TWI648062B - 能夠抑制c型肝炎病毒於人類脂肪幹細胞及肝細胞複製的肽及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
C型肝炎病毒(HCV)感染是全球肝硬化和肝細胞癌的主要原因2。現行的治療方案通常耐受差且僅在一部分感染個體中有效。我們發現了具有序列DEAQETAVSSHEQD的肽(兔α1-抗蛋白酶F的片段)及其衍生物DEAQETAVSSHEQ和QETACSSHEQD在hADSC和人肝細胞中顯著抑制血清攜帶的HCV複製。
Description
本發明涉及能夠抑制C型肝炎病毒複製的肽及其衍生物、其編碼多肽、載體、宿主細胞以及包含所述肽的藥物組合物以及它們的用途。
HCV為黃病毒科(Flaviviridae)的包膜正鏈RNA病毒。它含有9.6kb基因組,其始於非轉譯區(5’-UTR),接著是編碼結構蛋白(core、E1和E2)和包括p7、NS2、NS3、NS4A和4B、NS5A和5B在內的非結構(NS)蛋白的序列(關於綜述,參見參考文獻1)。至少1億7千萬的人被HCV長期感染,導致每年超過350,000人死亡2。現行治療例如PEG-干擾素和抗病毒藥利巴韋林的組合使用具有許多副作用,並且僅在部分感染患者中有效。已嚴謹地嘗試新的抗HCV治療的開發(關於綜述,參見參考文獻3),然而對於該開發,缺乏可靠
和生理學的細胞培養系統來生長血清攜帶的HCV(HCVser)仍然是一個障礙。例如,HCVser的直接感染僅在原代人和黑猩猩肝細胞中顯示,並且感染是暫態且低效的4。最近設計的體外基於細胞的培養方法利用HCV基因組的分子克隆,而非天然病毒(關於綜述,參見參考文獻5)。此外,這些模型在非原代人細胞例如肝癌細胞系6或神經上皮細胞系7中繁殖HCV。因此,關於將結果外推至臨床病毒-宿主相互作用存在憂慮。動物模型例如黑猩猩、人-肝嵌合小鼠8或遺傳修飾成易感於HCV感染的小鼠9難以獲得或建立。為克服此,在共同待審申請(PCT/CN2015/070243)中,我們成功地開發了一個平臺,其中人脂肪衍生的乾細胞(hADSC)的亞類支援血清源HCV基因型1a、1b、2a、2b和混合的2a+2b的完全複製。此外,新產生的病毒對於幼稚hADSC具有感染性,並且對幼稚hADSC的系列“再感染”保持病毒複製並且總病毒滴度在6個再感染循環後可逐步放大至超過1x1011個拷貝。有重大意義的是,由血清攜帶的HCV感染的hADSC產生的病毒對原代人肝細胞具有感染性。
仍對具有較少的副作用的有效藥物和治療存在需求。最近已在設計小分子作為新一代的抗HCV治療方面作出了進步,然而產生這些HCV特異性酶抑制劑是昂貴的。此外,其長期不利作用要求進一步監測。因而仍需要開發新的抗HCV療法,其由天然產物組成或來源於天然產物,會令人信服地導致更安全的特徵,並且具有較低的生產成本。
提供本概述以呈現本發明的概述,從而簡要地指出本發明的性質和實質。在理解其不用於解釋或限制申請專利範圍的範圍或含義的情況下提出該概述。
在一方面,本公開內容提供用於在受試者中治療或預防HCV感染或抑制HCV複製的方法,其中所述方法包括給予所述受試者有效量的肽或其變體、衍生物、突變體或片段,所述肽包含具有與胺基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中,所述肽的胺基酸序列具有與胺基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中,所述肽包含胺基酸序列DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ。在一些實施方案中,所述肽的序列基本上由或由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ組成。在一些實施方案中,所述肽包含至少一個胺基酸添加、缺失和/或取代。在一些實施方案中,所述胺基酸添加、缺失和/或取代在C端和/或N端進行。在一些實施方案中,所述肽具有1-5、優選1-3個胺基酸添加、缺失和/或取代。在一些實施方案中,所述方法進一步包含給予另一種抗HCV劑。這種抗HCV劑可在本發明肽之前、之後或與之同時給予。在一些實施方案中,HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
在另一方面,本公開內容提供肽或其變體、衍生
物、突變體或片段,所述肽包含與胺基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ具有至少70%同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中,所述肽的胺基酸序列與胺基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%或更多同一性。在一些實施方案中,所述肽包含胺基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ、基本上由胺基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ組成或由胺基酸序列QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ組成。在一些實施方案中,所述肽包含至少一個胺基酸添加、缺失和/或取代。在一些實施方案中,所述胺基酸添加、缺失和/或取代在C端和/或N端進行。在一些實施方案中,所述肽具有1-5、優選1-3個胺基酸添加、缺失和/或取代。在一些實施方案中,所述肽具有對HCV複製的抑制作用。在一些實施方案中,所述肽為分離的或通過化學合成獲得的。
在另一方面,本公開內容提供編碼本發明肽的多核苷酸。
在另一方面,本公開內容提供包含本發明多核苷酸的載體。
在另一方面,本公開內容提供包含本發明多核苷酸或載體的宿主細胞。
在另一方面,本公開內容提供包含有效量的本發明肽、多核苷酸、載體或宿主細胞和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
在另一方面,本公開內容提供本發明肽、多核苷酸、載體、宿主細胞或藥物組合物在製備用於在受試者中治療或預防HCV感染或抑制HCV複製的藥物中的用途。在一些實施方案中,所述藥物進一步包含另一種抗HCV劑。在一些實施方案中,HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
其他方面描述於下文。
當結合通過舉例而非限制的方式所包含的附圖閱讀時能更好地理解前述概述和詳述。
圖1:DEAQETAVSSHEQD及其衍生物有效地抑制hADSC和原代肝細胞中血清攜帶的HCV的複製。( A 和 B )將1、10和100μg/ml濃度的DEA、DEA-Q和QET肽加入p5 hADSC的培養物中1小時,然後暴露於HCV(+)血清(基因型1b)。HLA-A11限制的埃-巴病毒特異性肽表位元CSSCSSCPLSK用作對照(無關)肽。在感染後第21天,通過qRT-PCR定量上清液( A )和細胞裂解物( B )中的5’-UTR拷貝數。資料表示為3個實驗的平均值±SD。( C )將1、10和100μg/ml濃度的DEA、DEA-Q和QET肽加入原代人肝細胞的培養物中,然後暴露於HCVser(基因型1b)。感染5天后,將細胞RNA提取出用於5’-UTR的RT-PCR。資料表示為3個實驗的平均值±SD。在某些濃度(例如10和100μg/ml)DEA、DEA-Q和QET下的HCV拷貝數低於檢測限。
下面參照用於說明的實例應用來描述本發明的數個方面。應當理解的是,本文給出許多具體細節、關係和方法以供全面理解本發明。然而,相關領域普通技術人員應易瞭解的是,不需要一個或多個具體細節或者用其他方法便可實施本發明。本發明不受行動或事件的順序的限制,因為某些行動可以不同順序發生和/或與其他行動或事件同時發生。此外,並不是所有列舉的行動或事件都是實施本發明的方法所必需的。
除非另外定義,本文所用的所有科學和技術術語和命名與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義相同。通常,用於細胞培養、感染、分子生物學方法等的程式是本領域中所用的常用方法。這種標準技術可見於參考手冊例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories)和Ausubel等人(1994,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,New York)。
本文所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”旨在還包括複數形式,除非上下文明確另外指出。
本文所用的術語“約”當提及可測量的值例如量、時距等時,意在包括自所規定的值的±20%或±10%、更優選±5%、甚至更優選±1%和仍更優選±0.1%的變化,因為這樣的變化對於執行所公開的方法而言是合適的。
本公開內容的肽可以是重組、天然或合成肽。本
公開內容的肽可以是純化的天然產物或化學合成的產物。可替代地,它可以使用重組技術由原核或真核宿主產生,例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。根據重組生產中使用的宿主,肽可以是糖基化或非糖基化的。在一個實施方案中,本公開內容的肽來源於兔α1-抗蛋白酶F的片段及其衍生物。
如本文使用的,術語“衍生物”、“變體”、“突變體”和“片段”意指基本上保留與本發明肽的相同生物功能或活性的肽。
如本文使用的,術語“衍生物”包括但不限於(i)其中胺基酸殘基中的一個或多個包括取代基的那種,(ii)其中肽與另一種化合物例如增加肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的那種,(iii)其中另外的胺基酸融合至肽的那種,例如引導或分泌序列或用於純化肽或前蛋白的序列,或(iv)其中肽通過一些修飾進行修飾的那種。基於本文的教導,此類衍生物是本技術人員已知的。
如本文使用的,術語“修飾”(其通常不改變一級序列)包括肽的體內或體外化學衍生,例如乙醯化或羧基化。還包括的是糖基化的修飾,例如修飾肽的糖基化模式產生的那些,所述修飾在其合成或加工過程中或在進一步的加工步驟中,例如通過使肽暴露於糖基化酶(例如哺乳動物糖基化或去糖基化酶)而進行。還包括的是具有磷酸化胺基酸殘基例如磷酸酪胺酸、磷酸絲胺酸、磷酸蘇胺酸的序列,以及經修飾以改善對蛋白酶解降解的抗性或最佳化可溶性性質
的序列。
如本文使用的,術語“變體”包括但不限於幾個胺基酸的缺失、***和/或取代,優選幾個保守的胺基酸取代(一般為1-7、優選1-6、更優選1-5、甚至更優選1-4、還更優選1-3、最優選1-2個),和在肽的C末端、N末端或內部的一個或多個胺基酸(一般小於20、優選小於10、更優選小於5個)的添加。例如,當胺基酸殘基由相似或類似殘基取代,例如由保守或非保守的胺基酸殘基(優選保守胺基酸殘基)取代時,蛋白質功能通常是未改變的。進一步地,在C末端和/或N末端一個或多個胺基酸的添加通常不改變蛋白質功能。
如本文使用的,“保守胺基酸取代”意指與原始胺基酸序列相比,通過用具有基本上相同或相似性質的胺基酸取代至多7、優選至多6、更優選5且最優選至多3個胺基酸形成的肽。天然存在的胺基酸可基於共同側鏈性質分成下列類別:1)疏水的:正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;2)中性親水的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;3)酸性的:Asp、Glu;4)鹼性的:His、Lys、Arg;5)影響鏈取向的殘基:Gly、Pro;和6)芳族的:Trp、Tyr、Phe.
保守胺基酸取代可涉及這些類別之一的成員與同一類別的另一成員交換。保守胺基酸取代可包括非天然存
在的胺基酸殘基,其通常通過化學肽合成而不是通過生物系統的合成而摻入。這些包括肽模擬物和其他顛倒或反向的胺基酸部分。
示例性保守胺基酸取代列於表1中。
技術人員能夠使用周知的技術結合本文提供的資訊確定本文所述的多肽的合適變體。本領域技術人員可通過靶定據信對於活性不重要的區域而鑒定可被改變而不破壞活性的分子的合適區域。技術人員也會能夠鑒定在類似多肽間保守的分子的殘基和部分。在進一步的實施方案中,甚至對於生物活性或結構重要的區域可進行保守胺基酸取代,而不破壞生物活性或不會不利地影響肽結構。
本發明的多核苷酸可呈DNA和RNA的形式。DNA包括以單股或雙股形式的cDNA、基因組DNA和合成DNA等。本發明的多核苷酸可以是簡並序列。如本文使用的,術語“簡並序列”意指由於密碼子的簡並性,編碼相同蛋白質的不同序列。
術語“編碼肽的多核苷酸”包括編碼所述肽的多核苷酸和包含額外和/或非編碼序列的多核苷酸。
編碼本文所述的肽的多核苷酸可以通過PCR擴增、重組方法和合成方法進行製備。對於PCR擴增,通過基於本文公開的核苷酸序列尤其是ORF設計引子,且使用商購可得或通過本領域的傳統技術製備的cDNA文庫作為模板,可以獲得所述序列。一旦獲得序列,就可以通過重組方法產生許多序列。通常,將所述序列克隆到載體內,隨後將其轉化到宿主細胞內。使用傳統技術從擴增的宿主細胞中分離序列。
本發明進一步涉及包含本公開內容的多核苷酸的載體、用本公開內容的載體或多核苷酸轉化的遺傳改造的宿主細胞和用於通過重組技術產生肽的方法。
重組肽可以使用本發明的多核苷酸序列,通過傳統重組DNA技術表達或產生(Science,1984;224:1431)。一般地,它包括下述步驟:(1)用編碼肽的多核苷酸或含有多核苷酸的載體轉染或轉化合適的宿主細胞;(2)在合適的培養基中培養宿主細胞;(3)從培養基或細胞中分離或純化蛋白質。
在本發明中,本文所述的多核苷酸序列可以***重組表達載體內。術語“表達載體”意指細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物病毒或哺乳動物細胞病毒例如腺病毒、逆轉錄病毒或本領域已知的任何其他媒介物。任何質粒或載體都可以用於構建重組表達載體,只要它可以複製且在宿主中是穩定的。表達載體的一個重要特點是表達載體一般含有複製
起點、啟動子、標記基因以及轉譯調節組份。
已知方法可以用於構建含有本文所述的序列和合適的轉錄/轉譯調節組份的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。將DNA序列有效連接至表達載體中的合適啟動子,以指導mRNA的合成。示例性啟動子是大腸桿菌的lac或trp啟動子;噬菌體的PL啟動子;真核啟動子包括CMV立即早期啟動子;HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒的LTRs和一些其他已知啟動子,其控制原核細胞、真核細胞或病毒中的基因表達。表達載體可以進一步包含用於起始轉譯的核糖體結合位點、轉錄終止子等。
如本文使用的,“宿主細胞”包括原核生物例如細菌;低等真核生物例如酵母;高等真核生物例如哺乳動物細胞。代表性例子是細菌細胞例如大腸桿菌、鏈黴菌屬、鼠傷寒沙門氏菌;真菌細胞例如酵母;植物細胞;昆蟲細胞例如果蠅S2或Sf9;動物細胞例如CHO、COS或Bowes黑素瘤等。
本發明還涉及用於在受試者中治療或預防HCV感染或抑制HCV複製的方法,所述方法包括給予所述受試者有效量的本發明肽。這種肽可包括但不限於包含具有與胺基酸序列DEAQETAVSSHEQD具有至少70%同一性的胺基酸序列的肽或其變體、衍生物、突變體或片段。在一個實施方案中,所述肽包含胺基酸序列DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ,基本上由
DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ組成或由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ組成。在一個實施方案中,所述肽可為肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ的變體、衍生物、突變體或片段,只要所述變體、衍生物、突變體或片段保留肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ對HCV的抑制作用即可。例如,所述變體、衍生物、突變體或片段對HCV的抑制作用可為肽DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD或DEAQETAVSSHEQ對HCV的抑制作用的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%或更多。本領域技術人員可傳統地選擇和確定這類變體、衍生物、突變體和片段。
本文所用的術語“有效量”是指足以顯示有意義的患者益處例如持續的病毒負荷減少的活性組份的量。
本發明的HCV可為可感染hADSC或人肝細胞的任何HCV,或可自HCV感染個體分離的任何HCV。在一個實施方案中,HCV為選自以下的HCV基因型的至少一種:基因型1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a,或其任何組合。在另一實施方案中,HCV為選自以下的HCV基因型的至少一種:基因型1a、1b、2a、2b、3和4。
HCV的水準可通過本領域的任何已知技術確定。這樣的技術可包括抗HCV ELISA測定(酶聯免疫吸附測定),其測試HCV蛋白。可使用通過擴增測試RNA的用於HCV
複製的測試(例如聚合酶鏈式反應或PCR,分支DNA測定)。HCV RNA的合成當然可使用設計用於即時PCR的裝置在單一步驟中通過RT-PCR而分析或使用HCV特異性放射性探針通過在濾器上雜交RNA而分析。例如,分離的RNA可進行使用能夠擴增HCV基因組的特異性寡核苷酸引子的偶合的反轉錄和擴增,例如反轉錄和通過聚合酶鏈式反應的擴增(RT-PCR)。然後,可進行直接測序以確定感染所述受試者的HCV的基因型。
本文所用的術語"人類脂肪幹細胞"(hADSC)為人成體幹細胞,其為或者具有獲自包含脂肪組織的組織來源的親本細胞。在一些情況下,hADSC也稱為基質脈管級分(SVF),其是ADSC系列的真正來源。SVF是分離自人脂肪組織的原代細胞,並且在培養中它們會自發增殖(在細胞數量上的增加)。
本文所用的術語"患者"、"受試者"、"個體"等可互換使用,並指順應於本文所述方法的任何動物,包括人、非人哺乳動物(例如牛、綿羊、兔、狗、小鼠、大鼠、猴子等)和家禽。
本發明還提供包含有效量的本文肽、其變體、衍生物、突變體和/或片段以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它們的組合。藥物製劑應適於遞送方法。藥物組合物可呈注射劑形式,所述注射劑使用生理鹽水或包含葡萄糖或輔助物質的其他水性溶液通過傳統方法製得。可通過
傳統方法製備呈片劑或膠囊形式的藥物組合物。藥物組合物例如注射劑、溶液劑、片劑和膠囊應該在無菌條件下製備。活性成分以治療有效量給予,例如每天約1μg-50mg/kg體重或更多。
此外,本公開內容的肽可與其他抗HCV劑在組合療法中共同地或分開地給予,或者通過將化合物組合成組合物而給予。可與本公開內容的肽一起給予的劑包括但不限於干擾素和利巴韋林、boceprevir、替拉瑞韋(telaprevirs)或sofosbuvir。干擾素可選自干擾素α 2B、聚乙二醇化干擾素α、複合干擾素(consensus interferon)、干擾素α 2A、干擾素λ、聚乙二醇化干擾素λ和淋巴細胞樣干擾素τ。
本公開內容的肽還可用作實驗室試劑。所述肽可用於提供用於設計病毒複製測定、動物測定系統的驗證和結構生物學研究的研究工具以進一步增強HCV疾病機制的知識。此外,本公開內容的肽可用於建立或確定其他抗病毒劑的結合位點,例如通過競爭抑制。
本公開內容的肽還可用於治療或預防材料的病毒污染,從而減少接觸這類材料的實驗室或醫學人員或患者病毒感染的風險,所述材料例如血液、組織、手術儀器和衣服、實驗室儀器和衣服和採血或輸血裝置和材料。
本公開內容的肽、藥物組合物、用途和方法的實施方案旨在說明性的而非限制性的。本領域技術人員鑒於上述教導可做出修飾和變化,特別是可涉及保持關於抗HCV病毒作用上接近天然功能的肽中的變化的那些。因此,應該理
解的是,可在所描述的範圍內中公開的具體實施方案中進行變化。
本發明進一步由下列實施例闡述。這些實施例僅旨在說明本發明,而不是限制本發明的範圍。對於下列實施例中的實驗方法,它們在傳統條件,例如由Sambrook等於Molecule Clone:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989中所述或由製造商所指示的那些下進行,除非另有規定。
用於合成的通用資訊:用於合成的胺基酸:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。HPLC分析在Agilent 1100系列系統上使用C18柱(BIOSIL,4.6mm x 150mm,5μm)進行。在220nm通過UV進行檢測。流速為0.3mL/min。對於肽-3和5,使用下列梯度洗脫(溶劑A:0.1% TFA/H2O,溶劑B:0.1% TFA/MeOH):在0min時100% A,在10min時80% A,20% B,在15min時50% A,50% B,在20min時100% B,和100% B持續額外10min。在HPLC(NUCLEODUR C18 Pyramid,4.6mm x 250mm,5μm)中用於QET的流動相為0.1% TFA/CH3OH。MALDI-TOF質譜儀(Autoflex III系統,BrukerDaltonics)和核磁共振波譜學(Varian Unity Plus 400
MHz)用於肽鑒定。
肽的通用合成和純化:使用標準Fmoc策略和固相肽合成儀(PS3)合成了肽。一般而言,將D或Q殘基預裝載的Wang樹脂(0.79mmol/g載荷)稱入反應容器並在合成前用新鮮DMF(5mL)溶脹1小時。將第一和相續的Fmoc基團用含20%呱啶的5mL DMF(作為“DEP”溶液)去除2次各5min,以游離N端的胺。其後,將含0.4M N-甲基嗎啉的3mL DMF加入用於C端活化(作為“ACT”),並將所需的胺基酸(作為Fmoc-AA(保護的側鏈)-OH)和PyBOP以4倍過量用於偶聯(稱為AA)。在“AA”進行恰當時間(參見表2)後,將N端胺基酸引入Ac2O(100μL)以在ACT溶液中加冒其餘的未反應游離胺(稱為CAP)達25min(作為CAP)。然後,保持重複DEP-ACT-AA-CAP循環以自C端至N端構建肽。所有反應物通過Kaisar測試監測。最後,通過用95% TFA/H2O在冰浴中處理並返回室溫達1.5小時而將肽從固相支持體中移除。通過過濾收集粗產物。將粗產物通過中壓液相層析使用C18柱(MERCK Lobar 310-25 Lichrprep)進行純化。通過HPLC系統鑒定純度。所合成的肽通過MALDI-TOF質譜儀和核磁共振波譜學表徵。
肽-3(DEA-Q):DEAQETAV SSHEQ,收率:29%。保留時間:17.7min(純度>95%).MS(MALDI-TOF):理論值:1430Da(M+H+),實測值:1430Da(M+H+)(觀察的)。
1H-NMR(400MHz,D2O):8.54(s,1H),7.22(s,1H),4.65(m,1H),4.51(q,J=7Hz,1H),4.30(m,8H),4.09(m,3H),3.77(m,3H),3.58(m,2H),3.23(dd,J=6和6Hz,1H),3.09(dd,J=8和9Hz,1H),2.97(dd,J=5和5Hz,1H),2.87(dd,J=8和8Hz,1H),2.42(m,6H),2.04(m,15H),1.30(t,J=7Hz,6H),1.16(m,3H),0.87(dd,J=4和4Hz,6H)。
肽-5(DEA):DEAQETAVSSHEQD,收率:28%。保留時間:16.5min(純度>95%)。MS(MALDI-TOF):理論值:1545Da(M+H+),實測值:1545Da((M+H+)。1H-NMR(400MHz,D2O):8.53(s,1H),7.20(s,1H),4.64(m,2H),4.50(t,J=7Hz,1H),4.30(m,8H),4.08(m,3H),3.69(m,5H),3.20(dd,J=6和6Hz,1H),3.07(dd,J=8和8Hz,1H),2.85(m,3H),2.42(m,6H),2.07(m,15H),1.28(m,6H),1.15(m,3H),0.86(dd,J=3和3Hz,6H)。
QET:QETAVSSHEQD;保留時間:3.9;MS(MALDI-TOF):理論值:1230Da([M+H]),實測值:1230.Da([M+H])。
我們接下來檢查了在實施例1中製備的由14個胺基酸DEAQETAVSSHEQD組成的肽(命名為DEA)及其衍生
物QETAVSSHEQD(命名為QET)和DEAQETAVSSHEQ(命名為DEA-Q)在hADSC和人原代肝細胞中對血清攜帶的HCV的複製的作用。將1、10和100μg/ml劑量的各種肽加入了p5 hADSC的培養物中1h,然後暴露於HCV(+)血清(基因型1b)。也用100μg/ml的對照肽處理hADSC,所述對照肽為HLA-A11限制的埃-巴病毒特異性肽表位元CSSCSSCPLSK10。在感染後第21天,通過qRT-PCR定量上清液和細胞裂解物中的5’-UTR拷貝數。結果顯示在HCVser-1b感染hADSC的d21上清液(圖1A)和細胞裂解物(圖1B)中,通過用DEA、DEA-Q或QET肽預處理顯著減少病毒拷貝數,並且各種肽的抑制作用在1μg/ml下就已經值得注意了。相比之下,用對照肽進行的預處理沒有作用。
我們也檢測了這些肽是否還抑制人肝細胞中的HCVser複製。如所述11,人肝細胞分離自遠離損傷的非腫瘤部分。肝細胞靜置3天以允許貼附於朔料孔上,並隨後在有或無對照肽、DEA、DEA-Q或QET肽的預處理下暴露於HCVser-1b。感染5天后,將細胞RNA提取出用於5’-UTR的RT-PCR。結果證實與hADSC的情形一樣,在低至1μg/ml的濃度下(圖1C),用肽DEA、DEA-Q和QET進行的預處理顯著抑制人肝細胞中的HCVser複製。
總之,我們提供了下列證據:具有DEAQETAVSSHEQD、DEAQETAVSSHEQ和QETAVSSHEQD序列的肽具有在hADSC和原代人肝細胞兩者中對HCVser複製的抑制作用。具有DEAQETAVSSHEQD序列的肽為兔α1-
抗蛋白酶F的片段,這種天然來源的產物會令人信服地導致更安全的特徵,並且具有較低的生產成本。
1 Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function. Nature 436, 933-938, doi:10.1038/nature04077 (2005).
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5 Wilson, G. K. & Stamataki, Z. In vitro systems for the study of hepatitis C virus infection. International journal of hepatology 2012, 292591, doi:10.1155/2012/292591 (2012).
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9 Dorner, M. et al. A genetically humanized mouse model for hepatitis C virus infection. Nature 474, 208-211, doi:10.1038/nature10168 (2011).
10 Lin, C. L. et al. Immunization with Epstein-Barr Virus (EBV) peptide-pulsed dendritic cells induces functional CD8+ T-cell immunity and may lead to tumor regression in patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma. Cancer research 62, 6952-6958 (2002).
11 Bhogal, R. H. et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS one 6, e18222, doi:10.1371/journal.pone.0018222 (2011).
<110> 醫諾生藥開發有限公司
<120> 能夠抑制C型肝炎病毒於人類脂肪幹細胞及肝細胞複製的肽及其衍生物
<130> FPCH13160112TW
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<141> 2015-04-16
<160> 4
<170> PatentIn版本3.3
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 兔α1-抗蛋白酶F的殘基1-14
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<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DEA的衍生物
<400> 2
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DEA的衍生物
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A11限制的埃-巴病毒特異性肽表位元
<400> 4
Claims (9)
- 一種有效量的肽的用途,係用於製備用於在受試者中治療或預防HCV感染或抑制HCV複製的藥物,其中所述肽係選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽。
- 如請求項1的用途,其中所述藥物進一步包含使用另一種抗HCV劑。
- 如請求項1的用途,其中HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
- 一種多核苷酸的用途,係用於製備治療HCV感染或抑制HCV複製的藥物,該多核苷酸包含:編碼選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽的核苷酸序列。
- 一種載體的用途,係用於製備治療HCV感染或抑制HCV複製的藥物,該載體包含編碼選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽的核苷酸序列。
- 一種宿主細胞的用途,係用於製備治療HCV感染或抑制HCV複製的藥物,該宿主細胞包含:(1)選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽,或(2)編碼選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽的核苷酸序列。
- 一種包含選自由DEAQETAVSSHEQD、QETAVSSHEQD及DEAQETAVSSHEQ所成群組之肽的藥物組合物在製備用於在受試者中治療或預防HCV感染或抑制HCV複製的藥物中的用途。
- 如請求項4至7項中任一項的用途,其中所述藥物進一步包含另一種抗HCV劑。
- 如請求項4至7項中任一項的用途,其中HCV具有基因型1a、1b、2a或2b或基因型3或基因型4。
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張健 等人,胃腸病學和肝病學雜誌2004年05期( 2004/07) , 455-457. * |
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