TWI795740B - 用於Ｔ細胞活化之突觸（ｓｙｎＴａｃ）多肽類及彼等之用途 - Google Patents

用於Ｔ細胞活化之突觸（ｓｙｎＴａｃ）多肽類及彼等之用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供用於選殖抑制或選殖刺激T細胞之方法和組成物。

Description

用於T細胞活化之突觸(synTac)多肽類及彼等之用途
交叉參考資料
本申請案主張2014年6月18日提出申請之美國臨時專利申請案號62/013,715的權益，該申請案之全部內容以引用方式被併入本文。
政府支持聲明
本發明係在國家健康機構NIGMS所頒發之補助金編號3U54GM094662-02和5U01GM094665-02的資助下藉助政府的支持完成。政府對本發明具有某些權利。
以引用方式併入之以文本檔案形式提供的序列表
序列表係以2015年6月10日創建，大小為142KB之文本檔案“IMGN-EO03WO_ST25.txt”形式隨同本文一起提供。該文本檔案之全部內容以引用方式被併入本文。
本申請案之全文中引用之各種出版物係以方 括號指出。這些參考資料之全部引文可在本專利說明書之文末找到。這些出版物之揭示內容及本文所引用之所有專利案、專利申請出版物及書籍之全部揭示內容以引用方式被併入本申請案中，以更充分地描述與本發明相關之技藝。
過去十年，在用於發現臨床相關之生物標記物的高通量技術之研發方面的迅速進展已與生物製劑(其中該活性物質係由生物來源製造或從生物來源萃取之藥物，例如單株抗體、治療性蛋白質和肽)之逐步發展和應用並行，且已徹底改革免疫源性病況之治療。然而，目前之生物療法以彼等之合成對應物的雙倍比率(生物製品17%，合成製品8.5%)促成安全控管行動[1]。這被認為是從這些免疫調節生物製劑之作用模式體現：在自體免疫的情況下為全面免疫抑制(例如復邁(Humira)[2])及在治療癌症之情況下為全面免疫刺激(例如Yervoy[3])。這些治療未適當地將免疫調節限制在致病性相關細胞上，因而使患者易發生可能之致命性感染及一系列麻煩的副作用[4-6]。此外，這些藥物之中等療效和安全性變化形廓[7]已引出近來朝向靶向治療的趨勢。第一代“靶向”生物製劑將作用針對更侷限之T細胞亞群(例如抗體和蛋白質治療劑，諸如抗4-1BB、抗CD27、LAG-3及TIM-3)[8-11]。然而，如同先前之療法，這些“第一代”努力仍然無法僅針對疾病 相關之細胞。
包含適應性免疫反應之分子事件的核心為T細胞受體(TCR)與主要組織相容性複合體(MHC)分子所呈現之小肽抗原非共價接合。這代表免疫系統之靶向機制且為T細胞活化和效應子運作之必要的分子交互作用。抗原決定部位特異性細胞針對目標後，被招募之T細胞透過在抗原呈遞細胞上發現之共刺激分子的一般性接合被活化。二種信號對驅動T細胞特異性及活化或抑制都是必要的。重要的是，在T細胞發展期間，基因組編輯過程導致每個T細胞上均有獨特之TCR表現[12]，而該共刺激分子通常表現在所有T細胞(或大`T細胞亞群')上。目前的方法幾乎完全依賴該共刺激分子之一般性接合，而導致“全面性療法”。這些全面性免疫療法非常有效，但無差別地針對T細胞而導致重大毒性。若共刺激分子能優先結合攜帶疾病相關TCR之T細胞，其效力將從不利推進成優點。
現有多種調節T細胞的方法，其包括使用通常以Fc融合物形式表現之可溶性共刺激分子或能阻斷共刺激功能之針對共刺激分子的抗體[13，14]、抗體-藥物共軛結合物(ADC)[15]、雙特異性抗體(BsAb)[16，17]及游離肽抗原[18]。值得注意的是，ADC(通常稱為魔術子彈)確保將毒素(或其他藥物有效載荷)直接投遞在病理細胞之靶向投遞。然而，ADC目前苦於缺乏用於抗體靶向之較佳的生物標記物及不良的內化率(投予之劑量被發現僅有~1.5%在腫瘤細胞內部)。雙特異性抗體提供有吸引力的機 會來結合多種單株抗體之加成和協同作用，並可用於橋聯腫瘤細胞與T細胞[17]，因此，不需要內化以引出反應。雖然已研發出雙特異性抗體以具有與二種不同抗原之二價交互作用[19]，這些構建體仍然缺乏模組性且與母mAb相較下，苦於親和力降低[20]。過繼性T細胞(CAR-T)療法部分解決這些問題，且為上述傳統療法之有吸引力的替代法[21]。CAR-T利用經基因工程修飾之初級T細胞，該初級T細胞之表面上帶有嵌合型抗原受體(CAR)之轉基因：萃取患者之T細胞、純化及基因工程修飾以透過使用CAR瞄準腫瘤特異性抗原。該CAR通常具有針對病理細胞之外部單鏈可變結構域(抗體片段)，但庇有傳統之共刺激分子細胞質結構域。一旦該經基因工程改造之T細胞結合靶抗原，該內部刺激性結構域提供必要的信號使T細胞變成完全活躍。在這種完全活躍狀態，該T細胞可更有效地增殖和攻擊癌細胞。調和此反應以避免細胞因子釋出症候群和相關之副作用，及目前阻止此技術進入主流使用之可擴展性問題(例如與萃取和修改T細胞相關之大量花費和難度)[22]。
生物製劑(亦稱為生物藥品)為其中該活性物質係由生物來源製造或從生物來源萃取之藥物(與“小分子”藥物相反)。生物製劑新近加入全球治療市場，多半為透過基因工程製造之重組蛋白；這些包括單株抗體、治療性蛋白和肽類。目前銷售之生物藥物大多數係用於緩和罹患慢性疾病(諸如癌症、糖尿病、心血管疾病、***症和囊 性纖維化)之患者。2012年全球生物藥品市場之總值為1630億，預計在2017年將達到2520億，支持五年複合年均增長率(ompound annual growth rate)為9%。推動此增長的為對於更多之在研藥物(drug pipeline)的需求、對抗挑戰性疾病之有吸引力的靶的之識別及追求後續生物藥品(生物仿製藥(biosimilar)、仿製生物製劑(generic biologic))之推力，其實例為近期引入之縮短的FDA核准通路。
本發明解決對於用於免疫腫瘤學和自體免疫之精確治療劑的需求-與目前市場上或研發中之全面性和“偽靶向”調節劑相反之用於上調(例如在癌症的情況中)或抑制(例如在自體免疫之情況下)之訂製治療劑，該訂製治療劑係選殖上僅針對該與疾病相關之T細胞。
概要
本發明提供包含下列者之重組多肽：與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列，該與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列鄰接候選抗原決定部位肽，該候選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽序列，該T細胞調節結構域肽序列鄰 接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。
本發明亦提供包含下列者之重組多肽：與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列，該第一B2M前導序列鄰接候選抗原決定部位肽，該候選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接T細胞調節結構域肽序列，該T細胞調節結構域肽序列鄰接第三胺基酸連接子，該第三胺基酸連接子鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。
本發明亦提供抑制能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株之T細胞與能有效抑制T細胞選殖株之量的如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為抑制性結構域之T細胞調節結構域。
本發明亦提供藉由抑制能識別抗原決定部位肽之自體反應性T細胞選殖株來治療自體免疫疾病之方 法，其包含將該選殖株之T細胞與能有效治療自體免疫疾病之量的如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為抑制性結構域之T細胞調節結構域。
本發明亦提供刺激能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株之T細胞與能有效刺激T細胞選殖株之量的如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為刺激性結構域之T細胞調節結構域。
本發明亦提供藉由刺激能識別在癌症上之抗原決定部位肽的T細胞選殖株來治療癌症之方法，其包含將該選殖株之T細胞與能有效治療癌症之量的如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為刺激性結構域之T細胞調節結構域。
本發明亦提供重組多肽構建體，其包含(i)與第一胺基酸連接子序列結合之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，該包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵與(ii)結合，該(ii)包含具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸 序列。
本發明亦提供重組多肽構建體，其包含(i)與第一胺基酸連接子序列結合之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵與(ii)結合，該(ii)包含T細胞調節結構域肽，該T細胞調節結構域肽鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。
本發明亦提供包含二個本文所描述之重組多肽構建體的蛋白質，該二個構建體係藉由一或多個介於彼等之各別免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明亦提供包含二個本文所描述之重組多肽構建體的蛋白質，該二個構建體係藉由一或多個介於彼等之各別免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明提供藉由異源核酸轉導或以異源核酸轉染之經分離的懸浮適應細胞(suspension adapted cell)，其依5'至3'之順序包含編碼如本文所描述之重組多肽的序列。
本發明提供包含下列者之重組多肽：與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列，該與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列鄰接候選抗原決定部位肽，該候 選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽序列，該T細胞調節結構域肽序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。於一些情況中，該候選抗原決定部位包含7至20個胺基酸。於一些情況中，該第三胺基酸連接子為自裂解的。於一些情況中，該第二胺基酸連接子為自裂解的。於一些情況中，該自裂解肽為病毒2A肽或具有其序列。於一些情況中，該第一及/或第二B2M前導序列具有人B2M前導序列之序列。於一些情況中，該MHC重鏈為人MHC重鏈。於一些情況中，該MHC重鏈為MHC I分子。於一些情況中，該MHC重鏈為HLA-A02：01。於一些情況中，該MHC重鏈為MHC II分子。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgA Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgM Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為人免疫球蛋白Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG1 Fc結構域。於一些情況中，該重組多肽包含與其C-端鄰接之 His-8標記物。於一些情況中，該T細胞調節結構域為抑制性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為刺激性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為抗體和抗體片段、肽配體、T細胞共刺激肽、細胞因子或毒素。於一些情況中，該T細胞調節結構域包含PD-L1肽、PD-L1肽之Ig可變結構域，該T細胞調節結構域包含4-1BBL，該T細胞調節結構域包含B7-1W88A或者該T細胞調節結構域包含抗CD28單鏈Fv。於一些情況中，該重組多肽在其人天然B2M肽序列及其重鏈序列中包含突變從而使介於該B2M肽序列和重鏈序列之間的二硫鍵發生作用。
本發明提供包含下列者之重組多肽：與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列，該與第一B2M前導序列相一致之胺基酸序列鄰接候選抗原決定部位肽，該候選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接T細胞調節結構域肽序列，該T細胞調節結構域肽序列鄰接第三胺基酸連接子，該第三胺基酸連接子鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。於一些情況中，該候選抗原決定部位包含7至20個胺基酸。於 一些情況中，該第三胺基酸連接子為自裂解的。於一些情況中，該第二胺基酸連接子為自裂解的。於一些情況中，該自裂解肽為病毒2A肽或具有其序列。於一些情況中，該第一及/或第二B2M前導序列具有人B2M前導序列之序列。於一些情況中，該MHC重鏈為人MHC重鏈。於一些情況中，該MHC重鏈為MHC I分子。於一些情況中，該MHC重鏈為HLA-A02：01。於一些情況中，該MHC重鏈為MHC II分子。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgA Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgM Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為人免疫球蛋白Fc結構域。於一些情況中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG1 Fc結構域。於一些情況中，該重組多肽包含與其C-端鄰接之His-8標記物。於一些情況中，該T細胞調節結構域為抑制性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為刺激性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為抗體和抗體片段、肽配體、T細胞共刺激肽、細胞因子或毒素。於一些情況中，該T細胞調節結構域包含PD-L1肽、PD-L1肽之Ig可變結構域，該T細胞調節結構域包含4-1BBL，該T細胞調節結構域包含B7-1W88A或者該T細胞調節結構域包含抗CD28單鏈Fv。於一些情況中，該重組多肽在其人天然B2M肽序列及其重鏈序列中包含突變從而使介於該B2M肽序列和重鏈序列之間的二硫鍵發生作用。
於一些情況中，該重組多肽在其人天然B2M肽序列及其重鏈序列中包含突變從而使介於該B2M肽序列和重鏈序列之間的二硫鍵發生作用。於一些情況中，該重鏈序列為HLA且其中該二硫鍵聯接下列殘基對的其中一者：B2M殘基12，HLA殘基236；B2M殘基12，HLA殘基237；B2M殘基8，HLA殘基234；B2M殘基10，HLA殘基235；B2M殘基24，HLA殘基236；B2M殘基28，HLA殘基232；B2M殘基98，HLA殘基192；B2M殘基99，HLA殘基234；B2M殘基3，HLA殘基120；B2M殘基31，HLA殘基96；B2M殘基53，HLA殘基35；B2M殘基60，HLA殘基96；B2M殘基60，HLA殘基122；B2M殘基63，HLA殘基27；B2M殘基Arg3，HLA殘基Gly120；B2M殘基His31，HLA殘基Gln96；B2M殘基Asp53，HLA殘基Arg35；B2M殘基Trp60，HLA殘基Gln96；B2M殘基Trp60，HLA殘基Asp122；B2M殘基Tyr63，HLA殘基Tyr27；B2M殘基Lys6，HLA殘基Glu232；B2M殘基Gln8，HLA殘基Arg234；B2M殘基Tyr10，HLA殘基Pro235；B2M殘基Ser11，HLA殘基Gln242；B2M殘基Asn24，HLA殘基Ala236；B2M殘基Ser28，HLA殘基Glu232；B2M殘基Asp98，HLA殘基His192；和B2M殘基Met99，HLA殘基Arg234。
於一些情況中，該重組多肽在其人天然B2M肽序列及其重鏈序列中包含突變從而使介於該B2M肽序列和重鏈序列之間的二硫鍵發生作用。於一些情況中，該 重鏈序列為HLA且其中該二硫鍵聯接下列殘基對的其中一者：第一連接子位置Gly2，重鏈(HLA)位置Tyr84；輕鏈(B2M)位置Arg12，HLA Ala236；及/或B2M殘基Arg12，HLA殘基Gly237。
於一些情況中，該T細胞調節結構域為抑制性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為刺激性結構域。於一些情況中，該T細胞調節結構域為抗體和抗體片段、肽配體、T細胞共刺激肽、細胞因子或毒素。於一些情況中，該T細胞調節結構域包含PD-L1肽、PD-L1肽之Ig可變結構域，該T細胞調節結構域包含4-1BBL，該T細胞調節結構域包含B7-1W88A或者該T細胞調節結構域包含抗CD28單鏈Fv。
本發明提供編碼上文或本文他處所描述之任一重組多肽的核酸。本發明提供以編碼上文或本文他處所描述之任一重組多肽的核酸轉化的細胞。
本發明提供抑制能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株之T細胞與能有效抑制T細胞選殖株之量的上文或本文他處所描述之任一重組多肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為抑制性結構域之T細胞調節結構域。
本發明提供藉由抑制能識別抗原決定部位肽之自體反應性T細胞選殖株來治療自體免疫病症之方法，其包含將該選殖株的T細胞與能有效治療自體免疫病症之量的上文或本文他處所描述之任一重組多肽接觸，其中該 重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為抑制性結構域之T細胞調節結構域。
本發明提供刺激能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株的T細胞與能有效刺激T細胞選殖株之量的上文或本文他處所描述之任一重組多肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為刺激性結構域的T細胞調節結構域。
本發明提供藉由刺激能識別在癌症上之抗原決定部位肽的T細胞選殖株來治療癌症的方法，其包含將該選殖株的T細胞與能有效治療該癌症之量的上文或本文他處所描述之任一重組多肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含為刺激性結構域之T細胞調節結構域。
本發明提供重組多肽構建體，其包含(i)與第一胺基酸連接子序列結合之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，該包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵與(ii)結合，該(ii)包含具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。本發明提供包含二個重組多肽構建體之蛋白質，該二 個重組多肽構建體係藉由一或多個介於彼等之各別免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明亦提供重組多肽構建體，其包含(i)與第一胺基酸連接子序列結合之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵與(ii)結合，該(ii)包含T細胞調節結構域肽，該T細胞調節結構域肽鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。本發明提供包含二個重組多肽構建體之蛋白質，該二個重組多肽構建體係藉由一或多個介於彼等之各別免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明提供包含至少一個第一多肽和第二多肽之多聚體多肽，其中該第一多肽依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；及ii)第一主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex)(MHC)多肽；且其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；及ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽，其中該多聚體多肽在該第一多肽之C端或該第二多肽之N端包含免疫調節結構域。本發明提供包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸。本發明提供包含該核酸之重組表現載體。本發明 提供經基因工程修飾之宿主細胞，其中該經基因工程修飾之宿主細胞係經本發明之核酸或本發明之重組表現載體基因工程修飾。本發明提供包含該多聚體多肽之組成物，包括醫藥組成物。本發明提供調節T細胞之活性的方法，該方法涉及將T細胞與本發明之多聚體多肽接觸。本發明提供治療方法，該方法涉及投予有此需要之個體有效量之本發明的多聚體多肽。本發明提供含有本發明之多聚體多肽或包含本發明之多聚體多肽的組成物(例如醫藥組成物)之容器。
本發明提供一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)免疫調節結構域；ii)第二MHC多肽；及iii)Ig Fc多肽。本發明提供一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和iii)免疫調節結構域；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。於一些情況中，該第一MHC多肽為β2微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈多肽。於一些情況中，該β2微球蛋白多肽包含與SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽包 含與SEQ ID NO：5所列之胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第一MHC多肽為第II型MHC α鏈多肽；且其中該第二MHC多肽為第II型MHC β鏈多肽。於一些情況中，該抗原決定部位為T細胞抗原決定部位。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽包含與24A-24C圖中所描述之胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽係非共價性聯結。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽係共價性聯結。於一些情況中，該共價鍵聯係經由二硫鍵。於一些情況中，該第一MHC多肽或介於該抗原決定部位與第一MHC多肽之間的連接子包含胺基酸取代以提供第一Cys殘基，該第二MHC多肽包含胺基酸取代以提供第二Cys殘基，且其中該二硫鍵聯係介於該第一和第二Cys殘基之間。於一些情況中，該多聚體多肽包含介於該抗原決定部位與第一MHC多肽之間的第一連接子。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽、B7-1多肽、B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽及PD-L2多肽。於一些情況中，該第一多肽或第二多肽包含二或多個免疫調節多肽。於一些情況中，該2或多個免疫調節多肽為串列的。於一些情 況中，該多聚體多肽包含第三多肽，其中該第三多肽包含免疫調節多肽，此免疫調節多肽包含與該第一多肽之免疫調節多肽具有至少90%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第三多肽係與該第一多肽共價連接。於一些情況中，其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；ii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；和iii)親和標記物。
本發明提供一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；及ii)選擇性地，Ig Fc多肽或非Ig支架，其中該多聚體多肽選擇性地包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架，其中該多聚體多肽包含一或多個免疫調節結構域，其中該一或多個免疫調節結構域為：A)在第一多肽之C端；B)在第二多肽之N端；C)在第二多肽之C端；或D)在第一多肽之C端和第二多肽之N端。於一些情況中，多聚體多肽包含單一免疫調節多肽。於一些情況中，多聚體多肽包含二個免疫調節多肽(例如同一免疫調節多肽的二個複本)。於一些情況中，多聚體多肽包含三個免疫調節多肽(例如同一免疫調節多肽的三個複本)。於一些情況中，多聚體多肽包括四個免疫調節多肽(例如同一免疫調節多肽的四個複本)。於一些情況中，多聚體多肽包含單一免疫調節多肽。於一些情況中，多聚體多肽包含二個免疫調節多肽(例如同一免 疫調節多肽的二個複本)。於一些情況中，多聚體多肽包含三個免疫調節多肽(例如同一免疫調節多肽的三個複本)。於一些情況中，多聚體多肽包括四個免疫調節多肽(例如同一免疫調節多肽的四個複本)。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和iii)免疫調節結構域；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)免疫調節結構域；ii)第二MHC多肽；和iii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽；及iii)免疫調節結構域。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)免疫調節結構域。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)免疫調節結構域；和 ii)第二MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和iii)免疫調節結構域；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽。於一些情況中，該非Ig支架為XTEN多肽、轉鐵蛋白(transferrin)多肽、Fc受體多肽、彈性蛋白樣多肽、絲綢樣多肽或絲綢彈性蛋白樣多肽。於一些情況中，該第一MHC多肽為β2微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈多肽。於一些情況中，該β2微球蛋白多肽包含與SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽包含與SEQ ID NO：5所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第一MHC多肽為第II型MHC α鏈多肽；且其中該第二MHC多肽為第II型MHC β鏈多肽。於一些情況中，該抗原決定部位為T細胞抗原決定部位。於一些情況中，該多聚體多肽包含Fc多肽，且其中該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽包含與第24A-24C圖中所描述之胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽係非共 價聯結。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽係共價聯結。於一些情況中，該共價鍵聯係經由二硫鍵。於一些情況中，該第一MHC多肽或介於該抗原決定部位與第一MHC多肽之間的連接子包含胺基酸取代以提供第一Cys殘基，該第二MHC多肽包含胺基酸取代以提供第二Cys殘基，且其中該二硫鍵聯係介於該第一和第二Cys殘基之間。於一些情況中，該多聚體多肽包含介於抗原決定部位和第一MHC多肽之間的第一連接子。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽、B7-1多肽、B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽及PD-L2多肽。於一些情況中，該多聚體多肽包含2或多個免疫調節多肽。於一些情況中，該2或多個免疫調節多肽為串聯的。於一些情況中，該多聚體多肽包含第三多肽，其中該第三多肽包含免疫調節多肽，此免疫調節多肽包含與該第一多肽或第二多肽之免疫調節多肽具有至少90%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第三多肽係與第一多肽共價連接。於一些情況中，該第二多肽依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；和iii)親和標記物。
本發明提供包含編碼本發明之多聚體多肽的多肽鏈之核苷酸序列的核酸；於一些情況中，該核酸係存在於重組表現載體中。本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，i)其中該重組多肽依從N端至C端之順 序包含：a)抗原決定部位；b)第一MHC多肽；c)免疫調節多肽；d)蛋白水解可裂解之連接子或核糖體跳躍信號；e)第二MHC多肽；和f)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或基於非Ig之支架；或ii)其中該重組多肽依從N端至C端之順序包含：a)抗原決定部位；b)第一MHC多肽；c)蛋白水解可裂解之連接子或核糖體跳躍信號；d)免疫調節多肽；e)第二MHC多肽；和f)Ig Fc多肽或基於非Ig之支架。於一些情況中，該第一MHC多肽為β2微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈多肽。於一些情況中，該β2微球蛋白多肽包含與SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B或HLA-C重鏈。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽包含與SEQ ID NO：5所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該第一MHC多肽為第II型MHC α鏈多肽；且其中該第二MHC多肽為第II型MHC β鏈多肽。於一些情況中，該抗原決定部位為T細胞抗原決定部位。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽包含與24A-24C圖中所描述之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽、B7-1多肽、B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、 CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽及PD-L2多肽。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素(lymphotoxin)β受體、3/TR6、ILT3、ILT4及HVEM。於一些情況中，該蛋白水解可裂解之連接子或核糖體跳躍信號包含選自下列群組之胺基酸序列：a)LEVLFQGP(SEQ ID NO：37)；b)ENLYTQS(SEQ ID NO：34)；c)弗林蛋白酶(furin)裂解位點；d)LVPR(SEQ ID NO：36)；e)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64)；f)GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：65)；g)GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：66)；及h)GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：67)。於一些情況中，該重組多肽依從N端至C端之順序包含：a)第一前導肽；b)抗原決定部位；c)第一MHC多肽；d)免疫調節多肽；e)蛋白水解可裂解之連接子或核糖體跳躍信號；f)第二前導肽；g)第二MHC多肽；和h)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。於一些情況中，該第一前導肽和第二前導肽為β2-M前導肽。於一些情況中，核苷酸序列係可操作地連接轉錄控制元件。於一些情況中，該轉錄控制元件為在真核細胞中作用之啟動子。於一些情況中，該第一MHC多肽或介於該抗原決定部位和第一MHC多肽之間的連接子包含胺基酸取代以提供第一Cys殘基，該第二MHC多肽包含胺基酸取代以提供第二Cys殘基，且其中該第一和第二Cys殘基提供介於該第一 MHC多肽和第二MHC多肽之間的二硫鍵。本發明提供包含上文或本文他處所描述之任一核酸的重組表現載體。於一些情況中，該重組表現載體為病毒載體。於一些情況中，該重組表現載體為非病毒載體。本發明提供經如上文或本文他處所描述之重組表現載體基因工程修飾的宿主細胞。於一些情況中，該宿主細胞係在試管內。於一些情況中，該宿主細胞係經基因工程修飾從而使該細胞不會製造內源性MHC β2微球蛋白多肽。於一些情況中，該宿主細胞為T淋巴細胞。
本發明提供一種組成物，其包含：a)第一核酸，其包含編碼第一多肽之核苷酸序列，該第一多肽依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和iii)免疫調節結構域；及b)包含編碼第二多肽之核苷酸序列的第一核酸，該第二多肽依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽或基於非Ig之支架。本發明提供一種組成物，其包含：a)第一核酸，其包含編碼第一多肽之核苷酸序列，該第一多肽依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)包含編碼第二多肽之核苷酸序列的第一核酸，該第二多肽依從N端至C端之順序包含：i)免疫調節結構域；ii)第二MHC多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一及/或第二核酸係存在於重組表現載體中。本發明提供經上文或本文他處所描述之核酸組成物基因工程修飾的宿主細胞。
本發明提供製造如上文或本文他處所描述之多聚體多肽的方法，該方法包含：a)令如上文或本文他處所描述之宿主細胞在能使該宿主細胞合成該多聚體多肽的條件下培養在試管之培養基；及b)從宿主細胞及/或培養基分離該多聚體多肽。於一些情況中，該第二多肽包含親和標記物且其中該分離步驟包括將該由細胞製造之多聚體多肽與用於該親和標記物之結合配體(binding partner)接觸，其中該結合配體係被固定化，從而固定該多聚體多肽。於一些情況中，該方法包含將該經固定之多聚體多肽洗提出。
本發明提供選擇性調節抗原決定部位特異性T細胞之活性的方法，該方法包含將該T細胞與如上文或本文他處所描述之多聚體多肽接觸，其中該接觸選擇性地調節該抗原決定部位特異性T細胞之活性。於一些情況中，該免疫調節多肽為活化多肽且其中該多聚體多肽活化該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該免疫調節多肽為抑制多肽，且其中該多聚體多肽抑制該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該接觸係在玻管內進行。於一些情況中。該接觸係在活體內進行。
本發明提供選擇性調節個體中之抗原決定部位特異性T細胞之活性的方法，該方法包含投予該個體有效量之如上文或本文他處所描述之多聚體多肽，該有效量之多聚體多肽能有效選擇性地調節個體中之抗原決定部位特異性T細胞之活性。於一些情況中，該免疫調節多肽為 活化多肽，且其中該多聚體多肽活化該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該抗原決定部位為與癌症相關之抗原決定部位，且其中該投藥選擇性地增加特異於該與癌症相關之抗原決定部位的T細胞之活性。於一些情況中，該免疫調節多肽為抑制性多肽，且其中該多聚體多肽抑制該抗原決定部位特異性T細胞之活性。於一些情況中，該抗原決定部位為自體抗原決定部位，且其中該投藥選擇性地抑制特異於該自體抗原決定部位之T細胞的活性。
本發明提供治療個體之感染的方法，該方法包含投予該個體有效量之a)如上文或本文他處所描述之多聚體多肽；或b)一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的重組表現載體；或c)一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的mRNA，其中該抗原決定部位為病原體相關之抗原決定部位，其中該免疫調節多肽為活化多肽，且其中該投予能有效選擇性地調節個體特異於與病原體相關之抗原決定部位的T細胞之活性。於一些情況中，該病原體為病毒、細菌或原生動物。於一些情況中，該投予為皮下投予(即，該投予係經由皮下投予進行)。於一些情況中，該投予為靜脈內投予(即，該投予係經由靜脈內投予進行)。於一些情況中，該投予為肌肉內投予(即，該投予係經由肌肉內投予進行)。於一些情況中，該投予為全身性的。於一些情況中，該投予係在治療部位遠端(即，該投予係經由皮下投予進行)，該投予為局部投予 (即，該投予係經由皮下投予進行)，該投予係在治療部位或接近治療部位進行。
本發明提供一種組成物，其包含：a)如上文或本文他處所描述之多聚體多肽；及b)醫藥上可接受之賦形劑。
本發明提供一種組成物，其包含：a)如上文或本文他處所描述之核酸或如上文或本文他處所描述之重組表現載體；及b)醫藥上可接受之賦形劑。
第1圖：SynTac：用於T細胞活化之人工免疫突觸。左側圖板描繪用於T細胞活化之傳統二-信號假說。即，透過T細胞和抗原呈遞細胞(APC)之間的獨特TCR：MHC-抗原決定部位交互作用進行靶的T細胞接合，隨後透過共刺激分子接合進行刺激或抑制。中間圖板為synTac分子之示意圖，隨後為synTac(右)之作用模式。類似於自然反應(左)，該synTac融合蛋白透過MHC-抗原決定部位而容許高度特異性細胞之靶向作用。隨後為T細胞調節結構域(“MOD”)，其經由共刺激分子接合來作用，且能提供活化或抑制作用。此引出選殖株，而非全面性之T細胞反應。值得注意的是，該MOD可為任何已知或核准之抗體、抗體片段-共刺激分子或其他文獻驗證之有效載荷(細胞因子、毒素，等)以及新加入項。
第2A-2C圖：構建SynTac Fc融合物。一種 策略係利用構建Fc融合物來增加該相關產品之效價、穩定性和治療窗。簡單地說，該Fc區為天然共價同型二聚體，其係透過二個完全相同之免疫球蛋白CH2-CH3結構域交互作用形成(稱為Fc)，並透過二個介於CH2結構域之間的二硫鍵穩定化(以二條細線顯示)。第2A圖顯示出單鏈肽MHC蛋白質，其羧基端連接IgG Fc區。為了引入替代之蛋白鍵聯(諸如MOD)，將該構建體拆分成各別之重鏈和輕鏈，並將肽和蛋白質二者融合至不同端。一種構建法(第2B圖)導致該肽之胺基端聯結至輕鏈(β2微球蛋白，B2M)，其後為該輕鏈延伸至MOD效應分子之羧基端。在此情況中，該重鏈(HLA-分子，HC)係融合至Fc區。構建體係透過二硫橋(標記為SS)共價連接。一種替代方位(第2C圖)係將Fc之MOD胺基端與重鏈融合，但該肽仍連接B2M輕鏈。
第3A-3B圖：二種基礎synTac分子之整體設計。此構建體利用天然人B2M前導序列(LEADER)以允許有效分泌及ER加工，緊接在後為候選抗原決定部位(標記為肽(PEPTIDE))。在“輕鏈”鍵聯(LC，第3A圖)方面，其係透過連接子L1與天然B2M偶聯，而MOD係透過連接子L2結合。此完整盒係藉由豬捷申病毒-1(P2A)“自裂解”肽鏈接至另一B2M前導序列、MHC重鏈及IgG1 Fc結構域以允許每個鏈之化學計量表現。該重鏈(HC，第3B圖)鍵聯為類似情況，然而，現在該病毒P2A肽接續在B2M之後，而MOD接續在第二前導肽之後。此二種構建體終 止於8x His標記物。
第4圖：CRISPR/CAS介導內源性β-2微球蛋白之剔除。設計針對內源性B2M之指導RNA，與編碼CRISPR/CAS之質粒一起轉染並將其培養三天。將培養之細胞對B2M細胞表面進染色並藉由螢光活化之細胞分選術(FACS)反選擇(根據螢光損失分選)。回收分選出之細胞並進行二或更多輪之染色、反分選及回收(共三輪)以確保有效剔除。經由FACS(如上所示)監測B2M的表面表現來檢查最終匯集體之品質。
第5A-5B圖：製造及測試具有經基因工程處理之二硫鍵的synTac構建體之活性。一個構建體(H236-L12，標記為synTac 18)被證明具高度表現，第二個構建體(H237-L12，synTac 17)被證明具中度表現。使用dt-SCT二硫化物架構作為陽性對照組(標記為synTac 2)。非還原PAGE表明形成如預期之高分子量、經二硫鍵連接之部分(第5A圖)。將所有表現構建體規模放大成100毫升之尺度，純化之並透過結合表現在HEK細胞(稱為A6)表面上之同源TCR來測試活性，藉由FACS螢光監測之結果表明具有正確折疊和活性(第5B圖)。使用表現非同源TC之細胞(稱為HEK-AS01)作為陰性對照組。使用表現非同源TCR(稱為AS01)之細胞作為陰性對照組。
第6A-6C圖：各種synTac融合蛋白的表現。成功表現連接synTac融合體之輕鏈(第6A圖)，該synTac融合體具有各種靶向肽和具有PD-L1 MOD結構域之HLA 同種型，具體地說1)HTLV-人HLA-A02、2)IGRP-鼠H2-Kd及3)TUM-鼠H2-Kd(第6B圖)(其為以IGRP為基礎，具變異MOD結構域之synTac融合體)、4)PD-L1之Ig可變結構域、5)4-1BBL、6)抗CD28單鏈Fv及7)B7-1 W88A(第6C圖)(其為以IGRP為基礎，攜帶各種MOD，以重鏈鍵聯格式表現之synTac融合體)、8)PD-L1及9)抗CD28單鏈Fv。
第7A-7B圖：TCR-synTac-PD1橋聯：驗證該synTac蛋白成分之完整性。使用表現同源TCR之HEK細胞(A6)作為陽性對照，生成表現非同源TCR(AS01)之細胞並與未經轉導之親代細胞一起作為陰性對照組。以非螢光純化之HTLV-PD-L1 synTac變異體挑戰細胞並與其同源受體PD1(其融合至鼠IgG2a)一起培養。使用經FITC標記之抗小鼠二級抗體檢測該PD1-Fc融合物。第7A圖為反應示意圖。FAC結果顯示在第7B圖中。如所預期者，僅在以呈遞具有PD-L1 MOD之synTac的HTLV對同源(A6)HEK細胞株進行挑戰時才可觀察到共定位化螢光。值得注意的是，當對攜帶非同源TCR之HEK細胞或親本細胞進行挑戰時、當僅對FITC-PDL-Fc挑戰時或當MOD不存在時並未觀察到螢光。
第8A-8D圖：作用中之SynTac：玻管內T細胞分析。在固定化之抗CD3抗體的存在下培養來自8.3轉基因NOD小鼠之CD8+T細胞以刺激多株T細胞活化。以可溶性形式之synTac IGRP-PD-L1(第8A圖)或synTac TUM-PD-L1(第8C圖)處理經刺激的培養物以檢查具有任何抑制作用之抗原特異性。在接種前，以羧基螢光琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記細胞以監測經T細胞活化誘導之細胞增殖程度。5天後收穫細胞並使用流式細胞儀檢測存活力和增殖情況。亦使用複合式流式細胞儀小珠分析檢查上清液中CD8+T細胞效應子細胞因子IFNγ和TNFα的表現。有檢查之CD8+T細胞活化參數係以抗原特異性及效應子(即，MOD)結構域依賴方式受遏制(第8D圖)。
第9A-9F圖提供synTac多肽之胺基酸序列和結構域結構。
第10A-10C圖描繪用於表現4-1BBL三聚體之構建體。這些草圖為天然4-1BBL胞外域(殘基50-254)之單體形式(第10A圖)，其顯示近膜(Memb Prox，MP)和TN同源性(TNF-H)結構域、(第圖10B)4-1BBL二聚體synTac及(第10C圖)4-1BBL synTac之全活性雙三聚體形式，該三聚體形式係透過共同表現習知之synTac構建體與不具有親和標記物之“游離”4-1BBL胞外域(殘基50-254，第10A圖)來產生。所有構建體係在一起表現在哺乳動物細胞中時組裝。通過Fc區純化(A/G蛋白)，隨後進行尺寸排阻，從而可允許4-1BBL三聚體型synTac從游離BBL分離出。
第11A-11B圖.攜帶三聚體4-1BBL之synTac蛋白質的多角度光散射(MALS)分析。(第11A圖)透過MALS鑑定之主要種類的分子量，其顯示數個獨立測量之 實例。(第11B圖)來自synTac40+51之MALS的代表性痕跡，其具有相對高水準之光散射及低紫外線吸收，反映出存有少量具高分子量之蛋白質。低分子量緩衝成分導致折射率之大變化(正或負)，UV吸收中無相關變化。
第12圖.SynTac 4-1BBL受體結合。以重組人或小鼠4-1BB-Fc融合蛋白(來自商業來源)將蛋白A微珠塗層至飽和並用於結合攜帶4-1BB配體(二聚體和三聚體形式)的synTac構建體(為共調節結構域)，接著為特異於synTac重鏈同種型之螢光檢測抗體。然後，藉由高通量流式細胞儀測量synTac 4-1BBL特異結合珠源性4-1BB的程度。使用此系統探查在synTac支架之背景下，4-1BBL對人和鼠4-1BB二者之交叉反應程度和相對親和力。攜帶4-1BBL之synTac顯示出結合同源受體，但不結合“無受體”(被稱為無MOD)之Fc結合微珠，表明為折疊良好且活性之蛋白試劑。值得注意的是，該三聚體以預期為雙重三聚體型接合之親和力範圍結合，而原始二聚體顯示出結合親和力降低10倍，且所有構建體在鼠和人受體之間發生交叉反應。
第13圖.在固定抗化CD3抗體的存在下培養來自8.3轉基因NOD小鼠之CD8+T細胞以刺激多株T細胞活化。將經刺激之培養分別以可溶性形式之synTac TUM-41BBL(A)或synTac IGRP-41BBL(B和C)處理以檢查任何刺激作用之抗原特異性。對照處理為單獨之培養基(-CNTRL)或固定化之抗CD3(+CNTRL)對基準反應幅度。 以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)標記細胞以監測由T細胞活化誘導之細胞增殖的程度。4天後，收穫細胞並使用流式細胞儀檢測存活力和增殖情況。亦使用複合式流式細胞儀微珠分析檢查上清液中CD8+T細胞效應子細胞因子IFNγ和TNFα的表現。所有檢查之CD8+T細胞活化參數係以抗原特異性及效應子(即，MOD)結構域依賴方式被活化。
第14圖.單一劑量活體內T細胞刺激分析。在活體內之T細胞刺激實驗。經由腹膜內途徑為NOD小鼠注射synTac IGRP-41BBL、synTac TUM-41BBL或PBS。注射後6天，處死小鼠並使用適當之肽-MHC五聚體染色，經由流式細胞術檢查脾細胞之IGRP特異性CD8 T細胞的相對頻率。相對於對照組，IGRP-41BBL處理與IGRP特異性CD8 T細胞之頻率高出很多有關，此結果支持由單一劑量引起之明顯活體內擴充。
第15圖.多劑量活體內T細胞刺激分析。在二週之期間內經由腹膜內途徑為NOD小鼠注射三個synTac IGRP-41BBL、synTac TUM-41BBL或PBS之劑量。注射後7天，處死小鼠並使用適當之肽-MHC五聚體染色，經由流式細胞術檢查PBMC(來自血液)之IGRP-特異性CD8 T細胞的相對頻率。相對於對照組，IGRP-41BBL處理與IGRP特異性CD8 T細胞之頻率高出很多有關，此支持由多劑量引起之明顯活體內擴充，包括罕見腫瘤特異性T細胞(TUM)。
第16A-16B圖.4-1BBL三聚體型表現之優化的構建體之示意圖。二硫化物鎖定(第16A圖，DL)和單鏈三聚體(第16B圖，SCT)。
第17圖.SynTac 4-1BBL受體結合。以重組人或小鼠4-1BB-Fc融合蛋白將蛋白A微珠塗層至飽和並用於結合攜帶4-1BB配體(二硫鍵鎖定之三聚體(69、70和71)和單鏈三聚體(SCT))的synTac構建體(為共調節結構域)，接著為特異於synTac重鏈同種型之螢光檢測抗體。所顯示之天然三聚體為結合對照組(三聚體)。然後，藉由高通量流式細胞儀測量synTac 4-1BBL特異結合珠源性4-1BB的程度。攜帶4-1BBL之synTac顯示出結合同源受體，但不結合“無受體”(被稱為無MOD)之Fc結合微珠，表明為折疊良好且活性之蛋白試劑。所有構建體在鼠和人受體之間發生交叉反應。
第18圖.優化之4-1BBL構建體的表現驗證。藉由共同表現製造之SynTac，具有原始4-1BBL調節子(synTac40/51，無二硫鍵鎖定，標記為“O”(用於表示原始))及三個含有經基因工程處理之二硫鍵鎖定，限制該三聚體構形的優化之構建體。每個構建體中有二個天然殘基被半胱胺酸殘基取代(Q94C：P245C(在凝膠中標記為“DL1”)、Q94C：P242C“DL2”和Q89C：L115C“DL3”，分別稱為synTac 69、70和71)，其在人細胞中與庇有該相同突變(分別稱為98、99、100)之“游離”非標記形式共同表現以允許在細胞中共價鎖定。在非還原性SDS-PAGE分 析中藉由釋出之(非共價結合的)“游離”4-1BBL量來觀察二硫鍵結合程度。游離BBL會在~20kDa移行(BOX)，確認經基因工程處理之二硫鍵鎖定。攜帶單鏈三聚體形式(SCT)之4-1BBL的SynTac亦顯示出下列親和力和凝膠過濾純化(標記為“SCT”)。藉由多角度光散射(MALS)證實準確之質量。
第19A-19I圖.本發明之synTac構建體的實施態樣之示意圖。第19A-19C圖分別描繪相關於第2A-2C圖中描述之構建體。第19B和19C圖中描繪該P2A未裂解之多肽(頂端)和經裂解之多肽(透過P2A介導之自裂解)(底部)(其具有圖中說明之由半胱胺酸取代介導的(*)二硫鍵結(SS))。第19D-19F圖分別描繪相關於上文中第8A-8C圖中所描述之構建體；在第19D-19F圖之各個圖中，該P2A未裂解形式描繪於上方(頂端)，該P2A介導之自裂解多肽(底部)具有圖中說明之由半胱胺酸取代介導的(*)二硫鍵結(SS)。第19G圖描繪相關於第9B圖中之synTac40構建體的一般化形式，圖中說明未裂解的(頂部)和自裂解的/二硫鍵聯結(底部)之多肽。第19H圖描繪相關於第9C-9E圖中之synTac69、synTac70和synTac71構建體的一般化形式，圖中說明未裂解的(頂部)和自裂解的/二硫鍵聯結(底部)之多肽，亦指出(*)4-1BBL結構域中額外之半胱胺酸取代。圖。第19I描繪相關於第9F圖中之synTac 4-1BBL單鏈三聚體(SCT)的一般化形式，圖中說明未裂解的(頂部)和自裂解的/二硫鍵聯結(底部)之多肽。
第20圖提供來自現代人(NP_004039.1；SEQ ID NO：78)、黑猩猩(NP_001009066.1；SEQ ID NO：79)、獼猴(NP 001040602.1；SEQ ID NO：80)、普通牛(NP 776318.1；SEQ ID NO：81)和小家鼠(NP 033865.2；SEQ ID NO：82)之β-2微球蛋白(B2M)前體(即，包括前導序列)的多個胺基酸序列比對。
第21圖提供SEQ ID NO：6之構建體的結構域結構。
第22圖提供SEQ ID NO：7之構建體的結構域結構。
第23圖描繪活體內投予synTac IGRP-PDL1、synTac TUM-PDL1或磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)對IGRP特異性CD8+T細胞之頻率的效果上。
第24A-24C圖提供免疫球蛋白Fc多肽之胺基酸序列。
第25A-25C圖提供人第I類白血球抗原(HLA)重鏈多肽之胺基酸序列。
第26A-26B圖提供PD-L1多肽之胺基酸序列。
第27圖提供4-1BBL多肽之胺基酸序列。
第28圖提供ICOS-L多肽之胺基酸序列。
第29圖提供OX40L多肽之胺基酸序列。
第30圖提供PD-L2多肽之胺基酸序列。
第31圖提供CD80(B7-1)多肽之胺基酸序列。
第32圖提供CD86(B7-2)多肽之胺基酸序列。
第33圖提供Fas配體(FAS-L)多肽之胺基酸序列。
第34A-34H圖提供本發明之synTac構建體的實施態樣之示意圖，圖中說明由半胱胺酸取代(*)介導之二硫鍵聯結(SS)。在這些實施態樣中，二硫鍵係在存在於分開之多肽中的MHC(例如HLA)多肽之間形成。
定義
如本文所使用之“前導序列”包括可由哺乳動物細胞處理之任何信號肽，包括人B2M前導序列。該等序列為本技藝所周知。
除非另外具體指明，如本文所使用之關於，例如元件A和元件B的“相鄰”意指元件A與元件B相鄰且結合至元件B，較佳地，經由共價鍵結合。例如，對於鄰接第二胺基酸序列之第一胺基酸序列而言，該第一胺基酸序列之C端可藉由肽鍵連接該第二胺基酸序列之N端。
本文中，術語“肽”、“多肽”及“蛋白質”可互換使用，且係指任何長度之聚合型胺基酸，其可包括編碼和非編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具有修飾之肽主鏈的多肽。該術語亦包括具有共轉譯之多肽(例如信號肽裂解)及該多肽之轉譯後修飾，諸如，例如形成二硫鍵、糖基化、乙醯化、磷酸化、蛋白水解裂 解，等。此外，如本文所使用之“多肽”係指包括修飾之蛋白質，例如在天然序列中進行刪除、添加及取代(通常為本技藝之人士已知之保守性質的取代)，只要該蛋白質維持所需之活性。這些修飾可為故意的(如透過定點誘變者)或可為偶然的(諸如透過製造該蛋白質之宿主的突變或由於PCR擴增或其他重組DNA方法的錯誤)。
如本文所使用之用於描述核酸分子的術語“重組”係指基因組、cDNA、病毒、半合成及/或合成來源之多核苷酸，憑藉著該多核苷酸之起源或操作，該多核苷酸不與其天然連結之所有或一部分多核苷酸序列相聯結。如本文所使用之關於蛋白質或多肽的術語“重組”係指藉由重組多核苷酸之表現而製造的多肽。如本文所使用之關於宿主細胞或病毒的術語“重組”係指其中已引入重組多核苷酸之宿主細胞或病毒。本文中之關於物質(例如細胞、核酸、蛋白質或載體)的術語“重組”亦指已藉由引入異源物質(例如細胞、核酸、蛋白質或載體)而修飾之物質。
本文中，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”可互換使用以包括聚合型之核苷酸(不論是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)。該術語僅指分子之一級結構。因此，該術語包括三股、雙股和單股DNA，以及三股、雙股和單股RNA。該術語亦包括該等具有修飾之分子(諸如藉由甲基化及/或藉由封端修飾者)及未修飾型多核苷酸。更特別地，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”包括多聚去氧核苷酸(含有2-脫氧基- D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、任何其他類型之具有嘌呤或嘧啶鹼基之N-或C-糖苷的多核苷酸和含有非核苷酸主鏈、聚合物之其他聚合物，以及其他合成之序列特異性核酸聚合物，惟其該聚合物含有核鹼基，該核鹼基之構形允許進行鹼基配對和鹼基堆積(諸如在DNA和RNA中所發現者)。
如本文所使用之術語“載體”係指能將核酸序列轉移至靶細胞之載劑。例如載體可包含能在靶細胞中表現的編碼序列。如本文所使用之“載體構建體”、“表現載體”及“基因轉移載體”通常指能夠指導所欲基因表現之任何核酸構建體且其可用於將所欲基因轉移入靶細胞。因此，該術語包括選殖和表現載劑，以及整合載體和非整合載體。因此，載體能夠將核酸序列轉移入靶細胞，且於一些情況中，載體係用於操作核酸序列，例如重組核酸序列(即，用於製造重組核酸序列)，等。用於本發明目的之載體實例包括，但不限於質粒、噬菌體、轉座子(transposon)、黏粒(cosmid)、病毒，等。
如本文所使用之“表現盒”包含任何能夠指導任何RNA轉錄子(包括所欲之基因/編碼序列以及非轉譯之RNA)表現的核酸構建體。該等表現盒可被構建成“載體”、“載體構建體”、“表現載體”或“基因轉移載體”以將該表現盒轉移入靶細胞內。因此，該術語包括選殖和表現載體，以及病毒載體。表現盒之轉錄子可穩定或瞬時地表現且可從被整合入宿主基因組(以針對性或無針對性方式) 中之表現盒表現出或依需要保持未經整合的。
“可操作地連接”係指並排，其中該如此描述之成分係處於允許它們以其所意圖之方式運作的關係。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，該啟動子係可操作地連接於該編碼序列。如本文所使用之術語“異源啟動子”和“異源控制區”係指在自然界中通常不與特定核酸聯結之啟動子和其他控制區。例如，“對編碼區為異源之轉錄控制區域”為在自然界中通常不與該編碼區聯結之轉錄控制區。
如本文所使用之術語“免疫性突觸”或“免疫突觸”通常係指介於二個適應性免疫反應之交互作用免疫細胞之間的天然接觸面，包括，例如介於抗原呈遞細胞(APC)或靶細胞與效應子細胞(例如淋巴細胞、效應子T細胞、天然殺手細胞，等)之間的接觸面。介於APC和T細胞之間的免疫性突觸通常係藉由T細胞抗原受體和主要組織相容性複合體分子之間的交互作用起始(例如，如Bromley et al.,Annu Rev Immunol.2001；19：375-96中所描述者；其全部內容以引用方式併入本文)。
如本文所使用者，該關於核酸序列、蛋白質或多肽的術語“異源的”意指這些分子並非天然存在於該衍生這些異源核酸序列、蛋白質或多肽之細胞中。例如，該被***非人類細胞之細胞中的編碼人多肽之核酸序列在此特定之背景中為異源核酸序列。雖然異源核酸可源自不同的生物體或動物物種，該等核酸不需要自分別之生物物種 衍生才算是異源。例如，於一些情況中，合成之核酸序列或由其編碼之多肽對引入此核酸序列或由其編碼之多肽的細胞而言可能為異源的，因該細胞先前並未包含該合成之核酸。因此，合成之核酸序列或由其編碼之多肽對人細胞而言可被認為是異源的，例如，即使該合成之核酸序列或由其編碼之多肽中的一或多種成分最初係源自人類細胞。
如本文所使用之“宿主細胞”係指活體內或玻管內之真核細胞或來自以單細胞實體培養之多細胞生物體(例如細胞株)的細胞，該真核細胞可作為或已作為核酸接受者(例如包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之表現載體)，且包括已藉由該核酸基因工程修飾之原始細胞的後代。可理解的是，由於天然、偶然或蓄意之突變，單細胞之後代在形態或基因組或全部DNA互補序列上不一定與原始母細胞完全一致。“重組宿主細胞”(亦稱為“經基因工程修飾之宿主細胞”)為其中已經引入異源核酸(例如表現載體)之宿主細胞。例如，經基因工程修飾之真核宿主細胞係憑藉著將異源核酸(例如，對該真核宿主細胞而言為外來之外源核酸或通常不會在真核宿主細胞中找到之重組核酸)引進合適之真核宿主細胞來基因工程修飾。
於一些情況中，核酸或胺基酸序列(包括多肽和編碼多肽之核酸)係根據“序列相似性”或“序列同一性”(例如與一或多個參考序列作相比較)指稱。在其他情況下，突變體或變異體序列可根據與一或多個參考序列之比較來指稱。為了比較序列，通常一個序列作為參考序列， 再將測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入電腦中，若需要時，指明子序列坐標，並指明序列算法程式參數。然後，該序列比較算法根據指明之程式參數計算該測試序列相對於參考序列之序列同一性百分比。
當必要或需要時，可進行用於比較之序列的最佳比對，例如藉由Smith和Waterman之局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981)，其以引用方式被併入本文)、藉由Needleman和Wunsch之同源性比對算法(J.MoI.Biol.48：443-53(1970)，其以引用方式被併入本文)、藉由Pearson和Lipman之相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-48(1988)，其以引用方式被併入本文)、藉由電腦這執行些算法(例如在Wisconsin遺傳學軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.,Madison,Wis.)或藉由目視檢查。(一般參見Ausubelet al.(eds)，Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley and Sons,New York(1999))。
“T細胞”包括所有表現CD3之免疫細胞類型，包括T輔助者細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、T調節細胞(Treg)及NK-T細胞。
本文中所使用之術語“共刺激配體”包括一種在抗原呈遞細胞(例如APC、樹突細胞、B細胞，等)上之分子，其特異結合T細胞上之同源共刺激分子，從而在， 例如由TCR/CD3複合物與裝載肽之MHC分子結合時所提供主信號之外，另外提供可介導T細胞反應之信號，該T細胞反應包括，但不限於增殖、活化、分化，等。共刺激配體可包括，但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L和Fas配體(FasL)、誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體之激動劑或抗體和特異結合B7-H3之配體。除其他外，共刺激配體亦包含特異結合呈遞在T細胞上之共刺激分子的抗體，諸如，但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、與淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異結合CD83之配體。
術語“純化”、“分離”，等係指從含有不欲有之物質(例如污染物)的溶液移出所需物質(例如重組蛋白)或從含有所需物質之溶液中除去不欲有之物質，基本上只留下所需物質。於一些情況中，純化之物質可基本上不含其他物質，例如污染物。如本文所使用之純化可指一系列所產生的不同純度，例如其中該純化之物質組成溶液中所有物質之80%以上，包括85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上，等。本技藝之技術熟習人員將可理解，一般而言，當 決定物質之純度時不考慮溶液本身之成分(例如水或緩衝液或鹽類)。
如本文所使用之術語“治療(treatment、treating)”，等係指獲致所需之藥理學及/或生理學效果。就完全或部分預防疾病或其症狀而言，該效果可為預防性的及/或就部分或完全治癒疾病及/或歸因於該疾病之不利影響而言，該效果可為治療性的。如本文所使用之術語“治療”係涵蓋在哺乳動物中(例如在人類中)之任何疾病的治療，且包括：(a)預防疾病在可能易罹患該疾病，但尚未被診斷已患有該疾病之個體中發作；(b)抑制該疾病，即，阻止其發展；和(c)緩解該疾病，即，使該疾病消退。
本文中可互換使用之術語“個人”、“個體”、“宿主”及“患者”係指哺乳動物，包括，但不限於鼠類(例如大鼠、小鼠)、兔類(例如兔子)、非人靈長類動物、人類、犬、貓、有蹄類動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)，等。
“治療有效量”或“有效量”係指一種試劑之量或二種試劑之組合量在投予哺乳動物或其他個體以用於治療疾病時足以使該等用於疾病之治療生效。該“治療有效量”將根據該作用劑、疾病及其嚴重性、欲接受治療之個體的年齡和體重，等而有所不同。
在進一步描述本發明前，需理解：本發明並不限於所描述之特定實施態樣，因為這些實施態樣當然可能會有所不同。亦可理解的是，本文所使用之術語僅用於 描述特定實施態樣，且不意圖有所限制，因為本發明之範圍僅由所附之申請專利範圍限定。
當提供一個數值範圍時，需理解：除非上下文另有明確說明，在該範圍之上限和下限之間的各中間值(到該下限單位的十分之一)及該陳述範圍中之任何其他陳述之數值或中間值係包含在本發明之內。這些較小範圍之上限和下限可獨立地包括在該較小的範圍內且亦包括在本發明內，受制於該陳述之範圍中任何被具體排除的極限值。當該陳述之範圍包括一或二個極限值時，排除一或二個那些被包括在內之極限值的範圍亦包括在本發明中。
除非另外定義，本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明所屬之技藝中的一般技術人員所普遍理解者相同的含義。雖然亦可使用與本文所描述者類似或相等之任何方法和材料來實行或測試本發明，現在所描述者為較佳之方法和材料。本文所提及之所有出版物均以引用方式併入本文以揭示和描述與該出版物所列出者相關的方法及/或材料。
必須注意的是，除非上下文另有明確說明，如本文和所附之申請專利範圍中所使用之單數型“一(a、an)”和“該”包括複數指稱對象。因此，例如，引用“一多聚體多肽”時係包括多個該等多肽，而引用“該免疫調節多肽”時係包括對一或多個免疫調節多肽及本技藝之技術熟習人士所已知之等同物，等之引用。須進一步指明的是，該申請專利範圍可經制定以排除任何選擇性元件。因此， 此陳述旨在作為使用該等如“單獨地”、“僅”，等與申請專利範圍元件之敘述相關的排除性術語或使用“否定”限制時的前置基礎。
可察知的是，本發明之某些為了清楚起見而在分別之實施態樣的背景下描述的特性亦可在單一實施態樣中組合提供。相反地，本發明之各種為了簡單起見而在單一實施態樣的背景下描述的特性亦可分別提供或在任何合適之次組合中提供。與本發明有關之實施態樣的所有組合被明確涵蓋在本發明中且揭示於本文中，如同各個及每一組合被單獨且明確地揭示。此外，各種實施態樣及其元件的所有次組合亦明確涵蓋在本發明中且揭示於本文中，如同各個及每一次組合被單獨且明確地揭示於本文中。
本文所討論之出版物均僅提供其先於本申請案之申請日前的揭示內容。本文中沒有任何內容可被解釋為承認本發明沒有權利憑藉先前之發明而先於該等出版物。再者，所提供之出版物的日期可能不同於實際出版日期，該實際出版日期可能需要被獨立證實。
發明之詳細描述
本文中描述新穎之基於蛋白質的治療平台，此治療平台重現傳統之免疫反應；用於T細胞活化之人工免疫突觸(synTac)。一種新穎之融合蛋白，其連接共刺激分子與MHC抗原決定部位，以根據MOD分子部分允許精確之T細胞接合及選殖株T細胞活化或抑制。
多聚體多肽
本發明提供多聚體(例如異源二聚體、異源三聚體)多肽。本發明提供本發明之多聚體多肽的多聚蛋白前體。本發明提供前體基因產物，例如本發明之多聚體多肽的多聚蛋白前體以及編碼本發明之多聚體多肽的二或多個多肽鏈的mRNA基因產物。
本發明亦提供重組多肽構建體，其包含(i)結合至第一胺基酸連接子序列之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，該包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵結合(ii)具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。於一實施態樣中，該重組多肽構建體包含
Figure 110108178-A0101-12-0047-265
Figure 110108178-A0101-12-0047-264
Figure 110108178-A0101-12-0048-266
Figure 110108178-A0101-12-0048-267
(SEQ ID NO：6)。
本發明亦提供重組多肽構建體，其包含(i)結合至第一胺基酸連接子序列之候選抗原決定部位肽，該第一胺基酸連接子序列鄰接包含與人天然B2M肽序列相一致之序列的胺基酸序列，其中(i)係藉由一個或一個以上之二硫鍵結合(ii)T細胞調節結構域肽，該T細胞調節結構域肽鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序 列鄰接具有MHC重鏈序列之胺基酸序列，該具有MHC重鏈序列之胺基酸序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。於一實施態樣中，該重組多肽構建體包含
Figure 110108178-A0101-12-0049-268
Figure 110108178-A0101-12-0049-269
Figure 110108178-A0101-12-0050-270
Figure 110108178-A0101-12-0050-271
(SEQ ID NO：7)。
本發明亦提供包含二個本文所描述之重組多肽構建體的蛋白質，該二個重組多肽構建體係藉由一或多個介於彼等分別之免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明亦提供包含二個本文所描述之重組多肽構建體的蛋白質，該二個重組多肽構建體係藉由一或多個介於彼等分別之免疫球蛋白Fc結構域之間的二硫鍵聯結。
本發明亦提供synTac平台：用於靶向T細胞活化之人工免疫突觸。
於一實施態樣中，該β2微球蛋白具有與人β2微球蛋白相同之序列。於一實施態樣中，該組織相容性複合重鏈序列具有與人HLA-A序列相同之序列。於一實施態樣中，該組織相容性複合體重鏈跨膜結構域具有與人主要組織相容性複合體I(MHC I)重鏈跨膜結構域相同之序列。於一實施態樣中，該組織相容性複合體重鏈跨膜結構域具有與人主要組織相容性複合體II(MHC II)重鏈跨膜結構域相同之序列。
本發明亦提供包含多個構建體之組成物。
於一實施態樣中，該候選抗原決定部位肽為8、9、10、11或12個胺基酸的肽。於一實施態樣中，該候選抗原決定部位肽為13、14、15、16或17個胺基酸的肽。於一實施態樣中，該候選抗原決定部位肽為九聚體(長度為9個胺基酸)。
本發明提供包含二或多個(例如2、3、4或更多個)多肽鏈之多聚體多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)選擇性地，免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架，其中該多聚體多肽包含一或多個免疫調節結構域，其中該一或多個免疫調節結構域為：A)在第一多肽之C端；B)在第二多肽之N-端；C)在第二多肽之C端；或D)在第一多肽之C端和在第二多肽之N端。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽包含第一多肽和第二多肽，其中該第一多肽包含(依從胺基端(N端)至羧基端(C端)之順序)：a)抗原決定部位(例如T細胞抗原決定部位)；b)第一主要組織相容性複合體(MHC)多肽和c)免疫調節多肽；且其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：a)第二MHC多肽；和b)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。於其他情況中，本發明之多聚體多肽包含第一多肽和第二多肽，其中該第一多肽依從N端至C端之順序包 含：a)抗原決定部位(例如T細胞抗原決定部位)；和b)第一MHC多肽；且其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：a)免疫調節多肽；b)第二MHC多肽；和c)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一和第二MHC多肽為第I型MHC多肽；例如，於一些情況中，該第一MHC多肽為第I型MHC多肽β2微球蛋白(B2M)多肽且該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈(H鏈)。在其他情況中，該第一和第二MHC多肽為第II型MHC多肽；例如，於一些情況中，該第一MHC多肽為第II型MHC α-鏈多肽，且該第二MHC多肽為第II型MHC β-鏈多肽。於其他情況中，該第一多肽為第II型MHC β-鏈多肽，且該第二MHC多肽為第II型MHC α-鏈多肽。情況中，該多聚體多肽包括二或多個免疫調節多肽。於一些情況中，當本發明之多聚體多肽包括二或多個免疫調節多肽時，該二或多個免疫調節多肽係存在於同一多肽鏈中，且可為串列的。於一些情況中，當本發明之多聚體多肽包括二或多個免疫調節多肽時，該二或多個免疫調節多肽係存在於分開的多肽中。於一些情況中，本發明之多聚體多肽為異源二聚體。於一些情況中，本發明之多聚體多肽為三聚體多肽。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽；及iii)免疫調節結構域。於一些情況中，本發明之 多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)免疫調節結構域。於一些情況中，本發明之多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)免疫調節結構域；和ii)第二MHC多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；和iii)免疫調節結構域；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽。於一些情況中，當本發明之多聚體多肽包含非Ig支架時，該非Ig支架為XTEN多肽、轉鐵蛋白多肽、Fc受體多肽、彈性蛋白樣多肽、絲綢樣多肽或絲綢彈性蛋白樣多肽。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽為單價的。於一些情況中，本發明之多聚體多肽為多價的。例如，根據存在於本發明之多聚體多肽中的Fc多肽，該多聚體多肽可為同型二聚體，其中該多聚體多肽的二個分子係存在於該同型二聚體中，其中該多聚體多肽之二個分子可為，例如經由存在於該二個分子中之Fc多肽彼此連接的二硫化物。另一實例為，本發明之多聚體多肽可包含該多聚體多肽之三、四或五個分子，其中該多聚體多肽之分子可為，例如經由存在於該分子中之Fc多肽彼此連接的 二硫化物。
連接子
本發明之多聚體多肽可包括，例如介於抗原決定部位和MHC多肽之間、介於MHC多肽和免疫調節多肽之間或介於MHC多肽和Ig Fc多肽之間的連接子肽。
合適之連接子(也稱為“間隔子”)可輕易地選出且可為多種合適長度的任一者，諸如從1個胺基酸(例如甘胺酸)至20個胺基酸、從2個胺基酸至15個胺基酸、從3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
示例性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：8)和(GGGS)n(SEQ ID NO：9)，其中n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及本技藝中已知之其他彈性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物均可使用；甘胺酸和絲胺酸二者均為相對非結構化的，因此可以作為成分之間的中性繫鏈。可使用甘胺酸聚合物；甘胺酸甚至較丙胺酸更明顯接近phi-psi空間，且較具有長側鏈之殘基不受限制(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性連接子可 包含胺基酸序列，包括，但不限於：GGSG(SEQ ID NO：10)、GGSGG(SEQ ID NO：11)、GSGSG(SEQ ID NO：12)、GSGGG(SEQ ID NO：13)、GGGSG(SEQ ID NO：14)、GSSSG(SEQ ID NO：15)，等。
於一些情況中，存在於本發明之多聚體多肽的第一多肽中之連接子多肽包括可與存在於本發明之多聚體多肽的第二多肽中之半胱胺酸殘基形成二硫鍵的半胱胺酸殘基。例如，於一些情況中，合適之連接子包含胺基酸序列G C GASGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。
抗原決定部位
存在於本發明之多聚體多肽中的抗原決定部位可具有約4個胺基酸至約25個胺基酸之長度，例如該抗原決定部位可具有4個胺基酸(aa)至10aa、10aa至15aa、15aa至20aa或20aa至25aa。例如，存在於本發明之多聚體多肽中的抗原決定部位之長度可為4個胺基酸(aa)、5aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、15 aa、16 aa、17 aa、18 aa、19 aa、20 aa、21 aa、22 aa、23 aa、24 aa或25 aa。於一些情況中，存在於本發明之多聚體多肽中的抗原決定部位之長度為5個胺基酸至10個胺基酸，例如5aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa或10 aa。
存在於本發明之多聚體多肽中的抗原決定部位與T細胞特異結合，即，該抗原決定部位與抗原決定部 位特異性T細胞特異結合。抗原決定部位特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定部位，但基本上不結合與該參考胺基酸序列相異之抗原決定部位。例如，抗原決定部位特異性T細胞結合具有參考胺基酸序列之抗原決定部位，若結合與該參考胺基酸序列相異之抗原決定部位的話係以低於10-6M、低於10-5M或低於10-4M之親和力與之結合。抗原決定部位特異性T細胞可以至少10-7M、至少10-8M、至少-9M或至少10-10M之親和力結合其特異之抗原決定部位。
抗原決定部位之非限制性實例包括，例如人類親T淋巴細胞病毒-1抗原決定部位LLFGYPVYV(SEQ ID NO：17)；腫瘤抗原抗原決定部位KYQAVTTTL(SEQ ID NO：18)；及胰島特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化性次單位相關蛋白(IGRP)抗原決定部位VYLKTNVFL(SEQ ID NO：19)或TYLKTNLFL(SEQ ID NO：20)。Yang et al.(2006)J.Immunol.176：2781。
MHC多肽
如上述，本發明之多聚體多肽包括MHC多肽。在本發明之目的方面，術語“主要組織相容性複合體(MHC)多肽”意圖包括各種物種之MHC多肽，包括人MHC(亦稱為人白血球抗原(HLA))多肽、囓齒動物(例如小鼠、大鼠，等)MHC多肽和其他哺乳動物物種(例如兔類動物、非人靈長類動物、犬、貓、有蹄類動物，例如馬、 牛、綿羊、山羊，等)，等之MHC多肽。術語“MHC多肽”意圖包括第I型MHC多肽(例如β-2微球蛋白和第I型MHC重鏈)和第II型MHC多肽(例如第II型MHC α多肽及第II型MHC β多肽)。
如上述，於本發明之多聚體多肽的一些實施態樣中，該第一和第二MHC多肽為第I型MHC多肽；例如，於一些情況中，該第一MHC多肽為第I型MHC β2微球蛋白(B2M)多肽，且該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈(H鏈)。於其他情況中，該第一和第二MHC多肽為第II型MHC多肽；例如，於一些情況中，該第一MHC多肽為第II型MHC α鏈多肽且該第二MHC多肽為第II型MHC β-鏈多肽。於其他情況中，該第一多肽為第II型MHC β鏈多肽且該第二MHC多肽為第II型MHC α鏈多肽。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的MHC多肽為人MHC多肽，其中人MHC多肽亦稱為“人白血球抗原”(“HLA”)多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的MHC多肽為第I類HLA多肽，例如β2微球蛋白多肽或第I類HLA重鏈多肽。第I類HLA重鏈多肽包括HLA-A重鏈多肽、HLA-B重鏈多肽、HLA-C重鏈多肽、HLA-E重鏈多肽、HLA-F重鏈多肽及HLA-G重鏈多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的MHC多肽為第II類HLA多肽，例如第II類HLA α鏈或第II類HLA β鏈。第II型MHC多肽包括第II類MCH DP α和β多肽、DM α和β 多肽、DOA α和β多肽、DOB α和β多肽、DQ α和β多肽及DR α和β多肽。
舉例而言，本發明之多聚體多肽的第I型MHC重鏈多肽可包含與第25A圖中所描繪之人HLA-A重鏈多肽的胺基酸序列之胺基酸25-365具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
舉例而言，本發明之多聚體多肽的第I型MHC重鏈多肽可包含與下列人HLA-A重鏈胺基酸序列之胺基酸序列的胺基酸25-365具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、在至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列：
Figure 110108178-A0101-12-0058-273
Figure 110108178-A0101-12-0058-272
(SEQ ID NO：5)。
舉例而言，本發明之多聚體多肽的第I型MHC重鏈多肽可包含與第25B圖中描繪之人HLA-B重鏈多肽的胺基酸序列之胺基酸25-362具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少 99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
另一實例，本發明之多聚體多肽的第I型MHC重鏈多肽可包含與第25C圖中所描繪之人HLA-C重鏈多肽的胺基酸序列之胺基酸25-362具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
另一實例，本發明之多聚體多肽的第I型MHC重鏈多肽可包含與下列胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、在至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列：
Figure 110108178-A0101-12-0059-275
Figure 110108178-A0101-12-0059-274
Figure 110108178-A0101-12-0059-276
(SEQ ID NO：22)。
本發明之多聚體多肽的β2微球蛋白(B2M)多肽可為人B2M多肽、非人靈長類B2M多肽、鼠B2M多肽，等。於一些情況中，B2M多肽包含與第20圖中新描繪之B2M胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或 100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，MHC多肽相對於參考MHC多肽(其中參考MHC多肽可為野生型MHC多肽)包含單一胺基酸取代，其中該單一胺基酸取代係以半胱胺酸(Cys)殘基取代胺基酸。該等半胱胺酸殘基，當存在於本發明之多聚體多肽的第一多肽之MHC多肽中時可與存在於本發明之多聚體多肽的第二多肽鏈中之半胱胺酸殘基形成二硫鍵。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的第一多肽中之第一MHC多肽及/或本發明之多聚體多肽的第二多肽中之第二MHC多肽包括以半胱胺酸取代胺基酸之胺基酸取代，其中在第一MHC多肽中之經取代的半胱胺酸與在第二MHC多肽中之半胱胺酸形成二硫鍵，其中在第一MHC多肽中之半胱胺酸與在第二MHC多肽中之經取代的半胱胺酸一起形成二硫鍵或者其中在第一MHC多肽中之經取代的半胱胺酸與在第二MHC多肽中之經取代的半胱胺酸一起形成二硫鍵。
例如，於一些情況中，在HLA β2-微球蛋白和第I類HLA重鏈中之下列殘基對之一被半胱胺酸所取代：1)B2M殘基12，第I類HLA重鏈殘基236；2)B2M殘基12，第I類HLA重鏈殘基237；3)B2M殘基8，第I類HLA重鏈殘基234；4)B2M殘基10，第I類HLA重鏈殘基235；5)B2M殘基24，第I類HLA重鏈殘基236；6)B2M殘基28，第I類HLA重鏈殘基232；7)B2M殘基 98，第I類HLA重鏈殘基192；8)B2M殘基99，第I類HLA重鏈殘基234；9)B2M殘基3，第I類HLA重鏈殘基120；10)B2M殘基31，第I類HLA重鏈殘基96；11)B2M殘基53，第I類HLA重鏈殘基35；12)B2M殘基60，第I類HLA重鏈殘基96；13)B2M殘基60，第I類HLA重鏈殘基122；14)B2M殘基63，第I類HLA重鏈殘基27；15)B2M殘基Arg3，第I類HLA重鏈殘基Gly120；16)B2M殘基His31，第I類HLA重鏈殘基Gln96；17)B2M殘基Asp53，第I類HLA重鏈殘基Arg35；18)B2M殘基Trp60，第I類HLA重鏈殘基Gln96；19)B2M殘基Trp60，第I類HLA重鏈殘基Asp122；20)B2M殘基Tyr63，第I類HLA重鏈殘基Tyr27；21)B2M殘基Lys6，第I類HLA重鏈殘基Glu232：22)B2M殘基Gln8，第I類HLA重鏈殘基Arg234；23)B2M殘基Tyr10，第I類HLA重鏈殘基Pro235；24)B2M殘基Ser11，第I類HLA重鏈殘基Gln242：25)B2M殘基Asn24，第I類HLA重鏈殘基Ala236；26)B2M殘基Ser28，第I類HLA重鏈殘基Glu232；27)B2M殘基Asp98，第I類HLA重鏈殘基His192；28)B2M殘基Met99，第I類HLA重鏈殘基Arg234。MHC/第I類HLA重鏈之胺基酸編號係參考無信號肽之成熟MHC/第I類HLA重鏈。例如，在第25A圖中所描繪之包括信號肽的胺基酸序列中，Gly120為Gly144；Gln96為Gln120；等。
免疫調節多肽
本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽可為活化性免疫調節多肽或抑制性免疫調節多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽包括單一免疫調節多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽包括二個免疫調節多肽。於一些情況中，該二個免疫調節多肽係串列在一個多肽鏈中。於一些情況中，該二個免疫調節多肽係在分別之多肽鏈中。於一些情況中，該二個免疫調節多肽係在分別之多肽鏈中且為彼此連接之二硫化物。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽為T細胞調節多肽。於一些情況中，該T細胞調節多肽為刺激性(活化性)T細胞調節多肽。於一些情況中，該T細胞調節多肽為抑制性T細胞調節多肽。T細胞調節多肽可為抗體、肽配體、T細胞共刺激性多肽、細胞因子或毒素。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽為特異結合表現在抗原決定部位特異性T細胞之表面上的共刺激性多肽之基於抗體或非基於抗體的識別部分。基於抗體之識別部分包括，例如抗體；保留對抗原之特異性結合的抗體片段，包括，但不限於Fab、Fv、單鏈Fv(scFv)及和Fd片段；嵌合型抗體；人化抗體；單鏈抗體(scAb)、單一結構域抗體(dAb)；單一結構域重鏈抗體；單一結構域輕鏈抗體；等。合適之非基於抗體的識別 部分包括，例如親和體；經基因工程處理之Kunitz結構域；單體(纖連蛋白(adnectin))；抗運載蛋白(anticalin)；適體(aptamer)；經設計之錨蛋白(ankyrin)重複結構域(DARPin)；富含半胱胺酸之多肽(例如富含半胱胺酸之打結素(knottin)肽)的結合位點；高親和性多聚體(avimer)；afflin；等。基於抗體的或非基於抗體之識別部分特異性結合表現在抗原決定部位特異性T細胞之表面上的共刺激性多肽，其中該等共刺激性多肽包括，但不限於CTLA4、PD1、ICOS、OX40、CD20及4-1BB。該表現在抗原決定部位特異性T細胞之表面上的共刺激性多肽為本技藝所已知。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽為T細胞共刺激性多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽為T細胞共刺激性多肽且為腫瘤壞死因子(TNF)超家族之成員；例如FasL多肽、41BBL多肽、CD40多肽、OX40L多肽、CD30L多肽、CD70多肽，等。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的免疫調節多肽為T細胞共刺激性多肽且為免疫球蛋白(Ig)超家族的成員；例如CD7多肽、CD86多肽、ICAM多肽，等。
本發明之多聚體多肽的合適之免疫調節多肽包括，但不限於CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、ICAM、PD-L1、FasL及PD-L2。本發明之多聚體多肽的合適之免疫調節多肽包括，例如CD7、 CD3OL、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4及HVEM。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為PD-L1多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的PD-L1多肽包含與第26A或26B圖中所描繪之PD-L1胺基酸序列的胺基酸19-290具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性之胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為4-1BBL多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的4-1BBL多肽包含與第27圖中所描繪之4-1BBL胺基酸序列的胺基酸50-254具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為ICOS-L多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的ICOS-L多肽包含與第28圖中所描繪之ICOS-L胺基酸序列的胺基酸19-302具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為OX40多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的OX40多肽包含與第29圖中所描繪之OX40L胺 基酸序列的胺基酸1-183具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為PD-L2多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的PD-L2多肽包含與第30圖中所描繪之PD-L2胺基酸序列的胺基酸20-273具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為CD80(B7-1)多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的CD80多肽包含與第31圖中所描繪之CD80胺基酸序列的胺基酸35-288具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為CD86多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的CD86多肽包含與第32圖中所描繪之CD86胺基酸序列的胺基酸31-329具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽的T細胞調節多肽為FasL多肽。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的FasL多肽包含與第33圖中所描繪之FasL胺基 酸序列的胺基酸1-281具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
可用於本發明中之另外的T細胞調節結構域(MOD)包括天然存在或合成之人基因產物(蛋白質)、針對人基因產物之親和試劑(例如抗體、抗體片段、單鏈Fv、適體、奈米抗體)，包括，但不限於來自典型和非典型(例如FGF2、IL1、S100A4)分泌機制之所有分泌蛋白及藉由天然存在之基因編碼的蛋白質節段(單一或多個跨膜)或轉譯後修飾(諸如GPI鍵聯)錨定之所有細胞表面蛋白質的胞外結構域。針對細胞表面聚醣或其他轉譯後修飾(例如硫酸化)之任何天然存在或合成之親和試劑(例如抗體、抗體片段、單鏈Fv、適體、奈米抗體、凝集素(lectin)，等)。實例包括，但不限於TNF/TNFR族之成員(OX40L、ICOSL、FASL、LTA、LTB TRAIL、CD153、TNFSF9、RANKL、TWEAK、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、CD40LG、CD70)或針對TN/TNFR族成員之親和試劑；免疫球蛋白超家族之成員(VISTA、PD1、PD-L1、PD-L2、B71、B72、CTLA4、CD28、TIM3、CD4、CD8、CD19、T細胞受體鏈、ICOS、ICOS配體、HHLA2、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)、BTLA、B7-H3、B7-H4、CD3、CD79a、CD79b、IgSF CAMS(包括CD2、CD58、CD48、CD150、CD229、CD244、ICAM-1)、白血球免疫球蛋白樣受體(LILR)、殺手細胞免疫球蛋 白樣受體(KIR))、凝集素超家族成員、選擇素(selectin)、細胞因子/趨化因子和細胞因子/趨化因子受體、生長因子和生長因子受體)、黏連分子(整合素(integrin)、纖連蛋白、鈣黏著蛋白(cadherin))或多跨膜蛋白之胞外結構域或針對免疫球蛋白超家族及表列之基因產物的親和試劑。此外，這些基因產物之活性同系物/直系同源物包括，但不限於病毒序列(例如CMV、EBV)、細菌序列、真菌序列、真核病原體(例如血吸蟲(Schistosoma)、瘧原蟲(Plasmodium)、巴貝斯蟲(Babesia)、艾美球蟲(Eimeria)、泰勒蟲(Theileria)、弓形蟲(Toxoplasma)、內阿米巴(Entamoeba)、利什曼原蟲(Leishmania)和錐蟲(Trypanosoma))及哺乳動物來源之編碼區。此外，MOD可包含針對人基因產物之小分子藥物。
Fc多肽
本發明之多聚體多肽包含Fc多肽或其他合適之支架多肽。
合適之支架多肽包括基於抗體之支架多肽和非基於抗體之支架。非基於抗體之支架包括，例如白蛋白、XTEN(延伸之重組體)多肽、轉鐵蛋白、Fc受體多肽、彈性蛋白樣多肽(參見，例如Hassouneh et al.(2012)Methods Enzymol.502：215；例如包含(Val-Pro-Gly-X-Gly)之五肽重複單位的多肽，其中X為脯胺酸以外之任何胺基酸)、白蛋白結合多肽、絲綢樣多肽(參見，例如Valluzzi et al.(2002)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.357：165)、絲綢彈性蛋白樣多肽(SELP；參見，例如Megeed et al.(2002)Adv Drug Deliv Rev.54：1075)，等。合適之XTEN多肽包括，例如那些揭示於WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO2007/103515、US 2010/0189682及US 2009/0092582中；亦參見Schellenberger et al.(2009)Nat Biotechnol.27：1186)。合適之白蛋白多肽包括，例如人血清白蛋白。
於一些情況中，本發明之合適的支架多肽將為半衰期延長的多肽。因此，於一些情況中，相較於缺乏該支架多肽之對照組多聚體多肽，合適之支架多肽增加多聚體多肽之活體內半衰期(例如血清半衰期)。例如，於一些情況中，相較於缺乏該支架多肽之對照組多聚體多肽，支架多肽使該多聚體多肽之活體內半衰期(例如血清半衰期)增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或超過100倍。舉例而言，於一些情況中，相較於缺乏該Fc多肽之對照組多聚體多肽，Fc多肽使該多聚體多肽之活體內半衰期(例如血清半衰期)增加至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約50%、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約100倍或超過100倍。
本發明之多聚體多肽的Fc多肽可為人IgG1 Fc、人IgG2 Fc、人IgG3 Fc、人IgG4 Fc，等。於一些情況中，該Fc多肽包含與第24A-C圖中所描繪之Fc區的胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該Fc區包含與第24A圖中所描繪之人IgG1 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該Fc多肽包含與第24A圖中所描繪之人IgG2 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列；例如，該Fc多肽包含與第24A圖中所描繪之人IgG2 Fc多肽的胺基酸99-325具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該Fc多肽包含與第24A圖中所描繪之人IgG3 Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列；例如，該Fc多肽包含與第24A圖中所描繪之人IgG3 Fc多肽的胺基酸19-246具有至少約70%、至少約75%、 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該Fc多肽包含與第24B圖中所描繪之人IgM Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列；例如，該Fc多肽包含與第24B圖中所描繪之人IgM Fc多肽的胺基酸1-276具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。於一些情況中，該Fc多肽包含與第24C圖中所描繪之人IgA Fc多肽具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列；例如，該Fc多肽包含與第24C圖中所描繪之人IgA Fc多肽的胺基酸1-234具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
另外之多肽
除了上述者外，本發明之多聚體多肽的多肽鏈可包括一或多個多肽。合適之另外的多肽包括抗原決定部位標記物和親和性結構域。該一或多個另外之多肽可包 含在本發明之多聚體多肽的多肽鏈之N端、本發明之多聚體多肽的多肽鏈之C端或本發明之多聚體多肽的多肽鏈之內部。
抗原決定部位標記物
合適之抗原決定部位標記物包括，但不限於血球凝集素(HA；例如YPYDVPDYA(SEQ ID NO：23)；FLAG(例如DYKDDDDK(SEQ ID NO：24)；c-myc基因(例如EQKLISEEDL；SEQ ID NO：25)，等。
親和性結構域
親和性結構域包括可與結合伴侶交互作用之肽序列，例如，諸如固定在固體支持物上，用於鑑定或純化者。編碼數個連續單一胺基酸(諸如組胺酸)之DNA序列當融合至該表現出之蛋白質時，可藉由結合至樹脂交換柱(諸如鎳瓊脂糖)之高親和力而用於單步驟純化該重組蛋白。示例性親和性結構域包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO：26)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO：27)、C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：25)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：24)、StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：28)、血球凝集素，例如HA標記物(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：23)、麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、硫氧還原蛋白、纖維素結合結構域、RYIRS(SEQ ID NO：30)、Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO：31)、幾丁質結合結構域、S-肽、T7 肽、SH2結構域、C端RNA標記物、WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO：32)、金屬結合結構域，例如鋅結合結構域或鈣結合結構域，諸如來自鈣結合蛋白者，例如鈣調蛋白(calmodulin)、肌鈣蛋白C(troponin C)、鈣調磷酸酶B(calcineurin B)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain)、恢復蛋白(recoverin)、S-調節蛋白(S-modulin)、視錐蛋白(visinin)、VILIP、神經鈣蛋白(neurocalcin)、海馬鈣蛋白(hippocalcin)、神經元鈣傳感蛋白(frequenin)、鈣收縮蛋白(caltractin)、鈣蛋白酶大次單位(calpain large-subunit)、S100蛋白、小白蛋白(parvalbumin)、鈣結合蛋白D9K(calbindin D9K)、鈣結合蛋白D28K(calbindin D28K)及鈣視網膜蛋白(calretinin)、內含肽(inteins)、生物素(biotin)、鏈黴親和素(streptavidin)、MyoD、Id、白胺酸拉鍊序列(leucine zipper sequence)及麥芽糖結合蛋白(maltose binding protein)。
修飾
本發明之多聚體多肽可包括一或多個共價連接該多聚體多肽之非多肽部分。合適之非多肽部分包括，例如生物相容性脂肪酸及其衍生物；羥烷基澱粉(HAS)，例如羥乙基澱粉(HES)；聚(乙二醇)；透明質酸(HA)；合成肝素(heparosan)聚合物(HEP)；基於磷醯膽鹼之聚合物；葡聚醣；聚唾液酸(PSA)；等。於一些情況中，與不 包含該非多肽部分之對照組多聚體多肽比較，該非多肽部分增加多聚體多肽之活體內半衰期。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽包括可檢測之標記。合適之可檢測的標記包括放射性同位素，諸如123I(碘)、18F(氟)、99Tc(鍀)、111In(銦)、67Ga(鎵)、放射活性Gd同位素(153Gd)；造影劑，諸如釓(Gd)、鏑和鐵；產生可檢測之產物的酶(例如螢光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶，等)；螢光蛋白；生色蛋白，染料(例如異硫氰酸螢光素、若丹明、藻紅蛋白(phycoerythrin)，等)；螢光發射金屬，例如152Eu或其他鑭系元素；化學發光化合物，例如魯米諾(luminol)、異魯米諾、吖啶鹽，等；生物發光化合物；等。
活性
根據存在於本發明之多聚體多肽中的免疫調節(“MOD”)多肽之性質，該多聚體多肽可活化或抑制靶的T細胞。本發明之多聚體多肽選擇性地活化或抑制特異於存在於該多聚體多肽中之抗原決定部位的靶的T細胞。“靶的T細胞”包括抗原決定部位特異性CD4+ T細胞、抗原特異性CD8+ T細胞。於一些情況中，該靶的CD4+ T細胞為輔助性T細胞(例如Th1、Th2或Th17細胞)。於一些情況中，該靶的CD4+ T細胞為CD4+/CD25+/FoxP3+調節性T(Treg)細胞。於一些情況中，該靶的T細胞為CD8+ T細胞且為細胞毒性T細胞。於一些情況中，該靶的T細胞 為記憶性T細胞，其可為CD4+ T細胞或CD8+ T細胞，其中記憶性T細胞通常為CD45RO+。於一些情況中，該靶的T細胞為NK-T細胞。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽增進T細胞歸巢和運輸。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時會增加該靶的T細胞外滲到治療部位。於一些情況中，相對於該未與本發明之多聚體多肽接觸之靶的T細胞的外滲水準，當本發明之多聚體多肽與靶的T細胞接觸時可使外滲到治療部位之靶的T細胞增加至少10%、至少15%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍。增加之外滲可增加在治療部位之T細胞的數目。於一些情況中，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可增加在治療部位之T細胞的數目。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽增加由靶的T細胞表現之一或多種介導或調節靶的T細胞運輸淋巴細胞之蛋白質的表現。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可增加在靶的T細胞中之一或多種黏附分子及/或趨化因子受體分子的量。例如，於一些情況中，與由未接觸本發明之多聚體多肽的靶的T細胞製造之黏附分子及/或趨化因子受體分子的量相比較時，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可使 一或多種黏附分子及/或趨化因子受體之表現增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍。黏附分子之實例包括由CD8 T細胞製造之黏附分子，其中該等黏附分子之實例包括，但不限於CD44、LFA-1及VLA-4。趨化因子受體之實例包括由CD8 T細胞製造之趨化因子受體，其中該等趨化因子受體之實例包括，但不限於CCR5、CCR7和CXCR3。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽導致能對先前經驗之抗原決定部位產生快速之細胞毒性反應的記憶性T細胞產生。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時導致產生包含0.5%或更多之抗原特異性T細胞匯集體的記憶性T細胞。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時導致產生包含0.5%或更多、1%或更多、2%或更多、3%或更多、4%或更多、5%或更多、10%或更多、15%或更多或20%或更多之抗原特異性T細胞匯集體的記憶性T細胞。記憶性T細胞之細胞表面標記的實例為CD45RO。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽增加靶的T細胞增殖。例如，於一些情況中，相較於未與本發明之多聚體多肽接觸之靶的T細胞的增殖情況，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時能使靶的T細胞之增殖增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少2倍、至少 5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽增加T細胞對靶的細胞之細胞毒性活性。例如，於一些情況中，相較於未與本發明之多聚體多肽接觸之T細胞對該靶的細胞的細胞毒性活性，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可使該T細胞對靶的細胞之細胞毒性活性增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍。T細胞之靶的包括經病毒感染之細胞、癌細胞，等。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽可增加靶的T細胞製造細胞因子。例如，於一些情況中，相較於未與本發明之多聚體多肽接觸之靶的T細胞所製造之細胞因子的量，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可使靶的T細胞製造之細胞因子量增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少2倍、至少5倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或超過100倍。細胞因子之實例包括由Th1細胞製造之細胞因子，例如IL-2、IFN-γ及TNF-α；由Th17細胞製造之細胞因子，例如IL-17、IL-21和IL-22；由Treg細胞製造之細胞因子，例如TGF-β、IL-35和IL-10。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽抑制靶的T細胞製造細胞因子。例如，於一些情況中，相較於未與本發明之多聚體多肽接觸之靶的T細胞所製造之細胞因子的量，本發明之多聚體多肽當與靶的T細胞接觸時可抑制靶的T細胞製造細胞因子達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或超過90%。細胞因子之實例包括由Th2細胞製造之細胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
示例性實施態樣
本發明之多聚體多肽的非限制性實例包括：
1)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHCβ2微球蛋白多肽；和iii)4-BBL多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多 肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
2)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)PD-L1多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中 之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
3)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)ICOS-L多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第 I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
4)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)OX40L多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包 括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
5)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)CD80多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情 況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
6)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)CD86多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該 Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
7)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)PD-L2多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽 為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
8)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)4-BBL多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc 多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
9)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)PD-L1多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC 多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
10)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)ICOS-L多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多 肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
11)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)OX40L多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和 性結構域；
12)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)CD80多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
13)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)CD86多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
14)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽， 其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)PD-L2多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
15)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位； ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)FasL多肽；ii)第I型MHC重鏈多肽；和iii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
16)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之4- BBL多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
17)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之PD-L1多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序 包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
18)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之ICOS-L多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一 些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
19)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之OX40L多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化 物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
20)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之CD80多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和 β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
21)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之CD86多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該 第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
22)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之PD-L2；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽 中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
23)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)二個串列之FasL多肽；及b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽 中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
24)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一4-1BBL多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二4-1BBL多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多 肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二4-1BBL多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
25)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一PD-L1多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二PD-L1多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽 和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二PD-L1多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
26)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一ICOS-L 多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二ICOS-L多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代成)該第一和第二ICOS-L多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含 一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
27)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一OX40L多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二OX40L多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二OX40L多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該 Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
28)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一CD80多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二CD80多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一 多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二CD80多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
29)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一CD86多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二CD86多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺 酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二CD86多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
30)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)CD80多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含CD86多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物， 其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該CD80多肽和CD86多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
31)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一PD-L2多肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二PD-L2多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽 和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二PD-L2多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/或親和性結構域；
32)一種多聚體多肽，其包含：a)第一多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)T細胞抗原決定部位；ii)第I型MHC β2微球蛋白多肽；和iii)第一FasL多 肽；b)第二多肽，其依從N端至C端之順序包含：i)第I型MHC重鏈多肽；和ii)Ig Fc多肽；及c)第三多肽，其包含第二FasL多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為彼此連接之二硫化物；且該第一多肽和第三多肽為彼此連接之二硫化物。於一些情況中，該第一多肽包含一介於該抗原決定部位和β2微球蛋白多肽之間的連接子多肽。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該連接子多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該第一多肽和第二多肽為二硫化物，其經由存在於該第I型MHC β2微球蛋白多肽中之半胱胺酸殘基及存在於該第I型MHC重鏈多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接；於某些這些實施態樣中，該第I型MHC β2微球蛋白多肽及/或第I型MHC重鏈多肽包括胺基酸取代以提供參與該二硫鍵之半胱胺酸。於一些情況中，該第一多肽和第三多肽為二硫化物，其經由存在於(或經取代入)該第一和第二FasL多肽中之半胱胺酸殘基彼此連接。於一些情況中，該IgFc多肽為IgG1 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG2 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG3 Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，係使用第II型MHC多肽代替第I型MHC多肽。於一些情況中，該多聚體多肽在Fc多肽之C端包含一抗原決定部位標記物及/ 或親和性結構域。
多聚蛋白前體
本發明提供一種如下述之重組多肽，其包含鄰接候選抗原決定部位肽之與第一B2M前導序列相一致的胺基酸序列，該候選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接T細胞調節結構域肽序列，該T細胞調節結構域肽序列鄰接第三胺基酸連接子，該第三胺基酸連接子鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。
於一實施態樣中，該第一胺基酸可為具有50個胺基酸或更少至最少具有5個胺基酸的任何胺基酸序列。於一實施態樣中，該第二胺基酸連接子可為具有70個胺基酸或更少至最少具有5個胺基酸的任何胺基酸序列。於一實施態樣中，該第三胺基酸連接子可為病毒2A肽或具有已知之蛋白酶裂解能力的肽(例如於非限制性實施態樣中，弗林蛋白酶(furin)裂解位點、煙草蝕斑(Tobacco Etch)病毒[TEV]序列、Precission蛋白酶位點或凝血酶蛋白酶)。於一實施態樣中，該第一胺基酸包含 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：1)。於一實施態樣中，該第二胺基酸連接子包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)。於一實施態樣中，該第三胺基酸連接子包含SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：3)。
本發明亦提供一種如下述之重組多肽，其包含鄰接候選抗原決定部位肽之與第一B2M前導序列相一致的胺基酸序列，該候選抗原決定部位肽鄰接第一胺基酸連接子序列，該第一胺基酸連接子序列鄰接與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列，該與人天然B2M肽序列相一致之胺基酸序列鄰接第二胺基酸連接子序列，該第二胺基酸連接子序列鄰接第二B2M前導序列，該第二B2M前導序列鄰接T細胞調控結構域肽序列，該T細胞調控結構域肽序列鄰接第三胺基酸連接子序列，該第三胺基酸連接子序列鄰接與MHC重鏈相一致之胺基酸序列，該與MHC重鏈相一致之胺基酸序列鄰接與免疫球蛋白Fc結構域相一致之胺基酸序列。
連接子
於一實施態樣中，該第一胺基酸可為具有50個胺基酸或更少至最少具有5個胺基酸的任何胺基酸序列。於一實施態樣中，該第二胺基酸連接子可為具有70個胺基酸或更少至最少具有5個胺基酸的任何胺基酸序列。於一實施態樣中，該第三胺基酸連接子可為病毒2A肽或具有已知之蛋白酶裂解能力的肽(例如於非限制性實 施態樣中，弗林蛋白酶裂解位點、煙草蝕斑病毒[TEV]序列、Precission蛋白酶位點或凝血酶蛋白酶)。於一實施態樣中，該第一胺基酸包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：1)。於一實施態樣中，該第二胺基酸連接子包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)。於一實施態樣中，該第三胺基酸連接子包含SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：3)。
於該重組多肽之一實施態樣中，該第三胺基酸連接子為自裂解的。於該重組多肽之一實施態樣中，該第二胺基酸連接子為自裂解的。於該重組多肽之一實施態樣中，該自裂解肽為病毒2A肽或具有其序列。於一實施態樣中，該病毒2A肽為豬捷申病毒-1(P2A)、***病毒(F2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna virus)(T2A)、馬A型鼻炎病毒(E2A)或病毒性豬捷申病毒-1(P2A)肽或具有其中一者之序列。或者，此亦可以二個完全除去該2A序列之分開的質粒(或病毒)形式投遞。
該蛋白水解可裂解之連接子可包括一蛋白酶識別序列，此蛋白酶識別序列可被選自由下列所組成之群組的蛋白酶識別：丙胺酸羧基肽酶、蜜環菌蝦紅素(Armillaria mellea astacin)、細菌白胺醯胺基肽酶、癌症促凝血質、組織蛋白酶B(cathepsin B)、梭菌蛋白酶(clostripain)、胞漿丙胺醯胺基肽酶(cytosol alanyl aminopeptidase)、彈性蛋白酶、內蛋白酶Arg-C、腸激酶、胃亞蛋白酶(gastricsin)、明膠酶、Gly-X羧基肽酶、 甘胺醯內肽酶、人鼻病毒3C蛋白酶、皮蠅素C(hypodermin C)、IgA特異性絲胺酸內肽酶、白胺醯胺基肽酶、白胺醯內肽酶、lysC、溶酶體pro-X羧基肽酶、賴胺醯胺基肽酶、甲硫醯胺基肽酶、黏液菌(myxobacter)、苯乙肼裂解酶(nardilysin)、胰內肽酶E、細小核糖核酸病毒內肽酶2A(picornain 2A)、細小核糖核酸病毒內肽酶3C、前內肽酶、脯胺醯胺基肽酶、前蛋白轉化酶I、前蛋白轉化酶II、russellysin、酵母胃蛋白酶(saccharopepsin)、***凝固蛋白酶(semenogelase)、T-纖溶酶原活化劑、凝血酶、組織激肽釋放酶(kallikrein)、煙草蝕斑病毒(TEV)、批膜病毒素(togavirin)、色胺醯胺基肽酶、U-纖溶酶原活化劑、V8、蛇毒絲胺酸蛋白酶A(venombin A)、蛇毒絲胺酸蛋白酶AB及Xaa-PRO胺基肽酶。於一些情況中，該蛋白水解可裂解連接子可包括可被宿主酶識別之蛋白酶識別序列，例如由該宿主細胞天然產生之酶。
例如，該蛋白水解可裂解之連接子可包含基質金屬蛋白酶裂解位點，例如用於選自下列群組之MMP的裂解位點：膠原蛋白酶-1、膠原蛋白酶-2和膠原蛋白酶-3(MMP-1、MMP-8和MMP-13)、明膠酶A和B(MMP-2和-9)、溶基質素(stromelysin)1、2和3(MMP-3、MMP-10和MMP-11)、基質溶解因子(matrilysin)(MMP-7)和膜金屬蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。例如，MMP-9之裂解序列為Pro-X-X-Hy(其中X代表任意殘基；Hy為疏水殘 基)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO：33)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO：21)。蛋白酶裂解位點之另一實例為纖溶酶原活化子裂解位點，例如uPA或組織纖維蛋白溶酶原活化子(tPA)裂解位點。uPA和tPA之裂解序列的特殊實例包括包含Val-Gly-Arg之序列。可包含在蛋白水解可裂解連接子中之蛋白酶裂解位點的另一實例為煙草蝕斑病毒(TEV)蛋白酶裂解位點，例如ENLYTQS(SEQ ID NO：34)，其中該蛋白酶係在麩胺醯胺和絲胺酸之間裂解。可包含在蛋白水解可裂解之連接子中的蛋白酶裂解位點之另一實例為腸激酶裂解位點，例如DDDDK(SEQ ID NO：35)，其中裂解係發生在賴胺酸殘基之後。可包含在蛋白水解可裂解之連接子中的蛋白酶裂解位點之另一實例為凝血酶裂解位點，例如LVPR(SEQ ID NO：36)。可包含在蛋白水解可裂解之連接子中的蛋白酶裂解位點之另一實例為弗林蛋白酶裂解位點，例如Arg-X-(Arg/Lys)-Arg，其中X為任何胺基酸。另外之包含蛋白酶裂解位點之合適的連接子包括包含一或多個下列胺基酸序列之連接子：LEVLFQGP(SEQ ID NO：37)，可被PreScission蛋白酶(一種融合蛋白，其包含人鼻病毒3C蛋白酶和麩胱甘肽-S-轉移酶；Walker et al.(1994)Biotechnol.12：601)裂解；凝血酶裂解位點，例如CGLVPAGSGP(SEQ ID NO：38)；SLLKSRMVPNFN(SEQ ID NO：39)或SLLIARRMPNFN(SEQ ID NO：40)，可被組織蛋白酶B裂解； SKLVQASASGVN(SEQ ID NO：41)或SSYLKASDAPDN(SEQ ID NO：42)，可被Epstein-Barr病毒蛋白酶裂解；RPKPQQFFGLMN(SEQ ID NO：43)，可被MMP-3(溶基質素)裂解；SLRPLALWRSFN(SEQ ID NO：44)，可被MMP-7(基質溶解因子)裂解；SPQGIAGQRNFN(SEQ ID NO：45)，可被MMP-9裂解；DVDERDVRGFASFL(SEQ ID NO：46)，可被嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)樣MMP裂解；SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO：47)，可被基質金屬蛋白酶2(MMP-2)裂解；SLLIFRSWANFN(SEQ ID NO：48)，可被組織蛋白酶(cathespin)L裂解；SGVVIATVIVIT(SEQ ID NO：49)，可被組織蛋白酶D裂解；SLGPQGIWGQFN(SEQ ID NO：50)，可被基質金屬蛋白酶1裂解(MMP-1)；KKSPGRVVGGSV(SEQ ID NO：51)，可被尿激酶型纖溶酶原活化子裂解；PQGLLGAPGILG(SEQ ID NO：52)，可被第1型膜基質金屬蛋白酶(MT-MMP)裂解；HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT(SEQ ID NO：53)，可被溶基質素3(或MMP-11)、嗜熱菌蛋白酶、纖維母細胞膠原蛋白酶及溶基質素-1裂解；GPQGLAGQRGIV(SEQ ID NO：54)，可被基質金屬蛋白酶13(膠原蛋白酶-3)裂解；GGSGQRGRXALE(SEQ ID NO：55)，可被組織型纖溶酶原活化子裂解(tPA)；SLSALLSSDIFN(SEQ ID NO：56)，可被人***特異性抗原裂解；SLPRFKIIGGFN(SEQ ID NO：57)，可被激肽釋放酶(hK3)裂解；SLLGIAVPGNFN(SEQ ID NO：58)，可 被中性粒細胞彈性蛋白酶裂解；和FFKNIVTPRTPP(SEQ ID NO：59)，可被鈣蛋白酶(鈣活化之中性蛋白酶)裂解。合適之蛋白水解可裂解連接子之另外的實例包括：1)ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：60)；2)EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：61)；3)QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：62)；和4)VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：63)。合適之蛋白水解可裂解連接子之另外的實例包括：1)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64)；2)GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：65)；3)GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：66)；和4)GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：67)。
合適之連接子的實例包括2A連接子(例如T2A)、2A樣連接子或彼等之功能等效物及彼等之組合。於一些實施態樣中，該連接子包括細小核糖核酸病毒2A樣連接子、豬捷申病毒(P2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒(T2A)之CHYSEL序列，及彼等之組合、變異體和功能等效物。於其他實施態樣中，該連接子序列可包含Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly2A-Pro2B基序，此導致介於2A甘胺酸和2B脯胺酸之間的裂解。在本發明之目的方面，P2A(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64))、T2A(GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：65))、E2A(GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：66))和F2A(GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：67))可被視為是“蛋白裂解位點”或“核糖體跳躍信號”(CHYSEL)。參見，例如Kim et al.(2011)PLoS ONE 6：e18556。產生為二條多肽鏈形式之編碼多肽的機制可能為該連接子之自行裂解、核糖體跳躍或轉譯分流。無論機制為何，本發明之多聚體多肽中之至少二條多肽鏈可使用P2A、T2A、E2A或F2A序列製造。合適之連接子包括包含諸如下列胺基酸序列的多肽：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64)、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：65)、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：66)、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：67)或相對於SEQ ID NO：64-67所列之胺基酸序列具有1至5個胺基酸取代的胺基酸序列(例如相對於SEQ ID NO：64-67所列之胺基酸序列具有1至5個保守型胺基酸取代之胺基酸序列)。合適之連接子包括包含諸如下列胺基酸序列的多肽：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64)、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：65)、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：66)、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：67)或相對於SEQ ID NO：64-67所列之胺基酸序列具有1至10個胺基酸取代的胺基酸序列(例如相對於SEQ ID NO：64-67所列之胺基酸序列具有1至10個保守型胺基酸取代之胺基酸序列)。
抗原決定部位
於該重組多肽之一實施態樣中，該候選抗原決定部位包含7-20個胺基酸。於該重組多肽之一實施態樣中，該抗原決定部位肽為用於第I型MHC之5-20個胺基酸。於一實施態樣中，該抗原決定部位肽為用於第I型MHC之8-11個胺基酸。於一實施態樣中，該抗原決定部位肽為用於第II型MHC之5-40個胺基酸。於一實施態樣中，該抗原決定部位肽為用於第II型MHC之13-17個胺基酸。於一實施態樣中，該抗原決定部位肽為任何天然產生或突變之人序列或為任何由病原體衍生之序列。
MHC多肽
於該重組多肽之一實施態樣中，該第一及/或第二B2M前導序列具有人B2M前導序列之序列。
於一些情況中，前導肽包含與下列人B2M前導序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列：MSRSVALAVLALLSLSGLEA(SEQ ID NO：68)。
於一些情況中，如本文所描述之B2M前導序列可為哺乳動物B2M前導序列，包括，但不限於，例如人B2M前導序列、靈長類動物B2M前導序列、囓齒動物B2M前導序列，等。於一些情況中，如本文所描述之B2M前導序列包含與第20圖中所描繪之B2M前導序列之 一具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
於一實施態樣中，該B2M包含下列序列：
Figure 110108178-A0101-12-0119-277
Figure 110108178-A0101-12-0119-278
Figure 110108178-A0101-12-0119-279
(SEQ ID NO：4)。
於一些情況中，B2M多肽包含與第20圖中所描繪之B2M胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%之序列同一性的胺基酸序列。
於該重組多肽之一實施態樣中，該MHC重鏈為人MHC重鏈。於該重組多肽之一實施態樣中，該MHC重鏈為第I型MHC分子。示例性第I型MHC重鏈包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K和HLA-L之α鏈。於該重組多肽之一實施態樣中，該MHC重鏈為HLA-A02：01。於一實施態樣中，該HLA為HLA-A02。於一實施態樣中，該HLA-A02包含序列：
Figure 110108178-A0101-12-0119-280
Figure 110108178-A0101-12-0119-281
Figure 110108178-A0101-12-0120-282
Figure 110108178-A0101-12-0120-283
(SEQ ID NO：5)。
於該重組多肽之一實施態樣中，該MHC重鏈為第II型MHC分子。示例性第II型MHC重鏈包括HLA-D所具者。
於該重組多肽之一實施態樣中，該重組多肽進一步在其人天然B2M肽序列及其重鏈序列中包含突變以使該介於B2M肽序列和重鏈序列之間的二硫鍵作用。
於該重組多肽之一實施態樣中，該重組多肽重鏈序列為HLA且該二硫鍵連接下列殘基對中之一者：
B2M殘基12，HLA殘基236；
B2M殘基12，HLA殘基237；
B2M殘基8，HLA殘基234；
B2M殘基10，HLA殘基235；
B2M殘基24，HLA殘基236；
B2M殘基28，HLA殘基232；
B2M殘基98，HLA殘基192；
B2M殘基99，HLA殘基234；
B2M殘基3，HLA殘基120；
B2M殘基31，HLA殘基96；
B2M殘基53，HLA殘基35；
B2M殘基60，HLA殘基96；
B2M殘基60，HLA殘基122；
B2M殘基63，HLA殘基27；
B2M殘基Arg3，HLA殘基Gly120；
B2M殘基His31，HLA殘基Gln96；
B2M殘基Asp53，HLA殘基Arg35；
B2M殘基Trp60，HLA殘基Gln96；
B2M殘基Trp60，HLA殘基Asp122；
B2M殘基Tyr63，HLA殘基Tyr27；
B2M殘基Lys6，HLA殘基Glu232；
B2M殘基Gln8，HLA殘基Arg234；
B2M殘基Tyr10，HLA殘基Pro235；
B2M殘基Ser11，HLA殘基Gln242；
B2M殘基Asn24，HLA殘基Ala236；
B2M殘基Ser28，HLA殘基Glu232；
B2M殘基Asp98，HLA殘基His192；和
B2M殘基Met99，HLA殘基Arg234
(B2M和HLA序列參見SEQ ID NO：4和5)。
於該重組多肽之一實施態樣中，該重鏈序列為HLA且其中該二硫鍵連接下列殘基對中之一者：
第一連接子位置Gly2，重鏈(HLA)位置Tyr84；
輕鏈(B2M)位置Arg12，HLA Ala236；及/或
B2M殘基Arg12，HLA殘基Gly237。
Fc多肽
於該重組多肽之一實施態樣中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG Fc結構域。於該重組多肽之一實施態樣中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgA Fc結構域。於該重組多肽之一實施態樣中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgM Fc結構域。於該重組多肽之一實施態樣中，該免疫球蛋白Fc結構域為人免疫球蛋白Fc結構域。於該重組多肽之一實施態樣中，該免疫球蛋白Fc結構域為IgG1 Fc結構域。
免疫調節多肽
於該重組多肽之一實施態樣中，該T細胞調節結構域為抑制性結構域。
於該重組多肽之一實施態樣中，該T細胞調節結構域為刺激性結構域。
於該重組多肽之一實施態樣中，該T細胞調節結構域為抗體和抗體片段、肽配體、T細胞共刺激肽、細胞因子或毒素。
於該重組多肽之一實施態樣中，該T細胞調節結構域包括PD-L1肽、PD-L1肽之Ig可變結構域，該T細胞調節結構域包含4-1BBL，該T細胞調節結構域包含B7-1W88A或者該T細胞調節結構域包含抗CD28單鏈Fv。
可用於本發明中之另外的T細胞調節結構域(MOD)包括天然存在或合成之人基因產物(蛋白質)、針對 人基因產物之親和試劑(例如抗體、抗體片段、單鏈Fv、適體、奈米抗體)，包括，但不限於來自典型和非典型(例如FGF2、IL1、S100A4)分泌機制之所有分泌蛋白及藉由天然存在之基因編碼的蛋白質節段(單一或多個跨膜)或轉譯後修飾(諸如GPI鍵聯)錨定之所有細胞表面蛋白質的胞外結構域。針對細胞表面聚醣或其他轉譯後修飾(例如硫酸化)之任何天然存在或合成之親和試劑(例如抗體、抗體片段、單鏈Fv、適體、奈米抗體、凝集素，等)。實例包括，但不限於TNF/TNFR族之成員(OX40L、ICOSL、FASL、LTA、LTB TRAIL、CD153、TNFSF9、RANKL、TWEAK、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、CD40LG、CD70)或針對TN/TNFR族成員之親和試劑；免疫球蛋白超家族之成員(VISTA、PD1、PD-L1、PD-L2、B71、B72、CTLA4、CD28、TIM3、CD4、CD8、CD19、T細胞受體鏈、ICOS、ICOS配體、HHLA2、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)、BTLA、B7-H3、B7-H4、CD3、CD79a、CD79b、IgSF CAMS(包括CD2、CD58、CD48、CD150、CD229、CD244、ICAM-1)、白血球免疫球蛋白樣受體(LILR)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR))、凝集素超家族成員、選擇素、細胞因子/趨化因子和細胞因子/趨化因子受體、生長因子和生長因子受體)、黏連分子(整合素、纖連蛋白、鈣黏著蛋白)或多跨膜蛋白之胞外結構域或針對免疫球蛋白超家族及表列之基因產物的親和試劑。此外，這些基因產物之活性同系物/直系同 源物包括，但不限於病毒序列(例如CMV、EBV)、細菌序列、真菌序列、真核病原體(例如血吸蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲、艾美球蟲、泰勒蟲、弓形蟲、內阿米巴、利什曼原蟲和錐蟲)及哺乳動物來源之編碼區。此外，MOD可包含針對人基因產物之小分子藥物。
另外之多肽
於該重組多肽之一實施態樣中，其進一步包含鄰接該重組多肽之C-端的His-8標記物。
核酸
本發明提供編碼本文所描述之任一重組多肽的核酸。於一實施態樣中，該核酸為DNA。於一實施態樣中，該核酸為cDNA。於一實施態樣中，該核酸為RNA。於一實施態樣中，該核酸為mRNA。
於一實施態樣中，該重組核酸為載體。於一實施態樣中，該載體為病毒載體。於一實施態樣中，該病毒載體為慢病毒(lentivirus)載體。
本發明提供包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之核酸。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的個別多肽鏈係編碼在單獨之核酸裡。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的所有多肽鏈係編碼在單一核酸中。於一些情況中，第一核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽之核苷酸序列；而第二核酸包含編碼本發明之多聚 體多肽的第二多肽之核苷酸序列。於一些情況中，單一核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽及本發明之多聚體多肽的第二多肽之核苷酸序列。於一些情況中，核酸包含編碼如上述之多聚蛋白前體的核苷酸序列。
編碼多聚體多肽之個別多肽鏈的各別核酸
本發明提供包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之核酸。如上述，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的個別多肽鏈係編碼在各別核酸中。於一些情況中，編碼本發明之多聚體多肽的各別多肽鏈之核苷酸序列係可操作地連接轉錄控制元件，例如啟動子，諸如在真核細胞中作用之啟動子，其中該啟動子可為組成型啟動子或誘導型啟動子。
本發明提供第一核酸和第二核酸，其中該第一核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽之核苷酸序列，其中該第一多肽依從N端至C端之順序包含：a)抗原決定部位(例如T細胞抗原決定部位)；b)第一MHC多肽；和c)免疫調節多肽；且其中該第二核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第二多肽之核苷酸序列，其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：a)第二MHC多肽；和b)Ig Fc多肽。合適之T細胞抗原決定部位、MHC多肽、免疫調節多肽和Ig Fc多肽描述於上文中。於一些情況中，該編碼第一和第二多肽之核苷酸序列係可操作地連接轉錄控制元件。於一些情況中，該轉錄控制元件為在真核 細胞中作用之啟動子。於一些情況中，該核酸為存在於各別表現載體中。
本發明提供第一核酸和第二核酸，其中該第一核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽之核苷酸序列，其中該第一多肽依從N端至C端之順序包含：a)抗原決定部位(例如T細胞抗原決定部位)；b)第一MHC多肽；且其中該第二核酸包含編碼本發明之多聚體多肽的第二多肽之核苷酸序列，其中該第二多肽依從N端至C端之順序包含：a)免疫調節多肽；b)第二MHC多肽；和c)Ig Fc多肽。合適之T細胞抗原決定部位、MHC多肽、免疫調節多肽和Ig Fc多肽描述於上文中。於一些情況中，該編碼第一和第二多肽之核苷酸序列係可操作地連接轉錄控制元件。於一些情況中，該轉錄控制元件為在真核細胞中作用之啟動子。於一些情況中，該核酸為存在於各別表現載體中。
編碼存在於多聚體多肽中之二或多種多肽之核酸
本發明提供包含至少編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽和第二多肽之核苷酸序列的核酸。於其中本發明之多聚體多肽包括第一、第二和第三多肽的一些情況中，該核酸包括編碼第一、第二和第三多肽之核苷酸序列。於一些情況中，該編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽和第二多肽之核苷酸序列包括一介於編碼該第一多肽之核苷酸序列和編碼該第二多肽之核苷酸序列之間的蛋白水 解可裂解之連接子。於一些情況中，該編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽和第二多肽之核苷酸序列包括一介於編碼該第一多肽之核苷酸序列和編碼該第二多肽之核苷酸序列之間的內部核糖體進入位點(IRES)。於一些情況中，該編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽和第二多肽之核苷酸序列包括一介於編碼該第一多肽之核苷酸序列及編碼該第二多肽之核苷酸序列之間的核糖體跳躍信號(或順式作用水解酶元件，CHYSEL)。核酸之實例描述於下文中，其中蛋白水解可裂解之連接子係位在編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽和第二多肽之核苷酸序列之間；於這些實施態樣之任一者中，可使用IRES或核糖體跳躍信號來代替編碼該蛋白水解可裂解之連接子的核苷酸序列。
於一些情況中，第一核酸(例如重組表現載體、mRNA、病毒RNA，等)包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽鏈之核苷酸序列；而第二核酸(例如重組表現載體、mRNA、病毒RNA，等)包含編碼本發明之多聚體多肽的第二多肽鏈之核苷酸序列。於一些情況中，編碼該第一多肽之核苷酸序列，及編碼該第二多肽之第二核苷酸序列係各自可操作地連接轉錄控制元件，例如啟動子，諸如在真核細胞中作用之啟動子，其中該啟動子可為組成性啟動子或誘導型啟動子。
本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，其中該重組多肽依從N端至C端之順序包含：a)抗原決定部位(例如T細胞抗原決定部位)；b)第一MHC 多肽；c)免疫調節多肽；d)蛋白水解可裂解之連接子；e)第二MHC多肽；和f)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。本發明提供包含編碼重組多肽之核苷酸序列的核酸，其中該重組多肽依從N端至C端之順序包含：a)第一前導肽；b)抗原決定部位；c)第一MHC多肽；d)該免疫調節多肽；e)蛋白水解可裂解之連接子；f)第二前導肽；g)第二MHC多肽；和h)Ig Fc多肽。本發明提供包含編碼重組多肽之核酸，其中該重組多肽依從N端至C端之順序包含：a)抗原決定部位；b)第一MHC多肽；c)蛋白水解可裂解之連接子；d)免疫調節多肽；e)第二MHC多肽；和f)Ig Fc多肽。於一些情況中，該第一前導肽和第二前導肽為β2-M前導肽。於一些情況中，該核苷酸序列係可操作地連接轉錄控制元件。於一些情況中，該轉錄控制元件為可在真核細胞中作用之啟動子。
合適之MHC多肽描述於上文中。於一些情況中，該第一MHC多肽為β2微球蛋白多肽；且其中該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈多肽。於一些情況中，該β2微球蛋白多肽包含與SEQ ID NO：4所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性之胺基酸序列。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽為HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K或HLA-L重鏈。於一些情況中，該第I型MHC重鏈多肽包含與SEQ ID NO：5所列之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性之胺基酸序列。於一些情況中，該第一MHC多肽為第II 型MHC α鏈多肽；且其中該第二MHC多肽為第II型MHC β鏈多肽。
合適之Fc多肽描述於上文中。於一些情況中，該Ig Fc多肽為IgG1 Fc多肽、IgG2 Fc多肽、IgG3 Fc多肽、IgG4 Fc多肽、IgA Fc多肽或IgM Fc多肽。於一些情況中，該Ig Fc多肽包含與第24A-24C圖中所描繪之胺基酸序列具有至少85%胺基酸序列同一性之胺基酸序列。
合適之免疫調節多肽描述於上文中。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽、B7-1多肽、B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽和PD-L2多肽。於一些情況中，該免疫調節多肽係選自：CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4和HVEM。
合適之蛋白水解可裂解連接子描述於上文中。於一些情況中，該蛋白水解可裂解連接子包含選自下列群組之胺基酸序列：a)LEVLFQGP(SEQ ID NO：37)；b)ENLYTQS(SEQ ID NO：34)；c)DDDDK(SEQ ID NO：35)；d)LVPR(SEQ ID NO：36)；及e)GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：64)。
於一些情況中，該介於抗原決定部位與第一MHC多肽之間的連接子包含第一Cys殘基，該第二個MHC多肽包含一胺基酸取代以提供第二Cys殘基，從而 使該第一和第二Cys殘基提供一介於該連接子和第二MHC多肽之間的二硫鍵聯。於一些情況中，該第一MHC多肽包含一胺基酸取代以提供第一Cys殘基，而該第二MHC多肽包含一胺基酸取代以提供第二Cys殘基，從而使該第一Cys殘基和第二Cys殘基提供一介於該提供第一MHC多肽和第二MHC多肽之間的二硫鍵聯。
重組表現載體
本發明提供包含本發明之核酸的重組表現載體。於一些情況中，該重組表現載體為非病毒載體。於一些實施態樣中，該重組表現載體為病毒構建體，例如重組之腺相關病毒構建體(參見，例如US專利案第7,078,387號)、重組之腺病毒構建體、重組之慢病毒構建體、重組之逆轉錄病毒構建體、非整合病毒載體，等。
合適之表現載體包括，但不限於病毒載體(例如基於牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見，例如Li et al.，Invest Opthalmol Vis Sci 35：2543-2549,1994；Borras et al.,Gene Ther 6：515-524,1999；Li and Davidson,PNAS 92：7700-7704,1995；Sakamoto et al.,H Gene Ther 5：1088-1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相關病毒(參見，例如Ali et al.,Hum Gene Ther 9：81 86,1998、Flannery et al.,PNAS 94：6916 6921,1997；Bennett et al.,Invest Opthalmol Vis Sci 38：2857 2863,1997；Jomary et al.,Gene Ther 4：683 690,1997、Rolling et al.,Hum Gene Ther 10：641 648,1999；Ali et al.,Hum Mol Genet 5：591 594,1996；Srivastava，在WO 93/09239中，Samulski et al.,J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson et al.,Virol.(1988)166：154-165；和Flotte et al.,PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；人類免疫缺陷病毒(見，例如Miyoshi et al.,PNAS 94：10319 23,1997；Takahashi et al.,J Virol 73：7812 7816，1999)之病毒載體)；逆轉錄病毒載體(例如鼠白血病病毒、脾壞死病毒之載體)及衍生自逆轉錄病毒(諸如勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒(avian leukosis virus)、慢病毒(lentivirus)、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)和乳腺腫瘤病毒)之載體；等。
本技藝之技術熟習人員已知許多合適之表現載體且其中許多為市售商品。下列載體為示範之實例；用於真核宿主細胞者：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可使用任何其他載體只要其與宿主細胞相容。
根據所使用之宿主/載體系統，可在表現載體中使用許多合適之轉錄和轉譯控制元件中之任一者，包括組成型和誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子，等(參見，例如Bitter et al.(1987)Methods in Enzymology, 153：516-544)。
於一些實施態樣中，編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列係可操作地連接控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。該轉錄控制元件可在真核細胞，例如哺乳動物細胞；或原核細胞(例如細菌或古細菌細胞)中作用。於一些實施態樣中，編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列係可操作地連接允許該編碼DNA靶向RNA及/或定點修飾多肽之核苷酸序列在原核和真核細胞中表現的多個控制元件。
合適之真核啟動子的非限制性實例(在真核細胞中作用之啟動子)包括那些來自巨細胞病毒(CMV)即刻早期、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、來自逆轉錄病毒之長末端重複序列(LTR)和小鼠金屬硫蛋白-I者。合適之載體和啟動子的選擇係在本技藝之一般技術水準內。表現載體亦可含有用於轉譯起始和轉錄終止子之核糖體結合位點。該表現載體亦可包括用於擴增表現之合適序列。
經遺傳修飾之宿主細胞
本發明提供以編碼本文所描述之任何重組多肽的核酸轉化之細胞。可以編碼任一該重組多肽之核酸轉化的細胞之實例包括經分離之哺乳動物細胞，包括，但不限於人胚胎腎(HEK)、中國倉鼠卵巢(CHO)、NS0(鼠骨髓瘤)細胞、人羊水細胞(CAP，CAP-T)、酵母細胞(包括，但 不限於釀酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))、植物細胞(包括，但不限於煙草NT1、BY-2)、昆蟲細胞(包括，但不限於SF9、S2、SF21、Tni(例如High5))或細菌細胞(包括，但不限於大腸桿菌)。
本發明提供經基因工程修飾之宿主細胞，其中該宿主細胞係經本發明之核酸基因工程修飾。
合適之宿主細胞包括真核細胞，諸如酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。於一些情況中，該宿主細胞為哺乳動物細胞株的細胞。合適之哺乳動物細胞株包括人細胞株、非人類靈長類動物細胞株、囓齒動物(例如小鼠、大鼠)細胞株，等。合適之哺乳動物細胞株包括，但不限於HeLa細胞(例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號CCL-2)、CHO細胞(例如ATCC編號CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例如ATCC編號CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例如ATCC編號CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例如ATCC編號CCL10)、PC12細胞(ATCC編號CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC編號CRL1651)、RAT1細胞、小鼠L細胞(ATCC編號CCLI.3)、人胚胎腎(HEK)細胞(ATCC編號CRL1573)、HLHepG2細胞，等。
於一些情況中，該宿主細胞為已經過遺傳修飾，從而使其不會合成內源性MHC β2-M之哺乳動物細胞。
製造多聚體多肽之方法
本發明提供製造本發明之多聚體多肽的方法。一般而言，該方法涉及將經基因工程修飾之宿主細胞與包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的重組表現載體一起培養在培養基中；從經基因工程修飾之宿主細胞及/或培養基分離該多聚體多肽。以包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的重組表現載體進行基因工程修飾之宿主細胞亦稱為“表現宿主”。如上述，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的個別多肽鏈係編碼在各別之重組表現載體中。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的所有多肽鏈係編碼在單一重組表現載體中。
可使用標準之蛋白質純化法從該表現宿主細胞(例如從該表現宿主細胞之溶胞產物)及/或培養該宿主細胞之培養基分離多聚體多肽。
例如，可製備表現宿主之溶胞產物並使用高效液相色層分析法(HPLC)、排阻色層分析法、凝膠電泳法、親和力色層分析法或其他純化技術純化該溶胞產物。或者，當多聚體多肽從該表現宿主細胞分泌入培養基時，可使用HPLC、排阻色層分析法、凝膠電泳法、親和力色層分析法或其他純化技術從該培養基中純化該多聚體多肽。於一些情況中，相關於與產物製備方法及其純化有關之污染物，所使用之組成物將包含至少80重量%、至少約85重量%、至少約95重量%或至少約99.5重量%之所需產物。該百分比可按總蛋白質計。
於一些情況中(例如其中該多聚體多肽包含親和標記物)，該多聚體多肽可使用該親和標記物之固定化結合配體(binding partner)純化。
組成物
本發明提供組成物，包括包含本發明之多聚體多肽的醫藥組成物。本發明提供組成物，包括包含本發明之核酸或重組表現載體的醫藥組成物。
包含多聚體多肽之組成物
除了本發明之多聚體多肽外，本發明之組成物可包含下列一或多項：鹽，例如NaCl、MgCl、KCl、MgSO4，等；緩衝劑，例如Tris緩衝液、N-(2-羥乙基)六氫吡嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉代)乙磺(MES)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-胺基丙磺酸(TAPS)，等；增溶劑；洗滌劑，例如非離子型洗滌劑，諸如吐溫-20，等；蛋白酶抑制劑；甘油；等。
該組成物可包含醫藥上可接受之賦形劑，本技藝已知各種醫藥上可接受之賦形劑且不需要在本文中詳細討論。醫藥上可接受之賦形劑已充分描述於多種出版物中，包括，例如“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”，第19版(1995)或最新版，Mack出版公司；A.Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”，第20版，Lippincott、Williams& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人，第7版，Lippincott、Williams& Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc。
醫藥組成物可包含本發明之多聚體多肽及醫藥上可接受之賦形劑。於一些情況中，主題醫藥組成物將適合用於投予個體，例如將為無菌的。例如，於一些實施態樣中，主題醫藥組成物將適於投予人類個體，例如其中該組成物為無菌的且不含可檢測之熱原和/或其他毒素。
蛋白質組成物可包含其他成分，諸如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽，等。該組成物可含有為了近似生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調節劑和緩衝劑、毒性調節劑，等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、氫氯酸鹽、硫酸鹽、溶劑化物(例如混合之離子性鹽、水、有機物)、水合物(例如水)，等。
例如，組成物可以包括水溶液、粉末形式、顆粒、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧劑，等。該組成物可根據下文中描述之各種投藥途徑配製。
當本發明之多聚體多肽係以注射劑形式直接投予(例如經由皮下、腹膜內和/或靜脈內)至組織內時，調 製劑可以即用型劑型或非水溶液形式(例如可重構成之儲存穩定粉末)或水溶液形式(諸如由藥學上可接之載體和賦形劑所組成之液體)提供。亦可提供含蛋白質之調製劑從而提高該主題蛋白質在投藥後之血清半衰期。例如，該蛋白質可提供在脂質體調製劑中，製備成膠體或其他用於延長血清半衰期之傳統技術。用於製備脂質體之可用的方法有多種，如描述於，例如Szoka et al.1980 Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467、美國專利案第4,235,871、4,501,728和4,837,028案中者。該製劑亦可以控制釋出或緩釋形式提供。
適合用於腸胃道外投藥之調製劑的其他實例包括等張無菌注射液、抗氧化劑、抑菌劑和使該調製劑與預期之接受者的血液成為等張之溶質、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。例如主題醫藥組成物可存在於容器中，例如無菌容器，諸如注射器。該調製劑可存在於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶中)且可儲存在僅需在使用前不久加入無菌液態賦形劑(例如注射用水)的冷凍乾燥(凍乾)條件下。即時注射溶液和懸浮液可從無菌粉末、顆粒和片劑製備。
調製劑中之本發明之多聚體多肽的濃度可有很大的變化(例如從少於約0.1重量%，通常為或至少為約2重量%至多達20重量%至50重量%或更多)，且通常主要係基於流體體積、黏度和基於患者之根據所選擇之特殊投予模式的因素及患者需求來選擇。
本發明提供包含本發明之組成物(例如液體組成物)的容器。該容器可為，例如注射器、安瓿，等。於一些情況中，該容器為無菌的。於一些情況中，該容器和組成物均為無菌的。
包含核酸或重組表現載體之組成物
本發明提供包含本發明之核酸或重組表現載體的組成物，例如醫藥組成物。本技藝已知多種醫藥上可接受之賦形劑且不需要在此詳細討論。醫藥上可接受之賦形劑已詳細描述於多種出版物中，包括，例如A.Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”，第20版，Lippincott、Williams & Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel等人，第7版，Lippincott、Williams & Wilkins；及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe等人，第3版，Amer.Pharmaceutical Assoc。
本發明之組成物可包括：a)一個主體核酸或重組表現載體；和b)一或多種：緩衝劑、表面活性劑、抗氧化劑、親水性聚合物、糊精、螯合劑、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、抑菌劑、潤濕劑和防腐劑。合適之緩衝劑包括，但不限於(諸如N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸(BES)、雙(2-羥乙基)胺基-三(羥甲基)甲烷(BIS-TRIS)、N-(2-羥乙基)六氫吡嗪-N'3-丙磺酸(EPPS或HEPPS)、雙甘胺 肽(glycylglycine)、N-2-羥乙基六氫吡嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、六氫吡嗪-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氫鈉、3-(N-三(羥甲基)-甲基-胺基)-2-羥基-丙磺酸(TAPSO)、(N-三(羥甲基)甲基-2-胺基乙磺酸(TES)、N-三(羥甲基)甲基-甘胺酸(三羥甲基甘胺酸(Tricine))、三(羥甲基)-胺基甲烷(Tris)，等)。合適之鹽類包括，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4，等。
本發明之醫藥調製劑可包括含量為約0.001%至約90%(w/w)之本發明的核酸或重組表現載體。在下文中之調製劑的說明中，將可理解的是，“主題核酸或重組表現載體”包括本發明之核酸或重組表現載體。例如，於一些實施態樣中，主題調製劑包含本發明之核酸或重組表現載體。
主題核酸或重組表現載體可與其他化合物或化合物之混合物混合、包封在膠囊中、共軛結合或以其他方式聯結；該等化合物可包括，例如脂質體或受體靶向分子。主題核酸或重組表現載體可與一或多種協助攝取、分佈及/或吸收之成分組合在調製劑中。
主題核酸或重組表現載體組成物可配製成許多可能之劑型的任一者，諸如，但不限於片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。主題核酸或重組表現載體組成物亦可被配製成在水性、非水性或混合之介質中的懸浮液。水性懸浮液可進一步含有能增加該懸浮液之黏度的物質，包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖 醇及/或葡聚醣。該懸浮液亦可含有穩定劑。
包含主題核酸或重組表現載體之調製劑可為脂質體調製劑。如本文所使用之術語“脂質體”意指由排列成球形雙層或雙層之二親性脂質所組成的囊泡。脂質體為單層或多層囊泡，其具有從親脂性材料形成的膜和含有該欲投遞之組成物的水溶性內部。陽離子性脂質體為帶正電荷之脂質體，其可與帶負電荷之DNA分子交互作用以形成穩定之複合物。pH敏感性或帶負電荷之脂質體被認為係截留DNA，而非與其複合。陽離子性和非陽離子性脂質體均可用來投遞主題核酸或重組表現載體。
脂質體亦包括“立體穩定化”之脂質體，此術語在本文中係指包含一或多種專用脂質之脂質體，當該專用脂質被納入脂質體時會導致循環壽命期相對於缺乏該等專用脂質之脂質體增加。立體穩定化之脂質體的實例為那些其中該形成囊泡之脂質體的脂質部分中有部分包含一或多種醣脂或係由一或多種親水性聚合物衍生者，諸如聚乙二醇(PEG)部分。脂質體及彼等之用途進一步描述於美國專利案第6,287,860號(其全文以引用方式併入本文)中。
本發明之調製劑和組成物亦可包括表面活性劑。表面活性劑在藥品、調製劑和乳劑中之用途為本技藝所周知。表面活性劑及彼等之用途進一步描述於美國專利案第6,287,860號中。
於一實施態樣中，包含各種滲透增進劑以有效投遞核酸。除了協助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜外， 滲透增進劑亦增進該親脂性藥物之滲透性。滲透增進劑可被分類成分屬五大類(即，表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合型非表面活性劑)之一。滲透增進劑及彼等之用途進一步描述於美國專利案第6,287,860號(其全文以引用方式併入本文)中。
用於口服投藥之組成物和調製劑包括粉末或顆粒、微粒、奈米顆粒、在水或非水溶性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、囊劑、片劑或微型片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可能是理想的。合適之口服調製劑包括那些其中將主題反義核酸與一或多種滲透增進劑表面活性劑和螯合劑一起投予者。合適之表面活性劑包括，但不限於脂肪酸及/或其酯或鹽類、膽汁酸及/或其鹽類。合適之膽汁酸/鹽及脂肪酸和彼等之用途進一步描述於美國專利案第6,287,860號中。滲透增進劑之組合亦合適，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合。示例性合適組合為月桂酸、癸酸和UDCA之鈉鹽。另外之滲透增進劑包括，但不限於聚氧乙烯-9-月桂醚及聚氧乙烯-20-鯨蠟醚。合適之滲透增強劑亦包括丙二醇、二甲亞碸、三乙醇胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、2-吡咯啶酮及其衍生物、四氫呋喃醇和AZONETM。
調節T細胞活性之方法
本發明亦提供抑制能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株之T細胞與本文所 描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含抗原決定部位肽且包含能有效抑制T細胞選殖株之量的T細胞調節結構域，此T細胞調節結構域為抑制性結構域。
本發明亦提供刺激能識別抗原決定部位肽之T細胞選殖株的方法，其包含將該選殖株之T細胞與本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含抗原決定部位肽且包含能有效刺激T細胞選殖株之量的T細胞調節結構域，此T細胞調節結構域為刺激性結構域。
本發明提供選擇性調節抗原決定部位特異性T細胞之活性的方法，該方法包含將T細胞與本發明之多聚體多肽接觸，其中將T細胞與本發明之多聚體多肽接觸可選擇性地調節該抗原決定部位特異性T細胞之活性。於一些情況中，該接觸係發生在玻管內。於一些情況中，該接觸係發生在活體內。於一些情況中，該接觸係發生在發生活體外。
於一些情況中(例如其中該靶的T細胞為CD8+ T細胞)，該多聚體多肽包含第I型MHC多肽(例如β2微球蛋白和第I型MHC重鏈)。於一些情況中(例如其中該靶的T細胞為CD4+ T細胞)，該多聚體多肽包含第II型MHC多肽(例如第II型MHC α鏈；第II型MHC β鏈)。
當本發明之多聚體多肽包括為活化多肽之免疫調節多肽時，將T細胞與本發明之多聚體多肽接觸可活化該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該抗原 決定部位特異性T細胞為特異於存在於癌細胞上之抗原決定部位的T細胞且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸會增加該T細胞對癌細胞之細胞毒性活性。於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於癌細胞上之抗原決定部位的T細胞且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸會增加該抗原決定部位特異性T細胞的數量。
於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於經病毒感染之細胞上之抗原決定部位的T細胞且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸會增加該T細胞對經病毒感染之細胞的細胞毒性活性。於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於經病毒感染之細胞上之抗原決定部位的T細胞且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸會增加該抗原決定部位特異性T細胞的數量。
當本發明之多聚體多肽包括為抑制性多肽之免疫調節多肽時，將T細胞與該多聚體多肽接觸會抑制該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於自體抗原中之抗原決定部位的自體反應性T細胞且該接觸會減少自體反應性T細胞的數目。
治療方法
本發明亦提供經由抑制能識別抗原決定部位 肽之自體反應性T細胞選殖株來治療自體免疫性疾病的方法，其包含將該選殖株之T細胞與如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含能有效治療自體免疫性疾病之量的T細胞調節結構域，此T細胞調節結構域為抑制性結構域。
本發明亦提供經由刺激能識別在癌症上之抗原決定部位肽之T細胞選殖株來治療癌症的方法，其包含將該選殖株之T細胞與如本文所描述之重組肽接觸，其中該重組肽包含該抗原決定部位肽且包含能有效治療癌症之量的T細胞調節結構域，此T細胞調節結構域為刺激性結構域。
於一實施態樣中，經轉化以表現本發明之重組多肽的細胞為分離出之懸浮適應性細胞。於多個該分離出之懸浮適應性細胞或重組核酸之一實施態樣中，該核酸包含DNA。
於一實施態樣中，該T細胞包含從個體取得之外周T細胞。於一實施態樣中，該T細胞包含個體內之T細胞。於一實施態樣中，該T細胞包含個體內之外周T細胞。於本文之方法的一實施態樣中，該個體為人。
本發明提供選擇性調節個體之抗原決定部位特異性T細胞的活性之方法，該方法包含投予該個體能有效地選擇性調節個體之抗原決定部位特異性T細胞之活性的量之本發明的多聚體多肽或一或多種編碼該多聚體多肽的核酸。於一些情況中，本發明之治療方法包含投予需要 該治療之個體一或多個包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之重組表現載體。於一些情況中，本發明之治療方法包含投予需要該治療之個體一或多個包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之mRNA分子。於一些情況中，本發明之治療方法包含投予需要該治療之個體本發明之多聚體多肽。
本發明提供選擇性調節個體之抗原決定部位特異性T細胞之活性的方法，該方法包含投予個體有效量之本發明的多聚體多肽或一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸(例如表現載體；mRNA，等)，其中該多聚體多肽選擇性地調節個體之抗原決定部位特異性T細胞之活性。選擇性地調節抗原決定部位特異性T細胞之活性可治療個體之疾病或病症。因此，本發明提供治療方法，其包含投予需要該治療之個體有效量之本發明的多聚體多肽。
於一些情況中，該免疫調節多肽為活化多肽且該多聚體多肽活化該抗原決定部位特異性T細胞。於一些情況中，該抗原決定部位為與癌症相關之抗原決定部位，且該多聚體多肽增加特異於該與癌症相關之抗原決定部位的T細胞之活性。
本發明提供治療個體之癌症的方法，該方法包含投予該個體有效量之本發明的多聚體多肽或一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸(例如表現載體；mRNA，等)，其中該多聚體多肽包含為癌症抗原決定 部位之T細胞抗原決定部位，且其中該多聚體多肽包含刺激性免疫調節多肽。於一些情況中，“有效量”之多聚體多肽為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之癌細胞數目的多聚體多肽量。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於投予該多聚體多肽前或未投予該多聚體多肽之個體內的癌細胞數目而言，該多聚體多肽的量可減少該個體內之癌細胞數目達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，可將該個體內之癌細胞數目減少至無法檢測之水準的量。。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，可將該個體內之腫瘤質量減少的量。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於投予該多聚體多肽前或未投予該多聚體多肽之個體內的腫瘤質量而言，該多聚體多肽的量可減少該個體內之腫瘤質量達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可增加該個體之存活時間的多聚體多肽量。 例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於未投予該多聚體多肽之個體的預期存活時間而言，可增加該個體之存活時間達至少1個月、至少2個月、至少3個月、3個月至6個月、6個月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或超過10年的多聚體多肽量。
於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於經病毒感染之細胞上的抗原決定部位之T細胞，且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸時可增加該T細胞針對該經病毒感染之細胞毒性活性。於一些情況中，該抗原決定部位特異性T細胞為特異於存在於經病毒感染之細胞上的抗原決定部位的T細胞，且將該抗原決定部位特異性T細胞與該多聚體多肽接觸時可增加該抗原決定部位特異性T細胞之數目。
因此，本發明提供治療個體之病毒感染的方法，該方法包含投予該個體有效量之本發明的多聚體多肽或一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸，其中該多聚體多肽包含為病毒抗原決定部位之T細胞抗原決定部位，且其中該多聚體多肽包含刺激性免疫調節多肽。於一些情況中，多聚體多肽之“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之經病毒感染之細胞數目的多聚體多肽量，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於投予該多聚體多肽之前或未投予該 多聚體多肽之個體的經病毒感染之細胞數目而言，可減少該個體內之經病毒感染之細胞數目達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的多聚體多肽量。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之經病毒感染之細胞數目達無法檢測之水準的多聚體多肽量。
因此，本發明提供治療個體之感染的方法，該方法包含投予該個體有效量之本發明的多聚體多肽或一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸，其中該多聚體多肽包含與病原體相關之抗原決定部位之T細胞抗原決定部位，且其中該多聚體多肽包含刺激性免疫調節多肽。於一些情況中，該多聚體多肽之“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之病原體數目的多聚體多肽量。例如，於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於投予該多聚體多肽之前或未投予該多聚體多肽之個體內的病原體數目而言，可減少該個體內之病原體數目達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的多聚體多肽量。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之病 原體數目達無法檢測之水準的多聚體多肽量。病原體包括病毒、細菌、原蟲，等。
於一些情況中，該免疫調節多肽為抑制性多肽且該多聚體多肽抑制該抗原特異性T細胞之活性。於一些情況中，該抗原決定部位為自體抗原決定部位且該多聚體多肽選擇性地抑制特異於該自體抗原決定部位之T細胞的活性。
本發明提供治療個體之自體免疫性疾病的方法，該方法包含投予該個體有效量之本發明的多聚體多肽或一或多個包含編碼該多聚體多肽之核苷酸序列的核酸，其中該多聚體多肽包含為自體抗原決定部位之T細胞抗原決定部位，且其中該多聚體多肽包含抑制性免疫調節多肽。於一些情況中，多聚體多肽之“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時，相較於投予該多聚體多肽之前或未投予該多聚體多肽之個體內的自體反應性T細胞數目而言，可減少該個體內之自體反應性T細胞數目達至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的多聚體多肽量。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可減少該個體內之Th2細胞因子製造的多聚體多肽量。於一些情況中，本發明之多聚體多肽的“有效量”為當在一或多個劑量中投予有此需要的個體時可改善該個體之一或多種與自體免疫疾病相關之症狀的多聚 體多肽量。
如上文所指出者，於一些情況中，在執行本治療方法時，係將本發明之多聚體多肽以多肽本身之形式投予有此需要的個體。於其他情況中，在執行本治療方法時，係將一或多個包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列之核酸投予有此需要的個體。因此，於其他情況中，係將一或多個本發明之核酸(例如一或多個本發明之重組表現載體)投予有此需要之個體。
調製劑
上文中描述合適之調製劑，其中合適之調製劑包含醫藥上可接受之賦形劑。於一些情況中，合適之調製劑包含：a)本發明之多聚體多肽；和b)醫藥上可接受之賦形劑。於一些情況中，合適之調製劑包含：a)核酸，其包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列；和b)醫藥上可接受之賦形劑；於一些情況中，該核酸為mRNA。於一些情況中，合適之調製劑包含；a)第一核酸，其包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽之核苷酸序列；b)第二核酸，其包含編碼本發明之多聚體多肽的第二多肽之核苷酸序列；和c)醫藥上可接受之賦形劑。於一些情況中，合適之調製劑包含：a)重組表現載體，其包含編碼本發明之多聚體多肽的核苷酸序列；和b)醫藥上可接受之賦形劑。於一些情況中，合適之調製劑包含：a)第一重組表現載體，其包含編碼本發明之多聚體多肽的第一多肽之核苷酸 序列；b)第二重組表現載體，其包含編碼本發明之多聚體多肽的第二多肽之核苷酸序列；和c)醫藥上可接受之賦形劑。
合適之醫藥上可接受之賦形劑描述於上文中。
劑量
合適之劑量可由主治醫師或其他合格之醫事人員根據各種臨床因素決定。如醫學技藝中所周知者，用於任一患者之劑量取決於許多因素，包括患者之尺寸、體表面積、年齡、欲投予之特定多肽或核酸、患者之性別、投予時間和途徑、一般健康狀況及其他同時投予之藥物。本發明之多聚體多肽的投予量係介於每一劑量1ng/kg體重至20mg/kg體重之間，例如介於0.1mg/kg體重至10mg/kg體重之間，例如介於0.5mg/kg體重至5mg/kg體重之間；然而，低於或高於此示例性範圍之劑量是可預見的，尤其是考慮到前述因素。若該攝生法為連續輸注液，其亦可在每分鐘每公斤體重1μg至10mg之範圍內。
於一些情況中，本發明之多聚體多肽之合適劑量為每公斤體重0.01μg至100g、每公斤體重0.1μg至10g、每公斤體重1μg至1g、每公斤體重10μg至100mg、每公斤體重100μg至10mg或每公斤體重100μg至1mg。本技藝之一般技術人員可根據投予的作用劑在體液或組織中所測得之停留時間及濃度來輕易地估算出給藥 之重複率。成功治療之後，可能希望使患者經受維持療法以防止疾病狀態復發，其中本發明之多聚體多肽係以在下列範圍內之維持劑量投予：每公斤體重0.01μg至100g、每公斤體重0.1μg至10g、每公斤體重1μg至1g、每公斤體重10μg至100mg、每公斤體重100μg至10mg或每公斤體重100μg至1mg。
熟習本技藝之人士將輕易地察知劑量水準可隨著該特定之多聚體多肽、症狀之嚴重程度及個體對副作用之感受性而變化。指定之化合物的較佳劑量可由熟習本技藝之人士藉由各種方式輕易地測定。
於一些實施態樣中係投予數個劑量之本發明的多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體的投予頻率可根據多種因素的其中任一者變化，例如症狀之嚴重程度，等。例如，於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係每月投予一次、每月投予二次、每月投予三次、隔週投予一次(qow)、每週投予一次(qw)、每週投予二次(biw)、每週投予三次(tiw)、每週投予四次、每週投予五次、每週投予六次、每隔一日投予一次(qod)、每天投予一次(qd)、每天投予二次(qid)或每天投予三次(tid)。
本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體的投予持續期間(例如本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體的投予期 間)可根據多種因素(例如患者的反應，等)之其中任一者變化。例如，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體的投予期間可為約一天至約一週、約二週至約四週、約一個月至約二個月、約二個月至約四個月、約四個月至約六個月、約六個月至約八個月、約八個月至約一年、約一年至約二年或約二年至約四年或更長的時間。
投予途徑
活性劑(本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體)可使用任何可用之適合用於投遞藥物之方法和途徑投予個體，包括活體內和活體外方法，以及全身和局部投予途徑。
習知和醫藥上可接受之投予途徑包括腫瘤內、腫瘤周圍、肌肉內、氣管內、顱內、皮下、皮內、局部施用、靜脈內、動脈內、直腸、鼻、口及其他腸內和胃腸道外投予途徑。若需要時，可組合投予途徑或根據本發明之多聚體多肽及/或期望的效果調整。本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體可在單一劑量或數個劑量中投予。
於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由靜脈內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由肌肉內途徑投予。 於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由局部途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由腫瘤內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由腫瘤周圍途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由顱內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體係經由皮下途徑投予。
於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由靜脈內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由肌肉內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由局部途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由腫瘤內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由腫瘤周圍途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由顱內途徑投予。於一些實施態樣中，本發明之多聚體多肽係經由皮下途徑投予。
本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體可使用任何可用之適合用於投遞習知藥物之習知方法和途徑(包括全身性或局部途徑)投予宿主。一般而言，本發明所考慮之投予途徑包括，但不一定限於腸內、腸胃道外或吸入途徑。
除了吸入投予外之其他腸胃道外途徑包括，但不一定限於局部、透皮、皮下、肌肉內、眼眶內、囊內、脊柱內、胸骨內、腫瘤內、腫瘤周圍和靜脈內途徑，即，除了通過消化道外之任何其他投予途徑。可進行腸胃道外投予以實現全身或局部投遞本發明之多聚體多肽、本發明之核酸或本發明之重組表現載體。當需要全身投遞時，投予通常涉及侵入性或全身吸收性局部或黏膜投予醫藥製劑。
適合治療之個體
適合以本發明方法治療之個體包括具有癌症之個人，包括已被診斷為患有癌症之個人、已接受癌症治療，但對該治療沒有反應之個人及已經接受癌症治療且最初有反應，但隨後變成對該治療而言為難治的個人。適合以本發明方法治療之個體包括具有感染之個體(例如被病原體感染，諸如細菌、病毒、原生動物，等)，包括被診斷為具有感染之個人、已接受感染治療，但對該治療沒有反應之個人。適合以本發明方法治療之個體包括具有細菌感染之個體，包括被診斷為具有細菌感染之個人及已接受細菌感染治療，但對該治療沒有反應之個人。適合以本發明方法治療之個體包括具有病毒感染之個體，包括被診斷為具有病毒感染之個人及已接受病毒感染治療，但對該治療沒有反應之個人。適合以本發明方法治療之個體包括具有自體免疫性疾病之個體，包括被診斷為具有自體免疫性 疾病之個人、已接受自體免疫性疾病治療，但對該治療沒有反應之個人。
除非本文中另外指明或與上下文明顯矛盾，本文所描述之各種元素的所有組合都在本發明之範圍內。
從下文中之實驗細節將更清楚地了解本發明。然而，熟習本技藝之人士將輕易地察知該具體描述之方法和所討論之結果僅用於說明本發明，其後之申請專利範圍將更完整地描述本發明。
[實施例]
下列實施例係用於提供本技藝之一般技術人員如何製造和使用本發明的完整內容和描述且不意圖限制發明者所看待之其發明範圍，亦不意圖表示下列實驗為進行之全部或僅有的實驗。所使用之數字(例如量、溫度，等)已努力確保準確性，但應仍有一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，份數為重量份數，分子量為重均分子量，溫度為攝氏溫度且壓力為大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，微微升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內的(肌肉內地)；i.p.，腹膜內的(腹膜內地)；s.c.，皮下的(皮下地)；等。
實施例1：SynTac(用於T細胞活化之突觸)異二聚體的生 成
本發明之態樣關於新穎之基於蛋白質的治療性平台，“synTac”，其模仿免疫突觸之交互作用特異性和調節信號。SynTac為融合蛋白，其連接共刺激分子和MHC-抗原決定部位以允許精確之T細胞接合和選殖株T細胞的活化或抑制(第1圖)，身體自然反應之可溶形式。以此方式，synTac結合最佳之抗原決定部位、雙特異性抗體、可溶性共刺激分子和ADC。SynTac允許高度特異性細胞透過MHC-抗原決定部位瞄準，藉由“單鏈融合”設計不准游離之抗原決定部位交叉呈遞(第2A-2C圖)。T細胞調節結構域(本文中有時稱為“MOD”)亦經共價連接，其根據該共刺激接合的性質而引起活化或抑制。此引起抗原特異性，而非全面之T細胞反應。值得注意的，該MOD可包括任何已知之抗體、抗體片段、共刺激分子或其他經文獻驗證之有效載荷(細胞因子、毒素，等)且不需要經內化以對T細胞施加效果。此外，二個靶的存在於同一細胞表面上可排除傳統雙特異性抗體之“分隔問題”。
於一實施態樣中，該策略係利用Fc融合結構(第2A-2C圖中說明一非限制性實例)以增加該聯結產品之效價、穩定性和治療窗。簡單地說，該Fc區為天然共價同型二聚體並透過如第2A-2C圖中以二條細線說明的二個二硫鍵穩定。已知Fc結構域之存在可藉由增加血漿半衰期來延長治療活性，因其與新生Fc受體交互作用並減慢腎清除較大尺寸之二價分子[23,24]。從生物物理角度來 看，Fc結構域獨立折疊並可改善該伴侶分子在試管內和活體內之溶解度和穩定性[25]，且該Fc區允許在製造期間藉由蛋白質-A/G親和性色層分析法進行簡易之成本效益純化作用[26]。第2A圖顯示單鏈肽MHC蛋白(單鏈三聚體[27])，其羧基端連接IgG Fc區。如所描繪者，這些單鏈結構在透過替代之蛋白鍵聯(諸如MOD)延伸系統之能力方面有所限制。具體地說，鍵聯較育限制在MHC之C端區，如第2A圖中以虛線描繪者(其在本文中稱為直接鍵聯)。可使用第I型MHC或第II型MHC分子。使用直接鍵聯方式之構建體的表現高度取決於所使用之MOD。本文中所揭示之對此情形的解決方法為將該構建體***成各別重鏈和輕鏈並將肽和蛋白質二者融合至不同端(第2B圖和第2C圖)。一種結構造成肽之胺基端聯結至輕鏈(β2微球蛋白)，接著該輕鏈之羧基端再延伸至MOD效應子分子(第2B圖)。在此情況中，該重鏈(HLA-分子)係融合至Fc區。在製造過程中，所有成分係在真核細胞(例如HEK、CHO)內聯結和自行組裝。構建體係透過二硫橋聯共價結合在一起。一種替代之定向(第2C圖)係將Fc之MOD胺基端融合至重鏈，而該肽仍連接B2M輕鏈。同樣的，所有成分自行組裝並透過二硫鍵形成穩定之共價交互作用。習知之雙特異性抗體往往試圖藉由將一個胺基端Fc有效載荷與一個羧基端Fc有效載荷二聚體化來橋聯二個細胞。相反地，本文所揭示之結構使二個不同的蛋白質有效載荷、一個MHC抗原決定部位靶向機制和MOD效應子 朝向同一細胞之表面，類似於在習知抗體內發現的CH1-輕鏈交互作用。此外，使用Fc融合物可透過突變來調節對Fc受體之結合親和力以允許制訂執行相關之效應子功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或吞噬作用[28]。
第3A-3B圖中呈現二個基本synTac分子之設計。簡單地說，此構建體利用天然人B2M前導序列以允許有效分泌及ER加工，緊接在後為候選抗原決定部位(標記為肽(peptide))。一旦ER中之前導序列被完全除去，則允許肽呈遞在MHC結合袋中。在“輕鏈”鍵聯(LC，第3A圖)方面，其係透過連接子L1與天然B2M偶聯，而MOD係透過連接子L2結合。此完整盒係藉由豬捷申病毒-1(P2A)“自裂解”肽鏈接至另一B2M前導序列、MHC重鏈(例如實施例中之人HLA-A02：01或鼠H-2Kd)及Fc結構域(人IgG1或鼠IgG2a)以允許每個鏈之化學計量表現。選擇該P2A肽係因為據報導其對所有表現在哺乳動物細胞中之病毒2A肽而言具有最高之“裂解”效率[29]。“重鏈”(HC，第3B圖)鍵聯為類似情況，然而，現在病毒P2A肽接續在B2M之後，而MOD接續在第二前導肽之後，從而導致第2C圖中所示之蛋白質構建體。此二種構建體可終止於8xHis標記物以易於純化。
專門化之表現細胞：雖然由於該P2A鍵聯而使二條鏈表現且共同定位至ER，對於來自該表現宿主(懸浮適應HEK293細胞)之內源性B2M有些其可能超過該重 組形式之顧慮，因為HEK293細胞天然表現HLA和B2M分子。這將導致穩定性降低(例如表現在總產率降低)或令人非常不滿意之異源蛋白質樣本。為了避免此錯雜情況，利用CRISPR/CAS系統以從HEK細胞匯集體剔除天然B2M[30]。簡言之，設計針對內源性B2M之指導RNA，與編碼CRISPR/CAS之質粒一起轉染並將其培養三天。將培養之細胞表面針對抗B2M染色並藉由螢光活化之細胞分選術(FACS)反選擇(根據螢光損失分選)。回收分選出之細胞並進行二或更多輪之染色、反分選及回收(共三輪)以確保有效(~100%)剔除。如第4圖中所說明者，經由FACS監測B2M的表面表現來檢查最後匯集體之品質，結果表明該內源性B2M已被完全除去。然後，進行利用新一代測序之實驗以量化基因組層級之剔除百分比。使用所產生之HEK-293-B2M-KO株(稱為HEK-KO)進行所有後續實驗。
經基因工程處理之二硫鍵：為了增加蛋白質的穩定性和規避與可能之肽轉移至細胞性MHC分子相關的錯雜情況(交叉呈遞)和B2M釋出，通常採用單鏈構建體[27，31]。然而，這些單鏈結構(顯示於第2A圖)在透過替代蛋白質鍵聯(諸如MOD)來延伸該系統方面的能力有所限制。一種解決方法為類似於先前的努力將該構建體拆分成各別重鏈和輕鏈[32]，但現在依描述將肽和蛋白質二者融合至不同端(第2B和2C圖)。然而，在最終構建體中，為了保留由習知單鏈系統提供之穩定性，研究可選擇之介於 該重和輕鏈之間的遺傳加工之二硫橋(如第2圖中所說明之S-S)，如同在二硫鍵捕獲型單鏈三聚體中所見者[dt-SCT][33]。值得注意的是，由於開始製造synTac時企圖利用dt-SCT二硫鍵方案因而導致低表現水準，這進一步取決於呈遞之肽，dt-SCT二硫鍵被認為不適合用於拆分蛋白質系統中。因此，有人試圖鑑別替代位置以將二硫橋加工處理戰更適合用於拆分蛋白質系統，諸如synTac。從輕鏈選出二個各具有一個二硫鍵之可能的位置(2,12)以用於重鏈中之二個位置(從PDB 2X4R之分析中分別為119、120和236、237)。值得注意的是，這些位置為高度保守型殘基，沒有已知之與肽結合槽[34]、TCR複合物[35]或CD8共同受體[36]之交互作用。一個構建體(H236-L12，H指該重鏈位置且L指該輕鏈，在第5A-5B圖中標記為synTac 18)被證明具高度表現，第二個構建體(H237-L12，在第5A-5B圖中標記為synTac 17)被證明具中度表現。使用該dt-SCT二硫鍵方案作為陽性對照組(標記為synTac 2)。藉由非還原性PAGE凝膠可見到形成一高分子量部分，這表明形成穩定之二硫鍵(第5A圖)。將所有表現構建體規模放大成100毫升之尺度，純化之並透過結合表現在HEK細胞(稱為HEK-A6)表面上之同源TCR來測試活性，藉由FACS螢光監測之結果表明具有正確折疊和活性(第5B圖)。使用表現非同源TC之細胞(稱為HEK-AS01)作為陰性對照組。產生僅帶有C-端8X His標記物(單價)之另外的構建體。
SynTac對照組：先前之工作聚焦在自體免疫性糖尿病[37]和疾病-相關模型系統，已使用從非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠之胰島中分離的特異性自體反應性CD8+8.3 T細胞。基於此工作，產生帶有由小鼠第I型H-2Kd等位基因(稱為IGRP)呈遞，已知與8.3 T細胞交互作用之肽的synTac構建體，該肽係由胰島特異性葡萄糖-6-磷酸酶催化次單位相關蛋白質之殘基206至214(IGRP206-214)所組成。以同等方式(例如小鼠H-2Kd呈遞)製備呈遞源自腫瘤，不會被8.3 T細胞識別之肽(KYQAVTTTL，SEQ ID NO：18)的對照組synTac，並命名為TUM。為了測定該系統可以耐受多個HLA等位基因(例如鼠H-2Kd、人HLA-A02，等)之程度，構建攜帶先前驗證之人HLA-A02限制性抗原決定部位(人類嗜T細胞淋巴性病毒，Tax 11-19)的第三synTac變體，並稱為HTLV。為了允許針對性耗盡T細胞，初始synTac構建體係使用輕鏈鍵聯格式並攜帶PD-L1 MOD結構域(圖示在第2B圖中)。各synTac變異體(IGRP、TUM及HTLV)在HEK-KO細胞中顯示出陽性表現略圖，非還原性SDS-PAGE結果中顯示於第6A圖中。為了檢查該表現系統之大致情況，探查以IGRP為基礎，具變異MOD結構域之synTac構建體，包括二個用於刺激T細胞之MOD(即，人化抗CD28單鏈Fv和TNF配體4-1BBL之胞外結構域)，以及另外二個允許抑制T細胞之MOD(B7-1之單點突變[W88A]，已知具僅結合CTLA4[38]及PD-L1之截短的變異體[只有Ig可變結構域])。所有構 建體在HEK-KO細胞中表現良好，第6B圖。進一步探查利用重鏈鍵聯格式之synTac蛋白質的表現能力(圖示說明於第2C圖)。為此，使用IGRP抗原決定部位作為靶向肽並使用PD-L1或人化抗CD28 scFv作為MOD，結果在HEK-KO細胞中再次顯示陽性表現變化形廓(第6C圖)。接著，以1L或更大的規模製造這些並在無內毒素的環境中透過Ni2+IMAC及尺寸排阻來純化成同質性。在T細胞增殖分析中使用所有IGRP和TUM構建體且在下列TCR-synTac-PD1橋聯實驗中使用HTLV構建體。
TCR-synTac-PD1橋聯：雖然在尺寸排阻後之溶液變化形廓為折疊良好之蛋白質的指示，較理想的為，在活性分析中使用這些試劑之前先驗證各synTac成分(MHC-抗原決定部位靶向機制和MOD二者)的完整性。使用先前描述之HEK-A6細胞作為陽性對照組，生成表現非同源TCR之細胞(AS01，對HLA-A0201限制性愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Bar)病毒抗原決定部位具反應性)，與未經轉導之親代細胞一起作為陰性對照組(分別稱為HEK-AS01和PARENTAL)。進行mCerulean螢光(TCR融合報告子)及TCR傳信複合物(CD3 ε表現代替物)之表面染色以確認TCR表現。以非螢光純化之HTLV-PD-L1 synTac變異體挑戰HEK-A6細胞並與其同源受體PD1(融合至鼠IgG2a)一起培養。使用經FITC標記之抗小鼠二級抗體檢測該PD-1-Fc融合物。FITC螢光(即，“橋聯”)係取決於同源TCR表面表現(如第7A-7B圖中所顯示者)。尤其是，當對 攜帶非同源TCR之HEK細胞或親本細胞(HEK-AS01，PARENTAL)進行挑戰時、當僅對FITC-PDL-Fc挑戰時或當MOD不存在時並未觀察到FITC螢光。
作用中之SynTac：T細胞分析。在T細胞抑制分析中測試抑制性synTac構建體以證明synTac平台之靶向力的概念。假設融合至PD-L1之synTac IGRP的輕鏈形式將特異抑制IGRP206-214特異性T細胞。從非肥胖型糖尿病轉基因小鼠純化用於8.3 T細胞受體之CD8+脾細胞。此脾細胞亞群主要含有CD8+T細胞，此CD8+T細胞特異於H-2Kd背景下之IGRP206-214肽。然後，在固定化之抗CD3抗體的存在下培養這些CD8+T細胞(已知可刺激多株T細胞活化的處理)，以可溶性形式之synTac IGRP-PD-L1或synTac TUM-PD-L1處理經刺激的培養物以檢查具有任何抑制作用之抗原特異性。以不含PD-L1之synTac IGRP形式作為用於MOD結構域之效應子對照組。在接種前，以羧基螢光琥珀醯亞胺酯(CFSE)(一種螢光胞漿染料，其強度在每次細胞***時減半)標記細胞以監測經T細胞活化誘導之細胞增殖程度。培養5天後，收穫細胞並使用流式細胞儀檢測存活力和增殖情況。亦使用複合式流式細胞儀微珠分析檢查上清液中CD8+T細胞效應子細胞因子IFNγ和TNFα的表現。如第8A-8D圖中所示，所有檢查之CD8+T細胞活化參數係以抗原特異性及效應子(即，MOD)結構域依賴方式受遏制。亦即，相對於TUM-PD-L1 synTac或IGRP-(無PD-L1)而言，IGRP- PD-L1 synTac受到高度遏制，這指出synTac之活性係依賴肽-MHC和MOD結構域二者(第8D圖)。SynTac能夠抑制IFNγ分泌達到約100倍並導致絕大多數之細胞死亡，這表明攜帶PDL1作為MOD結構域之synTac能夠功能上抑制及消除針對性特異性。
親和力減弱：使用PD-L/PDL-1系統作為調節結構域的可能問題為PD-L1具有結合一個以上之受體的潛力，而伴隨下游傳信之差異。PD-L1顯示出可同時結合B7-1和PD-1。當以獨立之Fc融合物形式進行測試時，為了避免脫靶結合的錯雜，可使用僅結合所需之目標，PD-1(例如，具體的說，G119D和G119R及其他本文中所討論者)，但同時保留其T細胞抑制潛力之單點突變體。值得注意的是，該單獨之突變體PD-L1 Fc融合物可為用於免疫調節的有用試劑。在synTac之背景下，這些突變體提供一系列之PD-1結合親和力。攜帶G119D和G119R之基於IGRP的synTac融合蛋白突變體現已被製造出。
模組化設計：可溶性單價MHC分子對其同源T細胞受體具有固有之低親和力，因此不曾作為用於診斷或治療的有用試劑。而二聚體型MHC複合物已用於各種系統中以將抗原特異性T細胞可視化[39]，較高親合力MHC四聚體及較高階之多聚體較常被使用[40]。從目前的工作可清楚知道目前的二聚體型synTac結構使折疊良好之蛋白質高度表現並引發針對性T細胞反應，然而，在選擇之情況中，藉由增加效價來增強T細胞靶向潛力以擴充 該synTac技術可能是有利的。為此目的，再次設計攜帶IGRP靶向機制之synTac變異體，在IgA和IgM Fc區之背景下，以PD-L1 MOD作為輕鏈鍵聯。透過二硫鍵與J鏈共價結合，該IgA和IgM支架可分別允許四聚體和十聚體為基礎之呈現。生成慢病毒，轉導入HEK-KO細胞並測試其表現，結果支持具有表現這些試劑的初步能力。若需要時，可將MOD直接連接J-鏈成為N端、C端或雙融合物，以改變MOD對靶向分子之效價。此外，由於該synTac構型的靈活性，經由使用雙重鏈/輕鏈鍵聯，可同時呈現數個肽抗原決定部位或MOD(例如，三特異性)。此外，其他MOD，包括，但不限於用於活化之4-1BBL和抗CD28和用於抑制之B7W。選擇構建體可利用另外之靶向抗原決定部位。再者，可使用具有較高效價之synTac變異體(IgA和IgM)及所描述之非化學計量式連接之MOD(例如J-鏈鍵聯)。
實施例2：三聚體SynTac多肽之生成
刺激性MOD(4-1BBL)受體三聚體表現：生成攜帶活性4-1BBL之synTac的最初努力係利用輕鏈鍵聯變異體(第3A圖)。此係以單一轉染形式(所有片段編碼在單一質粒上)表現，由病毒P2A序列***並導致高度表現之折疊良好的蛋白質(第6B圖，第5道)。凝膠過濾變化略圖結合多角度光散射(MALS)數據表明該初始形式為折疊良好之二聚體(如第10B圖、第9B圖中所示)。已觀察到 4-1BBL(TNF族配體)需要三聚體化(例如相同蛋白質之三個複本，同質三聚體)以完全活化。為了實現三聚體化，將攜帶4-1BBL之synTac構建體與“游離”4-1BBL(不具親和標記物之單獨的4-1BBL[殘基50-254，包括近膜區和TNF同源結構域，第10A圖；第9A圖])二者表現在相同細胞上(例如共同表現)以允許天然組裝和三聚體化，如第10C圖中所示(原始synTac構建體以黑色表示，游離BBL以灰色表示)(共同表現第9A圖和第9B圖構建體)。凝膠過濾色層分析結合多角度光散射(MALS)數據支持該新形式為所需之三聚體(第11A-11B圖，標記為synTac編號40+ 51)。如下述(MOD最優化)，可將該4-1 BBL構建體進一步優化以進一步改善表現和純化變化形廓並增加穩定性和再現性。
刺激性MOD受體結合及人/鼠交叉反應：雖然尺寸排阻之後的溶液變化形廓為蛋白質折疊良好之指示，在活性分析中使用這些試劑之前先驗證各synTac成分(MHC-抗原決定部位靶向機制和MOD二者)之完整性較理想。此特殊靶向機制(在小鼠Kd之背景下為IGRP肽)已被徹底驗證(第7A-7B圖)，因而進一步研究4-1BBL受體結合之程度。為此，以重組人或小鼠4-1BB-Fc融合蛋白(來自商業來源)將蛋白A微珠塗層至飽和。然後，使用經4-1BB塗層之微珠來結合攜帶4-1BB配體(二聚體和三聚體形式)的synTac構建體(為共調節結構域)，接著為特異於synTac重鏈同種型之螢光檢測抗體。然後，藉由高通 量流式細胞儀測量synTac 4-1BBL特異結合珠源性4-1BB的程度。使用此系統探查在synTac支架之背景下，4-1BBL對人和鼠4-1BB二者之交叉反應程度和相對親和力。攜帶4-1BBL之synTac(稱為三聚體、二聚體)顯示出結合同源受體，但不結合“無受體”(被稱為無MOD)之Fc結合微珠，表明為折疊良好且活性之蛋白試劑(第12圖)。此外，該三聚體以預期為雙重三聚體型接合之親和力範圍結合，而原始二聚體顯示出結合親和力降低10倍，再次支持二聚體型呈遞。使用無MOD之synTac(標記為無MOD)作為陰性對照組，顯示出不結合4-1BBL受體。值得注意的是，所有構建體均結合鼠和人受體(交叉反應)，因此將允許直接推展至老鼠活體內試驗。
活體外T細胞刺激分析：為了測試4-1BBL synTac之活性，首先從8.3 TCR轉基因NOD小鼠純化CD8脾細胞並以CFSE進行螢光標記以在玻管內以可溶性IGRP-4-1BBL synTac(二聚體和三聚體)或可溶性TUM-41BBL synTac(第13圖)處理之前追踪增殖情形。以單獨之培養基或固定化之抗CD3處理對照組。培養4天後，藉由FACS檢查細胞之存活力(排除DAPI)和增殖情形(CFSE稀釋)。藉由流式細胞計數性ELISA來檢查上清液之IFNγ和TNFα水準。如在syntac-PDL1的情況中(第8A-8D圖)，snytac-41BBL之玻管內活性為高度抗原特異性，這導致在syntac IGRP-41BBL的情況中，相對於TUM-41BBL而言，具有高出許多之存活力、增殖及細胞 因子釋出。如所預期者，三聚體4-1BBL對充分的活性(例如增殖、存活力和細胞因子釋出)是必要的。此外，對IGRP-41BBL之反應優於對固定化之抗CD3基準，表明該可溶性syntac-41BBL可傳介高度T細胞活化。本文所描述之所有進一步之相關實驗係採用三聚體syntac-41BBL。
活體內T細胞之刺激-單一劑量：進一步檢查synTac-41BBL是否可在活體內對T細胞活化發揮類似的作用。以Syntac IGRP-41BBL處理NOD小鼠，並相對於synTac TUM-41BBL比較，且測定脾臟中之IGRP特異性CD8+T細胞的頻率。不像TCR轉基因NOD小鼠(其中大多數T細胞具有定義之選殖株型)，標準NOD小鼠具有高度多樣性TCR組庫，且為較佳之逼近“自然”的免疫組庫。經由腹膜內途徑為NOD小鼠注射synTac IGRP-41BBL、synTac TUM-41BBL或PBS，並在注射後6天處死小鼠。然後，使用適當之肽-MHC五聚體染色，經由流式細胞術檢查脾細胞之IGRP特異性CD8 T細胞的相對頻率。相對於對照組，IGRP-41BBL處理與IGRP特異性CD8 T細胞之頻率高出很多有關。此外，在活體內擴充之IGRP特異性細胞當在玻管內被重新刺激時能夠製造IFNγ。這些結果支持syntac-41BBL以抗原特異性方式擴充功能性CD8效應子T細胞的能力(第14圖)。
活體內T細胞之刺激-多劑量：檢查改變之治療方案對在活體內活化T細胞的效果，尤其注意已建立之腫瘤抗原，“TUM”九聚體肽。在二週之期間內使用三個 劑量(相對於先前之單劑量)之synTac IGRP-41BBL處理NOD小鼠並相對於synTac TUM-41BBL比較。測定IGRP-或TUM特異性CD8 T細胞之頻率。經由腹膜內途徑為NOD小鼠注射synTac IGRP-41BBL、synTac TUM-41BBL或PBS，並在注射後7天處死小鼠。然後，使用適當之肽-MHC五聚體染色，經由流式細胞術檢查血液(PBMC)和脾細胞之IGRP-或TUM特異性CD8 T細胞的相對頻率。同樣地，相對於不相關的抗原和PBS對照組，IGRP-41BBL處理與IGRP特異性CD8 T細胞之頻率高出很多有關，而TUM-41BBL處理與TUM特異性CD8 T細胞之頻率高出很多有關(第15圖)。類似的模式可在脾臟中觀察到。這些結果支持多劑量synTac-41BBL方案以抗原特異性方式擴充功能性CD8效應子T細胞的能力，包括抗原特異性擴充罕見腫瘤特異性T細胞。
活體內T細胞抑制作用：經由腹膜內途徑為非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠注射synTac IGRP-41BBL、synTac TUM-41BBL或PBS，並在注射後6天分離出胰臟並使用適當之肽-MHC五聚體染色，經由流式細胞術檢查胰臟細胞之IGRP特異性CD8+ T細胞的相對頻率。如第23圖所示，與對照組經synTac TUM-PDL1處理和經PBS處理之小鼠相比較，IGRP-41BBL處理與IGRP特異性CD8+T細胞之頻率低很多有關。這些數據證明在注射單劑量synTac後抗原特異性T細胞在活體內耗盡。
MOD最優化：在實驗過程中可觀察到大部分 靶蛋白(4-1BBL三聚體型synTac)在尺寸排阻色層分析法中顯示出高階多聚體之特性且會隨時間降解，這可能是透過“游離”BBL之釋出/交換。因此，尋求穩定性增加且容易製造之4-1BBL骨架的重點在共價組裝4-1BBL。為此，探討在4-1BBL之TNF同源結構域內使用經基因工程處理之二硫鍵(第16A圖；二硫化物係以箭頭指示；第9C-9E圖)。從X射線結構(PDB 2X29)之分析，選擇三組可能具有二硫鍵潛力且不太可能干擾受體結合之可能的殘基對。各構建體中的二個天然殘基被半胱胺酸殘基(Q94C：P245C)取代，Q94C：P242C和Q89C：L115C(分別稱為synTac 69、70和71)，其在人細胞中與庇有該相同突變(分別稱為98、99、100)之“游離”非標記形式共同表現以允許共價鎖定，並藉由非還原性SDS-PAGE分析來觀察二硫鍵結合程度(第18圖；下列共同表現構建體稱為DL1(二硫鍵鎖定-1，synTac69/98)、DL2(70/99)及DL3(71/100))。所有三種構建體均充分表現，允許二硫鍵鎖定並結合受體(第17圖)。雖然這些synTac-4-1BBL之共價“二硫鍵鎖定”變異體解決所討論之穩定性問題，但仍需要共同表現“游離”BBL(共同表現)以允許三聚體化，而此可使得刺激性synTac之製造和生藥製造變得複雜。這個障礙的一種解決方法被發現是將4-1BBL-TNF同源結構域以單一連續構建體，稱為單鏈三聚體之形式表現(4-1 BBL-SCT，第16B圖；第9F圖)。具體而言，藉由二個(G4S)5連接子序列將三份4-1 BBL殘基80-246(僅TNF同源結構 域)之複本共價結合在一起(第16B圖，連接子係以曲線說明；第9F圖)。表現和凝膠過濾加上多角度光散射(MALS)數據支持該新形式為所需之共價單鏈三聚體(第18圖)且與4-1 BBL受體良好結合(第17圖)。
儘管本發明已參考其特殊實施態樣描述，本技藝之技術熟習人士應理解可作出各種改變並可取代等效物，而會不偏離本發明之真正的精神和範圍。此外，可作出許多修改以使特殊情況、材料、組合物、方法、方法步驟適應本發明之目的、精神和範圍。所有該等修改係意圖包含在本文所附之申請專利範圍內。
參考資料
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<221> 重複子
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<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Figure 110108178-A0305-02-0203-78
<210> 66
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Figure 110108178-A0305-02-0204-79
<210> 67
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Figure 110108178-A0305-02-0204-80
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 68
Figure 110108178-A0305-02-0204-81
<210> 69
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 69
Figure 110108178-A0305-02-0205-82
Figure 110108178-A0305-02-0206-83
<210> 70
<211> 939
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Figure 110108178-A0305-02-0206-84
Figure 110108178-A0305-02-0207-85
Figure 110108178-A0305-02-0208-86
Figure 110108178-A0305-02-0209-87
Figure 110108178-A0305-02-0210-88
<210> 71
<211> 939
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 71
Figure 110108178-A0305-02-0210-89
Figure 110108178-A0305-02-0211-90
Figure 110108178-A0305-02-0212-91
Figure 110108178-A0305-02-0213-92
Figure 110108178-A0305-02-0214-93
<210> 72
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Figure 110108178-A0305-02-0214-94
Figure 110108178-A0305-02-0215-95
<210> 73
<211> 939
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Figure 110108178-A0305-02-0215-96
Figure 110108178-A0305-02-0216-97
Figure 110108178-A0305-02-0217-98
Figure 110108178-A0305-02-0218-99
Figure 110108178-A0305-02-0219-100
<210> 74
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Figure 110108178-A0305-02-0220-101
Figure 110108178-A0305-02-0221-102
<210> 75
<211> 939
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 75
Figure 110108178-A0305-02-0221-103
Figure 110108178-A0305-02-0222-104
Figure 110108178-A0305-02-0223-105
Figure 110108178-A0305-02-0224-106
Figure 110108178-A0305-02-0225-107
<210> 76
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Figure 110108178-A0305-02-0225-108
Figure 110108178-A0305-02-0226-109
<210> 77
<211> 1285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 77
Figure 110108178-A0305-02-0226-110
Figure 110108178-A0305-02-0227-111
Figure 110108178-A0305-02-0228-113
Figure 110108178-A0305-02-0229-114
Figure 110108178-A0305-02-0230-115
Figure 110108178-A0305-02-0231-116
Figure 110108178-A0305-02-0232-117
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 78
Figure 110108178-A0305-02-0232-118
Figure 110108178-A0305-02-0233-119
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<400> 79
Figure 110108178-A0305-02-0233-120
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> 彌猴
<400> 80
Figure 110108178-A0305-02-0233-121
Figure 110108178-A0305-02-0234-122
<210> 81
<211> 118
<212> PRT
<213> 家牛
<400> 81
Figure 110108178-A0305-02-0234-123
Figure 110108178-A0305-02-0235-124
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 82
Figure 110108178-A0305-02-0235-125
<210> 83
<211> 227
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 83
Figure 110108178-A0305-02-0235-126
Figure 110108178-A0305-02-0236-127
<210> 84
<211> 325
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 84
Figure 110108178-A0305-02-0237-128
Figure 110108178-A0305-02-0238-129
<210> 85
<211> 246
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 85
Figure 110108178-A0305-02-0238-130
Figure 110108178-A0305-02-0239-131
<210> 86
<211> 383
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 86
Figure 110108178-A0305-02-0239-132
Figure 110108178-A0305-02-0240-133
Figure 110108178-A0305-02-0241-134
<210> 87
<211> 276
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 87
Figure 110108178-A0305-02-0241-135
Figure 110108178-A0305-02-0242-136
<210> 88
<211> 353
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 88
Figure 110108178-A0305-02-0243-137
Figure 110108178-A0305-02-0244-138
<210> 89
<211> 222
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 89
Figure 110108178-A0305-02-0244-139
Figure 110108178-A0305-02-0245-140
<210> 90
<211> 327
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 90
Figure 110108178-A0305-02-0245-141
Figure 110108178-A0305-02-0246-142
Figure 110108178-A0305-02-0247-143
<210> 91
<211> 365
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 91
Figure 110108178-A0305-02-0247-144
Figure 110108178-A0305-02-0248-145
<210> 92
<211> 362
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 92
Figure 110108178-A0305-02-0249-146
Figure 110108178-A0305-02-0250-147
<210> 93
<211> 366
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 93
Figure 110108178-A0305-02-0250-148
Figure 110108178-A0305-02-0251-149
Figure 110108178-A0305-02-0252-150
<210> 94
<211> 290
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 94
Figure 110108178-A0305-02-0252-151
Figure 110108178-A0305-02-0253-152
<210> 95
<211> 290
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 95
Figure 110108178-A0305-02-0253-153
Figure 110108178-A0305-02-0254-154
Figure 110108178-A0305-02-0255-155
<210> 96
<211> 254
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 96
Figure 110108178-A0305-02-0255-156
Figure 110108178-A0305-02-0256-169
<210> 97
<211> 302
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 97
Figure 110108178-A0305-02-0256-157
Figure 110108178-A0305-02-0257-158
<210> 98
<211> 183
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 98
Figure 110108178-A0305-02-0258-159
<210> 99
<211> 273
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 99
Figure 110108178-A0305-02-0259-160
Figure 110108178-A0305-02-0260-161
<210> 100
<211> 288
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 100
Figure 110108178-A0305-02-0260-162
Figure 110108178-A0305-02-0261-163
<210> 101
<211> 329
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 101
Figure 110108178-A0305-02-0261-164
Figure 110108178-A0305-02-0262-165
Figure 110108178-A0305-02-0263-166
<210> 102
<211> 281
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 102
Figure 110108178-A0305-02-0263-167
Figure 110108178-A0305-02-0264-168

Claims (27)

  1. 一種多聚體多肽，其包含：異源二聚體多肽，該異源二聚體多肽包含：a)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex)(MHC)多肽；b)第二多肽，該第二多肽包含第二MHC多肽；及c)至少一個免疫調節多肽；其中該第一及/或第二多肽包含該至少一個免疫調節多肽，其中該第一MHC多肽為β2微球蛋白多肽且其中該第二MHC多肽為第I型MHC重鏈多肽，其中該肽抗原決定部位為病原體相關之抗原決定部位，且選擇性地，其中該多聚體多肽包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架。
  2. 如請求項1之多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含：a1)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及 b1)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)至少一個免疫調節多肽；ii)第二MHC多肽；及iii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或a2)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一個免疫調節多肽；及b2)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽；或a3)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b3)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一個免疫調節多肽；或a4)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包 含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b4)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；和ii)至少一個免疫調節多肽；或a5)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b5)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)至少一個免疫調節多肽；和ii)第二MHC多肽；或a6)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；ii)第一MHC多肽；及iii)至少一個免疫調節多肽；及b6)第二多肽，該第二多肽包含：i)第二MHC多肽。
  3. 如請求項1之多聚體多肽，其中該非Ig支架為XTEN多肽、轉鐵蛋白(transferrin)多肽、Fc受體 多肽、彈性蛋白樣多肽、絲綢樣多肽或絲綢彈性蛋白樣多肽。
  4. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該至少一個免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽、B7-1多肽、B7-2多肽、ICOS-L多肽、OX-40L多肽、CD80多肽、CD86多肽、PD-L1多肽、FasL多肽、細胞因子及PD-L2多肽。
  5. 如請求項4之多聚體多肽，其中該至少一個免疫調節多肽為細胞因子。
  6. 如請求項4之多聚體多肽，其中該至少一個免疫調節多肽係選自：4-1BBL多肽和CD80多肽。
  7. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其包含2或多個免疫調節多肽。
  8. 如請求項7之多聚體多肽，其中該2或多個免疫調節多肽為串列的。
  9. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含：a1)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b1)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)至少一個免疫調節多肽； ii)第二MHC多肽；及iii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽。
  10. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該多聚體多肽包含：a3)第一多肽，該第一多肽依N端至C端之順序包含：i)肽抗原決定部位；和ii)第一MHC多肽；及b3)第二多肽，該第二多肽依N端至C端之順序包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；及iii)至少一個免疫調節多肽。
  11. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該病原體相關之抗原決定部位為病毒、細菌或原生動物相關之抗原決定部位。
  12. 如請求項11之多聚體多肽，其中該病原體相關之抗原決定部位為存在於經病毒感染之細胞上之抗原決定部位。
  13. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該第一多肽和該第二多肽係經由二硫鍵彼此連接。
  14. 如請求項13之多聚體多肽，其中該β2微球蛋白多肽和該MHC重鏈多肽係經由二硫鍵聯結，該 二硫鍵聯結該β2微球蛋白多肽之半胱胺酸(Cys)殘基與該MHC重鏈多肽之Cys殘基。
  15. 如請求項14之多聚體多肽，其中位於該β2微球蛋白多肽之胺基酸殘基12的Cys與位於該MHC重鏈多肽之胺基酸殘基236的Cys係經二硫鍵鍵結。
  16. 如請求項14之多聚體多肽，其中該第一多肽包含介於該肽抗原決定部位和該β2微球蛋白多肽之間的連接子，且其中該二硫鍵連接存在於該連接子之Cys與該MHC重鏈多肽之Cys。
  17. 如請求項16之多聚體多肽，其中該第一多肽包含介於該肽抗原決定部位和該β2微球蛋白多肽之間的連接子，且其中該二硫鍵連接取代該連接子之Gly2的Cys與取代該MHC重鏈多肽之Tyr84的Cys。
  18. 如請求項1至3中任一項之多聚體多肽，其中該免疫調節多肽為活化免疫調節多肽。
  19. 一種蛋白質，其包含2個如請求項1至18中任一項之多聚體多肽，其中該2個多聚體多肽之每一者包含免疫球蛋白(Ig)Fc多肽，且其中該2個多聚體多肽係經由各別Ig Fc多肽之間的一或多個二硫鍵聯結。
  20. 一種核酸，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如請求項1至18中任一項之多聚體多肽的第一及/或第二多肽，其中該第一或第二多肽包含至少一個免疫調節多肽。
  21. 一種表現載體，其包含如請求項20之核酸。
  22. 一種宿主細胞，其係經如請求項21之表現載體基因工程修飾。
  23. 一種選擇性地調節與病原體相關之抗原決定部位結合的T細胞之活性之方法，該方法包含令該T細胞在活體外與如請求項1至18中任一項之多聚體多肽或如請求項19之蛋白質接觸，其中該接觸選擇性地調節該T細胞之活性。
  24. 一種如請求項1至18中任一項之多聚體多肽或如請求項19之蛋白質或如請求項20之核酸或如請求項21之表現載體於製備藥物之用途，該藥物係用於選擇性地調節個體的與病原體相關之抗原決定部位結合的T細胞之活性，其中該多聚體多肽或該蛋白質經投予以選擇性地調節存在於該個體的與病原體相關之抗原決定部位結合的T細胞之活性。
  25. 一種如請求項1至18中任一項之多聚體多肽、或如請求項19之蛋白質、或如請求項20之核酸、或如請求項21之表現載體、或一或多個mRNA於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體的病原體感染，其中該一或多個mRNA包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如請求項1至18中任一項之多聚體多肽或如請求項19之蛋白質。
  26. 一種組成物，其包含： a)如請求項1至18中任一項之多聚體多肽或如請求項19之蛋白質；和b)醫藥上可接受之賦形劑。
  27. 一種如請求項1至18中任一項之多聚體多肽或如請求項19之蛋白質或如請求項20之核酸或如請求項21之表現載體於製備藥物之用途，該藥物係用於選擇性地調節個體的與病原體相關之抗原決定部位結合的T細胞之活性，其中該T細胞為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
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