左右以上，且可每日分為多次來攝取。此外，本發明之經口組成物，為了有效地獲得其效果，較佳為持續攝取。例如，可例示連續或間歇地攝取跨二週以上之態樣。

含有生菌狀態之本乳脂FC株之經口組成物，攝取（投與）後，期待與既有乳脂FC株相同地於生物體內發揮有用的生理作用。因此，本發明之經口組成物，可基於其生理作用作為健康增進劑有效地使用。如此之本發明之經口組成物，包含具有特定之功能並以維持健康等為目的所攝取食用之食品。具體而言，本發明之經口組成物中，包含具有整腸作用、血糖值上升抑制作用、免疫活化作用、流感病毒感染防禦作用、過敏抑制作用、或/及運動狀況改善作用等之食品。此外，此等之食品中，包含表示或強調前述之作用或用途而製造販賣之食品，例如保健機能食品（營養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品）、特別用途食品（特定保健用食品）、及類似此之健康食品等。

以上，本說明書中，「包含」及「含有」之用語係包含「由…而成」及「實質上由…而成」之涵義。［實施例］

以下，關於本發明之構成及效果，為了幫助理解，使用實施例說明本發明。然而，本發明不因此等實施例受到任何限制。除非另有說明，以下之實驗係於室溫（25±5℃）、及大氣壓條件下實施。再者，除非另有說明，以下記載之「%」係指「質量%」、「份」係指「質量份」。

實施例1　新穎乳酸菌乳脂FC株之分離及鑑定將乳脂FC株（FERM P-20185）接種於完成殺菌之8%脫脂乳粉液（1%），於其最適溫度（25℃）放置10小時左右，使乳脂FC株活化（菌元1）。另一方面，將嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（以下，稱為「嗜熱菌」）接種於完成殺菌之8%脫脂乳粉液（1%），於其最適溫度（37℃）放置10小時左右，使嗜熱菌活化（菌元2）。接著，將於上述調製之菌元1及2接種於另外準備之完成殺菌之牛乳，於30℃條件下進行發酵。在觀察到凝乳形成之時間點開始冷卻（4℃）。

將所獲得之發酵乳於4℃之避光處保存46天後，於3L之TY-Gal培養基（1%葡萄糖、0.5% Bacto（TM）胰蛋白腖（Thermo Fisher Scientific公司）、0.5% Bacto（TM）酵母萃取物（Thermo Fisher Scientific公司）、0.5% NaCl）（pH7.0）中接種4%，並於26℃下培養72小時。將培養液劃線於TY-Gal瓊脂培養基（pH7.0）上於25℃下培養48小時，並將經繁殖之菌落培養於完成殺菌之8%脫脂乳粉液中保存。

由其中以實施例1所記載之方法取得經篩選之低pH耐性（耐酸性）高的菌株，並依照既定方法評價菌學性質。其結果示於表1。此外，使用API50CHL（生物梅里埃・日本股份有限公司製）評價對49種碳源之同化能力（糖發酵能力）。其結果示於表2。再者，表1係如前第［0015］段所述，表2係如前第［0016］段所述。

由此等結果，可確認所獲得之菌株係具有與作為親株使用之乳脂FC株（以下，亦簡稱為「親FC株」）相同的菌學性質及糖同化性。因此，將該菌株鑑定為屬於乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）之菌株，並命名為乳酸乳球菌乳脂亞種FC46株（Lactococcus lactis subsp. cremoris FC46）（以下，稱為「乳脂FC46株」，或簡稱為「FC46株」）。並且，該乳脂FC46株，係國際寄存於地址為日本國千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8第122號室之獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄託中心，日期為2020年11月6日，識別標示：Lactococcus lactis subsp. cremoris FC46，寄存號碼：NITE　BP-03310（寄存證明發行日：2020年11月30日）。

實施例2　耐酸性之評價將上述所獲得之FC46株以4%之比例接種於TY-Glu培養基（1%葡萄糖、0.5% Bacto（TM）胰蛋白腖、0.5% Bacto（TM）酵母萃取物、0.5% NaCl）（pH7.0），於25℃下培養15小時來調製前培養液。將所獲得之前培養液接種於使用乳酸調整為pH4.0之TY-Glu培養基40ml，使其最終濃度為1%。將其於26℃下靜置培養27小時，藉由使用BCP平板計數瓊脂培養基（日水製藥股份有限公司）之混合稀釋培養法時序性地測定培養液中之FC46株之生菌數（cfu/ml），並計算出27小時後之存活率（%）。作為比較試驗，使用親FC株取代上述FC46株進行相同的培養，並經時性地測定培養液中之親FC株之生菌數（cfu/ml），並計算出27小時後之存活率（%）。

將時序性地測定各乳脂株（FC46株、親FC株）之生菌數（cfu/ml）的結果示於圖1。如圖1所示，親FC株在pH4.0之低pH條件下急速死滅，在培養27小時後生菌數減少至6.6×10 ³（cfu/ml）（存活率0.2%）。相對於此，FC46株即使在pH4.0之低pH條件下亦存活性高，且即使在該pH條件下培養27小時後仍會維持1.9×10 ⁶（cfu/ml）（存活率33.6%）之高生菌數。據此，確認FC46株係與親FC株相比下耐酸性優異之乳脂菌株。

實施例3　發酵乳中之穩定性評價使用FC46株調製發酵乳，評價其在發酵乳中之穩定性。此外，作為比較對照，使用親FC株相同地調製發酵乳，評價其在發酵乳中之穩定性。

1 發酵乳之調製使用下述菌株之活化菌作為菌元，調製4種發酵乳1~4。 (1) 發酵乳1：親FC株（菌元1） (2) 發酵乳2：FC46株（菌元3） (3) 發酵乳3：親FC株（菌元1）+嗜熱菌（菌元2） (4) 發酵乳4：FC46株（菌元3）+嗜熱菌（菌元2）再者，菌元1及3，係將親FC株及FC46株分別接種（1%）於完成殺菌之8%脫脂乳粉液，於30℃下放置10小時左右使其活化來調製而成。此外，菌元2，係將嗜熱菌接種（1%）於完成殺菌之8%脫脂乳粉液，於最適溫度（37℃）下放置10小時左右使其活化來調製而成。

將上述中所調製之各菌元接種於完成殺菌之牛乳中，並於30℃條件下進行發酵。在觀察到凝乳形成之時間點，開始冷卻（4℃）抑制發酵以獲得發酵乳。

2　發酵乳中之菌之穩定性評價調製發酵乳1~4後，於10℃避光處靜置保存30天。測定保存後之發酵乳中之生菌數（cfu/ml）（發酵乳1及2為乳脂菌之生菌數、發酵乳3及4為乳脂菌與嗜熱菌之各生菌數）。再者，乳脂菌之生菌數係以使用TY-Gal培養基（pH7.0）之混合稀釋培養法（25℃）來測定；嗜熱菌之生菌數係使用BCP平板計數瓊脂培養基（pH7.0）之混合稀釋培養法（37℃）來測定。

此外，藉由下述方法測定發酵乳中之pH、酸度、及黏度。［pH之測定］發酵物中之pH，在將發酵物調整至10℃後使用pH計F-52（堀場製作所公司製）來測定。

［酸度之測定］精秤發酵物10g，加入等量之蒸餾水，稀釋，加入作為指示劑之酚酞溶液0.5ml，以0.1mol/L之氫氧化鈉水溶液滴定並將30秒內淺紅色不消失之點作為終點，從該滴定量求得每100g樣品之乳酸百分比量作為酸度。再者，0.1mol/L之氫氧化鈉水溶液1ml相當於乳酸9mg。

［黏度之測定］發酵物中之絕對黏度，在將發酵物調整至10℃後使用B型黏度計（Brookfield公司製，軸No.4）進行測定。轉子的旋轉時間設為1分鐘。

自保存開始第1天之結果示於表3，自保存開始第30天之結果示於表4。［表3］

［表4］

如表3及表4所示，親FC株在保存期間中急速死滅，在30天後每1mL僅殘留數個生菌（發酵乳1）。另一方面，FC46株在30天後仍維持1.1×10 ⁴（cfu/ml）（存活率0.0026%）之高生菌數（發酵乳2）。此外，親FC株及FC46株均藉由與嗜熱菌共發酵，而維持較單獨發酵高之生菌數（發酵乳3及4），尤其是FC46株顯示出5.8×10 ⁶（cfu/ml）（存活率2.8%）之非常高的生菌數（發酵乳4）。

進一步地，雖認定親FC株因30天之保存而黏性降低，FC46株與親FC株比較下抑制黏性之降低，與嗜熱菌共發酵之情形亦獲得相同之傾向。再者，以本實施例所製造之發酵乳1~4，外觀（顏色、是否離水）、香氣、及味道皆良好，在此等點未認定有差異。

實施例4　含乳酸菌組成物之調製及穩定性評價使用FC46株調製含乳酸菌組成物，評價於乾燥狀態之保存穩定性。再者，為了比較，使用親FC株取代FC46株調製含乳酸菌組成物，並相同地評價於乾燥狀態之保存穩定性。

1　乳酸菌液之調製將FC46株或親FC株，以4%之比例接種至已添加葡萄糖使最終濃度為0.5%之Difco M17培養基（BD公司），並於25℃下培養16小時來調製前培養液。在相同培養基，接種前述調製之前培養液4%，於25℃下培養16小時，獲得10L之培養液。藉由將其離心分離（3,000rpm×10分鐘），傾析去除獲得之上清液後，以生理食鹽水清洗殘渣2次，來調製分別濃縮FC46株或親FC株之乳酸菌液。

於調製之各乳酸菌，以10%之比例添加脫脂乳粉，進一步地使用冷凍乾燥機（FD-81，東京理化器械公司）依照習知方法進行冷凍乾燥處理，獲得約50g之冷凍乾燥乳酸菌體（FC46株菌體、親FC株菌體）。

將所獲得之冷凍乾燥乳酸菌體（FC46株菌體、親FC株菌體）0.5g，放入經滅菌處理之附夾鏈之積層膜製之袋子（LAMIZIP（ラミジップ）［註冊商標］：（股）生產日本公司製），於37℃之避光處條件下保存（強制劣化試驗）。自試驗開始（首日）時序性地測定冷凍乾燥乳酸菌體中之FC46株或親FC株之生菌數，並計算出存活率（%）。

結果示於表5。［表5］

親FC株在37℃之溫度條件之保存下急速死滅，3週後之生菌數為3.2×10 ⁹（cfu/g）（存活率：約1.6%），相較之下FC46株顯示出1.1×10 ¹⁰（cfu/g）（存活率：約14.7%）之非常高的生菌數。因此，可確認FC株即使在好氧條件下為經乾燥之粉體狀態，與親FC株相比下保存穩定性優異。［序列表］

序列編號1，表示本乳脂FC株之16S rRNA基因之鹼基序列。

〔圖1〕表示在實施例2中，時序性地測定酸性培養基中之各乳脂FC株（FC46株、親FC株）之生菌數（cfu/ml）之結果。

國外寄存資訊：JP日本、獨立行政法人製品評價技術基盤機構　特許微生物中心、2020年11月30日、NITE　BP-03310

Claims

一種乳酸菌，其係乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. cremoris）FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株，其特徵係該繼代株與該FC46株具有相同菌學性質、形態特徵、生理學特徵、碳源同化性、黏多醣產生性、耐酸性、以及於乾燥條件下及好氧條件之存活性，係屬於乳酸乳球菌乳脂亞種。
如請求項1所述之乳酸菌，其中，其係乾燥狀態。
一種發酵用種菌，其特徵係含有請求項1或2所述之乳酸菌。
如請求項3所述之發酵用種菌，其中，係進一步含有嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。
如請求項4所述之發酵用種菌，其中，其係乳酸乳球菌乳脂亞種FC46株（寄存號碼：NITE BP-03310）、或其繼代株，與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）之共棲體。
如請求項4之發酵用種菌，其中，其係乾燥狀態。
如請求項5之發酵用種菌，其中，其係乾燥狀態。
一種經口組成物，其特徵係其含有請求項1或2所述之乳酸菌。
如請求項8所述之經口組成物，其中，其係發酵食品。
一種發酵食品之製造方法，其特徵係其具有將請求項1或2所述之乳酸菌、或請求項3至7中任一項所述之發酵用種菌接種於發酵食品原料，而使其發酵之步驟。