TWI620819B - 抗大流行性感冒病毒ａ／ｈ１ｎ１之新穎疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於流行性感冒病毒疫苗，且具體而言係關於流行性感冒病毒，該病毒至少具有其包含D222突變之血球凝集素基因及奧司他韋(oseltamivir)抗性神經胺酸酶基因。在一些實施例中，該流行性感冒病毒疫苗進一步包含基質蛋白，該基質蛋白包含提高人類之特異性免疫反應之突變。該病毒可用於產生抵抗超毒力及奧司他韋抗性流行性感冒之疫苗。

Description

抗大流行性感冒病毒A/H1N1之新穎疫苗
本發明係關於抗流行性感冒病毒疫苗，且具體而言係關於抗大流行性A/H1N1流行性感冒病毒之超毒力株之疫苗。本發明提供可用於製造在HA及NA區段載有特定突變之流行性感冒疫苗之流行性感冒病毒株。
本申請案主張對2010年11月2日申請之美國臨時專利申請案第61,409/303號之優先權。此臨時申請案係全文以引用方式併入本文中。
流行性感冒係由正黏液病毒科(orthomyxoviridae family)之RNA病毒引起的。該等病毒有三種類型，且其引起三種不同類型之流行性感冒：A型、B型及C型。A型流行性感冒病毒病毒感染哺乳動物(人類、豬、雪貂、馬)及鳥。此對人類極為重要，此乃因該類型病毒已引起過世界範圍之大流行病。B型流行性感冒病毒(亦簡稱為流行性感冒B)僅感染人類。其有時引起流感之局部爆發。流行性感冒C病毒亦僅感染人類。其在早期感染人數最多且極少引起嚴重疾病。
流行性感冒A病毒感染眾多種哺乳動物，包括人類、馬、豬、雪貂及鳥。主要人類病原體與流行病及大流行病有關。有至少15種已知血球凝集素(H)血清型及9鐘已知神經胺酸酶(N)血清型。業內相信豬及鳥係尤其重要之儲存庫，其生成遺傳上及抗原性上不同之病毒池，該等病毒經由人類與動物之間之密切接觸轉移回人群。流行性感冒B病毒僅感染哺乳動物並引起疾病，但一般不如A型嚴重。與流行性感冒A病毒不同，流行性感冒B病毒不具有可辨別的血清型。流行性感冒C病毒亦僅感染哺乳動物，但極少引起疾病。其在遺傳上及形態上與A型及B型不同。
與許多其他病毒不同，流行性感冒基因組係由RNA而非DNA組成。該基因組包含8個區段，且僅含有所有8個區段之病毒顆粒有活力。(Steinhauer DA,Skehel JJ.,Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332)。
在流行性感冒病毒中存在4種抗原：血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)、核殼體(NA)、基質(M)及核殼蛋白(NP)。NP係類型特異性抗原，且以3種形式A、B及C存在，其提供人類流行性感冒病毒分類之基礎。基質蛋白(M蛋白)圍繞核殼體且佔顆粒質量之35-45%。在表面上觀察到兩種表面糖蛋白呈棒形凸起。血球凝集素(HA)係由2個次單元HA1及HA2構成。HA介導病毒附著至細胞受體。神經胺酸酶(NA)分子在外套膜中以較少量存在。循環之人類菌株因其往往年復一年地累積突變且造成流行病復發而廣為人知。
流行性感冒病毒係極少數基因組位於單獨區段(8個)中之病毒之一。基因組之區段性亦使得不同病毒株之間可交換完整基因，從而提高形成重組體之可能性(若兩種不同病毒感染相同細胞，則可藉由互換基因區段來形成)。亦即，若一細胞受到兩種不同流行性感冒株感染，則各區段可重分配以產生具有來自每一初始病毒之區段之新病毒。在自然界中，此可有助於快速產生新流感株。可由兩種病毒之間混合組裝出新基因組。該過程亦可在實驗室中複製(用於製造疫苗株)。在遠東地區，在豬中重組之禽類及人類株可容許進化出毒力人類株。
流行性感冒病毒之遺傳可塑性亦很可能與疫苗設計、致病性及新病毒自天然儲存庫中出現並引起世界性大流行病之能力有關。
大流行性(H1N1) 2009病毒已在世界範圍內進化，其在大流行過程期間自初始混合分枝模式變為一種分枝(分枝7)佔優。因此，構成此分枝之病毒可對世界範圍內爆發之大部分該大流行病負責。血球凝集素(HA)蛋白質序列中之突變S203T為分枝7分離物所特有。(Valli MB等人，Evolutionary pattern of pandemic influenza(H1N1) 2009 virus in the late phases of the 2009 pandemic. PLoS Curr Influenza. 2010年3月3日：RRN1149)。
在包含S203T突變之分枝7分離物中，血球凝集素HA1基因序列中對應於222位(H3編號中之225位)之胺基酸變化(其中天冬胺酸(D)變為甘胺酸(G))與嚴重臨床結果有關。在2009年4月至11月期間的不同時間點，在基因庫(GenBank)中之H1N1 pdm全球分離物(global isolate)中記錄到D222G突變(Chen GW,Shih SR(2009) Genomic signatures of influenza A pandemic(H1N1) 2009 virus. Emerg Infect Dis)。
流行性感冒疫苗係欲抵抗高度易變流行性感冒病毒進行保護之週年疫苗。所注射每一季節性流行性感冒疫苗皆含有三種流行性感冒病毒：一種A(H3N2)病毒、2009大流行性H1N1病毒及一種流行性感冒B病毒。(www.cdc.gov/vaccines/pubs/vis/downloads/vis-flu.pdf)。然而，大流行性流感疫苗對HA蛋白中載有D222G突變之流行性感冒H1N1病毒僅微弱有效。
因此，業內迫切需要生成抗H1N1之D222G變體之穩健抗體效價之病毒株及病毒衍生抗原。
本發明係關於製備對抗大流行性感冒A H1N1病毒之超毒力形式及/或奧司他韋(oseltamivir)抗性形式之疫苗之方法及組合物。提供在HA之D222殘基及NA之S275殘基中包含突變之疫苗組合物。
本發明提供流行性感冒病毒疫苗，其包含至少具有以下之流行性感冒病毒：血球凝集素(HA)基因區段，其包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO: 34；及神經胺酸酶(NA)基因區段，其包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO: 39。
在一實施例中，HA基因區段包含由病毒1之區段4之核苷酸序列(SEQ ID NO: 4)編碼之胺基酸序列。在一些形式中，HA基因區段包含大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之分枝7特異性HA序列。
在一實施例中，HA基因區段包含野生型大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒中D222殘基處之突變。在一實施例中，HA基因區段包含D222E突變。在一些實施例中，HA基因區段相對於野生型大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒包含S203T突變。
本發明係關於疫苗，其中HA基因區段進一步包含P83S及I321V突變中之一或多者。
在一實施例中，NA基因區段包含由病毒1中區段6之核苷酸序列(SEQ ID NO: 6)編碼之胺基酸序列。NA基因區段相對於野生型大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒包含Y275H突變。
本發明係關於疫苗，其中NA基因區段進一步包含I106V突變、D248N突變中之一或多者。
本發明疫苗可進一步包含：c)基質(MA)基因區段，其編碼包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO: 50之M1肽。
在一實施例中，MA基因區段包含由病毒1中區段7之核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)編碼之胺基酸序列。
在一些實施例中，基質(MA)基因區段編碼包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO: 51之M2肽。在一些實施例中，M1肽包含A198P突變。
本發明係關於使患者對流行性感冒病毒免疫之方法，其包含將本文所揭示流行性感冒疫苗投與患者之步驟。
本發明係關於使患者對超毒力流行性感冒病毒免疫之方法，其包含將本文所揭示流行性感冒疫苗投與患者之步驟。
本發明係關於使患者對奧司他韋抗性流行性感冒病毒免疫之方法，其包含將本文所揭示流行性感冒疫苗投與患者之步驟。
本發明係關於本文所揭示疫苗，其中該疫苗係重分配體疫苗。在一些實施例中，藉由傳統重分配獲得重分配體流行性感冒病毒。
本發明係關於本文所揭示疫苗，其係活減毒疫苗或不活化疫苗。在一些實施例中，疫苗經調配以供經口或鼻內投與。
本發明係關於製備用於使個體對超毒力流行性感冒病毒株免疫之疫苗之方法，其包含混合本文所揭示流行性感冒病毒與載劑及視需要選用之佐劑之步驟。
根據下文結合以下附圖對較佳實施例之說明可明瞭該等及其他態樣，盡但可在其中實施變化及修改，而不背離本揭示內容之新穎概念的精神及範圍。
以下圖式構成本說明書之一部分且經包涵以進一步展示本揭示內容之某些態樣，參照該等圖式中之一或多者以及本文所述具體實施例之詳細說明，可更透徹地理解本發明。本專利或申請案檔案含有至少一個彩色圖式。在提出要求並支付必要費用後，將由專利事務局(Office)提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之副本。
在本發明上下文中及在使用每一術語之具體上下文中，本說明書中所用術語一般具有業內普通含義。下文或說明書中其他地方論述用於闡述本發明之某些術語，其為關注本發明說明之從業人員提供額外指導。為方便起見，可使用(例如)斜體字及/或引號來突出顯示某些術語。使用突出顯示對術語之範圍及含義無影響；在相同上下文中，無論是否突出顯示，術語之範圍及含義皆相同。應瞭解，可以一種以上方式來描述同一對象。
因此，替代性語言及同義詞可用於本文所論述術語中之任何一或多者，無論術語在本文中是否詳細闡明或論述均不具有任何特殊意義。提供某些術語之同義詞。列舉一或多個同義詞並不排除其他同義詞之使用。本說明書中任一處之實例(包括本文所論述任一術語之實例)的使用僅具有說明性，且決不限制本發明或所例示任一術語之範圍及含義。同樣，本發明並不限於本說明書中給出之各個實施例。
除非另有說明，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者一般所瞭解之意義相同之意義。倘若出現矛盾，則以本文件(包括定義)為准。以下參考文獻為技術人員提供本發明中所用許多術語之一般定義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1993)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編輯，Cambridge University Press. 1990)；The Glossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人(編輯)，Springer Verlag(1991)；及Hale & Margham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。
一般而言，與本文所述細胞及組織培養、分子生物學以及蛋白質及寡核苷酸或多核苷酸化學及雜交有關之所用術語及其技術為業內熟知且常用之彼等。重組體DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉化(例如電穿孔、脂質體轉染)使用標準技術。酶促反應及純化技術係依照製造商說明書或如業內常用方法或如本文所述來實施。除非明確指示相反含義，否則本發明之實踐將採用業內熟知之病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組體DNA技術之習用方法，其中許多方法出於說明性目的闡述於下文中。該等技術完整闡釋於文獻中。例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning: A Practical Approach，第I卷及第II卷(D. Glover編輯)；Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B. Hames及S. Higgins編輯，1985)；Transcription and Translation(B. Hames及S. Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture(R. Freshney編輯，1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
流行性感冒A病毒含有由如下表1中所示8個負義RNA單獨區段組成之基因組。(Steinhauer DA,Skehel JJ.,Genetics of influenza viruses. Ann Rev Genet. 2002 36: 305-332)。循環人類株因其往往年復一年地積累突變且引起流行病而廣為人知。然而，基因組之區段性以使得不同病毒株之間可交換完整基因。流行性感冒病毒之遺傳可塑性亦很可能與疫苗設計、致病性及新病毒自天然儲存庫中出現並引起世界性大流行病之能力有關。
藉由細胞培養分離總計950種病毒，經由毛細管測序自該等病毒獲得193種神經胺酸酶(NA)及197種血球凝集素(HA)部分基因序列。由於HA及NA係AH1N1中之最易變序列，因此電腦模擬分析(系譜分析及BLAST)顯示，所有386個(HA及NA序列)可分為20個簇；在454鈦羅氏焦磷酸測序設備(454 Titanium Roche Pyrosequencing equipment，ROCHE)中對每簇中一個代表性成員之完整基因組進行焦磷酸測序。獲得總計20個完整AH1N1基因組，每一AH1N1由8個基因組成。
測序數據顯示四種具有三種不同突變之病毒分離物：(i)pAH1N1病毒，其在NA(奧司他韋R)、HA(超毒力)及基質區段中具有突變(病毒1)；(ii) pAH1N1病毒，起在NA及基質區段中具有突變(病毒2)；(iii) pAH1N1病毒，起在基質(MA)區段中具有突變(病毒3)；及(iv) pAH1N1病毒，其在神經胺酸酶(NA)區段中具有突變(病毒4)。
血球凝集素HA1基因序列中在對應於222位(H3編號中之225位)之胺基酸處之變化(其中天冬胺酸(D)變為甘胺酸(G))與嚴重臨床結果有關。在2009年4月至11月期間之不同時間點，在基因庫中之H1N1pdm全球分離物中記錄到D222G突變(Chen GW,Shih SR(2009) Genomic signatures of influenza A pandemic(H1N1) 2009 virus. Emerg Infect Dis)。
流行性感冒病毒與唾液酸-α2,3-半乳糖(α2,3受體)或唾液酸-α2,6-半乳糖(α2,6受體)之優先結合可決定其向性，此乃因α2,3受體及α2,6受體分別在下呼吸道細胞及上呼吸道細胞上佔主要地位(Shinya K、Ebina M、Yamada S、Ono M、Kasai N、Kawaoka Y. Avian flu: influenza receptors in the human airway. Nature. 2006；440(7083):435-6)。
最新聚糖微陣列分析表明，血球凝集素(HA) D222G取代可能引起自α2,6受體特異性至混合α2,3/α2,6受體特異性之變化，此可增強與α2,3受體之結合並提高疾病嚴重性。(Stevens J、Blixt O、Glaser L、Taubenberger JK、PaleseP、Paulson JC等人，Glycan microarray analysis of the hemagglutinins from modern and pandemic influenza viruses reveals different receptor specificities. J Mol Biol. 2006；355(5):1143-55)。此位置似乎影響受體結合特異性，且兩種1918病毒變體(同前)之間之D/G差異與自α2-6連接唾液酸優先性至雙重α2-3/α2-6特異性之變化有關，即其或許可使病毒更易感染氣道更深處(其中表現α2-3受體之細胞更豐富)，由此產生超毒力。
然而，尚未觀察到具有D222G取代之嚴重病例之獨特系譜簇集(Mak GC等人，Association of D222G substitution in hemagglutinin of 2009 pandemic influenza A(H1N1) with severe disease. Eurosurveillance，第15卷，第14期，2010年4月8日)。
所有發現在HA1中222位含有變化之病毒皆屬於以HA1取代S203T(分枝7之特徵)為特徵之大流行性H1N1病毒之亞分枝，該S203T亦由胺基酸袋圍繞且該胺基酸袋暴露為此超毒力株及其餘AH1N1株所特有之抗原性區域。此亞分枝佔歐洲及北半球其餘部分之大流行性病毒之大部分。對於南半球，此亞分枝亦分佈極廣。
基於與WHO共享之當前可得數據，D222G取代之盛行率小於1.8%(在超過2755個HA序列中檢測到52處)。在迄今分析之364個致死病例中，26個病例(7.1%)中之病毒具有D222G取代。關於該等病例中可能的潛在醫學病況之臨床資訊有限。具有D222G取代之大流行性(H1N1) 2009病毒在抗原性上類似於A/California/7/2009(H1N1)病毒(WHO推薦之疫苗病毒)。
在相同之上述病毒A(H1N1)2009中，發現(i)血球凝集素(HA)中之Gly222突變及(ii)神經胺酸酶(NA)中與對奧司他韋之抗性相關之Tyr275突變(McKimm-Breschkin JL. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors - a review. Antiviral Res 2000;47:1-17；Collins PJ等人，Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses. Vaccine 27(2009) 6317-6323)。由於兩種突變皆與重要表現型(超毒力及奧司他韋抗性)有關，且抗原性區域與彼等突變相關，故本發明疫苗候選者可有效識別突變體株及AH1N1野生型二者。
三種D222G變體病毒在神經胺酸酶(NA)中載有與奧司他韋抗性相關之H275Y取代。WHO Report. Preliminary review of D222G amino acid substitution in the hemagglutinin of pandemic influenza A(H1N1) 2009 viruses，2009年12月28日(www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/cp165_2009_2812_review_d222g_amino_acid_substitution_in_ha_h1n1_viruses.pdf)。
當前可得大流行病疫苗亦識別超毒力及奧司他韋抗性突變體，然而，儘管突變位於H1血球凝集素之受體結合腔而非抗原性位點中，但在瑞典傳染病控制研究所(Swedish Institute for Infectious Disease Control)及在吾人之實驗室實施之初步抗原表徵顯示，與野生型大流行性AH1N1株相比，突變體病毒與抗當前大流行病疫苗之抗血清之反應性顯著降低。因此，當前疫苗對該等在世界範圍內快速傳播之新突變體株之識別不如本發明疫苗候選者有效。
病毒基因組區段7(基質區段)之3'端中之突變顯示與流行性感冒BM區段之相似性(60%)。先前已報導此突變可提高人類之特異性免疫反應，且其亦可賦予抗流行性感冒B之保護。然而，主要抵抗病毒基質及核蛋白抗原之細胞介導之免疫性並不能保護免於感染，但其係病毒清除及自疾病恢復的關鍵。
4種病毒分離物之胺基酸序列係自核苷酸序列測定推斷得出。病毒1在HA、NA及MA蛋白中載有所關注突變。病毒2在NA及MA蛋白中載有所關注突變。病毒3在NA蛋白中載有所關注突變。病毒4在MA蛋白中載有所關注突變。
相對於野生型大流行性感冒A H1N1序列分析HA序列中之所關注突變。所有四種分離物皆載有突變P83S及I321V，該等突變似乎在A/H1N1大流行株之分枝7中盛行。
病毒1亦具有(i)分枝7特徵性S203T突變，及(ii)位於HA序列222位處之D222E突變。在222位-223位，病毒1具有E-R胺基酸而非野生型之D-Q。在流行性感冒A病毒(A/Novgorod/01/2009(H1N1)) HA蛋白中發現對病毒1之HA序列之準確匹配。
病毒1、2及4相對於野生型A/California/07/2009序列在NA區段(6)之I106V、D248N、Y275H殘基處載有突變。Y275H突變與奧司他韋抗性相關。在該三種分離物中發現之NA序列之準確匹配亦在其他分離物中發現。
當前野生型疫苗對在該等特定位點載有HA及NA突變二者之病毒1之有效性較低。(Puzelli等人，Transmission of Hemagglutinin D222G mutant strain of pandemic(H1N1) 2009 virus. Emerging Infectious Diseases 16(5): 863-865(2010))。由載有超毒力(HA區域中之D222G/E)及奧司他韋抗性(NA區域中之Y275H)二者之病毒(例如病毒1)生成之疫苗客服野生型H1N1大流行病疫苗之低效率並提供抗超毒力及奧司他韋抗性病毒二者之保護。
病毒1、2及3相對於野生型A/California/07/2009序列在M1區域(區段7)中載有突變A198P。此外，該三種分離物缺少對應於M2區域中之D34之殘基。
已報導此突變可提高細胞介導之免疫性(但並不能保護免於感染)。突變區域與流行性感冒B病毒MA區域具有60%序列相似性且抵抗載有此突變之病毒分離物生成之疫苗可產生抗流行性感冒B之免疫性。
此外，M1突變可用作病毒清除及恢復之治療靶。
本發明方法使用本文揭示之流行性感冒病毒抗原針對流行性感冒病毒感染來進行免疫。衍生出抗原之特定病毒可與所提供保護抵抗之特定病毒相同或不同，此乃因已知在流行性感冒病毒、尤其相同病毒亞型內之不同分離物之間存在交叉保護。
當前使用之流行性感冒疫苗命名為全病毒(WV)疫苗或亞病毒粒子(SV)(亦稱作「裂解」或「純化表面抗原」)。WV疫苗含有完整不活化病毒，而SV疫苗含有經清潔劑***之純化病毒，該清潔劑溶解含脂質病毒外套膜，之後將殘留病毒化學不活化。抗流行性感冒之減毒病毒疫苗亦在研發中。對習用疫苗之製備方法之論述可參見Wright,P. F.及Webster,R. G.,FIELDS VIROLOGY，第4版(Knipe,D. M.等人編輯)，1464-65(2001)。
倘若疫苗包括一種以上流行性感冒株，則不同株通常係分開生長且在已收穫病毒且已製備抗原後混合。或者，可合併流行性感冒病毒之不同分離物之不同區段以產生多潛能疫苗。本發明方法中使用之流行性感冒病毒可係重分配體株，及/或可藉由反向遺傳學技術來獲得。病毒可係減毒病毒。病毒可係溫度敏感性病毒。病毒可係適冷性病毒。可使用包括來自致病株之HA及/或NA病毒區段及來自非致病株之其餘6或7個區段之重分配體株。
本發明免疫原性組合物中所用流行性感冒病毒抗原可呈活病毒或較佳不活化病毒形式。病毒不活化通常涉及用諸如福馬林(formalin)或β-丙內酯等化學物質處理。倘若使用不活化病毒，則抗原可係全病毒、裂解病毒或病毒次單元。裂解病毒係藉由用清潔劑(例如***、聚山梨醇酯80、去氧膽酸鹽、三-N-丁基磷酸鹽、Triton X-100、Triton N101、溴化十六烷基三甲基銨等)處理病毒粒子以產生亞病毒粒子製劑來獲得。次單元疫苗包含流行性感冒表面抗原血球凝集素及神經胺酸酶中之一者或兩者。流行性感冒抗原亦可以病毒體形式來呈遞。
倘若抗原係自流行性感冒病毒製備(即並非係在不涉及流行性感冒病毒生長之重組體或合成系統中產生)，則病毒可在卵上或在細胞培養中生長。在無特定病原體之胚胎卵中生長係使流行性感冒病毒生長以供產生疫苗之傳統途徑，且細胞培養係更新研發方法。倘若使用細胞培養，則流行性感冒病毒疫苗通常將在哺乳動物細胞(例如MDCK細胞、VERO細胞或PER.C6細胞)上生長。該等細胞系隨處可得，例如得自美國細胞培養收藏中心(American Type Cell Culture(ATCC) collection)，或得自科裏爾細胞庫(Coriell Cell Repositories)。舉例而言，ATCC以目錄號CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586及CRL-1587供應各種不同VERO細胞，且其以目錄號CCL-34供應MDCK細胞。亦可在禽類細胞系(包括源自母雞之細胞系，例如雞胚纖維母細胞(CEF))上生長。
本發明免疫原性及藥劑組合物適合投與患者。此可藉由多種方式來達成，包括(但不限於)：皮內注射；經皮投與；及局部投與。該等方式可結合(例如)藉由金剛砂紙或藉由使用微磨料產生之皮膚擦傷來使用。
本發明免疫原性及藥劑組合物較佳以疫苗形式存在。
本發明組合物可包括佐劑。流行性感冒疫苗中已使用之佐劑包括鋁鹽、幾丁聚糖、CpG寡去氧核苷酸(例如CpG 7909)、水包油乳液(例如MF59)、水包油包水乳液、大腸桿菌(E.coli)不耐熱毒素及其去毒突變體、單磷醯脂質A及其3-O-去醯化衍生物、百日咳(pertussis)毒素突變體、胞壁醯二肽等。
血球凝集素(HA)係不活化流行性感冒疫苗中之主要免疫原，且疫苗劑量係參照HA含量標準化，通常係藉由單向輻射免疫擴散(SRID)分析所量測。肌內注射用疫苗通常含有約15 μg HA/株，但亦可使用較低劑量(例如用於兒童，或在大流行病形勢中)且已使用分次劑量，例如1/2(即7.5 μg HA/株)、1/4及1/8劑量。本發明組合物通常每流行性感冒株將包括介於0.1 μg與8 μg之間之HA，較佳例如約7.5、約5、約3、約2.5、約2、約1.5、約1、約0.75、約0.5、約0.4、約0.2 μg等。
肌內注射用疫苗通常具有0.5 ml之體積。組合物可包括防腐劑，例如硫柳汞(thiomersal)或2-苯氧基乙醇。然而，組合物較佳應實質上不含(即少於1 μg/ml)含汞材料，例如不含硫柳汞。不含汞之疫苗更佳。
倘若流行性感冒病毒已在細胞培養物上生長，則本發明組合物較佳含有少於100 pg殘留宿主細胞DNA/劑量，但可能存在痕量宿主細胞DNA。可在疫苗製備期間使用諸如層析等標準純化程序來移除污染性DNA。殘留宿主細胞DNA之移除可藉由核酸酶處理(例如藉由使用BenzonaseDNase)來增強。含有<100 pg宿主細胞DNA/10 μg血球凝集素之疫苗較佳，含有<100 pg宿主細胞DNA/0.25 ml體積之疫苗亦較佳。含有<100 pg宿主細胞DNA/50 μg血球凝集素之疫苗更佳，含有<100 pg宿主細胞DNA/ml體積之疫苗亦更佳。
本發明疫苗可按照單劑量免疫方案來遞送。或者，其可作為初免-加強方案(意指在第一次免疫後，在數週或數月內第二次注射類似抗原性)之初免元素來遞送。
測試流行性感冒疫苗之免疫原性之方法為業內所熟知。一種方法涉及以下程序：(a)在即將疫苗接種之前，自患者(通常自手臂)取10 ml靜脈血樣用於循環抗HA抗體之基線滴定；(b)之後，患者立即接受1劑量疫苗，該疫苗若投與手臂則應給予取血臂之異側臂；(c)在疫苗接種後約3週，應自患者取10 ml血樣。自血樣分離血清並儲存(若需要)在-20℃下。藉由血球凝集抑制(HI)或單向輻射溶血(SRH)分析血清之抵抗相關株之抗血球凝集素抗體。可自公共基準實驗室獲得陽性及陰性血清以及參照製劑。以一式兩份實施抗體滴定，且同時滴定疫苗接種前血清及疫苗接種後血清。賦予每一樣品之滴定值係兩次獨立測定之幾何平均值(但出於計算目的，在標準條件下任何<10(=不可檢測)之HI結果皆表示為5且任何陰性SRH結果皆表示為4 mm2)。
在HI測試中，血清轉化率對應於 40之免疫前與免疫後效價比及抗體效價之顯著(例如至少4倍)增加。在SRH測試中，血清轉化率對應於 25 MM 2 之疫苗接種後面積，及相對於疫苗接種前面積至少50%之面積。實例
不期望限制本發明之範圍，下文給出本發明實施例之實例性儀器、裝置、方法及其相關結果。注意，為方便讀者，實例中可使用標題或副標題，其絕不應限制本發明之範圍。另外，本文中提出並揭示某些理論；然而，不論其正確或錯誤，其絕不應限制本發明之範圍，只要本發明係根據本發明來實踐即可，不考慮任何特定作用理論或方案。
實例1：細胞系
VERO細胞係經充分研究之細胞系，其首先自非洲綠猴腎(草原猴(Cercopithecus aethiops))分離，且已廣泛用於微生物學、細胞生物學及病毒學研究。其在美國已獲批用於病毒疫苗生產(輪狀病毒(rotavirus)及脊髓灰白質炎病毒(polivirus))，其亦已經測試且在一些情形中獲批用於抵抗狂犬病(Rabies)、裏奧病毒(reovirus)及日本腦炎(Japanese encephalitis)之疫苗生產。由於此細胞系對共感染易感且其能在發酵罐或生物反應器中以工業規模生長(此係疫苗生產之合意特徵)，故選擇此細胞系。
所用VERO細胞系購自ATCC，且用二甲亞碸(DMSO)保持在-70℃下。根據CORNING說明書使細胞解凍。
實例2：無菌條件
吾人在BSLIII之所有設施皆經謹慎處理及監測以避免污染，有規律地實施房間、材料、試劑及設備無菌度測試。每個月對細胞培養區域進行規律性地清潔及消毒，且每24、48及72小時使用苯亞甲基(Benzal)、70%乙醇及5%氯進行若干輪消毒。在該等消毒結束時實施無菌度測試，亦藉由在巰基乙酸鹽液體培養基中培養等份試樣來測試所有試劑之污染。
實例3：細胞增殖
Vero細胞增殖係在適宜物理及化學條件(例如在聚苯乙烯細胞培養燒瓶(25 cm2，50 cm2及75 cm2)中儲存)下進行。該等燒瓶亦經γ輻照以降低疏水性。該等容器容許有效細胞黏附且因而容許形成單層。為促進細胞繁殖，使用生長培養基M199或DMEM(達爾伯克氏改良培養基，Dulbecco's Modified Medium)且補充10%胎牛血清(BFS)(SIGMA-Aldrich)；藉由使用Phenol Red來監測生理pH之維持。添加抗微生物混合物(青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)及兩性黴素B(amphotericin B))，且為抑制真菌污染，亦添加抗PPLO。
在35℃/5% CO2/5%濕度下培育細胞培養物。藉由相位差顯微術監測細胞品質及生長，此使得可棄去彼等呈現細菌或真菌污染之培養物。
如下所述對呈現完全鋪滿之燒瓶實施細胞繼代培養：
1.　移除且棄去培養基。
2.　用0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA溶液短暫沖洗細胞層以移除所有含有胰蛋白酶抑制劑之血清之痕跡。
3.　向燒瓶中添加2.0 ml至3.0 ml胰蛋白酶-EDTA溶液且在倒裝顯微鏡下觀察細胞直至細胞層分散(通常在5至15分鐘內)。
4.　添加6.0 ml至8.0 ml完全生長培養基且藉由緩慢吸液來吸出細胞。
5.　向新培養器皿中添加適當等份之細胞懸浮液。
6.　在37℃下培育培養物。
在觀察到80%鋪滿時，用1x106 p AHN1病毒接種細胞。此鋪滿程度最適於觀察由流行性感冒病毒A/H1N1引起之致細胞病變效應。
實例4：病毒分離
在接種有VERO細胞(80%鋪滿)之25 cm2燒瓶中進行病毒分離，在病毒分離中，移除生長培養基，對細胞實施三次離心及再懸浮以棄去細胞碎片。在細胞培養物中接種得自臨床診斷帶有流行性感冒AH1N1且藉由即時PCR確認之患者之50 μl拭子樣品，且培育30分鐘以使病毒可附著至細胞表面。此後，向M199中補充BFS 1%且以40℃/40 min培育。
藉由相位差顯微術監測經接種培養物中細胞病變效應之存在。同時，藉由即時PCR來測定病毒負荷。在達到1x106時，將培養物在-80℃下冷凍(DMSO 10%)且儲存以供進一步研究。
實例5：藉由即時RT-PCR對病毒感染進行確認及定量。
如先前所述藉由使用市售套組(ROCHE)自VERO細胞培養物提取病毒RNA，此後，藉由分光光度法使用NanoDrop設備對RNA進行定量。在Light Cycler 480溫度循環機(ROCHE)中藉由即時PCR實施用於AH1N1檢測之CDC方案，其包括流行性感冒用以進行定量之標準品(選殖於質粒中之H1基因的101至106個拷貝)。病毒負荷測定係基於對每一樣品之交叉點格式之計算。圖1顯示病毒負荷定量之實例。
實例6：樣品選擇
來自3760個pAH1N1陽性樣品之總計193個測序用樣品係基於臨床及大流行病學數據。臨床選擇標準係：感染嚴重性、抗藥性及非典型臨床環境。大流行病學標準係基於位置、性別及年齡。在自2009年3月至11月報導之4次爆發高峰期間收集所選樣品。使樣品再懸浮於2.5 mL病毒傳送培養基中，分配500 μl等份試樣且儲存在-70℃下。
實例7：核酸提取
根據製造商說明書，使用MagNA Pure LC總核酸分離套組(Roche)在MagNA Pure LC儀器(Roche)上藉由外部溶胞(External Lysis)方案分離臨床樣品之總核酸且使其再懸浮於去離子水(100 μ)中，簡言之：將500 μL樣品置於MagnaPure核酸柱中並添加一體積溶胞緩衝液，此後，設置所有參數並開始分離。將所提取RNA置於-70℃下以供進一步分析。
實例8：流行性感冒p/AH1N1即時PCR檢測
藉由兩種方法來實施對大流行性感冒AH1N1/09之檢測：即時即用型流行性感冒A/H1N1檢測組(Roche)，使用即時即用型RNA病毒主套組(Roche)。在Light Cycler 2.0儀器(Roche)上在以下條件下實施熱循環：在50℃下30 min；在95℃下15 min；45個在94℃下15 s之循環；及在60℃下30 s。
第二種方法係用於流行性感冒A(H1N1)之即時RT-PCR CDC方案，其使用上述方案中所述之引物及探針以及一步式RT-PCR Invitrogen SuperScriptTMIII Platinum一步式定量套組。在Light Cycler 2.0儀器上(Roche)在以下條件下實施熱循環：在50℃下50 min；在95℃下2 min；45個在95℃下15 s之循環；及在55℃下30 s。
兩種方法中之所有反應皆係根據製造商說明書使用存於20 μL總反應體積中之5 μL總RNA來實施。在兩種檢測方法中，包括內部對照(用於Roche方法之人類肌肉生長抑制素(Myostatin)基因及用於CDC方案之RnaseP)。
測試每一樣品且即時PCR分開使用以下探針：流行性感冒A(InfA)、通用豬(SwFlu A)、H1豬(SwH1)及用於人類核酸RNaseP(RP)之內部對照。引入陽性及陰性對照。
反應混合物含有0.8 μM每一引物、0.2 μM每一探針、1X PCR緩衝液及0.5 U of SuperScript III/Platinum Taq混合劑(Invitrogen)。
樣品配置之實例展示於圖2中。
擴增條件如下：
逆轉錄-50℃/30 min
不活化-15℃/2 min
延長-95℃/15個循環及55℃/30個循環。
實例9：數據分析
根據WHO標準如下所述分析結果：
1.-陰性對照中應不存在螢光。
2.-實驗樣品應存在RP探針之螢光。
3.-人類核酸對照應不發射InfA、SwFluA及SwH1探針之螢光。
4.-陽性對照(A/H1N1核酸)應發射所有引物及探針之螢光。
5.-若滿足所有標準，樣品應視為陽性。
圖3A及3B顯示Light Cycler 2.0即時溫度循環機介面之圖形視窗，其顯示螢光曲線。圖3A)臨床樣品。圖3B)RNAseP(RP)檢測。
實例10：測序
藉由細胞培養分離總計950種病毒，在ABI 3100測序機(Applied Biosystems)中經由毛細管測序自其獲得193個神經胺酸酶(NA)及197個血球凝集素(HA)部分基因序列。由於HA及NA係AH1N1中之最易變序列，因此電腦模擬分析(系譜分析及BLAST)顯示，所有386個(HA及NA序列)可分為20個簇；在454鈦羅氏焦磷酸測序設備(454 Titanium Roche Pyrosequencing equipment，ROCHE)中對每簇中一個代表性成員之完整基因組進行焦磷酸測序。
實例11：流行性感冒病毒在雞胚胎中之增殖
業內已若干次嘗試使流行性感冒疫苗之建議候選者在VERO細胞中增殖。然而，該等嘗試最初因所回收病毒量即使在3次繼代後仍極低而失敗。慮及此事件，在SPF(無特定病原體)雞胚胎中實施一次或兩次繼代。以每個候選者0.1 mL將該等候選者接種至羊水中。亦包括40種先前在流感大流行期間分離之其他病毒，且每種病毒使用兩個卵進行接種。
在35℃下三天後，自每一經感染胚胎收穫羊水，將所收集液體以3000 x g離心以移除細胞碎片，且藉由qRT-PCR分析上清液並儲存在-80℃下。所有程序皆係在BSL III中遵循所需標準來實施以避免生物安全性風險。
在繼代後，有三株之胚胎中之病毒負荷極高，其中之一係病毒候選者。亦藉由RT-PCR測試來檢測另外十個分離株，但顯示低病毒負荷。因此，將其在另一SPF雞胚胎中再次接種，但在此情形下接種至尿囊液中。在遵循上述相同條件接種72 hr後，藉由僅收集尿囊液來收穫病毒。藉由使用RT-PCR分析較小體積，且將剩餘部分儲存在-80℃下。結果顯示，10個病毒分離物中有6個能以高效率複製，從而現實高病毒負荷。
來自Karolinska研究所之序列之證明
在雞胚胎增殖前，將病毒株cDNA寄至Karolinska研究所以藉由使用454焦磷酸測序儀系統ROCHE來驗證序列。生物資訊學分析確認先前在吾人實驗室中測定之序列。
主種(master seed)鑒定
將流行性感冒疫苗之病毒候選者命名為HZFLUJAL。
流行性感冒病毒對在VERO細胞系上生長之適應
將自胚胎收穫之病毒候選者(HZFLUJAL)及另外兩種病毒接種於VERO細胞系上。為達成適應，實施若干次繼代，且在感染7至10天後收集培養物上清液。使用每種上清液來感染新VERO細胞繼代。對每次繼代之病毒負荷進行定量。圖4A顯示相同病毒在胚胎及各別繼代培養物中之病毒負荷之間之差異。在該圖中顯示，直至四次繼代後，病毒達成對此組織細胞系之適應。
流行性感冒病毒對在MDCK細胞系上生長之適應
不僅VERO細胞系被評定為流行性感冒病毒之基質，且亦使用MDCK細胞系來使病毒增殖。在MDCK細胞中實施用於達成對VERO細胞之適應之相同程序。初步結果顯示對此細胞系之更佳適應，此乃因似乎僅需三次繼代即可獲得大於雞胚胎之病毒負荷(圖4B)。
使病毒增殖以獲得主種HZFLUJAL
對於預先已適應在VERO細胞系上生長之病毒之增殖，使1個冷凍管之VERO細胞上之第四次繼代解凍且在175 cm2燒瓶上用其感染VERO細胞。在33℃下於CO2培育器中10天後，獲得120 mL主種，其顯示病毒負荷大於107個病毒顆粒數/mL(約107.7)。獲得120個含有1 mL主種之冷凍管。
主種之品質控制
對主種實施無菌度測試及血球凝集測試。對於第一個測試，使4個冷凍管之主種解凍，使用兩個冷凍管來接種兩個含有100 mL液體巰基乙酸鹽培養基NIH之燒瓶，且利用另兩個冷凍管來接種無抗生素DMEM培養基。將兩種培養基在35℃下培育8至15天。在培育期後於培養基中未觀察到生長及變化，因此將其視為無菌(不含細菌、真菌及原生動物)。
實施血球凝集測試以確定主種中血球凝集素之效價。在此分析中，在96孔U形微量板中之PBS(pH=7.4)中製備主種之1:2至1:1024之連續稀釋液。將相同體積之存於PBS中之0.5%(v/v)人類O紅血球懸浮液添加至每一稀釋液中。將微量板在4℃下培育2小時，且結果顯示血球凝集效價為1:8。
實例12：使用HZFLUJAL疫苗之臨床前之前導試驗(Pre- preclinical trial) 用於臨床前之前導試驗之病毒之不活化
為實施臨床前之前導試驗，使1個冷凍管之主種解凍，且在33℃下於CO2培育器中7天後在80 cm2燒瓶上用其感染VERO培養物。在35℃下藉由最終濃度為0.02%(v/v)之福馬林將培養物不活化18 h。在48 h中藉由對DMEM透析四次來清除福馬林。此後，對血球凝集素效價進行定量，其再一次為1:8。將不活化病毒懸浮液調節至106個病毒顆粒數/25 μL且在以下組中用作疫苗。
臨床前之前導試驗之動物模型
在臨床前之前導試驗中利用7至8週之雌性BALB/c小鼠。將每組置於具有籠Hepa濾蓋之架上。所有動物之操作皆應避免不必要之痛苦。在方案完成時，將所有小鼠安樂死。
臨床前之前導試驗中之血清轉化率分析
在9組(每組5只小鼠)中實施血清轉化率分析。
組1具有106個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
組2具有106個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+肌內投與
組3具有106個病毒顆粒之疫苗+舌下投與
組4具有106個病毒顆粒之疫苗+肌內投與
組5市售疫苗+舌下投與
組6市售疫苗+肌內投與
組7無胎牛血清之DMEM+舌下投與
組8無胎牛血清之DMEM+肌內投與
組9未治療
臨床前之前導試驗中之劑量反應分析
在5組(每組3只小鼠)中實施劑量反應分析。
組A具有107個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
組B具有105個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
組C具有104個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
組D具有103個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
組E具有102個病毒顆粒之疫苗+轉移因子+舌下投與
自免疫方案開始，將所有小鼠在用於實施免疫分析之具有生物安全性要求之動物實驗房間中維持4天。在適應時間後，記錄諸如體重及外觀等臨床數據，且在免疫前自每只小鼠提取無抗凝劑血樣。此後，藉由使用各別投與途徑來接種每一組。在免疫後7、14、21及28天自每只小鼠獲得四個血樣。
藉由離心血樣獲得血清，且將其用於檢測抗流行性感冒A H1N1病毒之IgG2抗體。另外，自小鼠收集分泌樣品以供檢測所分泌之免疫球蛋白A(1gA)。
實例13：由CIATEJ/OPKO/疫苗生成之抗流行性感冒p/AH1N1抗體之檢測
在VERO細胞中產生本文闡述為CIATEJ/OPKO/疫苗之實例性疫苗，且測試生成抗大流行性感冒AH1N1抗體之能力。在使用VERO細胞中由CIATEJ/OPKO產生之抗原作為小鼠中之疫苗時，其能誘導抗體產生。
由CIATEJ/OPKO抗原誘導之抗體之效價大於市售疫苗。圖5顯示藉由ELISA檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之總抗體。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經舌下或肌內實施。
圖6A顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgM抗體。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經肌內實施。
在將轉移因子添加至疫苗CIATEJ/OPKO中時，其使IgG抗體含量提高5倍，且在免疫第一週期間，轉移因子以相同方式使IgM抗體效價提高3倍。圖6B顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG抗體。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經肌內實施。
肌內投與疫苗CIATEJ/OPKO顯示誘導之IgG2A抗體多於舌下投與。圖7A顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG2A抗體。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經舌下或肌內實施。
圖7B顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG2A劑量依賴性。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經舌下實施。
肌內投與疫苗CIATEJ/OPKO顯示誘導之IgA抗體含量與舌下投與相當。圖8A顯示藉由ELISA在呼吸黏膜中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgA抗體。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經舌下或肌內實施(在免疫後第21天)。
圖8B顯示藉由ELISA在呼吸黏膜中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgA劑量依賴性。CIATEJ/OPKO/疫苗係在VERO細胞中產生，TF=轉移因子。在7至8週齡BALB/c雌性小鼠中實施免疫。免疫係經舌下或肌內實施(在免疫後第21天)。
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本說明書中引用之所有出版物及專利申請案皆以引用方式併入本文中，如同每一個別出版物或專利申請案明確且個別地指明以引用方式併入一般。
儘管上文已出於理解清楚之目的藉助圖解及實例較詳細地闡述了本發明，但彼等熟習此項技術者鑒於本發明之教示可容易地瞭解，可對本發明進行某些改變及修改，且不背離隨附申請專利範圍之精神或範圍。
圖1顯示藉由即時PCR對病毒負荷進行定量之實例。
圖2顯示AH1N1即時PCR檢測之樣品配置。
圖3A及3B顯示Light Cycler 2.0即時溫度循環機介面之圖形視窗，其顯示螢光曲線。圖3A)臨床樣品。圖3B)RNAseP(RP)檢測。
圖4A顯示流行性感冒病毒HZFLUJAL在VERO細胞系中之適應。該病毒能在VERO細胞中有效複製，直至4次繼代培養。圖4B顯示流行性感冒病毒HZFLUJAL在MDCK細胞系中之適應階段。在3次繼代培養後，流行性感冒病毒HZFLUJA能在MDCK細胞中有效複製。
圖5顯示藉由ELISA檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之總抗體。
圖6A顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgM抗體。
圖6B顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG抗體。
圖7A顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG2A抗體。圖7B顯示藉由ELISA在血清中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgG2A劑量依賴性。
圖8A顯示藉由ELISA在呼吸黏膜中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgA抗體。圖8B顯示藉由ELISA在呼吸黏膜中檢測之抗流行性感冒p/AH1N1之IgA劑量依賴性。
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Claims (20)

  1. 一種流行性感冒病毒疫苗，其包含流行性感冒病毒，該病毒包含：a)突變神經胺酸酶(NA)基因區段，其在胺基酸殘基275位置具有點突變，其中該點突變為Tyr275，及b)突變血球凝集素(HA)基因區段，其包含D222E突變。
  2. 如請求項1之疫苗，其中該HA基因區段包含大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之分枝7特異性HA序列。
  3. 如請求項1之疫苗，其中該HA基因區段相對於野生型大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒包含S203T突變。
  4. 如請求項1之疫苗，其中該HA基因區段進一步包含P83S突變、I321V突變；P83S突變及I321V突變。
  5. 如請求項1之疫苗，其中該HA基因區段包含由病毒1之區段4之核苷酸序列(SEQ ID NO：4)編碼之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之疫苗，其中該NA基因區段包含由病毒1中區段6之核苷酸序列(SEQ ID NO：6)編碼之胺基酸序列。
  7. 如請求項1之疫苗，其進一步包含：c)基質(MA)基因區段，其編碼M1肽，該M1肽包含A198P突變。
  8. 如請求項7之疫苗，其中該M1肽包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO：50。
  9. 如請求項7之疫苗，其中該MA基因區段包含由病毒1中區段7之核苷酸序列(SEQ ID NO：7)編碼之胺基酸序列。
  10. 如請求項7之疫苗，其中該基質(MA)基因區段進一步編碼M2肽，該M2肽包含衍生自大流行性感冒A H1/N1流行性感冒病毒之病毒1分離物之胺基酸序列SEQ ID NO：51。
  11. 如請求項1之疫苗，其中該突變血球凝集素(HA)基因區段編碼一蛋白質，其包含如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列。
  12. 如請求項1之疫苗，其中該突變神經胺酸酶(NA)基因區段編碼一蛋白質，其包含如SEQ ID NO：39所示之胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之疫苗，其中該疫苗係重分配體疫苗。
  14. 如請求項13之疫苗，其中該重分配體流行性感冒病毒係藉由傳統重分配法獲得。
  15. 如請求項1至12中任一項之疫苗，其中該疫苗係活減毒疫苗或不活化疫苗。
  16. 如請求項15之疫苗，其中該疫苗經調配以供經口或經鼻內投與。
  17. 一種如請求項1至12中任一項之流行性感冒病毒疫苗之用途，其用於製造使患者對流行性感冒病毒免疫之藥劑。
  18. 一種如請求項1至12中任一項之流行性感冒病毒疫苗之用途，其用於製造使患者對超毒力流行性感冒病毒免疫之藥劑。
  19. 一種如請求項1至12中任一項之流行性感冒病毒疫苗之用途，其用於製造使患者對奧司他韋(oseltamivir)抗性流行性感冒病毒免疫之藥劑。
  20. 一種製備使個體對超毒力流行性感冒病毒株免疫之疫苗之方法，其包括混合如請求項1至12中任一項所定義之流行性感冒病毒與載劑及視需要選用之佐劑之步驟。
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