TWI636994B - Ｄｋｋ１抗體及使用方法 - Google Patents

Ｄｋｋ１抗體及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI636994B
TWI636994B TW105125647A TW105125647A TWI636994B TW I636994 B TWI636994 B TW I636994B TW 105125647 A TW105125647 A TW 105125647A TW 105125647 A TW105125647 A TW 105125647A TW I636994 B TWI636994 B TW I636994B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
antibodies
seq
dkk1
bone
Prior art date
Application number
TW105125647A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201710291A (zh
Inventor
威廉 葛林森 理查
盧瀗鍹
華祖 凱
李朝陽
弗瑞德艾瑞克Ｗ 賈科波斯
Original Assignee
安美基公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 安美基公司 filed Critical 安美基公司
Publication of TW201710291A publication Critical patent/TW201710291A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI636994B publication Critical patent/TWI636994B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本發明提供特異性結合DKK1多肽之抗體及其免疫功能性片段。亦提供製備該等抗體或其片段之方法，以及含有該等抗體或片段之生理學上可接受之組合物。亦揭示該等抗體及片段用於治療多種疾病之用途。

Description

DKK1抗體及使用方法
本發明係關於dickkopf-1(DKK1)蛋白之選擇性結合劑，且更特定言之，係關於介導對DKK1蛋白之選擇性結合的抗體及抗原結合域以及CDR區。
本申請案主張2010年10月27日申請之美國臨時申請案第61/407,128號之權益，該案係以引用的方式併入本文中。
本申請案與電子格式序列表一起申請。序列表以2011年9月21日建立之名為A-1574-WO-PCT_seqlist.txt且大小為72.1kb的檔案形式提供。電子格式序列表中之資訊係以全文引用的方式併入本文中。
個體一生中經歷兩個或三個不同的骨質變化階段(參見Riggs,West J.Med.154：63 77(1991))。第一階段在男性與女性中均出現且進行至達到峰值骨質。此係經由軟骨內生長板之線性生長及歸因於骨膜並置速率之徑向生長實現。對於小樑骨(較常見於脊椎骨及骨盆中之扁骨)，第二階段在約30歲時開始，且對於皮層骨(例如主要見於長骨中，諸如肢體中)，第二階段在約40歲時開始且持續至老年。此階段之特徵在於緩慢骨質流失且在男性與女性中均發生。在女性中，亦發生第三階段骨質流失，其很可能由停經後***缺乏引起。僅在此階段期間，女性可能自皮層骨及小樑代謝區流失額外骨質(參見Riggs，見上文)。
骨礦物質含量流失可由多種病狀引起且可引起重大醫學問題。舉例而言，骨質疏鬆症為使人類衰弱之疾病且其特徵在於患病個體中骨骼骨質及骨密度顯著降低、骨結構劣化(包括骨微架構退化及骨脆弱性相應提高(亦即骨強度降低))及易於骨折。人類骨質疏鬆症通常具有臨床骨質減少之先兆(骨密度低於青年人骨骼平均值超過1個標準差但小於2.5個標準差)，即在美國在約2千5百萬人中所見之病狀。在美國，另有7千8百萬患者已診斷患有臨床骨質疏鬆症(定義為骨礦物質含量低於成熟青年人骨骼之骨礦物質含量超過2.5個標準差)。人類群體中骨質疏鬆症發生率隨年齡增加。在高加索人(Caucasian)中，骨質疏鬆症主要在女性中發生，在美國，女性患者占所有骨質疏鬆症患者群的80%。在老年人中，骨骼脆弱性及易骨折性提高因該群體中偶然摔倒之風險較大而加重。最常見的與骨質疏鬆症有關之損傷包括髖部骨折、腕部骨折及脊椎骨折。髖部骨折尤其使患者極其不適且花費昂貴，且對於女性，與高死亡率及發病率有關。
儘管已認為骨質疏鬆症由於降低骨質而增加骨折風險，但目前幾乎尚無可用的骨病症治療可提高成年人骨密度，且大部分目前可用治療主要藉由抑制進一步骨骼再吸收而非刺激新骨形成來起作用。現指出***可延緩骨質流失。然而，關於患者是否獲得任何長期益處及***對75歲以上患者是否具有任何作用存在一些爭論。亦建議降血鈣素、含維生素K之骨鈣化素或高劑量膳食鈣(有或無維生素D)用於停經後女性。然而，高劑量鈣通常具有不良之胃腸副作用，且必須連續監測血清及尿液鈣含量(例如Khosla及Riggs,Mayo Clin.Proc.70：978982,1995)。
其他當前骨質疏鬆症治療方法包括雙膦酸鹽(例如FosamaxTM、ActonelTM、BonvivaTM、ZometaTM、奧帕膦酸鹽(olpadronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、斯凱利得(skelid)、骨膦(bonefos))、副甲狀腺 素、蓋西地克(calcilytic)、同化類固醇、鑭鹽及鍶鹽以及氟化鈉。然而，該等療法通常與不良副作用有關(參見Khosla及Riggs，見上文)。
Dickkopf-1(DKK1)為dickkopf蛋白家族之成員，已顯示其為Wnt信號傳導之負調節劑，Wnt信號傳導在骨發育及骨形成中具有重要作用(參見例如Glinka等人，Nature 391：357-62(1998)；Fedi等人，J Biol Chem 274(27)：19465-72(1999)；Zorn,Curr Biol 11：R592-95(2001)；及Krupnik等人，Gene 238：301-13(1999))。DKK1經由其與Wnt共受體LRP5或LRP6及克里門蛋白(kremen protein)之相互作用抑制Wnt信號傳導(參見例如Bafico等人，Nature Cell Biol 3：683(2001)；Mao等人，Nature 411(17)：321(2001)；Mao等人，Nature 417：664(2002)；及Semenov等人，Curr Biol 11：951-61(2001))。藉由結合LRP5(LRP6)及克里門蛋白，DKK1阻止LRP5或LRP6與Wnt路徑之成員結合且因此阻止Wnt介導之信號轉導，從而又引起骨形成抑制。
DKK1受體LRP5/6為調節骨質之關鍵蛋白質(參見例如Gong等人，Cell 107：513-23(2001)；Patel,N Eng J Med 346(20)：1572(2002))。已將特徵在於低骨質之常染色體隱性遺傳病(骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群，或「OPPG」)鑑別為由LRP5之功能損失型突變(loss-of-function mutation)引起(Gong等人，2001)。此外，已顯示LRP5之功能獲得型突變(gain-of-function mutation)引起人類常染色體顯性高骨質(Little等人，Am J Human Genetics.70(1)：11-19,2002)。LRP5中引起高骨質之相同突變可妨礙DKK1抑制LRP5信號傳導之能力(參見例如Boyden等人，N Eng J Med.346(20)：1513-1521,2002)。因此，DKK1宜特徵在於其為骨沈積之負調節劑。
在硬化性骨化病(sclerosteosis)(由骨骼過度生長及強緻密骨顯現之骨骼疾病)中無硬化蛋白(sclerostin)(SOST基因之產物)(Brunkow等人，Am.J.Hum.Genet.,68：577 589,2001；Balemans等人，Hum. Mol.Genet.,10：537 543,2001)。已顯示硬化蛋白之抑制劑增大骨礦化速率，因此提高骨密度(Padhi等人，J Bone Miner Res.2010年6月；在印刷前以電子檔案形式公開(epublished ahead of print))。同樣地，已顯示DKK1與骨形成調節有關(尤其在骨折修復中)，且其在與骨質流失有關的多種其他疾病(例如癌症及糖尿病)中起作用。
鑒於當前療法之缺陷，在骨質流失領域(諸如骨質疏鬆症)中需要改良之療法，且在其他骨病症中需要改良之骨折修復。
本文提供新穎DKK1抑制劑，其有效治療需要增加骨骼構建(bone building)之病狀，例如與病理學病狀(諸如多發性骨髓瘤)有關之骨折修復或骨質流失。此外，本文提供增加骨骼合成代謝之試劑組合，包括DKK1與硬化蛋白抑制劑之組合。該等組合可用於治療例如骨質疏鬆症，促進骨折癒合及多種需要提高骨骼建構速率之病狀。該組合可為兩種個別抑制劑，例如抗硬化蛋白抗體及抗DKK1抗體，或可為單一分子實體，例如包括雙特異性抗體之雙特異性分子。
本文亦提供多種結合DKK1之抗體。抗DKK1劑亦可阻斷或降低DKK1與LRP5及/或LRP6之間的結合，藉此刺激至少一種與Wnt信號傳導有關之活性。該等試劑可為抗體或其免疫功能性片段且因此包括具有天然存在結構之抗體以及具有抗原結合域之多肽(例如域抗體)。抗體及片段可用於治療多種不同疾病，包括預防或治療與骨質流失或刺激產生新骨有關之病狀，以及各種非骨骼相關病症。亦提供適用於產生抗體及選擇性結合劑之核酸分子、載體及宿主細胞。
所提供之一些抗體及免疫功能性片段包括一或多個以下輕鏈(LC)互補決定區(CDR)：(i)與SEQ ID NO：97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217或223具有至少80%序列一致性之LC CDR1；(ii) 與SEQ ID NO：98、104、110、116、122、128、134、139、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218或224具有至少80%序列一致性之LC CDR2；及(iii)與SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225具有至少80%序列一致性之LC CDR3。所提供之一些抗體及免疫功能性片段包括一或多個前述LC CDR及/或一或多個以下重鏈(HC)互補決定區(CDR)：(i)與SEQ ID NO：100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220或226具有至少80%序列一致性之HC CDR1；(ii)與SEQ ID NO：101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221或227具有至少80%序列一致性之HC CDR2；及(iii)與SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228具有至少80%序列一致性之HC CDR3。所提供之一些抗體及其免疫功能性片段亦包括一或多個以上LC CDR及一或多個以上HC CDR。
該等抗體或片段可特異性結合DKK1多肽。某些抗體或片段包括1、2、3、4、5或全部6種前述CDR。
其他抗體或片段之輕鏈及重鏈如上文所描述，但與前述序列具有至少90%序列一致性。其他抗體或其片段具有如下輕鏈：其中CDR1具有如SEQ ID NO：97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217或223中闡述之胺基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：98、104、110、116、122、128、134、139、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218或224中闡述之胺基酸序 列及/或CDR3具有如SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225中闡述之胺基酸序列。一些抗體及片段亦可具有如下重鏈：其中CDR1具有如SEQ ID NO：100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220或226中闡述之胺基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221或227中闡述之胺基酸序列及/或HC CDR3具有如SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228中闡述之胺基酸序列。某些抗體或片段包括具有SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225之胺基酸序列的輕鏈CDR3及/或具有SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228之胺基酸序列的重鏈CDR3。
所提供之某些其他抗體及免疫功能性片段包括(a)與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94具有80%、85%、90%、92%、95%或95%以上序列一致性之輕鏈可變區(VL)；(b)與SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96具有至少80%序列一致性之重鏈可變區(VH)；或(c)(a)之VL及(b)之VH。
其他抗體或片段在結構上類似，但VL與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、 78、82、86、90或94具有至少90%、92%或更佳95%序列一致性；且VH與SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96具有至少90%序列一致性。在某些抗體或片段中，VL與SEQ ID NO：84、28或32具有至少98%序列一致性；且VH與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94具有至少98%序列一致性。其他抗體或片段包括具有SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列的VL及/或具有SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列的VH。
一些抗體或片段包括輕鏈及/或重鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列或由SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列組成，且該重鏈包含SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列或由SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列組成。
亦包括特異性結合自SEQ ID NO：1中所示序列表現之成熟人類DKK1蛋白的分離之抗體或其免疫功能性片段，其中該抗體結合於包含兩個環之抗原決定基，該等環由SEQ ID NO：2之胺基酸220與237之間的二硫鍵及SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基245與263之間的二硫鍵形成。
所揭示之其他抗體或片段針對與DKK1多肽之特異性結合與諸如 上述抗體之抗體競爭。舉例而言，一些抗體及片段與由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈組成的抗體競爭，其中該等重鏈包含SEQ ID NO：42且該等輕鏈包含SEQ ID NO：44。
所提供之多種抗體及片段可包括單一輕鏈及/或重鏈或單一輕鏈可變域及/或單一重鏈可變域。其他抗體及片段包括兩條輕鏈及/或兩條重鏈。在抗體或片段包括兩條輕鏈及/或重鏈之情況下，兩條輕鏈在一些情況下彼此相同；同樣地，兩條重鏈在一些情況下相同。所提供之抗體可包括例如單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。免疫功能性片段可包括(但不限於)scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或域抗體。在某些情況下，抗體或片段以5×10-4或5×10-4以下之kd(koff)自DKK1多肽解離。
亦提供包括任何前述抗體及免疫活性片段之醫藥組合物。該等組合物通常亦包括緩衝劑、醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑或防腐劑。亦提供前述抗體及免疫活性片段在製備醫藥組合物或藥劑中之用途。
亦提供多種編碼前述抗體之核酸。一些核酸例如編碼(a)具有如SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89及/或93中闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR；及/或(b)具有如SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91及/或95中闡述之胺基酸序列的重鏈CDR，使得經編碼之CDR編碼可特異性結合DKK1多肽之抗體或其免疫功能性片段。某些其他核酸包含編碼抗體或免疫活性片段之輕鏈可變區(VL)及/或重鏈可變區(VH)之序列或由該序列組成，其中VL與SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89或93具有至少80%、90%或95%序列一致性且VH與SEQ ID NO： 11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91或95具有至少80%、90%或95%序列一致性。一些核酸包括編碼VL之序列及/或編碼VH之序列，該VL包含SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89或93或由SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89或93組成，且該VH包含SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91或95或由11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91或95組成。本文亦揭示包含前述核酸之表現載體及包含該等表現載體之細胞(例如CHO細胞)。亦描述藉由培養含有該等表現載體之細胞來產生抗體或其免疫活性片段之方法。
在另一態樣中，揭示前述結合劑(例如抗體或免疫功能性片段或其組合)在治療多種疾病中之用途。某些方法例如涉及向有需要之患者之骨骼損傷處投與有效量之本文所述之抗體或免疫活性片段或組合，包括(但不限於)矯形外科程序、牙科程序、移植手術、關節置換、骨移植、骨骼整形手術及骨修復，諸如骨折修復、不連接癒合(nonunion healing)、延遲連接癒合(delayed union healing)及面部重建(facial reconstruction)。可在程序、置換、移植、手術或修復或其他與骨損害有關之病症之前、期間及/或之後投與一或多種組合物。
此外本文提供治療或預防骨質流失之方法，其包含投與有需要之患者治療有效量之如本文所述之抗體或其免疫功能性片段(例如包含以下之抗體或免疫功能性片段：至少一個選自由SEQ ID NO：97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217或223中所示之胺基酸， 或SEQ ID NO：98、104、110、116、122、128、134、139、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218或224中所示之胺基酸，及SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225中所示之胺基酸組成之群的輕鏈CDR，及/或至少一個選自由SEQ ID NO：100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220或226中所示之胺基酸，SEQ ID NO：101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221或227中所示之胺基酸，及SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228中所示之胺基酸組成之群的重鏈CDR)。在此實施例之一態樣中，患者罹患轉移至骨骼之癌症，且在另一態樣中，患者罹患多發性骨髓瘤。在又一態樣中，患者選自患有骨質疏鬆症、骨質減少、佩吉特氏病(Paget's disease)、牙周炎、類風濕性關節炎及由不活動引起之骨質流失之患者。在其他實施例中，患者選自患有可能由或可能不由潛在骨質流失(諸如由骨質疏鬆症或與癌症有關之溶骨病變(例如多發性骨髓瘤)引起)引起之骨損害之患者。該骨損害之實例包括(但不限於)矯形外科程序、牙科程序、移植手術、關節置換(例如髖部置換、膝部置換等)、骨移植、骨骼整形手術及骨修復，諸如骨折癒合、不連接癒合、延遲連接癒合及面部重建。可在程序、置換、移植、手術或修復之前、期間及/或之後投與一或多種組合物。
在其他實施例中，患者選自患有骨質流失之患者，該骨質流失可能由或可能不由諸如由骨質疏鬆症、與癌症有關之溶骨病變(例如多發性骨髓瘤)引起之病狀引起。
在參考以下實施方式及隨附圖式後，本發明之該等及其他態樣將變得顯而易知。
圖1：人類DKK1抗體之抗原決定基位點。胰蛋白酶位點用實線箭頭表示且AspN位點用點線箭頭表示。胰蛋白酶位點在實線箭頭處且AspN位點在點線箭頭處。Ab 5.25.1之結合區包括兩個非連續部分，胺基酸98至104之第一部分及胺基酸107-121及127-140之區域。最後3個二硫鍵形成主要抗原決定基區域，其中所有胰蛋白酶位點均可由Ab 5.25.1保護。亦保護ARG102免於胰蛋白酶消化。藉由CNBr處理來移除胺基酸位置121-125不引起結合損失。標註為對AspN消化具有抗性之區域可能不能用於抗體結合。
圖2：圖A中泳道1僅包括LRP6-His；泳道2 rhDKK1-Flag；泳道3 hLRP6-His+hDKK1-Flag；泳道4 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.80.1；泳道5 hLRP6-His+hDKK1-Flag+6.37.5；泳道6 hLRP6-His+hDKK1-Flag+r11H10；泳道7 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.25.1；泳道8 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.77.1。圖B中泳道1包括LRP6-His；泳道2 rhDKK1-Flag；泳道3 hLRP6-His+hDKK1-Flag；泳道4 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg 5.80.1；泳道5 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 5.80.1；泳道6 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg 6.37.5；泳道7 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 6.37.5；泳道8 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg r11H10；泳道9 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg r11H10；泳道10hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 5.25.1；泳道11 hLRP6-His+hDKK1-F1ag+5μg 5.77.1。
圖3：展示在媒劑、PTH及不同量抗體2.40.2情況下3週時脛骨骨密度之變化百分比。20mg/kg劑量與媒劑顯著不同。
圖4：活體內測試來自5.25.1倉之抗體5.32.1及來自11H10倉之抗 體5.80.1增加骨鈣化素之能力。於2週期間向8週齡雄性BDF-1小鼠皮下注射三劑之一之純化單株抗體(3、10或30mg/kg)。每組使用6隻小鼠。向陰性對照小鼠注射媒劑(PBS)。
圖5：經3週每週2次向小鼠皮下注射25mg/kg個別抗體(6.37.5及6.116.6)。每組使用10隻小鼠。向對照組注射媒劑(每週2次)或PTH(100μg/kg，每週5次)。資料呈現為腰椎骨密度自基線之變化百分比。
圖6：在大鼠閉合性骨折癒合模型中用大鼠11H10倉抗體進行其他研究。此研究中利用完全大鼠11H10倉抗體r11H10作為本文所述之完全人類抗體之替代分子。在骨折骨痂處以抗DKK1處理達成之最大負載及BMD之改良表明骨折癒合得到促進。
圖7：偵測自疾病之動物模型分離之血清中的DKK1且DKK1蛋白含量在以藥理學試劑誘發腎臟損害後3週時升高約5倍。
除非本文另有定義，否則關於本發明所使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。通常，本文所述之關於細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交使用之命名法及該等學科之技術為此項技術中所熟知及常用之命名法及技術。除非另有指示，否則通常根據此項技術中所熟知且如貫穿本說明書所引用及討論之多種一般及較特定參考文獻中所述之習知方法來執行本發明之方法及技術。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常實現或如本文中所述來執行。本文所述之關於分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學使用之術語及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知及常用的。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療患者。
除非另有說明，否則本發明中所用之以下術語應理解為具有以下含義：如本文中所用，「DKK1」包括例如DKK1之大鼠、鼠類、食蟹獼猴及人類原生形式。編碼人類、鼠類、大鼠及食蟹獼猴DKK1蛋白之例示性核苷酸序列分別展示於SEQ ID NO：1、3、5及7中；相應胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO：2、4、6及8中。人類DKK1蛋白(SEQ ID NO：2)具有由SEQ ID NO：2之胺基酸1-31組成之前導序列(leader sequence)。例示性大鼠DKK1蛋白序列列於GenBank寄存號XP219804中。該術語亦包括該等原生序列之變異體，其與該等原生蛋白質免疫交叉反應。該等蛋白質可抑制LRP5或LRP6與Wnt之間的相互作用。該術語亦指DKK1之原生或變異形式之片段，其含有抗體可特異性結合之抗原決定基。
術語「聚核苷酸」或「核酸」意謂單股或雙股聚合物。構成聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸酯。該術語包括單股與雙股形式。
術語「寡核苷酸」意謂包含200個或200個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸之長度為10至60個鹼基。在其他實施 例中，寡核苷酸之長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股，例如用於構築突變基因。
「分離之核酸分子」意謂基因組DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成來源或其一些組合，其與全部聚核苷酸或聚核苷酸之一部分不相關聯(其中在自然界中發現分離之聚核苷酸)或連接於其在自然界中不連接之聚核苷酸。為達成本發明之目的，應理解，「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。除指定序列外，「包含」指定核酸序列之分離之核酸分子可包括多達10種或甚至多達20種其他蛋白質之編碼序列或其部分，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調節序列及/或可包括載體序列。
除非另有規定，否則本文討論之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。5'至3'添加初生RNA轉錄物之方向稱為轉錄方向；具有與RNA轉錄物相同之序列之DNA股上位於RNA轉錄物5'端之5'的序列區稱為「上游序列」；具有與RNA轉錄物相同之序列之DNA股上位於RNA轉錄物3'端之3'的序列區稱為「下游序列」。
術語「控制序列」係指可影響其所接合之編碼序列之表現及處理的聚核苷酸序列。該等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括啟動子，該等啟動子包含轉錄因子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列之一個或複數個識別位點。本發明之「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適用於宿主細胞之轉 型且含有引導及/或控制(結合宿主細胞)可操作地連接之一或多個異源編碼區之表現之核酸序列的載體。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯及(若存在內含子)影響可操作地連接之編碼區之RNA剪接的序列。
如本文中所用，「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分具有允許其在適合條件下執行其固有功能的關係。舉例而言，載體中「可操作地連接」於蛋白質編碼序列之控制序列與蛋白質編碼序列接合以便在與控制序列之轉錄活性相容之條件下達成蛋白編碼序列之表現。
術語「宿主細胞」意謂已藉由核酸序列轉型或能夠藉由核酸序列轉型且藉此表現相關基因之細胞。該術語包括親本細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始親本細胞一致，只要存在相關基因即可。
術語「轉導」意謂基因自一個細菌轉移至另一個細菌，通常藉由噬菌體進行。「轉導」亦指藉由反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂細胞吸收外部或外源DNA，且當外源DNA被引入細胞膜內部時，細胞經「轉染」。許多轉染技術已在此項技術中熟知且揭示於本文中。參見例如Graham等人，1973,Virology 52：456；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Id.；Davis等人，1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；及Chu等人，1981,Gene 13：197。該等技術可用於將一或多個外源DNA部分引入適合宿主細胞中。
術語「轉型」係指細胞遺傳特徵改變，且當細胞經修飾從而含有新DNA或RNA時，細胞經轉型。舉例而言，當細胞藉由轉染、轉導或其他技術引入新遺傳物質而自其原生狀態經遺傳修飾時，細胞經轉型。在轉染或轉導後，可藉由將轉型DNA物理整合至細胞染色體中使 其與細胞DNA重組，或轉型DNA可以游離元件形式短暫維持而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉型DNA隨細胞***複製時，將細胞視為已經「穩定轉型」。
術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有原生蛋白質之胺基酸序列之巨分子，亦即由天然存在且非重組型細胞產生之蛋白質，或由經遺傳工程改造或重組型細胞產生之蛋白質，且包含具有原生蛋白質之胺基酸序列之分子，或原生序列之一或多個胺基酸經缺失、添加及/或取代的分子。術語「多肽」及「蛋白質」特定地涵蓋抗DKK1抗體，或抗DKK1抗體之一或多個胺基酸經缺失、添加及/或取代的序列。術語「多肽片段」係指與全長原生蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。與原生蛋白質相比，該等片段亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長度可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。本發明之適用多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在抗DKK1抗體情況下，適用片段包括(但不限於)CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分或僅其可變區(包括兩個CDR)及其類似物。
本文提及之術語「分離之蛋白質」意謂滿足以下條件之標的蛋白質：(1)不含通常與其一起發現之至少一些其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%的其在自然界中所結合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)與在自然界中不與其結合之多肽可操作地結合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)在自然界中不存在。基因組DNA、cDNA、mRNA或合成來源之其他RNA或其任何組合皆可編碼該分離之蛋白質。分離之蛋白質較佳實質上不含見於其天然環境中之蛋白質或多肽或其他污染物，此等物質將干擾其治 療、診斷、預防、研究或其他用途。
多肽(例如抗體)之「變異體」包含胺基酸序列，其中相對於另一多肽序列，一或多個胺基酸殘基***胺基酸序列中，自胺基酸序列缺失及/或取代入胺基酸序列中。本發明之變異體包括融合蛋白質。
多肽之「衍生物」為以一些與***、缺失或取代變異體不同之方式經化學修飾(例如經結合於另一化學部分)的多肽(例如抗體)
術語「抗體」係指任何同型完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合於與目標抗原之片段，且包括嵌合抗體、人類化抗體、完全人類抗體及雙特異性抗體。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，諸如天然存在於駱駝中之抗體可僅包含重鏈。本發明之抗體可僅自單一來源獲得，或可為「嵌合」，亦即抗體之不同部分可自兩種不同抗體獲得。舉例而言，可自大鼠或鼠類來源獲得CDR區，而自不同動物來源(諸如人類)獲得V區之構架區。可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解在融合瘤中產生本發明之抗體或結合片段。除非另有指示，否則術語「抗體」除包括包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體外亦包括其衍生物、變異體、片段及突變形成之蛋白質(mutein)，其實例描述如下。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足夠可變區序列以賦予結合特異性之片段。全長輕鏈包括可變區域VL及恆定區域CL。輕鏈可變區域位於多肽之胺基端處。本發明之輕鏈包括κ鏈及λ鏈。
術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足夠可變區序列以賦予結合特異性之片段。全長重鏈包括可變區域VH及三個恆定區域CH1、CH2及CH3。VH域位於多肽之胺基端且CH域位於羧基端，其中CH3最靠近--COOH端。本發明之重鏈可具有任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型)、IgA(包括IgA1及IgA2亞型)、IgM及 IgE。
如本文中所用，術語免疫球蛋白鏈之「免疫功能性片段」(或簡稱「片段」)係指抗體輕鏈或重鏈之一部分，其至少缺乏一些存在於全長鏈中之胺基酸但能夠特異性結合於抗原。該等片段由於其特異性結合於目標抗原且可與完整抗體競爭特異性結合於既定抗原決定基而具有生物學活性。在本發明之一態樣中，該片段將保留至少一個存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。該等生物學活性片段可由重組DNA技術產生，或可由完整抗體之酶促或化學裂解產生。本發明之免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗體及單鏈抗體，且可自任何哺乳動物來源獲得，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔類。此外預期本發明抗體之功能性部分(例如一或多個CDR)可共價結合於第二蛋白質或小分子以產生針對體內特定目標、具有雙功能治療性質或具有延長之血清半衰期的治療劑。
「Fab片段」包含一條輕鏈，及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
「Fc」區含有兩個重鏈片段，其包含抗體之CH2及CH3域且在一些情況下包含下鉸鏈區。兩個重鏈片段藉由兩個或兩個以上二硫鍵(通常於絞鏈區中)及CH3域之疏水性相互作用結合在一起。
「Fab'片段」含有一條輕鏈，及一條重鏈之一部分，其含有VH域及CH1域以及CH1域與CH2域之間的區域，使得可在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈，及兩條重鏈，其含有CH1域與CH2域之間的恆定區之一部分，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')2片段由藉由兩條重鏈之間的二硫鍵結合在一起的兩個Fab'片段構成。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
「單鏈抗體」為重鏈與輕鏈可變區已由可撓性連接子連接以形成構成抗原結合區之單一多肽鏈的Fv分子。單鏈抗體詳細討論於國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號中。
「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區與肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性(參見下文)。
「多特異性抗體」為靶向一種以上抗原或抗原決定基之抗體。
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗體為具有兩個不同抗原結合位點之雜合抗體。雙特異性抗體為一種多特異性抗體且可由多種方法產生，該等方法包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接。參見例如Songsivilai及Lachmann(1990),Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，(1992),J.Immunol.148：1547-1553。雙特異性抗體之兩個結合位點將結合於可位於相同或不同蛋白質目標上之兩個不同抗原決定基。
術語「中和抗體」係指結合於配位體、阻止配位體結合於其結合搭配物且中斷否則由配位體結合於結合搭配物引起之生物反應的抗體。在評估抗體或其免疫功能性片段之結合及特異性時，當過量抗體使結合於配位體之結合搭配物之量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%99%或99%以上時(如於活體外競爭性結合檢定中量測)，抗體或片段將實質上抑制配位 體結合於其結合搭配物。在針對DKK1之抗體的情況下，中和抗體將削弱DKK1結合LRP5或LRP6之能力，藉此誘導Wnt活性可量測之提高。
當用於針對相同抗原決定基進行競爭之抗體情形中時，術語「競爭」意謂藉由檢定測定抗體之間的競爭，其中所測試抗體或免疫功能性片段阻止或抑制參考抗體與共同抗原(例如DKK1或其片段)特異性結合。可使用眾多類型之競爭結合檢定，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭檢定(參見例如Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記檢定、固相直接標記夾心檢定(參見例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung等人，(1990)Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，該檢定涉及使用結合於固體表面之純化抗原或帶有該等抗原中任一者之細胞、未經標記之測試免疫球蛋白及經標記之參考免疫球蛋白。藉由在測試免疫球蛋白存在下測定結合於固體表面或細胞之標記量來量測競爭性抑制。通常，測試免疫球蛋白過量存在。由競爭檢定鑑別之抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合於相同抗原決定基的抗體及結合於足夠接近於由參考抗體所結合之抗原決定基的鄰近抗原決定基以便出現位阻之抗體。關於測定競爭結合之方法的其他細節提供於本文實例中。通常，當競爭抗體過量存在時，其將參考抗體與共同抗原之特異性結合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，選擇性結合劑(諸如抗體)將結合抑 制至少80%、85%、90%、95%或97%或97%以上，且此外能夠用於動物中以產生能夠結合於該抗原之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗體相互作用之抗原決定基。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白或T細胞受體之任何決定子。抗原決定基為抗原之區域，其由特異性靶向該抗原之抗體結合，且當抗原為蛋白質時，抗原決定基包括直接接觸抗體之特異性胺基酸。最通常，抗原決定基位於蛋白質上，但在一些情況下，可位於其他種類之分子(諸如核酸)上。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面基團(chemically active surface grouping)，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。通常，對特定目標抗原具有特異性之抗體將優先識別蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中目標抗原上的抗原決定基。
當解離常數(Kd)為1×10-7M時，將本發明抗體稱為「特異性結合」其目標抗原。當Kd為1×10-8時，抗體以「高親和力」特異性結合抗原，較高親和力為M 5×10-9M，且當Kd為5×10-10M時，抗體以「極高親和力」特異性結合抗原。在本發明之一實施例中，抗體之Kd為1×10-9M且脫附速率為約1×10-4/秒。在本發明之一實施例中，脫附速率<1×10-5。在本發明之其他實施例中，抗體將以介於約1×10-8M與1×10-10M之間的Kd結合於人類DKK1，且在又一實施例中，其將以Kd 2×10-10結合。熟習此項技術者將認識到特異性結合並非意謂獨佔結合，實情為其允許一定程度的非特異性結合，典型的如在彼此具有親和力之基團之間的生物反應中。
術語「一致性」係指如藉由比對及比較序列所測定，兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間之相同殘基的百分比，且基於所比較之最小分子之尺寸來計算。對於此等計算，必須 藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理比對中之空隙(若存在)。可用於計算比對之核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中描述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.48：1073。
在計算一致性百分比時，以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。用於測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl Acid Res 12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wisc.)。使用電腦演算法GAP來比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其個別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配範圍」，如由演算法測定)。空隙開放罰分(其計算為3×平均對角線，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線之平均值；「對角線」為由特定比較矩陣賦予各完美胺基酸匹配之分數或數字)及空隙擴展罰分(其通常為1/10×空隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比之推薦參數 如下：Algorithm：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，見上文；
空隙罰分：12(但最末空隙無罰分)
空隙長度罰分：4
相似性臨限值：0
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可能產生兩個序列之僅較短區域的匹配，且此小比對區域可能具有極高序列一致性，即使在兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若需要產生涵蓋目標多肽之至少50個鄰接胺基酸的比對，則可調整所選比對方法(GAP程式)。
如本文中所用，「實質上純」意謂所述分子物質為主要存在物質，亦即以莫耳濃度計，其比同一混合物中之任何其他個別物質均更豐富。在某些實施例中，實質上純之分子為目標物質占所存在之所有巨分子物質的至少50%(以莫耳濃度計)之組合物。在其他實施例中，實質上純之組合物將占組合物中所存在之所有巨分子物質的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，將目標物質純化至必需均質性，其中藉由習知偵測方法未能在組合物中偵測到污染物質，因此組合物由單一可偵測巨分子物質組成。
術語「骨質減少」係指與視為具有正常骨密度(BMD)之標準患者相比具有至少一個標準差之骨質流失的患者。為達成本發明之目的，藉由雙重能量X射線吸光測定法(Dual Energy X-ray Absorptiometry；DEXA)測定量測值且比較患者BMD與年齡及性別匹配之標準(Z分數)。在測定骨質減少時，可獲得一或多種骨骼之BMD量測值。
術語「治療有效量」係指經測定在哺乳動物中產生治療反應之抗DKK1抗體量。該等治療有效量可由一般技術者輕易確定。
「胺基酸」包括其在此項技術中之正常含義。20種天然存在胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology--A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Gren編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)。20種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α,α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸亦可為適用於本發明之多肽之組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向且右手方向為羧基端方向。
本發明提供新穎組合物，其包含對DKK1(例如由SEQ ID NO：2之胺基酸32至266組成之多肽)具有特異性之免疫球蛋白之抗體及抗原結合位點。一些該等抗體及抗體片段可與來自若干種哺乳動物來源之DKK1(包括大鼠、小鼠、食蟹獼猴及人類DKK1)交叉反應。一些抗體及片段對一種物種之DKK1之親和力高於對另一物種之DKK1之親和力(例如一些抗體及片段對人類DKK1之親和力高於對大鼠或鼠類DKK1之親和力；其他抗體對大鼠或鼠類DKK1之親和力高於對人類DKK1之親和力)。本發明亦提供新穎中和抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體，以及結合人類DKK1中構形抗原決定基之抗體及其免疫功能性片段。亦揭示編碼該等抗體及片段之核酸以及使用該等核酸表現抗體之方法。在另一態樣中，本發明係關於能夠呈現抗體抗原結合位點之免疫結合性質之分子(例如免疫功能性片段及多肽)。
本文揭示之抗體及免疫功能性片段具有多種用途。舉例而言，一些抗體及片段適用於特異性結合檢定、DKK1或其配位體之親和力純化及鑑別其他DKK1活性拮抗劑之篩選檢定。某些抗體可用於治療 多種與DKK1活性有關之疾病。因此一些抗體及片段可用於與骨有關之多種治療，諸如提高骨密度、合成新骨、治療全身性骨質流失(例如骨侵蝕)、骨修復及治療各種形式關節炎。一些抗體亦可用於提高蝕骨細胞活性及誘導骨骼再吸收。然而，某些所揭示之抗體及片段可用於治療與骨疾病無關的多種不同疾病。如下文更詳細描述，該等疾病之實例包括需要促進幹細胞更新之疾病(例如糖尿病及肌肉疾病)、發炎疾病(例如克隆氏病(Crohn's diseas)及發炎性腸病)、神經疾病、眼病、腎病及各種皮膚病。
提供多種適用於調節DKK1活性之選擇性結合劑。該等試劑包括例如以下抗體及其免疫功能性片段：其含有抗原結合域(例如單鏈抗體、域抗體、免疫黏附物及具有抗原結合區之多肽)且特異性結合於DKK1多肽(例如人類、大鼠及/或鼠類DKK1多肽)。一些試劑例如適用於抑制DKK1與LRP5及/或LRP6結合，因此可用於刺激與Wnt信號傳導有關的一或多種活性。
一些所提供之結合劑具有通常與天然存在抗體相關之結構。該等抗體之結構單元通常包含一或多個四聚物，各自由相同的兩對多肽鏈構成，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在一典型抗體中，各對包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中為約25kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中為約50-70kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干個「免疫球蛋白域」構成，各免疫球蛋白域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵摺疊圖案。該等域為構成抗體多肽之基本單元。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變域。羧基端部分與另一鏈端相比在進化方面更保守且稱為「恆定區」或「C區」。人類輕鏈通常分類為κ輕鏈及λ輕鏈，其各自含有1個可變域及1個恆定域。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε鏈，且該等鏈分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括 (但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM1及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈C區通常包含可負責效應子功能之一或多個域。重鏈恆定區域之數目將視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各含有三個C區域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有該等同型及亞型中之任一者。在本發明之某些實施例中，抗DKK1抗體具有IgG1、IgG2或IgG4亞型。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區與恆定區藉由「J」區(約12個或12個以上胺基酸)接合，其中重鏈亦包括「D」區(約10個或10個以上胺基酸)。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
免疫球蛋白鏈之可變區通常顯示相同整體結構，其包含由3個更常稱為「互補決定區」或CDR之高變區接合之相對保守構架區(FR)。來自上述各重鏈/輕鏈對之兩條鏈的CDR通常藉由構架區比對以形成與目標蛋白質(例如DKK1)上特異性抗原決定基特異性結合之結構。自N端至C端，天然存在之輕鏈與重鏈可變區兩者通常均與該等元件之下列順序相符：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計出對佔據該等域每一者中之位置的胺基酸分配編號的編號系統。該編號系統定義於Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987及1991,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883中。
表1中分別提供人類(SEQ ID NO：1及2)、小鼠(SEQ ID NO：3及4)、大鼠(SEQ ID NO：5及6)及食蟹獼猴(SEQ ID NO：7及8)核酸及蛋 白質DKK1序列。亦提供本文中提供之抗體之輕鏈及重鏈之特定實例及其相應核苷酸及胺基酸序列。序列識別符提供於最左側行中，中間行為序列(核酸或蛋白質)且最右側行為序列之內部名稱。此外，提供個別CDR(SEQ ID NO：97-228)。Vh=可變重鏈；Vk=可變κ輕鏈；Vl=可變λ輕鏈。
熟習此項技術者應瞭解與全長抗體之序列(額外包含恆定區)相比，圖1中展示之序列(涵蓋重鏈與輕鏈之可變區)之間的區別。可使用此項技術中熟知的標準技術組合可變域與適當恆定域。表1中所列之各輕鏈可與表1中展示之任一重鏈(例如SEQ ID NO：242或244中所示之多肽)組合以形成抗體。在一些情況下，抗體包括表1中所列之至少一條重鏈及一條輕鏈。在其他情況下，抗體含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。舉例而言，抗體或免疫功能性片段可包括兩條L1輕鏈及兩條H1重鏈，或兩條L2輕鏈及兩條H3重鏈，或兩條L2輕鏈及兩條H4重鏈，或兩條L2輕鏈及兩條H5重鏈，及如表1中所列之輕鏈對及重鏈對之其他類似組合。
其他所提供之抗體為組合表1中展示之重鏈與輕鏈形成之抗體的變異體，且包含各自與該等鏈之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%一致性的輕鏈及/或重鏈。在一些情況下，該等抗體包括至少一條重鏈及一條輕鏈，而在其他情況下，該等變異形式含有兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈。
某些抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處與本文所述之輕鏈可變域之序列不同的胺基酸序列，其中各該序列差異獨立地為缺失、***或取代一個胺基酸。一些抗體中之輕鏈可變區包含與表1中之輕鏈可變區之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的胺基酸序列。
一些所提供之抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處 與表1中之重鏈可變域之序列不同的胺基酸序列，其中各該序列差異獨立地為缺失、***或取代一個胺基酸。一些抗體中之重鏈可變區包含與表1中展示之重鏈可變區之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%序列一致性的胺基酸序列。其他抗體或免疫功能性片段包括剛描述之變異型輕鏈及變異型重鏈之變異形式。
可使用由Kabat等人於Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開號91-3242,1991中描述之系統鑑別既定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。
所提供之抗體及免疫功能性片段可包括1種、2種、3種、4種、5種或全部6種上述CDR。一些抗體或片段包括輕鏈CDR3與重鏈CDR3。某些抗體具有CDR之變異形式，其中一或多個(亦即2、3、4、5或6個)CDR各自與CDR序列具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。舉例而言，抗體或片段可包括輕鏈CDR3與重鏈CDR3，其分別各自與輕鏈CDR3序列及重鏈CDR3具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性。一些所提供之抗體之CDR序列亦可與表1中之CDR序列不同，使得任何既定CDR之胺基酸序列中不超過1、2、3、4或5個胺基酸殘基與表1中所列之序列不同。與所列序列之差異通常為保守性取代(參見下文)。
如下文更詳細描述，包含一或多個輕鏈或重鏈CDR之多肽可藉由使用適合載體在適合宿主細胞中表現多肽來產生。表1中揭示之重鏈及輕鏈可變區以及CDR可用於製備此項技術中已知的各種類型之免疫功能性片段中之任一者，包括(但不限於)域抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈抗體及scFvs。
舉例而言，當據稱抗體結合指定殘基(諸如DKK1)內之抗原決定 基時，其意謂抗體特異性結合於由指定殘基(例如DKK1之指定區段)組成之多肽。該抗體不一定接觸DKK1內之每一殘基。DKK1內之每一單胺基酸取代或缺失亦未必顯著影響結合親和力。可以多種方式測定抗體之精確抗原決定基特異性。舉例而言，一種方法涉及測試涵蓋DKK1序列且在少量胺基酸(例如3個胺基酸)之增量方面不同的約15個胺基酸之重疊肽之集合。將肽固定於微量滴定盤之孔內。可藉由生物素標記肽之一端來實現固定。視情況，可使相同肽之不同樣品在N端及C端經生物素標記且固定於個別孔中以便比較。此適用於鑑別末端特異性抗體。視情況可包括在特定相關胺基酸處封端之其他肽。此方法適用於鑑別DKK1之內部片段的末端特異性抗體。針對與各種肽中之每一者之特異性結合篩選抗體或免疫功能性片段。抗原決定基係定義為出現有由抗體展示特異性結合之所有肽共有之胺基酸區段。
亦提供結合於位於DKK1之羧基端部分之構形抗原決定基之抗體及其功能性片段(參見表1)。DKK1之羧基端含有若干個半胱胺酸殘基，其形成二硫鍵之叢集從而產生若干個環。本發明提供結合於該等環中之兩者從而中和DKK1抑制Wnt活性之能力的抗體。能夠結合於上述構形抗原決定基之例示性抗體為單株抗體11H10及1F11，其各包含輕鏈及重鏈。該等抗體詳細描述於美國專利第7,709,611號中。
包含該兩個環之抗原決定基由SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基220與237之間的二硫鍵及SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基245與263之間的二硫鍵形成。因此，形成抗原決定基之兩個環之主體包括SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及246-262。該環內涉及結合之區段包括SEQ ID NO：2之胺基酸221-229及SEQ ID NO：2之胺基酸246-253。因此，某些本文中提供之抗體及片段特異性結合於前述區域。舉例而言，一些抗體及片段結合於包含SEQ ID NO：2之胺基酸221至262或由SEQ ID NO：2之胺基酸221至262組成之肽。
在本發明之一態樣中，提供包含SEQ ID NO：2之胺基酸221-229及/或246-253或由SEQ ID NO：2之胺基酸221-229及/或246-253組成之肽。其他肽包含SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及/或246-262或由SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及/或246-262組成。其他所提供之肽包含SEQ ID NO：2之221至262區域或SEQ ID NO：2之胺基酸221-253或由SEQ ID NO：2之221至262區域或SEQ ID NO：2之胺基酸221-253組成。該等肽比原生DKK1之全長蛋白質序列短(例如肽可包括一或多個前述區域且長度為8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、30、40、50、75、100、150或200個胺基酸)。該等肽可與另一肽融合以增加免疫原性且因此呈融合蛋白質形式。
亦提供與一種例示抗體或功能性片段競爭特異性結合於DKK1之抗體及其免疫功能性片段。該等抗體及片段亦可與一種例示抗體結合於同一抗原決定基。預期與例示抗體或片段競爭或與例示抗體或片段結合於同一抗原決定基之抗體及片段展示類似功能性質。例示抗體及片段包括上述抗體及片段，包括具有表1中所列重鏈及輕鏈、可變區域及CDR之抗體及片段。競爭抗體或免疫功能性片段可包括結合於上文抗體及抗原決定基章節中所述之抗原決定基。
作為特定實例，一些競爭抗體或片段包括特異性結合由SEQ ID NO：2之胺基酸32至266組成之DKK1蛋白且可阻止或降低由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈組成之抗體與人類DKK1之結合的抗體或片段。其他競爭抗體阻止或降低由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈(諸如表1中所列者)組成之抗體與人類DKK1之結合。
所提供之抗體包括結合於DKK1之單株抗體。可使用此項技術中已知的任何技術產生單株抗體，例如藉由在完成免疫時程後使自轉殖基因動物獲得之脾細胞永生化。可使用此項技術中已知的任何技術使脾細胞永生化，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。適用 於產生融合瘤之融合程序之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率且酶不足，使得其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。適用於小鼠融合之細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞株之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。其他適用於細胞融合之細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，如下產生融合瘤細胞株：用DKK1免疫原使動物(例如具有人免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)免疫；自免疫之動物獲得脾細胞；使所得脾細胞與骨髓瘤細胞株融合藉此產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞產生融合瘤細胞株及鑑別產生結合DKK1多肽之抗體的融合瘤細胞株。本發明涵蓋該等融合瘤細胞株及由其產生之抗DKK1單株抗體。
可使用抗體技術中已知的任何適用技術純化由融合瘤細胞株分泌之單株抗體。可進一步篩選融合瘤或mAb以鑑別具有特定性質(諸如阻斷Wnt誘導之活性之能力)之mAb。該等篩選之實例提供於以下實例中。
亦提供基於上述序列之嵌合抗體及人類化抗體。適用作治療劑之單株抗體可在使用之前以各種方式經修飾。一個實例為「嵌合」抗體，其為由來自不同抗體之蛋白質區段構成之抗體，該等區段共價接合以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能性部分。通常，重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源。與嵌合抗體有關之方法參見例如美國專利第4,816,567號；及 Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1985)。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
通常，製造嵌合抗體之目標為產生來自預定患者物種之胺基酸數目得到最大化之嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之互補決定區(CDR)，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源。為用於人類，來自齧齒動物抗體之V區或所選CDR通常經移植入人類抗體中，置換人類抗體之天然存在之V區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。人類化抗體通常自最初在非人類動物中產生之單株抗體產生。該單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)通常經修飾成與相應同型之人類抗體中的相應殘基同源。可例如使用多種方法藉由用齧齒動物可變區之至少一部分取代人類抗體之相應區域來進行人類化(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321：522-25；Riechmann等人，1988,Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-36)。在某些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起用於產生雜合抗體。
亦提供完全人類抗體。可獲得製造對既定抗原具有特異性之完全人類抗體而不使人類暴露於抗原(「完全人類抗體」)的方法。一種用於實施完全人類抗體之產生的方法為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已不活化之小鼠體內為一種在小鼠(一種可用任何所需抗原進行免疫之動物)體內產生完全人類單株抗體(mAb)之方法。使用完全人類抗體可使免疫原性及過敏性反應減至最小，該等反應有時可由向人類投與小鼠或小鼠來源 之mAb作為治療劑所引起。
完全人類抗體可藉由對能夠在未產生內源性免疫球蛋白下產生人類抗體譜之轉殖基因動物(通常為小鼠)進行免疫來製造。為此目的，抗原通常具有6個或6個以上相鄰胺基酸，且視情況結合於載體(諸如半抗原)。參見例如Jakobovits等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，1993,Year in Immunol.7：33。在該方法之一實例中，如下產生轉殖基因動物：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，及向小鼠基因組中***含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座之人類基因組DNA的大片段。接著對具有少於一整套人類免疫球蛋白基因座之經部分修飾之動物進行雜交育種以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，該等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性、但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之其他細節參見例如WO96/33735及WO94/02602。有關用於製造人類抗體之轉殖基因小鼠之其他方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；PCT公開案WO91/10741、WO90/04036以及EP 546073B1及EP 546073A1中。
上述轉殖基因小鼠(本文中稱為「HuMab」小鼠)含有編碼未經重排之人類重鏈(μ及γ)及κ免疫球蛋白輕鏈序列之人免疫球蛋白基因微型基因座，以及使內源μ及κ鏈基因座不活化之目標突變(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。
因此，上述小鼠呈現降低之小鼠IgM或κ之表現且反應於免疫，且引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG κ單株抗體(Lonberg等人，見上文；Lonberg及 Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.,13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠之製備詳細描述於Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research,20：6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1994,J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14：845-851中。此外參見美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；國際公開案第WO 93/1227號；第WO 92/22646號；及第WO 92/03918號。用於在該等轉殖基因小鼠中產生人類抗體之技術亦揭示於WO 98/24893及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156中。舉例而言，HCO7及HCO12轉殖基因小鼠品系可用於產生人類抗DKK1抗體。
使用融合瘤技術，可自轉殖基因小鼠(諸如上述轉殖基因小鼠)產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類MAb。可使用適合載體及宿主細胞來選殖及表現該等抗體，或可自所培養之融合瘤細胞獲得抗體。
完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現文庫(如Hoogenboom等人，1991,J.Mol.Biol.227：381；及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222：581中所揭示)。噬菌體呈現技術經由在絲狀噬菌體表面上呈現抗體譜且隨後藉由噬菌體與所選抗原結合來選擇噬菌體來模擬免疫選擇。一種該技術描述於PCT公開案第WO 99/10494號中，其描述使用 該方法來分離MPL受體及msk受體之高親和力及功能性激動性抗體(functional agonistic antibody)。
本文中提供之抗DKK1劑亦可阻斷或降低DKK1與LRP5及/或LRP6之間的結合，藉此刺激至少一種與Wnt信號傳導有關之活性。該等試劑可為抗體或其免疫功能性片段，因此包括具有天然存在結構之抗體，以及具有抗原結合域之多肽(例如域抗體)。抗體及片段可用於治療多種不同疾病，包括預防或治療與骨質流失或刺激產生新骨有關之病狀，以及各種非骨骼相關病症。亦提供適用於產生抗體及選擇性結合劑之核酸分子、載體及宿主細胞。
所提供之一些抗體及免疫功能性片段包括一或多個以下輕鏈(LC)互補決定區(CDR)：(i)與SEQ ID NO：97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217或223具有至少80%序列一致性之LC CDR1；(ii)與SEQ ID NO：98、104、110、116、122、128、134、139、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218或224具有至少80%序列一致性之LC CDR2；及(iii)與SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225具有至少80%序列一致性之LC CDR3。所提供之一些抗體及免疫功能性片段包括一或多個前述LC CDR及/或一或多個以下重鏈(HC)互補決定區(CDR)：(i)與SEQ ID NO：100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220或226具有至少80%序列一致性之HC CDR1；(ii)與SEQ ID NO：101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221或227具有至少80%序列一致性之HC CDR2；及(iii)與SEQ ID NO：102、108、114、120、 126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228具有至少80%序列一致性之HC CDR3。所提供之一些抗體及其免疫功能性片段亦包括一或多個以上LC CDR及一或多個以上HC CDR。
該等抗體或片段可特異性結合DKK1多肽。某些抗體或片段包括1、2、3、4、5或全部6種前述CDR。
其他抗體或片段之輕鏈及重鏈如上文所描述，但與前述序列具有至少90%序列一致性。其他抗體或其片段具有如下輕鏈：其中CDR1具有如SEQ ID NO：97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181、187、193、199、205、211、217或223中闡述之胺基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：98、104、110、116、122、128、134、139、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218或224中闡述之胺基酸序列及/或CDR3具有如SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、195、201、207、213、219或225中闡述之胺基酸序列。一些抗體及片段亦可具有如下重鏈：其中CDR1具有如SEQ ID NO：100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184、190、196、202、208、214、220或226中闡述之胺基酸序列，CDR2具有如SEQ ID NO：101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221或227中闡述之胺基酸序列及/或HC CDR3具有如SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228中闡述之胺基酸序列。某些抗體或片段包括具有SEQ ID NO：99、105、111、117、123、129、135、140、147、153、159、165、171、177、183、189、 195、201、207、213、219或225之胺基酸序列的輕鏈CDR3及/或具有SEQ ID NO：102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180、186、192、198、204、210、216、222或228之胺基酸序列的重鏈CDR3。
所提供之某些其他抗體及免疫功能性片段包括(a)與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94具有80%、85%、90%、92%、95%或95%以上序列一致性之輕鏈可變區(VL)；(b)與SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96具有至少80%序列一致性之重鏈可變區(VH)；或(c)(a)之VL及(b)之VH。
其他抗體或片段在結構上類似，但VL與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94具有至少90%、92%或更佳95%序列一致性；且VH與SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96具有至少90%序列一致性。在某些抗體或片段中，VL與SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94具有至少98%序列一致性；且VH與SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96具有至少98%序列一致性。其他抗體或片段包括具有SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列的VL及/或具有SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列的VH。
一些抗體或片段包括輕鏈及/或重鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列或由SEQ ID NO：10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90或94之胺基酸序列組成，且該重鏈包含SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列或由SEQ ID NO：12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96之胺基酸序列組成。
亦包括特異性結合自SEQ ID NO：1中所示序列表現之成熟人類DKK1蛋白的分離之抗體或其免疫功能性片段，其中該抗體結合於包含兩個環之抗原決定基，該等環由SEQ ID NO：2之胺基酸220與237之間的二硫鍵及SEQ ID NO：2之半胱胺酸殘基245與263之間的二硫鍵形成。
所揭示之其他抗體或片段與諸如上述抗體之抗體競爭特異性結合於DKK1多肽。舉例而言，一些抗體及片段與由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈組成的抗體競爭，其中該等重鏈包含SEQ ID NO：42且該等輕鏈包含SEQ ID NO：44。
所提供之多種抗體及片段可包括單一輕鏈及/或重鏈或單一輕鏈可變域及/或單一重鏈可變域。其他抗體及片段包括兩條輕鏈及/或兩條重鏈。在抗體或片段包括兩條輕鏈及/或重鏈之情況下，在一些情況下兩條輕鏈彼此相同；同樣地，在一些情況下兩條重鏈相同。所提供之抗體可包括例如單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。免疫功能性片段可包括(但不限於)scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或域抗體。在某些情況下，抗體或片段以5×10-4或5×10-4以下之kd(koff)自DKK1多肽解離。
亦提供包括任何前述抗體及免疫活性片段之醫藥組合物。該等組合物通常亦包括緩衝劑、醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑或防腐劑。亦提供前述抗體及免疫活性片段在製備醫藥組合物或藥劑中之用途。
亦提供多種編碼前述抗體之核酸。一些核酸例如編碼(a)具有如SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89及/或93中闡述之胺基酸序列的輕鏈CDR；及/或(b)具有如SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91及/或95中闡述之胺基酸序列的重鏈CDR，使得經編碼之CDR編碼可特異性結合DKK1多肽之抗體或其免疫功能性片段。某些其他核酸包含編碼抗體或免疫活性片段之輕鏈可變區(VL)及/或重鏈可變區(VH)之序列或由該序列組成，其中VL與SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89或93具有至少80%、90%或95%序列一致性且VH與SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91或95具有至少80%、90%或95%序列一致性。一些核酸包括編碼VL之序列及/或編碼VH之序列，該VL包含SEQ ID NO：9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89或93或由其組成且該VH包含SEQ ID NO：11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91或95或由其組成。本文亦揭示包含前述核酸之表現載體及包含該等表現載體之細胞(例如CHO細胞)。亦描述藉由培養含有該等表現載體之細胞來產生抗體或其免疫活性片段之方法。
本文提供新穎DKK1抗體，其有效治療需要增加骨骼構建之病 狀，例如與病理學病狀(諸如多發性骨髓瘤)有關之骨折修復或骨質流失。此外，本文提供增加骨骼合成代謝之藥劑組合，包括DKK1與硬化蛋白抑制劑之組合。該等組合可用於治療例如骨質疏鬆症，提高骨折癒合速率及多種需要提高骨骼建構速率之病狀。該治療組合可呈兩種個別抑制劑形式，例如抗硬化蛋白抗體及抗DKK1抗體，或可為單一分子實體，例如雙特異性抗體。
如本文所用，雙特異性抗體在其兩個結合臂中之一者上結合一個抗原且在其第二個臂上結合一個不同抗原。因此，雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合臂且對其所結合之各抗原為單價。本文提供之雙特異性及雙功能性DKK1抗體可包括如上文所述之一或多個CDR或一或多個可變區。在一些情況下，雙特異性或雙功能性抗體為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜合抗體。該等雙特異性抗體可由多種方法產生，包括(但不限於)融合瘤融合或Fab'片段連接。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。
亦可根據本發明藉由融合產生雙特異性分子。在一實例中，本發明之抗體可連接(例如藉由表現融合蛋白質、化學連接、高親和力非共價結合或其類似方法)至一或多個其他結合分子。該等結合分子之實例包括(但不限於)另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑，從而產生雙特異性分子。
雙特異性分子亦可包含針對硬化蛋白之第一結合特異性及針對第二目標之第二結合特異性。舉例而言，第二目標可為硬化蛋白之不同於第一抗原決定基的另一抗原決定基。另一實例為包含至少一種針對硬化蛋白之第一結合特異性及針對DKK1內抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。另一實例為包含至少一種針對硬化蛋白之第一結合特異性及針對LRP4內抗原決定基之第二結合特異性的雙特異 性分子。此外，在本發明中若雙特異性分子具有多特異性，則除第一目標抗原決定基及第二目標抗原決定基外，該分子亦可進一步包括第三結合特異性。
在一實施例中，本發明之雙特異性分子包含作為結合特異性的至少一種抗體或其抗體片段，包括例如來自本文中提供之新穎抗DKK1抗體序列之Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。其亦可為輕鏈或重鏈二聚物，或任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所描述。
可使用此項技術中已知的方法藉由化學結合該等結合部分來製備雙特異性分子。當結合部分為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375中描述之方法。結合劑包括SATA及磺基-SMCC，其均可自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)獲得。當結合部分為抗體時，其可藉由兩條重鏈之絞鏈區之硫氫基結合來結合。在一實施例中，絞鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基使得存在未與相應重鏈或輕鏈對應物形成二硫鍵之游離硫氫基。
雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法的非限制性實例描述於多個專利公開案中，包括美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美 國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,482,858號；及美國專利申請案第2010/0076178號。
用於與DKK1抑制劑之組合療法或包括DKK1結合部分之雙特異性分子或多特異性分子之搭配物的實例包括硬化蛋白抗體或特異性識別硬化蛋白之結合片段。先前已描述硬化蛋白涉及經wnt信號傳導路徑調節骨密度(PCT WO 06/119107)。
存在DKK1抗體與硬化蛋白抗體之組合之報導，其中提出在模型動物中與單獨DKK1抗體或單獨硬化蛋白抗體相比，該組合可更大地增加疏質骨或海綿質骨之骨密度(PCT WO 09/047356)且改良總骨礦物質含量、密度及皮層厚度之增加。然而，在該等實例中使用完整骨骼而非骨折之骨骼。
報導指示骨折不連模型中DKK1表現升高(Bajada等人，2009 Bone；45(4)：726-35.)。同樣地，健康骨骼表現較低含量之DKK1，有助於解釋單獨DKK1抗體對完整骨骼中BMD之有限作用(參見實例15)。因此，鑒於令人驚訝之強癒合反應，包括在相對短期內峰值負載顯著增加，硬化蛋白與DKK1抑制劑之組合尤其適用於治療骨折。
變異體
所提供之一些抗體或免疫功能性片段為以上揭示之抗體及片段(例如具有表1中所列序列之抗體及片段)之變異形式。舉例而言，一些抗體或片段在表1中所列之重鏈或輕鏈、可變區或CDR中之一或多者中具有一或多個保守性胺基酸取代。
天然存在之胺基酸可依據常見側鏈性質分類：[0149]1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；[0150]2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；[0151]3)酸性：Asp、Glu；[0152]4)鹼性：His、Lys、Arg；[0153]5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及[0154]6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。保守性胺基酸取代可涉及將此等類別之一的成員更換為相同類別之另一成員。保守性胺基酸取代可涵蓋通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中合成所併入的非天然存在之胺基酸殘基。其包括肽模擬物及胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。
非保守性取代可涉及將以上類別之一的成員更換為另一類別之成員。該等經取代之殘基可引入抗體中與人類抗體同源之區域或引入分子之非同源區域中。
在進行該等改變時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數。蛋白質之親水概況係藉由賦予各胺基酸以數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈反覆計算該等值之平均值來計算。已基於疏水性及電荷特徵賦予各胺基酸以親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；***酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
在此項技術中理解親水概況在賦予蛋白質交互生物功能中之重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或分數之其他胺基酸且仍然保留類似生物活性。當基於親水指數進行變化時，在某些實施例中，包括親水指數在.+-.2內之胺基酸取代。在本發明之一些態樣中，包括親水指數在.+-.1內之胺基酸取代，且在本發明之其他態樣中，包括親水指數在.+-.0.5內之胺基酸取代。
此項技術中亦應理解，類似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行，尤其當由此產生之生物學功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況下。在某些實施例中，蛋白質之最大局 部平均親水性(取決於其相鄰胺基酸之親水性)與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即該蛋白質之生物性質)有關。
已賦予該等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；***酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。當基於類似親水性值進行變化時，在某些實施例中，包括親水性值在.+/-.2內之胺基酸取代，在其他實施例中，包括親水性值在.+/-.1內之胺基酸取代且在其他實施例中，包括親水性值在.+/-.0.5內之胺基酸取代。在一些情況下，亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。該等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術確定如本文所闡述之多肽的適合變異體。熟習此項技術者可藉由靶向咸信對於活性不重要之區域來鑑別分子中可經改變而不破壞活性之適合區域。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽中具有保守性之殘基及部分。在其他實施例中，甚至可能對生物活性或對結構重要之區域可經受保守胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。
此外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對於活性或結構重要之殘基的結構-功能研究。鑒於該比較，可預測蛋白質中對應於類似蛋白質中對於活性或結構重要之胺基酸殘基之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代來用於該等預測之重要胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可分析類似多肽中之三維結構及與該三維結構相關之胺基酸序列。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於抗體之三 維結構預測其胺基酸殘基之排列。熟習此項技術者可選擇不對預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基作出根本變化，此係因為該等殘基可能涉及與其他分子之重要相互作用之故。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用DKK1中和活性檢定篩選該等變異體(參見以下實例)，從而產生關於哪些胺基酸可變化且哪些不可變化之資訊。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可輕易確定應避免單獨或與其他突變組合之其他取代的胺基酸位置。
許多科學出版物已致力於預測二級結構。參見Moult,1996,Curr.Op.in Biotech.7：422-427；Chou等人，1974,Biochemistry 13：222-245；Chou等人，1974,Biochemistry 113：211-222；Chou等人，1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148；Chou等人，1979,Ann.Rev.Biochem.47：251-276；及Chou等人，1979,Biophys.J.26：367-384。此外，現可使用電腦程式幫助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同源模型化。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩種多肽或蛋白質通常具有類似結構拓撲學。蛋白質結構資料庫(PDB)之最新發展已使得二級結構之可預測性提高，包括多肽或蛋白質結構中之潛在摺疊數。參見Holm等人，1999,Nucl.Acid.Res.27：244-247。已提出(Brenner等人，1997,Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)在既定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦已解析臨界數目之結構，結構預測即變得顯著更加精確。
其他預測二級結構之方法包括「穿線(threading)」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-87；Sippl等人，1996,Structure 4：15-19)、「輪廓分析(profile analysis)」(Bowie等人，1991,Science 253：164-170；Gribskov等人，1990,Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987,Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)及「進化連 接(evolutionary linkage)」(參見Holm,1999，見上文；及Brenner,1997，見上文)。
在本發明之一些實施例中，進行胺基酸取代使得：(1)降低對蛋白質水解之敏感性，(2)降低對氧化之敏感性，(3)改變對形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變配位體或抗原結合親和力及/或(5)賦予該等多肽其他物理化學或功能性質或對其進行修飾。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單一或多個胺基酸取代(在某些實施例中為保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接觸之結構域以外的部分中進行取代。在該等實施例中，可使用不會實質上改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例如一或多個不破壞表徵親本或原生抗體之二級結構之置換胺基酸)。技術認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編)，1984,W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，1991,New York：Garland Publishing；及Thornton等人，1991,Nature 354：105中，其各自以引用的方式併入本文中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之糖基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化位點之數目及/或類型已改變。在某些實施例中，與原生抗體相比，抗體蛋白質變異體包含更大數目或更小數目之N-連接糖基化位點。N-連接糖基化位點之特徵在於序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸以外的任何胺基酸殘基。為產生該序列之胺基酸殘基取代提供潛在的新位點以便添加N-連接碳水化合物鏈。或者，消除或改變該序列之取代將阻止添加存在於原生多肽中之N-連接碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新的N-連接位點。抗體通常在Fc區中具有N-連接糖 基化位點。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。尤其當抗體必須再摺疊為生物學活性構形時，半胱胺酸變異體為適用的。與原生抗體相比，半胱胺酸變異體可具有較少半胱胺酸殘基，且通常為偶數個以最小化由不成對半胱胺酸引起之相互作用。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區域及CDR可用於製備含有特異性結合於DKK1多肽之抗原結合區的多肽。舉例而言，表1中所列之一或多個CDR可共價或非共價併入分子(例如多肽)中以產生免疫黏附。免疫黏附可併有CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR共價連接於另一多肽鏈，或可非共價併有CDR。CDR使免疫黏附可特異性結合於特定相關抗原(例如DKK1多肽或其抗原決定基)。
亦提供基於本文所述之可變區域及CDR之模擬劑(例如「肽模擬劑(peptide mimetic；peptidomimetic)」)。該等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區之組合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res.15：29；Veber及Freidinger,1985,TINS第392頁；及Evans等人，1987,J.Med.Chem.30：1229，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的。結構上類似於治療學上適用之肽之肽模擬劑可用以產生類似的治療或預防效果。該等化合物通常藉助於電腦化分子模型化來開發。通常，本發明之肽模擬劑為結構上類似於顯示所需生物活性之抗體的蛋白質，所需生物活性在此處諸如為以下能力：特異性結合DKK1，但具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知的方法由選自以下之鍵置換之肽鍵：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH--CH-(順式及反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--及--CH2SO--。在本發明之某些實施例中可使用以相同類型之D-胺基酸(例如D-離胺酸代替L-離胺酸)對共同序列 之一或多個胺基酸進行系統取代以產生更穩定蛋白質。此外，包含共同序列或實質上相同之共同序列變化的限定肽可由此項技術中已知的方法(Rizo及Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61：387，其以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基來產生。
亦提供本文所述之抗體及免疫功能性片段之衍生物。衍生抗體或片段可包含賦予抗體或片段所需性質(諸如在特定用途中半衰期增加)的任何分子或物質。衍生抗體可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色性、抗原性或酶性分子，可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)或結合於另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素))、治療性或診斷性部分(例如放射性、細胞毒素性或醫藥學上活性部分)或增加抗體對於特定用途(例如投與個體(諸如人類個體)或其他活體內或活體外用途)之適用性的分子。可用於衍生化抗體之分子之實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知的技術製備抗體之白蛋白連接及聚乙二醇化衍生物。在一實施例中，抗體結合於或以其他方式連接於運甲狀腺素蛋白(TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括抗DKK1抗體或其片段與其他蛋白質或多肽之共價或聚集結合物，諸如藉由表現包含異源多肽與抗DKK1抗體多肽之N端或C端融合之重組型融合蛋白質來達成。舉例而言，結合之肽可為異源信號(或前導)多肽(例如酵母α-因子前導序列)或肽(諸如抗原決定基標籤)。含有抗DKK1抗體之融合蛋白質可包含添加以有助於抗DKK1抗體(例如多His)純化或鑑別的肽。抗DKK1抗體多肽亦可連接 於FLAG肽，如Hopp等人，Bio/Technology 6：1204,1988及美國專利第5,011,912號中所描述。FLAG肽具有高抗原性且提供由特異性單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，從而實現快速檢定且有助於純化表現之重組型蛋白質。適用於製備FLAG肽融合於既定多肽之融合蛋白質的試劑為市售(Sigma,St.Louis,MO)。
含有一或多種抗DKK1抗體多肽之寡聚物可用作DKK1拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接二聚物、三聚物或更高級聚合物形式。預期使用包含兩種或兩種以上抗DKK1抗體多肽之寡聚物，其中一個實例為均二聚物。其他寡聚物包括雜二聚物、均三聚物、雜三聚物、均四聚物、雜四聚物等。
一實施例係關於包含多種經由融合於抗DKK1抗體多肽之肽部分之間的共價或非共價相互作用接合之抗DKK1抗體多肽的寡聚物。該等肽可為肽連接子(間隔子)，或具有促進寡聚之性質的肽。白胺酸拉鏈及某些衍生自抗體之多肽為可促進其所連接之抗DKK1抗體多肽之寡聚作用的肽，如下文中更詳細描述。
在特定實施例中，寡聚物包含兩種至四種抗DKK1抗體多肽。寡聚物之抗DKK1抗體部分可呈任一上述形式，例如變異體或片段。寡聚物較佳包含具有DKK1結合活性之抗DKK1抗體多肽。
在一實施例中，使用衍生自免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。製備包含某些異源多肽融合於抗體衍生之多肽之各種部分(包括Fc域)的融合蛋白質已由例如Ashkenazi等人，1991,PNAS USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁描述。
本發明之一實施例係關於包含藉由使抗DKK1抗體之DKK1結合片段與抗體之Fc區融合而產生之兩種融合蛋白質之二聚物。該二聚物 可如下製得：例如將編碼融合蛋白質之基因融合物***適當表現載體中，在經重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物，及使所表現之融合蛋白質極像抗體分子般組裝，隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以得到二聚物。
如本文所用，術語「Fc多肽」包括衍生自抗體Fc區之多肽的原生及突變形成之蛋白質形式。亦包括含有促進二聚合之鉸鏈區的該等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白質(及由其形成之寡聚物)提供藉由蛋白質A或蛋白質G管柱親和層析進行輕易純化之優勢。
一種適合之Fc多肽(描述於PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中(其各自以引用的方式併入本文中))為自人類IgG1抗體之Fc區之N端絞鏈區延伸至原生C端之單鏈多肽。另一適用Fc多肽為美國專利第5,457,035號及Baum等人，1994,EMBO J.13：3992-4001中所述之Fc突變形成之蛋白質。除胺基酸19由Leu變為Ala、胺基酸20由Leu變為Glu且胺基酸22由Gly變為Ala外，該突變形成之蛋白質之胺基酸序列與WO 93/10151中呈現之原生Fc序列之胺基酸序列相同。突變形成之蛋白質對Fc受體顯示降低之親和力。
在其他實施例中，諸如本文所揭示之抗DKK1抗體的重鏈及/或輕鏈之可變部分可取代抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分。
或者，寡聚物為包含多種抗DKK1抗體多肽(具有或不具有肽連接子(間隔肽))之融合蛋白質。適合肽連接子包括美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中所述之肽連接子。
製備寡聚抗DKK1抗體衍生物之另一方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進可見該等白胺酸拉鏈域之蛋白質之寡聚的肽。白胺酸拉鏈最初在若干DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且隨後在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括可二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性 寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺界面活性蛋白D(lung surfactant protein D；SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191(以引用的方式併入本文中)中。實現所融合之異源蛋白質之穩定三聚作用的經修飾之白胺酸拉鏈之用途描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一方法中，使包含抗DKK1抗體片段或衍生物融合於白胺酸拉鏈肽之重組型融合蛋白質表現於適合宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚抗DKK1抗體片段或衍生物。
所提供之一些抗體對DKK1之結合親和力(Ka)為至少104或105/M×量測秒數，例如以下實例中所描述。其他抗體之ka為至少106、107、108或109/M×秒數。所提供之某些抗體具有低解離速率。舉例而言，一些抗體之Koff為1×10-4s-1、1×10-5s-1或1×10-5s-1以下。
在另一態樣中，本發明提供活體外或活體內(例如當投與人類個體時)半衰期為至少1天之抗DKK1抗體。在一實施例中，抗體半衰期為至少3天。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為4天或4天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為8天或8天以上。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾以使其半衰期比未經衍生或未經修飾之抗體長。在另一實施例中，抗體含有點突變以增加血清半衰期，諸如WO 00/09560中所描述。
亦提供編碼本發明抗體或其片段、衍生物、突變形成之蛋白質或變異體之一個或兩條鏈的核酸；足以用作雜交探針之聚核苷酸；用於對編碼多肽之聚核苷酸進行鑑別、分析、突變或擴增之PCR引子或定序引子；用於抑制聚核苷酸表現之反義核酸；及前述各者之互補序列。核酸可為任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000個或5,000個以上 核苷酸，及/或可包含一或多個其他序列，例如調節序列，及/或為更大核酸(例如載體)之部分。核酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核苷酸及其人造變異體(例如肽核酸)。
亦提供編碼本文所提供之某些抗體所結合之抗原決定基的核酸。因此，包括一些編碼SEQ ID NO：2之胺基酸221-229及/或246-253之核酸，及編碼SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及/或246-262之核酸以及編碼SEQ ID NO：2之胺基酸221至262或SEQ ID NO：2之胺基酸221-253之核酸。亦提供編碼包括該等肽之融合蛋白質之核酸。
可自用DKK1或其免疫原片段進行免疫之小鼠之B細胞分離編碼抗體多肽之DNA(例如重鏈或輕鏈、僅可變域或全長)。可藉由習知程序(聚合酶鏈反應(PCR))分離DNA。噬菌體呈現為可藉以製備抗體衍生物之已知技術之另一實例。在一方法中，使作為相關抗體之組分之多肽表現於任何適合重組型表現系統中，且可組裝表現之多肽以形成抗體分子。
將編碼所提供之抗體及免疫功能性片段之輕鏈及重鏈、可變區及CDR之例示性核酸列於上表1中。由於遺傳密碼簡併，因此表1中所列之各多肽序列亦由除表1中所列之核酸序列以外的許多其他核酸序列編碼。本發明提供編碼各本發明一抗體之各簡併核苷酸序列。
本發明進一步提供在特定雜交條件下與其他核酸(例如包含表1-3中所列之核苷酸序列的核酸)雜交之核酸。用於雜交核酸之方法在此項技術中熟知。參見例如Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文中定義，中等嚴格雜交條件使用含有5倍氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、約50%甲醯胺之雜交緩衝劑、6倍SSC之預洗溶液及55℃雜交溫度(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液及42℃雜交溫度)，且洗滌條件為60℃，於0.5×SSC、0.1% SDS中。 嚴格雜交條件在45℃下於6×SSC中雜交，接著在68℃下於0.1×SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操縱雜交及/或洗滌條件以提高或降低雜交嚴格性，使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核苷酸序列之核酸通常仍彼此雜交。
影響雜交條件選擇之基本參數及用於設計適合條件之規則由例如Sambrook,Fritsch及Maniatis(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，第9章及第11章；及Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley & Sons,Inc.，第2.10章節及6.3-6.4章節)闡述，且可由一般技術者依據例如DNA之長度及/或鹼基組成輕易確定。
變化可藉由突變而引入核酸中，藉此使其所編碼之多肽(例如本發明之抗體或抗體衍生物)之胺基酸序列發生變化。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變。在一實施例中，使用例如定點突變誘發方案改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一實施例中，使用例如隨機突變誘發方案改變一或多個隨機選擇之殘基。無論以何種方式進行，可針對所需性質表現及篩選突變型多肽。
可在未顯著改變核酸所編碼之多肽之生物活性的情況下將突變引入核酸中。舉例而言，可進行引起非必需胺基酸殘基處之胺基酸取代的核苷酸取代。或者，可將選擇性改變核酸所編碼之多肽之生物活性的一或多個突變引入核酸中。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量改變之實例包括提高、降低或消除活性。定性改變之實例包括改變抗體之抗原特異性。
在另一態樣中，本發明提供適用作偵測本發明核酸序列之引子或雜交探針之核酸分子。本發明之核酸分子可僅包含編碼本發明之全 長多肽之核酸序列的一部分，例如可用作探針或引子之片段或編碼本發明之多肽之活性部分(例如DKK1結合部分)之片段。
基於本發明之核酸之序列的探針可用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼本發明之多肽之轉錄物。探針可包含標記群，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。該等探針可用於鑑別表現...之細胞。
在另一態樣中，本發明提供包含編碼本發明之多肽或其部分(例如含有一或多個CDR或一或多個可變區域之片段)之核酸的載體。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組型表現載體。本發明之重組型表現載體可包含本發明之核酸，其呈適用於宿主細胞中核酸表現之形式。重組型表現載體包括基於用於表現之宿主細胞選擇之一或多個調節序列，其可操作地連接於待表現核酸序列。調節序列包括引導多種類型宿主細胞中核苷酸序列之組成性表現的序列(例如SV40早期基因強化子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)及巨細胞病毒啟動子)、引導僅在某些宿主細胞中之核苷酸序列表現的序列(例如組織特異性調節序列，參見Voss等人，1986,Trends Biochem.Sci.11：287；Maniatis等人，1987,Science 236：1237，其以全文引用的方式併入本文中)及反應於特定處理或條件引導核苷酸序列之可誘導表現之序列(例如哺乳動物細胞中之金屬硫蛋白啟動子及原核與真核生物系統中之四環素反應性(tet-responsive)啟動子及/或鏈黴素反應性啟動子(參見id.))。熟習此項技術者將瞭解，表現載體之設計可視諸如待轉型宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素而定。可將本發明之表現載體引入宿主細胞中，藉此產生由本文所述之核酸編碼之蛋白質或肽，包括融合蛋白質或肽。
在另一態樣中，本發明提供已引入有本發明之重組型表現載體 之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。可經習知轉型或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染，已知視用表現載體及轉染技術而定，僅小部分細胞可將外部DNA整合入其基因組中。為鑑別及選擇該等整合物，通常將編碼可選擇標記(例如用於抗生素抗性)之基因以及相關基因引入宿主細胞中。較佳可選擇標記包括賦予藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)及甲胺喋呤)抗性之標記。可藉由藥物選擇以及其他方法來鑑別經引入之核酸穩定轉染之細胞(例如已併有可選擇標記基因之細胞將存活而其他細胞死亡)。
所提供之非人類抗體可例如源自任何抗體產生動物，諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴子(例如食蟹獼猴或恆河猴)或猿(例如黑猩猩))。非人類抗體可用於例如活體外細胞培養物及基於細胞培養物之應用中，或其中對抗體之免疫反應不出現或無意義、可得到阻止、不受關注，或被需要之任何其他應用中。在本發明之某些實施例中，可藉由用全長DKK1或DKK1之羧基端部分進行免疫來產生抗體。或者，可藉由用SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及/或胺基酸246-262(其為形成本文中提供之某些抗體(例如11H10，參見圖1)所結合之抗原決定基之部分的人類DKK1之區段)進行免疫來產生某些非人類抗體。抗體可為多株抗體、單株抗體或可於宿主細胞中藉由表現重組型DNA來合成。
可如上文所描述藉由對含有人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物進行免疫或藉由選擇表現人類抗體譜之噬菌體呈現文庫來製備完全人類抗體。
本發明之單株抗體(mAb)可由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975,Nature 256：495之標準體細胞雜交 技術。或者，可使用用於產生單株抗體之其他技術，例如B-淋巴細胞之病毒或致癌轉型。一種適用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統，其為一種極公認程序。此項技術中已知用於融合之經免疫之脾細胞之分離的免疫方案及技術。對於該等程序，使來自經免疫小鼠之B細胞與適合之永生化融合搭配物(諸如鼠類骨髓瘤細胞株)融合。必要時，可替代小鼠對大鼠或此外其他哺乳動物進行免疫且可使該等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠以外之來源的骨髓瘤細胞株。亦熟知製造融合瘤之融合程序。
所提供之單鏈抗體可藉由經胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈與輕鏈可變域(Fv區)片段(參見例如表1)從而產生單一多肽鏈來形成。該等單鏈Fv(scFv)可藉由使編碼DNA(該等DNA編碼兩個可變域多肽(VL及VH))之間的肽連接子之DNA融合來製備。視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定，所得多肽可在自身摺疊以形成抗原結合單體或其可形成多聚物(例如二聚物、三聚物或四聚物)(Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108)。藉由組合不同的包含VL及VH之多肽，可形成結合於不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40)。所開發用於產生單鏈抗體之技術包括美國專利第4,946,778號；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544；de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol.178：379-87中描述之技術。
可使用子類轉換方法將本文中提供之一種子類抗體換為不同子類之抗體。舉例而言，表1中所示之可變域可連接至任何所需Ig亞型之恆定域。該等技術允許製備具有既定抗體(親本抗體)之抗原結合性質且亦顯示與親本抗體不同之抗體同型或子類相關之生物性質的新穎抗體。可採用重組DNA技術。該等程序可採用編碼特定抗體多肽之經 選殖之DNA，例如編碼所需同型之抗體之恆定域的DNA。參見例如Lantto等人，2002,Methods Mol.Biol.178：303-16。
因此，所提供之抗體包括所需同型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE及IgD)及其Fab或F(ab')2片段。此外，若需要IgG4，則亦可能需要在絞鏈區中引入點突變(如Bloom等人，1997,Protein Science 6：407中所描述)以緩和形成H鏈內二硫鍵(其可引起IgG4抗體中之異源性)的傾向。
此外，亦已知用於產生具有不同性質(亦即對其所結合之抗原呈現不同親和力)之抗體之技術。一種該類技術(稱為鏈改組)涉及在絲狀噬菌體表面上呈現免疫球蛋白可變域基因譜，通常稱為噬菌體呈現。鏈改組已用於製備針對半抗原2-苯基噁唑-5-酮之高親和力抗體，如由Marks等人，1992,BioTechnology,10：779描述。
可對表1中描述之重鏈及輕鏈進行保守性修飾(且對編碼核酸進行相應修飾)以產生具有功能及生物化學特徵之抗DKK1抗體。實現該等修飾之方法描述於上文中。
可以多種方式進一步修飾本發明之抗體及其功能性片段。舉例而言，若其將用於治療目的，則其可與聚乙二醇結合(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。或者，標的抗體或其片段之V區可與不同抗體分子之Fc區融合。可修飾用於此目的之Fc區以使其不結合補體，從而降低在融合蛋白質用作治療劑時誘導患者中細胞溶解之可能性。此外，標的抗體或其功能性片段可與人類血清白蛋白結合以增加抗體或其片段之血清半衰期。適用於本發明抗體或其片段之另一融合搭配物為運甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚物之能力，因此抗體-TTR融合蛋白質可形成可增大其結合親合力之多價抗體。
或者，可藉由在維持(a)取代區域中分子主鏈之結構，例如片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之蓬鬆 度中作用顯著不同之重鏈及輕鏈之胺基酸序列中產生取代來實現本文所述之抗體及片段之功能及/或生物化學特徵的實質修飾。「保守性胺基酸取代」可涉及以非原生殘基取代原生胺基酸殘基，其對該位置之胺基酸殘基之極性或電荷影響極小或無影響。此外，亦可用丙胺酸取代多肽中之任何原生殘基，如先前關於丙胺酸掃描突變誘發所描述。
可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實施標的抗體之胺基酸取代(無論保守性或非保守性)。胺基酸取代可用於鑑別本文中提供之抗體之重要殘基，或提高或降低該等抗體對人類DKK1之親和力或用於改良本文所述之其他抗DKK1抗體之結合親和力。
可由多種習知技術中之任一種製備抗DKK1抗體及免疫功能性片段。舉例而言，可使用此項技術中已知的任何技術藉由重組表現系統產生抗DKK1抗體。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
本發明之抗體可於融合瘤細胞株中或除融合瘤以外的細胞株中表現。編碼抗體之表現構築體可用於轉型哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。可使用任何已知的用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法進行轉型，該等方法包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中且用構築體藉由此項技術中已知的轉染程序來轉導宿主細胞，如由美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號所例示。所用最佳轉型程序將視所轉型之宿主細胞之類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術所熟知，且包括(但不限於)聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中、將核酸與 帶正電之脂質混合及將DNA直接顯微注射至核中。
本發明之重組表現構築體通常包含編碼包含以下中一或多者之多肽的核酸分子：重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；重鏈可變區；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；抗DKK1抗體之輕鏈或重鏈之一或多個CDR。使用標準連接技術將該等核酸序列***適當表現載體中。在一實施例中，使11H10重鏈或輕鏈恆定區附於DKK1特異性重鏈或輕鏈可變區之C端且連接入表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中有功能之載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，從而允許進行基因擴增及/或表現)。在一些實施例中，使用採用蛋白質-片段互補檢定之載體，該等檢定使用報導蛋白(諸如二氫葉酸還原酶)(參見例如美國專利第6,270,964號)。可自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(先前為「Clontech」)購買適合表現載體。適用於選殖及表現本發明之抗體及片段之其他載體包括Bianchi及McGrew,Biotech Biotechnol Bioeng 84(4)：439-44(2003)中描述之載體。其他適合表現載體討論於例如Methods Enzymol，第185卷(D.V.Goeddel編)，1990,New York：Academic Press中，其以引用的方式併入本文中。
通常，用於任何宿主細胞之表現載體均含有用於質體或病毒保持及用於選殖及表現外源核苷酸序列之序列。該等序列(通稱為「側接序列」)通常包括一或多種以下可操作地連接之核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於***編碼待表現多肽之核酸的多連接子(polylinker)區域及可選擇之標記元件。
載體可視情況含有「標籤」編碼序列(亦即位於編碼序列之5'端或3'端處之寡核苷酸分子)、編碼多His(諸如6His)之寡核苷酸序列，或存在市售抗體之另一「標籤」(諸如FLAG©、HA(來自流感病毒之血 球凝集素)或myc)。標籤通常在表現時與抗體蛋白質融合，且可充當用於來自宿主細胞之抗體之親和力純化的構件。親和力純化可例如使用針對標籤之抗體作為親和基質藉由管柱層析來實現。接著可視情況藉由多種方法(諸如使用某些用於裂解之肽酶)自純化之抗體多肽移除標籤。
表現載體中之側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或品系)、異源(亦即來自不為宿主細胞物種或品系的物種)、雜合(亦即來自一種以上來源之側接序列之組合)、合成或原生的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機構中有功能且可由宿主細胞機構活化。
適用於本發明之載體中之側接序列可藉由此項技術中熟知的若干種方法中之任一種獲得。通常，在本文中適用之側接序列已藉由定位及/或限制性核酸內切酶消化預先鑑別且因此可使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，可能已知側接序列之完整核苷酸序列。在本文中，可使用本文中所描述用於核酸合成或選殖之方法來合成側接序列。
當側接序列之全部或僅一部分為已知時，其可使用PCR及/或藉由用來自相同或另一物種之適合寡核苷酸及/或側接序列片段篩選基因組文庫來獲得。當側接序列為未知時，含有側接序列之DNA的片段可自可含有例如編碼序列或甚至其他基因之較大片DNA分離。可如下實現分離：進行限制性核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，接著使用瓊脂糖凝膠純化、QiagenTM管柱層析(Chatsworth,Calif.)或熟習此項技術者已知的其他方法進行分離。熟習此項技術者將顯而易知達成此目的之適合酶之選擇。
複製起點通常為原核表現載體(尤其為市售原核表現載體)之一部 分，且複製起點有助於宿主細胞中載體之擴增。若所選載體不含複製起點位點，則其可基於已知序列化學合成且接入載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,Mass.)之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)且多種起點(例如SV40、多瘤病毒(polyoma)、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳突狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於選殖哺乳動物細胞中之載體。通常，哺乳動物複製起點無需哺乳動物表現載體(例如，SV40起點通常僅因其含有早期啟動子而得到使用)。
本發明之表現及選殖載體將通常含有啟動子，其由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之核酸。啟動子為位於控制結構基因之轉錄的結構基因之起始密碼子上游(亦即5')(通常在約100至1000bp內)的未轉錄序列。啟動子習知地分為兩類之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子反應於培養條件之一些變化(諸如存在或不存在營養物或溫度變化)引發在其控制下自DNA之轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子引發連續基因產物產生；亦即對基因表現之實驗控制極小或不存在。熟知大量由多種潛在宿主細胞識別之啟動子。如下使適合啟動子可操作地連接於編碼抗DKK1抗體之DNA：藉由限制酶消化自來源DNA移除啟動子或藉由聚合酶鏈反應使啟動子擴增且將所需啟動子序列***載體中。
此項技術中亦熟知適用於酵母宿主之啟動子。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適用於哺乳動物宿主細胞之啟動子已熟知，且包括(但不限於)自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒，且最佳為猿猴病毒40(SV40))之基因組獲得之啟動子。其他適合之哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
適用於實踐本發明之重組表現載體之特定啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子區域(Bemoist及Chambon,1981,Nature 290：304-10)；CMV啟動子；勞斯肉瘤病毒之3'長末端重複序列中所含之啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45)；金屬硫蛋白基因之調節序列(Brinster等人，1982,Nature 296：39-42)；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75：3727-31)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。亦可使用以下動物轉錄控制區域，其顯示組織特異性且已用於轉殖基因動物中：在胰臟腺泡細胞中具有活性之I型彈性蛋白酶基因控制區域(Swift等人，1984,Cell 38：63946；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；在胰臟β-細胞中具有活性之胰島素基因控制區域(Hanahan,1985,Nature 315：115-22)；在睾丸、***、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區域(Leder等人，1986,Cell 45：485-95)；在肝臟中具有活性之白蛋白基因控制區域(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-76)；在肝臟中具有活性之α-胎蛋白基因控制區域(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-48；Hammer等人，1987,Science 235：53-58)；在肝臟中具有活性之α 1-抗胰蛋白酶基因控制區域(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-71)；在骨髓細胞中具有活性之β-血球蛋白基因控制區域(Mogram等人，1985,Nature 315：338-40；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；在腦中之寡樹突神經膠細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區域(Readhead等人，1987,Cell 48：703-12)；在骨骼肌中具有活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區域(Sani,1985,Nature 314：283-86)；在下視丘中具有活性之促性腺釋放激素基 因控制區域(Mason等人，1986,Science 234：1372-78)；且最特別地，在淋巴樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區域(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-58；Adames等人，1985,Nature 318：533-38；Alexander等人，1987,Mol.Cell Biol.7：1436-44)。
可將強化子序列***載體中以增強編碼本發明之抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之核酸之高級真核細胞中之轉錄。強化子為DNA之順式作用元件(長度通常為約10-300bp)，其對啟動子起作用以提高轉錄。強化子為相對獨立定向及定位。已發現其在相對於轉錄單元之5'及3'。已知可自哺乳動物獲得之若干強化子序列(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。亦可使用來自病毒之強化子序列。SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、多瘤強化子及腺病毒強化子為用於真核啟動子之活化之例示性增強元件。儘管強化子可在核酸分子之5'位置或3'位置處剪接入載體中，但其通常位於啟動子之5'位點處。
在表現載體中，轉錄終止序列通常位於多肽編碼區末端之3'處且用於終止轉錄。用於原核細胞中之表現的轉錄終止序列通常為富G-C片段，後接多T序列。儘管序列易於自文庫選殖或甚至以載體之部分形式自市售，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文所述之核酸合成方法)輕易合成。
可選擇標記基因元件編碼生長於選擇性培養基中之宿主細胞之存活及生長所必需的蛋白質。用於表現載體之典型選擇標記基因編碼起以下作用之蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷型不足；或(c)提供無法自複合培養基獲得之關鍵營養物。可選擇標記之實例包括康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。亦可使用細菌性新黴素(bacterial neomycin)抗性基因以便在原核宿主細胞與真核宿主細胞中選擇。
其他選擇基因可用於擴增待表現基因。擴增為一種使得以單一複本形式不能以足夠高的允許細胞在某些選擇條件下存活及生長之量表現的基因在重組型細胞之連續繼代之染色體內連續複製的方法。適用於哺乳動物細胞之可擴增可選擇標記之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶。在使用該等標記時，將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中借助於存在於載體中之選擇基因使得僅轉型體為唯一地適於存活。藉由在培養基中選擇劑之濃度連續增加之條件下培養轉型之細胞來施加選擇壓力，藉此僅允許選擇基因已擴增之彼等細胞存活。在該等情況下，鄰近選擇基因之DNA(諸如編碼本發明抗體之DNA)與選擇基因一起擴增。因此，自擴增之DNA合成增加量的抗DKK1多肽。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需且特徵在於夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列(原核生物)或克紮克(Kozak)序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'及待表現多肽之編碼序列之5'。
在一些情況下，例如當真核宿主細胞表現系統中需要糖基化作用時，可操縱多個前序列以改良糖基化作用或產率。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點或添加原序列(其亦可影響糖基化作用)。最終蛋白質產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個易於表現之其他胺基酸，其可能尚未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有在肽酶裂解位點所見之一或兩個胺基酸殘基，其連接於胺基端。或者，使用一些酶裂解位點可產生所需多肽之微截短但仍活性之形式(若酶在成熟多肽內該區域切割)。
當市售表現載體缺乏一些如上文所述之所需側接序列時，可藉由將該等序列個別地接入載體中來修飾載體。在必要時已選擇及修飾載體後，將編碼抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之核酸分子***載 體之適當位點中。
將含有編碼本發明抗體或其免疫功能性片段之序列的完成載體***適合宿主細胞中以便擴增及/或多肽表現。可藉由熟知方法完成使抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之表現載體轉型至所選宿主細胞中，該等熟知方法包括諸如轉染、感染、氯化鈣、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-聚葡萄糖法之方法或其他已知技術。所選方法將部分地隨所用宿主細胞之類型而變。該等方法及其他適合方法已為熟習此項技術者所熟知。
轉型之宿主細胞(當在適當條件下培養時)合成抗DKK1抗體或其功能性片段，該抗DKK1抗體或其功能性片段接著可自培養基收集(若宿主細胞將其分泌入培養基中)或自產生其之宿主細胞直接收集。適當宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。
可用作供表現之宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知且包括(但不限於)可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)獲得之多種永生化細胞株，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及多種其他細胞株。在某些實施例中，可藉由測試多種細胞株以測定哪些細胞株具有最高表現量且產生具有組成性DKK1結合性質之抗體來選擇用於表現特定DNA構築體之最佳細胞株。
在某些實施例中，本發明亦提供包含標的抗DKK1抗體或其免疫功能性片段以及以下中一或多者的組合物：醫藥學上可接受之稀釋劑；載劑；增溶劑；乳化劑；防腐劑；及/或佐劑。該等組合物可含有有效量抗DKK1抗體或其免疫功能性片段。因此，亦包括本文中提 供之抗體及免疫活性片段在製備醫藥組合物或藥劑中之用途。該等組合物可用於治療多種疾病，諸如以下例示性效用章節中所列之疾病。
醫藥製劑之可接受調配物組分在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。除所提供之抗體及免疫功能性片段外，本發明之組合物亦可含有用於修改、維持或保持例如組合物之pH值、容積莫耳滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解速率或釋放速率、吸收或滲透之組分。適用於調配醫藥組合物之物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填料；單醣；二醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；形成鹽之相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、特立通(triton)、緩血酸胺、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳為氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨糖醇)；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑(參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Gennaro編)， 1990,Mack Publishing Company，其以引用的方式併入本文中)。
醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可本質上為水性或非水性。適用於該等組合物之媒劑或載劑包括注射用水、生理食鹽水溶液或人造腦脊髓液，可能補充有用於非經腸投藥之組合物中之其他常見物質。中性緩衝生理食鹽水或與血清白蛋白混合之生理食鹽水亦為例示性媒劑。可藉由使具有所需純度之所選組合物與視情況選用之調配劑以凍乾餅或水溶液形式混合來製備用於儲存之包含抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之組合物。此外，可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)將抗DKK1抗體或其免疫功能性片段調配為凍乾物。
調配物組分以投藥部位可接受之濃度存在。宜使用緩衝液維持組合物具有生理學pH值或稍低pH值，通常處於約4.0至約8.5或者介於約5.0至8.0之間的pH值範圍內。醫藥組合物可包含約pH 6.5-8.5之TRIS緩衝液，或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，其可進一步包括山梨糖醇或其適合替代物。
醫藥組合物可包括有效量抗DKK1抗體或其免疫功能性片段與適用於製造錠劑之無毒賦形劑之混合物。藉由使錠劑溶解於無菌水或另一適當媒劑中，可製備單位劑量形式之溶液。適合賦形劑包括(但不限於)惰性物質，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或***膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
其他醫藥組合物呈持續傳遞調配物或控制傳遞調配物形式。可使用調配多種其他持續傳遞或控制傳遞構件(諸如脂質體載劑、生物可侵蝕性微粒或多孔珠粒及儲槽式注射劑)之技術(參見例如PCT/US93/00829，其描述控制釋放多孔聚合微粒以便傳遞醫藥組合物)。持續釋放製劑可包括半透性聚合物基質，其呈特型製品形式，例如膜或微膠囊、聚酯、水凝膠、聚交酯(美國專利第3,773,919號及 EP 058,481)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人，1983,Biopolymers 22：547-556)、聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981,J Biomed Mater Res 15：167-277及Langer,1982,Chem Tech 12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羥丁酸(EP 133,988)。持續釋放組合物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知的若干種方法中之任一種製備。參見例如Eppstein等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。
用於活體內投藥之醫藥組合物通常為滅菌的。可藉由經滅菌過濾膜過濾實現滅菌。若組合物經凍乾，則可在凍乾及復原之前或之後進行滅菌。用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。在某些實施例中，將非經腸組合物置於具有滅菌出入孔之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶，或即可用於注射之滅菌預填充注射器。
一旦本發明之醫藥組合物已調配，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體形式或以脫水或凍乾粉末形式儲存於滅菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以在投藥前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。
用於調配醫藥組合物之組分較佳具有高純度且實質上不含可能有害之污染物(例如至少為國家食品(NF)級，通常至少為分析級，且更通常至少為醫藥級)。此外，意欲活體內使用之組合物通常為滅菌的。對於必須在使用之前合成既定化合物，所得產物通常實質上不含任何可能毒性劑，尤其是任何內毒素(其可能在合成或純化過程期間存在)。用於非經腸投藥之組合物亦為滅菌、實質上等張且在GMP條件下製得。
本發明提供產生多劑量或單劑量投藥單元之套組。舉例而言， 本發明之套組可各含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性稀釋劑之第二容器，包括例如單腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器、凍乾物注射器(lyo-syringes)或無針注射器)。
本發明之醫藥組合物可非經腸傳遞，通常藉由注射傳遞。注射可為眼內、腹膜內、門靜脈內、肌肉內、靜脈內、鞘內、腦內(實質內)、腦室內、動脈內、病灶內、病灶旁或皮下注射。眼滴劑可用於眼內投藥。在一些情況下，注射可局部於治療靶向之特定骨骼附近。對於非經腸投藥，抗體可以包含所需抗DKK1抗體或其免疫功能性片段於醫藥學上可接受媒劑中的無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式投與。尤其適用於非經腸注射之媒劑為滅菌蒸餾水，於其中抗DKK1抗體或其免疫功能性片段調配為滅菌等張溶液，經適當保藏。
包含標的抗DKK1抗體及其功能性片段之醫藥組合物可藉由快速注射投與或藉由輸注連續投與，藉由植入裝置、持續釋放系統或其他用於實現延長釋放之構件投與。亦可經由植入上面吸收或囊封有所需分子之膜、海綿或另一適當物質來局部投與醫藥組合物。當使用植入裝置時，可將裝置植入任何適合組織或器官中，且可經擴散、定時釋放大丸劑或連續釋放來傳遞所需分子。製劑可與以下試劑一起調配：諸如可注射微球體、生物可侵蝕性粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸；聚乙醇酸；或共聚(乳酸/乙醇酸)(PLGA)、珠粒或脂質體，其可提供隨後可經儲槽式注射傳遞之產物的控制釋放或持續釋放。含玻尿酸(hyaluronic acid)之調配物具有促進循環中持續時間之作用。
包含抗DKK1抗體或其功能性片段之標的組合物可經調配以用於吸入。在該等實施例中，將抗DKK1抗體調配為供吸入之乾粉，或抗DKK1抗體吸入溶液亦可與推進劑一起調配以用於氣溶膠傳遞(諸如藉由噴霧法)。經肺投藥進一步描述於PCT/US94/001875中，其描述化學修飾之蛋白質之經肺傳遞且其以引用的方式併入本文中。
本發明之某些醫藥組合物可經消化道(諸如經口)傳遞。以該方式投與之標的抗DKK1抗體或其免疫功能性片段可調配為含或不含混配固體劑型(諸如錠劑及膠囊)中常用之彼等載劑。膠囊可經設計為在胃腸道中生物可用性最大化且前全身性降解(pre-systemic degradation)最小化之點釋放調配物之活性部分。可包括其他試劑以促進抗DKK1抗體或其功能性片段之吸收。對於經口投與，可使用經修飾之胺基酸以賦予消化酶抗性。亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
包含抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之標的組合物亦可離體使用。在該等情況下，使自患者移除之細胞、組織或器官暴露於抗DKK1抗體或與抗DKK1抗體一起培養。接著可將所培養之細胞植回該患者或不同患者中或用於其他目的。
在某些實施例中，可藉由使用諸如本文所述之方法植入某些經遺傳工程改造之細胞以表現及分泌多肽來傳遞抗DKK1抗體或其免疫功能性片段。該等細胞可為動物細胞或人類細胞且可為自體細胞、異源細胞或異種細胞，或可經永生化。為降低免疫反應之機率，可囊封細胞以避免周圍組織之浸潤。囊封材料通常為生物相容、半滲透聚合外殼或膜，其允許釋放蛋白質產物但阻止患者免疫系統或來自圍繞組織之其他有害因素破壞細胞。
劑量
可投與所提供之醫藥組合物以用於預防性及/或治療性處理。「有效量」通常係指足以達成所需作用(但無毒性)之活性成分(亦即抗DKK1抗體或其免疫功能性片段)之量，該所需作用為降低或消除症狀之嚴重性及/或頻率及/或改良或補救損害。「治療有效量」係指足以補救疾病病況或症狀，或以其他方式預防、阻止、延緩或逆轉疾病或任何其他不良症狀之進展的量。「預防有效量」係指有效預防、阻止或 延緩疾病病況或症狀發作之量。
通常，可在細胞培養物及/或實驗動物中根據標準醫藥程序測定抗體或片段之毒性及治療功效，包括例如測定LD50(對50%群體之致死之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。顯示大治療指數之組合物較佳。
自細胞培養物及/或動物研究獲得之資料可用於調配用於人類之劑量範圍。活性成分之劑量通常在循環濃度範圍內(包括具有極小毒性或無毒性之ED50)。劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在該範圍內變化。
治療性或預防性採用之包含抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之醫藥組合物之有效量將視例如治療情形及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，根據某些實施例，用於治療之適當劑量濃度將因此部分地視所傳遞之分子、抗DKK1抗體所用於之適應症、投藥途徑及患者體型(體重、體表或器官大小)及/或狀況(年齡及一般健康狀況)而定。臨床醫師可滴定劑量且修改投藥途徑以獲得最佳治療作用。視上述因素而定，典型劑量範圍為約0.1μg/kg至約100mg/kg或100mg/kg以上。在某些實施例中，劑量可在0.1μg/kg至約150mg/kg；或1μg/kg至約100mg/kg；或5μg/kg至約50mg/kg範圍內。
給藥頻率將視調配物中抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之藥物動力學參數而定。舉例而言，臨床醫師將投與組合物直至達到獲得所需作用之劑量為止。因此，組合物可隨時間以單次劑量或以兩次或兩次以上劑量(其可能含有或可能不含相同量之所需分子)投與，或經由植入裝置或導管以連續輸注形式投與。治療可隨時間連續或為間歇性。適當劑量之進一步改進係由一般技術者常規進行且在其常規執行之任務範圍內。適當劑量係可經由使用適當劑量-反應資料來確定。
為藉由靶向DKK1來治療醫學病症，可以足以誘導至少一個反映病症嚴重性之指標持續改良的量及時間向患者投與包含標的抗DKK1抗體或其免疫功能性片段之組合物。若患者在間隔至少1至7天或在一些情況下間隔1至6週的至少兩個時機顯示改良，則將改良視為「持續」。適當間隔將在某種程度上視所治療之疾病狀況而定；確定適當間隔以便確定改良是否持續係在熟練醫師之範圍內。基於徵兆或症狀確定改良程度，且亦可採用投與患者之問卷，諸如生活品質問卷。
可評估多種反映患者疾病程度之指標以確定治療量及時間是否足夠。藉由在投與第一劑抗體之前檢查患者來建立所選指標之基線值。基線檢查較佳在投與第一劑之約60天內進行。若投與抗體以治療急性症狀，諸如治療斷骨，則在損傷發生後盡實際可能快地投與第一劑。
如下誘導改良：投與標的抗DKK1抗體或其免疫功能性片段直至患者顯示超過所選指標之基線的改良。在治療慢性病狀時，藉由於至少1個月或1個月以上(例如1、2或3個月或3個月以上，或無限期)之期間重複投與該藥劑來獲得該改良程度。1至6週之階段或甚至單次劑量通常足以用於治療急性病狀。對於損傷或急性病狀，單次劑量可足夠。
儘管根據一或多個指標，患者疾病程度在治療後可出現改良，但可以相同程度或以降低之劑量或頻率無限期繼續治療。一旦已減少或停止治療，若稍後症狀重現，則治療可以原始程度重新開始。
標的抗DKK1抗體及其免疫功能性片段可用於偵測生物樣品中之DKK1。該等使用可鑑別產生蛋白質之細胞或組織或充當偵測DKK1過度產生或產生不足之病理學病狀之診斷法。所提供之抗體及片段亦可用於篩選結合於DKK1之分子之方法中。可使用例如多種競爭篩選法。在一些方法中，抗DKK1抗體所結合之DKK1分子或其片段與本 文中揭示之抗體或片段以及另一分子(亦即候選分子)接觸。抗體或片段與DKK1之間的結合減小指示分子結合DKK1。可使用多種方法(例如ELISA)偵測抗體或片段之結合。可藉由以可偵測物標記抗體來簡化抗DKK1抗體或片段與DKK1之間結合之偵測。在一些方法中，進一步分析在初始篩選中顯示結合之分子以測定其是否抑制DKK1活性(例如分子是否活化Wnt信號傳導)。
可以多種方式量測DKK1抑制劑或硬化蛋白抑制劑或組合(例如個別結合劑)之活性。可使用單能量及雙能量X射線吸光光度法、超音波、電腦斷層攝影術、放射線攝影術及磁共振成像來量測結合劑介導之骨礦物質含量或骨密度提高。亦可自體重或藉由使用其他方法計算骨質之量(參見Guinness-Hey,Metab.Bone Dis.Relat.Res.,5：177-181(1984))。此項技術中使用動物及特定動物模型來測試醫藥組合物及方法對例如模擬人類疾病(諸如骨質疏鬆症及骨質減少)病狀之骨質流失、骨骼再吸收、骨形成、骨強度或骨礦化之參數之影響。該等模型之實例包括卵巢切除之大鼠模型(Kalu,Bone and Mineral,15：175-192(1991)；Frost及Jee,Bone and Mineral,18：227-236(1992)；及Jee及Yao,J.Musculoskel.Neuron.Interact.,1：193-207(2001))。本文所述之量測結合劑活性之方法亦可用於測定其他抑制劑之功效。
在人類中，可使用例如髖部及脊柱之雙重x射線吸光測定法(DXA)臨床測定骨密度。其他技術包括定量電腦斷層攝影術(QCT)、超聲波掃描法(ultrasonography)、單能量x射線吸光測定法(SXA)及放射線攝影吸光測定法。用於量測之常見中心骨骼位點包括脊柱及髖部；周邊位點包括前臂、手指、腕部及踵部。除超聲波掃描術外，美國醫藥協會(American Medical Association)指示BMD技術通常涉及使用x射線且基於輻射削弱視輻射路徑中組織之厚度及組成而定之原理。所有技術均涉及將結果與標準資料庫比較。
或者，可藉由監測骨標記含量來測定對一或多種結合劑之生理反應。骨標記為在骨重塑過程期間產生之產物且由骨、成骨細胞及/或蝕骨細胞(osteoclast)釋放。骨骼再吸收及/或骨形成「標記」含量之波動暗示骨重塑/塑造之變化。國際骨質疏鬆基金會(International Osteoporosis Foundation；IOF)建議使用骨標記來監測骨密度療法(參見例如Delmas等人，Osteoporos Int.，增刊6：S2-17(2000)，以引用的方式併入本文中)。指示骨骼再吸收(或蝕骨細胞活性)之標記包括例如C端肽(例如1型膠原蛋白之C端肽(CTX)或血清交聯C端肽)、N端肽(1型膠原蛋白之N端肽(NTX))、去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉、泌尿羥基脯胺酸、半乳糖羥基賴胺酸及酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶(例如血清酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶同功異型物5b)。骨形成/骨礦化標記包括(但不限於)骨特異性鹼性磷酸酶(BSAP)、由I型原膠原(P1NP、PICP)之N端及C端延長釋放之肽，及骨鈣化素(OstCa)。可自市場購得若干種套組以偵測及定量臨床樣品(諸如尿及血液)中之標記。
在投與後，治療劑較佳降低一或多種骨骼再吸收標記之含量(諸如I型膠原蛋白之C端肽(CTX)之血清含量)。因此，本發明進一步提供監測療法(亦即對硬化蛋白結合劑或其他硬化蛋白抑制劑之生理反應)之方法。該方法包含投與治療劑，接著量測一或多種骨骼再吸收標記之含量。此外，該方法可包含在投藥前量測一或多種骨形成標記之含量。治療期間及/或治療後之骨骼再吸收標記含量可與治療前含量比較，或者可與該患者群體之典型標準範圍比較。一般技術者可藉由測試年齡、性別、疾病程度及/或患者群體之其他特徵類似的代表性數目之患者來輕易測定適合標準範圍。藉由單次劑量之治療劑，骨骼再吸收標記含量可降低至少約5%(例如約10%、約20%或約30%)。在一些實施例中，與投藥之前骨骼再吸收標記含量相比，該劑治療劑使骨骼再吸收標記含量降低至少約40%(例如約50%、約60%或約70%)。此 外，在投與單次劑量後，骨骼再吸收標記含量可降低至少約3天(例如約7天、約2週、約3週、約1個月、約5週、約6週、約7週、約2個月、約9週、約10週、約11週或約3個月)。
除降低骨骼再吸收標記含量外，投與患者之治療劑量亦可提高一或多種骨形成標記之含量，諸如BSAP之血清含量、P1NP之血清含量及/或OstCa之血清含量。單次劑量之治療劑可將骨形成標記含量提高例如至少約5%(例如約10%、約20%或約30%)。在一些實施例中，該劑治療劑將骨形成標記含量提高至少約40%(例如約50%、約60%或約70%)。在其他實施例中，該劑治療劑將一或多種骨形成標記之含量提高至少約75%(例如約80%、約90%、約100%或約110%)。在其他實施例中，該劑治療劑將骨形成標記含量提高至少約120%(例如約130%、約140%、約150%、約160%或約170%)。在替代性實施例中，治療劑將骨形成標記含量提高至少約180%(例如約190%或約200%)。在投與單次劑量治療劑後，骨形成標記含量理想地保持提高(與治療前之骨形成標記含量或該患者群體之典型標準範圍相比)至少約3天(例如約7天、約2週、約3週、約1個月、約5週、約6週、約7週、約2個月、約9週、約10週、約11週或約3個月)。
通常，可「全身(total body)」(例如頭部、軀幹、手臂及腿部)或在髖部(例如全部髖部及/或股骨頸)、脊柱(例如腰椎)、腕部、手指、脛骨及/或踵部量測BMD。在骨質疏鬆症診斷中，比較患者BMD與30歲健康成年人(亦即「青年人」)之峰值密度，產生所謂「T分數」。亦可比較患者BMD與「年齡匹配」骨密度(參見例如World Health Organization Scientific Group on the Prevention and Management of Osteoporosis,「Prevention and management of osteoporosis：report of a WHO scientific group.」WHO Technical Report Series；921,Geneva,Switzerland(2000))。患者BMD與健康青年人之BMD之間的差異習知 地依據「標準差」之倍數來提及，該標準差通常等於骨密度降低約10%至約12%。世界衛生組織(World Health Organization)提出4種基於BMD T分數之診斷類別。BMD值在青年人參考平均值之1個標準差以內的(T分數≧-1)為「正常」。BMD值低於青年人平均值超過1個標準差但小於2個標準差(T分數<-1且>-2.5)的表示低骨質(骨質減少)。T分數低於標準值超過2.5個標準差的支持骨質疏鬆症診斷。若患者另外遭受一或多種脆弱性骨折，則認為該患者患有嚴重骨質疏鬆症。
可投與患者治療劑以改良骨密度而不論患者之T分數如何。可以使患者BMD有效提高至少約1%(約2%、約3%、約4%、約5%或約6%)之劑量及時段投與治療劑。在一些實施例中，BMD提高至少約8%(例如至少約10%、約12%、約15%或約18%)。在其他實施例中，治療劑使髖部、脊柱、腕部、手指、脛骨及/或踵部之BMD提高至少約20%(例如至少約22%、約25%或約28%)。在其他實施例中，BMD提高至少約30%(例如至少約32%、約35%、約38%或約40%)。換言之，BMD可增至低於健康青年人之正常BMD約1至約2.5個標準差之範圍(較佳為約0至約1個標準差之範圍)。
骨骼重塑或塑造之變化可引起整個身體中礦物質濃度波動。骨骼為血液中鈣含量之主要調節劑之一。蝕骨細胞介導之骨骼再吸收使儲存之鈣釋放入全身循環中，而成骨細胞介導之骨形成自循環移除鈣以併入骨組織中。在正常骨骼塑造/重塑中，該等過程循環以維持健康強壯之骨骼且維持游離鈣含量為約8.5mg/dL至約10.5mg/dL(例如約2.2mmol/L至約2.6mmol/L)。骨病症、其他疾病且甚至某些療法可擾亂全身鈣含量從而產生可怕後果。高鈣血症與血液中高鈣含量(例如大於12mg/dL或3mmol/L)有關。極高鈣含量引起例如疲勞、精神錯亂(confusion)、便秘、食慾降低、尿頻、心臟問題及骨痛。低鈣血症為電解質不平衡，其由血液中鈣含量異常低(例如小於約9mg/dL或 2.2mmol/L)指示。將鈣含量<7.5mg/dL(<1.87mmol/L)或7.5mg/dL以下視為嚴重低鈣血症且可能伴有臨床症狀。
治療及使用方法
本發明方法適用於治療或預防骨相關病症，諸如與成骨細胞或蝕骨細胞活性異常有關之骨相關病症。實情為，可向罹患選自由以下組成之群之骨相關病症的人類投與本發明之治療劑：軟骨發育不全、鎖骨顱骨發育不全、內生軟骨瘤病、纖維性結構不良、高歇氏病(Gaucher's Disease)、低磷酸鹽血症、X-性聯低磷酸血性佝僂病、馬方症候群(Marfan's syndrome)、多發性遺傳性外生骨疣(multiple hereditary exotose)、神經纖維瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化症、鞏膜病變、假關節、化膿性骨髓炎、牙周病、抗癲癇藥物誘發之骨質流失、原發性及繼發性副甲狀腺機能亢進、家族性副甲狀腺機能亢進症候群、失重誘發之骨質流失、男性骨質疏鬆症、停經後骨質流失、脊柱融合、骨關節炎、腎性骨營養不良、滲透性骨病症、口部骨質流失、頜部骨壞死、青少年佩吉特氏病(juvenile Paget's disease)、肢骨紋狀肥大、代謝性骨疾病、肥大細胞增多症、鐮形細胞性貧血/疾病、與器官移植有關之骨質流失、與腎移植有關之骨質流失、全身性紅斑狼瘡、僵直性脊椎炎、癲癇症、青少年關節炎性皮疹、地中海貧血症(thalassemia)、黏多醣症、法布立疾病(Fabry Disease)、特納氏症候群(Turner Syndrome)、唐氏症候群(Down Syndrome)、克萊恩費特氏症候群(Klinefelter Syndrome)、麻瘋病、佩西氏病(Perthe's Disease)、青少年特發性疹柱側凸、嬰兒期多系統發炎疾病、溫徹斯特症候群(Winchester Syndrome)、蒙克斯病(Menkes Disease)、威爾遜氏病(Wilson's Disease)、缺血性骨疾病(諸如累-卡-佩三氏病(Legg-Calve-Perthes disease)及侷限性遊走性骨質疏鬆症)、貧血病況、由類固醇引起之病狀、糖皮質激素誘發之骨質流失、肝素 誘發之骨質流失、骨髓病症、壞血病、營養不良、鈣缺乏症、骨質疏鬆症、骨質減少、酒精中毒、慢性肝病、停經後病況、慢性發炎病狀、類風濕性關節炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸炎、克隆氏病(Crohn's disease)、月經過少、閉經、妊娠、糖尿病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺病症、副甲狀腺病症、庫興氏病(Cushing's disease)、肢端肥大症、性腺低能症、不動症(immobilization)或廢用症(disuse)、反射***感神經失養症候群、局部骨質疏鬆症、軟骨病、與關節置換有關之骨質流失、與HIV有關之骨質流失、與生長激素損失有關之骨質流失、與囊腫性纖維化有關之骨質流失、與化學療法有關之骨質流失、腫瘤誘發之骨質流失、與癌症有關之骨質流失、激素腐蝕性骨質流失、多發性骨髓瘤、藥物誘發之骨質流失、神經性厭食症、與疾病有關之面部骨質流失、與疾病有關之顱骨骨質流失、與疾病有關之頜骨骨質流失、與疾病有關之頭骨骨質流失、與衰老有關之骨質流失、與衰老有關之面部骨質流失、與衰老有關之顱骨骨質流失、與衰老有關之頜骨骨質流失、與衰老有關之頭骨骨質流失及與太空旅行有關之骨質流失。
本發明方法無需治癒患者之病症或完全防止骨相關病症發作即可達成有益生物反應。該等方法可預防性使用，意謂完全或部分防止骨相關病症或其症狀。該等方法亦可治療性使用以完全或部分改善骨相關病症或其症狀，或完全或部分防止骨相關病症或其症狀進一步進展。實情為，本發明之物質及方法尤其適用於提高骨密度及維持提高之BMD歷經一段時間。在此方面，本發明提供一種治療骨相關病症之方法，該方法包含(a)投與一或多種量之硬化蛋白結合劑使得全身(例如頭部、軀幹、手臂及腿部)或髖部(例如整個髖部及/或股骨頸)、脊柱(例如腰椎)、腕部、手指、脛骨及/或踵部之實測BMD有效提高約1%、約2%、約3%、約6%、約8%、約10%、約12%、約15%、約 18%、約20%、約25%或30%或30%以上。可經例如約1個月至約18個月(例如約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月或約11個月)之治療階段進行包含硬化蛋白結合劑之醫藥組合物之一或多次投藥。該方法進一步包括(b)接著投與一或多種量之硬化蛋白結合劑以有效維持骨密度。「維持骨密度」意謂由步驟(a)產生之提高之BMD歷經步驟(b)過程(例如約6個月、約9個月、約1年、約18個月、約2年或歷經患者生命過程)不下降超過約1%至約5%。應瞭解，患者可能需要交替治療階段以便提高骨密度及維持骨密度。
預期本文所述之DKK1抑制劑(單獨或與另一同化劑(例如硬化蛋白抑制劑，諸如中和抗體)之組合)之治療用途有益於任何需要骨修復之病狀而無論其是否由潛在骨質流失病狀加重。並非總與骨質流失有關之骨修復之特定實例包括骨折修復，諸如延遲癒合或不連接癒合。因此，熟習此項技術者應理解，本文所述之某些適應症可能會或可能不會因與例如骨質疏鬆症有關之骨質流失或本文所述之任何其他骨質流失病狀而惡化。因此在其他實施例中，預期本發明組合物適用於改良矯形外科程序、牙周疾病、口部骨質流失、牙科程序、牙齒移植、移植手術、關節置換、骨移植、骨骼整形手術及骨修復(諸如骨折癒合)、脊柱融合、植入物固定(例如關節置換，諸如髖部或膝蓋)、不連接癒合、延遲癒合及面部重建之結果。可在程序、置換、移植、手術或修復之前、期間及/或之後投與一或多種組合物。
在另一態樣中，揭示前述治療形式(包括抗體或免疫功能性片段)在治療多種疾病中之用途。舉例而言，某些方法涉及向有需要之患者投與有效量之如本文所述之抗體或免疫活性片段以治療關節炎、對幹細胞更新起反應之疾病、發炎疾病、神經疾病、眼部疾病、腎病、肺病及皮膚病。一些治療方法涉及治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節 炎或骨關節炎。某些抗體及片段用於治療以下疾病：(a)對幹細胞更新起反應且選自由糖尿病、慢性心臟衰竭及肌肉疾病組成之群；(b)選自由克隆氏病、結腸炎及發炎性腸病組成之群的發炎疾病；(c)選自由阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)及亨丁頓氏病(Huntington's disease)組成之群的神經病；(d)選自由黃斑變性及視網膜病組成之群的眼部疾病；(e)選自由末期腎病、慢性腎病、絲球體腎炎、小管間質性腎炎及IgA腎病組成之群的腎病；(f)選自由慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化及囊腫性纖維化組成之群的肺病；或(g)由化學療法誘發之對腸上皮之損害引起的皮膚病。
已顯示硬化蛋白抑制劑(例如硬化蛋白結合劑)促進骨形成且抑制(或減緩)骨骼再吸收，同時全身鈣含量波動最小(例如鈣含量自基線血清鈣含量波動10%或10%以下)。因此其本身呈現為本文中呈現之DKK1抑制劑之可能搭配治療劑以增加治療反應。
若干疾病及醫藥療法改變全身鈣含量，藉此以不利方式影響骨密度，因此本發明之治療劑(包括其組合)適用於治療該等病狀中之骨質流失。高鈣血症及低鈣血症可由例如以下疾病引起：慢性腎病、腎病、腎衰竭、原發性或繼發性副甲狀腺機能亢進、假性副甲狀腺機能亢進、副甲狀腺機能減退、假性副甲狀腺機能減退、缺鎂症(magnesium depletion)、酒精中毒、雙膦酸鹽療法、嚴重高鎂血症、維生素D缺乏症、高磷酸鹽血症、急性胰臟炎、骨饑餓症候群、螯合作用、成骨性轉移(osteoblastic metastases)、敗血症、手術、化學療法、贅瘤形成症候群、家族性低鈣尿高鈣血症、類肉瘤病、結核病、鈹中毒、組織漿菌病(histoplasmosis)、念珠菌病(Candidiasis)、球黴菌病(Coccidioidomycosis)、組織球增多病X(histiocytosis X)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)或非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)、克隆氏病、韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、白血病、肺炎、聚矽氧誘發之肉芽腫、不動症或藥物療法，諸如投與噻嗪利尿劑、鋰、***、氟化物、葡萄糖及胰島素。此外，血清鈣波動為多種現有骨相關療法(諸如雙膦酸鹽療法及副甲狀腺素療法)之副作用。因為鈣不平衡之可能威脅生命之後果，所以對低鈣血症或高鈣血症敏感之患者可能需要放棄某些療法選擇。
因此，本發明之物質及方法(尤其組合)在治療對受鈣含量不穩定易感或敏感之患者方面有利。本發明之此態樣之情形中，向人類投與之硬化蛋白結合劑之量為不引起低鈣血症或高鈣血症(例如臨床顯著低鈣血症或高鈣血症)之量。此外，本發明提供一種治療罹患低鈣血症或高鈣血症或處於低鈣血症或高鈣血症之風險中的人類或禁忌使用雙膦酸鹽、副甲狀腺素或副甲狀腺素類似物進行治療之人類中骨相關病症的方法。該方法包含向人類投與有效提高骨形成標記含量(諸如BSAP、P1NP及/或OstCa之血清含量)及/或降低骨骼再吸收標記(諸如CTX)含量之量的硬化蛋白結合劑。
本文進一步提供治療或預防骨質流失之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之如本文所述之包含選自SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94及96之可變區的抗體或其免疫功能性片段(例如包含至少一個選自由SEQ ID NO：97至227及228組成之群之輕鏈CDR之抗體或免疫功能性片段)。在此實施例之一態樣中，患者罹患轉移至骨骼之癌症，且在另一態樣中，患者罹患多發性骨髓瘤。熟習此項技術者應瞭解，該等組合物(單獨或與一或多種其他治療劑組合)可適用於調配藥劑。本發明之抗體適用於治療骨相關病症。SEQ ID NO：42及44中所示之抗體用於治療骨折。 SEQ ID NO：42及44中所示之抗體用於治療空隙連接缺陷(gap union defect)。SEQ ID NO：42及44中所示之抗體與抑制性硬化蛋白抗體之組合用於治療骨折。SEQ ID NO：42及44中所示之抗體與抑制性硬化蛋白抗體之組合用於治療空隙連接缺陷。應理解，術語「骨折」意謂包括需要治療之患者的一或多種骨折。
可藉由本發明組合物治療之特定病狀包括骨生長或發育異常之發育不良。該等病狀之代表性實例包括軟骨發育不全、鎖骨顱骨發育不全、內生軟骨瘤病、纖維性結構不良、高歇氏病、馬方氏症候群、多發性遺傳性外生骨疣、神經纖維瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化症、鞏膜病變、假關節及化膿性骨髓炎。
可治療或預防之其他病狀包括骨質減少、骨質疏鬆症及骨質流失之多種病因。該等病狀之代表性實例包括牙周病、抗癲癇藥物誘發之骨質流失、原發性及繼發性副甲狀腺機能亢進、家族性副甲狀腺機能亢進症候群、失重誘發之骨質流失、男性骨質疏鬆症、停經後骨質流失、骨關節炎、腎性骨營養不良、滲透性骨病症、口部骨質流失、頜部骨壞死、青少年佩吉特氏病、肢骨紋狀肥大、代謝性骨疾病、肥大細胞增多症、鐮狀細胞病、缺血性骨疾病(諸如累-卡-佩三氏病及侷限性遊走性骨質疏鬆症)、貧血病況、由類固醇引起之病狀、糖皮質激素誘發之骨質流失、肝素誘發之骨質流失、骨髓病症、壞血病、營養不良、鈣缺乏症、特發性骨質減少或骨質疏鬆症、先天性骨質減少或骨質疏鬆症、酒精中毒、慢性肝病、停經後病況、慢性發炎病狀、類風濕性關節炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸炎、克隆氏病、月經過少、閉經、妊娠、糖尿病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺病症、副甲狀腺病症、庫興氏病、肢端肥大症、性腺低能症、不動症或廢用症、反射***感神經失養症候群、局部骨質疏鬆症、軟骨病、與關節置換有關之骨質流失、與HIV有關之骨質流失、與生長激素損 失有關之骨質流失、與囊腫性纖維化有關之骨質流失、纖維性結構不良、與化學療法有關之骨質流失、腫瘤誘發之骨質流失、與癌症有關之骨質流失、激素腐蝕性骨質流失、多發性骨髓瘤、藥物誘發之骨質流失、神經性厭食症、與疾病有關之面部骨質流失、與疾病有關之顱骨骨質流失、與疾病有關之頜骨骨質流失、與疾病有關之頭骨骨質流失及與太空旅行有關之骨質流失。其他病狀係關於與衰老有關之骨質流失，包括與衰老有關之面部骨質流失、與衰老有關之顱骨骨質流失、與衰老有關之頜骨骨質流失及與衰老有關之頭骨骨質流失。
如某些國家管轄內所允許，本文中揭示之參考文獻係以全文引用的方式併入本文中，如同各自個別地經併入以用於任何目的，包括實現及描述本發明。提供以下實例僅以說明本文中提供之抗體、片段及組合物之某些態樣且因此不應被視為限制所主張發明之範疇。
實例
實例1
製備人類DKK1(huDKK1)免疫原
如美國專利第6,344,541號中所描述用以下修飾來選殖人類DKK1。使用人類DKK1之兩種不同抗原決定基標記型式作為免疫原，一種含有FLAG抗原決定基且另一種為fc融合分子。使用熟習此項技術者顯而易知的標準分子生物學技術將兩個抗原決定基標籤附於人類DKK1之羧基端。
將人類DKK1之抗原決定基標記型式選殖入表現載體中以便在CHO細胞中表現。自改良性培養基純化含有FLAG或Fc抗原決定基之人類DKK1變異體以用作產生抗huDKK1抗體之抗原。自濃縮之改良性培養基(CM)純化抗原決定基標記之huDKK1。亦可使用熟習此項技術者已知的其他蛋白質產生及純化程序。
實例2
免疫及滴定
使用重組型FLAG標記之人類DKK1(FLAG-DKK1)及重組型Fc標記之人類DKK1(DKK1-fc)作為抗原。藉由對XenoMouse®小鼠(Abgenix,Inc.Fremont,CA)進行連續免疫來產生針對DKK1之單株抗體(參見例如美國專利第7,435,871號及其中描述)。經足墊途徑進行所有注射對XenoMouse動物進行免疫。藉由ELISA測定經免疫之XenoMouse小鼠之血清中的抗DKK抗體效價。
實例3
回收淋巴細胞、B細胞分離物、融合物及產生融合瘤
自各群組收集及彙集淋巴結。收集總排出物作為CD90陰性部分(預期大部分該等細胞為B細胞)。藉由使來自以上之經洗滌經增濃之B細胞與自ATCC購買之非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞(目錄號CRL 1580)(Kearney等人，J.Immunol.123,1979,1548-1550)以1：1之比率混合來進行融合。使用融合產生劑(ECM2001型，Genetronic,Inc.,San Diego,CA)進行電促細胞融合(Electro-cell fusion；ECF)。所用融合室大小為2.0mL。
在ECF後，在無菌條件下自融合室小心移除細胞懸浮液且轉移入含有相同體積融合瘤培養基(DMEM(JRH Biosciences))之無菌管中。培育細胞且接著離心。將細胞再懸浮於小體積融合瘤選擇培養基(補充有0.5×HA之融合瘤培養基(Sigma，目錄號A9666))中，且用更多融合瘤選擇培養基適當調節體積。溫和混合細胞且吸移入96孔盤中並使其生長。
實例4
在充分培養後，針對DKK1特異性單株抗體篩選融合瘤上清液。在一級篩選中，用50微升/孔Flag標記之rhDKK1(2μg/mL)塗佈ELISA盤，接著在4℃下培育隔夜。培育後，盤用洗滌緩衝液(Washing Buffer)洗滌3次，接著添加200微升/孔阻斷緩衝液且在室溫下培育該等盤。培育後，盤用洗滌緩衝液洗滌3次。添加融合瘤上清液之等分試樣(50微升/孔)以及陽性對照物及陰性對照物，且在室溫下培育該等盤2小時。
培育後，盤用洗滌緩衝液洗滌。添加50微升/孔偵測抗體且在室溫下培育該等盤1小時。培育後，盤用洗滌緩衝該等洗滌3次，接著添加50微升/孔TMB，且使盤顯色約10分鐘(直至陰性對照孔剛開始顯示顏色為止)。接著添加50微升/孔終止溶液且用ELISA盤讀取器在650nm波長下對盤進行讀取。截止點OD設定為高於陰性對照物之OD兩倍。
基於一級篩選，自陽性融合瘤細胞生長孔完全移除舊培養物上清液且將DKK1陽性融合瘤細胞與新鮮融合瘤培養基一起懸浮且轉移至24孔盤中。2天後，進行二級確認篩選，其中在經Flag標記之rhDKK1塗佈之ELISA(如上文描述)及經Flag標記之無關抗原塗佈之ELISA中確認初次篩選中之陽性融合瘤。3組偵測系統用於經抗原塗佈之ELISA，1組用於hIgG偵測，1組用於人類Ig κ輕鏈偵測且另一組用於人類λ輕鏈偵測以證明IgG與Ig κ或IgG與Ig λ或IgG與Ig κ加λ之完全人類組成。僅hIgG偵測用於經無關抗原塗佈之ELISA。除分別使用3種不同偵測抗體外，3組抗原塗佈之ELISA程序與上述相同。最終選擇係基於抗原上之正信號及無關抗原上之負信號。
將所產生之人類IgG/κ或IgG/λ DKK1特異性單株抗體詳述於表2中。
藉由限制稀釋來單細胞選殖分泌經認為具有功能利益之抗體之融合瘤。如上文所描述，藉由ELISA進行針對DKK1抗體之單細胞選殖之融合瘤的篩選。在融合瘤培養基中培養融合瘤純系且使用標準組織培養技術擴增以產生含有分泌之單株抗體之廢培養物上清液。亦產生融合瘤純系之冷凍儲備液。
實例5
藉由生物活性選擇產生針對人類DKK1之中和抗體的融合瘤
利用TCF/lef螢光素酶報導構築體(其中螢光素酶表現受典型Wnt路徑控制)測試如實例2中所描述獲得之融合瘤。當經該構築體轉染之細胞暴露於生物活性Wnt時，誘導螢光素酶活性。可藉由向含有該構築體之細胞中添加重組型DKK1蛋白來抑制Wnt誘導之螢光素酶活性。對於本發明之實驗，首先以抑制Wnt依賴性螢光素酶表現之約80%的最佳化量向細胞中添加Wnt3a與DKK1。預期向該等相同細胞中進一步添加具有中和活性之抗DKK1抗體可恢復Wnt活性，從而引起螢光素酶表現增加。因此測試來自融合瘤之上清液以測定其是否能夠 恢復經Wnt/螢光素酶構築體轉染之細胞中的螢光素酶表現。如下文所描述對螢光素酶活性進行定量。
在第0天，新近用胰蛋白酶處理之293T細胞塗於經纖維結合蛋白塗佈之96孔盤上。接著細胞與編碼螢火蟲螢光素酶之DNA及編碼海腎螢光素酶之DNA共轉染。在第1天，對於各孔，TCF/lef-螢光素酶DNA及含1ng海腎螢光素酶DNA之30μl DMEM與Polyfect Transfection ReagentTM(Qiagen 301107)混合且在室溫下培育10分鐘以形成PolyFect-DNA複合物。此培育後，向複合物中添加100μl生長培養基。接著自各孔移除培養基且將含複合物之生長培養基添加至孔中。3小時後，移除孔中之生長培養基且替換為含有Wnt3a之改良性培養基、重組型人類DKK1及抗DKK1融合瘤改良性培養基。
3天後，細胞用PBS洗滌1次且向各孔中添加被動溶解緩衝液。在室溫下震盪該等盤20分鐘以誘導溶解。根據製造商方案，每個檢定中10μl溶解物用於進行96孔白盤中之檢定。記錄來自螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶之發光信號且使用該等信號之比率來測定EC50且繪製劑量-反應曲線。首先，將螢火蟲螢光素酶之受質注入含細胞溶解物之孔中且記錄發光信號；接著，將海腎螢光素酶之受質注入同一孔中且記錄所得第二發光信號。
使用源自小鼠骨髓之基質細胞株ST2作為其他篩選物以便分離具有中和活性之抗DKK1抗體。反應於Wnt3a信號傳導，ST2細胞分化為表現成骨細胞標記蛋白鹼性磷酸酶(ALP)之成骨細胞。可藉由向培養基中添加Wnt抑制劑DKK1來阻斷該等細胞中藉由Wnt3a之ALP誘導。可在該等條件下藉由使細胞暴露於能夠中和DKK1活性之試劑(諸如中和性抗DKK1抗體)來恢復ALP表現。
總而言之，在ELISA檢定中篩選之融合瘤中，344者在ELISA檢定中結合DKK1且25者在1種或2種中和檢定(TCR/lef報導檢定或ST2細 胞檢定)中為陽性。將來自3次活動(campaign)中之每一者之顯示最佳活性之融合瘤展示於表3中。如自源自第二次活動(5.X.x)及第三次活動(6.X.x)之該等抗體之細胞活性可見，KL小鼠中產生之抗體通常顯示較佳的基於細胞之活性，如可由EC50低於第一次活動(2.X.x)中以Xenomouse產生之EC50顯見。
實例6
抗體之選殖及序列分析
自抗DKK1融合瘤細胞株製備總RNA。DNA序列由Abgenix提供或藉由對選殖之RACE(cDNA端快速擴增)PCR(聚合酶鏈反應)產物進行定序來獲得。
實例7
CHO細胞中人類抗huDKK1抗體之表現及純化
藉由使用標準電穿孔程序用表現質體pDC323-抗DKK1 κ及pDC324[抗DKK1-IgG2](對於2.40.3、6.35.5、6.116.6 HC-IgG2及LC-κ)轉染CHO宿主細胞來產生抗DKK1細胞株。在用表現質體轉染宿主細胞株後，使細胞於含有4%透析胎牛血清(ds或dfFBS)之-GHT選擇培養基中生長2-3週以允許質體選擇及細胞回收。接著自培養基移除血清且使細胞於GHT選擇性培養基中生長直至其達成>85%活力為止。接著，相繼在含有[150-300]nM MTX之培養基及含有500-1000nM MTX之培養基中培養該轉染之細胞池以選擇高表現細胞。
使用無菌細胞培養技術擴增表現抗huDKK1-1抗體之細胞株。在擴增後，將細胞接種入生物反應器中且視需要向其饋入培養物。在收集時，對細胞進行離心且過濾改良性培養基。在蛋白質A瓊脂糖凝膠上自改良性培養基純化人類抗huDKK1抗體。將純化之DKK1抗體緩衝交換至所選緩衝液。
實例8
基於ELISA之交叉阻斷檢定
此實例中所用之液體體積為96孔盤ELISA中通常所用之液體體積(例如50-200微升/孔)。此實例中，假設Ab-X及Ab-Y之分子量為約145Kd且具有2個DKK1結合位點/抗體分子。將抗DKK1抗體(Ab-X)塗佈(例如50μl，1μg/ml)於96孔ELISA盤上歷時至少1小時。在該塗佈步驟後，移除抗體溶液，盤用洗液洗滌且接著使用此項技術中已知的適當阻斷溶液及程序阻斷。自ELISA盤移除阻斷溶液且向ELISA盤之適當孔中添加含過量(例如50μl，10μg/ml)第二抗DKK1抗體(Ab-Y)(其正被測試其交叉阻斷所塗佈之抗體的能力)之阻斷溶液。
接著，向該等適當孔中添加含有限量(例如50μl，10ng/ml)huDKK1之阻斷溶液且在室溫下在震盪同時培育該盤至少1小時，接著洗滌該盤。向ELISA盤中添加含適量DKK1偵測試劑之阻斷 溶液且在室溫下培育至少1小時。
接著用洗液洗滌該盤且用適當試劑顯色。檢定之背景信號定義為具有塗佈之抗體(在該情況下為Ab-X)、第二溶液相抗體(在該情況下為Ab-Y)、僅DKK1緩衝液(亦即無DKK1)及DKK1偵測試劑之孔中獲得之信號。檢定之陽性對照信號定義為具有塗佈之抗體(在該情況下為Ab-X)、僅第二溶液相抗體緩衝液(亦即無第二溶液相抗體)、DKK1及DKK1偵測試劑之孔中獲得之信號。需要以使得陽性對照信號為背景信號至少6倍之方式進行ELISA檢定。
若與不存在溶液相抗DKK1抗體(亦即陽性對照孔)下獲得之DKK1偵測信號相比，溶液相抗DKK1抗體(呈格式1或格式2)能夠引起DKK1偵測信號(亦即由塗佈之抗體結合之DKK1量)降低60%與100%之間，特定言之70%與100%之間且更特定言之80%與100%之間，則將Ab-X及Ab-Y定義為交叉阻斷性。熟習此項技術者應理解，術語「交叉阻斷」不僅意欲涵蓋測試分子之結合之完全阻斷，實情為其亦可包括如本文描述之小於100%之結合降低範圍。在一實例中，分離之抗體或其片段交叉阻斷SEQ ID NO：42及44中所示之抗體與人類DKK1之結合及/或其與人類DKK1之結合由SEQ ID NO 42及44中所示之抗體交叉阻斷。與人類DKK1之結合由SEQ ID NO：42及44中所示之抗體之結合交叉阻斷之抗體包括與人類DKK1之結合降低60%、與人類DKK1之結合降低70%、與人類DKK1之結合降低80%、與人類DKK1之結合降低90%或與人類DKK1之結合降低95%之抗體。藉由結合SEQ ID NO：42及44中所示之抗體來交叉阻斷結合人類DKK1之抗體包括使其與人類DKK1之結合降低60%、與人類DKK1之結合降低70%、與人類DKK1之結合降低80%、與人類DKK1之結合降低90%或與人類DKK1之結合降低95%之抗體。在本文中將能夠彼此交叉阻斷之抗體視為屬於同一倉(in the same bin)。
在ELISA使用標記型式DKK1(諸如N端His標記之DKK1(R & D Systems,Minneapolis,MN,USA；2005目錄號1406-ST-025)之情況下，則適當類型之DKK1偵測試劑將包括HRP標記之抗His抗體。除使用N端His標記之DKK1外，亦可使用C端His標記之DKK1。此外，該基於ELISA之交叉阻斷檢定中可使用此項技術中已知的各種其他標籤及標籤結合蛋白組合(例如HA標籤與抗HA抗體；FLAG標籤與抗FLAG抗體；生物素標籤與抗生蛋白鏈菌素)。
本文所述之人類抗huDKK1中和抗體識別兩種不同抗原決定基(如因抗體不能彼此交叉阻斷而顯而易見)。第一抗原決定基稱為11H10，其已於先前描述(美國專利第7,709,611號)。第二抗原決定基描述於下文中且稱為5.25.1(SEQ ID NO：42及44)。
實例9
結合5.25.1抗體之人類DKK1抗原決定基之表徵
人類DKK1含有兩個二硫化物富集域，其位於N端附近及C端末端處，其在本文中稱為N端二硫化物域及C端二硫化物域。N端二硫化物域(以下稱為「二硫化物域1」或「D1」)含有55個胺基酸殘基(SEQ ID NO：2之胺基酸85-139)且具有形成5個分子內二硫鍵之10個半胱胺酸。C端二硫化物域(以下稱為「二硫化物域2」或「D2」)含有75個胺基酸(SEQ ID NO：2之胺基酸189-263)且含有亦形成5個分子內二硫橋鍵之10個半胱胺酸。該兩個二硫化物域由約50胺基酸之段隔離。已提出DKK1之二硫化物域2(D2)具有與典型輔脂酶摺疊類似之分子結構，其中晶體結構已使用豬輔脂酶測定(Aravind,A.及Koonin,E.V.,Current Biology 8：R477-479(1998))。最近已測定DKK分子之N端D1域中10個半胱胺酸殘基間的分子內二硫鍵。
用還原劑處理可消除DKK1結合5.25.1之能力，因此表明該抗體靶向之抗原決定基為構形抗原決定基(或非連續抗原決定基)且需要保 持D1域及D2域中之二硫鍵完整。為表徵該構形抗原決定基，應用涉及用溴化氰(CNBr)及若干種不同蛋白酶將人類DKK1分段，接著分析片段及測試其結合於抗體之能力的策略。亦在5.25.1存在下進行消化以偵測因抗體結合而經保護免於蛋白水解之彼等胺基酸殘基或序列區域。所得資料可說明抗原決定基之位置。本質上，在不存在或存在抗體5.25.1下進行DKK1蛋白水解消化，接著進行HPLC肽圖分析(peptide mapping)。可觀察到HPLC峰高之部分或完全降低及/或暴露於抗體之樣品中新產生之峰的偵測。
在每一次肽消化後，藉由HPLC分離反應產物，收集個別峰且藉由N端定序對肽進行鑑別及定位。為測定肽是否可結合5.25.1，用BiaCore工作站，使用與HuDKK1共價結合之感測器圖譜表面作為結合之生物感測器對其進行即時生物特異性相互作用檢定。在標準條件下進行HPLC肽圖分析。
CNBr消化
hDKK1之CNBr裂解產生兩個大片段。其為CNBr1及CNBr2，其分別表示D2二硫化物域及D1二硫化物域。由兩個肽(SEQ ID NO：2之胺基酸179-206及SEQ ID NO：2之胺基酸207-266[或274，若包括添加之C端flag肽])組成之CNBr1藉由5個二硫鍵結合在一起。類似地由兩個肽(SEQ ID NO：2之胺基酸32-122及SEQ ID NO：2之胺基酸127-178)組成之CNBr2亦藉由5個二硫鍵結合在一起(表4)。BiaCore分析結果表明5.25.1能夠顯著結合於CNBr2但完全不結合於CNBr1。因此，得出5.25.1結合於位於HuDKK1之D1二硫化物域中之抗原決定基區域的結論。
胰蛋白酶消化
接著用胰蛋白酶消化人類DKK1，胰蛋白酶在ARG及LYS殘基後裂解。將約200μg DKK1(0.5-1.0mg/mL)在37℃下於PBS(pH 7.2)中與 8μg該等蛋白酶中之一者或另一者一起培育20小時以實現DKK1完全消化。
胰蛋白酶消化物之HPLC層析產生多個峰，將其收集，乾燥且於0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)中復原。表4描述含有源自CNBr裂解及蛋白水解消化之N端二硫化物域D1之DKK1肽片段。
對在胰蛋白酶消化後自HPLC回收之肽峰進行序列分析。亦藉由LC-MS/MS分析確認含有肽序列且無二硫鍵之肽峰。藉由基質輔助雷射脫附質譜分析(MALDI-MS)確認含有多個二硫鍵聯肽之片段的分子質量。確認兩個峰，T2(滯留時間40.7分鐘(使用1mm內徑管柱)或43.5分鐘(使用2.1mm管柱))及T3(滯留時間41.9分鐘(使用1mm內徑管柱)或44.7分鐘(使用2.1mm管柱))含有定位於二硫化物域1之序列，而T1肽(滯留時間35分鐘(1mm C18管柱中)或36.5分鐘(2.1 C4管柱中))定位於二硫化物域D2。當藉由BiaCore結合實驗測試時，T1、T2及T3均不結合於5.25.1。T2及T3為由5個小型肽(長度為3至13個胺基酸)組成之大型肽片段，該5個小型肽藉由具有SEQ ID：2之胺基酸74-102、103-115、121-123、124-134、135-147(表4)之D1域中的5個二硫鍵結合在一起。二硫化物域1處序列之1個小型區段自T2及T3缺失。該含有所有Lys及Arg之缺失序列為SEQ ID NO：2之胺基酸116-120(序列ARG-ARG-LYS-ARG)。
在室溫下，人類DKK1亦與5.25.1以1：1至1：3之莫耳比一起於PBS緩衝液中培育1小時。接著在如上文所描述條件下藉由胰蛋白酶消化DKK1/抗體複合物之等分試樣。除T2及T3峰消失且新峰T4(滯留時間41.3分鐘(使用1mm管柱)或44.3分鐘(使用2.1mm內徑管柱))變得可偵測外，胰蛋白酶消化物之HPLC肽圖分析概況與在無抗體5.25.1存在下由DKK1消化物所得之概況完全相同。T4亦為N端域D1肽，但僅含有具有序列ID NO：2之胺基酸74-147(表4)之單一胺基酸序列。在Biacore結合檢定中，T4結合於5.25.1且可與感應晶片表面結合之DKK1競爭結合5.25.1。
AspN消化
為進一步描述結合5.25.1之抗原決定基，用蛋白酶AspN消化HuDKK1且如上文所描述分析所得片段。在由AspN消化產生之主要HPLC峰中，結合抗體5.25.1之峰為AspN1、AspN2及AspN3。序列分析表明AspN1及AspN2源自二硫化物域D1。AspN1及AspN2之胺基酸序列一致且其各自由兩個肽藉由二硫化物域D1中5個二硫鍵結合在一起組成。該兩個肽由SEQ ID NO：2之胺基酸78-104及105-141組成(參見表4)。AspN3為部分消化產物，其序列含有D1域序列與D2域序列。亦分離兩個其他峰，即AspN4及AspN5且確認為D2域中之二硫鍵聯肽，AspN4或AspN5不與DKK1競爭結合5.25.1。
消化結果分析
以上結果表明5.25.1結合於位於二硫化物域D1中人類DKK1之非線性抗原決定基。如圖1中例示，藉由以下描述之觀察結果推導抗原決定基區域：胰蛋白酶裂解(圖1中位置102處之R及位置115與120之間的 RKRRKR及位置134處之K)產生由二硫化物連接的5個肽。該D1域胰蛋白酶肽部分失去5.25.1結合活性。
抗體5.25.1可結合於DKK1以保護D1域上之所有裂解位點免於胰蛋白酶蛋白水解(位置99處之R，及位置115與120之間的RKRRKR及位置134處之K)。所得D1胰蛋白酶片段(以不同滯留時間回收)為單一多肽鏈，表明D1中所有Arg及Lys均受保護免於蛋白水解，因此緊密位於抗原決定基區域或與抗原決定基結合有關。維持D1片段產生之AspN或CNBr裂解中之結合活性。為維持結合活性，D1域之所觀察到之最小片段大小為胺基酸78-141，但Asp-N已將肽鍵夾於Gly 105與位置105處之Asp之間，使得該大型二硫化物環(於Cys 97與Cys 111之間形成)未連接在一起。
用於移除胺基酸123-126(序列ARG-HIS-ALA-MET)之CNBr裂解及Gly114-Asp115肽鍵之AspN裂解不影響CNBr2及AspN1(或AspN2)片段與5.25.1之結合，因此該等區域中之序列不處於抗原決定基中。D1中之高度帶負電區域(胺基酸83-91)在不存在Ab下對GluC及AspN消化具有抗性，表明該區域不易於蛋白水解(可能歸因於位阻)且亦不易接近5.25.1。
總而言之，存在於HuDKK1中用於5.25.1結合之抗原決定基包括在N端二硫化物域D1：SEQ ID NO：2之胺基酸98-104、107-121及129-140之非連續序列。且D1域二硫鍵必須保持完整以保留正確構形或三維結構以便5.25.1結合。
實例10
單株抗體對DKK1之結合親和力
使用BiaCore 2000(BIACORE,Uppsala,Sweden)進行分析以研究 人類抗huDKK1抗體對DKK1之結合。BiaCore可測定所選抗體之kd。更需要具有較低kd之彼等抗體，因為其與具有較大kd之抗體相比更久地結合hDKK1，且因此更可能引起較大反應。分析結合感測器圖譜且將資料概述於下文中。
除脫附速率外，諸如ka(吸附速率)、KD(親和力)、基於細胞之活性及活體內活性之其他參數亦為影響治療劑整體選擇之因素。表5中之資料亦表明彼等源自KL小鼠之後續免疫之抗體產生具有更所需Kd之抗體。亦測試若干抗體對huDkk4之結合以測定特異性且測定出人類抗huDKK1抗體對DKK1之特異性較之對Dkk4增加至少50倍，其中5.25.1及5.32.1未顯示對Dkk4之可偵測結合。
有趣的是，當分析由第二活動抗體(其含有11H10與5.25.1倉抗體)之BiaCore分析產生之感測器圖譜時，變得顯而易知的是各倉之間存 在差異。與5.25.1倉抗體相比，11H10倉抗體在既定抗體濃度下產生更高結合信號。自11H10倉抗體(2.40.2及5.80.2及5.80.3)觀察到增大之最大信號。
自BiaCore結果顯而易知，人類抗huDKK1抗體對DKK1之親和力不同，且若干種該等抗體對人類DKK1之親和力超過BiaCore檢定之靈敏度極限。因此，藉由使用更靈敏的KinExAtm 3000之平衡結合分析進一步評估若干種該等抗體對DKK1之親和力。對於該等量測，Reacti-Gel 6x珠粒(Pierce,Rockford,IL)用人類、食蟹獼猴或小鼠DKK1預塗佈且用BSA阻斷。將100pM、300pM或1000pM抗體與各種濃度之人類、小鼠或食蟹獼猴DKK1混合(濃度在1pM至50nM範圍內)且在室溫下平衡8小時。接著使混合物在DKK1塗佈之珠粒上方通過。使用以螢光標籤(Cy5；Jackson Immuno Research,West Grove,PA)標記之山羊抗人類-IgG抗體對珠粒結合之抗DKK1抗體之量進行定量。所量測之螢光信號之量與平衡狀態下各反應混合物中游離抗DKK1抗體之濃度成比例。使用KinExA軟體用雙曲線單位點均質結合模型，由競爭曲線之非線性回歸獲得解離平衡常數(Kd)。將所選抗體之KinExA檢定結果展示於表6中。
實例11
僅11H10倉抗體阻斷huDKK1與LRP6及Kremin2之結合
使用共免疫沈澱程序檢驗11H10倉抗體及5.25.1倉抗體阻斷DKK1與Wnt輔助受體LRP6或與Kremin2之結合的能力。將重組型小鼠LRP6-His及rhDKK1-Flag或重組型人類kremen2-his及hDKK1-flag在亨克氏平衡鹽溶液(HANKs balanced salt solution)中在有或無抗DKK1抗體之情況下預培育，同時震盪隔夜以形成複合物。
在圖2A中，將rhDKK1-flag與LRP6-His與5μg一種來自11H10倉(5.80.1、6.37.5或r11H10)或5.25.1倉(5.25.1、5.77.1)之中和性DKK1抗體中一起培育。用抗his抗體使混合物免疫沈澱，抗his抗體將結合his標記之LRP6且拉下所結合DKK1。接著使用識別rhDKK1之抗flag抗體對免疫沈澱物進行西方墨點分析(Western blotting analysis)。藉此，可量測溶液中與LRP6結合之DKK1及中和性DKK1抗體針對DKK1與LRP6(及根據推理與LRP5)之結合進行競爭之能力。泳道1僅包括LRP6-His；泳道2 rhDKK1-Flag；泳道3 hLRP6-His+hDKK1-Flag；泳道4 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.80.1；泳道5 hLRP6-His+hDKK1-Flag+6.37.5；泳道6 hLRP6-His+hDKK1-Flag+r11H10；泳道7 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.25.1；泳道8 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5.77.1。資料表明所有三種11H10倉抗體(而非5.25.1倉抗體)均可阻斷DKK1與LRP6之相互作用。
以類似方式，測定相同之上述抗體阻斷DKK1與Kremin2(及根據推理與Kremin1)結合之能力(圖2B)。泳道1僅包括LRP6-His；泳道2 rhDKK1-Flag；泳道3 hLRP6-His+hDKK1-Flag；泳道4 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg 5.80.1；泳道5 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 5.80.1；泳道6 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg 6.37.5；泳道7 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 6.37.5；泳道8 hLRP6-His+hDKK1-Flag+0.5μg r11H10；泳道9 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg r11H10；泳道10 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 5.25.1；泳道11 hLRP6-His+hDKK1-Flag+5μg 5.77.1。
資料表明所有三種11H10倉抗體(而非5.25.1倉抗體)均可阻斷DKK1與Kremin2之相互作用。此實驗呈現之資料表明兩種不同抗體倉在中和對Wnt信號傳導之DKK1活性之能力方面顯示不同作用機制。
實例12
所選抗體之活體內活性
進行實驗以測定小鼠動物模型中DKK1中和是否將引起骨密度(BMD)及血清骨鈣化素(骨形成標記)提高。測試抗體為2.40.2、5.32.5、5.80、6.37.5、6.116.6且如上文所描述進行純化。
在第一實驗中，於3週期間向4週齡雄性BDF-1小鼠(APR 233757，Charles River)皮下注射三劑之一之純化2.40.2單株抗體(5、10或20mg/kg)。每組使用5隻小鼠。向陰性對照小鼠注射媒劑(PBS)且向陽性對照小鼠注射副甲狀腺素(胺基酸1-34)，已知副甲狀腺素刺激該等小鼠骨密度提高(Dempster等人，Endocrine Reviews 14(6)：690-709(1993))。每次注射使用100μg/kg PTH(1-34)。將3週時脛骨骨密度之變化百分比結果展示於以下圖3中。
為比較兩種不同抗體倉之活體內功效，自各倉選擇代表性抗體。自5.25.1倉選擇5.32.1抗體且自11H10倉選擇5.80.1抗體。該等抗體以類似親和力結合小鼠DKK1。於2週期間向8週齡雄性BDF-1小鼠(APR 233737，Charles River)皮下注射三劑之一之純化單株抗體(3、10或30mg/kg)。每組使用6隻小鼠。向陰性對照小鼠注射媒劑(PBS)。資料於圖4中呈現為腰椎骨密度自基線之變化百分比且表明11H10倉抗體(5.80.1)比5.25.1倉抗體(5.32.1)顯示優越的骨構建活性。
在另一實驗中，將來自11H10倉之兩種其他抗體注入8週齡雄性 BDF-1小鼠中。經3週每週2次向該等小鼠皮下注射25mg/kg個別抗體(6.37.5及6.116.6)。每組使用10隻小鼠。向對照組注射媒劑(每週2次)或PTH(100μg/kg，每週5次)。資料於以下圖5中呈現為腰椎骨密度自基線之變化百分比且表明該等抗體以與PTH類似之程度提高骨密度。
在大鼠閉合性骨折癒合模型中用大鼠11H10倉抗體進行其他研究。此研究中利用完全大鼠11H10倉抗體r11H10作為本文所述之完全人類抗體之替代分子。由於針對人類抗體之齧齒動物免疫反應，因此此研究之長度排除使用完全人類DKK1抗體。簡言之，在7-7.5月齡雄性大鼠之股骨中產生閉合性骨折(參見實例14中之方法)。藉由在骨折之前將細針(18G)***股骨骨髓隙中來穩定股骨。接著用媒劑或r11H10(25mg/kg，每週兩次)處理該等動物。使骨折歷時7週癒合。在研究完成時，分析骨折之股骨之骨密度、生物力學強度及橋連。抗DKK1處理之動物顯示所有該等參數均顯著改良，表明抗DKK1療法將適用於處理骨折癒合及需要骨再生之其他適應症。圖6展示在骨折骨痂處抗DKK1處理所達成之最大負載及BMD之改良，表明骨折癒合得到促進。
實例13
偵測人類及動物模型血清及組織樣品中之DKK1
本文所述之抗體已用於偵測人類樣品(包括(但不限於)血清)中之DKK1含量。為發展此類型檢定，重要的是所選兩種抗體不識別相同抗原決定基，諸如本文所述之兩種不同抗原決定基。為檢定人類血清或其他組織中之DKK1，首先使用重組型huDKK1建立標準曲線。較佳在缺乏或含有低含量huDKK1之人類血清中建立該標準曲線。通常，用於血清之標準曲線之範圍介於25pg/ml與10ng/ml huDKK1之間，但可能需要視所分析樣品中獲得之huDKK1之最小值及極大值來調節該範圍。所用方案實例如下文描述，但可視所用特異性抗體及樣 品而進行熟習此項技術者顯而易知的修改。
首先，將待分析人類血清載入非結合半區盤中。向孔中添加預定量的來自抗原決定基X之生物素標記抗體(諸如11H10)及預定量的來自抗原決定基Y之辣根過氧化酶(HRP)標記之抗體(諸如5.25.1)以及含50mg/ml兔IgG之I-阻斷緩衝液以達到孔中60μl之總體積(包括血清)。將該混合物置於震盪器上30分鐘且接著在4℃下培育隔夜。
在培育隔夜後，將50μl溶液轉移入396孔盤中。接著在室溫下培育該盤1小時同時進行混合。孔用PBS洗滌且添加偵測溶液。接著在適當讀取器上分析該盤。一式兩份進行檢定且藉由與標準曲線比較來測定血清中之DKK1濃度。資料適用於確定患者之所分析組織或血清樣品中DKK1含量是否已變化。
除將本文所述之抗體用於偵測人類血清中之人類DKK1外，抗體亦可用於偵測自疾病之動物模型分離之血清中之DKK1。作為非包括性實例，使用如上文所述之方案以偵測大鼠慢性腎病(CKD)模型中之DKK1含量。製備患病腎及對照腎之提取物且測定大鼠DKK1蛋白含量。資料展示於圖7中且證明在用藥理學試劑誘發腎損害後3週，DKK1蛋白含量上升約5倍。該等結果表明DKK1與腎病進展有關且表明DKK1之藥理學調節在腎病中具有治療效用。同樣地，此實例中描述之方法可用於鑑別DKK1調節可具有治療效用之其他疾病病況。
實例14
硬化蛋白及DKK1為骨形成之負調節劑。在骨質疏鬆症之動物模型中，藉由用硬化蛋白單株抗體(Scl-Ab)進行全身處理來抑制硬化蛋白可顯著增加骨形成、骨質及骨強度(Li XD等人，J Bone Miner Res 2009；24：578)。此外，在骨修復之動物模型中，用Scl-Ab處理可增強骨折癒合(Ke HZ等人，Trans ORS 2009；34：22；Ominsky M等人，ASBMR摘要，2009年9月；Denver,CO)。類似地，藉由全身投與單株 抗體r11H10(DKK1-Ab)來中和DKK1可提高小鼠(Komatsu DE等人，J Orthop Res 2010；DOI 10.1002/JOR.21078)及大鼠骨折模型之骨折部位之骨密度(BMD)及骨強度。假設在成年大鼠模型中之骨折及非骨折骨骼中，Scl-Ab與DKK1-Ab之組合可具有刺激骨形成及提高骨強度之協同作用。
研究設計：如先前報導使7至7.5月齡雄性史泊格-多利(Sprague-Dawley；SD)大鼠(平均體重580g)罹患單側封閉性股骨中部骨幹骨折(Bonnarens F等人，J Orthop Res 1984；2：97-101)。簡言之，18號注射器刺針經股骨髁***髓管中且充當內固定物。接著經用鈍器擊打大腿正面(側面)使股骨橫骨折。在骨折後第1天，向動物(n=14-18隻/組)皮下注射鹽水媒劑或Scl-Ab，或DKK1-Ab(r11H10)或Scl-Ab與DKK1-Ab之組合(Combination)。每週兩次以25mg/kg藉由皮下注射來給予Scl-Ab與DKK1-Ab。在骨折後7週，使動物安樂死；收集骨折及完整的對側(CL)股骨以用於密度測定及生物力學。該研究經阿目金機構動物管理及使用委員會(Amgen's Institution Animal Care and Use Committee)批准。
密度測定：在骨折區域(骨折股骨之中間30%)或CL股骨中相應區域藉由DXA(GE Lunar PIXImus II)離體掃描股骨以測定區域骨密度(BMD)。亦使用桌上型微CT系統(eXplore Locus SP,GE Healthcare,London,Ontario,Canada)掃描兩種股骨且重建構至30μm解析度。在如先前所述(Taylor DK等人，J Bone Miner Res 2009；24：1043-1054)除去原始皮質後，評估中央1mm骨折骨痂之骨礦物質含量(BMC，臨限值為800mg/cc)。使用可變臨限值(對於媒劑、Scl-Ab及DKK1-Ab為570mg/cc；對於Combination為615mg/cc)以總體積百分比(BV/TV)之形式定量骨痂骨體積。對於完整CL股骨，檢驗跨越10%股骨高度、在皮層骨之中間層(臨限值為800mg/cc)及末梢股骨小樑骨(臨限值為450 mg/cc(媒劑及DKK1-Ab)、550mg/cc(Scl-Ab)及600mg/cc(Combination))之區域。分別評估該等部位之平均皮層骨面積及疏質骨體積分數(BV/TV)。
生物力學：在3點彎曲中在骨折骨痂中央或對側股骨之中間層處測試到股骨破損，且評估骨強度參數(MTS 858 Mini Bionix II；跨距=20mm；位移速率=0.1毫米/秒)。
統計分析：使用GraphPad Prism(5.01版)進行統計分析。藉由F測驗(F test)比較組方差(group variance)。若組方差顯著不同(p0.05)，則將資料進行對數變換且重新提交評估方差。當組方差之間的差異不顯著時，使用不成對t測驗進行媒劑與Scl-Ab或DKK1-Ab之間的組平均值比較。當組方差仍不同(p0.05)時，則使用曼惠特尼測驗(Mann Whitney test)進行比較。以平均值+SE形式報導資料，且將p<0.05視為顯著。
結果：骨折股骨：與媒劑相比，Scl-Ab與DKK1-Ab均顯示骨折骨痂處骨質及骨強度之類似改良，如分別由骨折骨痂之中央1mm處骨幹BMD增加11%(DXA)及BMC增加24-26%(μCT)及BV/TV增加40-60%(μCT)；及骨折骨骼之峰值負載增加76-122%證明。Scl-Ab與DKK1-Ab之組合處理以顯著大於單獨任一者之程度極大增強骨折骨痂處之骨質及骨強度。與媒劑相比，在Combination組中，在骨折骨痂之中央1mm處之骨幹BMD、BMC及BV/TV分別增加39%、60%及93%。與媒劑相比，該等變化引起Combination組中峰值負載增加230%。此外，與單獨Scl-Ab組或單獨DKK1-Ab組相比，Combination組中之BMD、BMC及BV/TV以及峰值負載顯著較高。
完整對側股骨： 在完整對側股骨中，DKK1-Ab不會顯著影響骨幹BMD、皮層骨面積及疏質骨BV/TV及骨強度。然而，與媒劑相比，Scl-Ab分別顯著 地使中部骨幹皮層骨BMD增加6%且皮層骨面積增加10%且末梢股骨疏質骨BV/TV增加43%。在Scl-Ab處理下，在皮層骨及疏質骨部位之該等骨質增加與峰值負載增加17%(與媒劑相比)相關。
與骨折之骨骼類似，與媒劑相比，Scl-Ab與DKK1-Ab之組合顯著地使對側股骨中部骨幹BMD增加12%、皮層骨面積增加17%且末梢股骨疏質骨BV/TV增加107%且峰值負載增加27%。Combination組中骨幹BMD及末梢股骨疏質骨BV/TV之平均值顯著大於單獨Scl-Ab組及單獨DKK1-Ab組之觀察結果，而Combination組中皮層面積及峰值負載分別比單獨DKK1-Ab組顯著地大15%及21%。
<110> 美商安美基公司
<120> DKK1抗體及使用方法
<130> A-1574-WO-PCT
<140> 100139221
<141> 2011-10-27
<150> 61/407,128
<151> 2010-10-27
<160> 244
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 266
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 816
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 272
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 810
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 5
<210> 6
<211> 270
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 6
<210> 7
<211> 798
<212> DNA
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 7
<210> 8
<211> 266
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 8
<210> 9
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
<210> 11
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
<210> 15
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
<210> 17
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
<210> 19
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
<210> 21
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
<210> 23
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
<210> 24
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
<210> 25
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
<210> 26
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
<210> 27
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
<210> 29
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
<210> 31
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
<210> 32
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
<210> 35
<211> 354
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
<210> 37
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
<210> 39
<211> 378
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
<210> 40
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
<210> 41
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
<210> 43
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
<210> 47
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
<210> 48
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
<210> 49
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
<210> 51
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
<210> 53
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
<210> 56
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
<210> 57
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
<210> 58
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
<210> 59
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
<210> 60
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
<210> 61
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
<210> 62
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
<210> 63
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
<210> 64
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
<210> 65
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
<210> 66
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
<210> 67
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
<210> 68
<211> 123
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
<210> 69
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
<210> 71
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
<210> 72
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
<210> 73
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 74
<210> 75
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
<210> 76
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 76
<210> 77
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
<210> 78
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 78
<210> 79
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 80
<210> 81
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 82
<210> 83
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
<210> 84
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
<210> 85
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
<210> 86
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
<210> 87
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 87
<210> 88
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
<210> 89
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
<210> 91
<211> 342
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
<210> 92
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
<210> 93
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
<210> 95
<211> 348
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
<210> 96
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
<210> 97
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 105
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
<210> 109
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
<210> 115
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
<210> 121
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
<210> 124
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
<210> 129
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
<210> 142
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
<210> 148
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
<210> 154
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
<210> 156
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
<210> 157
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
<210> 159
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
<210> 160
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
<210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
<210> 167
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
<210> 169
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
<210> 171
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
<210> 172
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
<210> 173
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
<210> 175
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
<210> 177
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
<210> 179
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
<210> 180
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
<210> 181
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 181
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
<210> 184
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
<210> 186
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
<210> 187
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 187
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
<210> 189
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 189
<210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 190
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 191
<210> 192
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 192
<210> 193
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 193
<210> 194
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 194
<210> 195
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 195
<210> 196
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 196
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 197
<210> 198
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 198
<210> 199
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 200
<210> 201
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 201
<210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 202
<210> 203
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 203
<210> 204
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 204
<210> 205
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 205
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 206
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 208
<210> 209
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
<210> 210
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 210
<210> 211
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 211
<210> 212
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 212
<210> 213
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
<210> 214
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 214
<210> 215
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
<210> 216
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
<210> 217
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 217
<210> 218
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 219
<210> 220
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 220
<210> 221
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 221
<210> 222
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 222
<210> 223
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 223
<210> 224
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 224
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 225
<210> 226
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
<210> 227
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 227
<210> 228
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 228
<210> 229
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 229
<210> 230
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 230
<210> 231
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 231
<210> 232
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 232
<210> 233
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 233
<210> 234
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
<210> 235
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 235
<210> 236
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 236
<210> 237
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 237
<210> 238
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
<210> 239
<211> 318
<212> DNA
<213> 智人
<400> 239
<210> 240
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 240
<210> 241
<211> 978
<212> DNA
<213> 智人
<400> 241
<210> 242
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 242
<210> 243
<211> 981
<212> DNA
<213> 智人
<400> 243
<210> 244
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 244

Claims (22)

  1. 一種分離之抗體或其片段，其交叉阻斷包含SEQ ID NO：94及96中所示序列之抗體與人類DKK1之結合及/或其與人類DKK1之結合由包含SEQ ID NO：94及96中所示序列之抗體交叉阻斷，且抑制人類DKK1活性，其中該抗體或其片段包含選自由以下組成之群之6個CDR：(a)SEQ ID NO：115-120、(b)SEQ ID NO：139-144、(c)SEQ ID NO：187-192、(d)SEQ ID NO：193-198、(e)SEQ ID NO：205-210、(f)SEQ ID NO：211-216、(g)SEQ ID NO：217-222及(h)SEQ ID NO：223-228。
  2. 如請求項1之抗體或其片段，其特異性結合於SEQ ID NO：2之胺基酸221-236及/或246-262中之非連續抗原決定基。
  3. 如請求項1之抗體或其片段，其以2.510E-04S-1或2.510E-04S-1以下之Kd結合於人類DKK1。
  4. 如請求項1之抗體或其片段，其具小於1x10-7M之親和力。
  5. 如請求項1之抗體或其片段，其阻斷Kremin2與人類DKK1之結合。
  6. 如請求項1之抗體或其片段，其中該CDR具有包含SEQ ID NO：223至228之序列。
  7. 如請求項1之抗體或其片段，其包含重鏈，該重鏈具有與SEQ ID NO：24、40、72、76、84、88、92或96具有至少85%序列一致性之序列。
  8. 如請求項1之抗體或其片段，其包含輕鏈，該輕鏈具有與SEQ ID NO：22、38、70、74、82、86、90或94具有至少85%序列一致性之序列。
  9. 如請求項7或8之抗體或其片段，其包含輕鏈與重鏈，該輕鏈與重鏈分別具有SEQ ID NO：22與24、38與40、70與72、74與76、82與84、86與88、90與92或94與96之序列。
  10. 如請求項9之抗體或其片段，其包含輕鏈與重鏈，該輕鏈與重鏈分別具有SEQ ID NO：94及96之序列。
  11. 如請求項1之抗體或其片段，其中該抗體係選自由以下組成之群：抗體2.40.1、5.23.1、5.78.1、5.80.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5及6.147.4，其中抗體2.40.1包含SEQ ID NO：22所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：24所示之可變重鏈序列，抗體5.23.1包含SEQ ID NO：38所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：40所示之可變重鏈序列，抗體5.78.1包含SEQ ID NO：70所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：72所示之可變重鏈序列，抗體5.80.1包含SEQ ID NO：74所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：76所示之可變重鏈序列，抗體6.37.5包含SEQ ID NO：82所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：84所示之可變重鏈序列，抗體6.116.6包含SEQ ID NO：86所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：88所示之可變重鏈序列，抗體6.139.5包含SEQ ID NO：90所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：92所示之可變重鏈序列，且抗體6.147.4包含SEQ ID NO：94所示之可變輕鏈序列及SEQ ID NO：96所示之可變重鏈序列。
  12. 如請求項11之抗體或其片段，其中該抗體為如請求項11所定義之6.147.4。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或其片段及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其進一步包含抗硬化蛋白(sclerostin)抗體。
  15. 一種雙特異性分子，其包含針對硬化蛋白之第一結合特異性及針對DKK1內抗原決定基之第二結合特異性，其中該雙特異性分子包含如請求項1至12中任一項之抗體或其片段。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項15之雙特異性分子及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  17. 一種如請求項13、14或16之醫藥組合物之用途，其係用以製備用於治療骨病症之藥劑。
  18. 如請求項17之用途，其中該骨病症為骨折。
  19. 一種DKK1抗體或其片段與硬化蛋白抗體或其片段之組合之用途，其係用以製備用於促進骨折修復之藥劑，其中該DKK1抗體或其片段為如請求項1至12中任一項之抗體或其片段。
  20. 如請求項19之用途，其中同時投與該等抗體或其片段。
  21. 如請求項20之用途，其中在骨折1天之內投與該等抗體或其片段。
  22. 如請求項19之用途，其中該等抗體或其片段為雙或多特異性分子之組份。
TW105125647A 2010-10-27 2011-10-27 Ｄｋｋ１抗體及使用方法 TWI636994B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40712810P 2010-10-27 2010-10-27
US61/407,128 2010-10-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201710291A TW201710291A (zh) 2017-03-16
TWI636994B true TWI636994B (zh) 2018-10-01

Family

ID=44910313

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100139221A TWI636993B (zh) 2010-10-27 2011-10-27 Ｄｋｋ１抗體及使用方法
TW105125647A TWI636994B (zh) 2010-10-27 2011-10-27 Ｄｋｋ１抗體及使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100139221A TWI636993B (zh) 2010-10-27 2011-10-27 Ｄｋｋ１抗體及使用方法

Country Status (10)

Country Link
US (3) US9879072B2 (zh)
EP (3) EP3838922A1 (zh)
JP (2) JP6066912B2 (zh)
AR (2) AR083740A1 (zh)
AU (3) AU2011319843C1 (zh)
CA (2) CA2815181C (zh)
ES (1) ES2863626T3 (zh)
MX (2) MX354481B (zh)
TW (2) TWI636993B (zh)
WO (1) WO2012058393A2 (zh)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL143266A0 (en) 1998-11-27 2002-04-21 Darwin Discovery Ltd Transforming growth factor-beta binding proteins and pharmaceutical compositions for increasing bone mineral content utilizing the same
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
US8551789B2 (en) 2010-04-01 2013-10-08 OncoMed Pharmaceuticals Frizzled-binding agents and their use in screening for WNT inhibitors
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
ME02819B (me) 2010-05-14 2018-01-20 Amgen Inc Formulacije sa visokom koncentracijom antitijela
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
US11167011B2 (en) 2010-06-07 2021-11-09 Enzo Biochem, Inc. Methods for treating bone loss using sclerostin peptides
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9403882B2 (en) 2010-06-07 2016-08-02 Joshua Rabbani Sulfation of Wnt pathway proteins
EP3838922A1 (en) * 2010-10-27 2021-06-23 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
US9133272B2 (en) * 2011-03-01 2015-09-15 Amgen Inc. Bispecific binding agents
EA029956B1 (ru) 2011-03-25 2018-06-29 Эмджен Инк. Кристаллы антител против склеростина и составы на их основе
WO2013019954A1 (en) 2011-08-04 2013-02-07 Amgen Inc. Method for treating bone gap defects
KR20190120401A (ko) 2011-12-28 2019-10-23 암젠 인크 항스클레로스틴 항체의 이용을 통한 치조골 소실의 치료 방법
EP2836512B1 (en) 2012-04-11 2018-10-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Improved antibody light chains
AU2013285488B2 (en) 2012-07-05 2018-03-22 Ucb Pharma S.A. Treatment for bone diseases
EP2911691B1 (en) 2012-10-23 2018-10-10 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP2016510411A (ja) * 2013-02-04 2016-04-07 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｗｎｔ経路インヒビターによる処置の方法およびモニタリング
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
US11135223B2 (en) 2016-01-22 2021-10-05 Yale University Compositions and methods for inhibiting Dkk-1
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
WO2018115879A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
JP7191833B2 (ja) * 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
SG11202003114UA (en) * 2017-10-04 2020-05-28 Amgen Inc Transthyretin immunoglobulin fusions
JP2021519065A (ja) * 2018-03-23 2021-08-10 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 骨障害を処置するための遺伝子治療法
SG11202008206TA (en) 2018-03-30 2020-09-29 Amgen Inc C-terminal antibody variants
US20210079079A1 (en) * 2018-05-02 2021-03-18 Ortheus, Inc. Systems and methods for local modulation of wnt signaling
US11407828B2 (en) 2019-02-01 2022-08-09 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-CLauDiN 18 antibodies and methods of use thereof
CN112121147B (zh) * 2019-06-24 2023-07-04 中国人民解放军海军特色医学中心 多肽在治疗或预防骨髓瘤药物中的应用、多肽、核酸、药物及重组表达载体
TR201920272A1 (tr) * 2019-12-15 2021-06-21 Uludamar Altay Dental i̇mplantlar, greft materyalleri̇ ve prf i̇le osseoi̇ntegrasyonun artirilmasi i̇çi̇n bi̇r terapöti̇k kompozi̇syon ve bunun lokal kullanim yöntemleri̇
WO2023143444A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗dkk1抗体、其药物组合物及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006015373A2 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Amgen Inc Antibodies to dkk-1
TW200922621A (en) * 2007-10-12 2009-06-01 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies against sclerostin

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
CA2111348A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 John S. Logan Production of human hemoglobin in transgenic pigs
DE69224906T2 (de) 1991-07-08 1998-10-29 Univ Massachusetts Thermotropes flüssig-kristallines segment-blockcopolymer
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
DE69332981T2 (de) 1992-10-23 2004-05-19 Immunex Corp., Seattle Methoden zur herstellung löslicher, oligomerer proteine
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6344541B1 (en) 1998-09-25 2002-02-05 Amgen Inc. DKR polypeptides
US20040038860A1 (en) * 2002-05-17 2004-02-26 Allen Kristina M. Reagents and methods for modulating dkk-mediated interactions
DK2319301T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
AR060017A1 (es) * 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
WO2008097510A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Merck & Co., Inc. Antibodies specific for dkk-1
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010032059A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Targeted binding agents directed to cd105 and uses thereof
KR101471239B1 (ko) * 2009-05-12 2014-12-09 화이자 인코포레이티드 항-ｄｋｋ-1 항체의 차단 및 그의 용도
EP3838922A1 (en) * 2010-10-27 2021-06-23 Amgen Inc. Dkk1 antibodies and methods of use
US9133272B2 (en) * 2011-03-01 2015-09-15 Amgen Inc. Bispecific binding agents
WO2013019954A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 Amgen Inc. Method for treating bone gap defects
KR20190120401A (ko) * 2011-12-28 2019-10-23 암젠 인크 항스클레로스틴 항체의 이용을 통한 치조골 소실의 치료 방법
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006015373A2 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Amgen Inc Antibodies to dkk-1
TW200922621A (en) * 2007-10-12 2009-06-01 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies against sclerostin

Also Published As

Publication number Publication date
TW201305198A (zh) 2013-02-01
MX354481B (es) 2018-03-07
CA2815181A1 (en) 2012-05-03
EP3219725A3 (en) 2017-11-22
US10800839B2 (en) 2020-10-13
JP2013545734A (ja) 2013-12-26
MX2013004726A (es) 2013-08-29
US20180111985A1 (en) 2018-04-26
EP3838922A1 (en) 2021-06-23
AU2011319843C1 (en) 2017-02-02
US20210040189A1 (en) 2021-02-11
AU2018201333A1 (en) 2018-03-15
WO2012058393A3 (en) 2012-10-04
EP2632951A2 (en) 2013-09-04
ES2863626T3 (es) 2021-10-11
EP2632951B1 (en) 2017-08-02
CA3085710A1 (en) 2012-05-03
US9879072B2 (en) 2018-01-30
TWI636993B (zh) 2018-10-01
EP3219725B1 (en) 2020-12-16
US20130209475A1 (en) 2013-08-15
MX2021001494A (es) 2021-04-28
JP2017043619A (ja) 2017-03-02
AU2016203722A1 (en) 2016-06-23
AU2011319843B2 (en) 2016-03-10
WO2012058393A2 (en) 2012-05-03
AR118047A2 (es) 2021-09-15
TW201710291A (zh) 2017-03-16
JP6066912B2 (ja) 2017-01-25
JP6353500B2 (ja) 2018-07-04
AR083740A1 (es) 2013-03-20
AU2011319843A1 (en) 2013-05-09
EP3219725A2 (en) 2017-09-20
CA2815181C (en) 2020-09-15
AU2018201333B2 (en) 2020-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI636994B (zh) Ｄｋｋ１抗體及使用方法
JP4840939B2 (ja) Ｄｋｋ−１に対する抗体
JP5661474B2 (ja) Ｒｇｍａタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用
TW200918553A (en) Human GM-CSF antigen binding proteins
KR20150018533A (ko) 콜로니 자극 인자 1 수용체(csf1r)에 결속하는 항체들에 의한 질병 상태의 치료 방법
AU2014235430A1 (en) Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
EA021539B1 (ru) Антитело к склеростину и его применение
US9708375B2 (en) Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors