TWI714568B - 液狀培養基組成物的製造方法，及用於該製造方法之製造裝置與套組 - Google Patents

液狀培養基組成物的製造方法，及用於該製造方法之製造裝置與套組 Download PDF

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Abstract

本發明係提供一種液狀培養基組成物之製造方法及用於該製造方法之製造裝置及套組，係對於含有2價金屬陽離子等連結物質之任意液體，可容易混合含有特定化合物之液體，且該液狀培養基組成物含有分散於該組成物中之微細構造體。使含有特定化合物之第1液體通過設置於噴嘴部之規定橫剖面積之貫通孔，成為規定之流量，將該第1液體以上述規定之流量射出到第2液體中。藉由該簡單操作，形成上述特定化合物通過上述連結物質連結而成之構造體，且該構造體較佳地分散於上述兩液體之混合液中。

Description

液狀培養基組成物的製造方法，及用於該製造方法之製造裝置與套組
本發明係有關液狀培養基組成物之製造方法及用於實施該等之製造裝置及套組。更詳細而言，本發明係有關為了形成上述培養基組成物，將適合混合之至少2種液體(含有特定化合物之第1液體，及含有將該特定化合物彼此連結而形成構造體之物質之第2液體)適當混合，製造分散有上述構造體之培養基組成物之方法及可將其分散之製造裝置及套組。
近年來，持續發展用於將在動物或植物體內擔任不同任務之種種器官、組織及使細胞在生體外增殖或維持之技術。將該等器官、組織於生體外增殖或維持者分別稱為器官培養、組織培養，將從器官、組織分離之細胞於生體外增殖、分化或維持者稱為細胞培養。
細胞培養為將經分離之細胞在培養基中，於生體外增殖、分化或維持之技術，為用於詳細解析生體內各種器官、 組織、細胞之機能及構造不可缺的技術。
又，藉由該技術培養之細胞及/或組織可在化學物質、醫藥品等之藥效及毒性評估；酵素、細胞增殖因子、抗體等有用物質之大量生產；補充因疾病或缺損而喪失之器官、組織、細胞之再生醫療；植物之品種改良、基因重組作物的作成等種種領域中利用。
作為用於培養細胞等(器官、組織、細胞)之培養基之一，可列舉液體培養基，本發明人等成功地開發可將細胞等以懸浮狀態培養之液狀培養基組成物(專利文獻1及2)。
專利文獻1中記載之液狀培養基組成物為特定化合物(尤其是具有陰離子性官能基之高分子化合物)通過2價金屬陽離子等集合，成為不定形之構造體，該構造體為分散於液體培養基中，成為懸浮狀態者。以下，亦將所謂具有陰離子性官能基之高分子化合物等上述特定化合物稱為「特定化合物」，亦將該特定化合物彼此連結之2價金屬陽離子等物質稱為「連結物質」。
該培養基組成物係不伴隨有會引起細胞等之障害或機能喪失之風險之振動或旋轉等操作，成為可將細胞等以懸浮狀態培養之較佳液狀培養基。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2014/017513號
[專利文獻2]US2014/0106348 A1
上述專利文獻1中記載之液狀培養基組成物原本意圖之較佳狀態為特定化合物彼此每次少量互相連結，成為微小之構造體，多數分散於液中之狀態。
惟，本專利之發明人等在詳細檢討該液狀培養基組成物之實際製作步驟時明瞭，若要獲得該等較佳狀態，必需要留意不使構造體以集中於培養基組成物中之局部之方式形成。例如，特定化合物為去醯化結蘭膠時，該去醯化結蘭膠與液體培養基混合時，通過液體培養基中之連結物質(例如鈣離子)形成不定形之構造體，該構造體成為用於使細胞等懸浮之載體。惟，將含有連結物質之液體培養基邊攪拌邊於其中注入含有高濃度特定化合物之液體之混合方法，為在兩液合流之瞬間，特定化合物與連結物質連接，成為構造體，因此該構造體在混合液中成為以紐狀長的連接之懸浮狀態(或紐狀之構造體以塊狀纒繞之狀態)，有不能成為本來意圖之分散狀態之情況。又，亦明瞭該等狀態即使以比較高速進行攪拌亦會發生。又，液體培養基中，一旦形成該等紐狀之構造體，則形成分子鏈之雙螺旋互相通過連結物質(例如鈣離子)而形成堅固的三維網狀結構，於該構造體具有如此之性質上要將其細切，使其分散於母材中並不容易。
為了獲得上述構造體在液體培養基中以細 分散之狀態，可進行為了分散之特別處理，其係使用粉末狀之培養基或濃縮培養基等成分已知之液體培養基，將含有特定化合物之液體稀釋，藉由將兩者混合，作出微細構造體經分散之狀態。
惟，為了該等分散的特別處理費工夫，又，於一般之液體培養基或特殊之液體培養基中要進行該等特別處理有困難之情況，因此可培養之細胞等亦受限制。
本發明之目的為提供解決上述問題，對於含有2價金屬陽離子等連結物質之任意液體，可容易的將含有高濃度特定化合物之液體混合，且可製造微細構造體經分散之液狀培養基組成物之方法及用於該製造方法之製造裝置與套組。
本發明人等經過深入研究之結果發現，使含有特定化合物之液體通過具有特定範圍之橫剖面積之貫通孔，成為特定值以上之流量，只以該流量衝進含有連結物質之液體中，不需使用特殊之攪拌裝置，即可獲得微細構造體在液體培養基中較佳分散之液狀培養基組成物，因而完成本發明。
本發明之主要結構為如下所述。
[1]一種液狀培養基組成物之製造方法，其具有：使含有下述(i)之特定化合物之第1液體通過設置於噴嘴部之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2之貫通孔，成為1.7mL/秒以上之流量；以及 將上述第1液體以上述之流量射出到含有下述(ii)之連結物質之第2液體中，藉此，形成上述特定化合物通過上述連結物質連結而成之構造體，且使該構造體分散於上述兩液體之混合液中之步驟之製造方法，其中
(i)為具有陰離子性官能基之高分子化合物之特定化合物，係藉由通過2價金屬陽離子連結，可形成可使細胞或組織懸浮之構造體。
(ii)為2價金屬陽離子之連結物質。
[2]如上述[1]所述之製造方法，其係將第2液體收容於下述(a)之容器，將第1液體從供給裝置送出，且通過下述(a)之容器之貫通孔，成為上述流量，藉此，將第1液體以上述流量射出到該容器內之第2液體中。
(a)為具有本體及蓋子的容器，該本體或該蓋子設置有具有將容器外與容器內連通之貫通孔之噴嘴部，該貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2。
[3]如上述[2]所述之製造方法，其中，上述供給裝置為注射器， 上述噴嘴部設置於容器的蓋子上，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
[4]如上述[1]所述之製造方法，其係將第2液體收容於容器中，將收容有第1液體之下述(b)之供給裝置之噴嘴部前端***上述容器內，使第1液體從該供給裝置送出，且通過該供給裝置噴嘴部之貫通孔，成為上述流量，藉此，將 第1液體以上述流量射出到容器內之第2液體中者。
(b)為具有用於收容液體之收容部、用於將收容之液體通過貫通孔射出之噴嘴部之供給裝置，該噴嘴部貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2。
[5]如上述[4]所述之製造方法，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部為安裝於上述注射器之注射針， 於上述容器之蓋子設置可使上述注射針之針管部從容器外貫通到容器內之可貫通部分，且於該可貫通部分之容器外側，用於嵌入注射針之針基部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所述之製造方法，其中，上述(i)之特定化合物為去醯化結蘭膠，第1液體為含有該去醯化結蘭膠之水溶液， 上述(ii)之連結物質為鈣離子及鎂離子中之一者或兩者，第2液體為含有鈣離子及鎂離子中之一者或兩者之液體培養基。
[7]一種製造裝置，為用於實施上述[1]所述之製造方法，為具有：用於將第1液體送出之供給裝置、用於收容第2液體且接受從上述供給裝置送出之第1液體之容器、以及具有於第1液體從上述供給裝置送出到上述容器內時可通過之貫通孔之噴嘴部；其中上述貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2， 上述供給裝置係以可將第1液體以1.7mL/秒以上之流量送出構成，藉由使第1液體以上述流量通過上述貫通孔，成為可將第1液體以1.7mL/秒以上之流量射出到上述容器內之構成。
[8]如上述[7]所述之製造裝置，其中，具有貫通孔之噴嘴部設置為上述容器之一部分，上述容器為具有本體及蓋子之容器，上述噴嘴部設置於容器之本體或蓋子，使上述貫通孔可連通容器外及容器內。
[9]如上述[8]所述之製造裝置，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部設置於容器之蓋子，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
[10]如上述[7]所述之製造裝置，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部為安裝於上述注射器之注射針，於上述容器之蓋子設置上述注射針可從容器外貫通到容器內之可貫通部分，且進一步於該可貫通部分之容器外側，用於嵌入注射針之針基部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
[11]一種套組，為用於實施上述[1]所述之製造方法之套組，由至少具有第1容器、注射器及第2容器所構成， 第1容器為收容上述[1]所述之第1液體之容器，注射器為作為用於將上述第1液體送出之供給裝置而運作機能之上述[3]所述之注射器，第2容器為用於收容上述[1]所述之第2液體之上述[2]所述之(a)之容器，如上述[3]所述，於容器的蓋子上設置噴嘴部，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
[12]如上述[11]所述之套組，其中，更於第2容器附帶未具有噴嘴部之密封用蓋子，可將該容器於本體內密封地構成，上述[2]所述之(a)容器之蓋子及上述密封用蓋子係成為具有互換性，可安裝於該容器本體之開口部。
[13]如上述[11]或[12]所述之套組，其中，更於上述注射器附帶有***於第1容器內並用於將第1液體吸引之管狀零件，該管狀零件係具有可***於第1容器內之外徑、以及具備長度為可從第1容器內將第1液體吸引之細管，且於上述細管部之一端具有可安裝於上述注射器外筒之前端部之連結部。
如上述先前技術之說明所述，於將含有連結物質之液體培養基(第2液體)邊攪拌邊於其中注入含有高濃度特定化合物之液體(第1液體)之通常攪拌、混合方法，構造體有於混合液中變成以紐狀長連接、懸浮之情況。該原因為在液體培養基中即使以攪拌棒高速旋轉，確實以 高速移動者只有攪拌棒而己，第2液體全體(尤其是第1液體注入之液面附近)並未如攪拌棒般以高速移動。
為了改善該情況，考慮例如將攪拌棒靠近注入第1液體之合流部分，邊將合流切斷邊攪拌之結構，惟，從回避生物污染之觀點而言，必需要有可以無菌或密閉狀態運用之特殊攪拌裝置。又，於多數之小容量容器中各自分別製作培養基組成物等時，在將攪拌機***容器時成為開放系統，從需要設置確保為無塵室或無塵工作棚等無菌狀態之特殊設施之觀點而言，難以將該等特殊攪拌裝置分別使用於小容量之容器中。
相對於此，本發明之製造方法、製造裝置中兩液體混合手法之原理係與上述之以往混合手法之原理完全相反，不將第2液體以高速攪拌，而是將第1液體通過具有規定橫剖面積S之貫通孔射出，以成為規定以上之流量Q(或流速V)，該流量Q(或流速V)為使第1液體衝入第2液體中者。藉此，於兩液體合流部分中兩液之速度差可確實地變高，兩液體以衝撃性接觸，因此，可充分抑制構造物成為長紐狀連接。又，一旦形成細構造物，即使該細構造物集中於混合液中之一部分，另進行攪拌，即可將細構造物均等地分散於容器內之混合液全體。
於本發明，為了將第1液體作成1.7mL/秒(L表示公升)以上之流量，噴嘴部貫通孔之橫剖面積S限定為0.01mm2至5.00mm2。貫通孔之橫剖面為以垂直切斷從該貫通孔之入口至出口之中心軸線時該貫通孔之剖面，貫 通孔之橫剖面積為該貫通孔之橫剖面之面積。
通過貫通孔出口之第1液體之流量Q、貫通孔之橫剖面積S及通過該貫通孔出口之第1液體流速V之間有Q=S×V之關係。
首先，使用超過上述橫剖面積之大口徑貫通孔時，第1液體成為粗流動，衝進第2液體中。該等粗流動於其中心部分之第1液體在失速前會發生不能與第2液體接觸之情況。相對於此，貫通孔之橫剖面積只要在上述範圍，射出流量通常為細流動，於該流動之中心之第1液體在失速前可與第2液體接觸之準確率變高。因此，於本發明，將貫通孔之橫剖面積限定於上述範圍。
又，於細胞等培養之現場，為了將第1液體送出所使用之實質使用上較佳之供給裝置如後所述，為手動之注射器。於超過上述橫剖面積之大口徑貫通孔，要確實進行以達成理想流速之流量送出變為不易。
因此，本發明即使在大容量之容器內一次製作大量培養基組成物時，通常使用具有上述範圍之橫剖面積之貫通孔。又，根據必要可使用複數之貫通孔將第1液體並列射出至第2液體中，亦可使用單一之貫通孔將第1液體複數次射出至第2液體中。此時之供給裝置，對應其吐出能力，可只設置1個亦可只以貫通孔之數並列設置。
1‧‧‧供給裝置
2‧‧‧噴嘴部
3‧‧‧容器
11‧‧‧外筒
11a‧‧‧前端部
12‧‧‧柱塞
13‧‧‧注射針
13a‧‧‧針基部
13b‧‧‧針管部
21‧‧‧貫通孔
31、K31‧‧‧本體
32、K32‧‧‧蓋子
33‧‧‧筒狀部
33a‧‧‧筒狀部內面
34、35‧‧‧突起部
34a、35a‧‧‧梯度
36‧‧‧螺紋
37‧‧‧環狀密封部
38‧‧‧刻痕
39‧‧‧可貫通部分
A‧‧‧第1液體
A1‧‧‧經射出之第1液體之流動
B‧‧‧第2液體
F‧‧‧擠壓力
K1‧‧‧第1容器
K2‧‧‧注射器
K21‧‧‧管狀零件
K3‧‧‧第2容器
K33‧‧‧密封蓋
X、Y‧‧‧觀看方向
第1圖為用於說明本發明製造方法及製造裝置結構之 概要之剖面圖。為了區別、強調領域，於噴嘴部之剖面加上影線。第1圖中各符號分別表示之構成要素係A：第1液體、B：第2液體、A1：經射出之第1液體之流動、1：供給裝置、2：噴嘴部、21：貫通孔、3：容器。
第2圖為表示本發明製造方法及製造裝置具體之實施態樣例之剖面圖。於同圖之實施態樣例，噴嘴部屬於容器側，又，第1液體以可射出至容器中心構成。於同圖，將容器本體及蓋子之剖面以側視圖表示，為供給裝置之注射器1不是顯示剖面，而是顯示外觀(第3圖、第6圖亦相同)。又，省略對於剖面之影線(第3圖至第7圖亦相同)。
第3圖為表示本發明製造方法及製造裝置具體之其他實施態樣例，於同圖之實施樣態，噴嘴部屬於容器側，又，第1液體以射出至從容器中心偏離之位置構成。
第4圖為將第2圖、第3圖中之噴嘴部位一部分放大之圖。第4圖(a)為噴嘴部之上面圖，第4圖(b)為將第2圖、第3圖中之噴嘴部位一部分放大之剖面圖，第4圖(c)為只將第4圖(b)之上部從同圖之X方向看到之側面圖。
第5圖為表示本發明之製造裝置中容器之蓋子之實施態樣例之圖。第5圖(a)為該蓋子之上面圖，第5圖(b)為該蓋子之側面圖，為沿著第5圖(a)之Y-Y線將該蓋子切斷時之剖面圖。
第6圖為表示本發明製造方法及製造裝置具體之其他實施態樣例之圖。於同圖之實施態樣例，噴嘴部為屬於供給裝置之注射器之零件(尼達(Needall)公司製造)，又，第1 液體以射出至從容器中心偏離之位置構成。
第7圖為將本發明套組之一結構例概略表示之圖。於同圖容器及蓋子以剖面圖表示。為供給裝置之注射器1不是顯示剖面，而是顯示外觀。
以下，邊說明本發明製造裝置之結構邊進行本發明製造方法之說明。本發明製造裝置具體結構之說明亦包含該如何具體實施本發明製造方法之說明。又，本發明製造方法之說明亦包含本發明製造裝置使用方法之說明。
本發明之製造方法，為如上述專利文獻1所述之較佳之液狀之培養基組成物製造方法，如第1圖所示，具有藉由使含有下述(i)之特定化合物之第1液體A通過設置於噴嘴部2之具有0.01mm2至5.00mm2橫剖面積S之貫通孔21，成為1.7mL/秒以上之流量Q，將上述流量Q之該第1液體射出到含有下述(ii)之連結物質之第2液體B中，將兩液體混合之步驟。
此處，上述(i)之特定化合物為具有陰離子性官能基之高分子化合物，其係可通過2價金屬陽離子連結，形成可將細胞或組織懸浮之構造體。
又，上述(ii)之連結物質為2價金屬陽離子。
上述之特定化合物、連結物質及含有特定化合物、連結物質之第1液體、第2液體詳細於後述。
藉由進行以上述流量Q之射出，即使特定化合物通過 連結物質連結之構造體邊形成於兩液體A、B之混合液中，仍可獲得該構造體於該混合液中呈現細分散之液狀培養基組成物。
第1液體A之流量Q只要在1.7mL/秒以上即可，對於具有上述範圍之橫剖面積S之貫通孔，流量Q越大，則第1液體強勁之力量衝進第2液體中，可抑制構造體長連結。
流量之上限並無特別限制，從考慮到貫通孔之橫剖面積S時第1液體之送出能力之觀點而言，可列舉約10mL/秒，以5mL/秒左右於實際操作上更適合。
噴嘴部貫通孔21之橫剖面積S只要為0.01mm2至5.00mm2即可，更佳為在0.05mm2至2.00mm2，特佳為0.10mm2至0.70mm2。藉由將貫通孔橫剖面積限制在上述範圍，即使從供給裝置送出之第1液體液量有些許變化，亦可獲得較佳之攪拌結果(亦即，構造體之較佳分散結果)。
將第1液體射出到第2液體中時第1液體之流動方向並無特別限制，如第1圖所示，可從上面往下面射出、亦可從橫面向側面射出、從下面向上面射出。
本發明之製造裝置為以可實施本發明製造方法構成之裝置，如第1圖所示，為由除了具有上述貫通孔21之噴嘴部2之外，至少具有供給裝置1及容器3所構成。
上述供給裝置1為用於將第1液體A送出之裝置，為可將第1液體以上述流量Q(mm3/秒)送出之構成。
容器3為用於收容第2液體B之容器，且用於接收從上述供給裝置1送出之第1液體，形成兩液體之混合液(亦即，可製造液狀培養基組成物)之容器。
噴嘴部2具有在將第1液體從上述供給裝置送到上述容器內時可通過之上述橫剖面積(mm2)之貫通孔21。噴嘴部2可為屬於供給裝置1之零件，可為屬於容器本體或蓋子之部分，亦可為不屬於任何一種，而是介於供給裝置與容器間之獨立接頭材料。
該製造裝置使用時，第1液體A以上述流量Q(mm3/秒)從供給裝置1送出，通過設置於噴嘴部2之上述橫剖面積S(mm2)之貫通孔21，衝入收容於容器3內之第2液體中。該一連串的操作為實施本發明之製造方法，藉此，如上所述，可獲得較佳之液狀培養基組成物。
可混合之第1液體與第2液體之體積比率並無特別限制，廣泛使用(第1液體：第2液體)=(1：1)至(1：1000)左右，較佳為(1：5)至(1：500)左右，更佳為(1：10)至(1：100)左右。
實際之細胞等培養操作，從使用時調製新鮮之培養基組成物觀點而言，相較於1個大容量之容器中一次製作大量之培養基組成物，再分配至各小容量之容器保存，較佳為以於每個為1至1000mL左右，較好為10至200mL左右之各小容量容器中個別製作培養基組成物。
於每個如上所述之小容量容器中製作培養基組成物時，被混合之兩液體的各別具體體積，收容於容器中之第 2液體為1mL至1000mL左右，更佳為10mL至200mL左右，射出到其中之第1液體為0.01mL至100mL左右，更佳為0.1mL至20mL左右。
對應該等組合，適當地選擇供給裝置1及容器3之容量即可。
第1液體與第2液體之混合液可為製造目的之培養基組成物，亦可於該混合液中另加入添加物，成為製造目的之培養基組成物。
與本發明相反，雖然先將少量之第1液體收容於容器中，於此射出大量之第2液體亦可獲得製造目的之培養基組成物，惟，有第1液體之黏度高而難以混合，及不能忽視之相對於全液量之向壁面等之液體飛散量等之情形，與在大量液體中將少量液體以細、快之流速衝入時之接觸狀態或稀釋條件有很大的不同。又，會產生射出需要耗費時間、容器內之壓力上昇等問題。因此，於本發明推薦以上述比率將第1液體射出到第2液體中。
供給裝置只要具有可以上述流量Q(1.7mL/秒以上)將第1液體送出之吐出能力者即可，可列舉例如蠕動泵、隔膜泵、注射器等。該供給裝置之驅動源可為手動式，亦可為使用馬達等驅動裝置者。其中，如第2圖、第3圖、第6圖所示之注射器(注射筒)，由於結構簡單、操作容易、便宜(因此亦可為可拋棄式)，即使以手動擠押，亦可達到上述流量，而為較佳之供給裝置。例如泰爾茂(Terumo)公司製之預防接種用泰爾茂注射器(1mL，型號 SS-01P)至泰爾茂公司製之泰爾茂注射器(50mL，型號SS-50ESZ)等塑膠製可拋棄式注射器，為適用於在每個上述之小容量容器中製作培養基組成物之注射器。
又，本發明之「注射器」為由具有外筒及柱塞(塞子)構成之裝置。本發明包含將注射器以原狀使用之態樣及在注射器前端另安裝注射針之態樣。
將第1液體送出時之流量Q(於單位時間通過流動中之某剖面之體積：mm3/秒)之上限並無特別限制，若為更大流量，則藉由通過上述噴嘴部之貫通孔，使流速變更高，由於第1液體以更衝撃性地衝進第2液體中，可使構造體更佳細分化、分散。
將注射器作為供給裝置使用時，如第2圖所示，以使第1液體A通過貫通孔21成為上述流量或流速之擠壓力(荷重)F，將柱塞(活塞部分)12押入，將收容於外筒11內之第1液體A送出即可。
亦即，本發明之「將第1液體通過設置於噴嘴部，橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2之貫通孔，使成為1.7mL/秒以上之流量」係指於第1液體通過供給裝置1，加入擠壓力F，藉由擠壓力，以上述之吐出流量將第1液體擠出到該貫通孔內，使第1液體可以1.7mL/秒以上之流量通過該橫剖面積之貫通孔。
將注射器作為供給裝置使用時，藉由調節柱塞全程移動所需之時間，可調節第1液體從該注射器送出之流量。亦即，注射器即使為以人力擠壓時，由於藉由調節柱塞之 沖程所需之時間，可調節目的之流量(mm3/秒)而較佳。
將注射器以人力擠壓時獲得之流量之上限係依個人之力量而異，大約為5mL/秒左右。使用少容量之注射器時之例為將貫通孔之橫剖面積設為0.2mm2，注射器為泰爾茂公司製之預防接種用泰爾茂注射器(1mL，型號SS-01P)，於該注射器中收容1.7mL之第1液體時，只要將第1液體全部擠出所需之柱塞全移動時間T1在1秒以下，則可達成以1.7mL/秒以上之流量送出。注射器以手動操作時，若考慮到將柱塞擠出之力量，柱塞之全移動時間T1以0.2秒至1秒左右較適當，於該情況獲得之流量為1.7mL/秒至8.5mL/秒。
又，使用大容量之注射器時之例為將貫通孔之橫剖面積與上述相同設為0.2mm2，注射器為泰爾茂公司製之泰爾茂注射器(50mL，型號SS-50ESZ)，於該注射器中收容20mL之第1液體時，於相同口徑之貫通孔，只要將第1液體全部擠出所需之柱塞全移動時間T2在12秒以下，則可達成以1.7mL/秒以上之流量送出。注射器以手動操作時，若考慮到將柱塞擠出之力量，柱塞之全移動時間T2以2.5秒至12秒左右較適當，於該情況獲得之流量為1.7mL/秒至8.0mL/秒。此時所需之擠壓力(荷重)與使用上述少容量之注射器時相同。
以人力擠壓柱塞時，雖然在該柱塞之移動速度要嚴密的保持一定上有困難，惟，只要在上述移動時間之範圍，即使以人力，亦可在不脫離該範圍地將該柱塞移動，可達 到經由該貫通孔出口之流速與目的之流量沒有大誤差。
噴嘴部之貫通孔只要具有上述範圍之橫剖面積S，可獲得上述範圍之流量者即可。該貫通孔較佳為直管狀，惟，亦可為用於樹脂成形之拔模。從該貫通孔出來時第1液體之流動A1比起擴散為噴霧狀，較佳為儘可能的以保持該貫通孔橫剖面原狀之線狀流動，藉此，可強且深地衝入第2液體中。貫通孔孔內之形狀適當設計使成為該等流動即可。
貫通孔橫剖面之形狀並無特別限制，可為圓形、橢圓形、長圓形、矩形、長方形、變形等。從貫通孔容易形成之觀點而言，貫通孔橫剖面之形狀較佳為圓形。又，為了特意擾亂經射出之第1液體之流動使其擴散，可將貫通孔橫剖面之形狀適當變形。
貫通孔之長度並無特別限制。噴嘴部設置於容器(本體或蓋子)時，貫通孔之長度較佳為0.01mm至10mm左右，噴嘴部若為注射器之注射針，貫通孔之長度較佳為1.0mm至100mm左右。
噴嘴部2如第2圖所示，可設置於該容器開口之中央等，使將第1液體射出到容器3之中央。藉由將第1液體從噴嘴部衝入到容器中央，如第2圖容器內箭頭所示，第1液體進入第2液體之深處後於容器之底部分開流動，可獲得在容器內轉動之效果。
又，噴嘴部2如第3圖所示，可位於從該容器開口之中央偏離之位置，使將第1液體射出到從容器中央偏向邊 緣之位置。藉由將第1液體衝入到從容器中央偏向邊緣之位置，如第3圖容器內箭頭所示，第1液體進入第2液體之深處後於容器之底部大轉彎，作為1個流動，可獲得在容器內轉動之效果。
噴嘴部之位置例如只要根據第1、第2液體之黏性或液量、容器之形狀等適當決定即可。
容器只要可收容上述第2液體且可接受第1液體之射出，可收容該等混合液者即可。於收容第2液體之容器若以保持氣密狀態將第1液體注入時，雖然容器內之壓力上昇，只要為上述具體之混合比率程度，壓力上昇則不會特別成為問題。
該容器之容量並無特別限制，從上述具體之混合比率之觀點而言，較佳可例示5mL至1000mL左右之容量。容器之橫剖面形狀並無特別限制，從經由混合時之對流，以達成流暢循環之觀點而言，較佳為圓形。
容器內部之深度L1與口徑D1之比率(L1/D1)並無特別限制，即使為相同容量之容器，比率(L1/D1)若太大，則作為全體，成為過度細長之容器，會妨礙混合時之對流而不佳。又，比率(L1/D1)若太小，則作為全體，成為如淺盤子的容器，會妨礙混合時之對流而不佳。較佳之比率(L1/D1)為可從0.5至30左右，較佳為1.0至15左右，更佳為2.0至8.0左右之範圍適當決定。
於容器內收容第2液體時，該液體占有之部分(浸液部)之深度Z與口徑d之比率(Z/d)並無特別限制，可從0.5 至20左右，較佳為1.0至10左右，更佳為1.3至4.0左右之範圍適當決定。
於第2圖、第3圖、第6圖之例，雖將容器底部之形狀向最深部描繪成變細的圓錐狀，惟，可為半球狀或平坦狀等，並無特別限制。從藉由液量或黏性推測對流狀態之變化之觀點、從將細胞等離心分離使細胞有效率的沈降而提昇回收率等實用面操作之觀點而言，較佳之情形為如第2圖、第3圖、第6圖所示之具有向最深部變細之圓錐狀底部之容器(亦稱為錐形管)。較佳容器之製品例可列舉日本必帝(Becton Dickinson)公司製之圓管5mL(352003)、錐形管15mL(352095)、錐形管50mL(352070)、錐形管175mL(352076)、錐形管225mL(352075)、住友電木(Sumitomo Bakelite)股份有限公司公司製之15mL離心沈澱管(MS-56150)、50mL離心沈澱管(MS-56500)、旭硝子公司製之離心沈澱管15mL(2322-015)、離心沈澱管50mL(2342-050)、離心沈澱管230mL(2386-230)等。
從作為理化學機器可利用之一般容器本體之觀點或從液體進出操作之觀點而言，容器3為如第2圖、第3圖、第6圖所示，較佳為由具有開口之本體31及被安裝於其開口部(開口及其周圍之壁部)之蓋子32組成者。
該容器之材料並無特別限制，可列舉例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯等之塑膠、玻璃、金屬等。容器本體與蓋子之材料亦可相互不同。
噴嘴部從該製造方法之該製造裝置操作成 為簡單之觀點而言，較佳為設置作為上述容器之一部分(流入部)或設置作為上述供給裝置之一部分(吐出部)。
噴嘴部設置作為容器之一部分時，該噴嘴部可設置於該容器之本體(圖未顯示)，亦可設置於蓋子(第2圖、第3圖)。該等情況之貫通孔為貫通該噴嘴部，將容器外與容器內連通之流路。第1液體通過該貫通孔，射出到容器內之第2液體中。
從作為理化學機器可利用之一般容器本體之觀點而言，如第2圖、第3圖所示，較佳為噴嘴部2設置於蓋子32之態樣。噴嘴部2較佳為於蓋子32一體設置之態樣，亦可為將經其他方法形成之零件安裝於蓋子之態樣。
於第2圖、第3圖例示之態樣，供給裝置1為注射器，噴嘴部2為設置於容器3之蓋子32。於任一種態樣，於噴嘴部2之容器外側，用於將注射器外筒11之前端部(筒口)11a嵌入之筒狀部33為從該蓋子32之外面突出。
如上所述，噴嘴部2可位於蓋子的中央(第2圖)，亦可位於從蓋子之中央偏向邊緣(第3圖)之位置。
使噴嘴部偏離時，只要將容器之開口形狀作為圓形，該開口之半徑設為R(mm)，從該開口之中心偏向邊緣之距離設為r(mm)，r在R中占有之比例[(r/R)×100]為40%至80%左右，則偏離之效果變顯著。噴嘴部之偏離若太大，則第1液體之流動太接近容器之壁部，有可能阻礙適當攪拌。
從噴嘴之前端到液面之距離較佳在0mm至200mm，更佳在150mm以內，又更佳在85mm以內。
第4圖為將第2圖、第3圖之態樣中經設置於蓋子之噴嘴部及其外側之構造例詳細表示之部分放大圖。
如第4圖(b)所示，噴嘴部2之前端(容器內側)為了確保貫通孔21之長度，從該貫通孔流出時第1液體之流動儘可能保持為該貫通孔橫剖面之線狀流動，於容器內側突起。該噴嘴部之前端與收容於容器中之第2液體之液面之間可以有空間，又，噴嘴部之前端亦可以與第2液體接觸而更延長。
又，較佳之選擇為於第4圖(a)至(c)之例，於從蓋子外面突出之筒狀部33之前端部，用於與旋鎖接口型(luer lock)注射器前端之內螺紋咬合之突起部34、35於側方突起，可將該注射器栓進，固定。於該突起部34、35各自之下方，如第4圖(c)所示，設置可於該注射器前端之內螺紋咬合之梯度34a、35a。
只要適當設定容器本體31與蓋子32間之連結構造或密封性、注射器前端部11a與蓋子之筒狀部33間之連結構造、該前端部11a與筒狀部內面33a之嵌合、密封性即可。
第5圖表示於第3圖表示之蓋子細部加上實用構造之實施例。於同圖之例，該容器與本來附屬之蓋子具有互換性，使可如將市售之理化學實驗用容器作為本體利用。
如第5圖(b)所示，於該蓋子32之內側設置螺紋36，使可如市售之理化學實驗用容器於本體之開口部可鎖緊。又，於該蓋子32內側之最內側表面，突起有使該蓋子於容器之開口部鎖緊時用於將該開口密封之環狀密封部37。又，如第5圖(a)所示，於蓋子之外圍側面與本來之蓋子相同設置刻痕38，於用手旋轉蓋子時防滑。
於第6圖例示之態樣，噴嘴部以作為供給裝置之一部分設置。於同圖之例，供給裝置1為注射器，噴嘴部為安裝於該注射器前端部之注射針13，該注射針13由具有針基部13a及針管部13b形成。針管部13a並非一定要銳利。
於同圖之態樣，針管部內部之管路成為本發明中之貫通孔，其橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2。於同圖之態樣，針管部的前端進入收容於容器內之第2液體之內部。
容器之蓋子32設置注射針13之針管部13b可從容器外貫通到容器內之可貫通部分39，於該可貫通部分39之容器外側，用於將注射針之針基部13a嵌入之筒狀部33從該蓋子32之外面突出。該筒狀部33並非必須，為於使用時用於保持注射器之較佳構造。
可貫通之部分39只要形成使針管於使用時可通過即可，可為適合針管部外徑之貫通孔，亦可為針管部可突破之脆弱部或薄膜部。
藉由本發明之製造方法，將第1液體射出到第2液體中時，可作成第2液體經攪拌之狀態，將第1液 體射出到該狀態之第2液體中。
攪拌方法可列舉例如於容器中加入手動振盪、機械性振盪(直線往返作動、離心旋轉作動及8字旋轉作動)、超音波振動、渦旋混合攪拌等，藉此，將容器內之第2液體作成攪拌狀態之方法。
第1液體作為特定化合物，含有可通過2價金屬陽離子連結，形成可將細胞或組織懸浮之構造體之具有陰離子性官能基之高分子化合物。
陰離子性之官能基可列舉羧基、磺基、磷酸基及該等之鹽，較佳為羧基或其鹽。本發明中使用之高分子化合物可含有1種或2種以上選自由上述陰離子性官能基所成群組者。
本發明中使用之高分子化合物之較佳具體例並無特別限制，可列舉經10個以上單糖類(例如丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合之多糖類，更佳可列舉具有陰離子性官能基之酸性多糖類。此處所稱之酸性多糖類只要是在其構造中具有陰離子性官能基者即可，並無特別限制，例如具有醣醛酸(例如葡萄醣醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多糖類、構造中之一部分中具有硫酸基或磷酸基之多糖類或具有該兩者構造之多糖類，不僅為從天然獲得之多糖類，亦包含藉由微生物產生之多糖類、基因工學產生之多糖類或使用酵素以人工合成之多糖類。更具體而言，可例示由1種或2種以上選自由玻尿酸、結蘭膠、去醯化結蘭膠(以下，亦稱為DAG)、鼠李聚糖膠、 大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠、三仙膠、己糖醛酸、褐藻糖膠、果膠、果膠酸、果膠脂酸、硫酸類肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖及該等之鹽所成群組構成之多糖類。多糖類較好為玻尿酸、DAG、大猷坦膠、黃原膠、角叉菜膠或該等之鹽，更佳為DAG或其鹽。DAG亦可使用磷酸化者。該磷酸化可以公知之手法進行。
此處之鹽可列舉例如鋰、鈉、鉀之鹼金屬鹽；鈣、鋇、鎂之鹼土金屬鹽；或鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等之鹽。
該等高分子化合物(多糖類等)之重量平均分子量較佳為10,000至50,000,000，更佳為100,000至20,000,000，又更佳為1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可由凝膠滲透層析儀(GPC)，以聚三葡萄糖(pullulan)換算而測定。
於本發明，可將具有上述陰離子性官能基之多糖類複數種(較佳為2種)組合使用。多糖類組合之種類只要可通過2價金屬陽離子連結，在液體培養基中形成上述構造體者即可，並無特別限制，該組合較佳為至少含有DAG或其鹽。亦即，較佳之多糖類組合中包含DAG或其鹽，及DAG或其鹽以外之多糖類(例如黃原膠、褐藻酸、角叉菜膠、大猷坦膠、甲基纖維素、槐豆膠或該等之鹽)。具體而言，多糖類之組合可列舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與大猷坦膠、DAG與黃原膠、DAG與角叉菜膠、DAG與三 仙膠、DAG與槐豆膠、DAG與κ-角叉菜膠、DAG與褐藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，惟，不只限於該等例。
去醯化結蘭膠為將1-3鍵結之葡萄糖、1-4鍵結之葡萄醣醛酸、1-4鍵結之葡萄糖及1-4鍵結之鼠李糖(rhamnose)之4分子糖作為構成單位之直鏈狀高分子多糖類，於以下通式(I)所表示之多糖類中，R1、R2同時為氫原子，n表示2以上之整數。惟，亦可包含R1為甘油基、R2為乙醯基，然而乙醯基及甘油基之含量較佳為10%以下，更佳為1%以下。
Figure 105110870-A0202-12-0026-1
特定化合物亦可以化學合成法獲得，然而該特定化合物為天然物質時，較佳為從含有該化合物之各種植物、各種動物、各種微生物，藉由使用慣用之技術，萃取及分離精製獲得者。例如，結蘭膠可以發酵培養基培養生產微生物，將於菌體外所生產之黏膜物質以通常之精製方法回收，經由乾燥、粉碎等步驟後作成粉末狀製造。又，為去醯化結蘭膠時，只要在將黏膜物回收時施行鹼處理，將結合於1-3鍵結之葡萄糖殘基上之甘油基及乙醯基進行脫醯化後回收即可。作為結蘭膠生產微生物之例不只限於此，可列舉多沼鞘胺醇單胞菌(Sphingomonas elodea) 及該微生物之基因經改變之微生物。
為去醯化結蘭膠時，可使用市售品，例如三晶股份有限公司公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)CG-LA」、三榮源FFI股份有限公司公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)」等。又，原型(native type)結蘭膠而言，可使用三榮源FFI股份有限公司公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)」HT」等。
第1液體通常為特定化合物之溶液。用於該溶液之溶劑只要可將特定化合物溶解者即可，並無特別限制，通常為水或親水性溶劑，較佳為水。亦即，於較佳態樣中，第1液體為特定化合物之水溶液。
第1液體中含有之特定化合物之濃度只要在與第2液體混合時，於混合液中，特定化合物通過2價金屬陽離子連結，形成可將細胞或組織懸浮之構造體且該構造體於混合液中均一分散，另，最終獲得之液狀培養基組成物藉由含有該構造體，可將細胞或組織懸浮培養即可，並無特別限制。於下詳述從將細胞或組織懸浮培養之培養基組成物中之特定化合物之濃度，及相對於最終產物獲得之培養基組成物體積之第1液體之體積之比率，可算出第1液體中特定化合物之濃度。例如，於將體積V1之第1液體與體積V2之第2液體混合，最終獲得體積V1+V2之液狀培養基組成物時，由於將該液狀培養基組成物中特定化合物之濃度作為C%(w/v)，因此只要將第1液體中特定化合物之濃度作成C×(V1+V2)/V1%(w/v)即可。具 體之例，使用DAG或其鹽作為特定化合物時，第1液體中DAG濃度為例如0.02至2.5%(w/v)，較佳為0.1至2.0%(w/v)，更佳為0.5至1.5%(w/v)。DAG濃度若超過2.5%(w/v)，則從溶解度之觀點而言，DAG於溶劑中之溶解變困難，又，於將第1液體與第2液體混合時，構造體於局部形成，變成糾纒成塊狀之狀態，於培養基組成物中變得不易分散之風險變高。另一方面，DAG濃度若低於0.02%(w/v)，則要製造目的之培養基組成物所必要之第1液體之體積變大。其結果，採用通常之液體培養基作為第2液體時，若與第1液體混合，則源自該液體培養基之成分被大幅度稀釋。
第1液體中2價金屬陽離子之濃度係必需低於在第1液體中特定化合物形成構造體之濃度。2價金屬陽離子可列舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。尤其是鈣離子及鎂離子之一者或兩者(以下，亦以「鈣離子及/或鎂離子」表現)有助於DAG等特定化合物構造體形成。
於第1液體，亦可含有特定化合物、溶劑以外之因子。該因子可列舉生理上容許之緩衝劑、鹽、等張劑，惟，不只限於該等。
第1液體之調製可藉由將特定化合物添加於上述溶劑(例如水)中，於該特定化合物可溶解之溫度(例如60℃以上、80℃以上、90℃以上)攪拌使進行溶解至成為透明之狀態。於上述情況，若使用經脫2價金屬陽離子處 理之DAG，由於不需加熱即溶解於水，因此溶解操作容易。若需要，可將所得之特定化合物溶液，附加脫2價金屬陽離子處理，將溶液中2價金屬陽離子濃度作成低於構造體形成之濃度。根據必要，可於溶劑中預先加入特定化合物以外之因子，亦可於所獲之特定化合物溶液中加入特定化合物以外之因子。第1液體較佳為進行滅菌處理。滅菌處理之方法可列舉高壓釡、過濾滅菌等，惟，不只限於此。
第2液體含有2價金屬陽離子作為連結物質。2價金屬陽離子可列舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。2價金屬陽離子之種類係只要於第1液體中含有之特定化合物可通過2價金屬陽離子連結，形成可將細胞或組織懸浮之構造體者即可，並無特別限制，較佳為鈣離子。
第2液體通常為連結物質(亦即，2價金屬陽離子)之溶液。用於該溶液之溶劑只要可將特定化合物溶解者即可，並無特別限制，通常為水或親水性溶劑，較好為水。亦即，於較佳態樣中，第2液體為連結物質(亦即，2價金屬陽離子)之水溶液。
於第2液體，在將第1液體與第2液體混合時，為了第1液體中之特定化合物形成構造體，含有充分濃度之2價金屬陽離子。例如，使用鈣離子或鎂離子作為連結物質時，第2液體中鈣離子或鎂離子之濃度通常在0.001mM以上，較佳在0.01mM以上。第2液體中2價金 屬陽離子濃度之上限值，理論上為飽和溶液之濃度(亦即，溶解度)，惟，2價金屬陽離子之濃度若太高，則有對於在經製造之培養基組成物中培養之細胞等造成不良影響之慮。因此，例如，使用鈣離子或鎂離子作為連結物質時，第2液體中鈣離子或鎂離子濃度之上限值通常設為100mM以下，較佳為10mM以下。又，第2液體含有鈣離子及鎂離子兩者時，該等各離子濃度之合計為100mM以下，較佳為10mM以下。
第2液體亦可含有連結物質(亦即，2價金屬陽離子)、溶劑以外之因子。該因子可列舉適用於培養目標細胞之培養基構成成分。該培養基構成成分可列舉緩衝劑(碳酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、HEPES等)、無機鹽(氯化鈉等)、各種胺基酸、各種維生素(膽鹼、葉酸等)、糖類(葡萄糖等)、抗氧化劑(單硫代甘油等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生物質、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、各種細胞激素、各種荷爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基材等，惟，不只限於此。第2液體較佳為經滅菌處理。滅菌處理之方法可列舉高壓釡、過濾滅菌等，惟，不只限於此。
於較佳態樣，第2液體較佳為含有形成構造體濃度之2價金屬陽離子(較佳為含有鈣離子及/或鎂離子)之液體培養基。亦即，第2液體中除了形成構造體濃度之2價金屬陽離子(較佳為鈣離子及/或鎂離子)及水之外，亦含有適用於培養目標細胞之培養基構成成分。由於通常使用之細胞培養用液體培養基中鈣離子濃度範圍為 0.1至2.0mM左右，鎂離子濃度為0.1至1.0mM左右，因此藉由DAG等特定化合物，可充分形成構造體。
於本態樣，包含藉由本發明之製造方法，藉由將第1液體與第2液體混合，第1液體中含有之特定化合物通過包含於第2液體之連結物質連接形成之構造體，可立即獲得目的之液狀培養基組成物。
尤其是，於第2液體，亦可不含上述之細胞培養用培養基構成成分之一部份或全部。於該情況，於本發明之製造方法，將第1液體與第2液體混合，可獲得包含於第1液體之特定化合物通過包含於第2液體之連結物質連結形成構造體之混合液，於該混合液中，藉由加入上述細胞培養用液體培養基構成成分之一部份或全部，可獲得作為目的之液狀培養基組成物。
可藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物由於含有包含於第1液體之特定化合物通過包含於第2液體之連結物質(亦即，2價金屬陽離子)連結形成之構造體，且於該培養基組成物中，該構造體均一分散，因此若使用該培養基組成物，即可在維持懸浮狀態下培養細胞或組織。
成為培養對象之細胞或組織所源自之生物種類並無特別限制，不只為動物(昆蟲、魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等)，亦包含植物。
於一態樣，成為培養對象之細胞為基礎依賴性之細胞。若使用可藉由本發明之製造方法獲得之液狀 培養基組成物，則可不使用基礎依賴性之細胞作為基礎載體，而是在維持懸浮狀態下進行培養。
本發明中細胞及/或組織之懸浮係指細胞及/或組織對於培養容器為不附著狀態(非接著)。另，於本發明中在增殖、分化或維持細胞及/或組織時，對於液體培養基組成物，不伴隨來自外部之壓力或振動或在該組成物中之振動、回轉操作等，將細胞及/或組織均一分散於該液體培養基組成物中且呈懸浮狀態稱為「懸浮靜置」，在該該狀態培養細胞及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，於「懸浮靜置」，可懸浮之期間包含5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，惟，保持懸浮狀態不只限於該等時間。
可藉由本發明之製造方法獲得之液體培養基組成物在細胞或組織的可維持或培養之溫度範圍(例如0至40℃)之至少1個點，細胞及/或組織可懸浮靜置。本發明中使用之培養基組成物較佳在25至37℃溫度範圍之至少1個點，更佳在37℃，細胞及/或組織可懸浮靜置。
是否可懸浮靜置可藉由例如使培養對象之細胞以2×104細胞/mL之濃度，均一分散於評估對象之培養基組成物中，在15mL圓錐管中注入10mL，於37℃至少靜置5分鐘以上(例如1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，藉由觀察該細胞之懸浮狀態是否被維持，而可進行評估。全細胞中之70%以上為懸浮狀態時，可結論為維持懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(大小500至600μ m，Polysciences公司製)替代細胞進行評估。
於較佳之態樣，可藉由本發明之製造方法獲得之液體培養基組成物，係藉由含有上述構造體，使其黏度實質上不提高。「實質上不提高液體黏度」係指液體之黏度不超過8mPa‧s。此時該液體之黏度(亦即，可藉由本發明之製造方法獲得之液體培養基組成物之黏度)於37℃時為8mPa‧s以下，較佳為4mPa‧s以下，更佳為2mPa‧s以下。含有構造體之液體黏度可以於37℃條件下使用E型黏度計(東機產業股份有限公司公司製，TV-22型黏度計、機種：TVE-22L、圓錐轉子：標準轉子1°34’×R24、回轉數100rpm)進行測定。
可藉由本發明之製造方法獲得之液狀培養基組成物中特定化合物之濃度，係依賴特定化合物之種類，可適當設定為特定化合物可在液體培養基組成物中形成上述構造體(較佳為實質上不提高該液體培養基之黏度)，將細胞及/或組織均一懸浮(較好使懸浮静置)之範圍。例如，為DAG時為0.001%至1.0%(W/V)，較佳為0.003%至0.5%(W/V)，更佳為0.005%至0.3%(W/V)，又更佳為0.01%至0.05%(W/V)，最佳為0.01%至0.03%(W/V)。為黃原膠時為0.001%至5.0%(W/V)，較佳為0.01%至1.0%(W/V)，更佳為0.05%至0.5%(W/V)，最佳為0.1%至0.2%(W/V)。為κ-角叉菜膠及槐豆膠混合系時兩化合物之總和為0.001%至5.0%(W/V)，較佳為0.005%至1.0%(W/V)，更佳為0.01%至0.1%(W/V)，最佳為0.03 %至0.05%(W/V)。為原型結蘭膠時為0.05%至1.0%(W/V)，較佳為0.05%至0.1%(W/V)。
將上述多糖類複數種(較佳為2種)組合作為特定化合物使用時，該多糖類之濃度可適當設定為在該多糖類之組合在液體培養基中形成上述構造體(較佳為實質上不提高該液體培養基之黏度)，將細胞及/或組織均一懸浮(較好使懸浮靜置)之範圍。例如，將DAG或其鹽與DAG或其鹽以外之多糖類組合使用時，DAG或其鹽之濃度可例示0.005至0.02%(W/V)，較佳為0.01至0.02%(W/V)，DAG或其鹽以外之多糖類濃度可例示0.0001至0.4(W/V)，較佳為0.005至0.4%(W/V)，更佳為0.1至0.4%(W/V)。以下例示具體濃度範圍之組合。
DAG或其鹽：0.005至0.02%(較佳0.01至0.02%)(W/V)DAG以外之多糖類
黃原膠：0.1至0.4%(W/V)
褐藻酸鈉：0.0001至0.4%(W/V)(較佳0.1至0.4%(W/V))
原型結蘭膠：0.0001至0.4%(W/V)
槐豆膠：0.1至0.4%(W/V)
甲基纖維素：0.1至0.4%(W/V)(較佳0.2至0.4%(W/V))
角叉菜膠：0.05至0.1%(W/V)
大猷坦膠：0.05至0.1%(W/V)
又，該濃度可以下述之式算出。
濃度[%(W/V)]=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之容量(mL)×100
於較佳之態樣，使用DAG或其鹽作為特定化合物，使用鈣離子作為連結物質。第1液體為DAG或其鹽之水溶液。該水溶液中DAG之濃度通常為0.05至1.5%(w/v)，較佳為0.1至1.2%(w/v)，更佳為0.5至1.0%(w/v)。第2液體為含有鈣離子之液體培養基。該液體培養基中鈣離子之濃度為DAG形成構造體之濃度，通常為0.1至2.0mM左右。可混合之第1液體與第2液體之體積比率為(第1液體：第2液體)=(0.5至10：100)，較佳為(1至5：100)，更佳為(1.5至3：100)。第1液體之體積例如為0.1至20mL，較佳為0.3至12mL，更佳為0.6至6mL。第2液體之體積例如為1至1000mL，較佳好為10至500mL，更佳為40至200mL。結果，獲得之液狀培養基組成物中DAG之濃度較佳為0.01%至0.05%(w/v)，最佳為0.01%至0.03%(w/v)。
該液狀培養基組成物藉由使DAG通過鈣離子連結形成之構造體均一分散含有，可實質上不提高黏度，將細胞及/或組織均一懸浮(較佳為使其懸浮静置)。
若使用藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物，則不伴隨有引起細胞或組織障礙或機能喪失風險之振動或旋轉等操作，可將細胞及/或組織於懸浮狀態培養。另，若使用該培養基組成物，則除了在培養時可容易的將培養基交換之外亦可使經培養之細胞及/或組織容易回收。若使用該培養基組成物，則可將在以往之盤子上必需以單層、以於細胞容器黏合之狀態培養之細胞以懸 浮狀態培養，因此可在不損壞黏合性細胞之機能下有效率的大量調製。
接著，說明本發明之套組。本發明之套組如第7圖所示，為將用於實施上述本發明製造方法之構成要素集中作為套組者。
如第7圖所示，本發明之套組由至少含有收容上述第1液體之第1容器K1、用於將上述說明之上述第1液體送出之供給裝置1之注射器K2及為參照第2圖至第5圖說明之容器3之第2容器K3構成。第2容器K3如於上述容器3之說明，為由具有附有噴嘴部之蓋子K32及本體K31組成之容器，進一步於該噴嘴部之容器外側，有用於將上述注射器前端嵌入之筒狀部從該蓋子之外面突出。
第1容器K1只要是僅將使用者需要之上述第1液體之量收容並送達到至使用者之容器即可，材料或尺寸並無限制。第1容器K1較佳為具有容器本體及將該容器本體之開口關閉之蓋子之態樣，蓋子較佳為於容器本體鎖緊之態樣。
第2液體亦可包含於套組內提供，亦可為使用者通常使用之液體培養基。
本發明套組之較佳態樣為如第7圖所示，更對於第2容器K3，附帶可將該容器之本體K31內密封而構成之未具有噴嘴部之密封用蓋子K32。該密封用蓋子K32係成為與容器之蓋子K32具有互換性，可安裝於該容器本體K31之開口部。
藉由提供該密封用蓋子K32，使用具有噴嘴部之蓋子K32，於容器本體K31內製造液狀培養基組成物後，可將該液狀之培養基組成物密封於容器之本體K31內。
容器之本體K31為市售品時，該密封用蓋子K32可為原本附屬於市售品容器本體之蓋子。
本發明套組之較佳態樣為如第7圖所示，更附帶有可安裝於上述注射器K2前端之管狀零件K21。該管狀零件為***於第1容器內，用於將第1液體吸引到注射器內之吸引用管。該管狀零件具有可***於第1容器K1內之外徑、長度為可從第1容器內將第1液體吸引之細管，且於上述細管部之一端具有可安裝於上述注射器外筒前端部之連結部。該管狀零件可為注射針，亦可為便宜之樹脂成形零件。
[實施例]
以下，表示評估本發明製造裝置及製造方法之種種試驗例。於以下各試驗例中之「比較例」係為了調查本發明較佳數值或條件而進行之實驗例，為依照本發明之技術思想進行者，不是表示以往技術者。
又，於各試驗使用之培養基中2價陽離子濃度為如下述表1所示。
Figure 105110870-A0202-12-0038-2
(試驗例1：用於評估本發明製造裝置及製造方法之試驗)
以下，表示製作本發明製造裝置之一態樣，使用此並實施本發明之製造方法，觀察於獲得之培養基組成物中構造體分散的樣子之試驗結果。又，比較例表示使第1液體射出之流量降低時之試驗結果。
於實施例1至9及比較例1至16，將去醯化結蘭膠作為特定化合物，將去醯化結蘭膠溶液作為第1液體，將含有鈣離子及鎂離子，用於將去醯化結蘭膠連結作成構造體之連結物質之液體培養基作為第2液體。
[製造裝置之規格]
於實施例1至9及比較例1至16，製作第3圖表示之型式之製造裝置。
容器使用市售之錐形管(容量225mL(225000mm3)或容 量50mL(50000mm3)、住友電木股份有限公司公司製)之本體部分，製作適合之如第5圖所示之蓋子。貫通孔之口徑皆為0.5mm。貫通孔之橫剖面積為約0.2mm2。
供給裝置使用容量5mL(5000mm3)或容量1mL(1000mm3)之可拋棄式注射器，將該注射器外筒之前端部嵌入於蓋子外側突起之圓筒部33而連結。
[第1液體之調製]
將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶股份有限公司公司製造)懸浮於超純水(Milli-Q水)使成為0.75%(w/v)後，藉由於90℃邊加熱邊攪拌而溶解，將本水溶液於121℃高壓釡滅菌20分鐘。
[液狀培養基組成物品之調製]
將達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM高葡萄糖、和光純藥公司製)200mL收容於225mL錐形管(住友電木股份有限公司公司製)中，於4℃冷卻，作為第2液體。DMEM中鈣離子濃度為1.80mM、鎂離子濃度為0.8mM。
將充填有經4℃冷卻之第2液體的上述錐形管之蓋子拔除，安裝作為本發明之製造裝置所製作之蓋子。
將填充有上述經滅菌之去醯化結蘭膠水溶液4mL(4000mm3)之可拋棄式注射器前端嵌入蓋子之圓筒部並連接，構成第3圖所示型式之本發明製造裝置。
於該狀態，將注射器之柱塞以人力擠壓，邊以等速移動邊將注射器內之去醯化結蘭膠水溶液射出到容器內，製 作培養基組成物。
變更各液體之濃度或體積、第1液體射出之流量等條件，作成實施例1至9及比較例1至16。此處，各例之第1液體之流量可以調節注射器柱塞之移動時間而達成。又，於實施例3、5、8，比較例3、5、10、14、16中，使用渦旋混合器(2500rpm)，將第2液體邊作成漩渦狀之攪拌狀態邊將第1液體射出。
射出後，各自將接頭蓋更換為錐形管之蓋子且密栓。
[評估]
於製作之培養基組成物中，添加用於將懸浮之細胞模擬性再現之聚苯乙烯珠子(直徑500至600μm、Polysciences Inc.製)並攪拌，停止攪拌10分鐘後以目視確認液體中珠子之分散狀態。
構造體於液體中適當的細分散時，珠子亦於液中分散呈現懸浮之原狀。另一方面，構造體之分散若不充分，則其對應之珠子亦沈降。
又，構造體於液體中適當的細分散時，以目視不能確認該構造體。另一方面，構造體若以紐狀連結、集合，則可以目視確認該構造體為使光散散之物體或雖為透明然經光折射而為不定形之紐狀物體。
於實施例1至9及比較例1至16之各個試驗條件、結果物中珠子之分散狀態、構造體之狀態表示於表2。
於表2，對於珠子之分散狀態，較佳之分散、懸浮狀態以○表示，雖然分散但有一部分沈降之狀態以△表示， 所有珠子都沈降之狀態以×表示。
於構造體為不能以目視確認之狀態(認為適當的細分散)或成為紐狀、塊狀，如下所示，以○、△、×表示。
○表示與為市售之液狀之培養基組成物之FCeM(註冊商標)同等，構造體為懸浮物，為不能以目視確認之狀態。
△表示若遮光，則為光散射之物體或雖為透明然經由光折射而為不定形之紐狀物體懸浮，為可以目視確認之狀態。
×表示構造體有明顯的繊維狀析出物懸浮或沈降，為可以目視確認之狀態。
Figure 105110870-A0202-12-0042-3
從表2之結果明瞭，第2液體攪拌狀態及未攪拌狀態並無差異。又，從比較例1至16明瞭，即使使用相同之貫通孔，第1液體之流量若小，則流速亦變慢，細構造體未分散。從以上明瞭，根據本發明之製造方法，藉由單純之射出，可容易的獲得構造體較佳分散之培養基組成物。
(試驗例2：關於噴嘴部貫通孔口徑之試驗)
於本試驗例2，評估從相同規格之注射器將相同量之第一液體以相同之擠壓力射出時，將噴嘴部貫通孔之口徑階段性變化時，流量與流速之變化及與上述試驗例1相同之珠子分散狀態(懸浮性)、構造體狀態(析出物)的樣子。
使用之第1液體、注射器、第2液體、錐形管與上述試驗例1相同。又，於本試驗例2，為了將噴嘴部貫通孔之口徑階段性變化，於注射器前端安裝種種量規(內徑)之注射針。亦即，於本試驗例，注射針之內部通路成為貫通孔。評估珠子之分散狀態(懸浮性)、構造體之狀態(析出物)樣子之基準與上述試驗例1相同。
於本試驗例2，實施例10使用量規編號18之注射針，相對於此，以相同量規編號將添加時間延長(流量小)之試驗例作為比較例17。
相同的，實施例11使用量規編號20之注射針，相對於此，以相同量規編號將添加時間延長之試驗例作為比較例18、19。
相同的，實施例12使用量規編號22之注射針，相對 於此，以相同量規編號將添加時間延長之試驗例作為比較例20、21。
另，作為參考試驗使用為小口徑之量規編號25之注射針，並進行添加時間變化之試驗，作為比較例21、22、23。
各試驗例(實施例、比較例)中珠子之分散狀態、構造體之狀態表示於表3。
Figure 105110870-A0202-12-0045-4
另，下述表4為將上述表3中記載之順序排列改變，分為實施例10至12及比較例17至24記載之表。
Figure 105110870-A0202-12-0047-5
從表4之結果明瞭，即使貫通孔之內徑相同，若未將第一液體以適當之流量射出，則不能同時滿足良好珠子之分散狀態(良好懸浮性)及良好構造體之狀態(無析出物)。
又，從比較例17至24之結果明瞭，貫通孔之剖面積即使在本發明之範圍內，若將第1液體以1.7mL/秒以下之流量添加於第2液體時，則不能同時滿足良好珠子之分散狀態(良好懸浮性)及良好構造體之狀態(無析出物)。
(試驗例3：關於第1液體射出方向之試驗)
於本試驗例2中將第1液體從注射器向容器內射出時，評估射出方向從上往下射出之情況與將容器上下顛倒，將射出方向從下往上方射出時，珠子之分散狀態(懸浮性)是否有不同。
使用之第1液體、注射器、第2液體、錐形管與上述試驗例1相同。
表5表示於各試驗例中珠子之分散狀態(懸浮作用)。
Figure 105110870-A0202-12-0049-6
從表5之結果明瞭，本發明之製造方法與射出方向無關，可獲得較佳之懸浮作用。
(試驗例4：關於容器之形狀、從噴嘴部之出口到液面之距離之試驗)
於本試驗例4，調查容器之長度(深方向之尺寸)L與容器外徑d之比(縱橫比L/D)、容器內保持之第2液體之深度Z與容器內徑d之比(縱橫比Z/d)、及從噴嘴部之出口到液面之距離對於混合時之懸浮性會有何影響。
於各試驗例，珠子之分散狀態(懸浮作用)表示於表6。
Figure 105110870-A0202-12-0051-7
從表6之結果明瞭，即使使用相同縱橫比L/D之容器，若浸液部淺且縱橫比Z/d小，或從噴嘴部之出口到液面之距離大，則有不能獲得較佳懸浮性之傾向。於上述試驗例4之條件，只要浸液部之縱橫比Z/d在1.24以下，則不能獲得較佳之懸浮性，縱橫比Z/d若超過1.24，則可獲得較佳之懸浮性。
(試驗例5：關於變更培養基種類時之懸浮性之試驗)
於本試驗例5，調查變更第2液體之培養基種類，製作液狀之培養基組成物時之懸浮性。將收容於容器內之第2液體之溫度維持在37℃，將第1液體之溫度設為室溫(RT)。
於各試驗例，珠子之分散狀態(懸浮作用)及構造體之狀態表示於表7。
Figure 105110870-A0202-12-0053-8
從表7之結果明瞭，即使第2液體不同，亦可將第1液體興第2液體充分混合，可獲得較佳之懸浮性。
(試驗例6：使用低黏合盤之A549細胞之細胞增殖試驗)
將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶股份有限公司公司製)懸浮於超純水(Milli-Q水)，使成為0.3%(w/v)或0.75%(w/v)後，藉由於90℃邊加熱邊攪拌使其溶解，將本水溶液於121℃進行高壓釡滅菌20分鐘。使用0.3%溶液，調製於含有10%(v/v)胎兒牛血清之DMEM培養基(WAKO公司製)中添加去醯化結蘭膠，使最終濃度為0.015%(w/v)之培養基組成物。於以往之方法(日本專利第5629893號實施例中記載之使用均質攪拌機之方法)或於實施例7調製之培養基組成物添加胎兒牛血清，使成為10%(v/v)。
將人類肺癌細胞株A549(DS Pharma Biomedical公司製 造)播種於添加上述含有胎兒牛血清之去醯化結蘭膠之培養基組成物(以往之方法)或實施例7之培養基組成物，使成為33333細胞/mL後分注於96洞平底超低接著表面微量盤(Corning公司製，# 3474)之洞中，使每洞成為150μL。又，作為陰性對照，於未含去醯化結蘭膠之同上所述之培養基中分注懸浮有A549細胞者。接著，將各盤在CO2恆溫器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態培養7日。對於播種後培養0日及7日後之培養液添加ATP試藥150μL(CellTiter-GloTM發光法細胞活力分析(Luminescent Cell Viabiliy Assay,Promega公司製)並使其懸浮，於室溫靜置約10分鐘後，以FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，以減去只有培養基之發光值，來測定生細胞數。將以上之試驗實施3次。
根據本發明製造方法使用培養基組成物之方法與以往之方法比較，顯示同程度之A549細胞之增殖性。於静置培養之培養日數0日及7日後之RLU值(ATP測定、發光強度)3次之試驗平均值表示於表8。
Figure 105110870-A0202-12-0054-9
從表8之結果明瞭，藉由本發明製造方法製 造之培養基組成物與以以往之方法製造之培養基組成物相同，可將細胞懸浮培養，可促進細胞增殖。
(試驗例7：低黏合盤中使用曲美替尼(Tramctinib)及MK-2206之A549細胞增殖抑制試驗)
將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶股份有限公司公司製造)懸浮於超純水(Milli-Q水)，使成為0.3%(w/v)或0.75%(w/v)後，於90℃邊加熱邊攪拌使其溶解，將本水溶液於121℃進行高壓釡滅菌20分鐘。使用0.3%溶液，調製於含有10%(v/v)胎兒牛血清之DMEM培養基(WAKO公司製造)中添加去醯化結蘭膠使最終濃度為0.015%(w/v)之培養基組成物。又，於實施例7調製之培養基組成物添加胎兒牛血清，使成為10%(v/v)。
將人類肺癌細胞株A549(DS Pharma Biomedical公司製)播種於添加上述去醯化結蘭膠之培養基組成物(以往之方法)或實施例7之培養基組成物，使成為14800細胞/mL後分注於96洞平底超低接著表面微量盤(Corning公司製，# 3474)之洞中，使每洞成為135μL。又，作為陰性對照，於未含去醯化結蘭膠之同上所述之培養基中分注懸浮有A549細胞者。將各盤在CO2恆溫器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態培養。於培養第1日，添加含有10倍濃度之各抗癌劑及最終濃度為0.015%(w/v)之去醯化結蘭膠之培養基組成物(以往之方法及本發明之製造方法)及只含有10倍濃度之各抗癌劑之培養基組成物(未添加法)各15μL，使最終濃度成為0.001至30μM，繼續培養7日。抗癌劑使用曲 美替尼(Trametinib，Santa Cruz公司製，MEK阻礙劑)及MK-2206(Santa Cruz公司製，Akt阻礙劑)。對於第5日及第8日之培養液，添加ATP試藥150μL(CellTiter-GloTM發光法細胞活力分析，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫靜置約10分鐘後以FlexStation 3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，以減去只有培養基之發光值，來測定生細胞數。
各抗癌劑對於A549細胞增殖之抑制效果，使用本發明製造方法製造之培養基組成物與以以往方法製造之培養基組成物未看到不同，為相同的結果，於本發明之培養基組成物，MK-2206亦顯示強藥效。又，表9表示静置培養第4日之RLU值(ATP測定、發光強度)之% Control值，表10表示静置培養第7日之RLU值(ATP測定、發光強度)之% Control值。
Figure 105110870-A0202-12-0057-10
Figure 105110870-A0202-12-0058-11
從表9、表10之結果明瞭，藉由本發明製造方法製造之培養基組成物與以以往之方法製造之培養基組成物相同，可作成細胞之懸浮培養，可增強抗癌劑抑制癌細胞增殖之效果。
(試驗例8：與於以各增殖因子刺激之Panc02,03細胞增殖作用中單層培養法之比較)
將去醯化結蘭膠(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)於超純水(Milli-Q水)使成為0.75%(w/v)後，藉由於90℃邊加熱邊攪拌使其溶解，將本水溶液於121℃高壓釡滅菌20分鐘。進行與實施例7相同之操作，製作於RPMI1640培養基(WAKO公司製造)中添加最終濃度0.02%(w/v)之去醯化結蘭膠使胎兒牛血清成為15%(v/v)之培養基組成物作為實施例13。
將人類胰臟癌細胞株Panc02,03(ATCC公司製)播種於上述實施例13之培養基組成物(藉由本發明之製造方法製作)使成為37000細胞/mL後分注於96洞平底超低接著表面微量盤(Corning公司製，# 3474)之洞中，使每洞成為135μL。又，作為陰性對照，於未含去醯化結蘭膠之同上所述之培養基中分注懸浮有Panc02,03細胞者。單層培養法為將人類胰臟癌細胞株Panc02,03細胞播種於上述未含去醯化結蘭膠之培養基組成物使成為2200細胞/mL後分注於96洞平底超低接著表面微量盤(Corning公司製造，# 3585)之洞中，使每洞成為135μL。將各盤在CO2恆溫器(37℃、5% CO2)內以靜置狀態培養。於培養第1日添加10 倍濃度之人類HB-EGF(PEPROTECH公司製)使最終濃度成為30,100ng/mL，10倍濃度之人類EGF(PEPROTECH公司製)使成為3,30ng/mL，10倍濃度之人類FGF2(PEPROTECH公司製)使成為10,100ng/mL，10倍濃度之人類TGF-β1(PEPROTECH公司製)使成為3,30ng/mL，10倍濃度之人類PDGF-BB(PEPROTECH公司製)使成為10ng/mL及10倍濃度之人類IGF-1(PEPROTECH公司製)使成為10,100ng/mL及含有最終濃度0.015%(w/v)之去醯化結蘭膠之培養基組成物(藉由以往之方法及本發明之製造方法製作)各15μL。於單層培養群或陰性對照群，各自添加10倍濃度之只有各增殖因子之培養基組成物各15μL。繼續培養5日。對於第6天之培養液添加ATP試藥150μL(CellTiter-GloTM發光法細胞活力分析，Promega公司製造)並使其懸浮，於室溫靜置約10分後，以FlexStation3(Molecular Devices公司製造)測定發光強度(RLU值)，以減去只有培養基之發光值，來測定生細胞數。
從其結果明瞭藉由使用依照本發明製造方法之培養基組成物之Panc02,03細胞增殖試驗法，與單層培養法或陰性對照群相比，人類HB-EGF及人類EGF顯示強力之藥效。又，培養第6日之RLU值(ATP測定、發光強度)之% Control值表示於表11。
Figure 105110870-A0202-12-0061-12
從表11之結果明瞭，藉由本發明之製造方法製造之培養基組成物與以以往之方法製造之培養基組成物相同，可作成細胞之懸浮培養，促進因HB-EGF或EGF刺激之細胞增殖。
[產業上利用之可能性]
藉由本發明，對於含有2價金屬陽離子等連結物質之任意液體(尤其是液體培養基)，可容易的將含有特定化合物之液體混合，且可製造微細構造體經分散之液狀培養基組成物。
本專利申請以於日本提出專利申請之日本特願2015-078795(申請日：2015年4月7日)為基礎，其內容全包含於本說明書中。
1‧‧‧供給裝置
2‧‧‧噴嘴部
3‧‧‧容器
21‧‧‧貫通孔
A‧‧‧第1液體
A1‧‧‧經射出之第1液體之流動
B‧‧‧第2液體

Claims (13)

  1. 一種液狀培養基組成物之製造方法，其為具有：使含有下述(i)之特定化合物之第1液體通過設置於噴嘴部之橫剖面積0.01mm2至5.00mm2之貫通孔，成為1.7mL/秒以上之流量；以及將上述第1液體以上述流量射出到含有下述(ii)之連結物質之第2液體中，藉此，形成上述特定化合物通過上述連結物質連結而成之構造體，且使該構造體分散於上述兩液體之混合液中之步驟之製造方法，其中(i)為具有陰離子性官能基之高分子化合物之特定化合物，其係藉由通過2價金屬陽離子而連結，可形成可使細胞或組織懸浮之構造體，(ii)為2價金屬陽離子之連結物質。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其為將第2液體收容於下述(a)之容器，使第1液體從供給裝置送出，且通過下述(a)之容器之貫通孔，成為上述流量，藉此，將第1液體以上述流量射出到該容器內之第2液體中者，其中(a)為具有本體及蓋子的容器，在該本體或該蓋子設置有具有將容器外與容器內連通之貫通孔之噴嘴部，該貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2者。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之製造方法，其中，上述供給裝置為注射器， 上述噴嘴部設置於容器的蓋子上，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其為將第2液體收容於容器中，將收容有第1液體之下述(b)之供給裝置之噴嘴部前端***上述容器內，將第1液體從該供給裝置送出，且通過該供給裝置噴嘴部之貫通孔，成為上述流量，藉此，將第1液體以上述流量射出到容器內之第2液體中者，其中(b)為具有用於收容液體之收容部、用於將經收容之液體通過貫通孔射出之噴嘴部之供給裝置，該噴嘴部貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2者。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之製造方法，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部為安裝於上述注射器之注射針，於上述容器之蓋子設置有可使上述注射針之針管部從容器外貫通到容器內之可貫通部分，且於該可貫通部分之容器外側，用於嵌入注射針之針基部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之製造方法，其中，上述(i)之特定化合物為去醯化結蘭膠，第1液體為含有該去醯化結蘭膠之水溶液，上述(ii)之連結物質為鈣離子及鎂離子中之一者或兩者，第2液體為含有鈣離子及鎂離子中之一者或兩 者之液體培養基。
  7. 一種液狀培養基組成物之製造裝置，為用於實施申請專利範圍第1項所述之製造方法，為具有用於將第1液體送出之供給裝置、用於收容第2液體且接受從上述供給裝置送出之第1液體之容器、以及具有於第1液體從上述供給裝置送出到上述容器內時應通過之貫通孔之噴嘴部；上述貫通孔之橫剖面積為0.01mm2至5.00mm2，上述供給裝置係以可將第1液體以1.7mL/秒以上之流量送出構成，藉由使第1液體以上述流量通過上述貫通孔，而成為第1液體可以1.7mL/秒以上之流量射出到上述容器內而構成之前述製造裝置。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之製造裝置，其中，具有貫通孔之噴嘴部設置為上述容器之一部分，上述容器為具有本體及蓋子之容器，上述貫通孔以連通容器外及容器內，於容器之本體或蓋子設置有上述噴嘴部。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之製造裝置，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部設置於容器之蓋子，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之製造裝置，其中，上述供給裝置為注射器，上述噴嘴部為安裝於上述注射器之注射針，於上述容器之蓋子係設置有上述注射針可從容器外貫通到容器內之可貫通部分，且進一步於該可貫通部分之容器外側，用於嵌入注射針之針基部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
  11. 一種液狀培養基組成物之製造套組，為用於實施申請專利範圍第1項所述之製造方法之套組，由至少具有第1容器、注射器及第2容器所構成，第1容器為收容申請專利範圍第1項所述之第1液體之容器，注射器為作為用於將上述第1液體送出之供給裝置而運作之申請專利範圍第3項所述之注射器，第2容器為用於收容申請專利範圍第1項所述之第2液體之申請專利範圍第2項所述之(a)之容器，如申請專利範圍第3項所述，噴嘴部設置於容器的蓋子上，且進一步於該噴嘴部之容器外側，用於嵌入上述注射器前端部之筒狀部從該蓋子的外面突出。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之套組，進一步，於第2容器中附帶有未具有噴嘴部之密封用蓋子，其係以可將該容器密封於本體內而構成，申請專利範圍第2項所述之(a)容器之蓋子及上述密封用蓋子係成為具有互換性，而可安裝於該容器本體之開口部。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項所述之套組，進一步，上述注射器係附帶有***於第1容器內並用於吸引第1液體而使用之管狀零件，該管狀零件係具有可***於第1容器內之外徑、以及具備長度為可從第1容器內將第1液體吸引之細管部，於上述細管部之一端具有可安裝於上述注射器外筒之前端部之連結部。
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