TWI676688B - 辨識細胞種類型之方法及系統 - Google Patents
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Abstract
本揭露為涉及一種方法用以產生候選探針和其使用方法。具體而言,所述候選探針可以與特定基因結合,並且進一步鑑定組織中細胞的類型。簡而言之,所述方法包含以下步驟:(a)使用晶片偵測具有已知器官來源之正常樣本中的基因表現;(b)使用處理模組比較所述正常樣本中的基因表現;以及(c)依據前述步驟之比較結果產生候選探針。而使用方法則包含以下步驟:(a’)使用前述候選探針以偵測具有未知細胞類型的測試樣本中相對應之基因表現;(b’)使用處理模組分析測試樣本以產生代表測試樣本分數;以及。(c’) 進一步預測所述測試樣本的細胞類型。此外,本揭露還提供一個系統用以執行前述之方法,並且所述系統包含一個具有候選探針的矩陣之偵測晶片和一個處理模組。
Description
本專利申請說明涉及一種用以辨識細胞類型的方法及系統。更具體地說,一種用以所述細胞類型是屬於正常/良性瘤細胞、原位癌細胞或是轉移癌細胞的方法及系統。
癌症逐漸已成為全球主要的死亡原因,並且在過去的數十年間平均每年奪走數了百萬人的生命。(Ferlay J et al 2015)。癌症的治療過程通常是昂貴、漫長和痛苦的。當癌症藥物開發仍受到許多國家政府的嚴格監管的狀態下,許多新的治療方法正在積極的被推廣,例如:標靶治療和免疫療法。病理解剖診斷是一項主觀且傳統的過程,其涉及利用顯微鏡檢查活檢切片。病理學家對活組織檢查的形態學的解釋是基於其對於特定類型癌症的知識和經驗。(Connolly JL et al, 2003)而此過程被認為是癌症診斷的黃金標準,因為自從大約一個世紀前首次被引入後,沒有任何其他更佳的技術被使用。
由於所述過程具有主觀的性質,於某些情況下不同病理學家檢驗活組織而產生差異結果之狀況並不令人驚訝。藉由解剖病理學對癌症診斷的準確性之系統研究揭示了全世界各種醫學機構中存在顯著的差異/錯誤率。(Nguyen et al 2004, Raab et al 2005, Elmore JG et al 2015, Singh H et al, 2007, Khazai L et al 2015, Mehrad M et al. 2015)舉例來說,Raab等人在回顧了1984年至2005年發表的十多篇研究論文後,揭示了解剖病理學在癌症診斷中的錯誤頻率為1%至43%。(Raab et al 2005)此外,整理115名病理學家對60例乳腺癌活檢切片的檢驗結果,Elmore等人揭示所數檢驗結果與先前的對照診斷僅具有75.3%的一致性(即具有25%的差異性)。(Elmore JG et al 2015)Nguyen等人發現44%的***腺癌患者在泌尿生殖腫瘤學家對其病理結果進行複閱後,其Gleanson評分(Gleanson score)至少改變1分。這些診斷的改變有一些會導致後續治療方法的變化。(Nguyen et al 2004)。
為了減少錯誤,包括美國臨床病理學家協會在內的許多醫學機構所推薦的最佳解決方案是讓不止一位病理學家對活組織檢查片進行審閱。(John E. et al 2000, Nakhleh RE et al 2016, Middleton LP et al 2014, Leong AS et al 2006)此外,解剖病理學程序的改進也有助於減少診斷錯誤。(Nakhleh RE 2008, Nakhleh et al 2016)選用標記蛋白在活檢標本上進行免疫組織化學染色有助於在癌症診斷中鑑定特定之癌症亞型。儘管已極盡可能地使用各種方式降低在外科病理學中所可能引起的錯誤率,提高癌症診斷準確性的最極致解決方法應是開發一種客觀的,而且是從形態學以外的面向來分析樣本的診斷系統。
因此我們期望開發一種方法和系統,以有效且準確地診斷細胞是正常細胞/良性腫瘤細胞、原發性腫瘤細胞還是轉移性腫瘤細胞。
本發明揭露了一種以基因為基礎(gene-based)的預測方法,其因藉由使用組織特異性基因表達譜(tissue-specific gene expression profile)而使其在癌症診斷中具有潛在應用價值。而且,本發明揭露了來自三十個不同解剖部位的正常人組織中均表現如表1所揭露候選基因的特定表達譜。而所述結果則藉由利用接近800個陣列(來自61個不同研究組別)進行大規模統合分析(large scale meta-analysis)驗證其結果,而所述驗證的準確性達到了99.2%。此外,上述結果揭示所述正常組織特異性表達譜在已經轉化為惡性腫瘤的細胞中會消失。因此,所述候選基因間的相對表現水平的數學關係(mathematical relationship)即計量比(stoichiometry)在正常組織中必須被妥善地維持以確保此正常組織應有的功能和型態發育(morphology),然而當組織轉變成癌症時所述基因的相對關係則會喪失。
藉由統合分析(meta-data)和分析來自肝臟的臨床樣本,本發明揭露標記基因的表現水平產生計量偏差可能是癌症中存在的普遍現象。藉由評估臨床數據和計算分數,本發明揭露正常表現譜中的偏差程度(deviation)與癌症的惡性程度有關(即相似程度與癌症惡性腫瘤的程度成反比)。此外,本發明揭露癌症可以藉由使用多個基因特徵來界定,而所述多個基因特徵則如表1所揭示的一個或多個基因。
本揭露還提供一種產生複數候選探針用以辨識哺乳動物中細胞類型之方法。所述方法包含以下步驟:步驟(a)為藉由偵測晶片從患有或不患有特定疾病、失調或基因症狀的哺乳動物標準樣本中產生複數基因表現,且所述標準樣本被診斷為屬於已知組織中的正常細胞;步驟(b)為藉由處理模組比較所述複數基因表現以產生比較結果;以及步驟(c)為根據所述比較結果轉化出包含所述複數候選探針的矩陣,其中所述複數候選探針可以結合至任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID No:1~652 或SEQ ID No:1~652的任一片段。另外,所述偵測晶片與所述處理模組彼此是連接的(例如:電訊連接(electrically)或通訊連接(wirelessly))。
在本發明一實施例中,所述複數候選探針的數量為大約200個。在本發明另一較佳實施例中,所述複數候選探針的數量為大約100個。在本發明另一更佳實施例中,所述複數候選探針的數量為大約50~60個。在本發明另一最佳實施例中,所述複數候選探針的數量為大約25~35個。
在本發明一實施例中,所述標準樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
在本發明一實施例中,所述特定疾病、失調或基因症狀包含血液科惡性腫瘤( hematologic malignancies)或實質固體瘤( solidtumors)。
在本發明一實施例中,所述複數探針的長度為至少15個核苷酸。
在本發明一實施例中,所述步驟(b)不包含將所述標準樣本中的所述複數基因表現與一個被診斷為患有特定疾病、失調、基因症狀或上述任意之組合的受試者異常樣本中的複數基因表現進行比較。
在本發明一實施例中,於所述產生複數候選探針用以辨識哺乳動物中細胞類型之方法中之步驟(c)其產生所述矩陣的方法包含:皮爾生相關係數(Pearson correlation)、斯皮爾曼等級相關係數(Spearman rank correlation)、肯德爾等級相關係數(Kendall)、K平均(k-means)、馬哈蘭距離(Mahalanobis distance)、漢明距離(Hamming distance)、萊文斯坦距離(Levenshtein distance)、歐幾里得距離(Euclidean distances)或上述任意之組合。
在本發明一實施例中,於所述產生複數候選探針用以辨識哺乳動物中細胞類型之方法中之步驟(c)還包含:步驟(c1)分析所述複數候選探針的特定序列與所述任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID No:1~652 或SEQ ID No:1~652的任一片段的表現量之間的相關性因子。在本發明另一實施例中,所述相關性因子包含結合親和力(binding affinity)。
本揭露還提供一種用以鑑定哺乳動物中細胞類型之方法。所述鑑定方法包含以下步驟:步驟(a')為藉由一個如前述包含複數候選探針的偵測晶片偵測患有或不患有特定疾病、失調或基因病變的受試者測試樣本中矩陣的表現,並且所述複數候選探針可以與任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID NO:1〜652或SEQ ID NO:1〜652的任一片段結合;步驟(b')藉由處理模組並且依據偵測的所述表現分析所述測試樣本以產生代表測試樣本分數(例如:CM score);以及步驟(c')藉由所述處理模組並且依據所述測試樣本分數(例如:CM score)預測所述測試樣本的細胞類型。
在本發明一實施例中,計算所述測試樣本分數係根據相似性程度(similarity degree)或相異性程度(dissimilarity degree)。
在本發明一實施例中,當所述測試樣本的CM score>大約0.8時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為正常/良性腫瘤細胞。
在本發明一實施例中,當所述測試樣本的CM score介於大約0.3~0.8時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為原發性腫瘤細胞。
在本發明一實施例中,當所述測試樣本的CM score<大約0.3時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為轉移性腫瘤細胞。
在本發明一實施例中,當所述相似性程度>大約80%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為正常/良性腫瘤細胞。當所述相似性程度介於大約30~80%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為原發性腫瘤細胞。當所述相似性程度<大約30%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為轉移性腫瘤細胞。其中值得注意的是,當所述相似性程度是100%時,兩個相比較的樣本個體是被鑑定為相同的。
在本發明一實施例中,當所述相異性程度<大約20%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為正常/良性腫瘤細胞。當所述相異性程度介於大約20~70%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為原發性腫瘤細胞。當所述相異性程度為>大約70%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為轉移性腫瘤細胞。其中值得注意的是,當所述相異性程度是0%時,兩個相比較的樣本個體是被鑑定為相同的。
在本發明一實施例中,所述測試樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
在本發明一實施例中,於所述步驟(b')中產生所述測試樣本分數的方法包含:皮爾生相關係數(Pearson correlation)、斯皮爾曼等級相關係數(Spearman rank correlation)、肯德爾等級相關係數(Kendall)、K平均(k-means)、馬哈蘭距離(Mahalanobis distance)、漢明距離(Hamming distance)、萊文斯坦距離(Levenshtein distance)、歐幾里得距離(Euclidean distances)或上述任意之組合。
更進一步地,本揭露還提供一種用以鑑定哺乳動物中細胞類型之系統,並且所述系統包含:處理模組以及偵測晶片。所述處理模組以及偵測晶片彼此電訊連結。所述偵測晶片包含所述複數候選探針,且所述複數候選探針可以結合至任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID No:1~652 或SEQ ID No:1~652的任一片段。除此之外,所述偵測晶片還可偵測患有特定疾病、失調或基因病變的哺乳動物測試樣本中矩陣的表現,並且處理模組可依據偵測的所述表現分析所述測試樣本以產生代表測試樣本的CM score而依據測試樣本的CM score預測所述測試樣本的細胞類型。
在本發明一實施例中,所述系統中的複數候選探針的數量為大約200個。在本發明另一較佳實施例中,所述系統中的複數候選探針的數量為大約100個。在本發明另一更佳實施例中,所述系統中的複數候選探針的數量為大約50~60個。在本發明另一最佳實施例中,所述系統中的複數候選探針的數量為大約25~35個。
在本發明一實施例中,所述系統中的測試樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
在本發明一實施例中,所述系統中的複數探針的長度為至少15個核苷酸。
以上本專利申請所揭露的相關內容和其他相關可透過以下較佳實施例的描述和附圖作進一步闡明。雖然可能會有變化或修改,但是其並不背離本專利申請所揭示的新穎性構想的精神和範圍。
除非另有定義,否則本文使用的所有術語(包括科技術語)的意義與本專利申請說明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。應當進一步理解,常用詞典中定義的術語的含義應當與相關領域和本專利申請說明的上下文中的含義一致,且不會解釋地過於理想化或過於正式,除非本文中明確定義。
本專利申請說明中,「一項實施例」 或「某一實施例」 的引用是指關於該實施例所描述的某一特定特徵、結構、或特性包括於至少一項實施例中。因此,本專利申請說明中不同位置出現的短語「在一項實施例中」或「在某一實施例中」 不一定均指同一實施例。此外,上述特定特徵、結構或特性可通過任何適宜方式在一項或多項實施例中進行組合。
定義說明
應當理解,除非上下文另有明確指示,否則單數形式「一」、「某」、「該」 、「所述」 也包括複數形式。因此,舉例來說,當使用術語「一個元件」時,其包括多個所述組件以及在所屬領域中習知的同等物。
當本文在敘述一個可測量的數值時(例如:數量或週期等等),本文所使用的「大約」是指數值±20%或是±10%,其較佳範圍為±5%,而更佳範圍為±1%。並且進一步更佳範圍為一個特定數值的±0.1%,因為所述數值範圍適合實施本發明所揭露之內容。
本文中所使用的「疾病」是用以形容動物的健康狀態呈現無法維持體內平衡( homeostasis),並且其中如果疾病沒有改善,則所述動物的健康將繼續惡化。相對地,「失調」是用以形容動物的健康狀態是呈現可維持體內平衡,但是所述動物現階段的健康狀態不如沒有失調( disorder)時的狀態。然而,若繼續不治療則不一定會進一步導致動物的健康狀況下降。
本文中所使用的「癌症( cancer)」和「腫瘤( tumor)」是用以定義一種疾病,其特徵在於此異常細胞之快速且不受控制的生長。所以「癌症」和「腫瘤」在此是可以互換的名詞。癌症細胞可以在局部擴散或通過血液和淋巴系統擴散到身體的其他部位。癌症舉例來說(但不限制)包括:乳癌、***癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴癌、白血病、肺癌等等。
本揭示之以下內文中之縮寫為此領域之通常知識者用以代表特定核苷酸之縮寫,其中「 A」指的是腺嘌呤核苷酸、「 C」指的是胞嘧啶核苷酸、「 G」指的是鳥嘌呤核苷酸、「 T」指的是胸腺嘧啶核苷酸、「 U」指的是尿嘧啶核苷酸。
本文中的「多核苷酸( polynucleotide)」 指的為前後相連如鏈狀之核苷酸。此外核酸( nucleic acids)為核苷酸之多聚體。因此,據上述本文中之多核苷酸與核酸為可互相替換之用詞。而此領域之通常知識者也可以理解所述核酸與所述多核苷酸為相等之用詞,且可以被水解成核苷酸。而本文所使用之多核苷酸指的是(但非限定) 所屬領域藉由各種方式所獲得之核酸序列,其包含(但非限定):基因重組手段( recombinant means),舉例來說為從一個重組基因庫( recombinant library)或一個細胞之基因體( genome)利用習知之克隆技術( cloning technology)或是聚合酶連鎖反應技術( PCR) 克隆出核酸序列,或是利用合成技術而合成出所述核酸序列。
本文中所使用的術語如「候選探針」和「選擇的探針」之定義均為依本揭露所產生且能夠結合表1中的基因之人工探針。因此,「候選探針」和「選擇的探針」是可以互換。
表1「用於作為鑑定探針設計之基因」
表1中所揭露的候選基因探針在以下文中簡稱為「CM探針」(CM probes)或「652個基因轉錄譜」(652-gene transcription profiles)。在下文中,所有統計計算通過處理模塊進行,處理模塊是中央處理單元(CPU)。 具體地,下面詳細描述本公開的過程:
步驟1:建構非癌症組織之對照基因譜(reference gene profile)
首先,步驟1(a)是從正常人體組織的基因轉錄數據(transcriptomic data)中獲取所選基因的RNA表達(RNA expression level)。將來自許多人的每個器官的基因表達值進行平均,以消除由單個人所引起的偏差。 因此,首先從GSE1133、GSE2361、GSE7307數據集中選擇出來自39個不同組織來源的254個樣本以構建訓練數據集。對於此訓練數據集,首先從GEO中獲取CEL文件,然後再由AffyQualityReport進行品質評估,以刪除品質量較差的陣列。所述通過品質評估的數據則進一步藉由Robust Multichip Average(RMA;Irizarry R等人,Biostatistics 2003, 4(2):249-264)程序處理以進行數據標準化(data normalization)。 其中,AffyQualityReport和RMA均從R package中的Bioconductor package獲得。遵循標準預處理程序,基因轉錄數據則進一步進行統計學和生物資訊學分析。
再來,步驟1(b)是將測試中所有器官的基因表達值結合,並且構建一個如下表所揭示的基因-器官矩陣(gene-by-organ matrix)。在所有器官中具有高變異係數(high coefficient of variance)的基因被選擇出來且進一步分析。
步驟1(c)是利用階層式分群法(hierarchical clustering analysis)對所述基因-器官矩陣進行分析,以評估其對組織分類的影響(如圖1所揭示)。在階層式分群法分析之後,每群中的一個代表性基因被選擇出來且將其他具有高度相似表現的基因除去。上述程序將可產生如表1所揭示之CM探針或652個基因轉錄譜。
階層式分群法之計算方程式:
步驟1(d)是藉由使用獨立的數據集來進一步驗證組織預測之效率,以確保所選基因表現譜可充分代表正常狀態下的特定器官。簡而言之,從驗證測試中的每個樣本提取所選基因的表現值,以構建樣本的表現譜。然後藉由自建軟體(in-house program)計算樣本與非癌症對照樣本表現譜之間的皮爾生相關係數。更明確地,是指樣本的表現譜與非癌症對照表線譜併入以最近鄰居分類法為基礎(即 KNN)的組織預測程序。我們將選擇具有最高相關係數(k = 1)的組織用於預測程序中。
k最近鄰居分類法( k-nearest neighbor method):
步驟1(e)是在對照列表中進行重複基因替換以改善組織分類直至滿足結果。標記(marker)的組成基因的任何改變都將導致新的對照譜被構建出來。在完成所有上述步驟後,即產生代表非癌狀態器官的652個基因轉錄譜。
再次聲明,其中值得注意的是步驟1(a)至1(e)中所使用的組織是具有已知器官但沒有任何異常/疾病組織的正常組織。此外,在一些實施例中,具有已知器官的所述正常組織可以從患有或不患有癌症的受試者(例如:人)中提取或分離出來。
步驟2:偵測腫瘤樣本中「652個基因轉錄譜」的表達:
步驟2(a)是從患者中取出腫瘤活檢測試樣本,並且藉由目前獲取的分子生物學技術進一步萃取其總RNA。
步驟2(b)與步驟1相似,其主要是藉由目前可獲取的分子生物學技術(例如:DNA微陣列中的探針雜交、磁珠系統(magnetic beads)上的雜交,逆轉錄聚合酶鏈式反應(rtPCR)或直接定序)從步驟2(a)中的測試樣品偵測652個基因轉錄譜的RNA表達。選擇性地,藉由使用轉換程序(例如:數據處理、數據提取和數據重新格式化)和使用處理模組(例如:中央處理單元(CPU)),則可以將測試樣本的表達進一步轉換為代表所選基因表達的數值期望值列表。
步驟3:評估腫瘤樣本的病理狀態以確定其是正常/良性或惡性腫瘤,還是原發性或轉移性的腫瘤。
樣本組織和正常對照樣本之間的所選基因的表達上的相似性(similarity)或不相似性(dissimilarity)(不相似性可以使用數學上從相似性轉換而來)被進一步測量如步驟1中所揭示。在一個實施例中,我們使用相似性分數(例如:CM score)。 此外,因為CM score的值介於0和1之間,所以可以透過以下公式計算相似度分數(similarity score)或相異度分數(dissimilarity score):(a)相似度=(CM score/1)* 100;而(b)相異度=1─相似度。值得注意的是,當相似度為100%時,則代表兩個受試者相同;當相異度為0%時,則代表兩個受試者相同。 但是,以下兩點值得注意。
(1)被記錄下來的所述基因表達值進一步進行計算機處理程序,透過計算樣本基因譜和對照基因譜之間的相似性以產生樣本的CM score。此處的CM score主要是藉由皮爾生相關係數分析(Pearson’s correlation coefficient)所產生,其公式如下所示:(附註:n代表用以作標記的基因數量;x代表來自測試樣本的基因表達值;y代表來自對照表達譜的基因表達值。)
然而,用於以計算來自樣本的表達譜和來自對照的表達譜之間的相似性或距離的計算方法(即CM方程式(CM algorithm))並不僅限於皮爾生相關係數分析。在一些其他實施例中,用於計算相似性或距離的方法包括但不限於斯皮爾曼等級相關係數(Spearman's rank correlation coefficient)、肯德爾等級相關係數(Kendall)、馬哈蘭距離(Mahalanobis distance)、歐幾里德距離(Euclidean distances)、K平均(k-means)、漢明距離(Hamming distance)、萊文斯坦距離(Levenshtein distance)等等。
(2)CM score與決斷分數(Cut-Off Score)的比較和相應的預測則如下表2所揭示。
表2
此外,CM score是從相似性基礎模式(Similarity-Based Mode)和/或距離基礎模式(Distance-Based Mode)的比較過程中所產生的。更明確來說,在相似性基礎模式中,其得分越高則代表樣本表達與「對照表達譜」越相似,因而推斷樣本具有較高的機率是良性或正常組織。在距離基礎模式中,其得分越高則代表樣本表達與「對照表達譜」的相似性越低,從而推斷樣本具有較高的機率為惡性腫瘤的可能性。
此外,為了進一步分辨組織樣本是屬於惡性的(malignant)還是癌性的(cancerous),將上述分數以實驗、統計(例如:接收者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve; ROC))或同時使用上述兩者的方法與經過確認的決斷分數(cut-off score)進行比較。
針對相似性基礎模式的評分系統,決斷分數A和B則進一步被設立。此外,分數A高於分數B。分數A可在區分原發性癌症與正常組織時提供顯著的敏感性和特異性,而分數B可在區分原發性癌症與轉移性癌症時提供顯著的敏感性和特異性。在實際操作中,如果樣本分數低於A分數但高於B分數,則樣本被預測為原發性癌症;如果樣本分數高於A分數,則樣本被預測為正常或良性腫瘤;如果樣本分數低於B分數,則樣本被預測為轉移性癌症。
針對距離基礎模式的評分系統,決斷分數C和D則進一步被設立。此外,分數C低於分數D。如果樣本分數低於D但高於C,則樣本被預測為原發性癌症;如果樣本分數低於C,則樣本被預測為正常或良性腫瘤;如果樣本分數高於D,則樣本被預測為轉移性癌症。
因此,本揭露中的「辨識細胞類型方法」包括三個步驟(即步驟1至3)。首先,步驟1是產生表1中所揭露的候選基因(即CM探針或652個基因轉錄譜)。接下來,步驟2是測定測試樣本中候選基因的表達。最後,評估測試樣本的CM score,然後預測測試樣本的細胞類型是正常細胞/良性腫瘤細胞、原發性腫瘤細胞還是轉移癌細胞。如上所述,本揭露的整個過程/方法可以概括為包括以下步驟:(1)從正常樣本中選擇具有高方差係數(coefficient of variance; CV)的候選基因而不與疾病樣品比較,以及數量所選基因的範圍為20至652; (2)通過層次聚類和組織預測驗證候選基因的表達; (3)選擇代表性核苷酸片段(例如,對於cDNA微陣列,針對每個選擇的基因設計約19至100個鹼基對長的基因特異性片段,並且為實時PCR的引物設計約15個鹼基長的寡核苷酸)。根據RNA定量方法的要求進一步產生CM探針的候選基因; (4)利用目前可用的分子生物學技術,利用CM探針確定測試樣品的候選基因表達水平; (5)基於CM演算法(algorithm)計算測試樣本的CM score; (6)基於CM score預測測試樣品的細胞類型。
在一個實施例中,本揭露還提供了用於開發多種候選探針以鑑定哺乳動物受試者中細胞類型的系統。更明確地,所述系統包括:偵測晶片和處理模組,且兩者彼此電訊連接。偵測晶片含有多個選定的探針,並且其探針可以結合選自SEQ ID No.1至652中的任一個或來自SEQ ID No.1至652的任何片段的多個多核苷酸序列,並檢測從哺乳動物受試者獲得的測試樣本陣列中的表現水平,而所述哺乳動物受試者其可能患有或不患有選定的疾病、病症、遺傳病症。 處理模組分析測試樣本陣列的表現水平並進一步產生測試樣本分數。 此外,處理模組可以基於測試樣本分數來預測測試樣本的細胞類型。
在一個實施例中,用於鑑定癌症主要部位組織(primary site)的偵測晶片是微陣列晶片或磁珠系統。在另一個實施例中,用於比較多個基因表現或開發包含候選探針的陣列的處理模組是中央處理單元(CPU)。
在一個實施例中,用於開發上述選擇探針的標準樣本包括:血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。在另一個實施例中,所選擇的疾病、病症或遺傳病包括:血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
示例1(Example 1)
在以下內文中,所有統計都是藉由處理模組進行計算的,且處理模組是中央處理單元(CPU)。實施例1中所使用的候選基因探針(即CM探針)數量減少至由表1中選出的50或56個基因。
材料與方法
組織與病人
本示例中之樣本是在台灣花蓮慈濟醫院醫院的同意下進行收集。從13名進行肝臟手術切除疑似惡性腫瘤之患者中收集了共 13個樣本。切除後立即將組織樣本浸入液氮中,然後進行RNAlater處理以便隨後進行RNA萃取。亞洲男性成年人的正常肝臟的總RNA(total RNA)則購自BioChain。
微陣列晶片雜交(Microarray hybridization)
簡單來說,主要利用Quiagen RNAeasy從腫瘤樣本中依照製造商所提供的標準方案萃取總RNA後再與Affymetrix HG-U133 plus2.0基因晶片進行雜交。Affymetrix HG-U133 plus2.0包含54,675個探針組,其代表大約38,572個獨特的UniGene聚集(cluters)。
數據集和標準化(Datasets and normalization)
為了使用六個GEO系列再次確認56個基因(即CM探針)在鑑定、辨別正常人體器官/組織方面的能力,我們使用GEO數據庫進行關鍵詞搜索以產生一組微陣列數據集。而所述微陣列數據集衍生自Affymetrix GeneChip HG-U133 plus2.0並且由正常的和癌症的組織樣本所組成(即結果段落中所揭露五個標準中的前兩個)。然後,這些候選GEO系列的摘要(abstract)以隨機順序逐一閱讀(read)以挑選出符合本文中所描述的那些其他三個標準。當找到第六個符合可用於再次確認的GEO系列時則搜索停止。
表3中所使用的測試數據集是藉由匯集上述六個新檢索的GEO系列和來自先前用於大規模統合分析(large-scale validation analysis)的數據集的癌症研究的特定子集所構建的。後者包含所有可檢索的微陣列數據系列(在GEO數據庫中以預固定GSE指定),其是在Affymetrix GeneChips HG133A或HG133plus2.0上進行並且包含24個可分析器官/組織的正常人樣本。而上述24種正常組織包括:腎、皮膚、肝、肺、氣管、骨骼肌、心臟、骨髓、胸腺、胰腺、腦下垂體、唾液腺、胎盤、子宮、卵巢、***、皮膚、睾丸、杏仁核、丘腦、小腦 、脊髓、胎兒肝臟、胎兒腦和甲狀腺。
本示例中所使用的GSE系列中可用CEL文件均從GEO網站下載,並且在Bioconductor包中使用RMA進行預處理。
檢驗試劑組和信號檢測(Assay kit and signal detection)
QuantiGene檢測試劑盒由Affymetrix Inc.依據Mao-Ying Inc.的需求進行定制。每個樣本以一式兩份進行測定而進一步確認,並按照標準方案進行處理。在每次檢測結束時,用Luminex®100/ 200™檢測雜交信號。
資料分析/組織預測(Data Analysis/Tissue Prediction)
24個正常器官/組織中每一個指定基因組(標記)的表達譜以如前述之方式被建構出來。簡而言之,在指定器官中正常人組織上進行的全基因組微陣列數據分析,並且從其中提取每個標誌(marker)基因的表現水平。 為了觀察組織樣本與其正常對應組的相似程度,我們還進一步從測試樣本中取得標記的表達水平且進行測試。然後在這兩個基因表現值列表之間計算皮爾生相關係數(cf,即相當於本揭露中的CM score)。皮爾生相關係數是利用的計算機程序搭配R語言進行而實現的。
統計分析
統計分析包括使用excel軟體計算標準偏差、學生t檢驗的P值。表4中學生t檢驗的P值是使用單尾(one tail)和第3型(type 3)作為參數設置而計算的。
結果
1.正常器官/組織的一致轉錄譜
數個新獲得的數據集重複地利用組織預測檢驗以重新確認Hwang等人先前揭露之內容。表3中所揭示的六個數據集則選自公共數據庫Gene Expression Omnibus(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),其標準如下:(1)具有來自正常組織和癌症組織的樣本。(2)數據來自利用Affymetrix GeneChips進行的實驗。(3)來自 24種可用CM演算法檢測的器官/組織樣本。
表3:藉由56個基因譜預測正常人體器官/組織
上述六個被使用之微陣列實驗數據集包括來自人皮膚、肺、甲狀腺和肝臟的組織樣本。此外,如表3所揭示,本發明正確地預測、鑑別了六個數據集中來自正常器官/組織的所有153個樣本。上述結果與先前發現一致,代表所選基因的表達譜形成了未患病的人體器官/組織的穩定分子特徵。
2. CM譜(CM profile)可將癌組織與正常組織區分開來
評分(CM score)系統則是被設計來代表「癌症惡性評分」,其反映測試樣本與相應正常組織對照譜(reference profile)之間的表現譜(expression profile)的相似性/不相似度。在本揭露中,CM score等於皮爾生相關係數。本揭露同時也測試了使用斯皮爾曼等級相關係數,並且其測試結果顯示可產生相同的結果(未揭示)。
在過去,與正常組織相比之下,組織預測測試通常對於癌組織只能有較低的準確性。因此,一個試數據集首先依據上述方法和材料被建構出。測試數據集主由27個獨立GEO系列中的轉錄組數據組成(來自927個癌症和340個正常樣本),其中所述樣本涵蓋腎、肝、肺、卵巢、***、皮膚、睾丸和甲狀腺。根據前述的程序計算試驗數據集每個陣列的CM score。CM score的得分越高,測試樣本越類似於其基因表達模式的正常對照。
為了檢查是否癌症與正常中的50或56個基因譜上有不同,首先對於每個GSE數據集中的癌症組別或正常組別樣本取得CM score的平均值。如表4所揭示,所有試驗GEO數據集中正常組織的平均CM score顯著高於癌症組織的,其代表癌組織與正常組織的標誌基因的總表現譜具有顯著偏離。來自正常組織的平均CM score大多在0.80以上,其標準偏差很少超過0.05,因此代表正常組織中56個基因的表現模式具有較佳的維持性。此種基因體階級的表現模式是組織特異性的,並且也可以由基因的子集表現,例如24個器官/組織中的56個基因。這種器官或組織特異性基因模式是以基因之間的數值公式表示,而不是以相對於對照基因的過度表現(overexpression)或低表現(underexpression)的倍數變化做為表示。
相比之下,癌症組織的平均CM score分佈在更廣泛的範圍內,並且它們的標準偏差值高於正常組別。所述現象代表癌組織中的整體基因表現模式與正常對照不相似。惡性腫瘤中的廣泛的CM score代表多種基因表達模式,其也可以反映出腫瘤中的異質癌細胞,這也是癌細胞中存在多種突變的預期結果。
3. 應用於個體樣本的正常和癌症之間的差異
雖然整組癌症樣本顯示比正常對照組具有更顯著低的CM score(如圖2和表4所揭示),但是不清楚所述差異是由一小部分試驗樣本還是由大多數樣本所貢獻。因此,我們從表4中採樣了一些數據集以仔細檢查每個樣本的CM score。而以此為目的所選擇的數據集包含:GSE10072(具有49個正常樣本和58個肺癌樣本),GSE15641(23個正常樣本和69個腎癌樣本),GSE19804(60個正常樣本和60個癌症樣本),GSE6008(4個正常樣本和99個卵巢癌),GSE62232(10個正常樣本和81個肝癌樣本),和 GSE65144(13種正常樣本和12種癌症樣本)。
表4
如圖3所揭示,來自六個分析數據集中的每一個的CM score基於CM score分佈形成兩個主要族群:一個是較高族群是來自位於較高CM score區域中的正常樣本,另一個較低族群則是位於較低CM score區域的癌症樣本。而由結果顯示所有測試數據集中的兩個族群均是清晰可分辨的,以至於一個可以用於區分兩類型組織的分割點數值被鑑定出。
4. CM score 與不同基因組合的標記配合良好
為了證明CM score可以區分癌症與非癌症,對從GEO所獲得的4個全基因體表現數據集(whole-genome gene expression datasets)(例如:Gene Expression Omnibus,其為一個基因表現的公共數據庫)進行統合分析。選擇用於試驗的數據集的標準包括:首先,數據集應代表不同的器官;其次,數據集應包含來自正常組織和癌症組織的樣本。而依據上述條件所選擇的數據集則如表5所揭示,其包括:GSE10072(其包含49個正常樣本和58個肺癌樣本)、GSE11151(其包含5個正常樣本和62個腎癌樣本)、GSE6008(其包含4個正常樣本和95個卵巢癌症)、GSE65144(其包含有13個正常樣本和12個甲狀腺癌樣本)。每個數據集均標有以GSE(prefix GSE)起始的GEO登錄號。根據數據集的登錄號,在括號中表示對腫瘤進行取樣的器官。使用三種基因組合被使用作為進行癌症/非癌症鑑別之標誌。除基因內容之外,三種標記中的每一種都由不同的基因數量組成(如表5所揭示)。
如圖3所揭示,針對四個數據集中的每一個數據集其決斷分數均選擇以0.8最為區分癌症與非癌組織。非癌症(或正常)組織之CM score將高於0.8(即相似性高於80%或相異性低於20%),而癌症組織之CM score將低於0.8(即相似性低於80%,或相異度高於20%)。而四個數據集的敏感度(靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性))和特異性(特異性=真陰性/(真陰性+假陽性))被進一步運算,其對應結果如表5所揭示:所有四個數據集的精準度、敏感性和特異性都很高。
根據圖3和表5的結果可以得出以下之結論:(1)在大規模統合分析中所觀察到的CM score差異(如表4所揭示)是由分析中大多數個體樣本所造成而非部份具有「顯著」值的樣本所造成;(2)惡性腫瘤與其起源器官之整體基因表現譜確實存在顯著差異;(3)所述特徵可具有很大的潛力,且於大多數個案中發展成客觀的癌症診斷方法以促進癌症之診斷。
如表5中所揭示,以大約0.8的決斷分數(即大約80%的相似性或大約20%的相似性)可以有效地分離除了甲狀腺以外的各種器官中的癌症組織和正常組織。
關於正常組織和癌症組織CM score分佈之間的部分重疊,其可能原因可歸於假陽性(false positives)和假陰性(false negatives)。舉例來說,重疊區域的正常樣本(即假陽性)可能被相鄰的癌細胞污染,或者癌症樣本中的腫瘤含量太低而無法在顯微鏡下觀察到,但其卻足以藉由分子雜交而被偵測到。假陰性的其中一種可能性是,它可能超出CM score的檢測範圍以區分某些癌症亞型與其起源的正常組織。
5. CM探針在臨床樣本中的應用
為了了解CM score與癌症狀態之間的可能關係,透過與台灣花蓮慈濟醫院腫瘤外科合作而將CM分析直接應用於臨床標本。惡性腫瘤的組織樣本是在已經被診斷患有癌症且在慈濟醫院接受切除的患者的同意下所獲得的。 為了擴大正常組的組織樣本數,從BioChain Inc.購買的「正常」肝臟的RNA樣本也被納入而共產生了27個樣本,其包括:16個肝臟腫瘤樣本、7個正常肝臟樣本、2個胰腺腫瘤樣本、1個甲狀腺腫瘤樣本和1個正常甲狀腺樣本。 每個樣本中的總RNA(total RNA)則依照標準方案之指示被萃取出,並且在使用RNA品質管控程序丟棄不合適的樣本後,通過品質管控的RNA將進一步與Affymetrix HU133 plus2.0基因晶片的陣列雜交。
表5:當將CM score設定為0.8且使用不同基因組合作為癌症標誌時,區分正常/癌症的敏感性和特異性
首先,計算每個樣本的CM score。從醫院的病歷文件中檢索每個患者的相應病理數據,且整合CM score以產生如表6中所揭示之結果。大多數正常樣本顯示CM score為0.79或更高,然而幾乎所有腫瘤均顯示其CM score低於0.81。CM score顯著高於0.81的唯一腫瘤樣本是樣本#100T,其捐贈者僅表現出非常輕微的肝癌症狀。此外,患者#100T其肝癌被歸類為BCLC-A,其屬於早期肝細胞癌。另一方面,正常樣本#87顯示其CM score為0.68是所有測試的正常樣本中最低的。其匹配對應的腫瘤樣本#88T恰好包括在本揭露中,並且在13個原發性肝細胞癌(HCC)樣本中也顯示出具有最低的CM score為0.55。與其他HCC標本相比,樣本#88T的病理報告揭示其屬於相對嚴重的惡性腫瘤。總之,這些結果均揭示CM score與腫瘤的惡性之間存在正相關。值得注意的是,此處的「正常」樣本與來自非患有疾病的捐贈者的正常對照不同,此處的「正常」樣本是患有癌症的器官的週邊組織。因此,正常樣本的CM score沒有表現出與健康個體一樣高的CM score並不值得意外。
在27個樣本中,4個腫瘤樣本的CM score特別地低,其中3個被診斷為膽管癌(樣本#8T、樣本#16T和樣本#386T)、1個(樣本#206T)為胰腺癌的實性假乳突狀瘤。上述可以在參照前述之652個基因轉錄譜對照代表正常組織的基因表現狀態並且低CM score代表其與正常對照不相似之後得到合理之解釋。因此,雖然肝臟中存在膽管癌,但由於它們起源於膽管,所以其與肝臟組織高度不同,且也因此其與正常肝臟的652基因轉錄譜相比之下其CM score非常低。胰腺癌中的實性假乳突狀瘤是胰腺癌中的一種罕見形式,其主要是壞死誘導細胞死亡的結果。因此,這種腫瘤的形態和功能可能僅與正常胰腺組織的形態和功能些微相似,從而其與正常胰腺相比之下而導致低CM score的結果。
因此,上述結果支持了本揭露之假設。
6. CM score可能與腫瘤的惡性程度有關
本揭露還發現CM score可能與腫瘤的惡性程度有關。舉例來說,如表4中所揭露之四個皮膚癌數據集。其中三個(即GSE15605、GSE4587、GSE7553)含有來自黑色素瘤的樣本(這是一種高度侵襲性且致命的皮膚癌類型),而另一個來自鱗狀皮膚癌的是GSE2503,其與黑色素瘤相比較輕微。 GSE2503中皮膚癌的CM score高於其他三個數據集中黑色素瘤的CM score。在來自肺癌的七個數據集中,最低的CM score 出現在小細胞肺癌的數據集,其為一種快速擴散和高度侵襲性的肺癌亞型。同樣地,在來自甲狀腺癌的六個GEO系列中,其中五個來自乳突狀甲狀腺癌的CM score幾乎與其正常對照組相同。乳突狀甲狀腺癌是最常見的甲狀腺癌類型,並且已知的是其分化良好、生長緩慢且預後良好。而來自未分化甲狀腺癌的癌症樣本GSE 65144具有低CM score(0.37±0.12)。甲狀腺未分化癌是一種非常具有攻擊性但很少發現的甲狀腺癌亞型。它的預後很差且對大多數治療具有抵抗力。總之,藉由上述我們可以了解這些臨床樣本的CM score均與癌症發展進程有關。
7. 以臨床樣本驗證磁珠系統上的CM score與基因標誌
表6:用以微陣列分析的花蓮慈濟醫醫院的臨床樣本的癌症特徵
依據表5和表6所揭示,由結果顯示決斷分數(CM score)大約0.8可區分出癌症與非癌症,並且如果使用Affymetrix微陣列進行mRNA定量的話則可以使用決斷分數(CM score)大約0.2以辨別原發性癌症與轉移性癌症。令我們好奇的是,是否相同的決斷分數也可適用於不同的技術平台,例如:磁珠系統。為了進一步驗證,我們使用由Affymetrix Inc.所提供的Quantigene plex 2.0測試磁珠系統上的臨床標本。首先,我們從32名在不同器官(包括:***、大腸、肝臟和胰臟)中患有癌症的患者獲得腫瘤樣本(如表7所揭示)。進一步地,樣本的總RNA(total RNA)與預先鍵結到磁珠上的50或56基因標誌探針進行雜交。計算來自個體樣本的每個標誌基因所產生的表現水平,且依照前述之常規計算程序得出CM score。由結果中我們發現所有原發性癌症的決斷分數低於0.8(即低於相似性80%,或高於相異性20%)。當使用CM score為0.2(即,相似性20%或相異性80%)作為區分原發性和轉移性癌症的決斷分數時,分別獲得100%、95%、97%的敏感性、特異性和準確性(如表8所揭示)。更進一步地,結果與表6中的分析一致。結果顯示,當使用磁珠系統進行RNA定量時,分數約0.2至0.3(即相似性為20〜30%或相異性為70〜80%)可以有效地作為區分原發性癌症與轉移性癌症的決斷分數。
表7:磁珠實驗中使用的臨床樣本摘要
表8:在磁珠系統上進行mRNA定量時,當CM score閾值為0.2時可以有效地分辨原發性癌症與轉移性癌症
8.良性腫瘤具有較高CM score
乳突狀甲狀腺癌(即PTC)是甲狀腺癌常見的亞型,其通常表現出相當良性的特徵:分化良好、生長緩慢、不易侵入血管、治療評分後預後良好等。如圖4A所揭示,PTC樣本的CM score似乎與正常樣本非常接近,其反映了良性特徵。雖然甲狀腺未分化癌(即ATC,其為侵襲性的亞型甲狀腺癌)的分數顯著低於正常或PTC,但是值得注意的是,在國際、多學門科學的和回顧性研究後,甲狀腺包膜内瀘泡型乳頭狀癌(EFVPTC)最近被重新分類並更名為「非入侵性濾泡甲狀腺腫瘤乳頭狀核」(NIFTP),以更好地反映其生物學和臨床特徵並避免過度治療患者。(Yuri E. Nikiforov, MD, PhD; Raja R. Seethala, MD; Giovanni Tallini, MD et al. JAMA Oncol. 2016;2(8):1023-1029. doi:10.1001/ jamaoncol.2016.0386)
而在其他癌症中我們也觀察到類似的結果。當將本發明所揭露的方法應用於包含良性腫瘤(平滑肌瘤)和子宮的子宮肌層正常組織的數據集(例如:GSE13319)時,這兩個類別的CM score基本上彼此重疊如圖4B所揭示,其代表良性腫瘤的非癌性之本質。GSE13319含有來自50個子宮肌瘤樣本、子宮良性腫瘤樣本的數據,以及27個子宮肌層樣本(即子宮中間層組織)。在分析表現譜之後,平滑肌瘤的CM score分佈幾乎與子宮肌層的CM score分佈重疊。平滑肌瘤的平均CM score(0.71±0.04)和子宮肌層的平均CM score(0.73±0.03)相當接近。
總結來說,本發明內容揭示使用一個以基因為基礎的新穎程序用於癌症診斷中,且更明確來說是在兩個不同的實驗系統(即使用高密度基因表達微陣列和磁珠輔助的多基因表現系統)上利用五種基因組合。所述程序透過比較測試樣本的所選基因(標誌)表現譜與正常對照組的表現譜來產生一個分數,例如:CM score。在本揭示中的分數是皮爾生相關係數。更進一步地,有兩個閾值:較高的閾值在大約0.8左右(即較高的相似性閾值在80%左右或較低的相異度閾值在20%),較低的閥值在0.2到0.3左右(即較低的相似性閾值在20〜30%,或更高的相異性閥值在70〜80%左右)。而CM score高於較高閾值的組織很可能是正常組織或良性腫瘤;低於第一個閾值但高於第二個閾值可能是原發性癌症;低於第二閾值可能是轉移性癌症。
附圖圖片中透過示例而非局限性方法展示出了一個或多個實施例,其中具有相同對照數位識別碼的元件始終表示類似元件。應該理解的是,本揭露不限於所揭示的較佳實施例。圖示和實施例中所揭示的數據則以平均±標準偏差(SD)標示且由配對t檢定驗證。顯著差異表示如下:*:P < 0.05;**:P <0.01。
圖1主要揭示了一個透過微陣列基因表達資料集所獲得的具有不同原發部位的轉移性癌症的關聯階層式分群結果。圖1主要揭示了一個使用標準雙向層次聚類分析(standard two-way hierarchical clustering analysis)產生之完整組織分類的示例性候選基因。行代表樣品的組織來源;列代表基因標誌。 基因微陣列熱圖上方所顯示的樹狀圖代表30個組織的聚集。
圖2主要揭示了本發明的候選基因,其可在多個數據集中區分癌症與正常樣本。 每個數據集中x軸所標示的正常或腫瘤樣本的平均癌症惡性腫瘤評分(下文稱為“CM scores”)分別被計算出。數據集的組織來源則顯示於GEO登錄號(GEO accession number)下方。 空心方塊(右上角標記為N)代表正常樣本,而封閉圓(表示為T)代表腫瘤樣本。平均值和誤差則是以灰線表示。
圖3主要揭示了來自所選數據集的個體中正常或癌症樣品的CM scores分佈。數據集的GEO登錄號則標記於相應圖示之頂部。每個圖示中之y軸代表CM scores;x軸則代表正常(空心方塊)或腫瘤(封閉圓)的樣品類型。每組數據中的灰線旁所顯示的單獨數值代表該組的CM scores的平均值。P值則使用單尾t檢定驗證計算出,並顯示為星號(例如****:P <0.0001)。
圖4A和4B主要揭示了良性腫瘤或近良性瘤的CM scores分析結果。 圖4A中所分析之樣本來自於GSE33630數據集,其樣本主要由正常甲狀腺、乳頭狀甲狀腺癌(即PTC)和間變性甲狀腺癌(即ATC)組成。 圖4B中所分析之樣本來自於GSE13319數據集,其樣本包含子宮肌層(代表子宮的正常組織,以星號代表)和平滑肌瘤(代表來自子宮的良性腫瘤,以空心鑽石形代表)的樣品。
附圖僅為示意圖,並且無任何限制。本揭露中的所有參考標記不得解釋為對本專利申請中權利要求範圍的限制。舉例來說,在各個附圖中相同的附圖標記表示相同的元件。
Claims (24)
- 一種產生複數候選探針用以辨識哺乳動物中細胞類型之方法,其包含:(a)藉由偵測晶片從所述哺乳動物的標準樣本中產生複數基因表現;(b)藉由處理模組比較所述標準樣本中所述複數基因表現以產生比較結果;以及(c)根據所述比較結果轉化出包含所述複數候選探針的矩陣,其中所述複數候選探針可以結合至任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID No:1~652或SEQ ID No:1~652的任一片段,其中,所述偵測晶片與所述處理模組彼此電訊連接。
- 如請求項1所述之方法,其中所述複數候選探針的數量為200個。
- 如請求項1所述之方法,其中所述複數候選探針的數量為100個。
- 如請求項1所述之方法,其中所述複數候選探針的數量為50~60個。
- 如請求項1所述之方法,其中所述複數候選探針的數量為25~35個。
- 如請求項1所述之方法,其中所述複數探針的長度為至少15個核苷酸。
- 如請求項1所述之方法,其中所述標準樣本是一個被診斷為不患有特定疾病、失調、基因症狀或上述任意之組合。
- 如請求項1所述之方法,其中所述標準樣本是一個被診斷為患有特定疾病、失調、基因症狀或上述任意之組合。
- 如請求項1所述之方法,其中所述標準樣本包含血液、血漿、血清、尿液、組織、細胞、器官、體液或上述任意之組合。
- 如請求項1所述之方法,其中所述步驟(b)不包含將所述標準樣本中的所述複數基因表現與一個被診斷為患有特定疾病、失調、基因症狀或上述任意之組合的受試者異常樣本中的複數基因表現進行比較。
- 如請求項1所述之方法,其中於所述步驟(c)中產生所述矩陣的方法包含:皮爾生相關係數(Pearson correlation)、斯皮爾曼等級相關係數(Spearman rank correlation)、肯德爾等級相關係數(Kendall)、K平均(k-means)、馬哈蘭距離(Mahalanobis distance)、漢明距離(Hamming distance)、萊文斯坦距離(Levenshtein distance)、歐幾里得距離(Euclidean distances)或上述任意之組合。
- 如請求項1所述之方法,其中於所述步驟(c)還包含:(c1)分析所述複數候選探針的特定序列與所述任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID No:1~652或SEQ ID No:1~652的任一片段的表現量之間的相關性因子。
- 如請求項12所述之方法,其中所述相關性因子包含結合親和力(binding affinity)。
- 一種用以鑑定哺乳動物中細胞類型之方法,其包含:(a')藉由一個包含如請求項1~5之任一項中所述複數候選探針的偵測晶片偵測患有特定疾病、失調或基因病變的哺乳動物測試樣本中矩陣的表現,其中所述複數候選探針可以與如請求項1~5之任一項中任一複數多核苷酸序列選自SEQ ID NO:1~652或SEQ ID NO:1~652的任一片段結合;(b')藉由處理模組並且依據偵測的所述表現分析所述測試樣本以產生代表測試樣本分數;以及(c')藉由所述處理模組且依據所述測試樣本分數預測所述測試樣本的細胞類型。
- 如請求項14所述之方法,其中計算所述測試樣本分數係根據相似性程度(similarity degree)或相異性程度(dissimilarity degree)。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相似性程度>80%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為正常/良性腫瘤細胞。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相似性程度介於30~80%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為原發性腫瘤細胞。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相似性程度<30%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為轉移性腫瘤細胞。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相異性程度<20%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為正常/良性腫瘤細胞。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相異性程度介於20~70%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為原發性腫瘤細胞。
- 如請求項15所述之方法,其中當所述相異性程度為>70%時,所述測試樣本的所述細胞類型被鑑定為轉移性腫瘤細胞。
- 如請求項14所述之方法,其中所述特定疾病、失調或基因症狀包含血液科惡性腫瘤或實質固體瘤。
- 如請求項14所述之方法,其中於所述步驟(b')中產生所述測試樣本分數的方法包含:皮爾生相關係數(Pearson correlation)、斯皮爾曼等級相關係數(Spearman rank correlation)、肯德爾等級相關係數(Kendall)、K平均(k-means)、馬哈蘭距離(Mahalanobis distance)、漢明距離(Hamming distance)、萊文斯坦距離(Levenshtein distance)、歐幾里得距離(Euclidean distances)或上述任意之組合。
- 如請求項14所述之方法,其中所述偵測晶片包含:微陣列晶片、次世代定序儀(Next-generation sequencing device)、定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction;qPCR)、磁珠系統。
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