TWI767343B - 珍珠貝美白因子、其製備方法及用途 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一種珍珠貝美白因子的製備方法，其包括如下步驟：步驟1）將蚌殼粉碎後，過篩，獲得小顆粒蚌殼粉；步驟2）將蚌殼粉與弱酸水溶液混合後，攪拌分解，分離出固體為粗蛋白；步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨，再與pH值6.0-7.5緩衝溶液混合，將混合液通過超高壓100-200Mpa、40~80℃處理20~40分鐘後，再在超音波震盪條件下、在40-60℃下與蛋白酶混合反應2-7小時；步驟4）在85-100℃下攪拌20-50分鐘滅酶後，通過過濾膜壓濾獲取無菌過濾液；步驟5）將凍乾保護劑與無菌過濾液混合，在預凍後放入真空冷凍乾燥倉中進行凍乾12-20小時；最終收穫水分含量在2-5%的凍乾粉。本發明還公開了所述方法得到的一種珍珠貝美白因子在製備內皮素拮抗劑中的用途。本發明工藝簡單，得到的產品美白效果明顯。

Description

珍珠貝美白因子、其製備方法及用途

本申請涉及一種珍珠貝美白因子及其製備方法、以及該珍珠貝美白因子的用途，尤其涉及一種珍珠貝美白因子的凍乾粉及其製備方式、以及該珍珠貝美白因子對內皮素的拮抗作用之用途。

美白是亞洲人最為關心的護膚需求，針對肌膚美白功效機理的研究，其中抑制內皮素刺激細胞分泌黑色素和抑制酪胺酸酶活性是美白作用中兩個關鍵環節。因此國內外很多研究單位展開內皮素拮抗劑的尋找工作，例如專利（申請號：200610030123.5，發明名稱：具內皮素拮抗作用的天然蛋白的酶介混合肽）列舉了很多相關蛋白多肽的製備。但該專利忽略了很多低值硬蛋白產物，尤其是目前產量很大的三角帆蚌的蚌殼。該蚌殼與珍珠存在明顯區別，為此已有國家標準為鑒別珍珠粉和蚌殼粉提供近紅外光鑒別的方法，另外在中藥中兩者功效就存在很多的區別。蚌殼的研究，國內外主要鮮有報導，即便有報導，也主要集中三角帆蚌淨化水質的研究。自去年發現燒製後的蚌殼粉具備超強吸附重金屬的作用後，我們對蚌殼的研究也日益開始重視，因此開始探索三角帆蚌中的成分，試探其是否具備美白作用，以及作用機理如何。

這項工作目的在於提升蚌殼的附加價值，開拓其在護膚品與保健品中的應用領域。在已有珍珠複合美白因子專利申請的基礎上，我們對其製備方法再提出創新，在基於機械化學的基礎上，保留部分蚌殼中的鈣質，並且將蚌殼中的蛋白進行選擇性的酶切，在達預定的酶解度後進行凍乾乾燥，獲取得到具備內皮素拮抗作用的美白凍乾粉。該技術克服了珍珠蛋白水解液不穩定、活性成分分子量要求嚴格以及優化鈣離子與活性多肽的比例的探索工作。而這些都是現有技術中未考慮也未克服的問題。而且該美白效果明顯，符合期望，並且使低廉的蚌殼粉能得到顯著的附加價值，廣泛應用於美白護膚品和補鈣的保健食品中。

本申請所要解決的問題是如何通過低廉大量副產物就能生產出具備內皮素抑制的產品。具體有：第一，預處理：如何處理蚌殼中的鈣質，如何處理蚌殼粉的粉末粒徑；第二、如何提高蚌殼半成品酶解的速率；第三、如何確定酶的種類和酶解度。第四、如何類比皮膚黑色素生成的模型以及美白機理的研究。

基於以上這些問題，本發明的發明點在於：1.保留蚌殼中的部分鈣質，有利於提高皮膚鈣離子通道，有利於蚌殼多肽越過皮膚屏障，作用於黑色素細胞。2.本發明的發明人研究中發現，並不用進行酶解到2000Da以下的多肽才具備內皮素抑制作用，這將大大提高了利用率，而且利用三角帆蚌蚌殼這種低廉大量副產物就能生產出具備內皮素抑制的產品，這也是廢棄物再利用的發現。3.基於機械化學法促進蚌殼蛋白空間結構的打開，促進蛋白酶的酶解；4、建立起3D內皮素黑色素細胞模型，科學類比確定蚌殼多肽組成分有利於內皮素的拮抗以及抑制黑色素的轉移。

本提供了一種珍珠貝美白因子的製備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）將蚌殼粉碎後，過篩，獲得小顆粒蚌殼粉；

步驟2）將小顆粒蚌殼粉與重量百分比為10-20%的弱酸水溶液按1:5-20的重量比混合後，在30-70℃下100-200rpm速度下攪拌，充分分解1-4小時，分離出固體為粗蛋白；

步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨到清洗排放液中之檢測水中總溶解固體值(TDS值)在100-500ppm時，再與pH值6.0-7.5緩衝溶液混合得到一混合液，其中該混合液中粗蛋白與緩衝溶液的重量比為1:5-15，將該混合液通過超高壓100-200Mpa、40~80℃處理20~40分鐘後，再在超音波震盪條件下、在40-60℃下與蛋白酶混合反應2-7小時；

步驟4）在85-100℃下攪拌20-50分鐘滅酶後，通過過濾膜壓濾獲取無菌過濾液；

步驟5）凍乾保護劑與無菌過濾液按照重量體積比0.5~4：100g/mL的比例混合，在液態氮或者-70~-85℃條件下進行預凍，隨後放入真空冷凍乾燥倉中進行凍乾12-20小時；最終收穫水分含量在2-5%的凍乾粉。

作為優選，在步驟1）中所述蚌殼在粉碎前進行預處理，即將蚌殼清洗乾淨，去除表皮汙物和藻類，曬乾；步驟1）所述過篩優選為過200目篩。

作為優選，步驟2）所述弱酸選自醋酸、乳酸、檸檬酸、碳酸、蘋果酸等中的一種或者多種；進一步優選為醋酸、乳酸或檸檬酸中的一種或者多種。

作為優選，步驟3）所述的pH值6.0-7.5緩衝溶液為PBS，Tris-HCl或檸檬酸緩衝液。

作為優選，步驟3）所述的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胃蛋白酶等中的一種或多種；進一步優選為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶中的一種或多種。

作為優選，步驟3）所述蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100-1:10g/mL。

作為優選，步驟4）所述過濾膜為0.22μm的過濾膜。

作為優選，步驟5）所述的凍乾保護劑為蔗糖、葡萄糖、麩胺酸、白蛋白、殼聚糖等中的一種或多種；進一步優選為蔗糖、葡萄糖或麩胺酸。

作為優選，本發明所述製備方法得到的凍乾粉可以罐裝於棕色的樣品瓶(vial)中，在1-10℃內進行儲存。

本發明還提供了一種珍珠貝美白因子，其由前述方法製備得到。

本發明還提供了所述珍珠貝美白因子在製備內皮素拮抗劑中的用途；所述內皮素拮抗劑可以為保健品或藥品等。

本發明所述方法獲得的珍珠貝美白因子有別於全成分酶解，以及定量選擇蛋白酶解液的分子量段的萃取方法，以上兩種方法是目前較為普遍的珍珠貝美白因子萃取的方式，本發明的優勢在於：

1、製備時效短，較以往萃取時間一般在3-7天，本發明萃取時間可以控制在2-4天，時效上縮短一半。

2、工藝簡便，接近於無損萃取。本發明脫鈣採用弱酸萃取，保留酸不溶有機物，隨後進行酶解萃取。不需要篩選蛋白進行分離，如果涉及萃取全部的蚌殼蛋白，涉及方法會很多，並且要去除蚌殼中的其他有機物，例如多糖、脂質等。

3、相近的現有技術中，需要將萃取物進行分子量段篩選，獲取2kda以內的蛋白多肽，會造成2kda以上蛋白的浪費，本發明利用工藝改進，提高酶解度，無需進行分子量段篩選。

4、美白效果更為明顯，本發明獲得的凍乾粉，較市面上賣的珍珠內皮素拮抗劑，其美白效果以及有效濃度更為明顯。

實施例1

一種珍珠貝美白因子的製備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）將蚌殼清洗乾淨，去除表皮汙物和藻類，曬乾粉碎後，過200目篩，獲得小顆粒蚌殼粉；

步驟2）將蚌殼粉與重量百分比為15%醋酸溶液按照1:20的重量比混合在60℃下200rpm速度下攪拌充分分解3小時，分離固體得到粗蛋白；

步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨後（清洗液中TDS值為150ppm），與pH值7.5緩衝溶液PBS按重量比1:5混合，將混合液通過超高壓100Mpa、40℃處理30分鐘後，再在超音波震盪下60℃下與胰蛋白酶混合反應3小時，胰蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100g/mL；

步驟4）85℃攪拌30分鐘滅酶後，通過0.22μm過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，向無菌過濾液中分別加入蔗糖和白蛋白進行混合；蔗糖與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL，白蛋白與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL；

步驟5）將混合液在-85℃下預凍，然後進行凍乾獲取凍乾粉，即為珍珠貝美白因子凍乾粉，具有內皮素拮抗作用。

實施例2

一種珍珠貝美白因子的製備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）將蚌殼清洗乾淨，去除表皮汙物和藻類，曬乾粉碎後，過200目篩，獲得小顆粒蚌殼粉；

步驟2）將蚌殼粉與重量百分比為10%乳酸溶液按照1:20的重量比混合在60℃下200rpm速度下攪拌充分分解4小時，分離固體得到粗蛋白；

步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨後（清洗液中TDS值為100ppm），與pH值7.5緩衝溶液Tris-HCl 按重量比1:10混合，將混合液通過超高壓100Mpa、40℃處理30分鐘後，再在超音波震盪下60℃下與中性蛋白酶混合反應3小時，中性蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100g/mL；

步驟4）85℃攪拌35分鐘滅酶後獲取上清液，通過0.22μm過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，向無菌過濾液中分別加入蔗糖和麩胺酸進行混合；蔗糖與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL，麩胺酸與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL；

步驟5）將混合液在-85℃下預凍，然後進行凍乾獲取凍乾粉，即為珍珠貝美白因子凍乾粉，具有內皮素拮抗作用。

實施例3

一種珍珠貝美白因子的製備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）將蚌殼清洗乾淨，去除表皮汙物和藻類，曬乾粉碎後，過200目篩，獲得小顆粒蚌殼粉；

步驟2）將蚌殼粉與重量百分比為20%檸檬酸溶液按照1:5的重量比混合在50℃下100rpm速度下攪拌充分分解3小時，分離固體得到粗蛋白；

步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨到清洗液中TDS值在120ppm時，再與pH值7.0檸檬酸緩衝溶液按重量比1:15混合，將混合液通過超高壓200Mpa、45℃處理40分鐘後，再在超音波震盪下40℃下與木瓜蛋白酶混合反應7小時，木瓜蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100g/mL。

步驟4）100℃攪拌20分鐘滅酶後獲取上清液，通過0.22μm過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，向無菌過濾液中分別加入殼聚糖和麩胺酸進行混合；殼聚糖與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL，麩胺酸與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL；

步驟5）將混合液在液態氮條件下預凍，然後進行凍乾獲取凍乾粉，即為珍珠貝美白因子凍乾粉，具有內皮素拮抗作用。

實施例4

一種珍珠貝美白因子的製備方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）將蚌殼清洗乾淨，去除表皮汙物和藻類，曬乾粉碎後，過200目篩，獲得小顆粒蚌殼粉；

步驟2）將蚌殼粉與重量百分比為15%乳酸溶液按照1:5重量比混合在70℃下100rpm速度下攪拌充分分解2小時，分離固體得到粗蛋白；

步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨到清洗液中TDS值在500ppm時，再與pH值7.5Tris-HCl緩衝溶液按重量比1:5混合，將混合液通過超高壓200Mpa、800℃處理20分鐘後，再在超音波震盪下55℃下與木瓜蛋白酶混合反應5小時，木瓜蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100g/mL。

步驟4）90℃攪拌20分鐘滅酶後獲取上清液，通過0.22μm過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，向無菌過濾液中分別加入殼聚糖和白蛋白進行混合；殼聚糖與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL，白蛋白與無菌過濾液的重量體積比為2:100g/mL；

步驟5）將混合液在液態氮條件下預凍，然後進行凍乾獲取凍乾粉，即為珍珠貝美白因子凍乾粉，具有內皮素拮抗作用。

測試例1—成分匹配

珍珠貝美白因子成分重量驗證，確保具備內皮素拮抗劑相應成分。進行電泳分子量檢測，用以驗證本發明所發明的萃取物與已有的珍珠內皮素拮抗劑一致。

如圖1，試驗證明，本發明能夠利用低成本貝殼為生物質原料，製備出與珍珠中內皮素拮抗劑分子量分佈相一致的產品。

測試例2—功效性強

為充分證明本發明製備的珍珠貝美白因子是否具備內皮素拮抗作用，鑒於內皮素是通過角質形成細胞的分泌刺激黑素細胞分泌黑色素，本發明首次選用黑色素細胞的3維模型，利用內皮素（ET-1）誘導黑色素模型形成黑色素沉積，從而更好模仿皮膚應激過程中的色素沉積。以3D黑色素皮膚模型（購於廣州博溪生物科技有限公司）為測試工具，採用表面給藥的方式，將樣品類比人體使用過程，均勻塗布於3D黑色素皮膚模型體外類比表面，通過外觀顏色變化、黑色素含量、黑色素分佈等指標，評估樣品對內皮素引起的黑色素合成的抑制作用及美白功效。

1. 實驗方案

表1 基於ET-1刺激的黑色素模型的活性物美白體外評估方案

日期	項目	實驗分組
分組	空白組	陰性對照組ET-1(5nM)	SPE-0.1%	SPE-1%	SPE-0.01%	OSPE-0.1%	OSPE-1%	OSPE-0.01%
第零天	樣品給藥	NO	NO	NO	NO	NO	NO	NO	NO
刺激條件	NO	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1
試驗操作	YES	NO	NO	NO	NO	NO	NO	NO
第三天	樣品給藥	NO	NO	YES	YES	YES	YES	YES	YES
刺激條件	NO	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1
試驗操作	YES	YES	NO	NO	NO	NO	NO	NO
第五天	樣品給藥	NO	NO	YES	YES	YES	YES	YES	YES
刺激條件	NO	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1	ET-1
試驗操作	NO	NO	NO	NO	NO	NO	NO	NO
第七天	試驗操作	表觀、L*值、黑色素含量、黑色素分佈
備註： 1.SPE為本發明的珍珠貝美白因子凍乾粉；OSPE為市場上購買的珍珠內皮素拮抗劑；稀釋溶劑為促滲體系（丙二醇：乙醇體積比為7:3）。 2.第1、3天試驗操作之測試項目包含「表觀、L*值檢測、黑色素含量」。

參照表1中的實驗分組及相應處理條件，自3D細胞模型建立後，除空白組外，從第零天起每天進行5nM的ET-1液之刺激處理，連續刺激3天後建立陰性對照組，於第三天將珍珠貝美白因子和珍珠內皮素拮抗劑塗佈於陰性對照組模型表面，給藥體積10μL/每次，每2天給藥一次，並以ET-1液連續刺激4天（每2天給藥刺激一次，共給藥刺激2次）結束操作，備用。

1.1 分組及給藥

取3D黑色素皮膚模型分成8組，分別為空白組（Control）、陰性對照組（ET-1），SPE-0.01%組、SPE-0.1%組、SPE-1%組、OSPE-0.01%組、OSPE-0.1%組、OSPE-1%組。測試空白組的表觀、L*值和黑色素含量。

除了空白組外，使用內皮素（ET-1）5nM對各組3D黑色素皮膚模型進行液下刺激處理，內皮素給藥體積10μL/每次，連續刺激3天，於第三天測試空白組和陰性對照組的表觀、L*值和黑色素含量。

然後除了空白組和陰性對照組外，使用本發明的珍珠貝美白因子（SPE）或市購的珍珠內皮素拮抗劑（OSPE）開始均勻塗抹給藥，給藥體積為10μL/每次，每2天給藥一次；每次使用珍珠內皮素拮抗劑給藥後，使用內皮素（ET-1）5nM進行一次給藥刺激，給藥體積為10μL/每次，給藥4天（即給藥2次）後結束操作，測試各組的表觀、L*值和黑色素含量。

其中，所述內皮素拮抗劑的給藥方式為：

SPE-0.01%組，將實施例1製備得到的珍珠貝美白因子凍乾粉用稀釋溶劑配製成重量百分比為0.01%的溶液進行給藥；

SPE-0.1%組，將實施例1製備得到的珍珠貝美白因子凍乾粉用稀釋溶劑配製成重量百分比為0.1%的溶液進行給藥；

SPE-1%組，將實施例1製備得到的珍珠貝美白因子凍乾粉用稀釋溶劑配製成重量百分比為1%的溶液進行給藥；

OSPE-0.01%組，將市購的珍珠內皮素拮抗劑用稀釋溶劑配製成重量百分比為0.01%的溶液進行給藥；

OSPE-0.1%組，將市購的珍珠內皮素拮抗劑用稀釋溶劑配製成重量百分比為0.1%的溶液進行給藥；

OSPE-1%組，將市購的珍珠內皮素拮抗劑用稀釋溶劑配製成重量百分比為1%的溶液進行給藥；

所述稀釋溶劑為丙二醇：乙醇體積比為7:3的混合溶劑。

1.2 模型表觀拍照觀察

對不同實驗組的模型進行表觀拍照觀察。若組織表面存在少量水分或樣品，用無菌棉棒小心吸乾組織表面。拍照在光線強度固定的攝影棚內進行。具體拍照操作標準如下：（1）相機模式：手動；拍照參數設置：焦距=5.8mm，孔徑=f/8，光圈F22，快門速度-1/80s，ISO=1600；(2)將黑色素模型放於比色卡的中心位置進行拍照。結果見圖2。

1.3 L*值檢測

對不同實驗組的模型進行 L*值檢測。具體檢測標準操作如下：（1）用手術刀片將模型沿小室邊緣環切取下；（2）將模型置於一個平整堅硬的白色平面上，按照色差儀使用說明，將色差儀檢測孔垂直對準模型表面進行檢測，每個模型重複讀數三次，並記錄資料。結果見表2。

表2 不同樣品細胞模型L*值的測定

第7天	組別	L* Average	PValue (control)	PValue (UVB)
BC	空白組	37.12± 0.43	/	/
NC	陰性對照組	27.84 ±0.88	0.0008	/
1	SPE-0.01%	32.54 ±4.70	/	0.277
2	SPE-0.1%	35.17±0.67**	/	0.0121
3	SPE-1%	38.90± 0.89***	/	＜ 0.0001
4	OSPE-0.01%	30.94± 0.05	/	0.8047
5	OSPE-0.1%	35.41 ±2.32***	/	0.0087
6	OSPE-1%	31.94± 1.34	/	0.4571

1.4 模型黑色素分佈檢測

對不同實驗組的模型進行黑色素分佈檢測，黑色素分佈檢測使用的模型為 L*值檢測後相應分組的模型。檢測方法如下：待測模型採用4%多聚甲醛固定模型，組織包埋，切片後進行Fontana-Masson染色，回收切片結果，使用顯微鏡拍照，進行兩次平行試驗。結果見圖3。

1.5 模型黑色素含量檢測

參照4.2.1的給藥方式進行處理後，對不同實驗組的模型進行黑色素含量檢測，黑色素含量檢測使用的模型為 L*值檢測後相應分組的模型。檢測方法如下：待測模型採用0.6mL 0.25%胰酶，37℃靜置處理2小時；結束後，用彎頭吸管反覆吹打組織約1分鐘；吹打結束後，用彎頭鑷子將脫離的PC膜取出；終止：添加 0.6mL 含 10%血清的 PBS， 2000r/min，離心 10分鐘，棄上清液；沉澱部分加入1N NaOH (含10%DMSO)，吹打數次，於 80℃水浴反應 30 分鐘，使黑色素顆粒完全溶解，然後 1200 r/min 離心 5 分鐘，取上清液加入 96 孔盤，每孔 200μL，於微量盤式分析儀A405nm 處檢測 OD 值。結果見表3。

表3珍珠貝美白因子對黑色素含量的影響

	黑色素含量（μg/ml）	P value（空白組）	P value（陰性對照組）
空白組	13.721.06
陰性對照組	24.97±3.52***	0.0002
SPE-0.01%	17.12±0.61**		0.0156
SPE-0.1%	15.88±1.72***		0.0034
SPE-1%	16.40±3.99***		0.0065
OSPE-0.01%	18.67±2.38		0.0925
OSPE-0.1%	16.53±0.69**		0.0076
OSPE-01%	16.60±1.19**		0.0083

本發明中的統計方法：

應用Graph Pad Prism作圖，結果表示為Mean±SD。各組間多重比較採用one-way ANOVA 單因子方差統計分析。所有的統計分析均為雙尾。 p＜0.05 被認為具有差異顯著性，其中*p＜0.05，0.005＜**p＜0.01，***p＜0.001，p值越小越顯著。

以上的實驗結果可見，本發明所發明的珍珠貝美白因子在萬分之一的濃度添加量中就具備非常顯著抑制黑色素的能力。相比較市面上採購的十幾萬一公斤的珍珠中萃取的內皮素拮抗劑，具備更加明顯的抑制黑色素的能力。不管在成本，副產物的開發，還是在美白效果上，本發明所發明的珍珠貝美白因子都具備十分明顯的提升作用。

測試例3—品質更為穩定

進行蚌殼為原料製備的萃取物和珍珠中內皮素拮抗劑的穩定性試驗，發現本發明所發明的珍珠貝美白因子具備更強的穩定性。

表4 兩種內皮素拮抗劑穩定性中理化指標比對

	本發明的珍珠貝美白因子	市售的珍珠內皮素拮抗劑
顏色	白色粉末，不吸潮不變色	白色粉末，略吸潮會變黃
溶水性	易溶於水	易溶於水
來源	蚌殼	珍珠
有效濃度	0.01%--0.5%	0.5—5%

無

圖1為不同樣品的電泳結果照片，可顯示其組成的分子量分佈；其中：1和6為大分子標準物；5為小分子蛋白標準物，由上往下依次為12kd，7kd；2為珍珠內皮素拮抗劑，3為本發明的珍珠貝美白因子，4為珍珠內皮素拮抗劑。

圖2為不同樣品作用於黑色素模型後在氣液培養第七天的表觀結果；

圖3為在模型取樣後對模型進行組織形態學銀染照片。

無

Claims (9)

1. 一種珍珠貝美白因子的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟： 步驟1）將蚌殼粉碎後，過篩，獲得小顆粒蚌殼粉； 步驟2）將小顆粒蚌殼粉與重量百分比為10-20%的弱酸水溶液按1:5-20的重量比混合後，在30-70℃下100-200rpm速度下攪拌，分解1-4小時，分離出固體為粗蛋白； 步驟3）將粗蛋白用去離子水清洗乾淨到清洗排放液中之檢測水中總溶解固體值(TDS值)在100-500ppm時，再與pH值6.0-7.5緩衝溶液混合得到一混合液，其中該混合液中粗蛋白與緩衝溶液的重量比為1:5-15，將該混合液通過超高壓100-200Mpa、40~80℃處理20~40分鐘後，再在超音波震盪條件下、在40-60℃下與蛋白酶混合反應2-7小時； 步驟4）在85-100℃下攪拌20-50分鐘滅酶後，通過過濾膜壓濾獲取無菌過濾液； 步驟5）凍乾保護劑與無菌過濾液按照重量體積比0.5~4：100g/mL的比例混合，在液態氮或者-70~-85℃條件下進行預凍，隨後放入真空冷凍乾燥倉中進行凍乾12-20小時；最終收穫水分含量在2-5%的凍乾粉。
2. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟2）所述弱酸選自醋酸、乳酸、檸檬酸、碳酸、蘋果酸中的一種或者多種。
3. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟3）所述的pH值6.0-7.5緩衝溶液為PBS，Tris-HCl或檸檬酸緩衝液。
4. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟3）所述的蛋白酶為中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或、胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胃蛋白酶中的一種或多種。
5. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟3）所述蛋白酶與混合液的重量體積比為1:100-1:10g/mL。
6. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟4）所述過濾膜為0.22μm的過濾膜。
7. 如請求項1所述之製備方法，其特徵在於：步驟5）所述的凍乾保護劑為蔗糖、葡萄糖、麩胺酸、白蛋白、殼聚糖中的一種或多種。
8. 一種珍珠貝美白因子，其由如請求項1至7中任一項所述之製備方法製備得到。
9. 一種如請求項8所述之珍珠貝美白因子在製備內皮素拮抗劑的用途。

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