TWI620571B

TWI620571B - 使用得自於秋葵果實的萃取物來治療第2型糖尿病

Info

Publication number: TWI620571B
Application number: TW106100588A
Authority: TW
Inventors: 彭瓊琿; 柯耀筆
Original assignee: 弘光科技大學
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2018-04-11
Also published as: TW201825105A

Abstract

本發明揭示一得自於秋葵果實的萃取物可被用來治療第2型糖尿病，其中該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合。

Description

使用得自於秋葵果實的萃取物來治療第2型糖尿病

本發明是有關於使用得自於秋葵果實( Abelmoschus esculentusfruits)的萃取物來治療第2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus)，其中該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合。

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種與代謝失調有關聯的慢性疾病，它的症狀包括不正常的高血糖(abnormally high blood sugar)[亦即高血糖症(hyperglycemia)]、多食症(polyphagia)、多尿症(polyuria)以及多渴症(polydipsia)。一般而言，糖尿病可被區分為第1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)[亦被稱為胰島素-依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes)或幼年型糖尿病(juvenile diabetes)]以及第2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)[亦被稱為非胰島素-依賴型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes)或成年型糖尿病(adult diabetes)]。

T1DM是一種自體免疫疾病(autoimmune disease)，它會使生產胰島素的胰臟β細胞(insulin-producing pancreatic β cells)受到永久性破壞而廢除(abolish)內生性胰島素(endogenous insulin)的生成。帶有T1DM的病患典型地具有高血糖症，若未予以妥善治療，可能會引起糖尿病酮酸症(diabetic ketoacidosis)而造成昏迷(coma)或死亡。

T2DM是一種具有複雜的致病機制(pathogenesis)的異質性疾病(heterogeneous disease)，該致病機制與基因易感性(genetic susceptibility)和生活方式(life style)(特別是飲食方式)有關。T2DM通常發生於40歲以上的成年人(特別是體重過重的成年人)，而體重過重的幼兒或青少年亦可能患有此種類型的糖尿病。

與T1DM相較之下，T2DM在糖尿病病患中所佔的比例較高，並且隨著現代人的飲食與生活型態而有逐年上升的情形。T2DM的症狀包括高血糖症、接近正常的胰島素位準(near normal insulin levels)、不同程度的胰島素抗性(insulin resistance)以及輕微地增加的升糖素(glucagons)位準，並且可能伴隨血脂異常(dyslipidemia)的症狀。

糖尿病所引起的慢性併發症(chronic complications)包括糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、糖尿病神經病變(diabetic neuropathy)、糖尿病腎病變(diabetic nephropathy)以及糖尿病心肌病變(diabetic cardiomyopathy)。所有的這些併發症促成在帶有糖尿病的人們中之過度的發病率(morbidity)與死亡率(mortality)。

目前臨床上用於治療和/或預防第2型糖尿病的藥物包括：似升糖素胜肽-1促效劑(glucagon-like peptide-1 agonist, GLP-1 agonist)[例如，艾塞那肽(exenatide)以及利拉魯肽(liraglutide)]、胰島素促泌素(insulin secretagogues)[例如，磺醯尿素(sulfonylureas)以及美格替耐(meglitinides)]、胰島素致敏劑(insulin sensitizers)[例如，雙胍(biguanides)以及噻唑烷二酮(thiazolidinedione)]、α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors, AGIs)以及二肽基胜肽酶-4抑制劑(dipeptidyl peptidase-4 inhibitors, DDP-4 inhibitors)。然而，這些藥物在第2型糖尿病治療上所達成的效果仍不盡理想並且可能會導致患者產生嚴重的副作用(side effects)。因此，本領域的相關研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines, TCM)或植物中來尋找可供用於治療第2型糖尿病的活性組分(active component)。

秋葵(拉丁學名： Abelmoschus esculentus；英文俗名：okra、lady's fingers或gumbo；漢語拼音：qiū kuí；中文俗名：黃秋葵、咖啡黃葵、羊角豆以及潺茄等)是錦葵科(Malvaceae)秋葵屬( Abelmoschus)的一年生草本植物；莖圓柱形，疏生散刺；葉互生，葉柄長7至15 cm，被長硬毛，托葉線形，葉掌狀有5至7個裂片；花瓣由白到黃呈倒卵形，花瓣根部有紅色或紫色斑點；種子球形多數，具毛脈紋。產區主要分布於非洲衣索比亞附近以及亞洲熱帶。

秋葵的整株植物(whole plant)皆為可利用的部位，在民俗醫學上，秋葵具有利咽、通淋、下乳以及調經等效用。此外，已有研究指出，秋葵具有抗氧化(antioxidant)、降血糖(hypoglycemic)、降血脂(hypolipidemic)的活性以及神經保護(neuroprotective)的功效(Sabitha V. et al. (2011), J. Pharm. Bioallied. Sci., 3:397-402；以及Sabitha V. et al. (2012), J. Ayurveda. Integr. Med., 3:188-193)。

目前已有研究是有關於秋葵果實的萃取產物在改善和/或治療糖尿病上的應用。例如，CN 102670673 B揭示秋葵的水萃取物、水性有機溶劑萃取物、秋葵多糖或活性化合物在預防、改善和/或治療代謝性疾病上的用途。依據此件大陸專利案的實施例，該秋葵多糖是藉由下述方法而被製備：首先，將30公斤的新鮮秋葵粉碎，繼而以120 mL的95%乙醇進行熱萃取歷時2小時，接著將所得到的萃取溶液進行過濾並收集殘餘物。該殘餘物被重複進行上述乙醇萃取步驟共計2次。之後，將最後一次乙醇萃取步驟所得到的殘餘物以75%乙醇進行脫脂，繼而將該經脫脂的殘餘物與水以一為1：4的體積比進行萃取歷時2小時，接著將所得到的萃取溶液進行過濾，而得到一上澄液以及一殘餘物。收取該上澄液，而該殘餘物被重複進行上述水萃取步驟共計1次。接著，收集所有的上澄液並進行濃縮與離心以去除不溶雜質，然後加入4倍體積的95%乙醇來進行沉澱，繼而予以離心並收集沉澱物，接著將該沉澱物進行冷凍乾燥歷時10天，藉此而得到該秋葵多糖。之後，該秋葵多糖被拿來對帶有高脂肪飼料-誘發的第2型糖尿病的小鼠[high fat diet (HFD) induced type 2 diabetes in mice]進行口服投藥，然後測量牠們的血糖以及血脂質位準。而實驗結果顯示：該秋葵多糖能夠降低帶有高脂肪飼料-誘發的第2型糖尿病的小鼠的血糖以及血脂質的位準，並且可以改善高脂肪飼料-誘發的胰島素抗性(HFD induced insulin resistance)。

在Peng C.H. et al. (2016), Food Funct., 7:728-740中，Peng C.H.等人將1公斤的新鮮秋葵的果實以去離子水洗淨並予以攪碎成為顆粒狀，然後在室溫、避光環境下，將顆粒狀的秋葵果實浸泡於4 L的95%乙醇中並靜置歷時2小時，接著以10,000 rpm來進行離心歷時30分鐘，而得到一上澄液以及一殘餘物。收取該上澄液，而該殘餘物被重複進行上述乙醇萃取-離心步驟共計2次。接著，收集所有的上澄液並予以冷凍乾燥歷時48小時，而得到一秋葵果實的萃取物F1。另外，在避光環境下，將最後一次乙醇萃取-離心步驟所得到的殘餘物浸泡於1 L的90℃去離子水中並靜置歷時2小時，繼而以10,000 rpm來進行離心歷時30分鐘，而得到一上澄液以及一殘餘物。收取該上澄液，而該殘餘物被重複進行上述水萃取-離心步驟共計2次。接著，收集所有的上澄液並予以冷凍乾燥歷時48小時，而得到一秋葵果實的萃取物F2。另外，將最後一次水萃取-離心步驟所得到的殘餘物浸泡於1 L的90℃ 1 N氫氯酸中並靜置歷時2小時，繼而以10,000 rpm來進行離心歷時30分鐘，而得到一上澄液以及一殘餘物。收取該上澄液，而該殘餘物被重複進行上述酸萃取-離心步驟共計2次。接著，收集所有的上澄液並予以冷凍乾燥歷時48小時，而得到一秋葵果實的萃取物F3。之後，Peng C.H.等人將30 mM葡萄糖添加至腎小管細胞(renal tubular cells)中，繼而分別添加秋葵果實的萃取物F1至F3並進行培養歷時24小時，然後測量腎小管細胞中與糖尿病腎性上皮-間質轉變(diabetic renal epithelial-mesenchymal transition)有關的蛋白質[亦即中間絲蛋白(vimentin)、E-鈣黏素(E-cadherin)以及血管緊縮素II受體-1 (angiotensin II receptor-1, AT-1)]的表現情形。而實驗結果顯示：在帶有葡萄糖-誘發的腎小管細胞中，秋葵果實的萃取物F1至F3皆能夠顯著地降低中間絲蛋白以及AT-1蛋白質的過度表現，此外，秋葵果實的萃取物F1與F2還能夠恢復E-鈣黏素蛋白質的表現。Peng C.H.等人據此而認為秋葵果實的萃取物F1至F3可以預防糖尿病腎性上皮-間質轉變並且可供用於治療糖尿病腎病變。

就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示秋葵果實的萃取產物可被用來治療和/或預防第2型糖尿病。經研究，申請人意外地發現秋葵果實的萃取產物可以有效地在帶有高脂肪飼料/鏈佐黴素-誘發的第2型糖尿病的大鼠體內降低血漿中的葡萄糖與糖化血紅素的位準，降低血清中的三酸甘油酯、自由脂肪酸以及低密度脂蛋白的位準，並且亦可以降低胰島素抗性。因此，依據本發明之秋葵果實的萃取產物被預期可供用來治療第2型糖尿病。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種得自於秋葵果實的萃取物供應用於製備一用來治療第2型糖尿病之醫藥品的用途，其中該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合。

在第二個方面，本發明提供一種用以治療一具有或被懷疑具有第2型糖尿病的個體的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述之得自於秋葵果實的萃取物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於治療第2型糖尿病的藥物上，申請人意外地發現到：得自於秋葵果實的萃取物具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示得自於秋葵果實的萃取物供應用於製備一用來治療第2型糖尿病之醫藥品的用途。

依據本發明，得自於秋葵果實的萃取物已藉由動物試驗而被証實可以有效地在帶有高脂肪飼料/鏈佐黴素-誘發的第2型糖尿病的大鼠體內降低血漿葡萄糖與糖化血紅素的位準，以及降低胰島素抗性的產生，並且具有改善第2型糖尿病的血脂異常的效用。此外，得自於秋葵果實的萃取物亦藉由活體外試驗( in vitrotest)而被証實可以有效地保護大鼠胰臟β細胞對抗棕櫚酸鹽-誘發的細胞凋亡，進而達到治療第2型糖尿病的效用。

因此，本發明提供一種得自於秋葵果實的萃取物供應用於製備一用來治療第2型糖尿病之醫藥品的用途，其中該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性的進展(progression of severity)。

在本發明的一個較佳具體例中，該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的一水溶性萃取產物。

在本發明的另一個較佳具體例中，該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的一水不溶性萃取產物。

依據本發明，該水溶性萃取產物以及該水不溶性萃取產物是藉由一包含下列步驟的方法而被製得： (a) 以乙醇來萃取一秋葵果實，繼而移除醇溶性物質，藉此而得到一醇不溶性產物；以及 (b) 在一升高的溫度下以水來萃取步驟(a)所得到的醇不溶性產物，繼而進行一分離處理，藉此而得到一水溶性萃取產物以及一水不溶性萃取產物。

較佳地，被使用於該方法的步驟(a)中的秋葵果實有先經過清洗以及攪碎處理。

依據本發明，在該方法的步驟(a)中，乙醇萃取可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參照，例如，CN 102670673 B以及Peng C.H. et al. (2016)(同上述)。

依據本發明，在該方法的步驟(a)中，乙醇萃取是在一為25℃至30℃的溫度下被進行歷時1至2小時。在本發明的一個較佳具體例中，乙醇萃取是在一為25℃的溫度下被進行歷時2小時。

依據本發明，在該方法的步驟(a)中，移除醇溶性物質是藉由過濾或離心來進行。

依據本發明，在該方法的步驟(b)中，水萃取可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。在此方面，可以參照，例如，CN 102670673 B以及Peng C.H. et al. (2016)(同上述)。

依據本發明，在該方法的步驟(b)中，水萃取是在一為50℃至90℃的溫度下被進行歷時2至6小時。在本發明的一個較佳具體例中，水萃取是在一為90℃的溫度下被進行歷時2小時。

依據本發明，在該方法的步驟(b)中，該分離處理是選自於一由下列所構成之群組：過濾處理、離心處理、酒精沉澱處理，以及它們的組合。

依據本發明，在該方法的步驟(b)中所得到的水溶性萃取產物可進一步被進行一乾燥處理。該乾燥處理可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行，這包括，但不限於：冷凍乾燥處理(lyophilization treatment)、低溫噴霧乾燥處理(low temperature spray-drying treatment)、真空蒸發處理(vacuum evaporation treatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該水溶性萃取產物被進行一冷凍乾燥處理。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、***錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)、甜味劑(sweetening agent)、調味劑(flavoring agent)、染色試劑(coloring agent)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇[諸如乙醇、丙二醇(propanediol)、甘油、甘露糖醇(mannitol)等]的水性溶液、有機溶劑，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，當該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的水溶性萃取產物時，該溶劑是水。在本發明的另一個較佳具體例中，當該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的水不溶性萃取產物時，該溶劑是乙醇。

在本發明的一個較佳具體例中，該醫藥品是呈一粉末或細顆粒的劑型。該醫藥品可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：乳糖(lactose)、纖維素(cellulose)、高嶺土(kaolin)、木糖(xylose)以及木酮糖(xylulose)。

在本發明的另一個較佳具體例中，該醫藥品是呈一液體的劑型(諸如，溶液、懸浮液、糖漿以及濃漿)。該醫藥品可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：水、乙醇、木糖以及木酮糖。

本發明亦提供一種用以治療一具有或被懷疑具有第2型糖尿病的個體的方法，其包括對該個體投藥以一得自於秋葵果實的萃取物。

依據本發明，該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合。

依據本發明，該得自於秋葵果實的萃取物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的醫藥品的每日投藥劑量通常是0.23 mg/kg體重至0.45 mg/kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗方法： 1. 統計學分析(statistical analysis)：

在下面的實施例中所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean, SEM)”來表示。所有數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，繼而為邦弗朗尼多重比較檢定(Bonferroni’s multiple comparison test)來進行評估，俾以評估正常對照組與病理對照組之間的差異性以及病理對照組與各個治療組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是 p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例1. 製備秋葵果實( Abelmoschus esculentusfruits) 的萃取產物：

被使用於下面實施例當中的秋葵果實的萃取產物主要是參照Peng C.H. et al. (2016), Food Funct., 7:728-740當中所述的方法來製備。首先，將1公斤採自於嘉義縣農地的新鮮秋葵( Abelmoschus esculentus)的果實以去離子水洗淨，繼而使用一攪碎機(blender)(6640-022, Oster)將秋葵的果實攪碎成為顆粒狀。之後，將呈顆粒狀的秋葵果實拿來進行下面的乙醇萃取步驟：在室溫以及避光的環境下，將所得到的顆粒狀秋葵果實浸泡於4 L的95%乙醇中並予以充分混合，繼而將所形成的混合物靜置歷時2小時。接著，將該混合物以10,000 rpm來進行離心歷時30分鐘，繼而收取殘餘物(residue)並將之拿來重複進行上述乙醇萃取-離心步驟共計2次。接著，將離心後所得到的殘餘物拿來進行下面的水萃取步驟：在避光的環境下，將該殘餘物浸泡於1 L的90℃去離子水中並予以充分混合，繼而將所形成的混合物靜置歷時2小時。之後，將該混合物以10,000 rpm來進行離心歷時30分鐘，繼而收取上澄液。另外，所得到的殘餘物被拿來重複進行上述水萃取-離心步驟共計2次。接著，將所有收集到的上澄液以一冷凍乾燥機(FD-3a2d, HCS)予以冷凍乾燥歷時48小時，而得到一呈凍乾粉末(lyophilized powder)的秋葵果實的水溶性萃取物(下稱第一萃取產物)。另外，在經過第3次水萃取-離心步驟之後所得到的殘餘物(下稱第二萃取產物)亦被收集備用。 實施例 2. 秋葵果實的水溶性萃取物的高效能液相層析 (high performance liquid chromatography, HPLC) 分析：

為瞭解本發明的秋葵果實的水溶性萃取物的主要成份分佈，依據上面實施例1所得到的第一萃取產物被拿來進行高效能液相層析分析。 實驗材料：

為供比較，申請人依據習知方法來製備秋葵多糖(以下簡稱為習知的秋葵多糖)，並將它拿來進行相同的HPLC分析。有關該習知的秋葵多糖是依據CN 102670673 B當中所述的方法來進行。簡言之，將新鮮秋葵粉碎，繼而以95%乙醇進行熱萃取歷時2小時，接著將所得到的萃取溶液進行過濾並收集殘餘物。該殘餘物被重複進行上述乙醇萃取步驟共計2次。之後，將最後一次乙醇萃取步驟所得到的殘餘物以75%乙醇進行脫脂，繼而將該經脫脂的殘餘物以水進行萃取歷時2小時，接著將所得到的萃取溶液進行過濾，而得到一上澄液以及一殘餘物。收取該上澄液，而該殘餘物被重複進行上述水萃取步驟共計1次。接著，收集所有的上澄液並進行濃縮與離心以去除不溶雜質，然後加入95%乙醇來進行沉澱，繼而予以離心並收集沉澱物，接著將該沉澱物進行冷凍乾燥歷時10天，藉此而得到該習知的秋葵多糖。

為供進行HPLC分析，在上面實施例1中所得到的第一萃取產物被溶於1%氫氧化鈉溶液中以配製成一具有一濃度為10 mg/mL的待測溶液樣品，而該習知的秋葵多糖被溶於1%氫氧化鈉溶液中以配製成一具有一濃度為10 mg/mL的待測溶液樣品。由此所得到的該等待測溶液樣品被拿來進行下面的HPLC分析。 實驗方法：

本實驗所使用的HPLC分析儀器如下：ACQUITY UPLC H-Class層析系統(ACQUITY UPLC H-Class chromatographic system)(Waters)；分析管柱為PolySep-GFC-P (75 mm × 7.8 mm)串聯以PolySep-GPC-P 4000 (300 mm × 7.8 mm (Phenomenex)。而HPLC操作條件被顯示於下面的表1中。表1. HPLC的操作條件 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 操作參數 </td><td> 條件 </td></tr><tr><td> 偵測波長 </td><td> UV-280 nm </td></tr><tr><td> 移動相 </td><td> 去離子水 </td></tr><tr><td> 管柱烘箱溫度(column oven temperature) </td><td> 40℃ </td></tr><tr><td> 流速(mL/分鐘) </td><td> 0.8 </td></tr></TBODY></TABLE> 結果：

圖1顯示將依據上面實施例1所製得的第一萃取產物拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形(elution profile)。從圖1可見，本發明的秋葵果實的水溶性萃取物在第0至40分鐘的滯留期間出現有8個主要的洗提波峰(分別被標示為波峰a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7以及a8)。

圖2顯示將依據CN 102670673 B所製得的秋葵多糖拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形。從圖2可見，該秋葵多糖在第0至40分鐘的滯留期間出現有3個主要的洗提波峰(分別被標示為波峰b1、b2以及b3)。

經由比對圖1與圖2的波峰位置可清楚地發現到，依據本發明所得到的秋葵果實的水溶性萃取物的成份是明顯不同於CN 102670673 B所揭示之秋葵多糖所具者。 實施例3. 秋葵果實的萃取產物在治療第2 型糖尿病上的效用評估：

在本實施例中，申請人將上面實施例1中所得到的第一萃取產物以及第二萃取產物分別投藥給帶有高脂肪飼料/鏈佐黴素-誘發的第2型糖尿病的大鼠[high fat diet (HFD)/streptozotocin (STZ) induced type 2 diabetes in rats]，俾以評估該等秋葵果實的萃取產物在治療第2型糖尿病上的效用。 實驗材料 ： 1. 實驗動物：

在本實施例中所使用的雄性Sprague Dawley大鼠(male Sprague Dawley rats)(7週大，體重約為250±20 g)是購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co., Ltd)。這些實驗動物被隨機地分成正常對照組(normal control)(n＝8)以及糖尿病組(n＝40)，其中正常對照組大鼠被餵食以一般飼料(normal diet)[它含有51.8%玉米澱粉(corn starch)、20%酪蛋白(casein)、12%玉米油(corn oil)、6%蔗糖(sucrose)、5%纖維素(cellulose)、4%礦物質預混料(mineral premix)(購自於Bio Serv)、1%維生素預混料(vitamin premix)(購自於Bio Serv)以及0.2%膽鹼(choline)]，而糖尿病組大鼠被餵食以高脂肪飼料(high fat diet)[它含有37.8%玉米澱粉、20%酪蛋白、25.9%玉米油、6%蔗糖、5%纖維素、4%礦物質預混料、1%維生素預混料、0.2%膽鹼以及0.1%膽固醇(cholesterol)]。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在25℃以及相對濕度維持在55±5%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的一切實驗程序是由中山醫學大學的動物模型實驗倫理委員會(Animal Model Experimental Ethics Committee of Chung Shan Medical University)所認可，並依據美國國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)來進行。 實驗方法 ： A. 第 2 型糖尿病的誘發 (Induction of Type 2 diabetes mellitus) ：

有關於第2型糖尿病的誘發是參考Peng C.H. et al. (2009), J. Agric. Food Chem., 57:8812-8819當中所述的方法來進行，並作部分修改。在經歷2個月的高脂肪飼料餵食之後，將配於0.5 mL的0.1 M檸檬酸緩衝液(citric acid buffer)(pH 4.5)中的鏈佐黴素(streptozotocin, STZ)(購自於Sigma)(劑量為35 mg/kg)腹腔注射(intraperitoneal injection)至糖尿病組大鼠體內。另外，在經歷2個月的一般飼料餵食之後，將0.5 mL的0.1 M檸檬酸緩衝液(pH 4.5)腹腔注射至正常對照組大鼠體內。 B. 秋葵果實的萃取產物的投藥：

首先，在STZ注射之後的第14天，將糖尿病組大鼠隨機地分成5組(每組n=8)，其中包括4個治療組(亦即第一萃取產物治療組1與2、第二萃取產物治療組1與2)以及1個病理對照組(pathological control)。接著，對在上面實施例1中所得到的第一萃取產物以及第二萃取產物各取適量並分別配於0.5 mL的二次水(ddH ₂O)中，接著將所形成的第一與第二萃取產物溶液分別口服投藥給各個治療組大鼠，而有關各個治療組大鼠的投藥劑量係如下面表2所示。各個治療組大鼠每天被投藥一次，直至在STZ注射之後的第97天結束之時。至於病理對照組以及正常對照組的大鼠則不作任何處理。表2. 各組大鼠被口服投藥的萃取產物以及劑量 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 組別 </td><td> 萃取產物 </td><td> 劑量(mg/kg/天) </td></tr><tr><td> 正常對照組 </td><td> － </td><td> － </td></tr><tr><td> 病理對照組 </td><td> － </td><td> － </td></tr><tr><td> 第一萃取產物治療組1 </td><td> 第一萃取產物 </td><td> 0.23 </td></tr><tr><td> 第一萃取產物治療組2 </td><td> 第一萃取產物 </td><td> 0.45 </td></tr><tr><td> 第二萃取產物治療組1 </td><td> 第二萃取產物 </td><td> 0.23 </td></tr><tr><td> 第二萃取產物治療組2 </td><td> 第二萃取產物 </td><td> 0.45 </td></tr></TBODY></TABLE>C. 生物樣品的製備：

在STZ注射之後的第13、27、41、55、69以及83天，令各組大鼠經歷至少8小時的隔夜禁食(overnight fasting)，接著對各組大鼠進行採血，繼而依據上面第B項所述來進行口服投藥。有關採血的步驟係如下所述：首先，藉由靜脈穿刺而從各組大鼠的尾部靜脈來採集血液，並以EDTA (BD Vacutainer)作為抗凝血劑(anticoagulants)。接著，在4℃下以3,000 rpm予以離心歷時10分鐘，由此所得到的血漿樣品被拿來進行下面第D以及E項的實驗。另外，在STZ注射之後的第97天，令各組大鼠經歷至少8小時的隔夜禁食，然後使用針筒而從各組大鼠的心臟抽取5 mL的血液，一部分由此所得到的血液樣品被拿來進行下面第F項的實驗。取一部分的血液樣品於4℃下以3,000 rpm進行離心歷時10分鐘，由此所得到的血清樣品被拿來進行下面第G至I項的實驗。 D. 血漿葡萄糖濃度的測定 ( determination of plasma glucose concentration) ：

在上面第C項中所得到之各組大鼠的血漿樣品是使用一福爾倍康血糖機(TD-4272A, Fora)來進行血漿中葡萄糖濃度(mg/dl)的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 E. 恆定模式評估胰島素抗性的測定 [ determination of homeostatic model assessment insulin resistance (HOMA-IR)] ：

在上面第C項中所得到之正常對照組、病理對照組、第一萃取產物治療組2以及第二萃取產物治療組2的血漿樣品是依據製造商的操作指南使用大鼠胰島素酵素免疫分析套組(rat insulin enzyme immunoassay kit)(SPI-BIO, Cat. No. A05105)，並於405 nm的波長下以一ELISA讀取儀(Spec384, Molecular Device)來測量各組大鼠的血漿樣品的吸光值(OD ₄₀₅)。將所得到的OD ₄₀₅吸光值根據預先以具有不同已知濃度的胰島素相對於它們自身的OD ₄₀₅吸光值所作出的一標準曲線而被換算成胰島素濃度(μU/mL)。有關恆定模式評估胰島素抗性(HOMA-IR)是以所測得的血漿中胰島素濃度以及將上面第D項中所測得的血漿中葡萄糖濃度換算成莫耳濃度(nmol/L)後代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A ＝ (B ×C)/22.5其中：A＝恆定模式評估胰島素抗性(HOMA-IR) B＝各個取樣時間點所分別測得的血漿中葡萄糖濃度(nmol/L) C＝各個取樣時間點所分別測得的血漿中胰島素濃度(μU/mL) F. 糖化血紅素的測定 [ determination of hemoglobin A1c (HbA1c)] ：

依據上面第C項中所得到之各組大鼠的血液樣品是委託新國泰醫事檢驗所來進行血液中糖化血紅素(%)的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 G. 血清三酸甘油酯濃度的測定 (determination of serum triglyceride concentration) ：

在上面第C項中所得到之各組大鼠的血清樣品是依據製造商的操作指南使用Triglycerides Liquicolor ^Mono套組(Human, Cat. No. 10724)，並以一Olympus AU-2700全自動生化分析儀來進行分析血清中三酸甘油酯濃度(mg/dl)的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 H. 血清自由脂肪酸濃度的測定 (determination of serum free fatty acid concentration) ：

在上面第C項中所得到之各組大鼠的血清樣品是依據製造商的操作指南使用非酯化脂肪酸分析套組[non-esterified fatty acids (NEFA) assay kit](RANDOX, Cat. No. FA115)，並以一Olympus AU-2700全自動生化分析儀來進行分析血清中自由脂肪酸濃度(mmol/L)的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 I. 血清低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白濃度的測定 [ determination of serum low-density lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HDL) concentration] ：

血清中的低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白的濃度是將上面第C項中所得到之各組大鼠的血清樣品分別依據製造商的操作指南使用LDL CHOLESTEROL liquicolor套組(Human, Cat. No. 10094)以及HDL CHOLESTEROL liquicolor套組(Human, Cat. No. 10084)，並以一Olympus AU-2700全自動生化分析儀來進行分析血清中低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白的濃度(mg/dl)的測定。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

有關高密度脂蛋白/低密度脂蛋白濃度比率(HDL/LDL concentration rate)是以所測得之各組大鼠的血清中高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白濃度(mg/dl)代入下列公式(2)而被計算出：公式 (2) ： D ＝ E /F其中：D＝HDL/LDL濃度比率 E＝血清中高密度脂蛋白濃度(mg/dl) F＝血清中低密度脂蛋白濃度(mg/dl) 結果： A. 血漿葡萄糖濃度的測定：

圖3顯示在STZ注射之後的第14、28、42、56、70以及84天，各組大鼠所測得的血漿中葡萄糖濃度。從圖3可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血漿中的葡萄糖濃度有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的血漿葡萄糖濃度異常升高。在STZ注射之後的第56天之時，與病理對照組相較之下，第一萃取產物治療組2的大鼠的血漿中的葡萄糖濃度開始呈現下降的情形。另外，在STZ注射之後的第70天與第84天之時，與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血漿中的葡萄糖濃度都有降低，其中又以第一萃取產物治療組2的大鼠的血漿中的葡萄糖濃度有顯著的降低。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物可以治療第2型糖尿病並且具有降低血漿葡萄糖位準的效用。 B. 恆定模式評估胰島素抗性 (HOMA-IR) 的測定：

圖4顯示在STZ注射之後的第14、28、42、56、70以及84天，各組大鼠所測得的血漿中恆定模式評估胰島素抗性。從圖4可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血漿中的恆定模式評估胰島素抗性有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們產生胰島素抗性。另外，在STZ注射之後的第56天起，與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血漿中的恆定模式評估胰島素抗性開始呈現下降的情形。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物可以治療第2型糖尿病並且具有降低胰島素抗性的效用。 C. 糖化血紅素 (HbA1c) 的測定：

圖5顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血液中糖化血紅素。從圖5可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血液中的糖化血紅素有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的糖化血紅素異常增加。而與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血液中的糖化血紅素都有顯著的降低。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物可以治療第2型糖尿病並且具有降低糖化血紅素位準的效用。 D. 血清三酸甘油酯濃度的測定：

圖6顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中三酸甘油酯濃度。從圖6可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的三酸甘油酯濃度有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的血清三酸甘油酯代謝異常。而與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血清中的三酸甘油酯濃度都有顯著的降低。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物具有降低血清三酸甘油酯位準的效用。 E. 血清自由脂肪酸濃度的測定：

圖7顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中自由脂肪酸濃度。從圖7可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的自由脂肪酸濃度有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的血清自由脂肪酸代謝異常。而與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血清中的自由脂肪酸濃度都有顯著的降低。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物具有降低血清自由脂肪酸位準的效用。 F. 血清低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白濃度的測定：

圖8顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中低密度脂蛋白濃度。從圖8可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的低密度脂蛋白濃度有顯著的升高，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的血清低密度脂蛋白代謝異常。而與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血清中的低密度脂蛋白濃度都呈現下降的情形，其中又以第二萃取產物治療組2的大鼠的血清中的低密度脂蛋白濃度有顯著的降低。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物具有降低血清低密度脂蛋白位準的效用。

圖9顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中高密度脂蛋白濃度。從圖9可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的高密度脂蛋白濃度有顯著的降低，這表示HFD/STZ會成功地誘發大鼠產生第2型糖尿病並且造成牠們的血清高密度脂蛋白代謝異常。而與病理對照組相較之下，各個治療組的大鼠的血清中的高密度脂蛋白濃度都呈現升高的情形。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物具有增加血清高密度脂蛋白位準的效用。

圖10顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中高密度脂蛋白/低密度脂蛋白(HDL/LDL)濃度比率。從圖10可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的大鼠的血清中的HDL/LDL濃度比率有顯著的降低。而與病理對照組相較之下，第一萃取產物治療組2以及第二萃取產物治療組2的大鼠的血清中的HDL/LDL濃度比率有顯著的增加。這個實驗結果顯示：秋葵果實的萃取產物具有改善第2型糖尿病的血脂異常的效用。

綜合以上的實驗結果可知：秋葵果實的萃取產物可以有效地在帶有高脂肪飼料/鏈佐黴素-誘發的第2型糖尿病的大鼠體內降低血漿葡萄糖、糖化血紅素、血清中三酸甘油酯、自由脂肪酸以及低密度脂蛋白的位準，並且亦可以增加高密度脂蛋白的位準以及降低胰島素抗性的產生。因此，申請人認為：秋葵果實的萃取產物可供用於治療第2型糖尿病。 實施例4. 秋葵果實的水溶性萃取物對於棕櫚酸鹽- 誘發的細胞凋亡(Palmitate-induced apoptosis) 的影響：

於本實施例中，申請人分別使用秋葵果實的水溶性萃取物以及秋葵多糖來對大鼠胰臟β細胞進行處理，並探討它們對於棕櫚酸鹽-誘發的細胞凋亡的影響。 實驗材料： 1. 大鼠胰臟β細胞株(rat pancreatic β cell line) RIN-m5F的來源與培養：

在本實施例中所使用的大鼠胰臟β細胞株RIN-m5F (BCRC 60410)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center, BCRC)。

RIN-m5F細胞被培養於含有RPMI 1640培養基(Gibco, Cat. No. 31800-022)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、2 mM L-麩胺醯胺(L-glutamine)、1.5 g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、4.5 g/L葡萄糖(glucose)、10 mM HEPES以及1 mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)]的10 cm培養皿(petri dish)中，並在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養。當細胞密度達到約80%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline, PBS)來清洗細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA (trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養箱中進行培養。 2. 第一萃取產物的儲備溶液(stock solution)的製備：

將5 mg之依據上面實施例1中所得到之呈凍乾粉末的第一萃取產物溶於995 μL的滅菌水中，繼而予以加熱歷時10分鐘以使粉末完全溶解，然後使用一為0.22 μm的濾膜來進行過濾，以配製成一具有一濃度為5 mg/mL的儲備溶液備用。 3. 秋葵多糖的儲備溶液的製備：

將5 mg之依據CN 102670673 B所製得之呈凍乾粉末的秋葵多糖溶於995 μL的滅菌水中，繼而予以加熱歷時10分鐘以使粉末完全溶解，並且使用一為0.22 μm的濾膜過濾，以配製成一具有一濃度為5 mg/mL的儲備溶液備用。 實驗方法：

首先，將RIN-m5F細胞分成4組，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組以及2個實驗組(亦即實驗組1與2)。將各組細胞分別以一為2×10 ⁶細胞的數量培養於含有10 mL的RPMI 1640培養基的10-cm培養皿中，接著在培養箱(37℃、5% CO ₂)中進行培養歷時24小時。

之後，將各組的細胞培養物分別更換以新鮮的RPMI 1640培養基(添加有10% FBS、2 mM L-麩胺醯胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES以及1 mM丙酮酸鈉)，接著將100 μM棕櫚酸鹽(palmitate)添加至病理對照組以及各個實驗組的細胞培養物中，俾以誘發細胞凋亡(cell apoptosis)的產生。至於正常對照組則不作任何處理。另外，實驗組1的細胞培養物同時被添加以適量之第一萃取產物的儲備溶液，而使得實驗組1具有一最終濃度為1 µg/mL的第一萃取產物，實驗組2的細胞培養物同時被添加以適量之秋葵多糖的儲備溶液，而使得實驗組2具有一最終濃度為1 µg/mL的秋葵多糖。而正常對照組以及病理對照組則不添加任何萃取物。

各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO ₂)中進行培養歷時24小時後，移除各培養皿中的液體，並以PBS予以清洗2次，並分別加入0.5 mL的RIPA溶解緩衝液(RIPA lysis buffer)(BB-40, BioKit Biotechnology Inc.)[添加有1錠劑(tablet)/10 mL的蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)(Roche, Cat. No. 04693159001)以及2.5 µL的磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)(Folibio Technology Co., Ltd., Cat. No. B14001)]予以充分混合。將所形成的細胞混合物置於微量離心管中，並在4℃下以一均質機(Eyela Nazelax)予以研磨歷時3分鐘。之後，使用5415D高速離心機(Eppendorf)以10,000 g予以離心歷時10分鐘，然後收集上澄液並以此作為總蛋白質樣品，接著藉由Bio-Rad蛋白質分析套組(Bio-Rad, Cat. No. 500-0002)來測定總蛋白質濃度。

之後，各組細胞的總蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析以及西方墨點分析(Western Blotting)，其中各組細胞的總蛋白質樣品是針對經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3來進行西方墨點分析。另外，β-肌動蛋白被用來作為內部對照組(internal control)。

有關SDS-PAGE分析以及西方墨點分析所使用的儀器與試劑分別如下所述： (1) SDS-PAGE分析是使用Bio-Rad電泳槽(Bio-Rad, Cat. No. 1653301)來進行。 (2) 蛋白質轉印(protein transfer)是使用Bio-Rad蛋白質轉印套組(Bio-Rad, Cat. No. 1703930)以及聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane](Millipore, Cat. No. IPVH00010)來進行。 (3) 在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表3中。表3. 用於進行西方墨點分析的一次抗體與二次抗體 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 蛋白質 </td><td> 一次抗體 </td><td> 二次抗體 </td></tr><tr><td> 經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3 </td><td> 兔子抗半胱-天冬胺酸蛋白酶-3多株抗體(rabbit anti caspase-3 polyclonal antibody)(Santa Cruz, Cat. No. sc-7148) </td><td> 山羊抗兔子IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體[goat anti rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) antibody] (Novus, Cat. No. HAF008) </td></tr><tr><td> β-肌動蛋白 </td><td> 小鼠抗β-肌動蛋白單株抗體(mouse anti β-actin monoclonal antibody)(Sigma-Aldrich, Cat. No. A5316) </td><td> 山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化氫酶(HRP)抗體(Novus, Cat. No. HAF007) </td></tr></TBODY></TABLE>(4) 化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用西方閃光系列HRP化學發光受質(western lightning series HRP chemiluminescence substrates)(PerkinElmer, Cat. No. NEL105)來進行，並使用LAS-4000 mini成像系統(LAS-4000 mini imaging system)(Fujifilm, Tokyo, Japan)來偵測訊號。

之後，使用Fujifilm Multi Gauge Ver2.0成像軟體來進行分析，藉此蛋白質帶(protein band)能夠被半-定量地計算出所對應的蛋白質表現量，各組的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量接而以其所對應的β-肌動蛋白蛋白質表現量來予以標準化(normalized)，然後將正常對照組之經標準化的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量當作100%，而其他各組相對於正常對照組的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量百分比可被計算出來。之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 結果：

圖11顯示經棕櫚酸鹽-誘發的細胞凋亡的各組細胞培養物藉由西方墨點分析所測得的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現情形。從圖11可見，病理對照組的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量相較於正常對照組所具者有顯著的升高，這表示棕櫚酸鹽會誘發細胞產生細胞凋亡。另外，實驗組1的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量相較於病理對照組所具者有顯著的下降，至於實驗組2的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現量相較於病理對照組所具者則無顯著的差異。依據這個實驗結果，申請人認為：使用秋葵果實的第一萃取產物來對大鼠胰臟β細胞進行處理能有效地保護細胞對抗棕櫚酸鹽-誘發的細胞凋亡，因而被預期可以達到治療第2型糖尿病的效用。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示將秋葵果實的第一萃取產物拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形(elution profile)，其中波峰a1至a8表示在第0至40分鐘的滯留期間所出現的8個主要成份；圖2顯示將依據CN 102670673 B所製得的秋葵多糖拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形，其中波峰b1至b3表示在第0至40分鐘的滯留期間所出現的3個主要成份；圖3顯示在STZ注射之後的第14、28、42、56、70以及84天，各組大鼠所測得的血漿中葡萄糖濃度，其中“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；以及“***”表示當與病理對照組作比較， p＜0.001；圖4顯示在STZ注射之後的第14、28、42、56、70以及84天，各組大鼠所測得的血漿中恆定模式評估胰島素抗性(HOMA-IR)，其中“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖5顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血液中糖化血紅素，其中“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及“***”表示當與病理對照組作比較， p＜0.001；圖6顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中三酸甘油酯濃度，其中“##”表示當與正常對照組作比較， p＜0.01；以及“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖7顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中自由脂肪酸濃度，其中“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖8顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中低密度脂蛋白濃度，其中“##”表示當與正常對照組作比較， p＜0.01；以及“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；圖9顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中高密度脂蛋白濃度，其中“##”表示當與正常對照組作比較， p＜0.01；“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05；以及“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；圖10顯示在STZ注射之後的第98天，各組大鼠所測得的血清中高密度脂蛋白/低密度脂蛋白(HDL/LDL)濃度比率，其中“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；以及“**”表示當與病理對照組作比較， p＜0.01；以及圖11顯示經棕櫚酸鹽-誘發的RIN-m5F細胞凋亡的各組細胞培養物藉由西方墨點分析所測得的經活化的半胱-天冬胺酸蛋白酶-3的表現情形，其中正常對照組表示未經任何處理的細胞；病理對照組表示被處理以100 μM棕櫚酸鹽的細胞；實驗組1表示被處理以1 µg/mL的第一萃取產物的細胞；實驗組2表示被處理以1 µg/mL之依據CN 102670673 B所製得的秋葵多糖的細胞；“###”表示當與正常對照組作比較， p＜0.001；以及“***”表示當與病理對照組作比較， p＜0.001。

Claims

一種得自於秋葵果實的萃取物供應用於製備一用來治療第2型糖尿病之醫藥品的用途，其中該得自於秋葵果實的萃取物是選自於下列所構成的群組：秋葵果實的一水溶性萃取產物、秋葵果實的一水不溶性萃取產物以及它們的組合，其中該水溶性萃取產物以及該水不溶性萃取產物是藉由一包含下列步驟的方法而被製得：(a)以乙醇來萃取一秋葵果實，繼而移除醇溶性物質，藉此而得到一醇不溶性產物；以及(b)在一升高的溫度下以水來萃取步驟(a)所得到的醇不溶性產物，繼而進行一分離處理，藉此而得到一水溶性萃取產物以及一水不溶性萃取產物。
如請求項1的用途，其中在該方法的步驟(a)中，移除醇溶性物質是藉由過濾或離心來進行。
如請求項1的用途，其中在該方法的步驟(b)中，水萃取是在一為50℃至90℃的溫度下被進行歷時2至6小時。
如請求項1的用途，其中在該方法的步驟(b)中，該分離處理是選自於一由下列所構成之群組：過濾處理、離心處理、酒精沉澱處理，以及它們的組合。
如請求項1的用途，其中該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的一水溶性萃取產物。
如請求項1的用途，其中該得自於秋葵果實的萃取物是秋葵果實的一水不溶性萃取產物。
如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。