TWI634213B - 誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法、由此方法所獲得之誘發微藻細胞自解之活性物質以及誘發微藻細胞自解的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法，包括：將一芽胞桿菌(Bacillus)屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期(stationary phase)，至該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，其中該活性溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質。

Description

誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法、由此方法所獲得之誘發微藻細胞自解之活性物質以及誘發微藻細胞自解的方法
本發明係關於一種誘發微藻細胞自解之活性物質與其製造方法，以及此誘發微藻細胞自解之活性物質的應用。
為了解決目前全球因過度使用化石能源所造成溫室效應及石油利用成本提升的問題，將生質料源轉化為能源方式已被視為取代傳統化石燃料的途徑之一。而生質能源技術開發中，微藻生質柴油是其中受到矚目的研究方向。
不同於目前產業界主要將微藻應用於食品、保健、生醫等高價產品，將微藻應用於生質燃料產業雖然市場規模極大，但產品單價低，對於生產的成本與耗能更加著重。而，要將油脂從微藻細胞中取出作為生質燃料，必需先破壞微藻細胞，但，此程序往往是相當耗能，進而造成成本提高。
在過去的研究中發現，以傳統機械力破壞微藻細 胞壁需要消耗約微藻細胞所含總能量的30%，成為微藻生質燃料產業化的一大阻礙。而，化學破壁方法因為需使用化學藥劑，所以在生物細胞破壞的同時，也可能造成胞內產物的破壞，而不利於後續產物回收使用，再者化學破壁也需額外之攪拌動力進而使成本提高。
有鑑於傳統機械破壁技術處理微藻細胞這類高含 水生質物所消耗的能量太大，不符合生質燃料產業所需，與化學破壁易造成胞內產物破壞且仍需額外攪拌動力，因此目前亟需一種新穎之低能耗、低成本的微藻破壁技術，以期微藻生質能可邁向市場化。
本發明提供一種誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法，包括：將一芽胞桿菌(Bacillus)屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期(stationary phase)，至該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，其中該活性溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質。
本發明也提供一種誘發微藻細胞自解之活性物質，係由包括下列步驟的一方法所獲得：將一芽胞桿菌屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期，至該芽胞 桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態；以及在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，其中該活性溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質。
本發明還提供一種誘發微藻細胞自解的方法，包 括：將微藻細胞與前述之誘發微藻細胞自解之活性物質接觸，以誘發微藻細胞自解。
本發明更提供一種誘發微藻細胞自解的方法，包 括：將一芽胞桿菌屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液；將在該菌體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期；在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液取出；將取出之該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，其中該活性溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質；將該微藻細胞與含該活性溶液混合以形成一混合液；以及將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解並沉降。
第1圖顯示，蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)ITRI-G1(民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心)培養液之蒸餾液與殘留液的破胞活性；第2圖顯示，不同之本發明活性物質的處理時間對於微藻破 胞的影響；第3A圖顯示，不同之本發明活性物質的處理時間對於小球藻破胞的影響；第3B圖顯示，不同之本發明活性物質的處理時間對於微星藻破胞的影響；第3C圖顯示，不同之本發明活性物質的處理時間對於擬球藻破胞的影響；第4A圖顯示，冷凍對於本發明誘發微藻細胞自解之活性物質的影響；第4B圖顯示，加熱對於本發明經冷凍之誘發微藻細胞自解之活性物質的影響；第5圖顯示，回收之本發明活性物質對於促進微藻油脂萃取的功效；第6圖顯示，測試攪拌對於活性物質誘發微藻破胞之影響的結果；第7圖顯示，不同之細菌培養時間所獲得之培養液的蒸餾液的微藻破胞效功效；第8圖顯示，適用於獲得誘發微藻細胞自解之活性物質之減壓蒸餾的溫度及壓力範圍；第9圖顯示，本發明之活性物質溶液之高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)的結果；第10A圖顯示，藉由將上述高效能液相層析所獲得之具有破胞活性之的區段產物進行氣相層析於第5.9分鐘所獲得的樣本的質譜分析(mass spectrometry)；以及 第10B圖顯示，藉由將上述高效能液相層析所獲得之具有破胞活性之的區段產物進行氣相層析於第8.5分鐘所獲得的樣本的質譜分析(mass spectrometry)。
在本發明一實施例中，本發明提供一種誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法。而本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質，具有在微藻細胞內誘發一連串生化反應而使其自行裂解的功效。
於此所敘述之微藻細胞，可為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護。在一實施例中，上述微藻細胞的例子可包括，但不限於，小球藻(Chlorella sp.)、擬球藻(Nannochloropsis sp.)、扁藻(Tetraselmis sp.)、等鞭金藻(Isochrysis galbana)與杜氏藻(Dunaliella sp.)等。
本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法，可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將一芽胞桿菌(Bacillus)屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液。
上述芽胞桿菌屬之菌株的例子，可包括，蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)等，但不限於此。上述蘇雲金芽胞桿菌可為蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683，或民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)ITRI-G1。在一實施例中，於本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法中所使用的芽胞桿菌屬之菌 株，可為民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1。
又，上述培養液之成分並無特殊限制。在一實施 例中，培養液的成分可包括蛋白腖(peptone)與酵母菌萃取物(yeast extract)等，但不限於此。上述蛋白腖於培養液中之濃度可為約1-5g/L，又，上述酵母菌萃取物於培養液中之濃度可為約0.1-0.5g/L，但不限於此。在一特定實施例中，培養液的成分可包括2g/L蛋白腖與0.2g/L酵母菌萃取物。
接著，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬之菌株培 養至少至一生長穩定期，至芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清的狀態。在一實施例中，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬之菌株培養約2-3天，可使芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。在一特定實施例中，培養芽胞桿菌屬之菌株約2天，可使芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。
又，培養上述芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約20-40 ℃，但不限於此。在一實施例中，將上述芽胞桿菌屬之菌株培養於28℃。
然後，在芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成 聚集且菌體懸浮液變為澄清之後，將菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，而活性溶液中則含有一誘發微藻細胞自解之活性物質。
上述減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40-90℃，但 不限於此。在一實施例中可為約40℃、約50℃、約60℃、約75℃或約90℃。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃。又，上述減壓蒸餾程序的壓力為約65-550hPa，但不限於此。在一實施例中可為約80hPa、約110hPa、約210hPa、約295hPa或約490hPa。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的壓力可為約110hPa。
在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約 40-90℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約65-550hPa。在另一定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約65-95hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約105-155hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約60℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約175-245hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約75℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約245-345hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約90℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約430-550hPa。 且，在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約110hPa。
在一實施例中，上述本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法可更包括，將所獲得之活性溶液以高效能液相層析分離出誘發微藻細胞自解之活性物質的步驟。
在另一實施例中，上述本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法，可更包括，將所獲得之含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液加熱，以避免其中之誘發微藻 細胞自解之活性物質聚集而降低活性的步驟。活性溶液加熱的溫度可為約50-90℃，而在一實施例中為約60℃。又，活性溶液加熱的時間可為約2-10小時，而在一實施例中為約8小時。 在一實施例中，活性溶液加熱的溫度可為約60-80℃，而活性溶液加熱的時間可為約6-8小時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度可為約60、70或80℃，而活性溶液加熱的時間可為約8小時。
在另一實施例中，本發明也提供一種誘發微藻細 胞自解之活性物質。本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質可藉由任何上述本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法來獲得。
在又另一實施例中，本發明還提供一種誘發微藻 細胞自解的方法。於此所述本發明之誘發微藻細胞自解的方法，可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將微藻細胞與藉由任何上述本發明之誘發 微藻細胞自解之活性物質的製造方法所獲得的誘發微藻細胞自解之活性物質接觸，以誘發微藻細胞自解。
於此所述之微藻細胞為一單細胞藻類微生物，具 有細胞壁外殼保護，例如小球藻、擬球藻、扁藻、鞭金藻或杜氏藻等。在一實施例中，微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
將微藻細胞與本發明誘發微藻細胞自解之活性物 質接觸的步驟並無特別限制，僅須使微藻細胞與誘發微藻細胞自解之活性物質實際接觸即可，例如，可於含微藻細胞之溶液中直接添加誘發微藻細胞自解之活性物質本身，或將微藻細 胞與含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液混合。
而在一實施例中，將微藻細胞與上述本發明之誘 發微藻細胞自解之活性物質接觸的步驟，可包括，但不限於，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液混合以形成一混合液，之後將混合液靜置或將混合液持續攪拌後靜置，以使微藻細胞自解並沉降。又，微藻細胞可佔上述混合液的約4-50wt%，例如10wt%。
由於本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質，具 有誘發微藻細胞內一連串生化反應而使其自行裂解的功效，且細胞裂解係由細胞內的生化反應所導致，因此誘發微藻細胞自解的方法對細胞外的攪拌質傳需求低，可在低攪拌條件下或甚至不須攪拌下進行。
在一實施例中，將微藻細胞與上述本發明之誘發 微藻細胞自解之活性物質接觸的步驟，可包括，但不限於，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液混合以形成一混合液，之後將混合液靜置，以使微藻細胞自解並沉降。於此實施例中，可將混合物靜置約5-30小時，例如約8、12、24小時。又，混合物的靜置溫度並無特殊限制。在一實施例中，可將混合物靜置於室溫。又，混合物的靜置溫度並無特殊限制。在一實施例中，可將混合物靜置於室溫。
在一實施例中，上述本發明之誘發微藻細胞自解 的方法，還可更包括，在將微藻細胞與藉由任何上述本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法所獲得的誘發微藻細胞自解之活性物質接觸之前，先將含誘發微藻細胞自解之活 性物質的活性溶液混合進行加熱，以避免其中的誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。而將含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液加熱的溫度可為約50-90℃，例如，60℃，但不限於此。又，將含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液加熱的時間可為約2-10小時，例如，8小時，但不限於此。 在一實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60-80℃，而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60、70或80℃，而加熱的時間為約8小時。
在另一實施例中，上述本發明之誘發微藻細胞自 解的方法，可更包括，在微藻細胞自解並沉降之後，回收上述混合液的一上清液，以回收於上清液中的誘發微藻細胞自解之活性物質。
於此實施例中，還可更包括，將所回收之上清液 進行加熱，以避免其中之誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性的步驟。而將含將所回收之上清液加熱的溫度可為約50-90℃，例如，60℃，但不限於此。又，將所回收之上清液加熱的時間可為約2-10小時，例如，8小時，但不限於此。在一實施例中，將所回收之上清液加熱的溫度為約60-80℃，而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，將所回收之上清液加熱的溫度為約60、70或80℃，而加熱的時間為約8小時。
在又另一實施例中，本發明更提供另一種誘發微 藻細胞自解的方法。於此所述本發明之誘發微藻細胞自解的方法，可包括，但不限於下方所述之步驟。
首先，將一芽胞桿菌屬之菌株接種進一培養液中 以獲得一菌體懸浮液。
適用於此所述之本發明誘發微藻細胞自解的方法 中使用的芽胞桿菌屬之菌株，可包括，但不限於，蘇雲金芽胞桿菌。上述蘇雲金芽胞桿菌的例子可包括，蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683與民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1等，但不限於此。在一實施例中，於本發明之誘發微藻細胞自解之活性物質的製造方法中所使用的芽胞桿菌屬之菌株，可為民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1。
而，適合在於此所述之本發明誘發微藻細胞自解 的方法中使用之培養液並無特殊限制。在一實施例中，於此所述之本發明誘發微藻細胞自解的方法中所使用的培養液為適合芽胞桿菌屬之菌株生長的培養液。在另一實施例中，培養液的成分可包括蛋白腖與酵母菌萃取物等，但不限於此。上述蛋白腖於培養液中之濃度可為約1-5g/L，又，上述酵母菌萃取物於培養液中之濃度可為約0.1-0.5g/L，但不限於此。在一特定實施例中，培養液的成分可包括2g/L蛋白腖與0.2g/L酵母菌萃取物。
然後，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬之菌株培 養至少至一生長穩定期，至芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清的狀態。在一實施例中，將在菌體懸浮液中的芽胞桿菌屬之菌株培養約2-3天，可使芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄 清。在一特定實施例中，培養芽胞桿菌屬之菌株約2天，可使芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成聚集且菌體懸浮液變為澄清。又，培養芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約20-40℃，例如約28℃，但不限於此。
再來，在芽胞桿菌屬之菌株於菌體懸浮液中形成 聚集且菌體懸浮液變為澄清之後，將菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性溶液，而活性溶液中則含有一誘發微藻細胞自解之活性物質。
適合獲得上述活性溶液之減壓蒸餾程序所採用的 蒸餾溫度與壓力，如下所述。減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40-90℃，例如約40℃、約50℃、約60℃、約75℃、約90℃等，但不限於此，在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃。又，上述減壓蒸餾程序的壓力為可約65-550hPa，例如在一實施例中可為約80hPa、約110hPa、約210hPa、約295hPa或約550hPa。在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的壓力可為約110hPa。
在一實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約 40-90℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約65-550hPa。在另一定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約40℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約65-95hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約105-155hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約60℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約175-245hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約75℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約245-345hPa，或減壓蒸餾程序的蒸餾溫 度可為約90℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約430-550hPa。且，在一特定實施例中，減壓蒸餾程序的蒸餾溫度可為約50℃，而減壓蒸餾程序的壓力為可約110hPa。
接著，將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液混合以形成一混合液。微藻細胞可佔上述混合液的約4-50wt%，例如10wt%。於此所述之微藻細胞為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護，例如小球藻、擬球藻、扁藻、等鞭金藻、杜氏藻等。在一實施例中，微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
最後，將混合液靜置，以使微藻細胞自解並沉降。可將上述混合液靜置約5-30小時，例如約8、12與24小時。在一實施例中，將上述混合液靜置約8-24小時。在一特定實施例中，則將上述混合液靜置約8、12或24小時。
又，在一實施例中，於此所述之本發明誘發微藻細胞自解的方法，可更包括，在將微藻細胞與前述活性溶液混合之前，將所獲得之活性溶液以高效能液相層析分離出誘發微藻細胞自解之活性物質的步驟。
另外，在一實施例中，於此所述之本發明之誘發微藻細胞自解的方法，可更包括，在將微藻細胞與前述活性溶液混合之前，先將前述活性溶液混合進行加熱，以避免其中之誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
而將含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液加熱的溫度可為約50-90℃，例如，60℃，但不限於此。又，將含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液加熱的時間可 為約2-10小時，例如，8小時，但不限於此。在一實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60-80℃，而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，活性溶液加熱的溫度為約60、70或80℃，而加熱的時間為約8小時。
此外，在另一實施例中，於此所述之本發明之誘 發微藻細胞自解的方法，也可更包括，在微藻細胞自解並沉降之後，回收上述混合液的一上清液，以回收於上清液中的誘發微藻細胞自解之活性物質。
而於此實施例中，還可更包括，將所回收之上清 液進行加熱，以避免其中之誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性的步驟。而將含將所回收之上清液加熱的溫度可為約50-90℃，例如，60℃，但不限於此。又，將所回收之上清液加熱的時間可為約2-10小時，例如，8小時，但不限於此。 在一實施例中，將所回收之上清液加熱的溫度為約60-80℃，而加熱的時間為約6-8小時。在一特定實施例中，將所回收之上清液加熱的溫度為約60、70或80℃，而加熱的時間為約8小時。
藉由本發明之誘發微藻細胞自解的方法，可只需 將微藻細胞與含誘發微藻細胞自解之活性物質的活性溶液混合後靜置，而不須進行攪拌及/或其他處理，即可完成微藻細胞之破胞。
又，於微藻細胞破胞完成後，於本發明之誘發微 藻細胞自解的方法中所使用的誘發微藻細胞自解之活性物質，也能輕易地被回收並繼續使用。因此，由此可知，本發明 之誘發微藻細胞自解的方法具有操作容易、節省能源與降低成本等多重優點，為一種新穎之低耗能、低成本、可回收之微藻細胞破胞方法。
實施例
實施例1
誘發微藻細胞自解之活性物質之揮發性質的確認
1. 蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)ITRI-G1(民國103年10月22日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心)之培養液的處理
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液進行減壓蒸餾程序。在不同蒸餾時間收集殘留液(未揮發部分)，並於蒸餾2小時之時收集所有蒸餾液，減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時
2. 小球藻之破胞測試
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻 懸浮液。接著將上方所得之殘留液或蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。
然後，測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻因細胞壁破壞而釋出之蛋白質的量。結果如第1圖所示。
根據第1圖可明確得知，隨蒸餾時間增加，殘留液之破胞活性越來越低，至蒸餾2小時之時，殘留液幾乎完全沒有破胞活性。相對地，蒸餾液則顯示相當高的破胞活性。
故，由上述可知，蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1所產生的誘發微藻細胞自解之活性物質完全揮發且存在於蒸餾液中。
實施例2
藉由誘發微藻細胞自解之活性物質之小球藻的破胞測試
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
2. 小球藻的破胞
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得之蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。
然後，於不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻因細胞壁破壞而釋出之蛋白質的量。結果如第2圖所示，其中測試1與測試2為重複實驗。
根據第2圖可明確得知，上方所獲得之蒸餾液，的確可使微藻破胞自解。
實施例3
誘發微藻細胞自解之活性物質對於不同微藻之破胞功效
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1與蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683(購自食品工業研究所生物資源保存及研究中心)的培養
分別將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1與蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1或蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
2. 微藻的破胞
將新鮮之微藻調配為濃度為約150g/L的微藻懸浮液。接著將上方所得之蒸餾液添加至微藻懸浮液中(控制組為將水添加至微藻懸浮液中)，至微藻於懸浮液的濃度為約5g/L。之後將懸浮液靜置24小時。獲自蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1之培養液的蒸餾液所測試之微藻種類包括小球藻、微星藻以及擬球藻，而獲自蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683之培養液的蒸餾液所測試之微藻種類則包括小球藻以及微星藻。
然後，於不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估微藻因細胞壁破壞而釋出之蛋白質的量。存在於蒸餾液中之誘發微藻細胞自解之活性物質對於小球藻、微星藻以及擬球藻之破胞功效分別結果如第3A、3B與3C圖所示。
根據第3A、3B與3C圖可知，存在於蒸餾液中之誘發微藻細胞自解之活性物質對於小球藻、微星藻以及擬球藻皆具有破胞效果。
實施例4
誘發微藻細胞自解之活性物質在冷凍後與冷凍後加熱的功效評估
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
(3)誘發微藻細胞自解之活性物質之冷凍與冷凍後加熱
將上述蒸餾液(活性物質溶液)置於-20℃以不同時間長度進行冷凍，且之後將其取出於室溫解凍。
將冷凍達72小時之蒸餾液(活性物質溶液)，解凍後置於60℃、70℃或80℃高溫水浴8小時。
(4)小球藻的破胞
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻 懸浮液。接著將上方所得之經冷凍之蒸餾液或經冷凍後加熱之蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。
然後，於不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻因細胞壁破壞而釋出之蛋白質的量。經冷凍之蒸餾液或經冷凍後加熱之蒸餾液之破胞功效分別如第4A與4B圖所示。
根據第4A與4B圖可知，隨冷凍時間增加，蒸餾液破胞活性逐漸減少，至冷凍達72小時，蒸餾液幾乎不具破胞活性。相對地，當將經冷凍之蒸餾液再進行加熱，則蒸餾液的活性可恢復至約70%(相較於未經冷凍之蒸餾液的破胞活性(未顯示))。
故，根據上述可知，冷凍會使存在於蒸餾液中之誘發微藻細胞自解之活性物質失活，而相對地，加熱可恢復存在於蒸餾液中之誘發微藻細胞自解之活性物質的活性。
實施例5
藉由活性物質所誘發之微藻破胞的微藻內油脂萃取與回收之活性物質的功效測試
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2 天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
2. 小球藻的破胞
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得之蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。之後將懸浮液靜置24小時。
3. 小球藻內之油脂萃取
於懸浮液靜置24小時後，將懸浮液離心，獲得小球藻之藻體。之後對小球藻進行油脂萃取，並進行脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester,FAME)分析，以測定油脂含量。
4. 活性物質的回收
於懸浮液靜置24小時後，將懸浮液離心，取得上清液。然後將300mL之上清液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
5. 回收之活性物質的功效測試
依照前述微藻破破胞方法以回收步驟中所獲得之蒸餾溶液進行微藻破胞，且於微藻破胞後以前述相同方式分析微藻油脂含量並再次回收活性物質。將活性物質重複回收與使用，並測定微藻破胞後之油脂含量達四次。結果如第5圖所示。
根據第5圖可知，活性物質具有誘發微藻破胞並促進油脂萃取的功效，且，活性物質使用後可被回收並繼續用於使微藻破胞，但其活性會略有下降。
實施例6
攪拌對於活性物質誘發微藻破胞的影響
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
2. 小球藻的破胞
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得之蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。之後，將懸浮液靜置(不攪拌)，或將懸浮液以100rpm進行水平震盪。
然後，於不同時間點取出部分懸浮液以測定懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻因細胞壁破壞而釋出之蛋白質的量。結果如第6圖所示。
根據第6圖可明確得知，無攪拌條件下可在12-16小時完成破胞。又，相較於攪拌處理，無攪拌條件下活性物質之微藻破胞效率較佳，不論是起始的破胞速率或最後的破胞率，無攪拌條件下活性物質之微藻破胞效率都較100rpm攪拌條件下高出近100%。
實施例7
不同之細菌培養時間所獲得之培養液的蒸餾液的微藻破胞效功效測試
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)不同培養時間之蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：(i)在150rpm之震盪速率下，以28℃培養1天；(ii)在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)減壓蒸餾
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，取300mL之培養液藉由一減壓蒸餾程序進行分離純化，並獲得100mL的蒸餾溶液。減壓蒸餾之條件如下所示：蒸餾溫度：50℃
壓力：110hPa
時間：2小時。
2. 小球藻的破胞
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著將上方所得之蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。之後將懸浮液靜置24小時。
3. 小球藻內之油脂萃取
於懸浮液靜置24小時後，將懸浮液離心，獲得小球藻之藻體。之後對小球藻進行油脂萃取，並進行脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester,FAME)分析，以測定油脂含量以此評估小球藻破胞情況。不同之細菌培養時間所獲得之活性物質的微藻破胞效果，如第7圖所示。
第7圖顯示，來自藉由培養蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1菌株1天至對數生長期末期所獲得之培養液的蒸餾液，並無明顯破胞能力，而來自藉由培養蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1菌株2天所獲得之培養液的蒸餾液則具有明顯的破胞能力。
因此，由上述可知，蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1菌株應於生長穩定期之後才會開始分泌誘發微藻細胞自解的活性 物質。
實施例8
以不同方式破胞之微藻的含水率
將未經破胞之小球藻懸浮液、經實施例1之方法破胞之小球藻懸浮液，以及經機械破胞(球磨15分鐘破胞)之小球藻懸浮液，分別以500rpm離心15分鐘，之後取濃縮藻泥測試其含水率。結果如表1所示。
表1顯示，以實施例1之方法破胞之微藻的含水率與未破胞的微藻的含水率相近，而經機械破胞的微藻的含水率較高。
而破胞後之微藻含水率越低，代表所使用的破胞方法使破胞後之微藻具有較佳之脫水性。微藻之脫水性佳，則代表容易回收破胞之微藻所釋放出之物質與用以破胞之活性物質。
因此，根據表1所示之結果可知，相較於機械破胞，以實施例2之方法破胞，可使破胞之微藻具有較佳的脫水性，且較易回收微藻所釋放出之物質與用以破胞之活性物質。
實施例9
適用於獲得誘發微藻細胞自解之活性物質之減壓蒸餾的溫度及壓力範圍測定
1. 誘發微藻細胞自解之活性物質的製備
(1)蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1的培養
將蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1以下方所示之培養液與培養條件進行培養
培養液：2g/L蛋白腖+0.2g/L酵母菌萃取物
培養條件：在150rpm之震盪速率下，以28℃培養2天
(2)誘發微藻細胞自解之活性物質的分離純化
於蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1培養完成後，將培養液在不同溫度下，以不同之壓力分別進行減壓蒸餾，並測得各溫度之水沸騰壓力。
2. 微藻的破胞與活性物質揮發界線壓力評估
將新鮮之小球藻調配為濃度為約150g/L的小球藻懸浮液。接著分別將上方所述以不同溫度不同之壓力之減壓蒸餾所獲得之不同蒸餾液添加至小球藻懸浮液中，至小球藻於懸浮液的濃度為約10g/L。然後將懸浮液靜置8小時。
然後，測定以各不同蒸餾液處理之懸浮液的280nm吸光值，以評估小球藻之細胞壁是否被破壞，並進而得知活性物質在各溫度下的最大揮發壓力(蒸餾壓力界線)。結果如表2與第8圖所示。
根據第8圖可知，適用於獲得誘發微藻細胞自解之活性物質之減壓蒸餾的溫度及壓力範圍係由在活性物質最大發揮壓力與水沸騰壓力之間的灰色區域所表示。
實施例10
活性物質溶液之高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)
(1)高效能液相層析
將實施例1之方法中所獲得之蒸餾液進行一高效能液相層析，而高效能液相層析之條件如下所示：高效能液相層析之條件
(a)管柱(column)：Jupiter® 5m C4 column(100 x 4.6mm),Phenomenex；(b)偵測波長(detection wave length)：214nm；(c)溶劑
溶劑A：0.1% TFA
溶劑B：0.1% TFA+10% CH3CN
溶劑C：0.1% TFA+90% CH3CN
(d)流速：1ml/分鐘
(e)高效能液相層析梯度程序(gradient program)：如下方表3所示。
之後，收集由高效能液相層析所獲得之各區段(不 同時間點)之產物。又，活性物質溶液之高效能液相層析之結果如第9圖所示。
(2)確認活性物質所存在之活性溶液高效能液相層析的產物區段
上方所述各區段之產物添加至小球藻懸浮液中(添加濃度約10wt%)並靜置8小時。
然後，測定以各區段之產物處理之懸浮液的280nm吸光值，以觀察小球藻之細胞壁是否被破壞並確認活性物質所謂於之區段。結果顯示，活性物質分布在11.5-13分鐘之間的區段產物中(第9圖中之黑色方框區域)。
實施例11
活性物質之氣相層析質譜分析(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)
將藉由高效能液相層析所獲得之具有破胞活性之在11.5-13分鐘之間的區段產物(第9圖中之黑色方框區域)以60℃加熱，並進行固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)(DVB/CAR/PDMS纖維(fibers)為獲自Supelco(Bellefonte,PA,USA))。
之後，固相微萃取之產物進行氣相層析質譜分 析。氣相層析質譜分析的條件如下所示：氣相層析質譜分析的條件：Agilent 6890氣相層析儀
極性鍵合相(polar bonded phase)BPX-5融合(fused)矽毛細管(silica capillary column)，長25m，內徑0.22mm，薄膜厚度0.25μm(SGE,Melbourne,Australia)。
電子撞擊界面化(EI interfaced)至Agilent 5973四極柱式質譜儀(quadrupole mass spectrometer)。
NIST 11質譜資料庫(spectra library)
將管柱的溫度程式化為以15℃/分鐘，從50℃(維持1分鐘)至250℃(維持5分鐘)。
將氦氣以0.6ml/分鐘之固定流速使用為載體氣體。
不分流進樣器(splitless injector)的溫度為270℃。
傳輸管線(transfer line)的溫度為250℃。
離子源(ion source)與四極柱(quadrupole)的溫度維持於230℃與150℃。
離子化(ionization)以70eV之撞擊電子(impacting electron)的動能來發生。藉由在m/z在10-600之質量範圍進行自動掃描(automatic scanning)以獲得質譜圖(Mass spectra)。
將前方所述由高效能液相層析所獲得之具有破胞活性之的區段產物，進行氣相層析質譜分析，並於第5.9分鐘與8.5分鐘各獲得一個可能與破胞活性有關的物質。接著，將前述分別於第5.9分鐘與8.5分鐘所獲得之可能與破胞活性有關的物質進行質譜分析，其質譜分析結果分別如第10A圖與第 10B圖所示。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心
民國103年10月22日
BCRC 910651

Claims (46)

  1. 一種誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，包括：將一芽胞桿菌(Bacillus)屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液，其中該芽胞桿菌屬之菌株為蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)，且其中該蘇雲金芽胞桿菌為蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683或寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1；將在該菌體懸浮液中的該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期，至該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態，其中培養該芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約20-40℃；以及在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得該活性物質溶液，其中該活性物質溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質，又其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約40℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約65-95hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約50℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約105-155hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約60℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約175-245hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約75℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約245-345hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約90℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約430-550hPa。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活 性物質溶液的製造方法，其中該培養液的成分包括蛋白腖(peptone)與酵母菌萃取物(yeast extract)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，其中培養在該菌體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬之菌株約2-3天以至少至一生長穩定期。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，其中培養該芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約28℃。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約50℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約110hPa。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，更包括，將該活性物質溶液以高效能液相層析分離出該誘發微藻細胞自解之活性物質。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，更包括，將該活性物質溶液加熱，以避免其中之該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，該活性溶液加熱的溫度為約50-90℃。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，該活性溶液加熱的溫度為約60、70或80℃。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，該活性溶液加熱的時間為約2-10小 時。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液的製造方法，該活性溶液加熱的時間為約8小時。
  12. 一種誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，係由包括下列步驟的一方法所獲得：將一芽胞桿菌屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液，其中該芽胞桿菌屬之菌株為蘇雲金芽胞桿菌，且其中該蘇雲金芽胞桿菌為蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683或寄存編號為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1；將在該菌體懸浮液中的該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期，至該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清的狀態，其中培養該芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約20-40℃；以及在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得該活性物質溶液，其中該活性物質溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質，又其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約40℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約65-95hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約50℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約105-155hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約60℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約175-245hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約75℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約245-345hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約90℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約430-550hPa。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，其中該培養液的成分包括蛋白腖與酵母菌萃取物。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，其中培養在該菌體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬之菌株約2-3天以達生長穩定期之後。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約50℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約110hPa。
  16. 如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，其中該方法更包括，將該活性物質溶液以高效能液相層析分離出該誘發微藻細胞自解之活性物質。
  17. 如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，其中該方法更包括，將該活性物質溶液加熱，以避免其中之該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液，該活性溶液加熱的溫度為約50-90℃，而加熱的時間為約2-10小時。
  19. 一種誘發微藻細胞自解的方法，包括：將微藻細胞與如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液接觸，以誘發微藻細胞自解。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將微藻細胞與如申請專利範圍第12項所述之誘發微 藻細胞自解之活性物質溶液接觸的步驟包括：將該微藻細胞與含該誘發微藻細胞自解之活性物質的該活性物質溶液混合以形成一混合液；以及將該混合液靜置或將該混合液持續攪拌後靜置，以使該微藻細胞自解並沉降。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞佔該混合液的約4-50wt%。
  22. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將微藻細胞與如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液接觸的步驟包括：將該微藻細胞與含該誘發微藻細胞自解之活性物質的活性物質溶液混合以形成一混合液；以及將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解並沉降。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置約5-30小時。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置於室溫。
  25. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，在將微藻細胞與如申請專利範圍第12項所述之誘發微藻細胞自解之活性物質溶液接觸之前，先將含該誘發微藻細胞自解之活性物質的該活性物質溶液混合進行加熱，以避免其中的該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之誘發微藻細胞自解的方法，將含該誘發微藻細胞自解之活性物質的該活性物質溶液 加熱的溫度為約50-90℃，而加熱的時間為約2-10小時。
  27. 如申請專利範圍第20項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，在該微藻細胞沉降之後，回收該混合液的一上清液，以回收於該上清液中的該誘發微藻細胞自解之活性物質。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，將該上清液進行加熱，以避免其中之該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  29. 如申請專利範圍第28項所述之誘發微藻細胞自解的方法，該上清液加熱的溫度為約50-90℃，而加熱的時間為約2-10小時。
  30. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中微藻細胞為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護。
  31. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
  32. 如申請專利範圍第19項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞包括小球藻(Chlorella sp.)、擬球藻(Nannochloropsis sp.)、扁藻(Tetraselmis sp.)、等鞭金藻(Isochrysis galbana)或杜氏藻(Dunaliella sp.)。
  33. 一種誘發微藻細胞自解的方法，包括：將一芽胞桿菌屬之菌株接種進一培養液中以獲得一菌體懸浮液，其中該芽胞桿菌屬之菌株為蘇雲金芽胞桿菌，且其中該蘇雲金芽胞桿菌為蘇雲金芽胞桿菌BCRC 14683或寄存編號 為BCRC 910651的蘇雲金芽胞桿菌ITRI-G1；將在該菌體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬之菌株培養至少至一生長穩定期之後，其中培養該芽胞桿菌屬之菌株的溫度為約20-40℃；在該芽胞桿菌屬之菌株於該菌體懸浮液中形成聚集且該菌體懸浮液變為澄清之後，將該菌體懸浮液取出；將取出之該菌體懸浮液進行一減壓蒸餾程序，以獲得一活性物質溶液，其中該活性物質溶液中含有一誘發微藻細胞自解之活性物質，又其中該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約40℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約65-95hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約50℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約105-155hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約60℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約175-245hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約75℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約245-345hPa，或該減壓蒸餾程序的蒸餾溫度為約90℃，而該減壓蒸餾程序的壓力為約430-550hPa；將該微藻細胞與該活性物質溶液混合以形成一混合液；以及將該混合液靜置，以使該微藻細胞自解並沉降。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該培養液的成分包括蛋白腖與酵母菌萃取物。
  35. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中培養在該菌體懸浮液中的該菌該芽胞桿菌屬之菌株約2-3天以達該生長穩定期之後。
  36. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞佔該混合液的約4-50wt%。
  37. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置約5-30小時。
  38. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中將該混合液靜置於室溫。
  39. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，在將該微藻細胞與該活性物質溶液混合之前，先將該活性物質溶液混合進行加熱，以避免其中之該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之誘發微藻細胞自解的方法，該活性溶液加熱的溫度為約50-90℃，加熱的時間為約2-10小時。
  41. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，在該微藻細胞沉降之後，回收該混合液的一上清液，以回收於該上清液中的該誘發微藻細胞自解之活性物質。
  42. 如申請專利範圍第41項所述之誘發微藻細胞自解的方法，更包括，將該上清液進行加熱，以避免其中之該誘發微藻細胞自解之活性物質聚集而降低活性。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之誘發微藻細胞自解的方法，該上清液加熱的溫度為約50-90℃，加熱的時間為約2-10小時。
  44. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的 方法，其中微藻細胞為一單細胞藻類微生物，具有細胞壁外殼保護。
  45. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞為新鮮存活狀態的微藻細胞。
  46. 如申請專利範圍第33項所述之誘發微藻細胞自解的方法，其中該微藻細胞包括小球藻、擬球藻、扁藻、等鞭金藻或杜氏藻。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI630270B (zh) * 2016-12-15 2018-07-21 財團法人工業技術研究院 新穎之蘇雲金芽孢桿菌突變株與其應用
US10927339B2 (en) 2017-03-17 2021-02-23 Industrial Technology Research Institute Mutant of Bacillus thuringiensis and application thereof
CN108624521B (zh) * 2017-03-17 2022-01-28 财团法人工业技术研究院 新的苏云金芽孢杆菌突变株及其应用
CN114672419A (zh) * 2022-03-14 2022-06-28 陕西科技大学 一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK287315B6 (sk) * 2006-06-02 2010-06-07 Biotika, A. S. Spôsob izolácie polymyxínu B z vyfermentovanej pôdy
US8404004B2 (en) 2006-12-29 2013-03-26 Genifuel Corporation Process of producing oil from algae using biological rupturing
FR2933848B1 (fr) 2008-07-18 2019-08-09 Roquette Freres Composition de fibres indigestibles solubles et d'organismes eucaryotes dotes d'une paroi polysaccharidique utilisees dans le domaine du bien etre
EP2370554B1 (en) 2008-11-28 2019-05-15 Corbion Biotech, Inc. Manufacturing of tailored oils in recombinant heterotrophic microorganisms
US8450111B2 (en) 2010-03-02 2013-05-28 Streamline Automation, Llc Lipid extraction from microalgae using a single ionic liquid
TWI457440B (zh) * 2010-06-04 2014-10-21 Taiam Pan Algasis Inc Method of broken the cell wall of microalgae
CN102286381A (zh) 2010-06-18 2011-12-21 中美生物资源股份有限公司 微藻类细胞壁破壁的方法
US8288150B2 (en) 2010-07-09 2012-10-16 Analytica Bioenergy, Inc. Method for breaking the cell walls of microalgae
US20130344576A1 (en) 2010-12-31 2013-12-26 Direvo Industrial Biotechnology Gmbh Extraction of scenedesmus cell components
US20130040340A1 (en) 2011-02-07 2013-02-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of alcohol esters in situ using alcohols and fatty acids produced by microorganisms
CN103045709B (zh) 2011-10-14 2014-12-17 中国科学院烟台海岸带研究所 利用植物激素和铁离子诱导小球藻合成虾青素的方法
CN103173273B (zh) 2011-12-21 2015-11-25 新奥科技发展有限公司 微藻油脂提取方法
DE102012001284A1 (de) 2012-01-25 2013-07-25 L'Air Liquide, Société Anonyme pour l'Etude et l'Exploitation des Procédés Georges Claude Verfahren zum Zellaufschluss von Mikroalgen
WO2014120989A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Carnegie Mellon University Methods, devices and systems for algae lysis and content extraction
CN103555582B (zh) * 2013-10-22 2015-06-10 渤海大学 一种用复合酶破壁小球藻的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
劉露等人，一株泡葉藻降解菌的篩選及其發酵條件優化，山東農業大學學報(自然科學版),2014,45(4):515-521. *
黃晶晶等人，溶藻細菌MS7 的分類鑒定及其溶藻活性的初步研究，海洋與湖沼，第44卷第3期2013年05月 *
黃晶晶等人，溶藻細菌MS7 的分類鑒定及其溶藻活性的初步研究，海洋與湖沼，第44卷第3期2013年05月。

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