TWI723363B - 用於治療癌症之包含引導rna及內切酶的藥學組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一用於治療癌症之包含crRNA及核酸內切酶作為活性成分的藥學組成物。本發明可依據病患或細胞類型之需求量身訂制，利用基於DNA與RNA之特異性結合性質而特異地治療癌細胞。本發明CRISPR PLUS系統之核酸酶活性可藉由將crRNA結合至特異地存在於癌細胞之基因而活化。因此，本發明之癌症治療效果比目前開發的其他抗癌劑更具特異性。

Description

用於治療癌症之包含引導RNA及內切酶的藥學組成物
本發明之實施例係有關包含引導RNA及核酸內切酶的抗癌組成物。
儘管癌症治療技術獲得重大突破，癌症仍然是人類最具威脅性的疾病。癌症可由多種致癌物引發，且可為一由染色體結構或DNA鹼基序列變異引起的疾病。癌症最顯著的特徵之一為經常性細胞增生。目前，最廣泛使用的抗癌療法為可有效殺死細胞的放射線療法，或使用靶向特定癌細胞的化合物或抗體治療。然而，第一線療法，包括化學療法/放射線療法，可造成病患的嚴重副作用與疼痛，係因其亦殺死身體內的正常增生細胞，如頭髮與免疫細胞。因此，需要開發能選擇性地僅殺死身體內癌細胞的抗癌劑。
欲滿足此等需求，目前正積極地研究標靶抗癌劑。標靶抗癌劑為藉由控制涉及癌症發展之特異性蛋白質或途徑而治療癌症的癌症藥物。藉由比較癌細胞與正常細胞之總蛋白質水平，可鑑定出對癌細胞具有特異性的標靶。換言之，特異地存在於癌細胞中或富含於癌細胞中之蛋白質可為潛在之標靶。標靶蛋白質之一範例為人類表皮生長因子受體2蛋白質(HER-2)。欲治療HER-2過度表現之乳癌與胃癌，已開發出數個標靶治療劑，係使用對抗HER-2的抗體，包括曲妥珠單抗(trastuzumab)(賀癌平(Herceptin® ))。另一方法為靶向導致癌症進展的突變體蛋白質。舉例而言，細胞增生傳訊BRCA1 與BRAF 分別以修飾之形式存在於許多乳癌與黑色素瘤中。已開發出許多靶向彼等類型之突變的標靶治療劑，且由其開發之標靶治療劑，經批准用於治療無法手術或轉移性癌症之病患。
近來開發的標靶治療劑與免疫治療劑皆依據在癌細胞中特異地表達的生物標記蛋白質。然而，特異地存在於癌細胞中的生物標記蛋白質與抗癌劑之間的交互作用強度不具特異性，且有時可導致不良副作用。此外，儘管標靶治療劑與免疫治療劑比常規化學治療劑的毒性更低，但仍有許多不良副作用的報導。
因此，在抗癌治療領域中，仍需開發特異地靶向體內癌細胞的抗癌劑。特別的是，依據DNA序列差異(其為區分癌細胞之最顯著特徵)開發抗癌劑，為人類長久以來的願望。
技術問題
癌細胞中存在之染色體的結構異常或與正常細胞之彼等不同的癌細胞鹼基序列，可作為區分癌細胞與正常細胞的重要標準。因此，此類染色體或鹼基序列差異，可作為癌症治療的重要靶標。據此，實施例之一目的在於提供一用於治療癌症之藥學組成物，其藉由靶向特異地存在於癌細胞中之序列而呈現抗癌效果。問題之解決方案
欲達到上述目的，一實施例提供一用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸及一核酸酶，以作為活性成分。
同時，一實施例提供一用於治療癌症之藥學組成物，其包含上述組成物。
此外，一實施例提供一用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一載體以作為活性成分，該載體含有一互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸之多核苷酸以及一編碼一核酸內切酶與一核酸外切酶之多核苷酸。
此外，一實施例提供一治療癌症之方法，其包含投予本發明之組成物至具有癌症之個體。本發明之優勢效果
本發明實施例之藥學組成物為一基於DNA與RNA之間的高特異性的藥物，其可針對各病患與各癌症量身定制，係因其可特異地靶向與殺死癌細胞。特別的是，僅病患之癌細胞可由選擇性地靶向具有僅存在於癌細胞之單核苷酸多型性(SNP)及/或複製數變異(CNV)基因有效地殺死。此外，由於標靶基因不存在於正常細胞中，故僅可有效地除去癌細胞。因此，依據實施例，在安全性方面優於常規之抗癌劑。尤其是，當使用一融合蛋白質時，其中CRISPR關聯性蛋白質與核酸外切酶(如RecJ)結合，可提供更佳的抗癌劑。
本發明之一實施例提供一用於殺死腫瘤細胞的組成物，其包含一互補地結合至一特異地存在於癌細胞之核酸的多核苷酸及一核酸酶，以作為活性成分。
本發明一實施例之多核苷酸可為crRNA或gRNA。crRNA意指CRISPR RNA。同時，gRNA意指引導RNA。crRNA與gRNA可為單股RNAs。此外，crRNA可結合至tracrRNA，以活化CRISPR關聯性蛋白質，且crRNA可與tracrRNA結合使用。crRNA可具有一序列，其互補於一特異地存在於標靶癌細胞之基因序列。此外，gRNA可結合至一特異地存在於標靶癌細胞之基因序列，從而導致CRISPR關聯性蛋白質呈現活性。crRNA或gRNA可為由15至40個核苷酸組成之RNA。多核苷酸可由18至30或20至25個核苷酸組成。舉例而言，crRNA或gRNA可由20個核苷酸組成。此外，crRNA或gRNA之3'端可含有額外之序列，以使CRISPR關聯性蛋白質(如Cas9)活化。在一實施例中，gRNA可為RNA，其為SEQ ID NOs: 87至129之任一者所示之DNA。
使用於此，術語“核酸酶”可指核酸內切酶。核酸酶可為關聯性蛋白質。使用於此，術語“CRISPR關聯性蛋白質”意指一能辨識與切割雙股或單股核酸(如DNA與RNA (dsDNA/RNA與ssDNA/RNA))之酵素。具體而言，其可辨識與切割結合至crRNA或引導RNA之雙股或單股核酸。
在本發明之一實施例中，本發明之核酸酶可為核酸內切酶，其功能由於辨識crRNA結合至標靶位點而活化。此外，由於核酸內切酶功能活化，其可具有核酸外切酶活性，能以非特異性方式切割雙股及/或單股DNA及/或RNA。同時，CRISPR關聯性蛋白質(如Cas12a)一旦活化時，可呈現非特異性核酸外切酶活性。其可以非特異性方式切割DNA與RNA。
據此，本發明之一示例性組成物可利用非特異性核酸酶特異地殺死癌細胞，該核酸酶由於crRNA或gRNA結合至存在於癌細胞中之特異性標靶位點而活化。如上述，本發明一實施例之組成物能特異地僅殺死癌細胞，因此可用作抗癌劑。
舉例而言，CRISPR關聯性蛋白質可為選自於由以下所組成之群組的任一核酸酶：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas14、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、CsMT2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、及Csf4。較佳地，CRISPR關聯性蛋白質可為核酸酶Cas9、Cas12a (Cpf1)、或Cas13a (C2c2)。
作為CRISPR關聯性蛋白質之一範例，Cas9蛋白質可具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。Cas9蛋白質可由一具有SEQ ID NO: 19之核酸序列編碼。此外，Cpf1蛋白質可具有SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。Cpf1蛋白質可由一具有SEQ ID NO: 21之核酸序列編碼。此外，C2c2蛋白質可具有SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。C2c2蛋白質可由一具有SEQ ID NO: 23之核酸序列編碼。
使用於此，術語“一特異地存在於癌細胞中之核酸”意指一僅存在於癌細胞中之核酸，其區分癌細胞與正常細胞。亦即，其可指一與正常細胞的不同之序列，且就至少一核酸而言，序列可不同。此外，基因之一部分可經取代或刪除。同時，其可具有一序列，其中一特定序列係重複。在此情況下，該重複序列可為一存在於細胞中之序列，或可為以外部方式***之序列。
舉例而言，特異地存在於癌細胞中之核酸的特徵可為單核苷酸多型性(SNP)、複製數變異(CNV)、結構變異(SV)、基因***、或基因刪除。
具體而言，特異地存在於癌細胞中之序列可為存在於癌細胞中之SNP。存在於癌細胞中之具有上述序列之標靶DNA與具有互補於標靶DNA之序列的crRNA或引導RNA可特異地彼此結合。因此，特異地存在於癌細胞中之核酸可賦予組成物殺死腫瘤細胞之特異性。特別的是，由於核酸特異地存在於癌細胞中，利用各癌症組織之基因體序列分析，可鑑定僅存在於癌細胞中之特異性SNP，且可以特異性SNPs製備crRNA或gRNA。因此，由於這呈現癌細胞毒性特異性，其可能開發出病患量身定制之抗癌治療劑。
此外，特異地存在於癌細胞中之序列，可含有存在於癌細胞中之複製數變異(CNV)。CNV意指基因體片段重複的變異。反複型基因(repetitive genes)之數量可因癌症類型或個體而變。常規上，CNV意指一核酸片段，相較於人類參考基因體，利用刪除、擴增、及其類似方式，在重複之序列的數量上顯示差異，其與普通基因的複製數2不同。舉例而言，正常細胞的基因CNV為2，但癌細胞的CNV為4或以上，可賦予組成物殺死腫瘤細胞的特異性。CNV可為至少4、8、10、12、14、16、18、20、24、30、40、50、60、70、80、90、或100。具體而言，當複製數為7或以上時，其可確定為CNV。各癌細胞株之基因複製數的具體範例顯示在下表1中。 [表1]
Figure 108110779-A0304-0001
CNV為與人類疾病，如癌症、智能障礙、癲癇、精神***症、兒童肥胖症、及其類似物，相關聯之最重要變體類型之一。大多數癌細胞株具有CNV，且一存在於CNV之標靶序列與一具有互補於其之序列的引導RNA彼此可特異地結合。因此，特異地存在於癌細胞之CNV可賦予本發明抗癌劑特異性。特別的是，CNV的數量愈高，則CRISPR關聯性蛋白質所切割之基因數量愈大，導致癌細胞核明顯受損。
特別的是，利用微陣列與螢光原位雜交(FISH)等技術，可易於獲得特異地存在於癌細胞中之CNV數據，且可用於產生crRNA或gRNA。當以靶向癌細胞之CNV之特異性序列的crRNA或gRNA與一CRISPR關聯性蛋白質處理癌細胞時，可誘導癌細胞特異性細胞凋亡。因此，由於這呈現癌細胞毒性特異性，因此可開發出病患量身定制之抗癌治療劑。
在本發明之一實施例中，利用下列方程式：N = 2 x 2V ，可從複製數值(V)計算CNV之預期複製數(N)。
在本發明之一實施例中，經證實，當一多核苷酸(其互補地結合至癌細胞中之一具有特異地高CNV之基因)與CRISPR關聯性蛋白質或CRISPR PLUS蛋白質(其中CRISPR關聯性蛋白質係與一核酸外切酶蛋白質融合)一起使用時，僅可有效地殺死癌細胞。此外，經證實，在使用一具有高CNV (其選自於特異地存在於癌細胞中之基因突變)時，可更有效地殺死癌細胞。
此外，特異地存在於癌細胞中之序列可為存在於癌細胞中之結構變異(SVs)，且SVs可為倒位、轉位、短核苷酸重複擴增、及其類似物。
倒位為一突變，其中一部分之基因經倒置，且為與血友病和肺癌等疾病相關聯之突變類型之一。轉位為一突變，其中一部分之染色體脫落且結合至另一染色體。短核苷酸重複擴增為一突變，其中相同序列連續重複且過度擴增。
大多數癌細胞株具有SVs，如基因倒位、轉位、及短核苷酸重複擴增，且具有SV序列之末端與正常細胞株序列之末端之間的連接序列僅存在於相應之癌細胞株中。存在於癌細胞中之SV連接序列與具有互補於其之序列的引導RNA彼此特異地結合。因此，特異地存在於癌細胞中之SV連接序列可賦予本發明抗癌劑特異性。
特別的是，不像CNV，SV連接序列不存在於正常細胞中，據此，其具有癌細胞特異性。因此，當以多核苷酸(其互補地結合至存在於癌細胞中之SV連接序列)與CRISPR關聯性蛋白質處理癌細胞時，可誘導癌細胞特異性細胞凋亡。因此，由於這僅在特定癌細胞呈現毒性特異性，其可能開發出病患量身定制之抗癌治療劑。
此外，利用基因之***或刪除，可產生特異地存在於癌細胞之序列。具有互補於利用***或刪除之突變序列的引導RNA序列可有效地殺死癌細胞。因此，特異地存在於癌細胞中之基因的***或刪除，可賦予本發明抗癌劑特異性。
特別的是，***與刪除突變體序列具有癌細胞特異性，係因其不存在於正常細胞中，如SV連接序列，且當以CRISPR關聯性蛋白質處理存在於癌細胞中之***或刪除突變體序列時，可特異地誘導細胞凋亡。然而，當靶向***與刪除突變體序列時，可能需要一PAM (前間隔序列鄰近模體(protospacer adjacent motif))序列，其可由Indel (***與刪除)附近之基因所辨識。
此外，***之基因可為存在於細胞中之核酸序列，但可能是外部導入之基因序列。特別的是，在由病毒感染或其類似物造成之癌細胞的情況中，病毒基因可***細胞中。在本發明之一實施例中，病毒核酸序列可作為特異地存在於癌細胞中之核酸。特別的是，具有此***突變的癌症並不常見，但***之病毒序列對癌細胞具有特異性，係因其不存在於正常細胞中。此外，當病毒序列以多個複製數(multiple copies)整入時，CNV變高，其肯定誘導癌細胞之細胞凋亡。此類癌症之範例可為乳突病毒造成之子宮頸癌。此一靶向外部導入基因之gRNA的範例可為由SEQ ID NOs: 121至124之任一者之DNA產生的gRNA。
此外，5'-NGG-3'序列，其為一PAM (前間隔序列關聯性模體(protospacer associated motif))序列，可一起考量，以選擇一具有癌細胞特異性之基因與一互補於該基因之多核苷酸序列。舉例而言，當5'-NGG-3'序列存在於癌細胞特異性序列附近時，可指定3'端方向的20個核苷酸為標靶。在選擇標靶基因時，可優先選擇一具有清楚之序列資訊的基因，如基因之***、基因之刪除、及連接區，以及一具有高複製數之CNV的基因。欲選擇標靶序列，可確認G或C是否存在於序列之5'端與3'端、整體序列之GC含量(%)是否在40至60%以內、及PAM之3’端方向的第三個-第四個鹼基部分(其為用於核酸內切酶、CRISPR關聯性蛋白質之切割的序列)是否為A或T。當G或C存在於序列之5'端與3'端且當整體序列之GC含量(%)在40至60%以內時，可增加sgRNA之結合親和力。特別的是，當PAM之3’端方向的第三個-第四個鹼基部分(其為釀膿鏈球菌Cas9 (Streptococcus pyogenes Cas9；SpCas9)切割該序列之位點)為A或T時，可增進SpCas9的切割效率。
上述癌症之範例可為選自於由膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛圍癌、中樞神經系統腫瘤、肝癌、及結直腸癌組成之群組之任一者。特別的是，其可為胃癌、結直腸癌、肝癌、肺癌、或乳癌，其已知為韓國的五大癌症。
特異地存在於上述癌症之核酸可為選自於由p53、PTEN、APC、MSH2、HBV、HCV、及EGFR所組成群組之任一基因之突變體，但不侷限於此。具體而言，在胃癌方面，其可為p53或PTEN (稱作腫瘤抑制基因)之突變體。在結直腸癌之情況中，其可為APC或MSH2基因之突變體。此外，肝癌主要由HBV與HCV病毒之感染造成，故可靶向HBV或HCV之核酸。此外，在肺癌中，可靶向EGFR基因之突變，且在乳癌之情況中，BRCA1/2基因之突變可為主要標靶。
如上述，可選擇與癌症發展密切相關之突變體基因及病毒基因作為特異地存在於癌細胞中之核酸序列，且可用於產生crRNA或gRNA。此時，可使用任何特異地存在於癌細胞中之DNA的SNP。特異地存在於癌細胞中之核酸序列的範例可為描述於下表2之序列，但不侷限於此。 [表2]
Figure 108110779-A0304-0002
此時，靶向特異地存在於癌細胞中之核酸序列的CRISPR RNA可含有一或多個crRNA或gRNA序列。舉例而言，可使用的crRNA或gRNA可同時靶向存在於卵巢癌或乳癌中之BRCA1外顯子10或11。此外，可使用二或多者之靶向BRCA1外顯子11的crRNAs或gRNAs。因此，可適度地選擇crRNA或gRNA之組合，其取決於癌症治療之目的與癌症之類型。亦即，可選擇與使用不同的gRNAs。
本發明之殺死腫瘤之組成物可進一步包含核酸外切酶。
使用於此，術語“核酸外切酶”為一切割核酸分子之5'端或3’端之核苷酸的酵素。因此，核酸外切酶可為一降解5'端至3’端方向之核酸的5'→3'核酸酶。此外，核酸外切酶可為一降解3'端至5'端方向之核酸的3'→5'核酸酶。
具體而言，5'→3'核酸酶之範例可為衍生自大腸桿菌的RecE或RecJ。其亦可為衍生自噬菌體T5之T5。此外，3'→5'核酸酶之範例可為衍生自真核細胞或原核細胞的Exo I。其亦可為衍生自大腸桿菌的Exo III。其亦可為人類衍生之Trex1或Trex2。此外，具有5'→3'與3'→5'雙向之切割活性的核酸酶可為衍生自大腸桿菌的ExoVII或RecBCD。此外，作為一範例，其可為衍生自大腸桿菌的5'→3' λ核酸外切酶。其亦可為衍生自綠豆(Vigna radiata )之綠豆(Mungbean)，其可切斷單股DNA。
示例性核酸外切酶可為選自於由核糖核酸外切酶T (Exoribonuclease T)、TREX2、TREX1、RecBCD、去氧核糖核酸外切酶I (Exodeoxyribonuclease I)、去氧核糖核酸外切酶III (Exodeoxyribonuclease III)、綠豆核酸外切酶 (Mungbean exonuclease)、RecE、RecJ、T5、λ核酸外切酶、核酸外切酶VII小型單元、核酸外切酶VII大型單元、Exo I、Exo III、Exo VII、及Lexo所組成群組之任一者。
具體而言，核酸外切酶可為選自於由核糖核酸外切酶T (SEQ ID NO: 4)、TREX2 (SEQ ID NO: 5)、TREX1 (SEQ ID NO: 6)、RecBCD_RecB (SEQ ID NO: 7)、RecBCD_RecC (SEQ ID NO: 8)、RecBCD_RecD (SEQ ID NO: 9)、去氧核糖核酸外切酶I (SEQ ID NO: 10)、去氧核糖核酸外切酶III (SEQ ID NO: 11)、綠豆核酸外切酶 (SEQ ID NO: 12)、RecJ (SEQ ID NO: 13)、RecE (SEQ ID NO: 14)、T5 (SEQ ID NO: 15)、λ核酸外切酶(SEQ ID NO: 16)、核酸外切酶VII小型單元(SEQ ID NO: 17)、及核酸外切酶VII大型單元(SEQ ID NO: 18)所組成群組之任一者。
另一實施例提供一用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一互補地結合至特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸及一由核酸內切酶與核酸外切酶組成之融合蛋白質，以作為活性成分。
術語“一特異地存在於癌細胞中之核酸”、“一互補地結合至特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸”、“核酸內切酶”、及“核酸外切酶”係如上述。
舉例而言，能以所需之核酸序列有效地殺死細胞的CRISPR/Cas系統，其係以核酸外切酶結合crRNA與CRISPR關聯性蛋白質的方式製備，稱作CRISPR PLUS。
由核酸內切酶與核酸外切酶組成之融合蛋白質之一範例可為Cas9-核糖核酸外切酶T、Cas9-REX2、Cas9-TREX1、Cas9-RecBCD_RecB、Cas9-RecBCD_RecC、Cas9-RecBCD_RecD、Cas9-去氧核糖核酸外切酶I、Cas9-去氧核糖核酸外切酶III、Cas9-綠豆、Cas9-RecJ、Cas9-RecE、Cas9-T5、Cas9-λ、Cas9-核酸外切酶 VII小型單元、Cas9-核酸外切酶 VII大型單元、Cpf1-核糖核酸外切酶T、Cpf1-REX2、Cpf1-TREX1、Cpf1-RecBCD_RecB、Cpf1-RecBCD_RecC、Cpf1-RecBCD_RecD、Cpf1-去氧核糖核酸外切酶I、Cpf1-去氧核糖核酸外切酶III、Cpf1-綠豆、Cpf1-RecJ、Cpf1-RecE、Cpf1-T5、Cpf1-λ、Cpf1-核酸外切酶 VII小型單元、或Cpf1-核酸外切酶 VII大型單元，較佳地Cas9-RecJ或Cpf1-RecJ，但不侷限於此。
在本發明之一實施例中，使用CRISPR PLUS蛋白質，其包含核酸內切酶與核酸外切酶之融合蛋白質，造成小數量之CNV (如CCR5基因之CNV為2)的細胞凋亡速率增加，且觀察到細胞凋亡效果比單獨使用核酸內切酶的更好。
在一態樣中，核酸內切酶與核酸外切酶可經由一連接子連接。連接子可為白蛋白連接子或胜肽連接子。連接子可包含1至50個胺基酸、3至40個胺基酸、或10至30個胺基酸。此外，胜肽連接子可為由Gly與Ser殘基組成之胜肽。此外，胜肽連接子可為由1至10個胺基酸組成之胜肽，其選自於由白胺酸(Leu，L)、異白胺酸(Ile，I)、丙胺酸(Ala，A)、纈胺酸(Val，V)、脯胺酸(Pro，P)、離胺酸(Lys，K)、精胺酸(Arg，R)、天門冬醯胺酸(Asn，N)、絲胺酸(Ser，S)、及麩醯胺酸(Gln，Q)組成之群組。此外，連接子可為由3至15個胺基酸組成之多胜肽，包括甘胺酸(Gly，G)與絲胺酸(Ser，S)殘基，且可由6至11個胺基酸組成。
在另一態樣中，提供一用於治療癌症之藥學組成物，其包含用於殺死上述腫瘤細胞之組成物。
腫瘤或癌症為選自於由膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛圍癌、中樞神經系統腫瘤、肝癌、及結直腸癌所組成群組之任一者。
本發明藥學組成物可為非經口配方。當配製時，通常使用稀釋劑或賦形劑，如填充劑、摻和劑、黏合劑、濕潤劑、崩散劑、或界面活性劑。特別的是，用於非經口投予之製劑包括無菌之水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍乾製劑、及栓劑。作為用於非水溶液與懸浮液之溶劑，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、注射用酯類如油酸乙酯、及其類似物。
本發明之藥學組成物可以非經口之方式投予，且可經由選自於由腫瘤內、靜脈內、肌內、皮內、皮下、腹腔內、小動脈內、心室內、病灶內、鞘內、局部、及其組合所組成群組之任一途徑投予。
本發明藥學組成物之劑量依據體重、年齡、性別、健康條件、飲食、投予時間、投予方法、排出速率、及病患疾病嚴重度而變，且可由本領域之彼等技術人員適當地選擇。針對需要之效果，本發明之藥學組成物可以每天0.01 μg/kg至100 mg/kg，更具體而言，1 μg/kg至1 mg/kg之劑量投予。投予可每天一次或分成數個劑量進行。因此，該劑量未旨在以任何方式侷限本發明之範疇。
在另一態樣中，本發明亦提供一用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一載體以作為活性成分，該載體含有一互補地結合至特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸與一編碼核酸內切酶之多核苷酸。
術語“一特異地存在於癌細胞中之核酸”、“核酸內切酶”、及“核酸外切酶”係如上述。此外，“一互補地結合至特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸”為DNA。DNA核酸可產生crRNA或gRNA，其能互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸序列。於此，“crRNA”與“gRNA”係如上述。
在上述組成物中，可將i)互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸與ii)編碼核酸內切酶之多核苷酸裝載至一單一載體中。視需求，可將i)互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸與ii)編碼核酸內切酶之多核苷酸裝載至不同載體中。
此外，組成物之載體中可額外地包含一編碼核酸外切酶之多核苷酸。同時，視需求，可將i)互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸，ii)編碼核酸內切酶之多核苷酸，及iii)編碼核酸外切酶之多核苷酸裝載至不同載體中。
在一實施例中，組成物可為一用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一載體以作為活性成分，該載體含有一互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸序列的多核苷酸與一編碼CRISPR關聯性蛋白質與核酸外切酶之融合蛋白質的多核苷酸。在本發明之一實施例中，將一編碼Cas9-RecJ融合蛋白質之多核苷酸，其中CRISPR關聯性蛋白質(核酸內切酶) Cas9與核酸外切酶RecJ融合，裝載至載體中。
載體可為病毒載體或質體載體，但不侷限於此。載體可以本領域已知之基因選殖方法製備，其含有互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸、編碼CRISPR關聯性蛋白質之多核苷酸、及/或編碼核酸外切酶之多核苷酸，且該方法未特別地侷限。
此外，一實施例提供一治療癌症之方法，其包含投予上述之組成物，以殺死個體之腫瘤細胞。
此時，互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸與核酸酶蛋白質可結合成RNP的形式，並投予患有癌症之個體。此外，核酸外切酶可加至RNP，並投予患有癌症之個體。本發明之藥學組成物可以多個途徑投予哺乳類動物，如家畜、人類、及其類似物。可預期所有的投予模式，舉例而言，經由選自於由腫瘤內、靜脈內、肌內、皮內、皮下、腹腔內、小動脈內、心室內、病灶內、鞘內、局部、及其組合所組成群組之任一者投予。發明模式
在下文中，通過參考實施例，將詳細描述本發明。然而，以下範例旨在說明本發明，且本發明之範疇不僅侷限於此。製備例1 ：Cas9 之crRNA 製備
經由基因定序，獲得確切之標靶基因核苷酸序列。在標靶基因之外顯子中確定前間隔序列鄰近模體(PAM，5'-NGG-3')後，將其上游20-mer序列定為前間隔序列。設計至少三類前間隔序列，係因細胞之編輯效率依據標靶序列之位置而有不同。
藉由將5'-TAGG-3'結合至20-mer序列之5'端部分且將5'-AAAC-3'結合至互補序列之3'端部分，合成寡核苷酸(寡聚物)。將二個合成的寡聚物調整成100 μM，各取2 μl，並在46 μl之純水中稀釋。
利用熱循環儀進行退火(annealing)，且反應混合物在95℃下處理5分鐘，以4℃/sec的速率冷卻至55℃，然後處理10分鐘。以BsaI限制酶將約5至10 μg之含有T7啟動子(SEQ ID NO: 1: TAATACGACTCACTATAGG)之用於體外轉錄作用的pUC19載體與crRNA框架序列 (SEQ ID NO: 2: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)消化隔夜且隨後純化。其序列以5'-TAATACGACTCACTATAGGTGAGACCGcAGGTCTCG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC -3' (SEQ ID NO: 3)表示。
然後，對以限制酶(100至200 ng/μl)處理之載體進行連接(ligation)。將6 μl之5個退火混合物、2 μl之載體、1 μl之T4 DNA連接酶10X緩衝液(Promega C126B)、及1 μl之T4 DNA連接酶(Promega M180A)置於1.5 ml Eppendorf試管中，輕敲混合，並在4℃下培養隔夜。以連接混合物進行大腸桿菌DH5α轉形。通過使用M13引物之Sanger定序，以下列序列確認選殖的結果： 5'-TAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 1)-20 mer前間隔序列-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO: 2)-3'。
使用由此製備之DNA序列，以聚合酶鏈反應(PCR)擴增包括T7啟動子、前間隔序列、及crRNA框架的區域，並以瓊脂糖凝膠電泳確認，然後純化。利用MEGAshortscriptTM T7 Kit (Invitrogen，AM1354)，使約800 ng之10個結果在50 μl反應體基中反應約4至8小時，以進行體外轉錄crRNA。
以MEGAclearTM Kit (Invitrogen，AM1908)純化轉錄產物，並以分光光度計測定純化之crRNA濃度。一般而言，會得到約1至2 μg/μl或更多的crRNA。此時，注意防止RNase污染。以所需之濃度與體積稀釋與分配純化之crRNA，接著保存在-80℃，同時注意避免溫度變化與衝擊。製備例2 ：Cpf1 (Cas12a) 之 crRNA 製備
通過基因定序，得到確切之標靶基因核苷酸序列。在決定標靶位點之後，在外顯子部分發現前間隔序列鄰近模體(PAM，5'-TTTN-3')序列，且其下游24-mer序列定為前間隔序列。此時，將前間隔序列具有約50%鳥糞嘌呤-胞嘧啶含量之位點定為標靶。設計至少三類前間隔序列，係因細胞之編輯效率依據標靶序列之位置而有不同。
分別合成用於體外轉錄作用之含有T7啟動子之序列與crRNA，及其互補序列等寡聚物： 5'-AATTC TAATACGACTCACTATAGG AATTTCTACTGTTGTAGAT (SEQ ID NO: 25)-24 mer前間隔序列 序列-3'。製備最終體積為20 μl之混合物，其中每一合成之寡聚物含有2 μg。此時，使用不含核酸酶之純水。
利用熱循環儀進行退火，且反應混合物在95℃下處理5分鐘，以4℃/sec的速率冷卻至55℃，然後處理10分鐘。利用MEGAshortscriptTM T7 Kit (Invitrogen，AM1354)，使4 μl (800 ng)之5個結果產物在50 μl反應體基中反應約4至8小時，以進行體外轉錄crRNA。利用乙醇沉澱純化所得之crRNA，並以分光光度計測定其濃度。一般而言，會得到約1至2 μg/μl或更多的crRNA，且注意防止RNase污染。以所需之濃度與體積稀釋與分配純化之crRNA，接著保存在-80℃，同時注意避免溫度變化與衝擊。製備例3 ：受質DNA 之製備
利用聚合酶鏈反應，從一含有標靶基因之模板擴增約1至1.5 kbp的dsDNA，使得由Cas9或Cpf1之前間隔序列靶向之核苷酸序列位於中間區域。於此，前間隔序列意指gRNA可互補地結合宿主細胞DNA中之標靶核苷酸序列。
通過選殖方式，將dsDNA***pUC19或pGEM載體之後，利用M13引子進行定序，以確認前間隔序列。利用M13引子，以聚合酶鏈反應擴增受質DNA，純化，並以100 ng/μl之濃度保存在-20℃。範例1 ：利用crRNA 確認CRISPR/Cas 蛋白質之非特異性核酸酶功能之活化作用
經證實，利用crRNA引導之標靶序列結合作用，活化CRISPR/Cas蛋白質(包括CRISPR/Cas12a)之基因體編輯功能，從而活化非特異性核酸酶功能，並降解DNA或RNA分子。其示意圖顯示於圖1。範例2 ：利用CRISPR PLUS 辨識癌細胞特異性SNP 與癌細胞之細胞凋亡
依據癌症來源組織與癌症類型，癌細胞具有其自身的染色體突變，包括不存在於正常細胞中之特異性基因體區域之基因突變或單核苷酸多型性(SNPs)。彼等癌症特異性SNPs作為本發明之癌細胞特異性標記。癌細胞特異性SNPs用於合成含有互補於SNPs之序列的crRNA，且由CRISPR PLUS蛋白質(其含有crRNA與核酸外切酶之CRISPR關聯性蛋白質)識別。在癌細胞基因體中，SNP與crRNA之間的序列特異性結合作用活化CRISPR PLUS蛋白質之基因體編輯功能，導致標靶DNA/RNA的斷裂。上述活化作用隨即活化CRISPR PLUS的內在非特異性核酸酶功能，其不可逆地破壞癌細胞之ds與ss DNA/RNA分子，導致細胞凋亡。彼等結果以示意圖顯示於圖2。範例3 ：確認SpyCas9 (SEQ ID NO: 46) 之核酸內切酶功能( 體外)
NEBufferTM 3.1在無核酸酶之純水中稀釋至最終1X濃度，並將120 nM之核酸酶與120 nM之crRNA加入其中，然後誘導RNP複合體形成。在混合後，混合物在室溫下培養約15分鐘。將約200 ng之受質DNA加入其中，且輕敲混合物，並在37℃下反應。欲確認反應針對受質DNA而非標靶序列，在此步驟中加入無法靶向的DNA。將反應混合物之最終體積調整至20 μl。在反應後，加入凝膠上樣染料溶液並充分混合。在製成2%瓊脂糖凝膠(Agarose，Sepro，GenDEPOT，A0224-050)之後，以12 μl之經染色反應物進行電泳，並搭配1 kb DNA標記(Thermo Scientific，SM0311)。隨後，觀察到核酸酶活性切割之受質DNA條帶。
其結果為，經證實，當僅不具有標靶序列之受質DNA反應時，DNA不切割。然而，經證實，當將標靶DNA放在一起時，所有的DNA皆切割。範例4 ：確認Cpf1 之非特異性核酸外切酶功能( 體外)
NEBufferTM 1.1在無核酸酶之純水中稀釋至最終1X濃度，並將120 nM之CRISPR/Cas12a與120 nM之crRNADHCR7 加入其中，然後誘導RNP複合體形成。小心地將200 ng之受質DNA加入230 nM之RNP複合體中，且輕敲混合物，並在37℃下反應。此時，製備受質DNA，其係於37℃之NEBuffer 1.1緩衝液中，將單獨之特異性或非特異性DNA受質或特異性DNA與非特異性DNA之混合物培養1.5小時或24小時。將反應混合物之最終體積調整至20 μl。
在反應所需之時間後，加入凝膠上樣染料並充分混合。在製成2%瓊脂糖凝膠(Agarose，Sepro，GenDEPOT，A0224-050)之後，以12 μl之經染色反應物進行電泳，並搭配1 kb DNA標記(Thermo Scientific，SM0311)。觀察到核酸酶活性切割之受質DNA條帶。結果顯示於圖3。
欲證實由CRISPR核酸酶產生之序列非特異性核酸外切酶活性，利用CRISPR核酸酶及特異性與非特異性DNA受質進行體外DNA切割實驗，結果顯示CRISPR核酸酶具有非特異性核酸外切酶活性，其取決於序列特異性核酸內切酶活性。
具體而言，將CRISPR/Cas12a (一靶向人類DHCR7基因之crRNA)，及一具有crRNA標靶序列之特異性DNA受質(DNA # 1，1.5 kb)，或一不具有crRNA標靶序列之非特異性DNA受質(DNA # 2，0.5 kb)培養1.5或24小時以誘導DNA切割，其在瓊脂糖凝膠上確認(參見圖3)。於此，互補地結合至DHCR7、dsDNA1 (1,431 bp)、及dsDNA2 (544 bp)之crRNA序列分別以SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、及SEQ ID NO: 134表示。
當特異性DNA受質與核酸酶和crRNA培養1.5小時之後，受質係序列特異地切割成約0.7 kb之片段(上圖，第3道)。然而，經證實，無crRNA而不切割受質(上圖，第4道)。當在相同條件下以非特異性DNA進行培養時，不論是否存在crRNA，皆不發生DNA切割(上圖，第5與6道)。
當以核酸酶同時處理特異性DNA受質與非特異性DNA受質時，如預期僅切割特異性DNA受質(上圖，第7與8道)。此外，當特異性DNA受質、核酸酶、及crRNA之培養時間增至24小時，觀察到特異性DNA受質及其片段消失(下圖，第3道)。這表示，CRISPR核酸酶之核酸外切酶活性可切割DNA。
當在沒有crRNA之情況下進行相同實驗時，DNA未消失(下圖，第4道)，代表核酸外切酶活性取決於CRISPR/Cas12a之序列特異性酵素活性。此外，此事實之結果亦證實，當非特異性DNA以核酸酶與crRNA處理24小時，DNA保留而未消失(下圖，第5與6道)。
此外，當特異性與非特異性DNA受質同時以核酸酶與crRNA處理24小時，特異性與非特異性DNA受質兩者皆降解且消失(下圖，第7道)，其僅在crRNA存在下觀察到 (下圖，第8道)。這代表，由序列特異性核酸內切酶功能之活化作用誘導的CRISPR/Cas12a核酸外切酶功能，在以序列非特異性方式上發揮作用。
因此，彼等實驗結果顯示，CRISPR/Cas12a具有非特異性核酸外切酶活性，其取決於序列特異性酵素活性。範例5 ：細胞毒性分析
利用DMEM/10% FBS生長培養基，在37℃之5% CO2 培養箱中培養人類癌症衍生之細胞(HeLa細胞)。在轉染前一天，將2.5 X 104 個細胞懸浮於100 μl之培養基中，並接種於96孔培養盤中。空白組(背景對照組)培養孔僅填載100 μl之培養基。隔天，在下表3所示之條件下，以CRISPR/Cas核酸酶與crRNA之複合體(RNP)進行轉染。crRNAs之一者具有人類DHCR7基因之序列特異性，另一者具有水稻DWARF5基因之序列特異性。 [表3]
Figure 108110779-A0304-0003
針對各培養孔，將5 μl之Opti-MEM培養基、2.4 nM之CRISPR/Cas、及2.4 nM之crRNA混和在1.5 ml試管中，接著在室溫下培養10分鐘。將0.17 μl之Lipofectamine Cas Plus Reagent加入相同試管中，並在室溫下培養5分鐘。在培養上述試管期間，準備另一試管。在試管中混和5 μl之Opti-MEM與0.3 μl之Lipofectamine CRISPRMAX Reagent，並在室溫下培養5分鐘。將二試管之內容物混和，並在室溫下培養10分鐘。將產生之試管溶液逐滴加入細胞生長之各培養孔。隨後，將細胞培養在37℃之5% CO2 培養箱中。
在24、48、及72小時之後，在乾淨的工作台上，將10 μl之WST-1 (Cell Proliferation Reagent，Roche 0501594401)加入各培養孔中。隨後，將培養盤置於溫度37℃之5% CO2 培養箱中，並觀察到顏色改變(淡紅色 → 暗紅色)。在10分鐘後，利用FLUOstar Omega ELISA讀盤儀(BMG Labtech)，在420至480 nm與690 nm下測定背景組與樣本組之吸光值。分析CRISPR/Cas核酸酶在標靶與非標靶crRNAs的細胞毒性。
將CRISPR/Cas12a核酸酶、crRNA、或該二分子之共軛體(RNP複合體)分別轉染至人類衍生之癌細胞HEK293 (圖4a)與HeLa (圖4b)，並在24、48、及72小時之後，利用存活力試驗，以WST-1測定細胞之存活力。其結果為，僅以核酸酶或crRNA轉染之細胞，在24、48、及72小時顯示存活力實質上未改變(參見圖4)。彼等結果顯示，核酸酶與crRNA本身對細胞無毒性。
另一方面，以具有序列特異性酵素活性之共軛體轉染的細胞，在72小時呈現明顯存活力減少。此結果顯示，CRISPR/Cas12a核酸酶對細胞呈現毒性，其取決於序列特異性酵素活性。以相同共軛體轉染的細胞顯示，在24與48小時，存活力不變(HEK293)或存活力略有下降(HeLa)。這表示，CRISPR/Cas12a核酸酶之毒性，需要一些時間才能影響細胞。
一般而言，已知細胞之CRISPR/Cas核酸酶之序列特異性酵素活性在24小時至48小時中穩定進行。此外，鑑於此活性導致非特異性核酸酶活性而表現出細胞毒性，可以說，在72小時後出現的細胞毒性，並非獨立於核酸酶活性的間接效應，而是由與核酸酶之序列特異性酵素活性相關聯之功能引起。然而，經證實，使用特異性crRNA比使用非特異性crRNA更具細胞毒性。
因此，此實驗之結果顯示，CRISPR/Cas12a核酸酶藉由對細胞呈現毒性而具有減少細胞存活力之功能，其取決於序列特異性酵素活性。範例6 ：癌細胞毒性特異性之分析
藉由分析人類衍生之肺癌細胞與正常細胞之基因序列，發現SNPs特異地存在於癌細胞，並合成能靶向其之crRNAs。將CRISPR核酸酶與crRNA混和，製成RNP複合體，且隨後以其轉染癌細胞與正常細胞。利用WST-1為主之細胞存活力試驗，分析癌細胞特異性殺死效果。製備所使用之crRNA，以靶向特異地存在於肺癌之EGFR之序列(SEQ ID NO: 43)。
在轉染前一天，將2.5 X 104 個細胞懸浮於100 μl之培養基中，並置於96孔培養盤中。空白組(背景對照組)培養孔僅填載100 μl之培養基。第二天，在下表4所示之條件下，以CRISPR/Cas核酸酶與crRNA之複合體(RNP)進行轉染。 [表4]
Figure 108110779-A0304-0004
針對各培養孔，將5 μl之Opti-MEM培養基、2.4 nM之CRISPR/Cas、及2.4 nM之crRNA混和在1.5 ml試管中，接著在室溫下培養10分鐘。將0.17 μl之Lipofectamine Cas Plus Reagent加入相同試管中，並在室溫下培養5分鐘。在培養上述試管期間，準備另一試管。在試管中混和5 μl之Opti-MEM與0.3 μl之Lipofectamine CRISPRMAX Reagent，並在室溫下培養5分鐘。將二試管之內容物混和，並在室溫下培養10分鐘。將產生之試管溶液逐滴加入細胞生長之各培養孔。隨後，將細胞培養在37℃之5% CO2 培養箱中。
在24、48、及72小時之後，在乾淨的工作台上，將10 μl之WST-1 (Cell Proliferation Reagent，Roche 0501594401)加入各培養孔中。隨後，將培養盤置於溫度37℃之5% CO2 培養箱中，並觀察到顏色改變(淡紅色 → 暗紅色)。在10分鐘後，利用FLUOstar Omega ELISA讀盤儀，在420至480 nm與690 nm下測定背景組與樣本組之吸光值。分析CRISPR/Cas核酸酶在標靶與非標靶crRNAs的細胞毒性。
其結果為，經證實，僅在以標靶crRNA處理之組別中特異地殺死肺癌細胞。範例7 ：利用EGFR 突變體序列特異性引導RNA 確認細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，利用Cas9蛋白質表現載體(PX459，Addgene質體#62988)，可在HCC827肺癌細胞之基因體中引起多重切割，從而誘導細胞凋亡。利用電穿孔法將載體轉移至細胞中。欲誘導基因體之多重切割，使用一靶向HCC827細胞中EGFR基因之E2突變體序列的引導RNA。已知EGFR基因之E2突變體序列存在於18個以上的多重複製體中。
將HCC827細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與500 ng之載體填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,300 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，6天後收取，並計數。結果顯示於圖5與圖6。
如圖5與圖6所示，經證實，相較於EGFR_WT實驗組(pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0-EGFR_WT)(其中無標靶序列)，以及相較於電脈衝組，EGFR_E2實驗組 (pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0-EGFR_E2)之細胞數量明顯減少。具體而言，EGFR_E2實驗組誘導83%細胞凋亡。從彼等結果證實，將Cas9蛋白質與細胞遺傳性序列特異性多重標靶引導RNA加入癌細胞誘導癌細胞之細胞凋亡。範例 8 ：細胞凋亡效果之確認取決於在肺癌細胞 H1299 中之標靶位置 範例 8.1 ：通過脂質體轉染導入 gRNA 與 CRISPR 關聯性蛋白質
肺癌細胞H1299以1.5 × 105 個細胞/孔分盤至24孔培養盤中。在24小時之後，將下表5顯示之DNAs種類(CCR5、HPRT1、MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2)導入各培養孔中。在基因導入方面，依據製造商之手冊，使用Lipofectamine 3000試劑，且各使用500 ng之DNA。 [表5]
Figure 108110779-A0304-0005
在DNA導入(即轉染) 72小時之後，利用抽吸移除各培養孔之培養液，且細胞再次以500 μl之1X PBS清洗。隨後，將胰蛋白質酶-EDTA施加於各孔中，使所有細胞脫離。細胞以台盼藍染劑染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖7與圖8。
如圖8所示，NT (非標靶)已知不具有在H1299中切割之標靶序列，且CCR5與HPRT1 (具有一對標靶位點)顯示類似的細胞凋亡效果。另一方面，MT2已知可切割超過100個位點，其顯示細胞凋亡效果，相較之下，可減少活細胞之量至約50%。此外，SMIM11 (約74%)、GNPDA2 (約58%)、SLC15A5 (約45%)、及KCNE2 (約77%)，其為肺癌細胞株之標靶位點，顯示細胞凋亡效果與MT2一樣高。其中，SMIM11與KCNE2呈現比MT2更好的細胞凋亡效果。下表6顯示各實驗組之複製數與必需性，並在顯微鏡下觀察各實驗組中細胞之形態，如圖7所示。 [表6]
Figure 108110779-A0304-0006
 範例 8.2 ：利用脂質轉染胺導入 gRNA 與 CRISPR 關聯性蛋白質
肺癌細胞H1299以1.5 × 105 個細胞/孔分盤至24孔培養盤中。在24小時之後，將下表7顯示之DNAs種類導入各培養孔中。在基因導入方面，依據製造商之手冊，使用Lipofectamine 3000試劑，且各使用500 ng之DNA。 [表7]
Figure 108110779-A0304-0007
在DNA導入(即轉染) 48小時之後，利用抽吸移除各培養孔之培養液，且細胞再次以500 μl之1X PBS清洗。隨後，將胰蛋白質酶-EDTA施加於各孔中，使所有細胞脫離。細胞以台盼藍染劑染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖9與圖10。在此範例中，包括一實驗組，其中僅進行脂質體轉染而不導入DNA。
如圖9所示，相較於僅脂質體轉染(僅Lipo)，在CCR5中，活細胞數量減少至約80%。相較於CCR5，NT1與HPRT1之數量約70%。在MT2，相較於NT1，細胞數量減少至約25%。在CNV標靶之三種類(GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2)中，更多細胞死亡，且利用台盼藍之細胞計數，無法明顯檢測活細胞。具體而言，NT1、CCR5、HPRT1、MT2、GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2顯示約43%、約23%、約50%、約86%、約99%、約99%、及約99%之細胞凋亡率。
選擇NT1與GNPDA2分別代表大量活細胞之實驗組與大量死細胞之實驗組。隨後，在顯微鏡下，以NucBlue Live ReadyProbes Reagent與Propidium Iodide ReadyProbes Reagent進行各培養孔之成像。結果顯示於圖10。利用螢光分析活細胞之比例，且結果與圖9之彼等類似。範例 9 ：細胞凋亡效果之確認取決於在肺癌細胞 H1563 中之標靶位置
H1563細胞以1.5 × 105 個細胞/孔分盤至24孔培養盤中，且在24小時之後，將下表8顯示之DNAs種類導入各培養孔中。在基因導入方面，依據製造商之手冊，使用Lipofectamine 3000試劑，且各使用500 ng之DNA。 [表8]
Figure 108110779-A0304-0008
在DNA導入(即轉染) 24小時之後，嘌黴素(puromycin)以1 μg/ml之濃度加入各培養孔中，並在72小時進行篩選。隨後，利用抽吸移除各培養孔之培養液，且細胞再次以500 μl之1X PBS清洗。隨後，將胰蛋白質酶-EDTA施加於各孔中，使所有細胞脫離。細胞以台盼藍染劑染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖11。
如圖11所示，相較於單一標靶CCR5，仍有小量之細胞，分別為HPRT1的約52%、MT2的約43%、及二個CNV標靶種類(IRX1與ADAMTS16)的約37%與40%。從彼等結果證實，相較於單一標靶(如CCR5)，藉由誘導大量的雙股斷裂物(DSB)，可增進細胞凋亡效果。範例 10 ：細胞凋亡效果之確認取決於在肺癌細胞 A549 中之標靶位置 範例 10.1 ：利用多個標靶確認 A549 細胞之細胞凋亡
利用電穿孔法(Lonza)，將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與gRNA導入肺癌細胞株A549之細胞。培養之A549細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各DNA混和。將細胞與DNA之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，使用分別靶向NT1 (其未對齊於人類基因序列)；HPRT1 (1個複製數之持家基因)；以及CCR5 (1個複製數之基因)之條件，以及僅電擊(僅脈衝)之條件。
在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複分盤在24孔培養盤中且以三重複分盤在96孔培養盤中。在DNA導入24、42、及72小時之後，將50 μl之CellTiter Glo試劑加入96孔培養盤之各培養孔中。將培養盤置於FLUOstar奧米加讀盤儀並搖晃2分鐘。在室溫下將其反應10分鐘後，測定冷光。上述方法為確定歷經代謝過程之活細胞量之方法，其係依據細胞中ATP量之冷光程度。結果顯示於圖12中。
如圖12所示，相較於三個對照組(NT1、HPRT1、及CCR5)，在靶向100個或以上位點之MT2條件中，隨時間誘導20%至50%之細胞凋亡。
在DNA導入後24小時，將1 μg/ml之嘌黴素加入24孔培養盤之各培養孔中。在僅電擊之條件且細胞凋亡約90%時，改變細胞培養基，以使細胞恢復。在恢復5至7天後，將細胞從各培養孔脫離，以台盼藍染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖13。另一方面，圖14顯示，在DNA引入且以嘌呤黴素篩選之後，在計數細胞數量之前，以顯微鏡觀察之照片。
其結果為，在僅電擊而無嘌黴素抗性之條件下，細胞無法存活，其作為對照組，且當靶向CCR5時，相較於NT1與HPRT1條件，觀察到約50%細胞凋亡。且經證實，在MT2條件下，約90%之細胞死亡。在DNA導入後，細胞以嘌黴素篩選，隨後在計數細胞數量之前，在顯微鏡下觀察。相較於NT1對照組，類似於細胞計數之結果，當靶向HPRT1與CCR5時(其僅具有1個複製數)，有超過50%的細胞恢復。另一方面，在MT2條件下，約90%之細胞死亡且僅10%之細胞恢復(藍色箭頭：恢復之細胞聚落)。因此，經證實，當以Cas9蛋白質誘導A549細胞中之多重DNA斷裂時，可誘導細胞凋亡。範例 10.2 ：利用 CNV 標靶確認 A549 細胞之細胞凋亡
以Cas9蛋白質誘導DNA斷裂，其係靶向肺癌細胞株A549細胞中一具有CNV之基因，並檢查細胞凋亡之程度。具體而言，利用電穿孔法(Lonza)，將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與各CNV標靶之gRNA導入A549細胞。培養之A549細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各DNA混和。將細胞與DNA之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，加上一條件為導入一能在大腸桿菌中表現蛋白質的pET21a載體、一條件為僅電擊(僅脈衝)、及一條件為不處理(無脈衝)。
在以電擊導入DNA之後，細胞以每一條件三重複分盤在96孔培養盤中。在DNA導入24、44、及51小時之後，將50 μl之CellTiter Glo試劑加入各培養孔中。將培養盤置於FLUOstar奧米加讀盤儀並搖晃2分鐘。在室溫下將其反應10分鐘後，測定冷光。結果顯示於圖15。
如圖15所示，相較於三個對照組(僅脈衝、pET21a、及無脈衝)，在靶向100個或以上位點之MT2條件中，隨時間誘導20%至50%之細胞凋亡。此外，相較於對照組，CD68、DACH2、及HERC2P2之三個CNV標靶誘導類似MT2之細胞凋亡，且SHBG之CNV標靶誘導70%至80%之細胞凋亡。據此，經證實，針對A549細胞中之四類CNVs (CD68、DACH2、HERC2P2、及SHBG)，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂時，可誘導細胞凋亡。範例 11 ：細胞凋亡效果之確認取決於在乳癌細胞 SKBR3 中之標靶位置 範例 11.1 ：利用 CNV 標靶確認 SKBR3 細胞之細胞凋亡
利用電穿孔法(Lonza)，將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與各CNV標靶之gRNA導入乳癌細胞株SKBR3之細胞。培養之SKBR3細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各DNA混和。將細胞與DNA之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，加上一條件為標靶NT1 (其未對齊於人類基因序列(非標靶))、一條件為僅電擊(僅脈衝)、及一條件為不處理(無脈衝)。在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複分盤在24孔培養盤中且以三重複分盤在96孔培養盤中。
在DNA導入24、42、及48小時之後，將50 μl之CellTiter Glo試劑加入96孔培養盤之各培養孔中。將培養盤置於FLUOstar奧米加讀盤儀並搖晃2分鐘。在室溫下將其反應10分鐘後，測定冷光。結果顯示於圖16。
如圖16所示，相較於三個對照組(NT1、僅脈衝、及無脈衝)，在靶向100個或以上位點之MT2條件中，隨時間誘導30%之細胞凋亡。此外，相較於對照組，ERBB2與KRT16之二CNV標靶誘導40%至50%之細胞凋亡。範例 11.2 ：利用 CNV 標靶確認 SKBR3 細胞之細胞凋亡
利用電穿孔法(Lonza)，將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與各CNV標靶之gRNA導入乳癌細胞株SKBR3之細胞。培養之SKBR3細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各DNA混和。將細胞與DNA之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，使用靶向NT1 (其未對齊於人類基因序列)與HPRT1 (其為1個複製數之持家基因)之條件。在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複分盤在24孔培養盤中。
在DNA導入後48小時，細胞從24孔培養盤之各培養孔脫離且以台盼藍染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖17。如圖17所示，相較於對照組，在靶向100個或以上位點之MT2條件中，隨時間誘導40%之細胞凋亡，且相較於對照組，ERBB2與KRT16之二CNV標靶誘導40%至50%之細胞凋亡。據此，經證實，針對SKBR3細胞中之二類CNVs (ERBB2與KRT16)，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂時，可誘導細胞凋亡。範例 12 ：細胞凋亡效果之確認取決於在子宮頸癌細胞 HeLa 中之標靶位置 範例 12.1 ：利用 CNV 標靶與 HPV 基因標靶確認細胞凋亡
利用電穿孔法，將600 ng之表現Cas9蛋白質之載體與gRNA導入子宮頸癌細胞株HeLa之細胞。培養之HeLa細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各載體混和。將細胞與DNA載體之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，使用之條件為標靶CCR5 (其為2個複製數之非必需基因)及MT2條件(其標靶超過100個非必需基因)。在實驗組方面，進行實驗以誘導HeLa細胞特異性細胞凋亡，其係靶向HeLa細胞中之PRDM9 (其已知存在於8個複製數或以上)與人類乳突病毒(HPV)衍生之基因(其已知存在於30個複製數或以上)。
在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複置於24孔培養盤中。在24小時之後，將0.5 μg/ml之嘌黴素加入各培養孔中以進行一殺死細胞之篩選過程而無DNA載體。在篩選3天之後，將培養基改成無嘌黴素之培養基。在3至4天之後，細胞從各培養孔脫離且以台盼藍染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖18與圖19。
如圖18與圖19所示，經證實，相較於CCR5，在靶向100個或以上位點之MT2條件中，隨時間誘導約50%之細胞凋亡，其僅切割HeLa細胞中之一位點。此外，經證實，CNV標靶PRDM9與HPV基因標靶HPV_1誘導之細胞凋亡類似於或大於MT2條件。具體而言，在圖18中，MT2與PRDM9呈現之細胞凋亡率分別為約50%與約80%。同時，在圖19中，MT2、PRDM9、及HPV_1觀察到約50%、約40%、及約40%之細胞凋亡率。據此，經證實，針對僅存在於HeLa細胞中之CNV與HPV基因，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂，可誘導細胞凋亡。範例 12.2 ：利用 CNV 標靶與 HPV 基因標靶確認細胞凋亡
利用電擊將DNA載體導入HeLa細胞之過程與範例12.1的相同。在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複置於96孔培養盤中。在24、48、及72小時之後，利用CellTiter Glo 2.0，確定歷經代謝過程之活細胞量，其係測定細胞中ATP量之冷光程度。作為對照組，其為一表達GFP之對照組載體，加上一條件為標靶CCR5(其為1個複製數之非必需基因)與MT2條件(其標靶超過100個非必需基因)。在實驗組方面，進行實驗以誘導HeLa細胞特異性細胞凋亡，其係靶向HeLa細胞中之PRDM9 (其已知存在於8個複製數或以上)與人類乳突病毒(HPV)衍生之基因(其已知存在於30個複製數或以上)。結果顯示於圖20a。
如圖20a所示，CCR5標靶(其僅切割HeLa細胞中之一位點)與僅脈衝之含有GFP之對照組顯示類似之冷光信號。此外，經證實，相較於CCR5條件，MT2條件誘導約50%之細胞凋亡。此外，經證實，CNV標靶PRDM9與HPV基因標靶HPV_1誘導之細胞凋亡高於MT2條件。具體而言，MT2、PRDM9、及HPV_1呈現之細胞凋亡率分別為約50%、約65%、及約65%。
據此，經證實，針對僅存在於HeLa細胞中之CNV與HPV基因，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂，可誘導細胞凋亡。範例 12.3 ：利用 HPV 基因標靶確認細胞凋亡
利用電擊將DNA載體導入HeLa細胞之過程與範例12.1的相同。將不存在於人類基因體之NT條件標靶區域加至現有條件，包括標靶CCR5 (其為1個複製數之非必需基因)與MT2條件(其靶向超過100個非必需基因)。NT1為表現20-mer非標靶sgRNA之條件，且NT2與NT3為非標靶sgRNA之間隔序列長度分別為10 mer與5 mer之條件。在實驗組方面，進行實驗以誘導HeLa細胞特異性細胞凋亡，其係靶向HeLa細胞中之人類乳突病毒(HPV)衍生之基因，其已知存在30個複製數或以上。在以電擊導入DNA之後，細胞以二重複置於24孔培養盤中。在24小時之後，將0.5 μg/ml之嘌黴素加入各培養孔中以進行一殺死細胞之篩選過程而無DNA載體。在篩選3天之後，將培養基改成無嘌黴素之培養基。在10天之後，細胞從各培養孔脫離，且利用CellTiter Glo方法測定冷光信號。結果顯示於圖20b。
如圖20b所示，相較於NT3條件(其具有5-mer間隔序列)，CCR5標靶(其僅切割HeLa細胞中之一位點)顯示約75%冷光信號，且相較於NT3條件，MT2條件誘導約99.5%細胞凋亡。此外，經證實，相較於CCR5條件，MT2條件誘導約50%之細胞凋亡。此外，相較於NT3條件，HPV_1 (HPV基因標靶)發現殺死約90%之細胞。據此，經由CellTiter Glo方法確認到，針對僅存在於HeLa細胞中之HPV基因，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂時，可誘導細胞凋亡。範例 13 ：細胞凋亡效果之確認取決於在結直腸癌細胞 HT-29 中之標靶位置 範例 13.1 ：利用 CNV 標靶確認細胞凋亡
HT-29細胞以1.5 × 105 個細胞/孔分盤至24孔培養盤中。在24小時之後，將下表9顯示之DNAs種類導入各培養孔中。在基因導入方面，依據製造商之手冊，使用Lipofectamine 3000試劑，且各使用500 ng之DNA。 [表9]
Figure 108110779-A0304-0009
在DNA導入(即轉染) 24小時之後，嘌黴素以1 μg/ml之濃度加入各培養孔中，並在90小時進行篩選。隨後，利用抽吸移除各培養孔之培養液，且容許細胞在正常培養基(McCOY + 10% FBS，1% P/S)中恢復12天。隨後，細胞再次以500 μl/孔之1X PBS清洗，並將胰蛋白質酶-EDTA施加於各孔中，使所有細胞脫離。細胞以台盼藍染劑染色，並計數二次活細胞數量，隨後進行平均。結果顯示於圖21。
如圖21所示，NT1已知不具有標靶序列，而CCR5具有單一標靶，顯示誤差範圍內之差異。在HPRT1之情況中，相較於NT1，約47%之細胞存活。MT2為陽性對照組，其在整個基因體中可切割100個重複序列，且相較於NT1，四個CNV標靶(TRAPPC9、LINC00536、TRPS1、及CDK8)呈現之細胞存活率分別為2%、3%、18%、20%、及4.2%。亦即，經證實，藉由使用CNV標靶，可有效地殺死癌細胞。範例 13.2 ：利用 CNV 標靶確認結直腸癌細胞之細胞凋亡
欲利用CNV (CDK8、LINC00536、TRPS1、及TRAPPC9)與MT2靶向四個基因以確定HT-29 (結腸癌細胞株)之特異性細胞凋亡，利用電穿孔法(Lonza)，將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與各CNV標靶之gRNA導入HT-29細胞。培養之HT-29細胞以1X PBS清洗，隨後以胰蛋白質酶-EDTA處理，使其從底部脫離。取出所需數量之細胞，以1X PBS清洗一次，懸浮於SF緩衝液(Lonza)，隨後與各DNA混和。將細胞與DNA之混合物置於電穿孔儀(Lonza)中，並施加電擊。作為對照組，加上一條件為標靶NT1 (其未對齊於人類基因序列(非標靶))與一條件為僅電擊(僅脈衝)。在電擊之後，細胞以每一條件四重複置於96孔培養盤中。在DNA導入24小時之後，將50 μl之CellTiter Glo試劑加入各培養孔中。將培養盤置於FLUOstar奧米加讀盤儀並搖晃2分鐘。在室溫下將其反應10分鐘後，測定冷光。結果顯示於圖22。
如圖22所示，相較於對照組，MT2條件(靶向100個或以上位點)與TRAPPC9 CNV標靶條件誘導90%之細胞凋亡，且利用CDK8、LINC00536、及TRPS1之三CNV標靶，誘導20%至45%之細胞凋亡。範例 14 ：比較標靶基因用於肺癌細胞 H1299 與 H1563 之細胞凋亡效果
H1563細胞以1.5 × 105 個細胞/孔分盤至24孔培養盤中。在24小時之後，將下表10顯示之DNAs種類導入各培養孔中。在基因導入方面，依據製造商之手冊，使用Lipofectamine 3000試劑，且各使用500 ng之DNA。 [表10]
Figure 108110779-A0304-0010
在DNA導入(即轉染) 24小時之後，嘌黴素以1 μg/ml之濃度加入各培養孔中，並在72小時進行篩選。隨後，利用抽吸移除各培養孔之培養液，且細胞再次以500 μl/孔之1X PBS清洗，並將胰蛋白質酶-EDTA施加於各孔中，使所有細胞脫離。細胞以台盼藍染劑染色，並計數活細胞數量。結果顯示於圖23。此時，在H1299中，除了CCR5以外，所有使用之DNA標靶皆擴增，且藉由切割基因體中超過12個位點，顯示細胞凋亡效果(請見圖8與圖9)。然而，由於此類擴增之CNVs不存在於H1563細胞中，所有的標靶僅切割二個標靶位置，如同CCR5之情況。
如圖23所示，在肺癌細胞H1563中，彼等標靶未呈現如同在H1299肺癌細胞中的細胞凋亡效果，但相較於CCR5，呈現相當高之細胞存活率。然而，在KCNE2之情況中，H1563亦觀察到呈現高的細胞凋亡效果。此與圖24之顯微鏡圖像推斷之細胞凋亡趨勢一致。KCNE2之細胞凋亡效果推斷由於未知原因所致，且除了KCNE2以外，H1299的三個CNV標靶(SMIM11、GNPDA2、及SLC15A5)在H1563中不會誘導細胞凋亡。因此，確認CNV之細胞特異性細胞凋亡效果。範例 15 ：利用 CNV 標靶測定肺癌細胞 H1299 之細胞凋亡
在轉染前一天，肺癌細胞株H1299之細胞以胰蛋白質酶-EDTA脫離，並以1.3 × 104 個細胞/孔分盤於白色96孔培養盤中。在隔天，利用微脂體之方法將500 ng之表現Cas9蛋白質之DNA與各CNV標靶之gRNA導入細胞中。
將0.3 μl之微脂體試劑I與5 μl之Opti-MEM混和(試管1)。將0.2 μl之微脂體試劑II、5 μl之Opti-MEM、及500 ng之各條件之DNA混和，以製備試管2。將兩試管之內容物混和，並在室溫下靜置15分鐘。微脂體與DNA之混合物以每孔11 μl加入96孔培養盤之各孔中。在3小時之後，將AnnV試劑加入各孔中，且在轉染24小時之後測定冷光程度。結果顯示於圖25。此方法為基於細胞凋亡時AnnV附著於暴露在外細胞膜之PS (磷脂醯絲胺酸)位點時發生的冷光程度而測定細胞凋亡程度的方法。
實驗結果為，KCNE2、GNPDA2、SMIM11、及SLC15A5顯示約30%置40%之細胞凋亡率。從上述結果可知，在H1299細胞之四CNVs (GNPDA2、KCNE2、SLC15A5、及SMIM11)中，當以Cas9蛋白質誘導標靶DNA斷裂時，經證實，將PS暴露於細胞膜時導致細胞凋亡。範例 16 ：確認 EGFR 突變體序列特異性引導 RNA 之細胞凋亡效果及 Cas9-RecJ 融合蛋白質 (CRISPR PLUS) 之細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，利用Cas9蛋白質表現載體(PX459，Addgene質體#62988)，其能在HCC827肺癌細胞之基因體造成多重切割，從而導致細胞凋亡。此外，經證實，利用PX459載體表現人類密碼子優化之Rec J蛋白質與Cas9蛋白質，可擴增細胞凋亡效果。使用電穿孔法，將載體移入細胞中，且欲誘導基因體之多重切割，使用引導RNA，靶向HCC827細胞中之EGFR基因之E2突變體序列。
將HCC827細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與500 ng之載體填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,300 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，4天後收取，並計數。結果顯示於圖26與圖27。
如圖26與圖27所示，當相較於對照組(其中僅施加電脈衝(僅脈衝))，相較於EGFR_WT實驗組(其中無標靶序列)，EGFR_E2實驗組之細胞數量明顯減少。具體而言，在利用Cas9靶向CCR5之實驗組中，細胞數量未改變，但在靶向EGFR_E2之實驗組中，呈現細胞凋亡率約33%。此外，觀察到，當與Rec J蛋白質共同表現時，利用多重切割不僅擴增細胞凋亡效果，同時減少細胞數量，即使切割單一標靶。具體而言，利用Cas9-RecJ靶向CCR5之實驗組呈現細胞凋亡率約50%，而利用Cas9-RecJ靶向EGFR_E2之實驗組顯示細胞凋亡率約80%。經由上述實驗，發現當將Cas9蛋白質與細胞基因體序列特異性多重標靶引導RNA導入癌細胞時，誘導細胞凋亡，且可利用CRISPR PLUS蛋白質控制效果。範例 17 ：確認 EGFR 突變體序列特異性引導 RNA 之細胞凋亡效果與 RNP 之細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，可利用Cas9/sgRNA核醣核蛋白質(Cas9 RNP)致使HCC827肺癌細胞之基因體之多重切割，從而誘導細胞凋亡。使用靶向HCC827細胞中之EGFR基因之E2突變體序列的引導RNA，以電穿孔法將RNPs移入細胞中，以誘導基因體之多重切割。
將HCC827細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與1.2 μM之RNP填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,300 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，1天後收取，並計數。結果顯示於圖28。
如圖28所示，相較於對照組(其中僅施加電脈衝(僅脈衝))或導入Cas蛋白質或單獨之引導RNA的對照組，導入靶向EGFR_E2序列之RNPs的實驗組細胞數量明顯減少。具體而言，導入靶向EGFR_E2序列之RNP的實驗組呈現細胞凋亡率約33%。經由上述實驗，經證實，當Cas9蛋白質與細胞基因體序列特異性多重標靶引導RNA導入癌細胞時，誘導細胞凋亡，且可利用Cas9 RNP控制效果。範例 18 ：確認 MT2 序列特異性引導 RNA 之細胞凋亡效果與 RNP 之細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，可利用Cas9/sgRNA核醣核蛋白質(Cas9 RNP)致使H1563肺癌細胞之基因體之多重切割，從而誘導細胞凋亡。使用靶向MT2之引導RNA，其能靶向人類基因體中超過100個位點，以電穿孔法將RNPs移入細胞，誘導基因體之多重切割。
將H1563細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與1.2 μM之RNP填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,200 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，2天後收取，並計數。結果顯示於圖29。
如圖29所示，經證實，相較於對照組(其中僅施加電脈衝(僅脈衝))或導入單獨之引導RNA的對照組，導入靶向MT2序列之RNP的實驗組細胞數量明顯減少。具體而言，導入靶向MT2序列之RNP的實驗組呈現細胞凋亡率約35%。經由上述實驗，經證實，當Cas9蛋白質與細胞基因體序列特異性多重標靶引導RNA導入癌細胞時，誘導細胞凋亡，且可利用RNP控制效果。範例 19 ：確認 MT2 、 GNPDA2 、及 SMIM11 序列特異性引導 RNAs 之細胞凋亡效果與 RNP 之細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，利用Cas9蛋白質，可致使H1299細胞(其為肺癌細胞)中之基因體之多重切割，從而誘導細胞凋亡。在多種癌細胞中，以具有相當高之轉染效率之H1299細胞進行實驗，並以電穿孔法將RNPs移入細胞中。
作為用於誘導基因體之多重切割的引導RNAs，使用三類引導RNAs靶向下列基因：MT2、GNPDA2、及SMIM11。依據H1299細胞特異性基因體定序資訊，在具有高複製數變異(CNV)之基因中，製備分別靶向存在約12個複製數或以上之致癌基因(GNPDA2)與存在約40個複製數或以上之非必需基因(SMIM11)的引導RNAs。分析存在於人類基因體序列中之所有Cas9前間隔序列鄰近模體(PAM，5'-NGG-3 ')，並構築靶向MT2之引導RNA，其能靶向超過100個位點。欲確認轉染作用，構築與使用C端具有GFP之Cas9蛋白質。
將H1299細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與RNP複合體(其由1.2 μM之Cas9-GFP蛋白質與1.5 μM之引導RNA製成)填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,300 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，且在2天之後，依據活細胞信號(冷光)決定活細胞數量，其係利用Promega的CellTiter Glo 2.0測定，並彼此互相比較。結果顯示於圖30至圖32。
如圖30至圖32所示，相較於導入蛋白質或僅引導RNA之對照組，在CCR5標靶實驗組(其已知具有單一標靶)中，觀察到未有明顯細胞凋亡。然而，在MT2、GNPDA2、及SMIM11實驗組(其皆導入致使多重切割之RNPs)中，觀察到明顯細胞凋亡。具體而言，在導入RNPs之MT2、GNPDA2、及SMIM11實驗組中，呈現細胞凋亡率分別約33%、約71%, and 約40%。經由上述實驗證實，當將Cas9蛋白質與細胞基因體序列特異性多重標靶引導RNA導入癌細胞時，誘導細胞凋亡，且可利用RNP控制效果。範例 20 ：確認 Cas12a 蛋白質之序列特異性細胞凋亡效果與突變體 CNV 之序列特異性細胞凋亡效果
在此範例中，經證實，利用Cas12a蛋白質表現載體，可致使HCC827細胞(其為肺癌細胞)中之基因體之雙重或多重切割，從而誘導細胞凋亡。在本發明中，Cas12a之DNA與胺基酸序列如SEQ ID NOs: 135與136所示。以電穿孔法將載體移入細胞中，並使用野生型非必需基因、CCR5 (SEQ ID NO: 138)、或crRNA (SEQ ID NO: 139)，其靶向EGFR_E2突變體序列(其已知於HCC827細胞中存在18個複製數)。
將HCC827細胞培養在含有RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基之75T培養瓶中至約50%滿，進行胰蛋白質酶化，以PBS清洗，且最終再懸浮於Neon Electroporation Buffer R之中。在將150,000個細胞與500 ng之載體填載至10 μl Neon吸管尖之後，在1,300 V、20 ms、及2個脈衝之條件下進行電穿孔法。隨後，容許細胞在RPMI-1640 (10%胎牛血清)培養基恢復，6天後收取，並藉由測定冷光信號量化細胞。另一方面，以EGFR_WT 序列(SEQ ID NO: 137)作為對照組，此序列已知不存在於HCC827細胞。結果顯示於圖33與圖34。
如圖33與圖34所示，相較於對照組，在靶向CCR5之實驗組中，殺死約76%的細胞，且在靶向EGFR_E2之實驗組中，殺死約83%的細胞。此實驗證實，當以Cas12a蛋白質切割癌細胞特異性序列時，不論複製數，可誘導標靶特異性細胞凋亡。
圖1為一說明一過程之示意圖，其中CRISPR關聯性蛋白質之非特異性核酸外切酶功能藉由crRNA引導之標靶位點結合而活化，從而降解癌細胞之標靶核酸。 圖2為一實施例之組成物示意圖，其包含crRNA、CRISPR關聯性蛋白質、及/或核酸外切酶(以下稱作CRISPR PLUS系統)，其在癌細胞中特異地活化且作為抗癌劑。 圖3說明一實施例之CRISPR/Cas12a蛋白質具有非特異性核酸外切酶活性，取決於其序列特異性核酸內切酶活性。 圖4顯示人類癌細胞株HEK293 (圖4a)與HeLa (圖4b)在以CRISPR/Cas12a (Cpf1)核酸酶、crRNA、或RNP複合體(其為該二分子之共軛體)轉染後24、48、及72小時測定之細胞存活力。 圖5顯示在僅脈衝、EGFR_WT、及具有EGFR突變體之HCC827細胞株實驗組中，利用一特異地結合至EGFR突變體與Cas9之引導RNA所誘導的細胞凋亡。 圖6係比較如圖5測試之僅脈衝、EGFR_WT、及具有EGFR突變體之HCC827細胞株實驗組(EGFR_E2)之活細胞數量的顯示圖。 圖7顯示利用互補於肺癌細胞株H1299中之標靶基因CCR5、HPRT1、MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。在此實驗中，進行脂質體轉染(lipofection)，以導入一編碼引導RNA與Cas9的核酸。NT1意指一引導RNA，其不含與互補於肺癌細胞中之彼等匹配之序列，且作為陰性對照組。特別的是，經證實，互補地結合至MT2、SMIM11、GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2的引導RNAs可有效地殺死肺癌細胞。 圖8顯示經測定之活細胞數量，以確認圖7所示之細胞凋亡結果。 圖9為一證實利用互補於肺癌細胞株H1299中之標靶基因CCR5、HPRT1、MT2、GNPDA2、SLC15A5、及KCNE2之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡顯示圖。Lipo為所包括之對照組，其中僅進行脂質轉染胺(lipofectamine)處理而不導入DNA。 圖10顯示利用NucBlue Live ReadyProbes Reagent與Propidium Iodide ReadyProbes Reagent獲得之NT1對照組與GNPDA2實驗組之活細胞顯微鏡圖像。NucBlue Live ReadyProbes Reagent為一藍色螢光染劑，其可染色活細胞與死細胞。Propidium Iodide ReadyProbes Reagent為一紅色螢光染劑，其僅可染色死細胞。 圖11顯示經測定之活細胞數量，以確認利用互補於肺癌細胞株H1563中之標靶基因 CCR5、HPRT1、MT2、IRX1、及ADAMTS16之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。 圖12顯示利用冷光測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於肺癌細胞株A549中之標靶基因 HPRT1、CCR5、及MT2之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。 圖13顯示經測定之活細胞數量，以確認利用互補於肺癌細胞株A549中之標靶基因 HPRT1、CCR5、及MT2之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。 圖14顯示圖13之結果的顯微鏡觀察。 圖15顯示利用冷光測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於肺癌細胞株A549中之標靶基因MT2、CD68、DACH2、HERC2P2、及SHBG之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。 圖16顯示利用冷光測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於乳癌細胞株SKBR3中之標靶基因MT2、ERBB2、及KRT16之引導RNAs誘導之乳癌細胞的細胞凋亡。 圖17顯示經測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於乳癌細胞株SKBR3中之標靶基因MT2、ERBB2、及KRT16之引導RNAs誘導之乳癌細胞的細胞凋亡。 圖18顯示經測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於子宮頸癌細胞株HeLa中之標靶基因CCR5、MT2、及PRDM9之引導RNAs誘導之子宮頸癌細胞的細胞凋亡。各基因之CNV為CCR5為2、MT2為至少100、及PRDM9為至少8。 圖19顯示經測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於子宮頸癌細胞株HeLa中之標靶基因CCR5、MT2、PRDM9、及HPV_1之引導RNAs誘導之子宮頸癌細胞的細胞凋亡。各基因之CNV為CCR5為2、MT2為至少100、PRDM9為至少8、及HPV_1為30。 圖20a顯示利用冷光測定之隨時間的活細胞數量，以確認利用互補於子宮頸癌細胞株HeLa中之標靶基因CCR5、MT2、HPV_1、及PRDM9之引導RNAs誘導之子宮頸癌細胞的細胞凋亡。 圖20b顯示利用冷光測定之活細胞數量，以確認利用互補於子宮頸癌細胞株HeLa中之標靶基因CCR5、MT2、及HPV_1之引導RNAs誘導之子宮頸癌細胞的細胞凋亡。將靶向不存在於人類基因體區域之NT序列NT1、NT2、及NT3概括為陰性對照組。 圖21顯示經測定之活細胞數量，以確認利用互補於結直腸癌細胞株HT-29中之標靶基因 CCR5、HPRT1、MT2、TRAPPC9、LINC00536、TRPS1、及CDK8之引導RNAs誘導之結直腸癌細胞的細胞凋亡。 圖22顯示利用冷光測定之活細胞數量，以確認利用互補於結直腸癌細胞株HT-29中之標靶基因MT2、CDK8、LINC00536、TRPS1、及TRAPPC9之引導RNAs誘導之結直腸癌細胞的細胞凋亡。 圖23顯示經測定之活細胞數量，以確認利用互補於結直腸癌細胞株H1563中之標靶基因 SMIM11、GNPDA2、SLS15A5、及KCNE2之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡。進行此實驗之目的在於，確認在肺癌細胞株H1299中有效之互補於標靶基因之引導RNAs對其他肺癌細胞株H1563是否亦有效。 圖24提供圖23之結果的顯微鏡觀察。 圖25為一證實利用互補於標靶基因CCR5、KCNE2、GNPDA2、SMIM11、及SLS15A5之引導RNAs誘導之肺癌細胞的細胞凋亡顯示圖。進行此實驗以確認CNV在肺癌細胞株H1299中之效果。由於加入AnnV試劑，在死細胞中檢測到高的冷光。 圖26顯示Cas9 (其為具有核酸內切酶功能之CRISPR關聯性蛋白質)與RecJ (其具有核酸外切酶活性)之融合蛋白質的癌細胞殺死效果，其係使用互補於肺癌細胞株HCC827中之EGFR突變體與CCR5、Cas9、及Cas9-RecJ (SEQ ID NO: 87)之引導RNAs。其結果為，經證實，在含有核酸外切酶之融合蛋白質中，殺死肺癌細胞的能力明顯增加。 圖27顯示圖26之結果的顯微鏡觀察。 圖28顯示一依據遞輸系統以確認效果之實驗結果，其中檢查是否RNP (核醣核蛋白質)，其中引導RNA與核酸內切酶蛋白質Cas9結合，具有細胞凋亡效果。具體而言，經證實，RNP (其中引導RNA互補地結合至肺癌細胞株HCC827中之EGFR突變體)與Cas9結合，有效地殺死肺癌細胞。另一方面，作為陰性對照組的Cas9蛋白質與引導RNA不會殺死細胞。 圖29顯示一依據遞輸系統而確認效果之實驗結果。在此實驗中，檢查是否RNP可有效地誘導細胞凋亡。以sgRNA作為對照組，並以由一互補於MT2之引導RNA與Cas9組成之RNP作為實驗組。細胞株為肺癌細胞株H1563。 圖30顯示一依據遞輸系統而確認效果之實驗結果。在此實驗中，檢查是否RNP可有效地誘導細胞凋亡。以sgRNA與Cas9蛋白質作為對照組，並以RNPs (各由Cas9與互補於CCR5、GNPDA2、及SMIM11之任一者的引導RNA組成)作為實驗組。細胞株為肺癌細胞株H1299。 圖31顯示一依據遞輸系統而確認效果之實驗結果。在此實驗中，檢查是否RNP可有效地誘導細胞凋亡。以sgRNA與Cas9蛋白質作為對照組，並以RNPs (各由Cas9與互補於CCR5或MT2之引導RNA組成)作為實驗組。細胞株為肺癌細胞株H1299。 圖32提供圖30之結果的顯微鏡觀察。 圖33證實利用互補於標靶基因CCR5與EGFR_E2之引導RNAs及Cas12a之誘導細胞凋亡。細胞株為肺癌細胞株HCC827。 圖34顯示圖33之結果的顯微鏡觀察。
(無)

Claims (13)

  1. 一種用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸及一含有一核酸內切酶與一核酸外切酶之融合蛋白質，以作為活性成分，其中該多核苷酸為crRNA或gRNA，其中該核酸內切酶為Cas9，且其中該核酸外切酶為RecJ。
  2. 如請求項1之組成物，其中該核酸內切酶與該核酸外切酶係經由一連接子連接。
  3. 如請求項1之組成物，其中該特異地存在於癌細胞中之核酸的特徵在於單核苷酸多型性(SNP)、複製數變異(CNV)、結構變異(SV)、基因***、或基因刪除。
  4. 如請求項3之組成物，其中該結構變異之特徵在於倒位、轉位、或短核苷酸重複擴增。
  5. 如請求項1之組成物，其中該特異地存在於癌細胞中之核酸係選自於複製數變異(CNV)至少為4之基因。
  6. 如請求項5之組成物，其中該特異地存在於癌細胞中之核酸係選自於複製數變異(CNV)至少為7之基因。
  7. 如請求項1之組成物，其中該特異地存在於癌細胞中之核酸為選自於由p53、PTEN、APC、MSH2、HBV、HCV、及EGFR所組成群組之任一基因的 突變體。
  8. 一種用於治療癌症之藥學組成物，其包含如請求項1至7中任一項之組成物。
  9. 如請求項8之藥學組成物，其中該癌症係選自於由膀胱癌、骨癌、血癌、乳癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、骨髓癌、直腸癌、咽喉癌、喉癌、肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮膚癌、腦瘤、子宮癌、頭頸癌、膽囊癌、口腔癌、結腸癌、肛圍癌、中樞神經系統腫瘤、肝癌、及結直腸癌組成之群組。
  10. 一種用於殺死腫瘤細胞之組成物，其包含一載體以作為一活性成分，該載體含有一互補地結合至一特異地存在於癌細胞中之核酸的多核苷酸，其中該多核苷酸為crRNA或gRNA，以及一編碼一核酸內切酶與一核酸外切酶之多核苷酸，其中該核酸內切酶為Cas9，且其中該核酸外切酶為RecJ。
  11. 如請求項10之組成物，其中該載體為病毒載體或質體載體。
  12. 一種如請求項1至7、10與11中任一項之組成物於製備藥物之用途，該藥物是用於治療癌症，該組成物是投予至具有癌症之個體。
  13. 如請求項12之用途，其中該投予係經由選自於由腫瘤內、靜脈內、肌內、皮內、皮下、腹腔內、小動脈內、心室內、病灶內、鞘內、局部、及其組合所組成群組之任一途徑。
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