TWI657821B - 用於治療ｃ－ｍｅｔ相關性癌症的方法和組成物 - Google Patents

用於治療ｃ－ｍｅｔ相關性癌症的方法和組成物 Download PDF

Info

Publication number
TWI657821B
TWI657821B TW104127751A TW104127751A TWI657821B TW I657821 B TWI657821 B TW I657821B TW 104127751 A TW104127751 A TW 104127751A TW 104127751 A TW104127751 A TW 104127751A TW I657821 B TWI657821 B TW I657821B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
fip
cancer
met
identification number
sequence identification
Prior art date
Application number
TW104127751A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201628640A (zh
Inventor
吳文陞
吳家如
胡志棠
尤仁音
馬珮羚
陳子智
Original Assignee
益生生技開發股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 益生生技開發股份有限公司 filed Critical 益生生技開發股份有限公司
Publication of TW201628640A publication Critical patent/TW201628640A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI657821B publication Critical patent/TWI657821B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明關於真菌免疫調節蛋白(FIP)在治療癌症，特別是治療c-Met-相關性癌症，更特別是治療肝細胞癌的用途；關於FIP在抑制腫瘤生長、癌症，特別是c-Met-相關性癌症，更特別是肝細胞癌之遷移、轉移或復發的用途。本發明亦關於用於阻斷c-Met訊息傳導的方法和組成物。

Description

用於治療C-MET相關性癌症的方法和組成物 優先權主張
本申請案主張2014年9月2號提申之美國專利申請案第62/044,415號的優先權，其整體內容係以參照方式併入本案。本申請案所揭示的部分資料已於2015年1月21號線上發表於PLoS ONE，標題為“Preclinical Trials for Prevention of Tumor Progression of Hepatocellular Carcinoma by LZ-8 Targeting c-Met Dependent and Independent Pathways”。
發明領域
本發明關於真菌免疫調節蛋白(FIP)在治療癌症，特別是c-Met-相關性癌症，更特別是肝細胞癌的用途；關於FIP在抑制腫瘤生長、癌症，特別是c-Met-相關性癌症，更特別是肝細胞癌之遷移、轉移或復發的用途。本發明亦關於用於阻斷c-Met訊息傳導的方法和組成物。
發明背景
肝細胞癌(HCC)是世界上危害最嚴重的癌症之一，尤其在東南亞。HCC的預後不良與復發是腫瘤轉移所 造成。近來，腫瘤微環境被強調在激發腫瘤轉移的重要性。腫瘤微環境包含原發腫瘤本身，其可能和基質性及炎性細胞交互作用，導致分泌大量轉移性生長因子，包括肝細胞生長因子(HGF)，進而激發原發腫瘤的轉移性表型變化。
本領域已知c-Met的活化可以自泌方式發生在HCCs，證據是高位準的細胞質內HGF。再者，HCCs的高HGF血清位準與c-Met表現失調和早期復發密切相關，高-Met表現的HCCs患者在治療性切除手術後通常具有較短的5年存活率。此外，一組帶有c-Met-引發的轉錄標誌的HCCs(27%)，以高比率的血管侵襲為其特徵。另一方面，活體外研究也顯示出，HGF對於包括EMT、遷移與侵襲在內的HCC轉移性變化具有影響力。因此，HGF-c-Met訊息傳導被認為是預防HCC惡化的最有希望治療標靶。
HGF結合至c-Met會引發了c-Met的胞質區域的自磷酸化作用，接著召集上游調節因子，例如Gab、Grb2、與PI3K，從而活化下游的訊息傳導，包括受胞外信號調節的蛋白激酶(ERK)、c-Jun激酶(JNK)和蛋白激酶B(AKT)。在過去十年中，已設計眾多用於阻斷c-Met信號級聯的小型分子。到目前為止，包括JNJ-38877605、GEN-203、與ARQ197等至少17個抑制劑已進入臨床評估(Zhu K et al.,Expert Opin Ther Pat 2014,24：217-230)。
c-Met抑制劑的毒性已在眾多研究中被證實。在一個動物實驗中，GEN-203會導致明顯的肝臟和骨髓毒性。在臨床試驗中，觀察到以ARQ 197治療HCC會導致包 括貧血與嗜中性白血球低下症(neutropenia)的嚴重不良事件。這些副作用可歸因於c-Met廣泛表現在許多器官的上皮細胞及其關鍵性生物功能，例如對於組織損傷的防禦反應。
儘管面臨上述潛在挑戰，在改善c-Met治療方式上仍有極大潛力。首先，可針對具有活躍之c-Met訊息傳導的HCC進行大規模篩選，以募集參加試驗的適宜患者。其次，慎選確保安全性的更有效c-Met抑制劑。第三，可建立由患者衍生出來之HCC株，以測試HCC拮抗劑的效率。
數種源自於例如赤芝(Ganoderma lucidium)、草菇(Volvariella volvacea)、金針菇(Flammulina velutipes)等可食性菌類的蛋白質具有相似的胺基酸序列和免疫調節功能。這些蛋白質被命名為真菌免疫調節蛋白(FIPs，Ko J.L.,Eur.J.Biochem.1995；228：244-249)。
從赤芝(Ganoderma lucidum)、金針菇(Flammulina veltipes)、草菇(Volvariella volvacea)、松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、紫芝(Ganoderma japoncium)、小孢子靈芝(Ganoderma microsporum)、甜芝(Ganoderma sinense)與紅球叢赤殼菌(Nectria haematococca)、銀耳(Tremella fuciformis)、樟芝(Antrodia camphorate)中已經鑑定並單離出至少10種FIPs，而且分別命名為LZ-8(亦被稱為FIP-glu)、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gts、FIP-gja(GenBank：AY987805)、FIP-gmi、FIP-gsi、FIP-nha、FIP-tfu(GenBank：EF152774)、FIP-aca(Hsu H C,et al.,Biochem J 1997；323(Pt 2)：557-565；Kong et al.,Int.J.Mol.Sci.2013；14：2230-2241；Han et al.,J Appl Microbiol 2010,109：1838-44；以及中國專利第102241751B號)。在彼等當中，FIP-gts的去氧核醣核酸序列被發現與赤芝的LZ-8序列一樣。兩分子展現相同的免疫活性，這指出它們是相同的蛋白質。FIPs於活體外對於人類周邊血液淋巴細胞(hPBLs)和老鼠脾細胞來說是促進有絲***物質。它們所引發的鐘形劑量反應曲線與凝集素類細胞***激素類似。以FIPs活化hPBLs導致了與ICAM-1表現相關的IL-2、IFN-γ及腫瘤壞死因子-α等分子的產量增加(Wang P H,et al.,J Agric Food Chem 2004；52(9)：2721-2725)。FIPs也能作為免疫抑制劑。於活體內，這些蛋白質能防止全身的過敏反應，並且在老鼠的阿都司氏(Arthus)反應期間能顯著地減少足墊水腫。這些觀察顯示FIPs能夠促進健康而且具有療效。
以Garnier分析法預測FIP-gts之二級結構發現，此蛋白有兩個α-螺旋、七個β-摺片與一個β-轉折。以SDS-PAGE分析，FIP-gts之分子量為13kD。以20μM戊二醛(蛋白質共軛物)進行胺基酸結合分析，發現FIP-gts形成26kD雙聚體。
雖然FIPs的免疫調節活性已被廣泛研究，但其抗癌活性直到近年來才受到探討。讓渡給本案申請人的美國專利第8,629,096號揭露FIP-gts對於乳腺癌、肺癌、***癌和黑色素瘤展現出抗增生活性，從而顯示FIPs作為廣效抗癌劑的潛在利用性。FIP-gts也被發現對於胃癌細胞系能 夠展現出致死效應(Liang C et al.,Oncol Rep 2012,27：1079-1089)。美國專利公開案第2011/009597號提供了另外的實驗數據，其顯示由嗜甲醇酵母表現出來的重組型FIP-gts蛋白能夠於活體外引發血癌細胞的程式化細胞死亡，而且能夠於活體內壓制肝癌細胞的生長。美國專利第8,476,238號教示了FIP-gmi可經由抑制表皮生長因子受體(EGFR)的訊息傳導來抑制肺癌的侵襲與轉移。另有活體外研究報導，FIP-gts亦可壓制子宮頸癌的細胞遷移(Wang PH et al.,Reprod Sci 2007,14：475-485)。然而，FIPs對癌症的抗轉移效應仍有待進一步研究。
FIP-gts抗腫瘤活性的分子機制已經過初步研究。FIP-gts可穩定p53，進而增加了使肺癌細胞週期停滯的CDK抑制劑p21。讓渡給本案申請人的美國專利公開案第2007/071766號揭露FIP-gts可抑止肺腺癌細胞的端粒酶活性。在信號傳導層次上，FIP-gts可能影響蛋白激酶C(PKC)/ROS、PTK/PLC/PKCalpha/ERK1/2，以及PTK/PLC/PKCalpha/p38的級聯作用。在這些當中，已經知道PKC與ERK對於HGF/c-Met的訊息傳導來說非常重要。到目前為止，尚未探討是否有任何FIP可以阻斷c-Met依賴型訊息傳導作用。
發明概要
在第一態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一細胞內的肝細胞生長因子受體(c-Met)活性的方法，該方 法包含使該細胞和一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)相接觸，以抑制c-Met活性。
在第二態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於抑制一細胞內的肝細胞生長因子受體(c-Met)活性。
在第三態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一細胞內的肝細胞生長因子受體(c-Met)活性的組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制c-Met活性。
在第四態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞生長因子受體(HGFR)-相關性癌症之轉移的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制HGFR-相關性癌症之轉移。
在第五態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於抑制一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症之轉移。
在第六態樣中，本案所提供的是一種用於抑制肝細胞生長因子受體(HGFR)-相關性癌症轉移的藥學組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制一個體內的HGFR-相關性癌症之轉移。
在第七態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症之細胞遷移的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)。
在第八態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於抑制一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症之細胞遷移。
在第九態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症之細胞遷移的組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)。
在第十態樣中，本案所提供的是一種治療癌症的方法，該方法係藉由阻斷一需要接受治療之個體內的肝細胞生長因子受體(c-Met)訊息傳導，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以阻斷c-Met訊息傳導。
在第十一態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於藉由阻斷一需要接受治療之個體內的肝細胞生長因子受體(c-Met)訊息傳導來治療癌症。
在第十二態樣中，本案所提供的是一種藥學組成物，該組成物係用於藉由阻斷一需要接受治療之個體內的肝細胞生長因子受體(c-Met)訊息傳導來治療癌症，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以阻斷c-Met訊息傳導。
在第十三態樣中，本案所提供的是一種用於預防一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症復發的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白 (FIP)，以預防HGFR-相關性癌症之復發。
在第十四態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於預防一個體內的肝細胞生長因子受體-相關性癌症之復發。
在第十五態樣中，本案所提供的是一種藥學組成物，該組成物係用於預防肝細胞生長因子受體(HGFR)-相關性癌症之復發，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以預防HGFR-相關性癌症之復發。
在第十六態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞癌之轉移的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制肝細胞癌之轉移。
在第十七態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於抑制一個體內的肝細胞癌之轉移。
在第十八態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞癌轉移的藥學組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制肝細胞癌之轉移。
在第十九態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞癌之細胞遷移的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制肝細胞癌之細胞遷移。
在第二十態樣中，本案所提供的是一種真菌免 疫調節蛋白(FIP)，其係用於抑制一個體內的肝細胞癌之細胞遷移。
在第二十一態樣中，本案所提供的是一種用於抑制一個體內的肝細胞癌之細胞遷移的組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以抑制肝細胞癌之細胞遷移。
在第二十二態樣中，本案所提供的是一種用於預防一個體內的肝細胞癌復發的方法，該方法包含給予該個體一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以預防肝細胞癌之復發。
在第二十三態樣中，本案所提供的是一種真菌免疫調節蛋白(FIP)，其係用於預防一個體內的肝細胞癌之復發。
在第二十四態樣中，本案所提供的是一種用於預防一個體內的肝細胞癌復發的藥學組成物，該組成物包含一有效量之真菌免疫調節蛋白(FIP)，以預防肝細胞癌之復發。
本發明的上述與其他目的、特徵與效應在參照下列較佳具體例之說明連同隨附圖式將變得顯明，其中：圖1A與1B顯示所指涉HCC細胞系進行48小時傷口癒合試驗的形態與活動性，其中照片是以相位差顯微鏡拍攝(放大200倍)；圖1C顯示所述HCCs的活動性定量分析，其中個 別HCC的相對活動性是以將HCC340的活動性取作1.0來計算，(**)與(*)代表所述HCCs與HCC340之間活動性差異的統計顯著性(分別為p<0.005與p<0.05，n=4)；圖2顯示比對HCC細胞系中多種訊息傳導分子的免疫印跡分析，其使用GAPDH作為載入對照組，其中所示數據代表2個再現性實驗；圖3A、3B與3C顯示FIP-gts與JNJ對於HCC329和HCC372細胞遷移以及對於HGF-引發之HepG2細胞遷移的抑制效應；圖4為取自SCID小鼠的全肝標本全覽照，其顯示在SCID小鼠模型中，FIP-gts與JNJ對於HCC329腫瘤生長和轉移的抑制效應，其中培養基-與JNJ-處理組出現肝內轉移瘤，但FIP-gts-處理小鼠組並無出現；圖5A-5D顯示FIP-gts阻斷c-Met陽性和陰性HCCs以及受HGF-誘發之HepG2中的訊息傳導；圖6A-6B為顯示FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo分別對於HCC372與HCC329細胞存活率之效應的直方圖；圖7顯示透孔遷移試驗的HCC細胞病理影像，顯示FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo抑制HCC329與HCC372的細胞遷移；以及圖8顯示比對HCC細胞系中多種訊息傳導分子的另一免疫印跡分析，其使用GAPDH作為載入對照組。
發明詳細說明
本發明基植於發現到以FIP-gts為例的真菌免疫調節蛋白(FIP)有效於抑制c-Met活性，這一發現指出表現出c-Met蛋白之癌細胞的遷移與轉移能夠藉由給予FIP來抑制c-Met活性而被壓制。尤其，當FIP-gts被使用作為FIP的例示性範例時可以發現到，相較於習知c-Met抑制劑JNJ-38877605，FIP-gts對於c-Met活性的抑制效應更為強效。相較於JNJ-38877605，FIP亦可更有效地阻斷恆常性c-Met-依賴型訊息傳導。本發明進一步發現到受HGF-引發的c-Met-依賴型訊息傳導和癌細胞遷移能夠被FIP所抑制。這些發現顯示FIP在醫療上可供用於治療增生性病症，例如癌症，包括與c-Met訊息傳導相關的癌症或是c-Met-相關性癌症。特別是，以FIP來處理表現出c-Met蛋白的癌細胞會造成c-Met訊息傳導被阻斷，並且抑制與c-Met訊息傳導有關的下游事件，例如將癌細胞內的JNK與ERK活化。本發明進一步發現到，除了壓制恆常性c-Met訊息傳導及受HGF-引發的c-Met訊息傳導以外，FIP亦可阻斷HCCs中恆常性c-Met非依賴型訊息傳導，並且抑制HCC細胞的生長、遷移和轉移，其中c-Met蛋白實質上未表現出來或是實質上測不到c-Met蛋白的活性形式。
c-Met亦稱為肝細胞生長因子受體(HGFR)，其由Met原致癌基因所編碼並擁有酪胺酸激酶活性。肝細胞生長因子(HGF)是Met受體的唯一已知天然配體。HGF/c-Met訊息傳導，其在本案中也可互換地稱作為HGFR訊息傳導，啟動了侵襲性生長程式，該程式被認為對早期 胚胎發育至關重要，但在失調時，可能導致異常細胞的惡性生長、活動、遷移與侵襲。據信HGFR訊息傳導，其包括與MAPK(絲裂原活化型蛋白激酶)-、PI3K/AKT-、STAT3-與β-連環蛋白(β-catenin)-相關的途徑，經由引發不受控制的細胞生長和血管生成，在發展癌症時扮演重要角色；並主導了透過引發散播(scattering)，也就是細胞解離(也稱作上皮間質轉化或EMT)來啟動腫瘤發展，以及由於生成金屬蛋白酶所導致的遷移和侵襲，而此經常造成轉移。
HGFR訊息傳導的活化主要是依賴Met受體上的某些胺基酸殘基的磷酸化，其中激酶區域內的Tyr1234與Tyr1235在回應HGF結合時發生自磷酸化，造成位於C-端多官能對接位址內的Tyr1349和Tyr1356進一步磷酸化。HGFR的磷酸化作用繼而活化非-受體酪胺酸激酶Src、點狀黏著激酶(FAK)以及Ras/MEK/ERK和PI3K/AKT的傳訊級聯作用。因此，「抑制HGFR活性」、「壓制HGFR活化」與「阻斷HGFR訊息傳導」等用語在本案可互換地使用，意思是藉由給予FIP或任何c-Met抑制劑，例如JNJ-38877605，阻止HGFR活化及/或降低HGFR激酶活性，其乃是藉由，舉例來說，相較於在無FIP或c-Met抑制劑存在時所測得者，HGFR蛋白的整體表現位準、磷酸化位準(尤其是HGFR在Tyr1234處的磷酸化位準)抑或是例如ERK與JNK等下游效應蛋白之磷酸化位準的可測得減少量來進行測定。
HGFR的恆常性活化與異常表現可為配體-非依賴型，且據信在許多人類癌症中促成腫瘤的生長、遷移、侵襲和轉移(Mizuno S.and Nakamura T.,Int.J.Mol.Sci.2013,14：888-919)。本案中所使用的用語「HGFR-相關性癌症」或「HGFR-陽性癌症」意指在癌細胞表面上表現出HGFR蛋白的癌症，且通常具有HGFR蛋白的異常表現及/或活化，其可導致、增進或促成癌症的生長、遷移、轉移或復發。在HGFR-相關性癌症中，HGFR蛋白的存在及其磷酸化形式可以藉由胜肽或蛋白之定量或定性分析中所使用的任何習用技術而容易地進行檢測，例如免疫印跡法、酵聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫沉澱法與螢光顯微鏡檢法。在一些具體例中，該癌症為選自於由下列所組成之群組中的固體腫瘤：肝細胞癌、遺傳型和散發型人類乳突性腎癌、卵巢癌、***癌，膽囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、間皮瘤、大腸癌和骨原性肉瘤。在其他具體例中，該癌症為液體腫瘤，譬如淋巴瘤和多發性骨髓瘤。
如本案揭示者，本發明提供一種用於抑制癌細胞中的HGFR活性的方法，該方法包含使HGFR接觸一有效量之FIP。在一些具體例中，HGFR的活性係由於HGF或HGFR過度表現而失調，此意指HGF或HGFR的表現位準相較於相同類型非癌組織的基線表現位準是向上偏離。在一些具體例中，HGFR在細胞中異常活躍，舉例來說，其磷酸化形式大量地出現，尤其是在Tyr1234處被磷酸化者。 用語「細胞」在用於本案時指的是活體外(in vitro)、離體(ex vivo)或活體內(in vivo)的細胞。在一些具體例中，離體細胞可為從例如哺乳動物等生物體上切除的組織樣本的一部分。在一些具體例中，活體外細胞可為細胞培養物裡的細胞。在一些具體例中，活體內細胞為生活於例如哺乳動物等生物體中的細胞。本案中所使用的用語「接觸」指的是使所指涉的部分聚集在一活體外系統或活體內系統內。舉例來說，使HGFR「接觸」FIP包括給予FIP至一個體或患者，例如人類，以及，舉例來說，將FIP導入含有表現出HGFR之細胞的樣本內。
在較佳具體例中，本案所揭示的發明關於使用FIP來抑制HGFR-相關性癌症之細胞遷移或轉移，所述HGFR-相關性癌症例如選自於由下列所組成之群組：肝細胞癌、遺傳型和散發型人類乳突性腎癌、卵巢癌、***癌、膽囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、大腸癌、與骨原性肉瘤、淋巴瘤和多發性骨髓瘤。在上列癌症中，肝細胞癌是最佳的。根據本發明，用語「遷移」指的是一細胞或多個細胞從一個部位移動到另一個部位。本案中所使用的用語「轉移」指的是癌細胞從其原先由正常、增殖性或發育異常細胞形成的原發癌部位，移位至所移位癌細胞暫居與增殖的繼發部位的過程。通常，轉移的過程涉及癌細胞遷移通過例如基底膜及其他習知細胞外基質等生理屏障的能力。
本發明更設想到預防HGFR-相關性癌症的復發，因為癌症的微轉移經常導致復發的風險。的確，癌症的復發可歸因於未完全去除或殺死原發癌的細胞，並可局部性地發生(原發癌的相同部位)、區域性地發生(在原發癌附近，可能是在淋巴結或組織)及/或由於轉移而遠端性地發生。根據下文所說明的實施例顯示，給予FIP會引發原發腫瘤縮小並且壓制HCC的肝內轉移，這表示HGFR-相關性癌症的復發可藉由本案所揭示之發明而有效地預防。因此，用語「預防復發(preventing recurrence)」與「復發的預防(prevention of recurrence)」在用於本案時指的是在病情緩解後，減少或消除癌症的再次出現。
在另一較佳具體例中，本案所揭示的發明適用於癌症治療。本案中所使用的用語「治療(treating)」或「治療(treatment)」關於目前病況的症狀改善、病程的減緩，尤其是壓制腫瘤生長、抑制惡性復發或轉移，以及引發腫瘤縮小。在一些具體例中，用語「治療(treating)」或「治療(treatment)」指的是縮減或穩定腫瘤尺寸或癌性細胞計數。理想地，被治療的癌症是HGFR-相關性癌症，例如選自於由遺傳型和散發型人類乳突性腎癌、卵巢癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、食道癌、胰腺癌、大腸癌和骨原性肉瘤所組成之群組者。
然而，先前研究指出c-Met的過度表現僅在20-48%人類HCC樣本中觀察到。此觀察在某種程度上被本案揭示的實施例3所證實，其中所分析的十個細胞系中僅 有四個顯示出具有可偵測位準的c-Met與p-c-Met。就該等欠缺c-Met訊息傳導的HCCs而言，以c-Met為標靶的方式並不合宜。
本發明人意外地發現到FIP仍可壓制實質上未表現出c-Met蛋白及/或磷酸化c-Met的癌症的細胞遷移、轉移與復發，尤其是HCCs，這表示FIP可藉由多重機制壓制腫瘤發展，包括抑制c-Met依賴型訊息傳導途徑以及至少一個c-Met非依賴型訊息傳導途徑。實質上未表現出c-Met蛋白及/或磷酸化c-Met的HCCs在本案也稱作「HGFR-陰性HCCs」，它們涵蓋以胜肽或蛋白質定量或定性分析所使用的任何習用技術，例如免疫印跡法、酵聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫沉澱法和螢光顯微鏡檢法進行評估，在癌細胞中未觀察到可偵測位準之c-Met及/或p-c-Met(尤其是在Tyr1234處被磷酸化者)的HCCs。極有可能HGFR對於HGFR-陰性HCCs的腫瘤發展並非關鍵。如下文實施例7所示，EGFR訊息傳導-而非c-Met訊息傳導-在HGFR-陰性HCCs中是活躍的，而且其可被本案揭示的FIP所壓制。
本案所使用的用語「真菌免疫調節蛋白」或縮寫成“FIP”指的是屬於首先定義於Ko et al.,Eur.J.Biochem.1995；228：244-249之蛋白家族的蛋白，其係基於胺基酸序列與免疫反應效應的相似性。經報導，FIP家族的免疫調節蛋白共享至少57%之序列相同性。尤其，FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo與LZ-8的一級結構展現60-70%之高序列相同性(Kong et al.,Int.J.Mol.Sci.2013,14,2230-2241； 中國專利第CN102241751B號；Wang XF et al.,Curr.Topics Nutraceutical Res.2012,10(1)：1-12；以及Li OZ et al.,Crit.Rev.Biotech.2011,31(4)：365-375)。因此，本案所使用的用語「真菌免疫調節蛋白」意欲涵蓋與序列辨識編號第1號所示FIP-gts之胺基酸序列具有至少57%、較佳為至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%胺基酸相同性並具有引發、增強或延伸個體免疫反應之能力的任何多肽。在一較佳具體例中，該真菌免疫調節蛋白具有選自於由下列所組成之群組的胺基酸序列：序列辨識編號第1號(FIP-gts)、序列辨識編號第2號(FIP-fve)、序列辨識編號第3號(FIP-vvo)、序列辨識編號第4號(LZ-8)、序列辨識編號第5號(FIP-gja)、序列辨識編號第6號(FIP-gmi)、序列辨識編號第7號(FIP-gsi)與序列辨識編號第8號(FIP-nha)，及其作為免疫調節劑的功能性變異體。在另一較佳具體例中，所述FIP衍生自靈芝屬或草菇，尤其具有選自於由下列所組成之群組中的胺基酸序列：序列辨識編號第1號、序列辨識編號第2號、序列辨識編號第3號、序列辨識編號第4號、序列辨識編號第5號、序列辨識編號第6號與序列辨識編號第7號。最佳者包含序列辨識編號第1號之胺基酸序列、基本上由序列辨識編號第1號之胺基酸序列所組成，或是由序列辨識編號第1號之胺基酸序列所組成。
本案所使用的FIP可得自於天然來源、真菌培養物，抑或是於諸如細菌或酵母菌宿主等原核或真核微生物 宿主中重組表現。依此獲得的FIP可為粗製物形式，或是藉由任何適宜技術所分離、分餾、或部分或實質上純化自於真菌物質的精製調配物。較佳為該蛋白在使用前經過至少部分地純化。可供用於製備FIP的一種方法揭示於WO2005040375A1，該方法涉及培養包涵帶有FIP基因之表現載體的酵母轉形株，並從酵母培養物收集重組型FIP蛋白。其他的有用方法可見於，舉例來說，Kong et al.(同前)；CN101205553A；以及Wang XF et al.,Curr.Topics Nutraceutical Res.2012；10(1)：1-12。
在所使用的FIP為LZ-8或FIP-gts的情況下，該FIP可以直接單離自於赤芝或松杉靈芝，或在宿主細胞系統中由重組蛋白技術製備出來。宿主細胞可為酵母菌或細菌系統。較佳地，該宿主細胞系統係選自於由下列所組成之群組：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)、漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、博伊假絲酵母((Candida boidinii)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltose)、乳糖克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)、西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)、球擬酵母屬(Torulopsis sp.)、陸地酵母(Arxula adeninivorans)、曲黴屬(Aspergillus sp.)(例如構巢曲黴(A.nidulans)、黑曲黴(A.niger)、泡盛曲黴(A.awamori)和米曲黴(A. oryzae))，以及木黴屬(Tricoderma sp.)(例如瑞氏木黴(T.reesei))。
本案所使用的FIPs係根據上述方法，例如WO2005/040375A1所揭露的方法實質上單離或純化。本案所使用的用語「實質上單離」或「實質上純化」指的是從天然環境或宿主系統內移出，以及至少60%不含、較佳至少75%不含、且更佳至少90%不含、甚至更佳至少95%不含宿主系統內彼等所天然相連或彼等所伴隨之其他組分的FIPs。
用於本案時，用語「個體」意欲涵蓋人類或非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括家畜動物、陪伴動物、實驗室動物、和非人靈長類。非人類個體亦包括而不限於馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、沙鼠、倉鼠、水貂、兔和魚。應該理解，較佳的個體為人類，尤其患有癌症或處於癌症風險的人類病患，例如肝細胞癌。
就研究目的而言，用語「個體」可指本案所定義的生物樣本，包括但不限於細胞、組織或器官。據此，本案所揭示的發明係意欲在活體內還有活體外施用。
根據本發明，用語「給予一個體」包括以適宜藥學調配物將FIP藉由用於遞送FIP至該個體所欲位置的任何適宜途徑分配、遞送或施用至一個體，以使FIP接觸目標細胞或組織。
FIP可藉由任何適宜途徑投至該個體，例如局 部、直腸、腸內或非經腸途徑，舉例來說，口服、靜脈內、皮下、腫瘤內、肌肉內、腹膜內、穿皮、脊鞘內、或腦內途徑。投藥可以是快速的，例如藉由注射，或歷經一段時間，例如藉由緩慢輸注或給予緩釋調配物。
在一較佳具體例中，FIP係欲以口服給予並製備成可口服給予調配物形式。此類調配物係較佳以適宜載劑、賦形劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、加味劑、防腐劑調配，並打成錠劑或囊封成固體膠囊或軟膠囊。亦設想得到此類調配物可設計成下列劑型：口服溶液、或口服小包、或口服丸劑。或者除了口服給予，還可設想得到此類調配物可設計成灌腸劑、或栓劑、或植入物、或貼片、或乳霜、或軟膏劑型。適宜載劑、賦形劑、與稀釋劑的若干例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、***膠、磷酸鈣、藻酸鹽、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、明膠、糖漿、甲基纖維素、甲基-與丙基-羥基苄酸鹽、滑石、硬脂酸鎂、水、礦物油等等。調配物亦可額外包括潤滑劑、濕潤劑、乳化劑與懸浮劑、防腐劑、甜味劑或加味劑。FIP組成物可調配成能夠在運用本領域習知流程給予病患後快速、持續或延遲釋放活性成分。調配物亦可含有減少蛋白水解、核酸和其他降解作用的物質及/或促進吸收的物質，例如，舉例來說，表面活性劑。該組成物可和聚乙二醇(即PEG化)、白蛋白或類似物錯合，以幫助促進在血流中的穩定性。
另一較佳的FIP製劑係利用生理鹽水溶液載體；可設想到其他藥學上可接受的載劑，例如亦可使用無毒鹽或化合物的生理濃度、5%葡萄糖水溶液、無菌水或等等。可能也會希望組成物內存在有適宜的緩衝液。若有需要，此類溶液可凍乾儲存在無菌安瓿裡，待加入無菌水復溶即可用於注射。主要溶劑可為水性或者非水性。
該載劑亦可含有其他藥學上可接受的賦形劑，以調整或維持調配物的pH、滲透壓、黏度、澄清度、顏色、無菌性、穩定性、溶解速率或氣味。類似地，載劑可另含有其他藥學上可接受的賦形劑，以調整或維持釋放或吸收或滲透穿過血腦屏障。此類賦形劑為慣用於調配供單位劑量或多劑量形式之非經腸給予或供藉由連續或週期性輸注來直接輸注之藥劑的物質。
FIP可藉由習用生藥技術合宜地調配成上述單位劑型。此類技術包括使FIP與生理上可接受的載劑、稀釋劑、佐劑及/或多種賦形劑結合在一起的步驟。一般而言，調配物係藉由使FIP和液體載劑或細微化固體載劑或此兩者均勻且緊密地結合在一起來進行製備，隨後視必要性塑形成產品。
該FIP係以一治療有效量給予個體，以引起研究人員、獸醫、醫師或其他臨床人員在細胞、組織、系統、動物或人類中所追求的生物學或醫學反應，以穩定、改善或減輕該個體病況的症狀，例如在該個體中降低腫瘤生長、癌症的細胞遷移、轉移或復發和引發腫瘤縮小。因 此，用語「有效量」與用詞「以一有效量給予(in an amount effective to)」在本案係互換地使用並意欲指稱產生醫藥效應的FIP份量，當該有效量的FIP被給予個體時，觀察到上述症狀減少。儘管有效量通常藉由彼等所具有的效應相較於在不包括本案所述FIP的一組成物(即對照組)給予類似情況患者觀察到的效應決定，但實際劑量係依據所選定的特定投藥途徑來計算。實際劑量可依據所選定的特定投藥途徑來計算。為決定適當投藥劑量所必要的進一步精細計算係由具本領域通常知識者以常規方式進行。於是，在給予一人類個體時，FIP係較佳地每日、每週或一週兩次給予一介於0.01毫克/公斤體重/日至100毫克/公斤體重/日之間，更佳0.1毫克/公斤/日至10毫克/公斤/日的份量。視藥劑調配物的藥動學參數與使用的投藥途徑而定，可重複多劑投藥。
下列實施例係給定僅供例示目的，而非意欲限制本發明之範疇。應注意到，在以下說明的實施例中，執行配對司徒登氏t測試(Student's t test)是為了統計分析所指群體之間的西方印跡的帶強度差異以及細胞活動性的定量估算。定量數據係以平均±變異數(C.V.)表示，在各圖中以誤差線顯示。所指分子在免疫組化影像的再現性是使用費雪氏精確v2測試(Fisher Exact v2 test)以分類數據來統計分析。
實施例1：建立供FIP-gts臨床前試驗用的患者衍生HCC
臨床衍生的HCC細胞系是以經過患者同意和佛 教慈濟綜合醫院研究倫理委員會(IRB 101-62)批准的手術獲得的HCC組織中之一部分所建立。簡言之，HCC組織係以膠原蛋白酶預處理，接著在絲裂黴素處理過的NIH3T3滋養層上挑選HCC細胞系，共4-6個繼代。獲得同質的HCC細胞群體並測試它們在活體外與活體內的持續增生能力(超過20個繼代)與轉移潛力。HCC腫瘤細胞系的特徵是藉由偵測超過40個繼代之後的HCC腫瘤標記來確認，例如磷脂醯肌醇聚醣3(Glypican 3；GCP3)。
患者衍生的HCC細胞系被建立且其表型被鑑定。展示了9個HCCs(分別稱作HCC329、328、326與340、353、365、363、372、274)的形態(圖1A)。若干細胞系(HCC329、353、365、363與372)展現出間質表型，而其餘(例如HCC340、374)則展現出上皮表型。
實施例2：傷口癒合遷移試驗
將HCC細胞培養在設置有傷口癒合培養***物的24孔盤上，直至細胞匯聚，接著使細胞血清飢餓達24小時，隨後將培養***物移除。在適當處理後，在指定時間使用相位差顯微鏡拍攝照片。實施例1所述HCC細胞系的活動性的定量分析是使用取自於NIH網頁的Image J.軟體直接計數於48小時遷移至空白區域的細胞來進行。結果顯示於圖1B。一般而言，間質HCCs的活動性比上皮HCCs的活動性更高。在彼等當中，間質表型HCC329與HCC372展現出最高的活動性，上皮型HCC340與HCC374展現出最低的活動性(圖1C)。
實施例3：分析患者衍生HCCs的訊息傳導
涉及HCCs腫瘤惡化的關鍵性訊息傳導成員，包括c-Met、ERK、JNK與AKT的狀態進一步在實施例1所建立的患者衍生細胞系與習用HCC細胞系HepG2中檢視。從這些細胞中收集到總蛋白質，並使其接受免疫印跡分析，使用GAPDH作為載入對照組。p-c-Met、p-JNK、p-ERK、p-樁蛋白(p-paxillin；S178)、GAPDH和ERK的抗體購自Santa Cruz Biotechnology(California,USA)。印跡上的譜帶強度以Image J.軟體加以定量。圖2顯示的結果代表2個再現性實驗。
如圖2所示，c-Met(β次單元，M.W.140kD)在HCC 372、340與HepG2內高度表現，在HCC374稍微偵測到，但在其餘細胞系皆未觀察到。已經知道c-Met的二聚化會活化激酶區域的酪胺酸殘基(Tyr1234)的磷酸化作用，這導致各種胞質效應子蛋白之羧基末端的受質結合部位(Tyr1349與Tyr1356)的磷酸化作用。相似於c-Met的表現模式，在HCC372與HCC340中偵測到c-Met(p-c-Met)於Tyr1234的磷酸化，在HepG2與HCC374中稍微偵測到，但在其餘HCCs皆未觀察到。在HCC372中，觀察到p-c-Met(Tyr1234)下方有一極強譜帶(以*予以標記)，其仍有待辨識。此外，其餘兩種磷酸化-c-Mets(於Tyr1356與Tyr1349)在全部細胞系皆未偵測到(資料未顯示)。至於下游訊息傳導成員，磷酸化的JNK(p-JNK)在大部分HCCs中極多，在HCC340與HepG2中則相對較低。另一方面， 磷酸化的ERK1與2(p-ERK1與p-ERK 2)這兩者的位準在HCC340明顯較高及在HepG2則相對較高。再者，p-ERK2(但非p-ERK1)在HCC372中極高，而p-ERK1(但非p-ERK2)分別在HCC328與HCC326中極高與相對較高。在包括HCC329、HCC353、HCC363、HCC365和HCC374的其他HCCs中，僅檢測到少許p-ERK1。此外，可在大部分HCCs中偵測到豐富的p-AKT。總而言之，儘管c-Met訊息傳導僅在若干細胞系為陽性(包括HCC340、372、374與HepG2)而在其餘為陰性(包括HCC326、329、353、363、365)，但下游ERK、JNK與AKT在大部分HCCs皆有活性。據此，這些HCCs中存在有c-Met依賴型和非依賴型訊息傳導。
實施例4：製備FIPs
序列辨識編號第1號的FIP-gts如WO2005/040375A1所述在啤酒酵母宿主細胞內重組表現。表現FIP-gts的細胞被打碎、離心，並使上清液通過濾網與分子篩，以獲得介於10kDa與100kDa之間的蛋白質。濾液進一步使用FPLC以Superdex® 75管柱(GE Healthcare)純化。純度經FPLC測定為超過95%。
使用本案中所陳述的相同方法製得FIP-fve(序列辨識編號第2號)、FIP-vvo(序列辨識編號第3號)和FIP-gmi(序列辨識編號第6號)，依此製備的蛋白質被發現有超過95%的純度。
實施例5：FIP-gts對HCCs轉移性表型的壓制效應
在實施例2中所辨識出最具活動性的HCC細胞系，也就是HCC372與HCC329，被運用在測試FIP-gts對於HCC的分子與細胞效應，並與c-Met催化活性的ATP-競爭性抑制劑JNJ-38877605(下文縮寫為JNJ)作比較。在細胞增生試驗中，HCC329與HCC372細胞未經處理或經0.5、1.0或2.0微克/毫升的FIP-gts(於實施例4中製備)處理72小時。將細胞數目計數，個別處理組的相對倍增時間是藉由將未處理組的數據取作100%來測定。重複實施例2所示傷口癒合遷移試驗，不同之處在於HCC329與HCC372分別另以FIP-gts與JNJ(MedKoo Biosciences,Chapel Hill,NC,USA)處理48小時。相對遷移量是藉由將未處理細胞(Con)的活動性取作1.0來進行定量分析。結果顯示於圖3A與3B，其中符號(**)、(*)與(#)代表所指經抑制劑處理的樣本與未經處理之HCC329或HCC372對照組之間的統計顯著性(分別為p<0.005與p<0.05，n=3)。
如圖3A所示，0.5、1.0與2.0微克/毫升FIP-gts劑量相依性地增加了HCC329與HCC 372的倍增時間，分別達25-46%與14-47%，這顯示它對於兩種HCCs的抗增生活性。
進一步檢視FIP-gts對於兩種HCC的細胞遷移效應。如圖3B所示，FIP-gts(2.0微克/毫升)大幅地壓制HCC372的細胞遷移，達95%。一般而言，c-Met專一性拮抗劑JNJ-38877605(JNJ，IC50：26.5nM)壓制HCC372的遷移，達50%。另一方面，FIP-gts與JNJ壓制HCC329的細 胞遷移，分別達到80%與15%。值得注意的是，JNJ在HCC372中的抑制程度高於其在HCC329中所得者。此可以c-Met訊息傳導在HCC372中而非在HCC329中活躍來解釋。此外，相較於單獨以FIP-gts處理，FIP-gts和JNJ的組合並未顯現對於阻斷兩種HCCs遷移具有增強效應(資料未顯示)。綜言之，FIP-gts可以壓制c-Met陽性與陰性HCCs兩者的恆常性細胞遷移與細胞增生。
在另一實驗中，運用了傳統用於觀察受HGF-引發的分子與細胞效應的人類肝癌細胞系HepG2，它是一種不具活動性的HCC細胞系。在此實驗中，再次重複實施例2所述傷口癒合遷移試驗，不同之處在於HepG2(購自Bioresource Collection and Research Center(BCRC),Hsinchu,Taiwan)是在存有或不存有25nM HGF(PeproTech Inc.,Rocky Hill,NJ,USA)的條件下經過FIP-gts或JNJ-38877605處理48小時。相對遷移量是藉由將未處理細胞(Con)的活動性取作1.0來定量地分析。結果顯示於圖3C，其中符號(**)代表所指經HGF或抑制劑處理的樣本以及單獨以HGF處理組之間的統計顯著性(p<0.005,n=3)。與圖2B所示的數據一致，FIP-gts(2.0微克/毫升)阻止了受HGF-引發的HepG2細胞遷移，相較於JNJ(26.5nM)遠為有效(圖3C)。
實施例6：FIP-gts在SCID小鼠中壓制HCC329的腫瘤發展
FIP-gts對於HCC329的腫瘤發展與轉移的壓制效應是在嚴重合併性免疫不全(SCID)小鼠模型中驗證。將 懸浮於100微升杜氏改良之伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM；Gibco,Grand Island,NY,USA)的HCC329細胞(約2×107個)直接注射至SCID小鼠的肝中葉的漿膜下層，接著每週兩次於腹腔內給予DMEM作為載劑，抑或是含有FIP-gts(4.0-20微克/克小鼠)或JNJ(0.5-2.0毫微莫耳/克小鼠)的載劑。
小鼠在注射2個月後犧牲。測量腫瘤質量並記錄肝內轉移及/或肝外轉移的發生。在左或右葉上觀察到直徑大於0.1-0.2公分的結節被視為繼發腫瘤病灶。肝內轉移被定義為在經處理小鼠的左及/或右肝葉觀察到至少兩個繼發腫瘤病灶的情況。肝外轉移被定義為腫瘤出現在肝以外的器官，例如腸內的情況。在動物實驗期間，遵循照護和使用實驗動物的相關法規。此經慈濟大學的機構動物照護和使用委員會(IACUC)批准(同意書編號：102080)。
如圖4的白色箭頭所指，就SCID小鼠模型的HCC329而言，在培養基-與JNJ-處理組的左與右肝葉上觀察到繼發腫瘤，而FIP-gts-處理組顯示正常的肝葉結構，這指出FIP-gts大幅地壓制了腫瘤發展，包括原發腫瘤生長與內部轉移(費雪氏測試p<0.05，N=3)。相較之下，c-Met抑制劑JNJ對於HCC329腫瘤發展的效應並不突出(圖4)。FIP-gts對於SCID小鼠的毒性測試是藉由處理未接種HCC329的4隻正常SCID小鼠來進行。在腹腔內投予FIP-gts(20微克/克小鼠)2-3個月後，以動物活力與每個器官的完整性的角度觀之，沒有觀察到不利的效應(資料未顯 示)。
實施例7：FIP-gts在HCCs對c-Met依賴型與非依賴型訊息傳導的效應
為了探討FIP-gts在壓制HCCs腫瘤發展的分子機制，於HCCs中檢視FIP-gts對於c-Met依賴型訊息傳導途徑中所存在的關鍵成員，包括c-Met、磷酸化c-Met(p-c-Met)與下游效應子p-JNK與p-ERK的活性及/或含量的效應。HCC329與HCC372細胞以FIP-gts(2微克/毫升)處理4或24小時。從細胞收集到總蛋白質並使其接受免疫印跡分析，使用GAPDH作為載入對照組。p-c-Met、p-JNK、p-ERK、p-樁蛋白(S178)、GAPDH與ERK的抗體購自Santa Cruz Biotechnology(California,USA)。印跡上的譜帶強度以Image J.軟體定量。個別分子的譜帶強度是將未經處理的HCC372或HCC329的數據取作1.0來計算。結果顯示於圖5A與5B，其中(**)(##)與(*)(#)代表所指經抑制劑處理的樣本與未經處理之HCC329或HCC372對照組之間的統計顯著性(分別為p<0.005與p<0.05，n=3)。
如圖5A與5B所展示，在HCC 329中，FIP-gts(2.0微克/毫升)在處理24小時後減少JNK、ERK與AKT的磷酸化作用，分別達85、51與18%。FIP-gts對於HCC372訊息傳導的效應在幾個方面不同於HCC329。首先，FIP-gts的壓制效應在HCC372中較早觀察到(於3-4小時)，比起HCC329(於24小時)為早。再者，FIP-gts在c-Met陽性HCC372中可以使c-Met相關信號分子產生變化，在 HCC329中則否。如圖5A與5B所展示，Met蛋白的表現被FIP-gts大大地壓制，在HCC372中早在第4個小時即達90-95%，其可持續直至24小時(未顯示)。與此數據一致，FIP-gts在第4個小時顯著地壓制了Met的磷酸化(於Tyr1234處)達55%，以及大大地壓制了ERK與AKT的磷酸化達80-95%(圖5A與5B)。反之，FIP-gts在HCC372中完全未減少p-JNK。綜言之，FIP-gts在c-Met陽性與陰性HCCs兩者中皆可以壓制關鍵信號分子的活性。
另一研究顯示，相較於未經處理的HCC329中所觀察到者(資料未顯示)，在經FIP-gts處理16小時的HCC329中，磷酸化EGFR(p-EGFR)明顯地減少。在傷口癒合試驗給予EGFR抑制劑，包括AG1748和SU5416，會壓制HCC329的細胞遷移達80%，而且在4至16小時內減少p-JNK位準達30%(資料未顯示)。這些發現指出，EGFR-JNK訊息傳導，而非HGFR訊息傳導，主導了HCC329細胞遷移的調控，而此可被FIP有效地壓制，而且FIP似乎藉由多重機制來壓制腫瘤發展，包括藉由抑制c-Met訊息傳導途徑以及藉由抑制EGFR訊息傳導途徑。此一多樣性因而可提供重大的臨床優勢，因為在給予患者FIP之前不需要針對c-Met來篩選HCC患者。
實施例8：FIP-gts在HCC中對於受HGF-引發的c-Met依賴型訊息傳導的效應
HepG2細胞在存有或不存有HGF(25nM)下以FIP-gts(2.0微克/毫升)處理0.5小時。從細胞收集到總蛋 白質，並進行實施例6中所述免疫印跡分析，不同之處在於使用ERK作為載入對照組。結果顯示圖5C與5D，其中(**)代表所指經HGF/FIP-gts共同處理的樣本與單獨以HGF處理組之間的統計顯著性(p<0.005，n=3)。
如圖5C所展示，FIP-gts在HepG2大大地壓制HGF-引發的c-Met訊息傳導，包括p-c-Met、p-JNK、p-ERK與磷酸化樁蛋白(於Ser 178)，達85-90%(圖5D)。
綜合實施例7與8的結果，本發明發現到FIP-gts在HCCs中能夠壓制恆常性與受HGF-引發的c-Met訊息傳導、還有恆常性c-Met非依賴型訊息傳導。實施例5與7所示結果更指出，c-Met依賴型訊息傳導被FIP所阻斷乃是HCC細胞遷移減少的主因。
實施例9：FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo對HCCs的壓制效應
在存有或不存有實施例4所製備之1、2.5與5微克/毫升FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo的條件下，將實施例2中所建立的HCC372與HCC329細胞系以1×105個細胞/孔的濃度培養在補充有1%熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco,NY,USA)的杜氏改良伊格爾培養基(DMEM；Sigma,St.Louis,MO,USA)的24孔盤中，歷時48小時。將上清液移除並於每孔加入25微升溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的2.5毫克/毫升MTT(3-[4,5-二甲基吡啶-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物；Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)。將該盤於37℃培育1小時，以容許MTT轉變成不溶於水的甲臢結晶。隨後，將上清液移除並將二甲亞碸(DMSO)加至所有孔中， 徹底混合，以溶解深藍色結晶。置於室溫幾分鐘以確保所有結晶完全溶解後，於570nm讀取盤。相對存活率是以將未經處理細胞(Con)的數量取作100%來計算。結果顯示於圖6A與6B，其中數據是代表4個再現性實驗。
結果顯示FIP-gmi分別於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC372的生長達23%與96%，並分別於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC329的生長達23%與94%。進一步顯示FIP-vvo分別於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC372的生長達48%與96%，並分別於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC329的生長達54%與95%，同時FIP-fve於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC372的生長達13%，並分別於2.5微克/毫升與5微克/毫升的濃度下壓制了HCC329的生長達18%與22%。和實施例5所示使用FIP-gts所獲得的結果一致，顯示出FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo能夠抑制c-Met陽性與陰性HCCs兩者的細胞增生。
再者，檢視三種FIPs對兩種HCC細胞的遷移效應。將HCC372與HCC329細胞種在置於完全培養基的24-孔透孔遷移***物上(Nalge Nunc International Corp.,Rochester,NY,USA)，歷時24小時。以FIP-gmi(3微克/毫升)、FIP-fve(10微克/毫升)與FIP-vvo(2.5微克/毫升)處理48小時後，將已遷移至***膜底側的細胞以0.3%結晶紫加以染色。用棉棒刮擦該***膜頂側上的細胞。使用相位差顯微鏡以放大200倍拍攝底側上的遷移細胞。
如圖7所展示，FIP-gmi與FIP-vvo大幅地壓制了HCC329與HCC372的細胞遷移達95-99%，而FIP-fve僅稍微抑制HCC372與HCC329的細胞遷移。和實施例5所示FIP-gts的結果一致，顯示FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo能夠抑制c-Met陽性與陰性HCC細胞兩者的遷移。
實施例10：FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo在HCCs中對於c-Met依賴型訊息傳導的效應
重複實施例7所述實驗，不同之處在於以FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo取代FIP-gts來處理HCC329和HCC372。西方印跡分析的結果顯示於圖8。和實施例7所示使用FIP-gts所獲得的結果一致，顯示在HGFR-陽性HCC細胞系HCC372中，c-Met、p-c-Met與p-JNK被FIP-gmi、FIP-fve與FIP-vvo顯著地壓制，表示這三種FIPs如同FIP-gts一樣，對於c-Met依賴型訊息傳導展現抑制活性，其結果是可以經由阻斷c-Met依賴型訊息傳導來壓制HCC372的細胞遷移和轉移。此外，由於c-Met實質上未表現於HCC329，所以FIP-gmi、FIP-fve和FIP-vvo對於HCC329的抑制效應必須經由阻斷c-Met非依賴型訊息傳導，例如EGFR-依賴型訊息傳導途徑，才能發生作用。
儘管本發明已參照以上較佳具體例說明，應認知到較佳具體例係僅為例示目的給予而非意圖限制本發明之範疇，可進行對熟習相關技藝者而言極為明顯的各種更動與改變，而無逸離本發明精神與範疇。
本案提到的所有論文、刊物、文獻、專利、專 利申請案、網址、及其他印刷或電子文件-包括但不限於下文所列參考文獻-係以參照方式整體併入。若有衝突，將以本說明-包括定義-為準。
<110> 益生生技開發股份有限公司
<120> 用於治療C-MET相關性癌症的方法和組成物
<160> 8
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> 松杉靈芝(Ganoderma tsugae)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(111)
<400> 1
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 金針菇(Flammulina Velutipes)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(114)
<400> 2
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> 草菇(Volvariella volvacea)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(112)
<400> 3
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 赤芝(Ganoderma lucidum)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(111)
<400> 4
<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 紫芝(Ganoderma japoncium)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(111)
<400> 5
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 小孢子靈芝(Ganoderma microsporum)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(111)
<400> 6
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 甜芝(Ganoderma sinense)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(111)
<400> 7
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 紅球叢赤殼菌(Nectria haematococca)
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)...(114)
<400> 8

Claims (12)

  1. 一種真菌免疫調節蛋白(FIP)在製造一醫藥品上的用途，該醫藥品用於抑制一細胞內的肝細胞生長因子受體(HGFR)活性。
  2. 如請求項1之用途，其中該細胞衍生自於HGFR-相關性癌症，而該HGFR-相關性癌症選自於由肝細胞癌、遺傳型和散發型人類乳突性腎癌、卵巢癌、***癌、膽囊癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、頭頸鱗狀細胞癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胸膜間皮瘤、大腸癌、骨原性肉瘤、淋巴瘤和多發性骨髓瘤所組成的群組。
  3. 一種真菌免疫調節蛋白(FIP)在製造一醫藥品上的用途，該醫藥品用於抑制一個體內的肝細胞癌之轉移。
  4. 一種真菌免疫調節蛋白(FIP)在製造一醫藥品上的用途，該醫藥品用於預防一個體內的肝細胞癌之復發。
  5. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該肝細胞癌為HGFR-陽性肝細胞癌。
  6. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該肝細胞癌為HGFR-陰性肝細胞癌。
  7. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該FIP與序列辨識編號第1號的胺基酸序列具有至少57%之胺基酸相同性。
  8. 如請求項7之用途，其中該FIP具有一選自於由下列所組成之群組中的胺基酸序列：序列辨識編號第1號、序列辨識編號第2號、序列辨識編號第3號、序列辨識編號第4號、序列辨識編號第5號、序列辨識編號第6號、序列辨識編號第7號與序列辨識編號第8號。
  9. 如請求項8之用途，其中該FIP具有序列辨識編號第1號之胺基酸序列。
  10. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該FIP呈口服給予形式。
  11. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該FIP呈非經腸給予形式。
  12. 如請求項3、4中任一項之用途，其中該個體選自於由人類和非人類脊椎動物所組成之群組。
TW104127751A 2014-09-02 2015-08-25 用於治療ｃ－ｍｅｔ相關性癌症的方法和組成物 TWI657821B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462044415P 2014-09-02 2014-09-02
US62/044,415 2014-09-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201628640A TW201628640A (zh) 2016-08-16
TWI657821B true TWI657821B (zh) 2019-05-01

Family

ID=55439128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104127751A TWI657821B (zh) 2014-09-02 2015-08-25 用於治療ｃ－ｍｅｔ相關性癌症的方法和組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170368119A1 (zh)
CN (1) CN107106645A (zh)
TW (1) TWI657821B (zh)
WO (1) WO2016034081A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9937226B2 (en) * 2014-12-29 2018-04-10 Mycomagic Biotechnology Co., Ltd. Use of immunomodulatory protein from ganoderma in inhibiting cancer stem cells
TW201728336A (zh) * 2016-02-05 2017-08-16 台灣原生藥用植物股份有限公司 用以抑制腎癌細胞增生與改善腎功能之靈樟芝組合物
CN107118263B (zh) * 2017-04-08 2020-07-03 张喜田 重组灵芝免疫调节蛋白突变体及其应用
US11058746B2 (en) * 2017-09-25 2021-07-13 Mycomagic Biotechnology Co., Ltd. Use of immunomodulatory protein from Ganoderma in inhibiting fibrosis
TWI725580B (zh) * 2019-10-18 2021-04-21 臺中榮民總醫院 重組微生物、其代謝物、及其用於治療或/及預防脂肪肝及心血管疾病之用途
CN111454335B (zh) * 2020-04-28 2022-09-23 上海市农业科学院 一种蛋白amu3及其在制备抗肺癌药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1939532A (zh) * 2005-09-23 2007-04-04 益生生技开发股份有限公司 真菌免疫调节蛋白之用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI328038B (en) * 2003-09-17 2010-08-01 Yeastern Biotech Co Ltd Fungal immunomodulatory protein (fip) prepared by microorganisms and uses thereof
US8629096B2 (en) * 2005-09-23 2014-01-14 Yeastern Biotech Co., Ltd. Compositions comprising fungal immunomodulatory protein and use thereof
US8569360B2 (en) * 2008-04-01 2013-10-29 Donald P. Bottaro Compositions and methods for inhibition of hepatocyte growth factor receptor c-Met signaling

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1939532A (zh) * 2005-09-23 2007-04-04 益生生技开发股份有限公司 真菌免疫调节蛋白之用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
You, W. K., & McDonald, D. M. (2008). The hepatocyte growth factor/c-Met signaling pathway as a therapeutic target to inhibit angiogenesis. BMB reports, 41(12), 833-839. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170368119A1 (en) 2017-12-28
WO2016034081A1 (en) 2016-03-10
CN107106645A (zh) 2017-08-29
TW201628640A (zh) 2016-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI657821B (zh) 用於治療ｃ－ｍｅｔ相關性癌症的方法和組成物
JP7095028B2 (ja) 薬学的組成物及び方法
Cintra et al. Interleukin-10 is a protective factor against diet-induced insulin resistance in liver
CA2909349C (en) Use of a multi-agent composition for treatment of cancer
CN112386678B (zh) 多肽或其衍生物的应用
US20200384001A1 (en) Composition for prevention or treatment of neuroinflammatory disease, containing protein tyrosine phosphatase
CN107847551A (zh) 具有抗病毒作用的肽和包含其的组合物
JP2019537608A (ja) 癌の処置のための医薬組成物および方法
JP6062108B2 (ja) Ａｄｋタンパク質を有效成分として含む敗血症または敗血症性ショックの予防または治療用組成物
US20180243366A1 (en) Drug containing recombinant mistletoe lectins for treating malignant melanoma
KR102261371B1 (ko) CP2c 표적 펩티드 기반 항암제
KR102230547B1 (ko) 종양에 대한 직접적 억제 효과를 갖는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도
TW201204345A (en) Use of curcumin or its analogues in cancer therapy utilizing epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor
JP6397122B2 (ja) 血管新生関連疾患を治療するためのペプチドの使用
KR20060126631A (ko) 인터페론-타우의 의약으로서의 용도
KR101996490B1 (ko) 간질환 예방 또는 치료용 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물
KR102561720B1 (ko) 종양에 대한 직접적인 억제 효과를 갖는 인터페론의 결정 방법 및 그 용도
US20060159658A1 (en) Methods of treating disease with glycosylated interferon
Ou et al. Marine bromophenols suppressed choroidal neovascularization by targeting HUWE1 through NF-κb signaling pathway
Ballon New drugs
KR20180126273A (ko) 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩타이드-38을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물
Han et al. Therapeutic Effect of Shp2 Inhibition Combined with Regorafenib in Advanced Colorectal Cancer