TWI617573B - 用於酵素置換療法的改造酵素 - Google Patents

用於酵素置換療法的改造酵素 Download PDF

Info

Publication number
TWI617573B
TWI617573B TW105124932A TW105124932A TWI617573B TW I617573 B TWI617573 B TW I617573B TW 105124932 A TW105124932 A TW 105124932A TW 105124932 A TW105124932 A TW 105124932A TW I617573 B TWI617573 B TW I617573B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
enzyme
residue
glucuronidase
human
modified
Prior art date
Application number
TW105124932A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201718628A (zh
Inventor
傅倫 羅
Steve Roffler
莊懷堯
Huai Yao Chuang
Original Assignee
中央研究院
Academia Sinica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中央研究院, Academia Sinica filed Critical 中央研究院
Publication of TW201718628A publication Critical patent/TW201718628A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI617573B publication Critical patent/TWI617573B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01076—L-Iduronidase (3.2.1.76)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一種改造酵素，包含與人類β-葡萄糖醛酸苷酶的胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，其中與該人類β-葡萄糖醛酸苷酶相比，該改造酵素顯示出更高量的α-己醛醣酸鹽水解酶活性。

Description

用於酵素置換療法的改造酵素 【相關申請案的交互引用文獻】
本申請案主張於2015年8月6日申請的美國臨時申請案申請號62/201,889的優先權，其內容透過引用的方式整體併入本文。
本發明係有關於一種酵素，特別是關於一種用於酵素置換療法的改造酵素。
溶酶體貯積症(lysosomal storage disorders，LSD)包括超過50種不同的疾病，具有廣泛的臨床表現型，以及在活產新生兒中總發生率為1/7000。不同的溶酶體貯積症(LSDs)由不同溶酶體酶的遺傳缺陷所引起，導致未經處理的糖胺聚醣(glycosaminoglycans，GAG)的累積與漸近性組織損傷。酵素置換療法(enzyme replacement therapy，ERT)為許多溶酶體貯積症提供了有效的治療，並且被美國食品及藥物管理局批准用於治療第I型、第II型、第IV型黏多醣症(mucopolysaccharidosis，MPS)、第I型高歇氏病(Gaucher disease)，以及法布里氏病(Fabry disease)。酵素置換療法(ERT)包括靜脈注射治療性酵素以補充缺乏或缺陷的酵素，進而清除累積的代謝物。
施用重組酵素可以在缺乏或具有截短型內生性酵素的患者 體內誘導免疫反應。事實上，在酵素置換療法(ERT)患者的血清中發現抗治療性酵素的抗體，其頻率範圍為：高歇氏病為15%、法布里氏病為55-80%、第I型黏多醣症為91%、第IV型黏多醣症為97%，以及龐貝氏症(Pompe disease)為100%。越來越多的證據表明，患者體內的抗體反應會阻礙酵素置換療法(ERT)的功效。例如，在龐貝氏病中，蛋白質含量、抗體反應，以及治療結果之間存在明確的關係。在完全不具有酸性α-葡萄糖苷酶的患者體內發現具有抗該酵素的高抗體力價，而且在酵素置換療法(ERT)期間顯現出對酵素吸收和活性的抑制現象。其他研究也顯示在法布里病和龐貝氏症患者中有類似的結果。在第I型黏多醣症的動物模型中，亦有報告指出抗α-L-己醛醣酸鹽水解酶的特異性抗體會降低酵素置換療法(ERT)的治療功效。經由以免疫抑制藥物治療患者所誘導出的免疫耐受性，顯示可增加該患者的組織酵素含量以及降低GAG的含量。在第I型黏多醣症的患者體內因為抗體介導之酵素吸收的抑制現象，也與較差的生物標記反應強烈相關，這可能暗示在臨床結果中的重要角色。危及生命的過敏反應也發生在接受重組人類α-己醛醣酸鹽水解酶(英文藥名為laronidase)的患者中。這些研究凸顯了在酵素置換療法(ERT)臨床使用中保持對重組酵素之最小免疫反應的重要性。
溶酶體貯積症(LSDs)通常在個體患者中是異質性的，因此難以達成通用的去免疫化方法，例如去除治療性蛋白質的免疫原性的抗原決定位。克服針對重組酵素的抗體反應的現行方法主要集中於誘導免疫耐受性。然而，因為該方法通常結合高劑量的免疫抑制藥物，所以這可能對患者是有害的。而且感染及惡性腫瘤風險的增加也是令人擔心的。
於一發明態樣，本文描述一種改造酵素，其包括與一人類β-葡萄糖醛酸苷酶的胺基酸序列至少80%相同的一胺基酸序列，其中與該人類β-葡萄糖醛酸苷酶相較，該改造酵素顯現出一較高量的α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性。
在一具體實施例中，人類β-葡萄糖醛酸苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，且該改造酵素可以在如SEQ ID NO：2所示的序列中對應於殘基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606或P636的至少一個殘基處具有取代。例如，該改造酵素可以具有殘基S484、D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。在另一個實例中，該改造酵素具有殘基H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604，及/或F606。或者，該改造酵素可具有殘基D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、D598、T604、F606，及/或S636。該改造酵素可用於治療患有與缺陷酵素相關之疾病的受試者，例如患有黏多醣症的受試者。
於另一發明態樣，本文描述了發展用於在具有與缺陷酵素相關之疾病的受試者中治療該疾病的候選酵素置換療法。該方法包括選擇模板酵素，其中該模板酵素對該受試者而言是內源性及/或非免疫原性的，且在該受試者體內正常地表現，並且改造該模板酵素以獲得一改造酵素，其中，與模板酵素的活性相較，該改造酵素顯現出增加的目標酵素活性，該 目標酵素活性是該缺陷酵素的野生型對應物的酵素活性；其中該改造酵素為用於治療該疾病的候選酵素置換療法。
在附圖及以下的描述中闡述了一個或多個具體實施例的細節。具體實施例的其他特徵、目的和優點將從描述及附圖中，以及從申請專利範圍中變得明顯。
第一圖為用於酵素置換療法的「隱形匿蹤」酵素之概念的圖式。野生型α-己醛醣酸鹽水解酶(IDUA)可在黏多醣症(MPS)第I型患者體內產生特異性抗體，其可抑制治療效果，甚至引起危及生命的過敏反應。改變其活性位點以顯示α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性的β-葡萄糖醛酸苷酶(Beta-glucuronidase，βG)變體，可表現為正常的免疫耐受自身蛋白，因此能夠預防及/或最小化抗體反應，從而保持治療活性及減少副作用。人類免疫球蛋白G(150kDa)、α-己醛醣酸鹽水解酶(83kDa)，以及β-葡萄糖醛酸苷酶(78kDa)的大小未按比例繪製。
第二圖為可裂解之表面系鏈酵素多用途篩選系統(enzyme cleavable surface tethered all-purpose screening system，ECSTASY)的應用說明。(1)將β-葡萄糖醛酸苷酶變體的庫選殖到反轉錄病毒載體中，其編碼一信號肽、一HA標籤、一6x His標籤、一酵素變體、一myc標籤，以及人類DAF的C-端37個胺基酸。(2)透過在低感染複數的條件下對HEK293細胞進行反轉錄病毒轉導作用，以產生表現一種GPI錨定的β-葡萄糖醛酸苷酶變體的庫細胞。(3、4)以抗β-葡萄糖醛酸苷酶-FITC共軛物對細胞進行免疫螢光染色，以鑑定在其表面上表現β-葡萄糖醛酸苷酶的細胞。進行螢光活化 細胞的區分，即以低免疫螢光染色判斷，以快速去除表現折疊錯誤或不穩定的酵素變體的細胞。(5)將陽性細胞單獨區分至96孔微量盤中，使其生長至完全長滿。(6)藉由PI-PLC裂解作用自細胞釋放表面系鏈的酵素變體。(7)含有可溶性酵素變體的上清液以ELISA測量酵素濃度，並以螢光測定法測量酵素活性。(8)透過DNA改組或位點飽和突變誘發作用，使獲選之具有較高活性的突變體可作為新一代庫的模板。
第三圖為顯示人類β-葡萄糖醛酸苷酶對α-己醛醣酸鹽水解酶基質MUI展現可測量活性的一系列圖組。重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶係從人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷型細胞(34/2000，衍生自第I型黏多醣貯積症患者)中純化，並與250μM α-己醛醣酸鹽水解酶基質4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽(MUI)在0.2M甲酸鹽緩衝液，pH 3.5，在37℃下作用1或17小時。(A)在355nm的激發波長以及460nm的發射波長下檢測螢光。MUI水解為4-甲基繖形酮(4-MU)的作用也透過在以20%甲醇(pH 4)平衡的LiChroprep RP18(40-63μm)管柱上的固相提取/高效液相色層分析法檢測。以二次蒸餾水配置之25%甲醇(pH 4)洗提單獨的MUI(B)以及與人類β-葡萄糖醛酸苷酶作用的MUI(C)。以二次蒸餾水配置之25%甲醇(pH 4)洗提未與α-己醛醣酸鹽水解酶作用(D)或與α-己醛醣酸鹽水解酶作用(E)的市售MUI(未純化的)。
第四圖為合成庫的構建示意圖。全長的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體庫係由5固DNA片段(F0-F4)組合而成，各片段之間有18個核苷酸重疊。F0片段含有一個Apa I選殖位點以及一個沉默突變以去除一個獨特的Bgl II酶切位點。透過引子組合，隨後並以PCR擴增構建F2及F3片段，這二 個片段在第19個位置上含有可變胺基酸。F4片段含有Sal I選殖位點。將所有的片段以等莫耳比混合並以PCR擴增以獲得全長人類β-葡萄糖醛酸苷酶庫。庫連接後，以Bgl II限制酶解作用去除野生型DNA。
第五圖為顯示以ECSTASY篩選人類β-葡萄糖醛酸苷酶合成庫的篩選實例的一系列圖組。A.將293和293/L1細胞以7G8-FITC染色，並在流式細胞儀上分析表面人類β-葡萄糖醛酸苷酶的表現(虛線，16%)。將表現出人類β-葡萄糖醛酸苷酶表現量最高的細胞(實線，6.8%)，以單細胞分選至96孔微量盤中，以用於隨後的篩選。B.以PI-PLC從各個293/L1選殖株酶切出GPI錨定的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體。在pH 3.5環境下，測量上清液中4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽水解苷(MUI)的水解。蛋白質含量透過三明治ELISA進行定量。野生型與β-葡萄糖醛酸苷酶變體分別以實心及空心的圓形來表示。C.每個β-葡萄糖醛酸苷酶變體的特異性活性以每毫微克(ng)蛋白的相對螢光單位(relative fluorescence unit，RFU)表示。
第六圖為顯示表現出α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性的β-葡萄糖醛酸苷酶變體特性分析的圖式。將重組野生型和β-葡萄糖醛酸苷酶變體在pH 3.5的環境下與4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽(MUI)作用，並檢測相對螢光。
第七圖為顯示表現出α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性的β-葡萄糖醛酸苷酶變體特性分析的一圖組。將人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷型細胞(34/2000，衍生自第I型黏多醣貯積症患者)與Na2 35SO4一起作用，以放射性標記糖胺聚醣。然後以5μg/ml重組酵素處理細胞72小時。A.與未處理的細胞相比，細胞裂解物之減少的放射性以平均值±SD表示(白色柱狀圖)。 B.與未處理的細胞相比，上清液之增加的放射性以平均值±SD表示(黑色柱狀圖)。
第八圖為顯示表現出α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性的β-葡萄糖醛酸苷酶變體特性分析的圖式。以5μg/ml重組酵素處理人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷細胞72小時，並以Lysotracker-Red DND-99染劑染色溶酶體。每個細胞的溶酶體螢光以平均值±SEM表示。透過雙尾t檢驗並顯示與未處理細胞比較的統計上顯著差異。*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；n.s.：無顯著差異(n=3)。
第九圖為顯示人類β-葡萄糖醛酸苷酶轉基因小鼠的建立的一組數據。A.顯示用於產生表現人類β-葡萄糖醛酸苷酶的轉基因小鼠的pCAG-hβG質體的圖式。B.透過基因組PCR(230bp)進行新生小鼠的基因分型。PC：正對照組。NC：負對照組。C.從小鼠尾部萃取的總蛋白，在10%SDS-PAGE上進行電泳，並以抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶(抗-hβG)抗體以及抗β-肌動蛋白抗體進行免疫墨點分析。
第十圖為顯示轉殖人類β-葡萄糖醛酸苷酶的轉基因小鼠中，改造β-葡萄糖醛酸苷酶免疫原性評估的一系列圖組。A、B，及C.每組三隻轉殖人類β-葡萄糖醛酸苷酶的轉基因小鼠，每三週以靜脈注射分別注射50μg小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶、50μg人類α-己醛醣酸鹽水解酶，或50μg人類β-葡萄糖醛酸苷酶。以ELISA測定每週血清樣品中抗各自蛋白質的抗體。D.每組三隻轉殖人類β-葡萄糖醛酸苷酶的轉基因小鼠，每三週以靜脈注射50μg所指示的重組蛋白，共注射4次。將血清樣品稀釋1000倍，並以ELISA測量抗體反應。注射人類α-己醛醣酸鹽水解酶的小鼠與注射其它蛋白質的小 鼠中的抗體反應之間顯現出顯著差異。**，p<0.001。
本文描述了可用於酵素置換療法的改造酵素以及發展酵素置換療法之方法。
模板酵素的酵素活性或特異性被發現可以在該模板酵素的結構或序列沒有顯著改變的情況下，至少部分地轉換為另一種酵素的酵素活性或特異性。
因此，本文描述了從人類β-葡萄糖醛酸苷酶模板(例如野生型β-葡萄糖醛酸苷酶)產生的改造酵素，其展現出比該人類β-葡萄糖醛酸苷酶模板較高量的α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性。該改造酵素與該β-葡萄糖醛酸苷酶模板具有高胺基酸序列一致性(例如至少80%、85%、90%、95%、97%或99%)，但與人類α-己醛醣酸鹽水解酶具有非常低的序列一致性。
以下提供了人類β-葡萄糖醛酸苷酶與人類α-己醛醣酸鹽水解酶的示例性核酸及胺基酸序列。
人類β-葡萄糖醛酸苷酶核酸序列(SEQ ID NO：1)：
人類β-葡萄糖醛酸苷酶胺基酸序列(SEQ ID NO：2)
人類α-己醛醣酸鹽水解酶核酸序列(SEQ ID NO：3)
人類α-己醛醣酸鹽水解酶胺基酸序列(SEQ ID NO：4)
該改造酵素可以具有與如SEQ ID NO：2所示的序列至少80%相同的胺基酸序列，並且在對應於在如SEQ ID NO：2所示的序列(例如，透過序列比對確定)中由位置204、279、438、484、502、503、504、506、508、509、542、545、565、587、592、594、595、598、600、603、 604、606以及636組成的位置群組的一個或多個位置包括胺基酸取代。例如，該改造酵素可以在一個或多個上述的23個位置具有相應的野生型殘基(如SEQ ID NO：2中所示)，或任何其它胺基酸(例如A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V或其類似物)。
在一具體實施例中，該改造酵素具有與如SEQ ID NO：2所示的序列至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的胺基酸序列。
在一具體實施例中，該改造酵素具有一胺基酸序列，其中，與SEQ ID NO：2的序列相比，相應的位置204為T或K；位置279為Q或H；位置438為K或M；位置484為S、D、H、R或C；位置502為N、D或K；位置503為A、D、Y、P或V；位置504為Y、G或C；位置506為S或G；位置508為Y或D；位置509為H、A或P；位置542為G或D；位置545為T或A；位置565為L或A；位置587為W或T；位置592為F或Y；位置594為T或L；位置595為L、V、Q或G；位置598為P或D；位置600為R或A；位置603為G或E；位置604為Y、S、A或T；位置606為Q、F或L；並且位置636為P或S。在一具體實施例中，根據表1或表2(參見下文)進行該改造酵素胺基酸的胺基酸殘基的取代作用。
例如，與如SEQ ID NO：2所示的序列相比，該改造酵素可以具有以下改變的/取代的殘基：S484、D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。另一個示例性改造酵素具有以下改變的殘基：H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604及/或F606。另一種改造酵素可具有以下改變的殘基：D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、 D598、T604、F606及/或S636。
在野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶(例如，SEQ ID NO：2)中的某些殘基可以是改變其酵素活性的特定目標，例如N484、N502、S503、S506、H509、F592、E595、N604和K606。因此，在一具體實施例中，改造酵素可包括在該9個胺基酸位置中的一個或多個的胺基酸取代。另一方面，某些野生型殘基，例如，S447、G542、L565、W587、R600、G603和P636可能是較佳的。因此，該改造酵素可保留這七個野生型殘基(如SEQ ID NO：2所示)中的一個或多個。因此，在一具體實施例中，改造酵素在對應於如SEQ ID NO：2所示的序列的殘基S447、G542、L565、W587、R600、G603及/或P636的殘基處不具有取代。
在一具體實施例中，本發明還提供了分離的多核苷酸，其編碼如本文所述的改造酵素。
在另一具體實施例中，本發明提供了表現載體，其包含編碼如本文所述的改造酵素的多核苷酸。
本領域已知的方法，例如重組技術，可用於產生本文所述的改造酵素。
改造酵素可以作為酵素置換療法，以治療具有與缺陷性α-己醛醣酸鹽水解酶相關的疾病(即黏多醣貯積病)的受試者。由於改造酵素將以正常的、非免疫原性之內源性酵素呈現於受試者的免疫系統，所以其不會在受試者體內誘導不想要的免疫反應。
涉及施用編碼該改造酵素之核酸分子的基因治療也可用於治療受試者的黏多醣貯積病。
本文還描述了發展或鑑定候選酵素置換療法的方法，該候選酵素置換療法用於在具有與缺陷酵素相關之疾病的受試者中治療該疾病，例如，溶酶體貯積症，如MPS第I型、MPS第II型、MPS第IV型、第I型高歇氏病、龐貝氏症，以及法布里氏病。該缺陷可以是起因於突變的酵素(例如，截短的酵素)或低於正常量的野生型酵素。
在該方法中，改變一正常內源性酵素(即模板酵素)的酵素活性及/或特異性，以補償該缺陷酵素的酵素活性及/或特異性。由於修飾的酵素將表現為正常的內源性蛋白，所以該修飾的酵素在受試者中將不會引起免疫反應。
合適的模板酵素應該是對具有缺陷酵素的受試者而言是內源性的，且在該具有缺陷酵素的受試者體內為正常地表現的模板酵素。模板酵素和缺陷酵素的野生型對應物可以在一個或多個方面相似，例如，催化機制、催化結構域結構、組織表現概況、大小，以及細胞定位方面。
然後，改變所選擇的模板酵素，以便至少部分地將其酵素活性或特異性轉換成缺陷酵素的正常對應物的酵素活性或特異性。這種改變包括胺基酸取代、缺失和***。該改變不應使該模板酵素以外源蛋白呈現於受試者的免疫系統。換句話說，該修飾的酵素應當仍然與模板酵素具有高的序列一致性(例如，至少80%、85%、90%、95%或99%的一致性)。改變可以是合理設計的、隨機的或其組合。
例如，可以基於模板酵素和缺陷酵素的正常對應物的結構(例如，整個酵素的結構和活性位點的結構)設計改造酵素。本領域可用的各種技術和軟體可用於比較兩種酵素的序列及結構，以鑑定用於改變的 潛在殘基。已知或預測與一基質相互作用的殘基可以是用於改變的特定目標。可以產生在各變體中一個或多個所鑑定的殘基處具有取代的變體庫，以用於篩選。還可以進行篩選隨機產生之模板酵素變體的庫，以鑑定表現出所需活性及/或特異性的變體。
可以進一步測試候選酵素置換療法(例如，在動物模型中)以確定其是否誘導出不想要的免疫反應。在一具體實施例中，選擇不會誘導免疫反應的候選酵素，或是選擇與由缺陷酵素誘導的免疫反應相較，誘導較低量免疫反應的候選酵素，以用於酵素置換療法。
該方法可以應用於野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶模板(例如，SEQ ID NO：2)，以產生表現出α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性的改造酵素。可以改變人類β-葡萄糖醛酸苷酶的催化結構域內的殘基。如上所述，在如SEQ ID NO：2所示的序列中位置204、279、438、484、502、503、504、506、508、509、542、545、565、587、592、594、595、598、600、603、604、606和636，各自是改變的目標。本文所述的每種特定改造酵素可以進一步改變(例如，添加取代的殘基或不同的取代殘基)以發展更多改造酵素。
篩選方法可以使用本領域已知的技術或系統進行。一個示例性的技術為可裂解之表面系鏈酵素多用途篩選系統(ECSTASY)。參見Chen,C.P.，等人，Protein Eng Des Sel，2012年。25(7)：p.367-75；以及亦可參見第二圖。
「受試者」係指人類及非人類的動物。非人類動物的實例包括所有脊椎動物，例如，哺乳類動物，例如非人類靈長類動物(特別是較 高級的靈長類動物)、狗、囓齒動物(例如，小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓，以及非哺乳類動物，例如鳥類、兩棲動物等。在優選的具體實施例中，該受試者為人類。在另一具體實施例中，該受試者為適合作為疾病模型的實驗動物或動物。
本文所用，術語「治療」係指將包括一種或多種活性劑的組合物應用或施用於患有疾病、疾病的症狀，或對疾病有傾向的患者，其目的為治療、治癒、緩解、紓解、改變、補救、改善、促進或影響該疾病、該疾病的症狀、或對疾病的傾向。如本文所用，「有效量」係指給予受試者治療效果所需的每種活性劑的量，包括單獨或與一種或多種其它活性劑之組合。如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所認識到的，有效量的變化取決於施用途徑、賦形劑的使用，以及與其它活性劑的共同使用。
以下的具體示例將被解釋為僅僅是說明性的，而且不以任何方式限制本公開的其餘部分。無需進一步詳細描述，相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以基於本文的描述最大程度地利用本公開內容。本文引用的所有出版物透過引用方式整體併入本文。
實施例
以下所描述為另一種策略，其中改變正常內源性酵素的酵素特異性，以補償缺陷酵素以幫助減輕抗體反應。請參見第一圖。因為修飾的酵素將整體以正常的內源蛋白出現，所以該酵素在LSD患者體內的免疫原性較低。
我們採用人類β-葡萄糖醛酸苷酶作為模板以生成α-己醛醣酸鹽水解酶的類似物。β-葡萄糖醛酸苷酶的表現在MPS第I型的患者中是正 常的，因此重組β-葡萄糖醛酸苷酶應當可被良好地耐受，且為非免疫原性的。β-葡萄糖醛酸苷酶與α-己醛醣酸鹽水解酶在它們的催化結構域中共有類似的TIM(β/α)8-桶狀結構，並且屬於糖苷水解酶(GH-A)的相同群體。它們也具有類似的催化機制，其透過一對谷胺酸殘基來水解基質，該殘基係為保守取向的β-葡萄糖醛酸苷酶的E451和E540，以及α-己醛醣酸鹽水解酶的E182和E299。此外，與α-己醛醣酸鹽水解酶一樣，β-葡萄糖醛酸苷酶可經由存在於缺陷細胞表面上的甘露糖-6-磷酸受體，以透過受體調節的胞吞作用定位到溶酶體。由於這些相似性，選擇β-葡萄糖醛酸苷酶作為特異性轉換的候選物。
我們構建了一個β-葡萄糖醛酸苷酶庫，並使用以前在我們實驗室開發的可裂解之表面系鏈酵素多用途篩選系統(ECSTASY)以篩選其α-己醛醣酸鹽水解酶的活性。參見第二圖以及Chen,C.P.，等人，Protein Eng Des Sel，2012年，25(7)：p.367-75。該β-葡萄糖醛酸苷酶庫透過與來自人類衰變加速因子(decay accelerating factor，DAF)的C端GPI-錨定信號序列融合而表現於表面。參見Caras,I.W.，等人，Science，1987年，238(4831)：p.1280-3。以高通量螢光激活細胞分選器(fluorescence-activated cell sorting，FACS)篩選膜結合的β-葡萄糖醛酸苷酶庫細胞，接著以磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)酶切，以便於在確定的條件下篩選α-己醛醣酸鹽水解酶活性。篩選後，研究在α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷細胞中之β-葡萄糖醛酸苷酶變體的體外功效。
我們成功地分離展現顯著的α-己醛醣酸鹽水解酶活性以及表現出對MPS第I型細胞的表型功效的β-葡萄醣醛酸苷酶變體。結果顯示， 正常表現的內源性人類酵素的特異性可以轉移，以補償另一缺陷酵素。
野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶顯示可偵測到的α-己醛醣酸鹽水解酶活性
由於人類β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛醣酸鹽水解酶之間的相似性，我們試圖確定人類β-葡萄糖醛酸苷酶是否顯示內源性α-己醛醣酸鹽水解酶活性。
我們從源自MPS第I型患者的人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷纖維母細胞中，表現和純化重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶，以消除重組β-葡萄糖醛酸苷酶與內源性α-己醛醣酸鹽水解酶可能的污染。透過硫酸銨沉澱和Ni2+ -次氮基三乙酸親和色層分析法純化帶有多組胺酸(6x His)標籤的重組β-葡萄糖醛酸苷酶。
體外測定顯示，人類β-葡萄糖醛酸苷酶顯現出抗α-己醛醣酸鹽水解酶基質，即4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽(MUI)，可測量的活性，對應於野生型人類α-己醛醣酸鹽水解酶的約0.002%的活性。MUI的水解與人類β-葡萄糖醛酸苷酶的含量及作用時間成比例。參見第三圖，A部分。HPLC也證實了這種活性，其顯示MUI的水解和產物4-甲基繖形酮4-MU的增加。參見第三圖，B及C部分。注意，市售MUI含有0.1-2%的4-甲基繖形酮基β-D-葡糖酸苷(MUG)的污染，如所提供的資料表以及HPLC分析所指出所示。參見第三圖，D及E部分。因此，在測定之前先將市售MUI以在「材料及方法」所述的方式純化，以避免得到由MUG水解而來的訊號。
對顯示升高的α-己醛醣酸鹽水解酶活性的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體的鑑 定
我們以ECSTASY方法篩選具有較高α-己醛醣酸鹽水解酶活性的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體，以用於選殖。參見第二圖。簡而言之，透過結構分析及文獻回顧而設計出具有19個殘基突變的人類β-葡萄糖醛酸苷酶庫，其總多樣性為3×109。參見表1。
藉由引子組合以及隨後以PCR擴增(參見第四圖)，在人類β-葡萄糖醛酸苷酶基因的19個位置上引入突變，產生1.2×107個細菌菌落。以0.1的感染複數(MOI)對293細胞株以庫DNA進行逆轉錄病毒轉導，以確保每個細胞中僅有單一β-葡萄糖醛酸苷酶變體基因，結果產生3×106個穩定的選殖株(293/L1細胞)。
為了除去不能正確折疊或在細胞表面上表現的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體，我們首先以會結合人類β-葡萄糖醛酸苷酶的單株抗體7G8-FITC對活的293/L1細胞進行染色，並收集在其表面上展現出相對高量的人類β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白的細胞。流式細胞儀分析結果顯示，16%的293/L1細胞在其表面上表現GPI錨定的人類β-葡萄糖醛酸苷酶(虛線框，參見第五圖，A部分)。將顯現出最高表現量的人類β-葡萄糖醛酸苷酶的細胞，以單細胞方式分選至96孔微量盤(群體的6.8%，實線框，第五圖，A部分)中，並允許增殖至接近細胞長滿的程度。接著以PI-PLC處理每個選殖株以 切除GPI錨，並以如「材料及方法」中所述方法測定每種可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶變體的濃度及活性。例如，幾個96孔微量盤的篩選結果中，發現三株β-葡萄糖醛酸苷酶變體，其展現出比野生型β-葡萄糖醛酸苷酶顯著更高的α-己醛醣酸鹽水解酶活性。參見第五圖，B及C部分。總結，我們篩選了50個具有分選的293/L1庫細胞的96孔盤，並鑑定出1.3%(73/4800)的β-葡萄糖醛酸苷酶變體，與野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相較，具有提高的α-己醛醣酸鹽水解酶活性。
展現α-己醛醣酸鹽水解酶活性之人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體的特性描述
隨機選擇表現出高的α-己醛醣酸鹽水解酶活性的幾株人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體，並將其選殖到哺乳動物表現載體中，以從BALB/3T3纖維母細胞以及34/2000細胞(源自一位MPS第I型患者的人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷型纖維母細胞)產生更大量的重組可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶。與野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相較，所有可溶性人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體展現出增強的α-己醛醣酸鹽水解酶活性，並分析其序列。參見表1。
所選擇的選殖株的胺基酸序列示於表2中。進一步針對三株β-葡萄糖醛酸苷酶變體，102H1、101C7和70H1進行特性描述。重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體顯示出與野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶類似的分子量，如透過以抗-6x His標籤抗體進行免疫墨點分析法所測定的。與野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶相較，β-葡萄糖醛酸苷酶變體還顯示出對MUI的活性的增加。參見第六圖。
表2. 高α-己醛醣酸鹽水解酶活性變體的胺基酸序列
測量和分析人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體對MUI的動力學性質。參見表3。人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體102H1、101C7和70H1對MUI的基質親和力KM分別為36.9±3.2、28.2±2.4和24.5±1.6μM。與野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶相較，這些變體分別顯示對MUI增加19、25和29倍的親和力。人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體102H1、101C7和70H1的酶變率kcat為0.0099±0.0009、0.013×0.0011和0.0039±0.0003，這對應於與野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相較，分別為11、14和4倍的改善。與野生型β-葡萄糖醛酸苷酶相較，三株β-葡萄糖醛酸苷酶變體的總體α-己醛醣酸鹽水解酶活性從100增加到290倍。參見表4。酵素特異性從β-葡萄糖醛酸苷酶轉變為α-己醛醣酸鹽水 解酶的範圍從7900倍至24500倍。β-葡萄糖醛酸苷酶變體表現出低但顯著的α-己醛醣酸鹽水解酶活性，其範圍為野生型α-己醛醣酸鹽水解酶的0.3-0.9%。
為了解決重組人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體是否可以改變MPS第I型細胞的表型，透過35SO4併入試驗來測量細胞GAG的累積。在將細胞暴露於5μg/ml重組酵素72小時之前，將MPS第I型細胞與Na2 35SO4一起作用以放射性標記GAG。然後收集細胞裂解物和培養基，並測量35S的放射性。與未處理的細胞相較，以野生型α-己醛醣酸鹽水解酶或β-葡萄糖醛酸苷酶變體102H1和70H1處理的細胞，在細胞裂解物中表現出顯著降低的放射性。參見第七圖，A部分。與使用野生型β-葡萄糖醛酸苷酶處理的細胞相比，使用野生型α-己醛醣酸鹽水解酶和三株β-葡萄糖醛酸苷酶變體處理的MPS第I型細胞的培養基顯現出顯著增加的放射性(參見第七圖，B部分)，表明細胞GAG產物增強的消化和***。總之，與未處理的細胞以及使用野生型β-葡萄糖醛酸苷酶處理的細胞相較，以β-葡萄糖醛酸苷酶變體102H1和70H1處理的細胞顯現出顯著降低的細胞GAG和增加的GAG***。以β-葡萄糖醛酸苷酶變體101C7處理的細胞展現出細胞GAG不具統計上顯著性的降低，但顯著增加GAG***。儘管β-葡萄糖醛酸苷酶變體不如野生型α-己醛醣酸鹽水解酶那樣有效，但這些結果表明MPS第I型細胞中貯存之GAG的部分校正。
我們還採用定性溶酶體染色方法來顯現MPS第I型細胞的表型變化。將MPS第I型細胞與5μg/ml重組酵素一起作用72小時，然後以Lysotracker-red DND-99染料(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美國)染色以顯現溶酶體(數據未顯示)。將溶酶體螢光定量為每個細胞的平均螢光強度。在未處理的MPS第I型細胞中觀察到高度溶酶體染色。正如所預期的，以野生型β-葡萄糖醛酸苷酶處理細胞並不影響溶酶體螢光。相較之下，與未處理的MPS第I型細胞相較，以α-己醛醣酸鹽水解酶或β-葡萄糖醛酸苷酶變 體(102H1、101C7和70H1)處理的細胞顯現出的溶酶體染色顯著減少(參見第八圖)，表示在缺陷細胞中至少有一部分正常化溶酶體。總之，這些結果顯示β-葡萄糖醛酸苷酶變體顯現出對MPS第I型細胞表型的校正具有有益效果。
與MPS第I型患者中的α-己醛醣酸鹽水解酶相較，β-葡萄糖醛酸苷酶變體被預期顯現出降低的免疫原性，因為只有幾個胺基酸從野生型β-葡萄糖醛酸苷酶序列改變。例如，所選的β-葡萄糖醛酸苷酶變體102H1、101C7和70H1具有11、13和13個胺基酸變化，其對應於總胺基酸的1.7、2和2%。此外，這些突變大多被埋在內部活性位點中，且可能無法與抗體接觸。
人類β-葡萄糖醛酸苷酶轉基因小鼠中人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體的免疫原性
針對研究β-葡萄糖醛酸苷酶變體的免疫原性，合適的動物模型如人類β-葡萄糖醛酸苷酶轉基因小鼠是非常有用的。人類β-葡萄糖醛酸苷酶轉基因小鼠可以模擬MPS第I型患者，其表現正常人類β-葡萄糖醛酸苷酶，但不表現人類α-己醛醣酸鹽水解酶。這些小鼠可用於研究人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體的免疫原性以及測試是否誘導針對內源性人類β-葡萄糖醛酸苷酶引發的宿主自體免疫反應。因此，我們生產了表現人類β-葡萄糖醛酸苷酶的轉基因小鼠。參見第九圖。
為了確定轉基因小鼠中人類β-葡萄糖醛酸苷酶是否具耐受性，將50μg重組蛋白(即人類β-葡萄糖醛酸苷酶、小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶、人類α-己醛醣酸鹽水解酶、人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體101C7，以及人類β- 葡萄糖醛酸苷酶變體70H1)每三週以靜脈注射到轉基因小鼠中，共注射4次。並以ELISA測定抗施用的蛋白質之血清抗體。
正如所預期的，小鼠耐受重複注射小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶(參見第十圖，A部分)，但小鼠體內發展出抗人類α-己醛醣酸鹽水解酶的抗體(參見第十圖，B部分)。相較之下，小鼠不產生抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶的抗體(參見第十圖，C部分)，表示人類β-葡萄糖醛酸苷酶顯示為自身的抗原。二個顯示α-己醛醣酸鹽水解酶活性的人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體(101C7和70H1)在轉基因小鼠中，顯現出比野生型α-己醛醣酸鹽水解酶顯著更低的免疫原性(參見第十圖，D部分)，表示「隱形匿蹤」的方法可有助於降低酵素置換療法的免疫原性。
總結，轉基因小鼠表現人類β-葡萄糖醛酸苷酶，並且對施用之野生型人類β-葡萄糖醛酸苷酶具有良好的耐受性。該動物模型容易模擬表現正常β-葡萄糖醛酸苷酶而不表現α-己醛醣酸鹽水解酶的MPS第I型患者。
材料及方法
試劑及抗體
磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)、Lysotracker-Red DND-99染料，以及Hoechst 33342核染料係來自Invitrogen公司(Carlsbad，加州，美國)。4-甲基繖形酮基β-D-葡糖酸苷(MUG)係來自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，密蘇里州，美國)。4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽(MUI)來自USB公司(Cleveland，俄亥俄州，美國)。在以20%甲醇(pH 4)平衡的LiChroprep RP18(40-63μm)管柱，透過固相萃取/高效液相色層法除去市售MUI中的微量MUG污染物(~2%)。以二次蒸餾水配置之25%甲醇(pH4) 洗提MUI，並在旋轉蒸發器中濃縮。如所述，以FITC或生物素直接標記小鼠抗人類β-葡萄糖醛酸苷酶單株抗體(mAb)7G8。鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(HRP)來自Jackson ImmunoResearch公司(West Grove，賓州，美國)。
細胞培養
GP293V細胞(源自人類胚胎腎293細胞)由位於華盛頓州西雅圖的華盛頓大學的Andre Lieber博士慷慨提供。34/2000細胞(來源於MPS第I型患者的人類α-己醛醣酸鹽水解酶缺陷型纖維母細胞)是來自義大利熱那亞的G.Gaslini研究所的Mirella Filocamo博士慷慨的贈與。BALB/3T3纖維母細胞和HEK293細胞獲自ATCC(Manassas，維吉尼亞州，美國)。細胞在添加有10%胎牛血清、2.98g/L HEPES、2g/L NaHCO3、100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的Dulbecco基本必需培養基(DMEM)中培養。
人類β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛醣酸鹽水解酶的結構分析
人類β-葡萄糖醛酸苷酶、人類α-己醛醣酸鹽水解酶，以及解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)β-木糖苷酶的蛋白質結構比對顯示它們具有保守的催化性谷胺酸殘基。由解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)β-木糖苷酶(PDB ID：1Y24)和解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)β-木糖苷酶(PDB ID：1PX8)衍生出的人類β-葡萄糖醛酸苷酶(PDB ID：1BHG)、人類α-己醛醣酸鹽水解酶同源模型的立體結構也被用於分析中。催化TIM(β/α)8-桶狀區域被疊加並分別透過PyMOL與OPAAS分析。雖然人類β-葡萄糖醛酸苷酶和α-己醛醣酸鹽水解酶的整個蛋白質結構彼此不是非常相似，這些蛋白 質具有共同的TIM(β/α)8-桶狀結構以及保守的谷胺酸殘基在其催化位點中。選擇預測會接觸基質的殘基進行突變。
合成庫構建
設計了具有19個殘基的突變的人類β-葡萄糖醛酸苷酶庫，其總多樣性為3×109。β-葡萄糖醛酸苷酶催化結構域中的15個殘基(S447、N484、N502、S503、Y504、Y508、H509、G542、W587、F592、T594、E595、R600、N604和K606)被鑑定為包圍該活性位點，其中能容納基質。先前的研究還報告了與醛素活性和特異性相關的幾種β-葡萄糖醛酸苷酶殘基(N484、S503、S506、H509、T545、L565、E595、P598、N604和K606)。總共19個胺基酸殘基被突變。參見表1。透過結構分析和文獻回顧，辨識出的六個劃底線的殘基(N484、S503、H509、E595、N604和K606)被認為是熱點。這六個熱點突變為可變胺基酸以增加庫的多樣性。例如，我們在S503使用簡併引子將絲胺酸突變為具有側鏈的帶正電荷(組胺酸)、帶負電荷(天門冬胺酸)、芳香族(酪胺酸和***酸)、疏水性(丙胺酸、亮胺酸和纈胺酸)、特殊構象(脯胺酸)的胺基酸。將其他殘基突變為從結構比較或在先前研究中鑑定的相應胺基酸(表1)。使用引子組合產生人類β-葡萄糖醛酸苷酶庫(見第四圖)。簡言之，將全長β-葡萄糖醛酸苷酶序列分成五個彼此之間具有18個重疊核苷酸的片段(F0-4)。F0片段含有Apa I選殖位點以及沉默突變(核苷酸G741A)以去除人類β-葡萄糖醛酸苷酶基因中的獨特Bgl II切割位點，以在庫構建後除去野生型DNA的污染。野生型片段F1僅用作F0和F2片段之間的橋梁。透過引子組合，隨後透過PCR擴增構建了在19個位置含有可變胺基酸的F2和F3片段。野生型F4片段含有Sal I選殖位點。 所有片段以相同的莫耳比混合，並透過PCR擴增以獲得全長β-葡萄糖醛酸苷酶庫，其用Apa I和Sal I消化並連接到pLNCX-hβG-DAF中的相同位點，以附加編碼GPI錨定到酵素變體C端的序列。透過Bgl II消化DNA庫以除去任何野生型DNA的污染，然後透過電穿孔轉型至DH5α勝任細胞中。在15-cm含卡本西林(carbenicillin)的LB瓊脂培養基上，於37℃下進行篩選轉型的細菌16小時。從單一菌落中純化質體DNA並定序以確定所選殘基的突變率。所有預期的突變存在於合成庫中。收集來自多個培養基的菌落並在含有卡本西林的LB培養基中增殖。當OD600為0.5時，透過加入氯黴素將質體增殖至終濃度170μg/ml。整夜培養後，使用Beckman Optima L-90K超速離心機(Beckman Coulter公司，Fullerton，加州，美國)，在4℃下，使用Ti 70.1轉子以60,000rpm在CsCl-溴化乙錠密度梯度中離心24小時以純化質體DNA。
穩定庫細胞的產生
為了產生穩定的細胞庫，將庫質體DNA與pVSV-G(Clontech公司，Mountain View，加州，美國)共轉染到GP293V細胞中以產生重組逆轉錄病毒顆粒。轉染後兩天，將培養基過濾，與8μg/ml聚凝胺混合，並與293細胞以0.1的感染複數培養。在含有0.5mg/ml G418(Calbiochem公司，San Diego，加州，美國)的培養基中選擇穩定的細胞株。得到的合成庫細胞稱為293/L1細胞。
流式細胞儀分析和庫細胞篩選
使用會結合人類β-葡萄糖醛酸苷酶的7G8-FITC染色293/L1細胞，並以FACScaliber流式細胞儀(BD Biosciences公司，Franklin Lakes，紐澤西州，美國)測量活細胞的免疫螢光來測定人類β-葡萄糖醛酸苷酶表面 的表現。通常，將2 x 107個細胞清洗後懸浮於1ml含有0.5%BSA以及20μg/ml 7G8-FITC的HBSS培養液(5.4mM KCl、0.3mM Na2HPO4、0.4mM KH2PO4、4.2mM NaHCO3、1.3mM CaCl2、0.5mM MgCl2、0.6mM MgSO4、137mM NaCl、5.6mM D-葡萄糖，pH 7.4)，在4℃下培養30分鐘。以含有0.5%BSA的冰冷HBSS培養液清洗細胞，並懸浮於含有5μg/ml碘化丙啶的0.5%BSA/HBSS培養液中。在FACSAria細胞分選儀(BD Biosciences公司，Franklin Lakes，紐澤西州，美國)上分選細胞。在488/515nm(FL1)的激發/發射波長下檢測到7G8-FITC免疫螢光之前，框選出死細胞(碘化丙啶陽性，高FL3螢光者)。將表現表面人類β-葡萄糖醛酸苷酶的單細胞分選到含有添加有10%牛血清的Dulbecco基本必需培養基的96孔微量盤中。
表面酵素釋放以及酵素活性篩選
將96孔微量盤中的293/L1細胞以PBS洗滌一次，並與100μl含有50mU/mL磷脂醯肌醇磷脂酶C(PI-PLC)的PBS在37℃下培養1小時，以從該細胞表面切下GPI錨定的β-葡萄糖醛酸苷酶變體。將20μl裂解酶樣品與80μl的50μM4-甲基繖形酮α-L-己醛醣酸鹽(MUI)在0.2M甲酸鹽緩衝液(pH3.5)中，於37℃下混合17小時來測定釋放的β-葡萄糖醛酸苷酶的α-己醛醣酸鹽水解酵素活性。透過加入100μl中止緩衝液(1M甘胺酸，0.5M碳酸氫鈉，pH 10.7)中止反應，並在激發波長355nm和發射波長460nm下測量盤孔中的4-甲基繖形酮(4-MU)螢光。為了減少大規模MUI測定和三明治ELISA分析期間，以手動移轉液體造成的體積轉移的系統誤差，使用自動液體處理系統MicroLab MPH-96(Hamilton Robotics，Reno，內華達州，美國)。透過用限定濃度的酵素水解連續稀釋的基質(400μM)來測定針對 MUI的動力學參數。在各個時間點中止反應並測量螢光。透過與4-MU標準曲線比較，將獲得的螢光轉化為產物濃度。使用Lineweaver-Burk圖測定KM和kcat。
三明治酵素聯結免疫吸附分析法(ELISA)
透過三明治ELISA測量以PI-PLC切割來自分選的單一株293-L1細胞之表面酶產生的可溶性β-葡萄糖醛酸苷酶的濃度。將稀釋於50μl塗覆緩衝液(50mM Na2CO3、50mM NaHCO3，pH 8)中的0.1μg單株抗體7G8在96孔微量盤的每個孔中，於室溫下作用1小時。將微量盤以PBS洗滌3次，然後在室溫下以含有2.5%脫脂奶粉的PBS進行阻隔作用1小時。將微量盤以PBS洗滌3次，並將以PBS稀釋至50μl的20μl人類β-葡萄糖醛酸苷酶變體樣品在室溫下轉移至每個孔中靜置1小時。將微量盤以含有0.05%Tween 20的PBS洗滌3次，然後在室溫下加入在含有2.5%脫脂奶粉的50μl PBS中的20ng 7G8-生物素和50ng鏈黴親和素-HRP，並靜置1小時。在每個步驟後，將微量盤以含有0.05%Tween 20的PBS清洗3次。在室溫下添加150μl新鮮製備的2,2'-聯氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)ABTS基質，靜置30分鐘並在405nm波長處測量每個孔的吸光度。
溶酶體染色和圖像的獲得
採用溶酶體染色法觀察MPS第I型細胞中的酵素效應。簡言之，將MPS第I型細胞接種在96孔微量盤中，並與5.0μg/ml重組酵素共同培養72小時。以PBS清洗細胞，並以含有100nM Lysotracker-red DND-99染料和1μg/mL Hoechst 33342的100μl培養基在37℃下染色30分鐘。以PBS清洗細胞兩次，並補充200μl不含酚紅的DMEM培養液，並在ImageXpress Micro XL High-Content Screening System(高內涵篩選生物影像系統)(Molecular Devices公司，加州，美國)上進行即時成像。使用TRITC(Em=545±20、Ex=593±20nm)和DAPI(Ex=350±50、Em=455±50nm)過濾器分別觀察Lysotracker和Hoechst染色。透過MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software(高內涵圖像採集和分析軟體)(Molecular Devices公司，加州，美國)記錄和分析每孔9個圖像位點。
統計分析
使用雙尾學生t檢驗，透過Graphpad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.公司，San Diego，加州，美國)計算野生型和β-葡萄糖醛酸苷酶變體之間的顯著差異。在P值小於0.05時，認為數據具有顯著性。
其他具體實施例
在本說明書中揭露的所有特徵可以任何組合方式來組合。本說明書中揭露的每個特徵可以由具有相同、等同或類似目的的替代特徵替換。因此，除非另有明確說明，所公開的每個特徵僅僅是等同或類似特徵的一般系列的示例。
由以上描述，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以容易地確定所描述的具體實施例的基本特徵，並且在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以對具體實施例進行各種改變和修改以適應各種用途和條件。因此，其他具體實施例也在申請專利範圍內。
<110> 中央研究院
<120> 用於酵素置換療法的改造酵素
<130> 16P0361
<140> TW105124932
<141> 2016-08-05
<150> US 62/201,889
<151> 2015-08-06
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1956
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 651
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 1962
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 653
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4

Claims (22)

  1. 一種改造酵素，包含與一人類β-葡萄糖醛酸苷酶的胺基酸序列至少95%相同的一胺基酸序列，其中與該人類β-葡萄糖醛酸苷酶相較，該改造酵素顯現出一較高量的α-己醛醣酸鹽水解酶酵素活性。
  2. 如申請專利範圍第1項之改造酵素，其中該人類β-葡萄糖醛酸苷酶包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之改造酵素，其中該改造酵素在該如SEQ ID NO：2所示的序列中對應於殘基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606，及/或P636的一殘基處包含一取代。
  4. 如申請專利範圍第3項之改造酵素，其中該改造酵素在N484、N502、S503、S506、H509、F592、E595、N604，及/或K606處包含一取代。
  5. 如申請專利範圍第3項之改造酵素，其中殘基204為T或K；殘基279為Q或H；殘基438為K或M；殘基484為S、D、H、R、S或C；殘基502為N、D或K；殘基503為A、D、Y、P、H或V；殘基504為Y、G或C；殘基506為S或G；殘基508為Y或D；殘基509為H、A或P；殘基542為G或D；殘基545為T或A；殘基565為L或A；殘基587為W或T；殘基592為F或Y；殘基594為T或L；殘基595為L、V、Q或G；殘基598為P或D；殘基600為R或A；殘基603為G或E；殘基604為Y、S、A或T；殘基606為Q、F或L；且殘基636為P或S。
  6. 如申請專利範圍第1~5項中任一項之改造酵素，其中該改造酵素在該如SEQ ID NO：2所示的序列中對應於殘基S447、G542、L565、W587、R600、G603，及/或P636的殘基處不包含一取代。
  7. 如申請專利範圍第3項之改造酵素，其中該改造酵素包含殘基S484、 D502、A503、G506、A509、D542、A545、Y592、V595、S604，及/或F606。
  8. 如申請專利範圍第3項之改造酵素，其中該改造酵素包含殘基H279、C484、K502、Y503、G504、G506、P509、A545、A565、L594、Q595、A604，及/或F606。
  9. 如申請專利範圍第3項之改造酵素，其中該改造酵素包含殘基D484、K502、Y503、G506、D508、P509、A545、Y592、L594、G595、D598、T604、F606，及/或S636。
  10. 一種核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1~9項中任一項之改造酵素的核酸序列。
  11. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第10項之核酸分子。
  12. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第1~9項中任一項的改造酵素以及一醫藥上可接受之載體。
  13. 一種利用如申請專利範圍第1~9項中任一項的改造酵素製備藥物的用途，其中該藥物在受試者中治療黏多醣貯積症。
  14. 一種發展候選酵素置換療法的方法，該候選酵素置換療法用於在具有與缺陷酵素相關之疾病的受試者中治療該疾病，該方法包含：選擇一模板酵素，其中該模板酵素對該受試者而言是內源性的，且在該受試者體內正常地表現；以及改變該模板酵素以獲得一改造酵素，其中與該模板酵素的目標酵素活性相較，該改造酵素顯現出增加目標酵素活性，該目標酵素活性是該缺陷酵素的野生型對應物的酵素活性；其中該改造酵素為用於治療該疾病的候選酵素置換療法。
  15. 一種鑑定候選酵素置換療法的方法，該候選酵素置換療法用於在具有與缺陷酵素相關之疾病的受試者中治療該疾病，該方法包含： 提供改造酵素的庫，其中在該庫中的每種改造酵素為一模板酵素的變體，該模板酵素對該受試者而言為內源性的，且在該受試者體內正常地表現；以及測定該庫的目標酵素活性，其中該目標酵素活性為該缺陷酵素的野生型對應物的酵素活性；其中，與該模板酵素的目標酵素活性相較，顯現出一增加目標酵素活性的一改造酵素為用於治療該疾病的候選酵素置換療法。
  16. 如申請專利範圍第14或15項之方法，其中該疾病為溶酶體貯積症，且該缺陷酵素為溶酶體酶。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該缺陷酵素為人類α-己醛醣酸鹽水解酶，且該模板酵素為人類β-葡萄糖醛酸苷酶。
  18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該模板酵素包含如SEQ ID NO：2所示之序列。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該改造酵素在該如SEQ ID NO：2所示的序列中對應於殘基T204、Q279、K438、N484、N502、S503、Y504、S506、Y508、H509、G542、T545、L565、W587、F592、T594、E595、P598、R600、G603、N604、K606，及/或P636的殘基處包含一取代。
  20. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該目標酵素活性為4-甲基繖形酮-α-L-己醛醣酸鹽的水解作用。
  21. 如申請專利範圍第14或15項之方法，進一步包含確定該候選酵素置換療法是否在一動物模型或具有該疾病的受試者體內誘導一免疫反應。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，進一步包含選擇不誘導免疫反應的候選酵素置換療法，或與由該缺陷酵素誘導的免疫反應相較，誘導較低量的免疫反應的候選酵素置換療法。
TW105124932A 2015-08-06 2016-08-05 用於酵素置換療法的改造酵素 TWI617573B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562201889P 2015-08-06 2015-08-06
US62/201,889 2015-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201718628A TW201718628A (zh) 2017-06-01
TWI617573B true TWI617573B (zh) 2018-03-11

Family

ID=57943727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW105124932A TWI617573B (zh) 2015-08-06 2016-08-05 用於酵素置換療法的改造酵素

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10604747B2 (zh)
CN (1) CN107922932A (zh)
TW (1) TWI617573B (zh)
WO (1) WO2017024204A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2984166T3 (pl) 2013-03-15 2021-01-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje do leczenia mpsi
SG11201806270XA (en) 2016-02-03 2018-08-30 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i
EP3676385A1 (en) 2017-07-06 2020-07-08 The Trustees of The University of Pennsylvania Aav9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090041741A1 (en) * 2007-03-06 2009-02-12 Saint Louis University Modified enzyme and treatment method

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9701454D0 (sv) 1997-04-18 1997-04-18 Ulf Lindahl new DNA sequences and a process for enzyme manufacture
US20100221235A1 (en) * 2006-02-08 2010-09-02 Diatos Compositions and Methods for Treating Lysosomal Storage Diseases
EP2252288A1 (en) * 2007-11-21 2010-11-24 Summit Corporation Plc Treatment of protein folding disorders
CA2840224C (en) * 2011-06-22 2019-08-13 The General Hospital Corporation Treatment of proteinopathies
US20140377246A1 (en) 2013-06-19 2014-12-25 Carol Ann Foundation and International Morquio Organization Enzyme replacement therapy for treating mps vii related bone lesions using a chemically modified enzyme
CN104131094A (zh) * 2014-07-25 2014-11-05 封志纯 用于溶酶体病基因筛查的引物组合物及试剂盒
US9920306B2 (en) * 2014-09-29 2018-03-20 Integrated Micro-Chromatography Systems, Llc Mutant β-glucuronidase enzymes with enhanced enzymatic activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090041741A1 (en) * 2007-03-06 2009-02-12 Saint Louis University Modified enzyme and treatment method

Also Published As

Publication number Publication date
CN107922932A (zh) 2018-04-17
US10604747B2 (en) 2020-03-31
US20180346896A1 (en) 2018-12-06
TW201718628A (zh) 2017-06-01
WO2017024204A1 (en) 2017-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102369436B (zh) 用于检测jc多瘤病毒的方法
JP5687069B2 (ja) 高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素の製造およびそれの使用
KR101949906B1 (ko) 고도로 인산화된 활성 인간 n-아세틸갈락토사민-6-설파타제의 제조 및 이것의 용도
KR100603683B1 (ko) 활막세포 단백질
CN105911275B (zh) 诊断自闭症的试剂盒
Li et al. Potential host range of multiple SARS-like coronaviruses and an improved ACE2-Fc variant that is potent against both SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1
TWI617573B (zh) 用於酵素置換療法的改造酵素
WO2005061532A1 (es) Composiciones y procedimientos para detectar infección patógena
Edwards et al. Gonococcal phospholipase D modulates the expression and function of complement receptor 3 in primary cervical epithelial cells
Messmer et al. A human pathology-related mutation prevents import of an aminoacyl-tRNA synthetase into mitochondria
Vo et al. The protozoan parasite Toxoplasma gondii encodes a gamut of phosphodiesterases during its lytic cycle in human cells
Padgett et al. Elp3 and RlmN: A tale of two mitochondrial tail-anchored radical SAM enzymes in Toxoplasma gondii
US20130108660A1 (en) Anti-trypanosome therapeutic and diagnostic applications
CN109072274A (zh) 淀粉样蛋白球体（aspd）样结构体及医药组合物
KR20230039607A (ko) 변이체 SARS-CoV-2 단백질 및 그의 용도
Morgenstern et al. Controlling ion channel trafficking by targeted ubiquitination and deubiquitination
JP4920239B2 (ja) ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群
US20180313836A1 (en) BINDING ACTIVITY OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE IN CHARCOT-MARIE-TOOTH (CMT) NEUROPATHY AND CMT-RELATED NEUROLOGICAL DISEASES
EP3761029A1 (en) A novel assay for the diagnosis of nematode infections
JP5891561B2 (ja) ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群
Ninaltowski Investigation of an Alternative Protocol for the Production of SARS-CoV-2 Antigenic Proteins
Blakely Characterization of a Putative Acid Phosphatase in Toxoplasma gondii and Its Role in Parasite Propagation
WO2006070028A1 (es) Composiciones y procedimientos para detectar infección patógena
Black Impact of tyrosine phosphorylation of Syntaxin 4 and Munc18c on GLUT4 translocation
Kaiser GPI80 is a cell surface marker for hematopoietic stem cells throughout human fetal development