TWI714373B - 一種複合纖維 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種複合纖維,該複合纖維係包含褐藻酸纖維、高分子材料、抗菌劑及含有生長因子的基因之質體。本發明並提供一種傷口敷料,其中該傷口敷料包含如前述之複合纖維。本發明所製備的複合纖維,能釋放抗菌劑和含有生長因子的基因,除了能減少微生物的著生,並可藉由轉染使傷口部位分泌生長因子,藉此促進傷口癒合。
Description
本發明揭露一由複合電紡絲技術製備褐藻酸及高分子材料的複合纖維,其特徵在於該複合纖維混合抗菌劑及含有生長因子的基因之質體。所製備的纖維除了能減少微生物的著生,並可藉由基因轉染使傷口部位分泌生長因子,藉此促進傷口癒合。
傳統敷料由棉質或合成纖維製成,如紗布、棉片等,其優點為能快速吸收傷口滲出液且加工過程簡單,但是由於其通透性高使傷口過於乾燥,且微生物容易通過易造成感染,更重要的是移除時會沾黏傷口,使患者在更換敷料時造成極大的痛感。
合成敷料常見形式是以聚胺酯(polyurethane,PU)為材質的薄膜,是一種可以維持傷口濕潤、防止細菌通過的防水敷料,但是這種敷料無法吸收傷口滲出液,並且在撕除時會造成細胞組織受損。
這些敷料都只能提供被動性的保護,無法促使傷口再生,因此無法應用於如糖尿病患者身上常見的慢性傷口。
另外,添加銀離子或奈米銀的敷料也被應用於醫療器材上以減低感染的風險,然而過高濃度的銀以被證實具有細胞毒性,對於一些慢性傷口的應用時會導致無法達到癒合的目的。
目前市售的產品多半以被動是保護為主,有些強調抗菌效
果,但都沒有促進傷口組織再生的功效。
為了結合上述提到市面上傷口敷料的優點並克服其缺點,開發一種新型的多功能傷口敷料有其必要性。
奈米纖維支架可以模仿細胞外基質的結構,除此之外更被認為可以增加細胞貼附、遷移、分化和增殖,另外,因為奈米纖維支架具有高表面積和多孔性的特性,能使傷口有更好的透氣性,並防止傷口部位液體聚集,因此具有促進增加傷口癒合的能力,靜電紡絲技術所製備的奈米纖維絲被視為最簡單和最具成本效益的方法。
本發明所述之複合纖維係透過包含電紡絲(electrospinning)或電噴灑(electrospray)等方式製作。
應用於組織工程領域的電紡絲,其成分可以分成天然高分子與合成高分子兩大類,且有各自的優缺點。
天然高分子由動植物獲得,具有良好的生物相容性以及生物可降解性,但是機械性質差,限制了天然高分子的發展;合成高分子由人工的方式合成,具有良好的機械性能,但降解物容易造成細胞死亡。
電紡絲具有表面積與體積比高,孔徑小及孔隙率高等特性,因此在許多應用中,特別是傷口敷料是具有巨大的潛力。
慢性傷口癒合緩慢,可能會造成很多風險與生活上的不便,因此,本發明欲開發多功能傷口敷料以促進組織再生。
本發明之複合纖維組成包含褐藻酸(alginate)纖維、高分子材料、抗菌劑及含有生長因子的基因之質體。
在一實施例中,該抗菌劑係金屬離子、奈米顆粒或其氧化物、抗生素、石墨烯、碳奈米管或其上述組合。
在一實施例中,該抗菌劑係銀離子、二氧化鈦、氧化鋅奈米顆粒、氧化銅奈米顆粒、四氧化三鐵奈米顆粒、奈米銀或其上述組合。
在一實施例中,該高分子材料具有生物降解性。
在一實施例中,該高分子材料係聚酯類(polyester)、聚醯胺(Polyamide)、聚碳酸酯(Polycarbonate)、聚氨酯(polyurethane)或其組合。
在一實施例中,該聚酯類係聚乳酸(Polylactide,PLA)、聚乙醇酸(Polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)或聚己內酯(polycaprolactone,PCL)。
在一實施例中,該生長因子的基因係具有編碼出包含血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor)、表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor)、角質細胞生長因子(Keratinocyte growth factor)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast growth factor)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor)或其上述組合之基因。
在一實施例中,親水性的褐藻酸纖維具高吸收性,可以吸收傷口滲出液並提供潮濕環境,高分子材料則可增加機械強度並促進細胞貼附。
本發明將抗菌劑導入高分子材料中使其可以持續抑制微生物的生長。
在一實施例中,本發明之該含有該生長因子的基因之質體係
包覆於一非病毒性載體中。
在另一實施例中,該非病毒性載體係脂質體複合物、陽離子高分子、胜肽或殼聚醣聚合物。
在另一實施例中,該非病毒性載體與質體所形成的複合物係正電性複合顆粒。
在一實施例中,本發明之非病毒性載體係吸附在該褐藻酸纖維上,其中該非病毒性載體包含該含有生長因子的基因之質體。
在另一實施例中,本發明之正電性複合顆粒係透過靜電作用力吸附於褐藻酸纖維。
在一實施例中,本發明之褐藻酸纖維與高分子材料的重量比例範圍可為1:9至9:1。
在一實施例中,褐藻酸纖維與高分子材料的重量比例為8:2。
在一實施例中,本發明係利用鈣鹽使該褐藻酸纖維相互交聯。
在一實施例中,該鈣鹽係碳酸鈣、磷酸鈣、草酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣或硝酸鈣。
本發明使用的褐藻酸易溶於水中,應用上會藉由與鈣離子交聯,使其產生蛋盒模式(egg box)結構,可解決此問題,再經由電紡絲技術,使其可以釋放鈣離子促進凝血。
本發明可應用於生醫上的敷料使用,首先複合纖維具有高表面積及多孔的特性,可使傷口具有高透氣性,成分組成包含抗菌劑及含有生長因子的基因之質體,且一併釋放鈣離子可以促進凝血,同時達到傷口
修復、抗菌及凝血的多功能。
本發明另外提供一種製備複合纖維的方法,其中該方法步驟包括:
步驟(a)為提供一褐藻酸溶液及一高分子材料溶液,係取一褐藻酸與一聚氧乙烯(PEO)或一聚乙烯醇(PVA)混合,製得該褐藻酸濃度為1至10wt%之該褐藻酸溶液、較佳為2~8%wt%之該褐藻酸溶液;係取該高分子材料與該聚氧乙烯(PEO)或該聚乙烯醇(PVA)混合,製得該高分子材料溶液;步驟(b)為提供奈米銀溶液,從銀鹽與還原劑進行氧化還原反應形成該奈米銀溶液;步驟(c)為混合該奈米銀溶液與該高分子材料溶液,取得載銀高分子溶液;步驟(d)為將該褐藻酸溶液和該載銀高分子溶液製成該複合纖維。
在一實施例中,該步驟(d)包含靜電紡絲技術或電噴灑技術。
在一實施例中,該步驟(d)進一步包含分別設於二自動進樣裝置的注射器,以0.1至5.0毫升/小時(mL/h)的進樣速度,經12至24kV之電壓以及10至25公分之收集距離,將該些紡絲液經靜電紡絲技術噴出。
在一實施例中,該製備複合纖維的方法可進一步包含步驟(e)係將一非病毒性載體與質體所形成之正電性複合顆粒吸附於步驟(d)所製成之該複合纖維。
在一實施例中,其中該銀鹽係指指鹵素或酸根與金屬銀形成的離子化合物的總稱,係醋酸銀、亞硝酸銀、硝酸銀、氯化銀或硫酸銀。
在一實施例中,其中該還原劑係硼氫化鈉、聯胺水合物、檸檬酸鈉或二甲基甲醯胺。
在一實施例中,該奈米銀溶液係利用高能機械球磨法、蒸發冷凝法、光化學還原法、液體化學還原法、電化學還原法、液體化學氧化還原法、微乳法或化學沉澱法製備而成。
在一實施例中,其中該奈米銀溶液濃度為5mM至75mM。
在一實施例中,其中該奈米銀溶液濃度為30mM。
第1圖為共電紡製備複合纖維示意圖。
第2圖為複合纖維外觀的SEM圖。
第3圖為複合纖維中奈米銀的TEM圖。
第4圖為紙錠擴散法觀察不同比例的複合纖維對表皮葡萄球菌抑菌效果的照片。
第5圖為紙錠擴散法觀察不同比例的複合纖維對大腸桿菌抑菌效果的照片。
第6圖為複合纖維的抑菌率分析圖。
第7圖為不同奈米銀濃度之複合纖維的抑菌率分析圖。
第8圖為NIH 3T3培育於複合纖維之細胞存活率分析圖。
第9圖為NIH 3T3培育於不同濃度奈米銀之複合纖維1、5天後之存活率分析圖。
第10圖為複合纖維比例為A8P2的原位轉染的螢光照片。
第11圖為複合纖維比例為A2P8的原位轉染的螢光照片。
第12圖為複合纖維之凝血試驗比較圖。
第13圖為第7、11天不同複合纖維之傷口外觀比較圖。
第14圖為第7、11天不同複合纖維之傷口癒合率比較圖。
第15圖為第7、11天不同複合纖維之組織切片H&E染色圖。
第16圖為複合纖維之功能示意圖。
複合纖維的製備
褐藻酸/聚氧乙烯((polyethylene oxide,PEO)紡絲液配製
配製成5g的紡絲溶液,將3.33g的褐藻酸儲備溶液、1.0g的PEO儲備溶液以及0.525g的助溶劑(二甲基亞碸)/界面活性劑(Triton X-100),並補0.145g的水後進行混合,使褐藻酸的最終濃度為4wt%、PEO為2wt%、二甲基亞碸為10%且Triton X-100為0.5%,將此溶液加熱攪拌(50℃、60rpm)兩天後,以離心方式去除氣泡。
PCL/PEO紡絲液配製
配製成4g紡絲溶液,將PCL與PEO儲備溶液各秤取1.8g,另外再加入0.4g二甲基甲醯胺(Dimethylformamide,DMF),使PCL的最終濃度為4.5wt%、PEO則為3.6wt%,將此溶液加熱攪拌(40℃、60rpm)一天。
配置30mM Ag PCL/PEO紡絲溶液
秤取25.48mg硝酸銀於樣本瓶,加入0.5ml DMF於室溫下以60rpm速度攪拌5min後,將0.4ml含銀DMF溶液逐滴加入3.6g PCL/PEO溶液,最後在40℃、60rpm條件下攪拌加熱一天,即完成製備。
以共電紡(第1圖)的方式合成褐藻酸紡絲液及Ag PCL/PEO紡絲溶液的複合纖維。
本發明將奈米銀導入聚己內酯後,再與褐藻酸進行混合,形
成複合纖維(第2圖),確認複合纖維確實為奈米網狀結構且聚己內酯具有奈米銀粒子(第3圖)。
為了增加傷口癒合之功效,本發明加入血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor B,PDGF B)至複合纖維中,其中PDGF B為嗜中性粒細胞的化學引誘物,且可誘導成纖維細胞的增殖和分化,進而促進傷口修復。製法上是透過靜電作用力,將陽離子高分子與帶有PDGF B的質體所形成的正電性複合顆粒吸附至複合纖維中的帶負電之褐藻酸纖維上。
抑菌實驗
本發明將抗菌效果的奈米銀導入複合纖維中,且褐藻酸/聚己內酯以重量比例8:2(A8P2),6:4(A6P4),4:6(A4P6)及2:8(A2P8)比例製成的複合纖維進行抑菌實驗,發現表皮葡萄球菌(第4圖)及大腸桿菌(第5圖)均能被抑制生長,效果隨著聚己內酯比例而增加,僅20%的聚己內酯(A8P2)仍可以成功地達到抑菌效果,而純褐藻酸(pure A)纖維則無抗菌效果。
本發明將褐藻酸/聚己內酯以重量比例8:2(A8P2),6:4(A6P4),4:6(A4P6)及2:8(A2P8)的複合纖維分別測試大腸桿菌及表皮葡萄球菌的抑菌率,並與純褐藻酸做比較,經12hr後,即使是僅20%的聚己內酯(A8P2)對大腸桿菌與表皮葡萄球菌的抑菌率仍能分別達到83%與71%的抑菌率(第6圖)。
本發明將奈米銀濃度為0mM、10mM、30mM及50mM的複合纖維分別測試大腸桿菌及表皮葡萄球菌的抑菌率,經11.5hr後,其中30mM與50mM複合纖維對大腸桿菌的抑菌率分別達到83%與95%,表皮葡萄球菌
的抑菌率分別為71%與73%(第7圖),皆能超過70%的抑菌效果。
細胞存活率試驗(MTT assay)
奈米銀的添加可能會造成細胞毒性,因此以MTT進行細胞存活率測試,發現聚己內酯比例越高,奈米銀毒性也越顯著,但A6P4及A8P2仍保有60%以上的生物適合性(第8圖)。
利用NIH 3T3細胞培養在複合纖維上1天及5天後,以MTT分析其細胞存活率,發現從第5天的結果(第9圖)可以看出50mM的複合纖維對細胞的毒性非常明顯,而10mM、30mM的複合纖維則沒有差異不大。
儘管50mM的複合纖維抗菌效果最好,但是該濃度對細胞的毒性太高,因此不適合作為傷口敷料。
另一方面,利用帶有綠色螢光蛋白及血小板衍生生長因子的基因以帶正電的非病毒性載體包覆成帶正電的複合顆粒,並將其吸附於複合纖維上進行原位轉染。
因為褐藻酸具負電性,可以促進帶正電的複合顆粒吸附,結果顯示褐藻酸比例越高轉染效果越好(第10圖、第11圖)。
結果證實本發明可以調控纖維組成比例,藉此控制複合纖維使其同時具有抗菌及基因輸送能力,且避免抗菌劑奈米銀產生細胞毒性的副作用,以A8P2的比例在本實施例中具有最佳的整體表現。
凝血試驗
緩慢的凝血可能阻礙傷口癒合,並增加細菌感染的風險,因此檢測複合纖維的凝血功能,先在複合纖維上滴加100μl含抗凝劑之人類全血,並分別在室溫下放置5、10、20分鐘後以吸光光譜測試凝血率(第12圖)。
交聯過的複合纖維由於可以釋放出鈣離子,因此其凝血率明顯高於一般紗布與未交聯的纖維。
傷口癒合試驗
在C57BL/6小鼠背部製作2個直徑5mm的傷口,將敷料置於傷口處,分別於7、11天記錄傷口大小,從傷口外觀(第13圖)與傷口癒合率(第14圖)可以看出控制組(完全不提供複合纖維),即使到11天,傷口仍未癒合到達60%,而相較之下,具有PDGF B基因的複合纖維在7、11天分別為77%與95%,且傷口外觀上看11天後幾乎看不到傷口,並從H&E染色法染色(第15圖)後發現該組別在7天時表皮已生成,證實具有PDGF B基因的複合纖維的確可以對傷口部位進行原位基因轉染,使傷口部位細胞分泌PDGF B來促進傷口癒合。
綜上所述,本發明之複合纖維,經由上述的試驗測試後,代表該複合纖維具備高機械強度、組織止血、吸收傷口滲出液、抗菌及促進受傷組織再生的功能(第16圖),且調整組成成分比例的不同,使該複合纖維得以表現更好的功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內,相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (15)
- 一種複合纖維,其中該複合纖維包含一褐藻酸纖維、一高分子材料、一抗菌劑及至少一生長因子的基因之質體。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該抗菌劑係金屬離子、奈米顆粒或其氧化物、抗生素、石墨烯、碳奈米管或其上述組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該高分子材料係聚酯類(polyester)、聚醯胺(Polyamide)、聚碳酸酯(Polycarbonate)、聚氨酯(polyurethane)或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該生長因子的基因係具有編碼出包含血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor)、表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor)、角質細胞生長因子(Keratinocyte growth factor)、纖維母細胞生長因子(Fibroblast growth factor)、轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)、胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor)或其組合之功能的基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該褐藻酸纖維及該高分子材料的重量比例範圍1:9至9:1。
- 如申請專利範圍第5項所述之複合纖維,其中該褐藻酸纖維及該高分子材料的重量比例為8:2。
- 如申請專利範圍第2項所述之複合纖維,其中該抗菌劑係一奈米銀。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該褐藻酸纖維係利用一鈣鹽相互交聯。
- 如申請專利範圍第8項所述之複合纖維,其中該鈣鹽為碳酸鈣、磷酸鈣、草酸鈣、氯化鈣、硫酸鈣或硝酸鈣。
- 如申請專利範圍第1項所述之複合纖維,其中該含有該生長因子的基因之質體係以非病毒性載體包覆。
- 如申請專利範圍第10項所述之複合纖維,其中該非病毒性載體係脂質體複合物、陽離子高分子、胜肽或殼聚醣聚合物。
- 一種製備複合纖維的方法,其中該方法步驟包括:步驟(a)為提供一褐藻酸溶液及一高分子材料溶液,係取一褐藻酸與一聚氧乙烯(PEO)或一聚乙烯醇(PVA)混合,製得該褐藻酸濃度為1至10wt%之溶液;係取該高分子材料與該聚氧乙烯(PEO)或該聚乙烯醇(PVA)混合,製得該高分子材料溶液;步驟(b)為提供一奈米銀溶液,從一銀鹽與一還原劑進行氧化還原反應形成該奈米銀溶液;步驟(c)為混合該奈米銀溶液與該高分子材料溶液,取得一載銀高分子溶液;步驟(d)為將該褐藻酸溶液和該載銀高分子溶液製成該複合纖維;及步驟(e)係將一非病毒性載體與質體所形成之正電性複合顆粒吸附於步驟(d)所製成之該複合纖維。
- 如申請專利範圍第12項所述之一種製備複合纖維的方法,其中該奈米銀溶液的濃度範圍為5mM至75mM。
- 如申請專利範圍第14項所述之一種製備複合纖維的方法,其中該奈米銀的濃度為30mM。
- 如申請專利範圍第12項所述之一種製備複合纖維的方法,其中該還原劑係硼氫化鈉、聯胺水合物、檸檬酸鈉或二甲基甲醯胺。
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