TWI653056B - 一種高粱酒糟萃取液作為美白保養品之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種高粱酒糟萃取物，係以金門高粱酒糟為原料，以純水、醇類之溶劑及超臨界流體萃取高粱酒糟以獲得；該高粱酒糟萃取物具有抗氧化活性、抑制酪胺酸脢能力以及降低生成黑色素含量能力，其係可作為製備美妝或藥妝組合物之添加物用途；其中該高粱酒糟萃取物基於該美妝或藥妝組合物之總重量之0.001重量%至0.003重量%之量，有較佳之細胞毒性、抗氧化能力以及美白能力。

Description

一種高粱酒糟萃取液作為美白保養品之用途
本發明係為一種高粱酒糟萃取物，特別是關於一種可作為製備美妝或藥妝組合物之添加物用途之高粱酒糟萃取物。
高粱酒糟(sorghum distillery residue,SDR)為釀造高粱酒後所產生之副產物，25公斤高粱釀酒後約可產生8.2公斤高粱酒糟，而金門酒廠高粱酒糟每日產量高達250公噸，目前主要提供為金門當地做家畜飼料，抑或是提供一般家庭式或是小型農場作為有機肥料。但是前述所提之使用量始終太少，所能消化的高粱酒糟相當有限，故大部分的高粱酒糟都還是未被利用而以工業廢棄物處理，又一般的高粱酒之製法為三蒸三釀，其生質利用率約為9成，而金門酒廠之高粱酒製程為二蒸二釀，其生質利用率不到7成，故希望將此物質利用綠色無毒製程萃取其機能性成分，應用於美妝保養品組合物上。
據2001年金門酒廠研究高粱發酵過的副產物酒糟，其澱粉含量仍可高達25%(乾重)以上，而文獻指出，高粱具有豐富生、藥理活性之多酚類化合物(polyphenol compounds)，例如單寧(tannins)、黃酮類化合物(flavonoids)、酚酸(phenolic acid)，而其他機能性成分還有長鏈脂肪 醇(policosanols)及植物固醇(phytochemicals)等。研究證實這些機能性成分具有清除體內自由基、抗脂質氧化、預防心血管疾病、降低人體血清膽固醇、抗癌及抗微生物等作用。亦有研究顯示，烏魚攝食添加高粱酒糟之飼料可增強血液中抗氧化特性，且能減少血液之凝固，使之具有抗寒的特性，增加冬季之成長率。
在先前文獻發表中，對於高粱酒糟已有部分研究產出。中華民國專利I430755，一種具有抗菌之高粱酒糟萃取物及其製造方法：在此篇專利中使用下列萃取方式，(a)冷水萃取：將高粱酒糟在0~25℃下以蒸餾水1/10~1/100w/v的比例範圍中攪拌；(b)酒精萃取：將高粱酒糟在0~25℃下以5~95%酒精溶液在1/10~1/100w/v比例範圍中攪拌；(c)熱水萃取：將高粱酒糟加入蒸餾水以1/10~1/100w/v比例範圍中經100~135℃熱處理，選自上述方法獲得的萃取物後，再進行過濾，去除水分後，進行磨粉即得高粱酒糟粉末，因其粉末不經直接磨粉而無稻穀和高粱殼等纖維物質，其目的在於做抑菌之用途，抑制Bacillus cereus、Escherichia coli O157：H7、Salmonella spp.和Staphylococcus aureus等菌株之功效，因此可作為食品添加物使用。
台灣農業化學與食品科學(中華民國九十九年十月第四十八卷第五期：第二三三至二三八頁)，高粱酒糟機能性成分萃取，此文獻目的在於萃取製程上使用不同溶劑對於萃取成分之影響，其利用(1)甲醇、異丙醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、不同比例之乙醇水溶液及90℃熱水等溶劑進行攪拌萃取(2)超臨界二氧化碳流體萃取高粱酒糟，萃取溫度為35~80℃及萃取壓力為172~483bar，進行3小時萃取。
中華民國專利公開號201000628，具有抗氧化及抑制酪氨酸 酶活性的保健原料之方法，此專利中主要目的在於其開發製程利用二氧化碳超臨界流體分離程序萃取黃酒粕，操作溫度為40℃、壓力350bar時，且二氧化碳使用量與共溶劑添加量比值小於40，可得具有抗氧化及抑制酪胺酸酶活性的保健原料。
中華民國專利第104142021號，酒糟萃取物及其製造方法，利用酸、鹼水解以破壞植物細胞壁方法，再經由乙醇純化分離，除可萃取獲得游離性酚酸外，並可增加結合性酚酸的獲得含量，以增加產率。其中酒糟萃取物經由高效液相層析儀(High-Performance erformance Liquid Chromatography,HPLC)鑑定其成分後，再經由氣相層析質譜儀(chromatography-mass spectrometry,GC-MS)進行結構鑑定，證實其包含阿魏酸等多種酚酸機能性成分，此類化合物具有抗氧化能力、抑制酪胺酸酶的美白功效，可應用於美容保養品組合物。
本發明進一步採用全綠色無毒、無有害化學溶劑之萃取製程法，並揭露在此發明製程下，最適應用於製備美妝或藥妝組合物之添加物之最適添加比例。
本發明除了利用溶劑萃取法(使用溶劑為不同比例之乙醇水溶液及不同溫度下之純水)進行高粱酒糟之萃取外，也利用超臨界二氧化碳流體萃取設備進行萃取。本發明之製程方法為應用於保養品之機能性成分萃取，故考量可應用於保養品的組成分要求，在使用溶劑萃取法時，必須避免使用會對環境及人體造成危害之有機溶劑，例如：甲醇 (methanol)、正己烷(hexane)、等，所挑選的為乙醇及純水，藉由調控其比例及溫度進行萃取，且以較高規格之美國藥典USP 467溶劑殘留之規範來進行原料開發上之自我審查，乙醇為其規範之Ⅲ級殘留溶劑，一般認為Ⅲ級殘留溶劑對人體危害相比較I級和Ⅱ級殘留溶劑而言低毒、低風險。
除了使用溶劑萃取法固然為常用之方法，另外也使用超臨界二氧化碳流體萃取設備，以二氧化碳做為超臨界萃取技術的流體，符合綠色工業製程的標準，也善盡“企業社會責任CSR(Corporate Social Responsibility)”，並且符合各國衛生法規中，化妝保養產品不得殘留危害人體物質的規定，加上萃取溫度低，能較佳地保留萃取物的生物活性等成份。再加上使用二氧化碳超臨界流體萃取，超臨界流體具有選擇性，經過本發明的實驗設計驗證，可獲得純度高、毒性低之酒糟機能性成分活性物，可適用於作為化妝保養品之應用。
本發明善加利用高梁酒之高粱蒸釀後產生的廢棄物，期望將高粱酒糟廢棄物轉變成可利用之物質，不僅減少環境汙染更可以提升經濟價值。而近年來環保意識抬頭，且黑心商品問題日益嚴重，直接接觸人體肌膚的保養品及彩妝品之安全性不容忽視，有鑒於一般市售保養品及彩妝品大多含有防腐劑及人工香精及色素等，如果原料合成之製程中提取純化的不確實，長期使用後可能會導致人體累積許多化學成份而造成敏感、刺激等皮膚傷害，因此消費者更崇尚天然保養產品，故本發明希望能開發出能讓消費者安心使用之化妝保養產品。
本發明研究開發較天然環保之製程萃取高粱酒糟中機能性成分，並經由實驗證實其溶劑萃取法所獲得萃取物之總多酚含量約為207.46 mg/100g SDR至298.87mg/100g SDR，而超臨界二氧化碳流體萃取法所獲得萃取物之總多酚含量約為27.22mg/100g SDR，先前研究證實這些多酚化合物，具抗氧化能力及對酪胺酸脢有抑制作用，並且未有用於化妝保養品之先例，因此利用此萃取液找出最適用於化妝保養品之濃度，得其在化妝品組合物中最適合酒糟總多酚含量為0.001%至0.02%，並且其在化妝品組合物中含量為0.02%時，具有80%以上的抗氧化能力。
圖一為DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)清除自由基能力測定之分析結果；圖二為MTT細胞存活率之分析結果；圖三為細胞內酪胺酸酶活性之分析結果；圖四為生成黑色素含量減少之分析結果。
以下藉由具體實施例探討高粱酒糟萃取液之製備及其應用於美白保養品之用途。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可由本說明書所揭露之內容了解本發明之其他優點及功效，並在不背離本發明之範疇下對本發明所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。
實施例1 高粱酒糟萃取液製備
(1)高粱酒糟：試驗樣品經100℃至120℃下使用流體化床連續烘乾設備，再利用粉碎機進行研磨。
(2)溶劑萃取高粱酒糟：秤取20g高粱酒糟於三角錐形燒瓶中，分別以200ml 之75℃純水、90℃純水、75%乙醇(ethanol)及90%乙醇水溶液進行1小時之攪拌萃取，萃取終了再以濾紙過濾後定量濾液體積。
(3)超臨界二氧化碳流體萃取高粱酒糟：本發明所使用之超臨界二氧化碳萃取使用250ml之萃取槽進行。三次萃取分別取高粱酒糟粉末93.51g、98.85g及98.85g，開啟二氧化碳進入管路內，調整背壓閥(back pressure regulaor)控制系統壓力(三次萃取壓力分別為170bar、250bar及300bar)，以及調整萃取槽內的溫度(此次使用溫度為40℃)，使用之共萃溶劑為乙醇，待壓力與溫度達到實驗設定值後開始計時，先將樣品使用乙醇/二氧化碳的超臨界流體以靜態萃取浸泡於萃取槽2小時，之後以流速0.2L/hr之二氧化碳及流速0.4L/hr之乙醇，進行乙醇/二氧化碳超臨界流體動態萃取2小時，將兩個分離槽所收集到的樣品混合均勻，保存備用。
實施例2 總多酚化合物(Total phenolic compounds,TPC)含量分析
(1)標準品及試劑配製：標準品配製：此實驗可利用習知方法，以沒食子酸(gallic acid,Arcos Organics)為標準品，秤取0.1g之無水沒食子酸加入100ml純水以超聲波震盪溶解均勻後，使標準品濃度為1000ppm，再依下表標示之體積，加入純水連續稀釋不同濃度之標準品：
實驗試劑則需配製(a)福林試劑(Folin-ciocalteus phenol reagent)以純水稀釋10倍備用(b)7.5%碳酸鈉水溶液(Sodium Carbonate,Na2CO3)。
(2)實驗步驟：標準品及樣品以純水配製成適當濃度再分別取1ml加入5ml 稀釋10倍之福林試劑，混和均勻後避光靜置5分鐘，之後加入4ml之7.5%碳酸鈉水溶液，混和均勻後避光靜置1小時後離心，以分光光度計於765nm下測定其吸光值。以標準品濃度為橫坐標，吸光值為縱座標做直線回歸分析，當標準曲線相關係數(R2)為0.999至1方可使用。之後再將樣品吸光值帶入標準曲線計算其總多酚化合物含量。總多酚化合物之萃取量以每百克高粱酒糟萃出之毫克數表示(mg/100g SDR)。
(3)實驗結果：
表一為總多酚含量之分析結果，當使用純水萃取時，溫度對於其沒有顯著影響，但是使用75%乙醇萃取時，其總多酚含量明顯高於90%乙醇萃取液，而使用超臨界萃取方式，總多酚含量則明顯低於其他兩種萃取方式，因使用二氧化碳為溶劑，其極性較低，而多酚類化合物因含有羥基(hydroxyl group)，大部分極性都較高，和極性較低之二氧化碳相容性較差。
實施例3 清除DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)自由基能力測定
(1)試劑配製：取0.004g之DPPH加入100ml之乙醇(濃度為40ppm)，均勻溶解後避光保存備用，並且存放不可超過半天。
(2)實驗步驟：將各萃取液配製成200ppm，再以其萃取之溶劑依序稀釋成 100ppm、50ppm、25ppm及12.5ppm，取6ml之DPPH加入1ml樣品，配置完成後換算樣品終濃度為28.6ppm、14.3ppm、7.1ppm、3.6pm、1.8ppm，混和均勻後避光靜置40分鐘，以分光光度計於517nm下測定其吸光值，並依下列公式計算各萃取液的DPPH自由基之清除效應百分比(scavenging effects；%)
DPPH自由基之清除效應百分比(%)
(3)實驗結果：
萃取液中所含物質較為複雜，而酚類化合物與抗氧化能力有高度相關性，故清除DPPH自由基能力測定實驗以總多酚濃度作為依據。圖一為清除DPPH自由基能力測定實驗之分析結果，橫坐標則為總多酚化合物之含量；圖一顯示其清除能力隨著萃取液濃度下降而降低，並且以75%乙醇萃取液及90%乙醇萃取液最佳，其在酒糟總多酚200ppm之濃度(終濃度為28.6ppm)下均有約85.3%及85.2%之清除能力。
由於高粱酒糟中主要具自由基清除能力之物質為總多酚化合物，由實驗結果也證明萃取液之DPPH自由基清除能力與總多酚化合物呈現正相關。由此實驗結果可知酒糟萃取液樣品可作用抗老化、抗氧化之應用。。
實施例4 細胞存活率之分析
(1)實驗原理
利用MTT試劑中Tetrazolium在活細胞內會被粒線體中的脫氫酶(Dehydrogenase)還原產生藍紫色Formazan結晶的特性，來檢測存活細胞的相對比例。Formazan結晶物於波長570nm時有最大吸光值，故藉由吸光值的測定來計算細胞的存活率。
(2)實驗方法
將黑色素瘤細胞(5×104cells/well)植入24孔培養盤中，培養24小時後，以終濃度10、20、30ppm之酒糟萃取溶液樣品處理細胞24小時，每孔洞以PBS(phosphate buffer saline)清洗一次，加入MTT溶液置於37℃、4小時後，利用Dimethyl Sulphoxide(DMSO)溶解由細胞粒腺體中的脫氫酶(dehydrogenase)所還原MTT形成的formazan產物，以免疫酵素分析儀(ELISA)測定產物之OD570吸光值。細胞存活愈多則產物顏色愈呈深紫色。
細胞存活率公式(%)=100-[(A-B)/A×100%]
A：控制組之OD570吸光值
B：樣品組之OD570吸光值
(3)實驗結果：
圖二為水萃、酒精萃以及超臨界萃取之細胞存活率分析，其酒糟總多酚在溶液中之終濃度分別為10ppm、20ppm、30ppm。由實驗結果可知，超臨界流體在相同的酒糟萃取溶液有較佳的細胞存活率，而酒糟萃取液除酒精30ppm外，其餘樣品細胞存活率皆在70%以上。由此實驗結果可知酒糟萃取液樣品不會對細胞有毒害效果。
實施例5 細胞內酪胺酸酶活性之分析
(1)細胞內酪胺酸酶活性之分析原理
利用冷凍解凍(Freeze-thaw cycle)的方法，將細胞置於-80℃冷凍一段時間(30分鐘)，使細胞內的水分形成冰晶；再將細胞取出置於室溫解凍(30分鐘)，使冰晶恢復成水狀，藉由此過程使細胞破裂，進而釋放出胞內物質，而我們欲測定之酪胺酸酶亦於其中。加入酪胺酸酶的催化受質(如L-dopa)，分析其產物的生成量，可推知其酪胺酸酶的相對活性。
(2)細胞內酪胺酸酶活性之分析方法
藉由測量多巴醌(dopachrome)自氧化抑制率，以瞭解酒糟萃取液是否能抑制酪胺酸酶活性而降低黑色素形成。於24孔培養盤中植入密度5×104cells/ml的B16F10黑色素瘤細胞，培養於含100nM α-MSH的培養基中，置入37℃、5% CO2培養箱中等待24小時後，加入酒糟SFE繼續處理24小時，接著每孔洞加入100μl 1%(V/V)Triton X-100/50mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)及10mM PMSF置於-80℃、30分鐘，再取出於室溫30分鐘，以12000r.p.m轉速離心30分鐘後，取出80μl上層懸浮液置入96孔盤中，並且每孔加入1mg/ml多巴溶液，測定OD490吸光值，每10分鐘測量一次，連續一個小時，最後再計算酪胺酸酶抑制率。
抑制率公式(%)=(A-B)/A×100%
A：控制組之OD490吸光值
B：樣品組之OD490吸光值
(3)實驗結果
圖三為細胞內酪胺酸酶活性之分析結果，超臨界萃取之酒糟萃取液有較佳的酪胺酸酶抑制率，酒糟總多酚在溶液中濃度為20ppm、30ppm時，其抑制率達70%以上。由此實驗結果可知酒糟萃取液樣品可作用美白效能之應用。
實施例6 黑色素含量之分析
(1)黑色素含量之分析原理
利用高溫和強鹼將細胞內的黑色素溶出，並於其特殊吸光波長405nm的測定來分析各種不同條件的處理對B16F10黑色素瘤細胞中黑色素含量的影響。
(2)黑色素含量之分析方法
於24孔培養盤植入5×104個細胞，培養於含有100nM α-MSH的培養基中，培養24小時(37℃、5% CO2培養箱內)。之後置換含不同濃度之酒糟SFE或麴酸之培養基(控制組只換培養基)，再培養24小時。接著去除培養基，以PBS清洗2次後加入100μl 1N NaOH(10%DMSO配製)於60℃反應1小時，最後取80μl至96孔盤中去測定波長405nm的吸光值，計算出黑色素的相對含量。
(3)實驗結果
圖四為黑色素含量之分析結果，水萃、酒精萃以及超臨界萃取之酒糟萃取液樣品皆有減少生成黑色素之效能，而其中又以超臨界萃取酒糟總多酚30ppm終濃度有較佳的結果。由此實驗結果可知酒糟萃取液樣品可作用淡疤、淡斑之應用。

Claims (7)

  1. 一種高粱酒糟萃取物之萃取方法，係以金門高粱酒糟為原料，採用乙醇/二氧化碳超臨界流體為共溶劑，先將高粱酒糟原料使用乙醇/二氧化碳超臨界流體靜態萃取2小時，之後再使用乙醇/二氧化碳超臨界流體連續動態萃取2小時，使用之高粱酒糟乾燥後之含水率低於30%，操作壓力介於150bar至350bar之間，溫度介於40℃至60℃之間。
  2. 如申請專利範圍第1項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該超臨界流體萃取最適條件為操作壓力170bar、溫度40℃，操作壓力170bar、溫度50℃，操作壓力170bar、溫度65℃，操作壓力250bar、溫度40℃，以及操作壓力300bar、溫度40℃。
  3. 如申請專利範圍第1項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該萃取物具有抗氧化活性、抑制酪胺酸脢能力以及降低生成黑色素含量能力，其係可作為製備美妝或藥妝組合物之添加物用途。
  4. 如申請專利範圍第3項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該萃取物作為製備美妝或藥妝組合物之添加物用途，為防止皮膚老化、美白、嫩白、淡斑或明亮皮膚。
  5. 如申請專利範圍第4項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該萃取物作為製備美妝或藥妝組合物之添加物，係以基於該組合物之酒糟總多酚總重量之0.001重量%至0.02重量%之量存在。
  6. 如申請專利範圍第5項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該萃取物作為製備美妝或藥妝組合物之添加物，其中該萃取物基於該組合物之酒糟總多酚總重量之0.001重量%至0.003重量%之量，有較佳之細胞毒性、抗氧化能力以及美白能力。
  7. 如申請專利範圍第6項之高粱酒糟萃取物之萃取方法，其中，該萃取物作為製備美妝或藥妝組合物之添加物，其中以超臨界流體萃取之萃取物基於該組合物之酒糟總多酚總重量0.003重量%之量有最佳之細胞毒性、抗氧化能力以及美白能力。
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