TWI654993B - 陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途 - Google Patents

陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI654993B
TWI654993B TW106137957A TW106137957A TWI654993B TW I654993 B TWI654993 B TW I654993B TW 106137957 A TW106137957 A TW 106137957A TW 106137957 A TW106137957 A TW 106137957A TW I654993 B TWI654993 B TW I654993B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
hydrogen phosphate
calcium hydrogen
antigen
microparticles
Prior art date
Application number
TW106137957A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201828983A (zh
Inventor
Chien Hsiung Pan
潘建雄
Guo Chung Dong
董國忠
Hsin Wei Chen
陳信偉
Original Assignee
National Health Research Institutes
財團法人國家衛生研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Health Research Institutes, 財團法人國家衛生研究院 filed Critical National Health Research Institutes
Publication of TW201828983A publication Critical patent/TW201828983A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI654993B publication Critical patent/TWI654993B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1611—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明係關於一種以陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子做為遞送疫苗之載體之用途，該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子係以磷酸氫鈣(calcium hydrogenphosphate；CHP)修飾其表面，於本發明中，以此磷酸氫鈣修飾之陶瓷聚合物微粒子所製備之疫苗，顯現出較低的毒性，並可延長抗原之停留時間且增強免疫反應。

Description

陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途
本發明係關於一種以陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子所製備之蛋白質疫苗，尤其特指一種以表面經陽離子修飾之磷酸氫鈣(calcium hydrogenphosphate；CHP)微粒子所製備之次單元疫苗。
接種疫苗之安全性係當前越來越受關注之議題，因此，開發新穎技術以製備更安全且更有效之疫苗用以預防新興傳染病乃當務之急；蛋白質疫苗(protein vaccine)係一類對於人類來說具備安全性之優良疫苗，然而，蛋白質疫苗尚具有需要額外的佐劑或者透過新的免疫途徑來彌補其免疫力低於其他種類疫苗等缺點，並仍需克服其缺乏誘導CD8 T淋巴細胞免疫反應之問題，同時仍需持續開發具有安全性、有效性及足夠的免疫原性的蛋白質疫苗。
聚乳酸-甘醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)係聚乳酸(poly lactic acid,PLA)和聚乙醇酸(poly glycolic acid,PGA)的共聚物，其用於藥物遞送之設計及成效已被明確定義，由於其具有長期於臨床之使用經驗、良好的降解特性和持續給藥的可能性，聚乳酸-甘醇酸共聚物在各種適用於生物之可降解聚合物中最受青睞，近期的文獻亦揭示聚乳酸-甘醇酸共聚物之降解可以用於以期望的劑量持續釋放藥物而無需進行外科手術，然而，用於製備聚乳酸-甘醇酸共聚物的陽離子表面活性劑仍存在生物毒性的問題。
美國專利公開案US 2004/0013742 A1揭示了一種用於成骨細胞或骨髓基質細胞生長之生物可降解陶瓷，其具備骨傳導和骨誘導性質，該新穎之陶瓷包含以六亞甲基二異氰酸酯(hexamethylene diisocyanate,HMDI)修飾之磷酸氫鈣(calcium hydrogenphosphate,CaHPO4)，六亞甲基二異氰酸酯係透過共價鍵被接枝到磷酸氫鈣上，因而使磷酸氫鈣之表面帶有正電荷，且其生物毒性低於習知用於藥物遞送之帶正電荷的CTAB-PLGA。
在先前的研究中，我們使用修飾磷酸氫鈣的生物陶瓷作為載體，將骨碎補(Gu-Sui-Bu)運送到骨細胞培養系統中，並評估骨碎補固著於磷酸氫鈣(Gu-Sui-Bu-immobilized modified calcium hydrogenphosphate,GI-MCHP)作用於骨細胞之活性(Biomaterials 24(2003)873-882)，據此，本發明進一步探討疫苗製劑之相關應用。
基於上述之目的，本發明提供一種陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物，用以做為蛋白質疫苗中的抗原載體。
據此，於一方面，本發明係有關於一種蛋白質疫苗組成物，其係包含一蛋白質或一胜肽抗原，以及一陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物 微粒子，所述之陶瓷聚合物微粒子係用以將該蛋白質或該胜肽抗原吸附於於其陽離子表面。
於一實施例中，該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子係經表面修飾之一磷酸氫鈣(calcium hydrogenphosphate,MCHP)修飾微粒子。
於一實施例中，該磷酸氫鈣修飾微粒子之粒徑係介於0.1至10微米(μm)。
於一實施例中，該磷酸氫鈣修飾微粒子之表面電位係介於+1至+50毫伏(mV)，較佳者，係介於+1至+40毫伏(mV)。
於一實施例中，該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子之抗原吸附率(antigen adsorption rate)係每毫克(mg)之該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子吸附0.1至100微克(μg)之該蛋白質或該胜肽抗原。
於一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一腫瘤抗原。
於另一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一病毒抗原；於本文中，「胜肽」(peptide)及「多胜肽」(polypeptide)為相互通用之名詞。
於一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一登革熱病毒次單元；於另一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含登革熱病毒套膜結構域III(ED3)胜肽，較佳者，係第二型登革熱(dengue-2)之登革熱病毒套膜結構域III(ED3)胜肽。
於一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一細菌抗 原；於另一實施例中，該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一真菌抗原。
於另一方面，本發明係關於一種以表面修飾之磷酸氫鈣(modified calcium hydrogenphosphate；MCHP)作為抗原載體以製備蛋白質疫苗之用途。
圖1係以表面修飾磷酸氫鈣(modified calcium hydrogenphosphate；MCHP)微粒子製備次單位疫苗(subunit vaccine)之示意圖。
圖2係說明表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之蛋白疫苗於活體外之蛋白質吸附特性(protein adsorption)；磷酸氫鈣-卵清白蛋白(ovabumin,OVA)疫苗係以0.1%之氫氧化鈉(NaOH)及2%之十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)處理以沖提所吸附之卵清白蛋白，並以蛋白質定量套組(micro-BCA kit)進行卵清白蛋白定量；卵清白蛋白定量圖係分別顯示吸附於聚乳酸-甘醇酸共聚物(PLGA(+))或磷酸氫鈣之卵清白蛋白，其定量後之平均值及標準差。
圖3係說明控制表面修飾磷酸氫鈣製備之蛋白疫苗於活體內之釋放動態；BALB/c小鼠係分別以皮下注射2組樣本，分別為螢光染劑(Alexa Fluor® 647)標記之溶解態卵清白蛋白，或螢光染劑(Alexa Fluor® 647)標記之磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗，並透過活體影像系統(IVIS)監測螢光衰退，圖3A及圖3B係分別顯示平均螢光強度及活體影像。
圖4係說明磷酸氫鈣濃度之最佳化以強化蛋白疫苗之免疫原性 (immunogenicity)；C57BL/6小鼠(n=4)係分別以皮下注射4組樣本，分別為(1)0.5微克(μg)之卵清白蛋白、(2)10微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗、(3)1微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗及(4)0.25微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗；圖4A係顯示以酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析對卵清白蛋白具專一性之T淋巴細胞反應；圖4B係顯示以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析對卵清白蛋白具專一性之免疫球蛋白(IgG)效價；分析結果係將各別從三隻小鼠所獲得之數值計算過後，以平均值及標準差呈現，並以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
圖5係說明表面修飾磷酸氫鈣製備之蛋白疫苗確實誘發增強免疫原性及毒殺型T淋巴細胞反應；C57BL/6小鼠係分別以皮下注射2組樣本以進行評估，分別為溶解的卵清白蛋白，或磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗；圖5A係顯示以酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析對卵清白蛋白具專一性之產生干擾素-γ(interferon-γ；IFN-γ)之T淋巴細胞反應；圖5B係顯示以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析對卵清白蛋白具專一性之免疫球蛋白(IgG)產量；分析結果係取各小鼠所獲得之數值並以Student’s test進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
圖6係說明表面修飾磷酸氫鈣製備之第二型登革熱(dengue-2)次單元疫苗確實增強專一性T淋巴細胞反應；圖6A及圖6B係分別顯示產生干擾素-γ及產生介白素-4(interleukin-4；IL-4)之T淋巴細胞反應，其係將BALB/c小鼠(n=4)以皮下注射3組樣本，分別為(1)磷酸緩衝溶液(PBS)、(2)10微克已溶解的第二型登革熱病毒(D2)套膜結構域III(ED3)重組蛋白或(3)磷 酸氫鈣製備-二型登革熱病毒套膜結構域III(MCHP-D2)抗原疫苗，並以酶聯免疫斑點法進行分析；實驗結果係以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
圖7係說明表面修飾磷酸氫鈣製備之第二型登革熱(dengue-2)次單元疫苗確實增強抗體反應；實驗係以酵素結合免疫吸附分析法分析對第二型登革熱病毒(D2)具有專一性之免疫球蛋白(IgG)效價，實驗結果係以one-way ANOVA進行統計分析。
圖8係說明表面修飾磷酸氫鈣製備之第二型登革熱(dengue-2)次單元疫苗確實增強病毒清除率；實驗係於最後一次免疫接種四週後以第二型登革熱病毒攻毒，而後取得病毒血症(viremia)的血液以溶斑試驗(plaque assay)定量登革熱病毒；實驗結果係以two-way ANOVA進行統計分析。
為了闡明本發明之特點，以下結合圖式以說明本發明之較佳實施例，而非用以限制本發明之技術，在不脫離本發明之新穎概念的精神和範圍的情況下，其中的變化和修改均被包含於本發明之範圍內。
實施例1、以表面修飾磷酸氫鈣(MCHP)製備登革熱蛋白疫苗
表面修飾磷酸氫鈣之微粒子經秤重後轉移到1.5毫升(ml)微量管中，以冰磷酸緩衝溶液(PBS)沖洗後再重新懸浮於冰磷酸緩衝溶液中，每一劑量係將10-0.25毫克(mg)表面修飾磷酸氫鈣微粒子懸浮於200微升(μl)冰磷酸緩衝溶液中，接著再取10-1微克(μg)第二型登革熱病毒套膜結構域III(D2-ED3)重組蛋白加入前述表面修飾磷酸氫鈣微粒子懸浮液中，於4℃下以垂直旋轉的方式隔夜混合以進行蛋白質吸附，經蛋白質吸 附之流程後，即獲得磷酸氫鈣-第二型登革熱病毒套膜結構域III(D2-ED3)蛋白疫苗；於本實施例中，較佳者，係以10微克第二型登革熱病毒套膜結構域III重組蛋白及10毫克表面修飾磷酸氫鈣微粒子於200微升磷酸緩衝溶液中製備該登革熱蛋白疫苗。
圖1係顯示以表面修飾磷酸氫鈣(MCHP)微粒子遞送疫苗之示意圖；簡言之，具備生物可降解性之陽離子型陶瓷聚合物微粒子與次單元抗原反應後即可形成磷酸氫鈣蛋白疫苗(例如：卵清白蛋白；OVA)，由於表面修飾磷酸氫鈣微粒子之粒徑僅介於5-0.5毫米(mm)，因此磷酸氫鈣製備之疫苗將優先被巨噬細胞或樹突細胞(dendritic cells；DC)吞噬並活化CD80/86的表現，在經蛋白裂解及交叉呈現(cross-presentation)後，胜肽將被呈現給具專一性之T淋巴細胞並誘發適應性免疫反應(adaptive immune response)。
實施例2、磷酸氫鈣蛋白疫苗於活體外之蛋白質吸附特性(protein adsorption)以及於活體內之控制釋放
蛋白吸附率測試
實驗係取10毫克陽離子型聚乳酸-甘醇酸共聚物微粒子或10毫克磷酸氫鈣微粒子，在4℃下分別於300微升磷酸緩衝溶液中與100微克卵清白蛋白(ovalbumin；OVA)隔夜旋轉混合，而後去除未吸附之卵清白蛋白，再以300微升磷酸緩衝溶液清洗微粒子，接著將微粒子沉降後，以100微升沖提緩衝液(包含0.2N NaOH及1% SDS)置於旋轉器上隔夜沖提，以獲得吸附在微粒子之卵清白蛋白，接著，經離心後以BCA protein assay定量上清液中卵清白蛋白之濃度。
圖2係顯示卵清白蛋白定量後之平均值及標準差，所述之卵清白蛋白係分別吸附於聚乳酸-甘醇酸共聚物微粒子(PLGA(+))或磷酸氫鈣微粒子，由結果可以得知，聚乳酸-甘醇酸共聚物微粒子及磷酸氫鈣微粒子之蛋白質吸附率幾乎相同，其蛋白質吸附率分別為每毫克聚乳酸-甘醇酸共聚物微粒子吸附2.81±0.71微克卵清白蛋白，以及每毫克磷酸氫鈣微粒子吸附2.47±0.41微克卵清白蛋白。
疫苗於活體內之釋放動態
實驗係分為2組，每組包含3隻BALB/c小鼠，分別以皮下注射不同樣本，其中一組是以50微克螢光染劑(Alexa Fluor® 647)標記之卵清白蛋白並溶於200微升磷酸緩衝溶液中，另一組則是螢光染劑(Alexa Fluor® 647)標記之磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗並溶於200微升磷酸緩衝溶液中，接著以活體影像系統拍攝活體影像並計算螢光強度，將標計螢光染劑之卵清白蛋白定量後，係於圖3A顯示每一區域之螢光強度，且於圖3B以縱向編排影像以顯示螢光衰減程度。
由圖3A及圖3B之結果指出，於注射樣本48小時後，磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗之蛋白量仍維持95%，相反地，未吸附於磷酸氫鈣之溶解態卵清白蛋白，其蛋白量在注射樣本48小時內已急遽下降至18%，且於注射樣本72小時後已無法偵測到螢光訊號；由此些結果可以得知，利用表面修飾磷酸氫鈣所製備之蛋白疫苗，能夠延長抗原維持於被免疫動物體內的時間，並可控制抗原之釋放。
實施例3、優化表面修飾磷酸氫鈣微粒子之使用劑量以增強疫苗之免疫原性
實驗係將C57BL/6小鼠分別以皮下注射4組不同樣本，分別為(1)0.5微克(μg)之卵清白蛋白、(2)10微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗、(3)1微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗及(4)0.25微克之磷酸氫鈣-0.5微克之卵清白蛋白疫苗，樣本皆溶於200微升磷酸緩衝溶液中，並於小鼠注射樣本兩週後接種相同的疫苗，於接種疫苗一週後犧牲小鼠並取得脾臟細胞，接著以酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析脾臟細胞中對卵清白蛋白具專一性之T淋巴細胞反應，並分別分析專一性T淋巴細胞產生干擾素-γ及介白素-4之產量，對干擾素-γ及介白素-4具專一性之斑點形成細胞(spot-forming cells；SFC)數量係扣除培養基背景值後計算而獲得，分析結果係計算各別從三隻小鼠所獲得之數值後，以平均值及標準差呈現，並以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
結果如圖4A所示，相較於10微克表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之卵清白蛋白疫苗，以0.25微克及1微克表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之卵清白蛋白疫苗具有較佳之增強免疫原性之效果。
此外，由磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗所誘導之抗體反應係透過分析對卵清白蛋白具專一性之免疫球蛋白(IgG)效價來評估，實驗係以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析，且分析結果係以各別從三隻小鼠所獲得之數值之平均值及標準差呈現，並以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異；結果如圖4B所示，相較於以10微克表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之卵清白蛋白疫苗，以0.25微克及1微克 表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之卵清白蛋白疫苗可誘發產生較高效價之免疫球蛋白；由上述結果可以得知，以0.25微克至1微克表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備蛋白疫苗，可達到增強疫苗免疫原性之效果，較佳者，係以1微克表面修飾磷酸氫鈣微粒子與0.5微克卵清白蛋白混合以製備成磷酸氫鈣卵清白蛋白疫苗。
實施例4、表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之蛋白疫苗可增強免疫原性及毒殺型T淋巴細胞反應
磷酸氫鈣蛋白疫苗誘發T淋巴細胞反應
實驗係將C57BL/6小鼠以皮下注射2組不同樣本以進行評估，分別為0.5微克已溶解的卵清白蛋白，或磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗，樣本皆溶於200微升磷酸緩衝溶液中，並於小鼠注射樣本兩週後接種相同的疫苗，於接種疫苗一週後犧牲小鼠並取得脾臟細胞，接著以酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析脾臟細胞中產生干擾素-γ之專一性T淋巴細胞反應，其係扣除培養基之背景值後，分別分析對卵清白蛋白具專一性、對CD-8之OT-1胜肽具專一性或對CD-4之OT-2胜肽具專一性之斑點形成細胞數量，分析結果係以各別從三隻小鼠所獲得之數值之平均值及標準差呈現，並以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
結果如圖5A所示，表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之蛋白疫苗誘發干擾素-γ反應之效果顯著優於卵清白蛋白，此外，注射磷酸氫鈣-卵清白蛋白疫苗之組別亦可測得對CD-8之OT-1胜肽具專一性之毒殺型T淋巴細胞反應，而注射卵清白蛋白之組別則未觀察到T淋巴細胞反應。
磷酸氫鈣蛋白疫苗誘發抗體反應
實驗係將C57BL/6小鼠以皮下注射2組不同樣本以進行評估，分別為0.5微克已溶解的卵清白蛋白，或磷酸氫鈣卵清白蛋白疫苗，樣本皆溶於200微升磷酸緩衝溶液中，並於小鼠注射樣本間隔兩週後接種相同的疫苗兩次，於小鼠接受免疫六週後取其血清，接著以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析對卵清白蛋白具專一性之免疫球蛋白(IgG)效價，分析結果係取各小鼠所獲得之數值並以Student’s test進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
結果如圖5B所示，由磷酸氫鈣蛋白疫苗所誘發之免疫球蛋白產量顯著高於卵清白蛋白，且其所誘發之免疫球蛋白產量為卵清白蛋白誘發之免疫球蛋白產量的十倍。
實施例5、表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之第二型登革熱(dengue-2)次單元疫苗增強具抗原專一性之T淋巴細胞反應
磷酸氫鈣-登革熱蛋白疫苗誘發T淋巴細胞反應
實驗係以皮下注射的方式給予BALB/c小鼠(n=4)樣本，並分為3組不同的樣本，分別為(1)磷酸緩衝溶液(PBS)、(2)10微克已溶解的第二型登革熱病毒(D2)套膜結構域III(ED3)重組蛋白或(3)磷酸氫鈣-第二型登革熱病毒套膜結構域III(MCHP-D2)抗原疫苗，樣本皆溶於磷酸緩衝溶液中，並於注射樣本兩週後接種相同疫苗兩次，於最後一次接種的一週後犧牲小鼠並取得脾臟細胞，接著以酶聯免疫斑點法(ELISPOT)分析產生干擾素-γ及產生介白素-4(interleukin-4；IL-4)之T淋巴細胞反應，其係扣除培養基之背景值後，分別分析對第一型至第四型登革熱病毒套模結構域III(ED3)胜肽混合物或含有CD8毒殺性T細胞可辨識的登革熱抗原第2-6 號胜肽具專一性之斑點形成細胞數量，實驗結果係顯示自各小鼠取得數值後計算所得之平均值及標準差，並以two-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
結果由圖6A及圖6B指出，磷酸氫鈣-第二型登革熱病毒套膜結構域III(D2 ED3)抗原疫苗顯著誘發對第二型登革熱抗原具專一性之干擾素-γ及介白素-4之T淋巴細胞反應，且其誘發之效果顯著高於登革熱病毒套模結構域III重組蛋白，而無法測得對其他血清型之登革熱抗原具專一性之T淋巴細胞反應，此外，結果亦顯示磷酸氫鈣-第二型登革熱病毒套膜結構域III(D2 ED3)抗原疫苗可誘發對CD-8之登革熱抗原D2-6具專一性之毒殺型T細胞反應。
實施例6、表面修飾磷酸氫鈣微粒子製備之第二型登革熱(dengue-2)次單元疫苗增強抗體反應以及病毒清除率
磷酸氫鈣-登革熱蛋白疫苗誘發抗體反應
實驗係以實施例3所述之方法對BALB/c小鼠(n=4或8)進行免疫接種，於接種六週後取得小鼠之血清，並以酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)分析血清中對登革熱病毒抗原D2 ED3具專一性之免疫球蛋白之效價，實驗結果係以每一隻小鼠之血清所測得的免疫球蛋白效價之平均值及標準差來顯示，並以one-way ANOVA進行統計分析，p值小於0.05者係表示具顯著性差異。
受磷酸氫鈣登革熱蛋白疫苗免疫接種之小鼠，以第二型登革熱病毒攻毒後形成之病毒血症(viremia)
實驗係以實施例3所述之方法對BALB/c小鼠(n=4)進行免疫接種，並於最後一次免疫後以第二型登革熱病毒攻毒，其係預先以第二型登革熱病毒感染K562細胞，再取5 x 107個感染後細胞進行腹腔內接種，而後於不同時間點取得小鼠之血漿，再以螢光集落分析法(fluorescent focus assay)量測每毫升血漿中所包含的集落形成單位(focus forming units；Ffu)以評估病毒血症形成的情形，實驗結果係以平均值及標準差顯示。
結果如圖8所示，以磷酸氫鈣-第二型登革熱病毒套膜結構域III(D2 ED3)抗原疫苗進行免疫接種之小鼠，在攻毒之後其體內形成的病毒血症低於登革熱病毒D2 ED3重組蛋白之組別及控制組，以此結果證實了，在小鼠模式中，磷酸氫鈣登革熱蛋白疫苗確實可提供較佳的保護效果以對抗登革熱病毒感染。
綜合上述，本發明所提供之陶瓷聚合物微粒子，由於其表面帶有陽離子，使得蛋白質抗原得以有效地吸附於其表面，進一步而言，本發明之一實施例係以表面修飾磷酸氫鈣之陶瓷聚合物微粒子作為抗原載體，得以藉以控制抗原之釋放，並能在接受免疫接種之動物體內維持並持續釋放長達六個月，藉由磷酸氫鈣修飾之陶瓷聚合物微粒子而達到延長抗原於動物體內的滯留時間，而能夠延長抗體產生的時程，並有效誘導毒殺型T淋巴反應，因此，本發明所提供之以表面修飾磷酸氫鈣之陶瓷聚合物微粒子所製備之蛋白疫苗，適用於長期疫苗(long-term vaccines)以及抗腫瘤疫苗之開發。

Claims (11)

  1. 一種蛋白質疫苗組成物，其係包含：一蛋白質或一胜肽抗原；以及一陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子，用以將該蛋白質或該胜肽抗原吸附於於其陽離子表面，其中該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子係一表面經修飾之磷酸氫鈣(calcium hydrogenphosphate,CHP)微粒子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該表面經修飾之磷酸氫鈣微粒子之粒徑係介於0.1至10微米(μm)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該表面經修飾之磷酸氫鈣微粒子之表面電位係介於+1至+40毫伏(mV)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子之抗原吸附率(antigen adsorption rate)係每毫克(mg)之該陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子吸附0.1至100微克(μg)之該蛋白質或該胜肽抗原。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一腫瘤抗原。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一病毒抗原。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一登革熱病毒次單元。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含登革熱病毒套膜結構域III(envelope domain III；ED3)胜肽。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一細菌抗原。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之蛋白質疫苗組成物，其中該蛋白質或該胜肽抗原係包含至少一真菌抗原。
  11. 一種以表面經修飾之磷酸氫鈣(modified calcium hydrogenphosphate,MCHP)微粒子作為抗原載體以製備蛋白質疫苗之用途。
TW106137957A 2016-11-04 2017-11-02 陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途 TWI654993B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662417860P 2016-11-04 2016-11-04
US62/417860 2016-11-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201828983A TW201828983A (zh) 2018-08-16
TWI654993B true TWI654993B (zh) 2019-04-01

Family

ID=62077087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106137957A TWI654993B (zh) 2016-11-04 2017-11-02 陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN110087639B (zh)
TW (1) TWI654993B (zh)
WO (1) WO2018085651A1 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541000B1 (en) * 1990-04-16 2003-04-01 President & Fellows Of Harvard College Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-Ig immune response
US20040013742A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Purzer Pharmaceutical Co., Ltd. Biodegradable ceramic for medical use
WO2008152652A2 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology A dengue envelope domain iii-based tetravalent protein vaccine
US8431160B2 (en) * 2006-02-24 2013-04-30 Novartis Ag Microparticles containing biodegradable polymer and cationic polysaccharide for use in immunogenic compositions
US9474717B2 (en) * 2007-10-12 2016-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040258763A1 (en) * 1999-02-03 2004-12-23 Bell Steve J.D. Methods of manufacture and use of calcium phosphate particles containing allergens
CN1241871C (zh) * 2003-04-07 2006-02-15 瑞安大药厂股份有限公司 医药用生物可分解性陶瓷
CA2628328A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
CN101721709B (zh) * 2009-11-13 2013-01-30 上海市肿瘤研究所 磷酸钙和两亲性聚合物复合载药纳米微球、制备方法和用途
EP2706040A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-12 Baden-Württemberg Stiftung gGmbH Particle for recovering an anion from an aqueous solution
CN105381458A (zh) * 2015-12-22 2016-03-09 中国药科大学 阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541000B1 (en) * 1990-04-16 2003-04-01 President & Fellows Of Harvard College Hydroxyapatite-antigen conjugates and methods for generating a poly-Ig immune response
US20040013742A1 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Purzer Pharmaceutical Co., Ltd. Biodegradable ceramic for medical use
US8431160B2 (en) * 2006-02-24 2013-04-30 Novartis Ag Microparticles containing biodegradable polymer and cationic polysaccharide for use in immunogenic compositions
WO2008152652A2 (en) * 2007-06-12 2008-12-18 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology A dengue envelope domain iii-based tetravalent protein vaccine
US9474717B2 (en) * 2007-10-12 2016-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sahdev, Preety, et al. "Calcium phosphate nanoparticles for transcutaneous vaccine delivery." Journal of biomedical nanotechnology 9.1 (2013): 132-141.
SAHDEV, PREETY, ET AL: "Calcium phosphate nanoparticles for transcutaneous vaccine delivery", ANTIBODY− DRUG CONJUGATES: LINKING CYTOTOXIC PAYLOADS TO MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 9, no. 1, 2013, pages 132 - 141 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110087639A (zh) 2019-08-02
WO2018085651A1 (en) 2018-05-11
TW201828983A (zh) 2018-08-16
CN110087639B (zh) 2021-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Esparza et al. Parameters affecting the immunogenicity of microencapsulated tetanus toxoid
US6528051B2 (en) Methods and compositions for enhancing immune response
Conway et al. Protection against Bordetella pertussis infection following parenteral or oral immunization with antigens entrapped in biodegradable particles: effect of formulation and route of immunization on induction of Th1 and Th2 cells
Binjawadagi et al. Adjuvanted poly (lactic-co-glycolic) acid nanoparticle-entrapped inactivated porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine elicits cross-protective immune response in pigs
Saini et al. Comparison of humoral and cell-mediated immune responses to cationic PLGA microspheres containing recombinant hepatitis B antigen
US20120189700A1 (en) Nanoparticle Based Immunological Stimulation
Faisal et al. Leptospira immunoglobulin-like protein A variable region (LigAvar) incorporated in liposomes and PLGA microspheres produces a robust immune response correlating to protective immunity
CN102905729A (zh) 含有佐剂的合成纳米载体的剂量选择
JP2011105730A (ja) 細胞輸送組成物およびこれらの使用
KR20150127206A (ko) 나노입자-기재 조성물
Muttil et al. Pulmonary immunization of guinea pigs with diphtheria CRM-197 antigen as nanoparticle aggregate dry powders enhance local and systemic immune responses
JP2004534798A (ja) 粘膜及び注射送達ワクチン用のアジュバント組成物
Huntimer et al. Polyanhydride nanovaccine platform enhances antigen-specific cytotoxic T cell responses
Venkataprasad et al. Induction of cellular immunity to a mycobacterial antigen adsorbed on lamellar particles of lactide polymers
Qiao et al. Recombinant lactic acid bacteria as promising vectors for mucosal vaccination
Jabbal-Gill et al. Potential of polymeric lamellar substrate particles (PLSP) as adjuvants for vaccines
Schully et al. Evaluation of a biodegradable microparticulate polymer as a carrier for Burkholderia pseudomallei subunit vaccines in a mouse model of melioidosis
Mohanan et al. Encapsulation of antigen in poly (d, l-lactide-co-glycolide) microspheres protects from harmful effects of γ-irradiation as assessed in mice
TWI654993B (zh) 陽離子型生物可降解性陶瓷聚合物微粒子用以遞送疫苗之用途
US10022440B2 (en) Materials and methods for modulating immune responses
WO1999024066A2 (en) Methods and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs
US8173104B2 (en) Controlled-release immunogenic formulations to modulate immune response
WO2023280303A1 (zh) Avc-29作为疫苗佐剂的用途以及含有该佐剂的疫苗组合物
MXPA03009515A (es) Vacunas que incluyen como adyuvante ifn del tipo i, y procesos relacionados con ellas.
WO2005023293A1 (en) Vaccine composition comprising il-12 adjuvant encapsulated in controlled-release microsphere