TWI626248B - 血紅素及肌紅素之分離方法 - Google Patents

Abstract

一種血紅素及肌紅素之分離方法，包含：提供包含有血紅素及肌紅素的樣品及填充有螯合瓊脂糖凝膠之管柱；進行前處理步驟，以將樣品與具預定酸鹼度及預定濃度的緩衝溶液混合在一起而得前處理溶液；進行鍵結步驟，以將前處理溶液流過管柱，使得前處理溶液中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；進行清洗步驟，將緩衝溶液流過管柱以將前處理溶液中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的肌紅素從管柱中沖洗出來而得肌紅素溶液；及進行沖提步驟，藉由沖提鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從管柱中分離出來。

Description

血紅素及肌紅素之分離方法

本發明係有關於一種分離方法，特別是一種血紅素及肌紅素之分離方法。

血紅素(hemoglobin，又稱血紅蛋白)具有四個球蛋白次單元(globular protein subunit)，每一球蛋白次單元包含有一個血基質(heme)分子，且每一血基質分子具有一個二價鐵離子(Fe ²⁺)。

血紅素在大部分脊椎動物之血管系統與組織之間的氣體交換中起重要作用。其負責將氧經由血液循環自呼吸系統攜帶至身體細胞中且亦攜帶代謝廢物及二氧化碳離開身體細胞至呼吸系統中。由於血紅素具有此氧輸送特性，所以若可在活體外穩定且能使用於活體內，則血紅素可使用為有力的供氧器。

肌紅素(Myoglobin，又稱肌紅蛋白)是由153個胺基酸環繞中央的血基質組成的單鏈蛋白質，為負責肌肉細胞內氧氣輸送與儲存的功能性蛋白質。肌紅素對氧氣的親和力大於血紅素，所以在肌肉組織中有儲存氧氣的功能。

現有純化分離血紅素或肌紅素的製程繁雜、成本高昂且純度不高。因此，本發明所屬技術領域中具有通常知識者持續致力研究如何以較簡便且快速的方式來分離並純化血紅素及肌紅素，或從組織萃取液或樣本中去除血紅素及肌紅素。

有鑑於上述習知技藝的問題，本發明的目的就是在提供一種血紅素及肌紅素之分離方法，以簡便且快速地從樣品中分離並純化出血紅素及肌紅素。

本發明的血紅素及肌紅素之分離方法，至少包含： 提供一樣品，樣品包含有血紅素及肌紅素；提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow)之一管柱；進行一前處理步驟，以將樣品與具一預定酸鹼度及一預定濃度的一緩衝溶液混合在一起而得一前處理溶液；進行一鍵結步驟，以將前處理溶液流過管柱，使得前處理溶液中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；進行一清洗步驟，藉由將一緩衝溶液流過管柱，以將前處理溶液中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的肌紅素從管柱中沖洗出來而得一肌紅素溶液；以及進行一沖提步驟，藉由沖提一鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從管柱中分離出來。

前述的螯合瓊脂糖凝膠包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)，且交聯瓊脂糖珠之濃度係為6%。

前述的緩衝溶液為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液，預定酸鹼度係介於pH 6.3至6.5之範圍，預定濃度係介於5 mM至50 mM之範圍。

其中，於清洗步驟之後更進行一檢測步驟，以檢測前處理溶液中全部的血紅素是否與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，若是則進行沖提步驟。

前述的檢測步驟包含：對從管柱流出的肌紅素溶液進行一電泳量測步驟而得一電泳圖譜。

其中，若是電泳圖譜僅具有肌紅素標記，則表示前處理溶液中全部的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；而若是電泳圖譜同時具有血紅素標記及肌紅素標記，則表示前處理溶液中的血紅素非全部與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起。

其中，從管柱中分離出來之血紅素係溶解於鹼性溶液中，且於沖提步驟後更進行一中和步驟，藉由一酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之一中性溶液。

前述的鹼性溶液為氫氧化鈉，酸性溶液為檸檬酸(citric acid)，且氫氧化鈉之濃度為50 mM，檸檬酸之濃度為50 mM。

本發明之血紅素及肌紅素之分離方法更包含對中性溶液進行一濃縮步驟，以提高中性溶液中血紅素的濃度。

本發明之血紅素及肌紅素之分離方法更包含對從管柱中沖洗出來的肌紅素溶液進行一濃縮步驟，以提高肌紅素溶液中肌紅素的濃度。

承上所述，本發明的血紅素及肌紅素之分離方法可具有一或多個下述優點：

(1) 本發明的血紅素及肌紅素之分離方法，先藉由前處理步驟來調控前處理溶液的酸鹼度及濃度，再藉由填充於管柱中的螯合瓊脂糖凝膠來與血紅素(配位)鍵結在一起，可達到分離樣品中的血紅素與肌紅素之目的，並取得包含有肌紅素的肌紅素溶液。並且，藉由沖提鹼性溶液來降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力，使血紅素從管柱中分離出來，以取得血紅素。

(2) 本發明的血紅素及肌紅素之分離方法，藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，以得到包含有血紅素的中性溶液，再進行濃縮步驟，而能夠獲得高濃度之血紅素。此外，也可以對肌紅素溶液進行濃縮步驟，藉以獲得高濃度之肌紅素。

(3) 本發明的血紅素及肌紅素之分離方法，藉由檢測步驟來檢測前處理溶液中全部的血紅素是否與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，可達到確實分離並純化血紅素及肌紅素之目的。若是所得之電泳圖譜中僅具有肌紅素標記，則表示前處理溶液中全部的血紅素已與管柱中的螯合瓊脂糖凝膠(配位)鍵結在一起(即肌紅素溶液中不具有血紅素)，已確實分離血紅素及肌紅素。而若是所得之電泳圖譜同時具有血紅素標記及肌紅素標記，則表示部分的血紅素未與管柱中的螯合瓊脂糖凝膠(配位)鍵結在一起(可能是因為螯合瓊脂糖凝膠抓取血紅素的鍵結力已達飽和，使得肌紅素溶液中包含有血紅素)，因此可以將包含有血紅素的肌紅素溶液流過填充有鍵結力未達飽和的螯合瓊脂糖凝膠之管柱，以繼續分離血紅素及肌紅素，直到所得之電泳圖譜僅具有肌紅素標記，達到確實分離血紅素及肌紅素之目的。

(4) 本發明的血紅素及肌紅素之分離方法，藉由使用具預定酸鹼度及濃度的緩衝溶液、螯合瓊脂糖凝膠、鹼性溶液及酸性溶液，能夠簡便且快速的達到分離血紅素及肌紅素之目的，並可應用於實驗材料製備或臨床試驗。

茲為使鈞審對本發明的技術特徵及所能達到的技術功效有更進一步的瞭解與認識，謹佐以較佳的實施例及配合詳細的說明如後。

為利 貴審查員瞭解本創作之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本創作配合圖式，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本創作實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本創作於實際實施上的權利範圍。此外，為使便於理解，下述實施例中的相同元件係以相同的符號標示來說明。

請參閱圖1，圖1為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第一實施例之流程示意圖。如圖1所示，本發明的血紅素及肌紅素之分離方法至少包含下列步驟S10、S20、S30、S40、S50及S60。在步驟S10中，提供樣品，樣品包含有血紅素及肌紅素。樣品可例如為待分離純化的材料樣品或是人體或動物體的糞便樣品，但不限定於此。任何含有血紅素及肌紅素之樣品皆可藉由本發明之方法來進行分離純化。在步驟S20中，提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow)之管柱。在步驟S30中，進行前處理步驟，以將樣品與具預定酸鹼度及預定濃度的緩衝溶液混合在一起而得前處理溶液。前述的緩衝溶液可例如為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液，例如Na-PO ₄(PBS緩衝溶液)，但不限定於此。任何可用以分離血紅素及肌紅素的溶液皆為本發明所請求保護之緩衝溶液。前述的預定酸鹼度可例如介於pH 6.3至6.5之範圍，預定濃度可例如介於5 mM至50 mM之範圍。較佳地，預定酸鹼度為pH 6.4，預定濃度為10 mM。在步驟S40中，進行鍵結步驟，以將前處理溶液流過管柱，使得前處理溶液中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起。在步驟S50中，進行清洗步驟，藉由將緩衝溶液流過管柱，以將前處理溶液中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的肌紅素從管柱中沖洗出來而得肌紅素溶液。在步驟S60中，進行沖提步驟，藉由沖提鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從管柱中分離出來。

在本發明之分離方法中，所選用的螯合瓊脂糖凝膠係購自GE Healthcare Life Sciences。螯合瓊脂糖凝膠為一種生物處理程序(BioProcess)固定化金屬親和性層析法(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)介質(medium)，用於純化對金屬離子具有親和力的蛋白質。因此，當蛋白質樣品中包含有金屬離子時(例如血液樣品中包含有二價鐵離子)，在蛋白質樣品流過填充有螯合瓊脂糖凝膠的管柱時，螯合瓊脂糖凝膠會抓住蛋白質，藉以將蛋白質從樣品中分離出來。較佳地，螯合瓊脂糖凝膠不帶有電荷(即電中性)且不包含有金屬離子，因此可以抓取更多的蛋白質，提高蛋白質的純化效率。

然而，由於樣品中的血紅素及肌紅素皆會被螯合瓊脂糖凝膠所抓取(鍵結或配位)，因此若是將包含有血紅素及肌紅素的樣品直接流過管柱，則無法達到分離肌紅素及血紅素之目的。因此，在本發明中，藉由進行前處理步驟S30來使得包含有血紅素及肌紅素的樣品與具預定酸鹼度及預定濃度的緩衝溶液混合在一起而得前處理溶液。經前處理步驟S30後，再將前處理溶液流過填充有螯合瓊脂糖凝膠的管柱，前處理溶液中僅有血紅素可以特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠(步驟S40)，而肌紅素則不能與螯合瓊脂糖凝膠特異性鍵結。因此，在進行清洗步驟S50時，肌紅素會連同緩衝溶液而一起從管柱中被沖洗出來而得肌紅素溶液。最後，再進行沖提步驟S60以藉由沖提鹼性溶液來降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從管柱中分離出來。

於實務上，步驟S30及S50中所選用的緩衝溶液可例如為相同的緩衝溶液。緩衝溶液可例如為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液。步驟S30及S50中所使用的緩衝溶液不限定於前述舉例的緩衝溶液，使用者也可視實際需求選用適當的緩衝溶液。

請參閱圖2，圖2為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第二實施例之流程示意圖。如圖2所示，本發明的血紅素之純化方法至少包含下列步驟S10、S20、S30、S40、S50、S60、S70、S80及S90。本發明的第二實施例及第一實施例之差異處僅在於，第二實施例之方法中更包含進行中和步驟S70，藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之中性溶液。此外，如圖2所示，在本發明之第二實施例中，在進行中和步驟S70之後，更可以對中性溶液進行濃縮步驟S80，以提高中性溶液中血紅素的濃度。並且，在進行沖提步驟S60之後，更可以對從管柱中沖洗出來的肌紅素溶液進行濃縮步驟S90，以提高肌紅素溶液中肌紅素的濃度。

前述的鹼性溶液可例如為氫氧化鈉，而酸性溶液可例如為檸檬酸(citric acid)。鹼性溶液並不限定於氫氧化鈉，任何可用以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠螯合能力來沖提出管柱中的血紅素的鹼性溶液皆為本發明所請求保護之鹼性溶液。在進行沖提步驟S60中，使用鹼性溶液來沖提管柱而使管柱中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的螯合能力降低而令血紅素從管柱中分離出來，舉例來說，可以是血紅素溶解於鹼性溶液中而使得血紅素能夠隨著鹼性溶液的沖提過程而從管柱中分離出來。而酸性溶液也不限定於檸檬酸，任何可用以調節鹼性溶液之酸鹼度之酸性溶液皆為本發明所請求保護之酸性溶液。

前述的鹼性溶液的使用量可例如為1個管柱體積(column volume)，使用者可經由管柱的尺寸而得知管柱的管柱體積，藉以獲知鹼性溶液的使用量。較佳地，前述氫氧化鈉之濃度可例如為50 mM，而檸檬酸之濃度可例如為50 mM，但不限定於此。

在步驟S80及/或S90中，可選用例如冷凍乾燥、超濾(Ultrafiltration)或透析膜等方式來進行濃縮步驟。在進行濃縮步驟S80及/或S90時，並不限定於前述的方式，任何可用以提高血紅素及/或肌紅素濃度的方法皆為本發明所請求保護之濃縮步驟。

請接續參閱圖3，圖3為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第三實施例之流程示意圖。如圖3所示，本發明的血紅素之純化方法至少包含下列步驟S10、S20、S30、S40、S50、S60及S100。本發明的第三實施例及第一實施例之差異處僅在於，第三實施例之方法中更包含進行檢測步驟S100，以檢測前處理溶液中全部的血紅素是否已與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起。在本發明之第三實施例中，也可以包含有前述的步驟S70及S80及/或S90(未繪示)。使用者經參閱第二實施例後，應可理解如何於第二實施例中進行步驟S70、S80及S90，故在此不多贅述。

在本發明之第三實施例中，步驟S100包含：對從管柱流出的肌紅素溶液進行電泳量測步驟而得電泳圖譜。使用者可藉由電泳裝置來進行電泳量測步驟，且電泳裝置可例如為一般常用的電泳裝置。藉由電泳裝置來進行電泳量測步驟，可得知從管柱中流出的溶液是否含有血紅素及/或肌紅素。由圖4可知，以血紅素標準品進行電泳量測可得約為14.2 kDa的血紅素標記，而以肌紅素標準品進行電泳量測可得約為16.1 kDa的肌紅素標記(M：分子量標準品，He：血紅素標準品，My：肌紅素標準品)。由於在電泳量測的過程中，肌紅素可能因斷裂而於約14.2 kDa處呈現較淡的標記。因此，若是同時具有明顯16.1 kDa的肌紅素標記以及14.2 kDa處的淡標記，仍可獲知此樣品包含有肌紅素。藉由觀看電泳圖譜即可推知試樣中是否含有血紅素及/或肌紅素。

若是電泳圖譜中僅具有肌紅素標記，則表示該前處理溶液中全部的血紅素已與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，可接續進行沖提步驟S60。而若是電泳圖譜中同時具有血紅素標記及肌紅素標記，則表示前處理溶液中的血紅素非全部與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起(即肌紅素溶液中包含血紅素，未確實分離血紅素及肌紅素)。使用者可以將包含有血紅素的肌紅素溶液再次流過填充有鍵結力未達飽和的螯合瓊脂糖凝膠的管柱(此管柱可以是全新的管柱，或者是已使用過但仍可抓取血紅素的管柱)，並將緩衝溶液流過第二管柱且進行電泳量測步驟直到所得之電泳圖譜中僅具有肌紅素標記，以接續進行沖提步驟。藉此，可達到確實分離血紅素及肌紅素之目的。

在本發明中，螯合瓊脂糖凝膠可例如包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)。其中，交聯瓊脂糖珠的濃度可例如為6% 交聯瓊脂糖(cross-linked agarose)。而管柱之長度可例如為20公分、內徑為1.6公分。螯合瓊脂糖凝膠的成分組合及管柱的尺寸並不限定於前述的物質及數值，任何可用以抓取血紅素的物質成分及管柱皆為本發明所請求保護之螯合瓊脂糖凝膠及管柱。

如前所述，可以藉由電泳裝置來檢測血紅素及/或肌紅素之存在，以得知本發明之血紅素及肌紅素之分離方法的效果。下列說明選用不同的酸鹼度及濃度條件的溶液或緩衝溶液，來作為混合肌紅素及血紅素使用以及作為沖洗管柱使用所得的電泳檢測結果。請參閱圖5至圖9，使用電泳裝置來檢測血紅素及肌紅素之分離效果的檢測結果如圖5至圖9所示。圖5中條件1所使用的溶液為滅菌純水(Milli-Q water)，酸鹼度為pH 7.5 (電泳線1至3：流經管柱收集的樣本，電泳線4至6：鹼性溶液沖提收集的樣本)；條件2所使用的緩衝溶液為10 mM Na-PO ₄(PBS緩衝溶液)，酸鹼度為pH 7.5 (電泳線7至9：流經管柱收集的樣本)。由圖5可知，使用滅菌純水來混合肌紅素及血紅素以及作為沖洗管柱使用的條件1，不具有分離血紅素及肌紅素的功能(血紅素及肌紅素皆會被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取)；而使用10 mM Na-PO ₄pH 7.5來混合肌紅素及血紅素以及作為沖洗管柱使用的條件2，也不具有分離血紅素及肌紅素的功能(血紅素及肌紅素皆不會被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取)。

請參閱圖6，圖6中條件3所使用的緩衝溶液為10 mM Na-PO ₄(PBS緩衝溶液)，酸鹼度為pH 6.6 (電泳線1至3：流經管柱收集的樣本，電泳線4至6：鹼性溶液沖提收集的樣本)。由圖6可知，使用10 mM Na-PO ₄pH 6.6來混合肌紅素及血紅素以及作為沖洗管柱使用的條件3，仍有部分的血紅素未被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取，分離效果不佳。如圖7所示，在條件4中，使用10 mM Na-PO ₄pH 6.8來混合肌紅素及血紅素以及沖洗管柱(電泳線F：流經管柱收集的樣本，電泳線E：鹼性溶液沖提收集的樣本)，仍有部分的血紅素未被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取，分離效果亦不佳。而如圖8所示，在條件5中，使用10 mM Na-PO ₄pH 6.14來混合肌紅素及血紅素以及沖洗管柱(電泳線F：流經管柱收集的樣本，電泳線E：鹼性溶液沖提收集的樣本)，仍有部分的血紅素未被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取，且有部分的肌紅素被管柱中的螯合瓊脂糖凝膠所抓取，無法分離血紅素及肌紅素。

請接續參閱圖9，圖9中條件6所使用的緩衝溶液為10 mM Na-PO ₄，酸鹼度為pH 6.4；條件7所使用的緩衝溶液為100 mM Na-PO ₄，酸鹼度為pH 6.4 (電泳線F：流經管柱收集的樣本，電泳線E：鹼性溶液沖提收集的樣本)。由圖9可知，在條件6中，使用10 mM Na-PO ₄pH 6.4來混合肌紅素及血紅素以及沖洗管柱，可達到確實分離血紅素及肌紅素之效果。而若是選用高濃度的Na-PO ₄來混合肌紅素及血紅素以及沖洗管柱(條件7)，則無法分離血紅素及肌紅素。

由此可知，經選用適當酸鹼度及濃度的緩衝溶液來調配前處理溶液後，配合使用螯合瓊脂糖凝膠及鹼性溶液，可有效分離樣品中的血紅素及肌紅素。並且，經研究後，若是選用酸鹼度介於pH 6.3至6.5之範圍且濃度介於5 mM至50 mM之範圍的例如為Na-PO ₄的緩衝溶液，皆可達到有效分離血紅素及肌紅素之目的。

本發明之分離方法可用以純化製得大量的血紅素及肌紅素，能應用於實驗材料的製備。或者，本發明之分離方法也可應用於臨床試驗。舉例來說，本發明可用於區分糞便中是否存在有血紅素及/或肌紅素，避免因肌紅素的存在而影響檢驗糞便潛血反應的準確度。

在前述的電泳檢測中，所使用的血紅素係購自sigma，肌紅素係購自sigma。前述的10 mM Na-PO ₄pH 6.4係由下列方式所製得，但不限定於此：

在本發明中所使用的緩衝溶液是指由弱酸及其共軛鹼(或弱鹼及其共軛酸)所組成的緩衝對配製的，能夠在加入少量的酸或鹼時，可以減緩pH改變的溶液。表示該溶液可控制溶液內的其他反應進行時，即使產生少量的強酸或強鹼或水而稀釋濃度，緩衝溶液都可維持溶液的pH值僅有小幅改變。較佳地，本發明所選用的共軛酸鹼對是Na ₂HPO ₄(鹼，pH值約8.5~9，視濃度而定)及NaH ₂PO ₄(酸，pH值約3.5~4，視濃度而定)。配製時，以相同濃度進行滴定，直到所需要的pH值。Na-PO ₄緩衝溶液的穩定範圍(即pH調節範圍)約在6.0~7.5之間。舉例來說，若需要50 mM pH值6.5的緩衝溶液，則分別配製 50 mM 的 Na ₂HPO ₄(鹼)及NaH ₂PO ₄(酸)，開始滴定至pH值6.5。

綜上所述，本發明之血紅素及肌紅素之分離方法，先藉由前處理步驟來調控前處理溶液的酸鹼度及濃度，再藉由填充於管柱中的螯合瓊脂糖凝膠來與血紅素(配位)鍵結在一起，可達到分離樣品中的血紅素與肌紅素之目的，並取得包含有肌紅素的肌紅素溶液。並且，藉由沖提鹼性溶液來降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力，使血紅素從管柱中分離出來，以取得血紅素。本發明藉由酸性溶液來調節溶解有血紅素的鹼性溶液之酸鹼度，以得到包含有血紅素的中性溶液，再進行濃縮步驟，而能夠獲得高濃度之血紅素。此外，也可以對肌紅素溶液進行濃縮步驟，藉以獲得高濃度之肌紅素。在本發明中，藉由檢測步驟來檢測前處理溶液中全部的血紅素是否與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，可達到確實分離並純化血紅素及肌紅素之目的。若是所得之電泳圖譜中僅具有肌紅素標記，則表示前處理溶液中全部的血紅素已與管柱中的螯合瓊脂糖凝膠(配位)鍵結在一起(即肌紅素溶液中不具有血紅素)，已確實分離血紅素及肌紅素。而若是所得之電泳圖譜同時具有血紅素標記及肌紅素標記，則表示部分的血紅素未與管柱中的螯合瓊脂糖凝膠(配位)鍵結在一起(可能是因為螯合瓊脂糖凝膠抓取血紅素的鍵結力已達飽和，使得肌紅素溶液中包含有血紅素)，因此可以將包含有血紅素的肌紅素溶液流過填充有鍵結力未達飽和的螯合瓊脂糖凝膠之管柱，以繼續分離血紅素及肌紅素，直到所得之電泳圖譜僅具有肌紅素標記，達到確實分離血紅素及肌紅素之目的。並且，藉由使用具預定酸鹼度及濃度的緩衝溶液、螯合瓊脂糖凝膠、鹼性溶液及酸性溶液，能夠簡便且快速的達到分離血紅素及肌紅素之目的，並可應用於實驗材料製備或臨床試驗。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中`.

S10、S20、S30、S40、S50、S60、S70、S80、S90、S100、‧‧‧步驟

圖1為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第一實施例之流程示意圖。

圖2為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第二實施例之流程示意圖。

圖3為本發明的血紅素及肌紅素之分離方法的第三實施例之流程示意圖。

圖4為分子量標準品、血紅素標準品及肌紅素標準品之電泳照片圖。

圖5至圖9為經電泳量測步驟所得之量測結果之照片圖。

Claims (9)

1. 一種血紅素及肌紅素之分離方法，至少包含：提供一樣品，該樣品包含有血紅素及肌紅素；提供填充有螯合瓊脂糖凝膠(Chelating Sepharose Fast Flow)之一管柱；進行一前處理步驟，以將該樣品與具一預定酸鹼度及一預定濃度的一緩衝溶液混合在一起而得一前處理溶液，其中該緩衝溶液為磷酸緩衝鹽(phosphate buffer saline，PBS)溶液，該預定酸鹼度係介於pH 6.3至6.5之範圍，該預定濃度係介於5mM至50mM之範圍；進行一鍵結步驟，以將該前處理溶液流過該管柱，使得該前處理溶液中的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；進行一清洗步驟，藉由將該緩衝溶液流過該管柱，以將該前處理溶液中非特異性鍵結於螯合瓊脂糖凝膠的肌紅素從該管柱中沖洗出來而得一肌紅素溶液；以及進行一沖提步驟，藉由沖提一鹼性溶液以降低血紅素與螯合瓊脂糖凝膠的鍵結力而使血紅素從該管柱中分離出來。
2. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中螯合瓊脂糖凝膠包含有交聯瓊脂糖珠(cross-linked agarose beads)及亞胺基二乙酸(iminodiacetic acid)，且交聯瓊脂糖珠之濃度係為6%。
3. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中於該清洗步驟之後更進行一檢測步驟，以檢測該前處理溶液中的全部的血紅素是否與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起，若是則進行該沖提步驟。
4. 如申請專利範圍第3項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中該檢測步驟包含：對從該管柱流出的該肌紅素溶液進行一電泳量測步驟而得一電泳圖譜。
5. 如申請專利範圍第4項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中若是該電泳圖譜僅具有肌紅素標記，則該前處理溶液中的全部的血紅素與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起；而若是該電泳圖譜同時具有血紅素標記及肌紅素標記，則該前處理溶液中的血紅素非全部與螯合瓊脂糖凝膠鍵結在一起。
6. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中從該管柱中分離出來之血紅素係溶解於該鹼性溶液中，且於該沖提步驟後更進行一中和步驟，藉由一酸性溶液來調節溶解有血紅素的該鹼性溶液之酸鹼度，而得包含有血紅素之一中性溶液。
7. 如申請專利範圍第6項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，其中該鹼性溶液為氫氧化鈉，該酸性溶液為檸檬酸(citric acid)，且氫氧化鈉之濃度為50mM，檸檬酸之濃度為50mM。
8. 如申請專利範圍第6項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，更包含對該中性溶液進行一濃縮步驟，以提高該中性溶液中血紅素的濃度。
9. 如申請專利範圍第1項所述之血紅素及肌紅素之分離方法，更包含對從該管柱中沖洗出來的該肌紅素溶液進行一濃縮步驟，以提高該肌紅素溶液中肌紅素的濃度。