TWI612899B - 油茶粕萃取物及其所製成之生物農藥 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種油茶粕萃取物及其應用之生物農藥，其中該油茶粕萃取物之成分包括：三萜類皂苷化合物 0.5~99％、類黃酮類化合物 0.5~40％，及進一步含有酚類化合物 0~20％。該生物農藥含有該油茶粕萃取物，得用以防治軟體動物、線蟲或抑制植物病害微生物之生長。

Description

油茶粕萃取物及其所製成之生物農藥

本發明係關於一種植物萃取物及其所製成的生物農藥，尤其是一種經由油茶粕萃取而來之萃取物，及其所製成之生物農藥，用以防治軟體動物、線蟲或抑制植物病害微生物生長等。

近年來環保意識抬頭，由於天然皂素（saponin）可迅速被微生物分解，不會衝擊環境，因此，來自植物萃取之皂素等的使用重新受到重視。例如，油茶粕（又稱苦茶粕）之再生利用。油茶粕源自苦茶樹的茶籽榨過油後的殘渣，其因富含茶皂素，不僅可作為天然清潔劑使用，還能破壞福壽螺的黏膜，導致福壽螺死亡，故常被拿來做為水田施肥與福壽螺防治之用。

茶皂素在農業上的實際應用仍多以直接施用油茶粕或其浸出液等相關產物為主。例如，在水稻插秧期間，在水田間施灑未經處理的油茶粕，使得油茶粕在水中釋出茶皂素，造成接觸到茶皂素的福壽螺死亡，進而有效抑制福壽螺孳長，惟油茶粕用量不菲，容積大，造成田間施作負擔。此外，亦可將油茶粕浸漬於水中，使茶皂素溶入水，待經過簡單過濾即為粗萃取液，並以之作為原料再進行後續加工製造成各種萃取液成品。由於萃取液成品容積大，造成儲存和運送的困難。倘若要將萃取液中的水份蒸發以分離出萃取物，更是一項高耗能的製程，勢必將大大提高製造成本。

台灣專利第I379896號提供一種天然皂素製備方法，其係以含矽固相介質作為天然皂素的吸附物，因此所製得之成品為粉末狀天然皂素，藉此將低容積，且無需高耗能。

本發明提供一種有別於傳統皂素製備方法製造出來的油茶粕萃取物，其具有高生物活性成分，且成分單純。

具體而言，經過本發明特殊的茶皂素萃取純化製程產出之油茶粕萃取物，其特徵在於由下列重量百分比的組份所組成：三萜類皂苷化合物0.5~99％；類黃酮類化合物0.5~40％；及進一步含有酚類化合物0~20％。其中該類黃酮類化合物包括黃酮醇類化合物。

本發明之油茶粕萃取物可再進一步產製成為特定成分比率之生物農藥，用以防治扁蝸牛、非洲大蝸牛及福壽螺等軟體動物及根瘤線蟲，且還能抑制植物病害微生物如青黴病菌、綠黴病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、炭疽病菌等微生物之生長。

具體而言，本發明之生物農藥可針對需要包括餌劑、水溶性粒劑或粒劑及水溶性粉劑、溶液、乳劑或微乳劑等不同劑型。當生物農藥被製作成餌劑時，其成分更包括一誘引劑、一防腐劑、一填充劑及一黏結劑；而當生物農藥被製作成水溶性粒劑時，其成分更包括一分散劑、一黏結劑、一崩解劑及一載體。

本發明之油茶粕萃取物係藉由一茶皂素萃取純化製程（第一圖）所製得，使其具有高生物活性成分，此活性成分主要包括三萜類皂苷化合物（triterpenoid saponins）及類黃酮類化合物（flavonoids），得用以防治扁蝸牛、非洲大蝸牛及福壽螺等軟體動物及根瘤線蟲，且還能抑制青黴病菌、綠黴病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、炭疽病菌等微生物之生長。

參閱第一圖，該茶皂素萃取純化的製程大致包括前處理1、除油2、茶皂素萃取3、茶皂素純化4及後處理5等五階段，今詳如下述：

首先，在前處理1的階段中，油茶粕樣品（油茶粕餅），先以研磨機粉碎（步驟11），並以 ≧ 60目之篩網過篩，以增加其與溶劑之接觸表面積，並秤取過篩後之油茶粕粉末。

一般而言，油茶粕係源自苦茶樹的茶籽榨過油後的殘渣，其雖富含茶皂素，但事實上即使榨油過之油茶粕（餅）內仍殘留不少油脂，因此在萃取茶皂素之前，較佳係先對油茶粕進行的除油2作業。在此階段中，將過篩後的粉末加入脂溶性的有機溶劑，例如正己烷（料液比1：4），並攪拌混合均勻，使油脂溶解，以提取油脂（步驟21）。此步驟是在室溫下以超音波震盪萃取 60分鐘。隨後再進行過濾（步驟22），以去除溶劑正己烷。重複進行多次後，將除油後的油茶粕粉末晾乾（步驟23）。

續進入茶皂素萃取3的階段，首先是將晾乾後的油茶粕粉末加入一甲醇及丙酮的混合溶劑，並攪拌混合均勻，使茶皂素溶解於該混合溶劑中，以萃取茶皂素（步驟31）。此步驟是在室溫下以超音波震盪萃取60分鐘，以提高提取效率，隨後再進行過濾（步驟32），以濾除雜質，並收集濾液，也就是茶皂素提取液。如此重複進行多次。接著，再將過濾後的茶皂素提取液進行減壓濃縮（步驟33），以去除溶劑，得到高濃度的茶皂素提取液。隨後以沉澱劑進行沉澱作用，該沉澱劑為酮類或醚類等物質。由於茶皂素不溶於酮或醚等沉澱劑，會因為加入沉澱劑而析出沉澱，故在倒出上清液後，即得到沉澱的粗茶皂素（步驟34）。

隨後進入茶皂素純化4的階段，此階段是將粗茶皂素沉澱物以高溫的醇類混和溶劑使茶皂素復溶（步驟41），再加入上述的沉澱劑使其沉澱（步驟42），如此循環反覆進行多次，以純化茶皂素。

最後，在後處理5的階段中，將純化後之茶皂素沉澱物以適量酮類溶劑清洗（步驟51）後，放置烘箱烘乾（步驟52），即得到油茶粕萃取物，記錄其重量，得到產率約5~25%。

今以電灑法超高效液相層析串聯質譜儀（UPLC/ESI/MS/MS）對所製得之油茶粕萃取物進行鑑定分析，可得到如第二圖所示之總離子層析圖。從此圖譜可窺知該油茶粕萃取物的組分成分主要包括三大群組A、B、C。其中，群組A的波峰約是在滯留時間0.6-1.0分出現，經一次質譜與其二次質譜及三次質譜之結構分析，可推估此類化合物為酚類化合物。群組B的波峰約是在滯留時間4.5-6.0分，經一次質譜與其二次質譜及三次質譜之結構分析，可推估此類化合物為類黃酮類化合物，尤指黃酮醇苷。其中，群組C的波峰約是在滯留時間10.6-16.7分，經一次質譜與其二次質譜及三次質譜之結構分析，可推估此類化合物為三萜類皂苷化合物。

經多次茶皂素萃取純化的實驗後統計發現，本發明產製之油茶粕萃取物的組成分十分單純，主要是由下列重量百分比的組份所組成：三萜類皂苷化合物0.5~99％；類黃酮類化合物0.5~40％；及進一步含有酚類化合物0~20％。其中，三萜類皂苷化合物及類黃酮類化合物是主要的生物活性成分。此外，該三萜類皂苷化合物中的多種組分之分子量皆是落在特定的範圍內，猶如經過篩選，顯示此三萜類皂苷化合物的組分單純且特殊。

經過前述質譜儀的定性及定量分析，本發明更進一步將該油茶粕萃取物製作成特定含量比率的生物農藥，並依照防治對象或使用方式的不同需要，製作成相對應的劑型，例如餌劑、粒劑、溶液、乳劑、微乳劑、水溶性粒劑或水溶性粉劑等。其中，防治對象主要包括扁蝸牛、非洲大蝸牛及福壽螺等軟體動物、根瘤線蟲以及青黴病菌、綠黴病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌及炭疽病菌等植物病害微生物。

第三圖係顯示將油茶粕萃取物進一步製作成生物農藥的過程。首先，以油茶粕萃取物及其他材料混合作為原料，將之捏合、擠壓造粒，再進行烘乾、整粒等工序，即可形成本發明之含有油茶粕萃取物的生物農藥。其中，當該生物農藥需要製作成餌劑的劑型時，該原料除了該油茶粕萃取物之外，還包括誘引劑、防腐劑、填充劑及黏結劑；而當該生物農藥需要製作成水溶劑粒劑的劑型時，該原料則除了該油茶粕萃取物之外，還包括分散劑、黏結劑、崩解劑及載體等。

本發明之生物農藥經過活性試驗，證實其在防治扁蝸牛、非洲大蝸牛及福壽螺等軟體動物、防治根瘤線蟲及抑制青黴病菌、綠黴病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌及炭疽病菌等植物病害微生物之生長等各方面皆具有優異的防治效果，如第四至十五圖所示（可參照附件）。

活性試驗（1）：非洲大蝸牛

參見第四圖的統計表，取五個盆器分別供容置五隻非洲大蝸牛，每個盆器內撒上含7.9%油茶粕萃取物之餌劑約2克，觀察六天後，統計其生命狀態發現其校正死亡率為60%，而十天後的校正死亡率為75%，因此本發明之含油茶粕萃取物的餌劑確實能使非洲大蝸牛致死。

活性試驗（2）：扁蝸牛

參見第五圖的統計表，取三個盆器分別供容置50隻扁蝸牛，其中第一個盆器無施加任何農藥（對照組），第二個盆器內撒上含7.9%油茶粕萃取物之餌劑約2克（試驗組），而第三個盆器內撒上習知之6%聚乙醛農藥約2克，觀察164小時後，統計其生命狀態發現三個盆器中之扁蝸牛的死亡率分別為30%、84%及92%，由此可知本發明之含油茶粕萃取物的餌劑對扁蝸牛之防治效果可媲美習知聚乙醛農藥。

活性試驗（3）：甘藍植株上的扁蝸牛

參見第六圖的統計圖，以含34.62%油茶粕萃取物之水溶性粒劑稀釋成0.46 mg/mL、0.68 mg/mL及0.88 mg/mL等濃度的稀釋液施於甘藍植株上，觀察十二天後，統計扁蝸牛的生命狀態發現12天之半致死濃度（LC50）為0.88 mg/mL。再者，在12天期間中，可觀察到扁蝸牛在死亡前僅是遊走於植株上攀爬，並未啃食植株，使得植株的表面均十分完整，推測本發明之油茶粕萃取物的活性成分還能抑制扁蝸牛的味覺感受器，使其無法正常識別食物，產生拒食作用，且濃度愈高，效果愈明顯。

活性試驗（4）：火龍果植株上的扁蝸牛

參見第七圖的統計圖，以含34.62%油茶粕萃取物之水溶性粒劑稀釋成0.89 mg/mL、1.79 mg/mL及2.61 mg/mL等濃度的稀釋液施於火龍果植株上，觀察十二天後，統計扁蝸牛的生命狀態發現12天之半致死濃度（LC50）為0.89 mg/mL。再者，在12天期間中，可觀察到扁蝸牛在死亡前僅是遊走於植株上攀爬，並未啃食植株，故植株完整，再次驗證油茶粕萃取物的活性成分無論是在火龍果植株或是甘藍植株上，對扁蝸牛具有拒食性。

活性試驗（5）：福壽螺

參見第八圖的統計表，取含86.51%油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成濃度為70μg/mL的稀釋液以及含34.62%油茶粕萃取物之水溶性粒劑稀釋成70μg/mL的稀釋液，同時對福壽螺進行試驗，發現72小時後，所有福壽螺皆死亡，死亡率百分之百，換言之，無論是水溶性粉劑或是水溶性粒劑，只要極低濃度即可使福壽螺致死。

活性試驗（6）：根瘤線蟲

參見第九圖的統計圖，以油茶粕萃取物稀釋成0.25 mg/mL、1.00 mg/mL、3.98 mg/mL及7.97 mg/mL等濃度的稀釋液對根瘤線蟲進行試驗，發現其濃度愈高，對根瘤線蟲的致死效果愈明顯，尤其濃度為7.97 mg/mL的稀釋液之致死率更高達百分之百，證實其確實能有效抑制根瘤線蟲孳長。

活性試驗（7）：植株上的根瘤線蟲

參見第十圖的統計圖，以1g含34.62%油茶粕萃取物之水溶性粒劑對根瘤線蟲進行植株的生長試驗（試驗組），發現其與無施藥之對照組相比，不僅根瘤指數較低，僅剩約40%的根系有根瘤線蟲，且從單位土壤中的線蟲數量來看，數量明顯較少，故確實能有效抑制根瘤線蟲孳長。

活性試驗（8）：青黴病菌（penicillum italicum）

參見第十一圖的數據表，以油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成適當濃度的稀釋液後對青黴病菌進行試驗，發現沒有施藥的對照組之平均生長半徑是2.52公分，然而有施藥的試驗組平均生長半徑則僅只有0.2公分。更進一步來看，該試驗組之平均生長半徑（0.2公分）扣除掉菌絲塊半徑（0.2公分）所得到之淨生長半徑等於零，換句話說其抑制率為100％，證實其對青黴病菌有優異之抑菌效果。

活性試驗（9）：綠黴病菌（penicillum digitatum）

參見第十二圖的數據表，以油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成適當濃度的稀釋液後對綠黴病菌進行試驗，發現沒有施藥的對照組之平均生長半徑是2.72公分，然而有施藥的試驗組則隨著濃度愈高，生長直徑愈小，表示抑菌效果越好，其中試驗組-4之平均生長半徑（0.35公分）扣除掉菌絲塊半徑（0.2公分）所得之淨生長半徑甚至小到0.15公分，表示抑制率可高達94.04％，證實其對綠黴病菌有絕佳的抑菌效果。

活性試驗（10）：立枯絲核菌（rhizoctonia solani）

參見第十三圖的數據表，以油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成適當濃度的稀釋液後對立枯絲核菌進行試驗，發現沒有施藥的對照組之平均生長半徑是3.23公分，然而有施藥的試驗組則隨著濃度愈高，生長直徑愈小，表示抑菌效果越好，其中試驗組-4之平均生長半徑（0.78公分）扣除掉菌絲塊半徑（0.2公分）所得之淨生長半徑等於0.58公分，表示抑制率可達80.77％，證實其對立枯絲核菌有良好的抑菌效果。

活性試驗（11）：尖孢鐮刀菌（fusarium oxysporum）

參見第十四圖的數據表，以油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成適當濃度的稀釋液後對尖孢鐮刀菌進行試驗，發現沒有施藥的對照組之平均生長半徑為3.68公分，然而有施藥的試驗組則隨著濃度愈高，生長直徑漸小，表示抑菌效果漸佳，其中試驗組-3之平均生長半徑（2.42公分）扣除掉菌絲塊半徑（0.2公分）所得之淨生長半徑等於2.22公分，表示抑制率可達36.36％，證實其對尖孢鐮刀菌有適度的抑菌效果。

活性試驗（12）：炭疽病菌（colletotrichum gloeosporioides）

參見第十五圖的數據表，以油茶粕萃取物之水溶性粉劑稀釋成適當濃度的稀釋液後對炭疽病菌進行試驗，發現沒有施藥的對照組之平均生長半徑是4.25公分，然而有施藥的試驗組則隨著濃度愈高，生長直徑漸小，表示抑菌效果漸佳，其中試驗組-4之平均生長半徑（2.08公分）扣除掉菌絲塊半徑（0.2公分）所得之淨生長半徑等於1.88公分，表示抑制率可達53.50％，證實其對炭疽病菌有良好的抑菌效果。

如上所述，藉由本發明特殊之茶皂素萃取純化製程可得到純化後之油茶粕萃取物，其組成分具有高生物活性且單純，此外搭配超高效液相層析串聯質譜之成分定性及定量分析，本發明之油茶粕萃取物所製作出的生物農藥能夠被鑑別及定量控制，且能有效防治扁蝸牛、非洲大蝸牛及福壽螺等軟體動物、防治根瘤線蟲及抑制青黴病菌、綠黴病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌及炭疽病菌等植物病害之生長。

無論如何，任何人都可以從上述例子的說明獲得足夠教導，並據而了解本發明內容確實不同於先前技術，且具有產業上之利用性，及足具進步性。是本發明確已符合專利要件，爰依法提出申請。

1‧‧‧前處理

11‧‧‧樣品粉碎

2‧‧‧除油

21‧‧‧提取油脂

22‧‧‧過濾

23‧‧‧晾乾

3‧‧‧茶皂素萃取

31‧‧‧茶皂素提取

32‧‧‧過濾

33‧‧‧減壓濃縮

34‧‧‧茶皂素沉澱

4‧‧‧茶皂素純化

41‧‧‧茶皂素復溶

42‧‧‧茶皂素沉澱

5‧‧‧後處理

51‧‧‧清洗

52‧‧‧烘乾

第一圖係本發明茶皂素萃取純化的製造流程圖。 第二圖係本發明油茶粕萃取物的鑑定圖譜。 第三圖係本發明生物農藥的製造流程圖。 第四圖係本發明生物農藥對非洲大蝸牛之致死率的數據表。 第五圖係本發明生物農藥對扁大蝸牛之致死率的數據表。 第六圖係本發明生物農藥稀釋成不同濃度對甘藍植株上的扁蝸 牛之致死率的數據圖。 第七圖係本發明生物農藥稀釋成不同濃度對火龍果植株上的扁蝸牛之致死率的數據圖。 第八圖係本發明生物農藥稀釋成不同濃度對福壽螺之致死率的數據表。 第九圖係本發明生物農藥稀釋成不同濃度對根瘤線蟲之致死率的數據圖。 第十圖係本發明生物農藥對植栽上的根瘤線蟲之抑制效果的數據圖。 第十一圖係本發明生物農藥對青黴病菌之抑菌效果的數據表。 第十二圖係本發明生物農藥對綠黴病菌之抑菌效果的數據表。 第十三圖係本發明生物農藥對立枯絲核菌之抑菌效果的數據表。 第十四圖係本發明生物農藥對尖孢鐮刀菌之抑菌效果的數據表。 第十五圖係本發明生物農藥對炭疽病菌之抑菌效果的數據表。

1‧‧‧前處理

11‧‧‧樣品粉碎

2‧‧‧除油

21‧‧‧提取油脂

22‧‧‧過濾

23‧‧‧晾乾

3‧‧‧茶皂素萃取

31‧‧‧茶皂素提取

32‧‧‧過濾

33‧‧‧減壓濃縮

34‧‧‧茶皂素沉澱

4‧‧‧茶皂素純化

41‧‧‧茶皂素復溶

42‧‧‧茶皂素沉澱

5‧‧‧後處理

51‧‧‧清洗

52‧‧‧烘乾

Claims (14)

1. 一種油茶粕萃取物，其成分包含：三萜類皂苷化合物(triterpenoid saponins)，佔該油茶粕萃取物之重量百分比為0.5~99%；及類黃酮類化合物，佔該油茶粕萃取物之重量百分比為0.5~40%。
2. 如申請專利範圍第1項所述之油茶粕萃取物，其成分更包含一酚類化合物，佔該油茶粕萃取物之重量百分比為0~20%。
3. 如申請專利範圍第1項所述之油茶粕萃取物，其中該類黃酮類化合物包括黃酮醇類化合物。
4. 一種生物農藥，其成分包括如申請專利範圍第1或2項所述之油茶粕萃取物，且其防治對象為軟體動物、線蟲或植物病害微生物。
5. 如申請專利範圍第4項所述之生物農藥，其劑型為餌劑、水溶性粒劑、粒劑、水溶性粉劑、溶液、乳劑及微乳劑當中任一者。
6. 如申請專利範圍第5項所述之生物農藥，其劑型為餌劑，用以防治扁蝸牛、非洲大蝸牛、蛞蝓或螺類。
7. 如申請專利範圍第6項所述之生物農藥，其成分更包括一誘引劑、一防腐劑、一填充劑及一黏結劑。
8. 如申請專利範圍第5項所述之生物農藥，其劑型為水溶性粒劑，用以防治扁蝸牛、非洲大蝸牛、蛞蝓、螺類、線蟲或菌類。
9. 如申請專利範圍第8項所述之生物農藥，其成分更包括一分散劑、一崩解劑、一黏結劑及載體。
10. 如申請專利範圍第5項所述之生物農藥，其劑型為水溶性粉劑，用以防治福壽螺、扁蝸牛、非洲大蝸牛、蛞蝓、螺類、線蟲或菌類。
11. 如申請專利範圍第10項所述之生物農藥，其成分更包括一防腐劑及一填充劑。
12. 一種生物農藥，其包括如申請專利範圍第1或2項所述之油茶粕萃取物，且其防治對象為根瘤線蟲。
13. 一種生物農藥，其包括如申請專利範圍第1或2項所述之油茶粕萃取物，用以抑制植物病害微生物之生長。
14. 如申請專利範圍第13項所述之生物農藥，其中該植物病害微生物係選自於由青黴病菌、綠黴病菌、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)以及立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)所組成之群組。