TWI607091B - 用以偵測肺癌發生的方法及套組 - Google Patents

Description

用以偵測肺癌發生的方法及套組

本揭示內容是關於癌症發生的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種用以對一個體進行肺癌風險評估的方法或套組。

個體與個體間去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的相似度約為99.9%。個體的特有表型是取決於剩下的0.1%差異。除了造成表型差異外，上述「微小」差異亦與個體是否會發生疾病相關。已有許多研究希望了解某些疾病之發生風險與特殊變異(variant)之遺傳或單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)之間的關聯性。SNP是指一鹼基位置，在群體中該鹼基位置發生單一鹼基取代的頻率至少為1%；在人類基因體(genome)中，平均每約1,900個鹼基對即會出現一個SNP。

已知有數種SNP與癌症發生相關。舉例來說，位於表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)基因之rs4444903的SNP，可能會導致膽囊癌及肺癌；分別位於乳癌1(breast cancer 1,BRCA1)基因及BRCA2基因之rs1799950及rs1799954的SNP與乳癌的發生相關；位於骨髓過氧化酶(myeloperoxidase,MPO)基因之rs2333227的SNP可能會造成胃癌及肺癌；而位於X輻射修復交互互補2(X-ray repair cross complementing 2,XRCC2)基因之rs3218536的SNP則可能在乳癌及卵巢癌的發生上扮演著重要的角色。

Yes-相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)亦稱為YAP或YAP165，是由位於人類染色體11q22之YAP1基因編碼而成。YAP1是一種具多功能性的細胞內接合蛋白(junctional protein)及轉錄增感劑(transcriptional co-activator)，YAP1的異常表現可能會導致細胞內訊息傳遞失常，進而造成不同疾病的產生。已知YAP1的不正常表現與多種類型的癌症相關。舉例來說，在包含肝癌、食道鱗狀上皮細胞癌、非小細胞癌及卵巢癌等不同人類癌症中皆可觀察到YAP1的過量表現。YAP1於細胞核及細胞質的不當表現則與結腸腺癌、肺腺癌及卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma)的發生有關。此外，即使是YAP1的單一S127A突變，亦會增強乳癌及黑色素瘤的生長及轉移能力。因此，YAP1蛋白的不正常表現往往與癌症密切相關。

肺癌是最常造成男性及女性死亡的癌症之 一，平均每年約有1-2百萬人是死於肺癌。然而，目前利用基因體鑑定及/或蛋白表現來評估肺癌發生風險的方法多數缺乏準確性及有效性。因此，相關領域亟需一種更為準確且有效的方法，據以評估一個體否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容是關於一種用以評估一個體否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險的方法；以及一種用以評估發生風險的套組。

本揭示內容一態樣是關於一種用以從一個體之生物檢體來評估該個體是否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險的方法。該方法包含由該生物檢體萃取DNA；以及偵測該經萃取之DNA是否具有rs193100333之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因座；其中，若該經萃取之DNA具有rs193100333之SNP基因座，代表該個體罹患肺癌或有發生肺癌之風險。

依據本揭示內容某些實施方式，該方法更包含利用一對分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列的引子來放大該經萃取的DNA。

依據本揭示內容某些實施方式，該SNP基因座可利用直接定序(direct sequencing)、引子延伸法(primer extension)、動態對偶基因特異性雜交(dynamic allele-specific hybridization,DASH)、分子信漂(molecular beacon)、SNP微陣列(SNP microarray)、限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、瓣狀核酸內切酶(flap endonuclease,FEN)、單股結構多形性(single strand conformation polymorphism)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、變性高效液相層析法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)、全擴增高解析熱熔解(high-resolution melting of the entire amplicon)或DNA誤配結合蛋白(DNA mismatch-binding protein)來進行偵測。在本揭示內容的實施方式中，是利用引子延伸法來偵測SNP基因座，其中該引子延伸法是利用基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)來進行偵測。

依據本揭示內容某些實施方式，生物檢體可以是皮膚切片檢體、全血檢體、膚色血球層(buffy coat)檢體、血漿檢體、血清檢體、尿液檢體或黏液檢體。

依據本揭示內容的實施方式，個體是一華人(Chinese)。

依據本揭示內容某些實施方式，rs193100333的SNP基因座對應於一YAP1蛋白的突變，在該突變中蛋白位置331之精胺酸(arginine)會取代為色胺酸(tryptophan)。

本揭示內容之另一態樣是關於一種用以偵測源自一個體之生物檢體中rs193100333之SNP基因座的套組，以評估該個體是否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險。該套組包含一對分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列的引子，可藉由一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)來放大生物檢體中包含rs193100333之SNP基因座的DNA片段；以及PCR反應試劑，其係包含PCR反應酵素、MgCl₂、去氧核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP)、PCR反應緩衝液及二次蒸餾水(double-distilled water)。

在本揭示內容某些實施方式中，套組更包含一作為正對照組的DNA模板，該DNA模板之核苷酸序列具有一rs193100333之SNP基因座。在本揭示內容其他實施方式中，套組更包含一作為負對照組的DNA模板，該DNA模板之核苷酸序列不具一rs193100333之SNP基因座。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術 領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖是依據本揭示內容之實施例所繪示的族譜，其中(A)為原發病家族(original family)的族譜，而(B)則為驗證族群(validation cohort)的族譜；箭頭標示為指標個案(proband)，以形狀符號標示性別，方形代表男性，而圓形代表女性；形狀符號內的+、x及NA分別代表YAP1 R331W帶因者(carrier)、非帶因者及DNA無法取得者；以斜線劃過之形狀符號表示該個體已死亡；位於形狀符號下方的數字代表該個體之年齡；以及第2圖是依據本揭示內容之實施例所繪示的柱狀圖，其中(A)為特定細胞的細胞聚落形成能力(colony formation ability)，(B)為特定細胞的侵犯能力(invasion ability)。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學 與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

在本說明書中，「單核苷酸多型性」(single nucleotide polymorphism,SNP)是指一DNA序列變異；更具體來說，該DNA序列變異是指在一物種之不同個體間，或是在一個體之成對染色體間，基因體(或其他共享序列)中單一核苷酸(A、T、C或G)會隨著個體/染色體的不同而不同。一般來說，隸屬於國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)及國家人類基因研究機構(National Human Genome Research Institute,NHGRI)的單核苷酸多型性資料庫(Single Nucleotide Polymorphism Database,db SNP)會對各SNP指定一SNP參考識別碼(reference SNP ID,rs)。

「核苷酸序列」(Nucleotide sequence)、「多核苷酸」(polynucleotide)及「核酸」(nucleic acid)在本說明書中為可互換的詞彙，依據本揭示內容，當可理解該些詞彙是指一雙股DNA、一單股DNA或所述DNA的轉錄產物(例如核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子)。本發明之核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以分離方法或基因工程方法(genetic engineering method)進行萃取及純化(或 部分純化)；該分離方法包含，但不限於，離子交換層析法(ion-exchange chromatography)及分子粒徑篩析層析法(molecular size exclusion chromatography)；基因工程方法則可以是放大(amplification)、扣除雜交法(subtractive hybridization)、轉殖(cloning)、次轉殖(sub-cloning)、化學合成或該些基因工程方法之組合。

「個體」(subject)一詞在本說明書是指受益於本揭示內容之方法的哺乳類動物(包含人類)。此外，除非另有所指，否則「個體」(subject)一詞同時包含男性及女性。依據本揭示內容之實施方式，個體為一華人(Chinese)。

本揭示內容是關於一種用以評估風險的方法，其係藉由偵測rs193100333的SNP基因座來評估一個體的肺癌發生風險；以及一種用以偵測rs193100333之SNP基因座的套組。

本揭示內容的一態樣是關於一種以源自一個體之生物檢體來評估該個體是否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險的方法。該方法包含由該生物檢體萃取DNA；以及偵測經萃取之DNA是否具有rs193100333之SNP基因座；其中，若經萃取之DNA具有rs193100333之SNP基因座，代表該個體罹患肺癌或有發生肺癌之風險。依據本揭示內容某些實施方式，該方法更包含利用一對分別具體序列編號：1及2之核苷酸序 列的引子來放大經萃取之DNA。在PCR反應中，該對引子可專一地放大一段包含rs193100333之SNP基因座的DNA片段。放大的DNA片段可用以偵測rs193100333的SNP基因座，且增加本發明方法風險評估的準確性。

依據本揭示內容的實施方式，可利用一試驗來偵測rs193100333的SNP基因座，該試驗是選自由直接定序(direct sequencing)、引子延伸法(primer extension)、動態對偶基因特異性雜交(dynamic allele-specific hybridization,DASH)、分子信漂(molecular beacon)、SNP微陣列(SNP microarray)、限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、瓣狀核酸內切酶(flap endonuclease,FEN)、單股結構多形性(single strand conformation polymorphism)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、變性高效液相層析法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)、全擴增高解析熱熔解(high-resolution melting of the entire amplicon)或DNA誤配結合蛋白(DNA mismatch-binding protein)所組成的群組。

在本揭示內容一實施方式中，是對個體之 全基因體直接定序，藉以偵測rs193100333的SNP基因座。可使用次世代定序法(next generation sequencing assay,NGS assay)來進行全基因體定序。NGS是先對單一的基因體DNA進行切割，形成一包含不同小片段的資料庫(library)，再以數以百萬之平行反應均勻且準確地分析該些小片段的序列。經確認的鹼基串(稱為序列讀段，read)可利用一已知的參照基因體(作為基因體支架，scaffold)進行重組(再定序，resequencing)，或是在無參照基因體的情況下直接進行重組(重新定序，de novo sequencing)。經重組排列的序列讀段可用以辨讀基因體DNA中各染色體的全長序列。

在本揭示內容另一實施方式中，是利用引子延伸法來偵測rs193100333的SNP基因座。可使用基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)來進行引子延伸法。質譜分析是一種可敏感地分辨生物分子之非均質集合體中各成分的分子量，進而確認各成分的技術。MALTI-TOF MS是將欲進行分析的檢體置於一紫外光吸收基質墊片(UV-absorbing matrix pad)中，再對該檢體照射一短雷射脈衝。離子化的分子會加速離開(即脫附，desorption)基質墊片，移動至一朝向偵測器的電場。到達偵測器的「飛行時間」(time of flight)是取決於各分子的重量/電荷(mass/charge,m/z)比。 在利用MALTI-TOF MS進行DNA定序時，是先將欲進行定序的DNA序列以4次獨立的反應(各反應包含三個rNTP鹼基及一個特定的dNTP)，於活體外轉錄成RNA。RNA水解酶無法對轉錄RNA中dNTP嵌入的位置進行切割，因而產生不同的片段。各片段具有一特定的m/z比，在MALTI-TOF光譜上會形成特定的波峰。再將由DNA檢體測得之MALTI-TOF質量訊號與參照序列(包含4種切割反應之產物)之預期的m/z光譜進行比對。任何檢體DNA及參照DNA序列間的SNP差異皆會在光譜上產生一可預期的平移，據以推斷其確切的特性。

在本揭示內容再另一實施方式中，是利用定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)來偵測特定的SNP基因座。qPCR是以可分別標的至各對偶基因之不同的引子組合來放大並同時偵測及定量包含SNP基因座的DNA檢體。相較於其他SNP的放大週期，設計良好的引子可在較早的週期放大其標的SNP。藉由個別的qPCR反應來偵測各SNP，以辨別二種以上的對偶基因。為達到足夠高的專一性，可在引子序列3’端附近置入一人工誤配(artificial mismatch)，該技術一般稱為Taq-MAMA。相較於單一誤配，人工誤配會對非標的對偶基因造成一更大的放大延遲，且基本上不會影響標的SNP的放大反應。

在本揭示內容再另一實施方式中，是對包 含rs193100333之SNP基因座的特定DNA片段進行直接定序，以偵測SNP基因座。

依據本揭示內容之實施方式，生物檢體可以是皮膚切片檢體、全血檢體、膚色血球層(buffy coat)檢體、血漿檢體、血清檢體、尿液檢體或黏液檢體。較佳是以全血檢體作為生物檢體；更佳是以由全血檢體取得之白血球細胞及血小板作為生物檢體。

依據本揭示內容之實施方式，rs193100333的SNP基因座對應於一YAP1蛋白的突變，在該突變中蛋白位置331之精胺酸會取代為色胺酸。

本揭示內容的另一態樣是關於一種用以偵測一個體之生物檢體中rs193100333之SNP基因座的套組，藉以評估該個體是否罹患肺癌或是否有發生肺癌之風險。該套組包含一對引子、PCR反應試劑及用以指示使用者如何使用套組的說明書。該對引子分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列，在一PCR反應中可放大生物檢體中包含rs193100333之SNP基因座的DNA片段。該PCR反應試劑包含PCR反應酵素、MgCl₂、去氧核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP)、PCR反應緩衝液及二次蒸餾水。

依據本揭示內容某些實施方式，該套組更包含一作為正對照組的DNA模板，該DNA模板的核苷酸序列中具有一rs193100333之SNP基因座。依據本揭示內容其他實施方式，該套組更包含一作為負對照組的 DNA模板，該DNA模板的核苷酸序列中不具rs193100333之SNP基因座。

本揭示內容是關於rs193100333之SNP基因座與肺癌發生的關聯性。下文提出多個實驗例來闡述用以評估一個體是否罹患或是否有發生肺癌風險的方法；以及用以進行風險評估的套組。該些實施例僅用以使本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，而不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料及方法

研究族群

參與本研究之個體係選自於肺腺癌之遺傳流行病學研究(Genetic Epidemiology Study of Lung Adenocarcinoma,GELAC)及癌症篩檢計畫(Cancer Screening Project,CSP)二項計畫之參與者。GELAC計畫包含肺癌病患、病患家屬及經配對的健康對照個體。GELAC中的對照個體是隨機選自於計畫招募時期，於相同醫院進行健康檢查之個體。在本項研究中，所有的肺癌皆為肺腺癌，且GELAC收集了所有病患及其家屬的基因體DNA。CSP是由台灣七個鄉鎮招募之健康個體所參與的前瞻性研究群體。

為確認與肺癌相關的SNP，由GELAC計 畫選取一個具有六位肺癌病患的家族，再分別對其基因體進行全基因體定序分析。家族中母親及其四位女兒為確診之肺腺癌病患，其兒子則為健康個體。父親亦死於肺腺癌，然而已無法取得其DNA。六位肺癌病患皆無吸煙史。

經篩選後，對選自CSP之30位正常個體進行MALDI-TOF試驗分析，以去除會表現於健康個體的SNP。

此外，對1135位正常對照個體及1312位肺癌病患進行分析研究，以了解SNP YAP1 R331W與肺癌之間的關聯性。所有的肺癌病患皆係選自GELAC計畫。在1135位健康個體中，470位個體係選自CSP計畫，而665位個體則係選自GELAC計畫。

依據標準處理程序，自各檢體之周邊血的膚色血球層萃取基因體DNA。本研究是在機構審查委員會(Institutional Review Board)認可核准下進行。本研究亦已取得所有病患之簽署知情同意書。

以次世代定序法(next generation sequencing assay,NGS assay)進行基因定序

依照標準處理程序(Life Technologies,Foster City,CA)建立SOLiD^TM 4系統的個體配對資料庫(Mate-paired libraries)。簡單來說，先將基因體DNA剪切約為3kb大小的片段以製備資料庫，該些片段可作為乳化聚合酶連鎖反應(emulsion PCR)的模板。利用轉接序列(adapter sequence)來連結資料庫片段及磁珠，接著以SOLiD^TM EZ Bead^TM系統(Life Technologies,Foster City,CA)進行轉殖放大。修飾與磁珠連結之DNA片段的3’端，藉以使磁珠附著於玻片上。將SOLiD^TM定序引子與轉接序列雜交後(hybridized)，利用四種螢光標記之雙鹼基探針(di-base probe)進行連接型定序(ligation-based sequencing)。分別以二次不同的連接反應來定序各核苷酸，以增加定序的準確度。分別對正向標誌(forward tag,F3 tag)及反項標誌(reverse tag,R3 tag)之50個鹼基對進行定序。依據使用操作說明，利用SOLiD^TM BioScope^TM軟體來比對定序結果及人類基因體參照序列(hg19)。

以基質輔助雷射脫附飛行時間質譜儀(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)進行基因定序

依據Su K-Y等人所建立之SNP基因定序方法(Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)T790M Mutation Predicts Shorter EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor Response Duration in Patients With Non-Small-Cell Lung Cancer,Journal of Clinical Oncology,30：433-440,2012)，利用MassARRAY系統(SEQUENOM,San Diego,CA)進行MALDI-TOF MS，以確認NGS試驗所偵測到的基因體變異。

以定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)進行基因定序

依據使用操作說明進行TaqMan型qPCR試驗(Life Technologies,Carlsbad,CA)，以對YAP1 R331W對偶基因進行基因定序。

對特定DNA片段進行基因定序

依據使用操作說明，利用Pacific Biosciences(Pacific Biosciences,Menlo Park,CA)對特定的DNA片段及資料庫構建進行序列分析。為建構5kb***資料庫，以一對分別具有序列編號：1(當將YAP1 rs193100333標記為+1時，位於-594bp)及序列編號：2(當將YAP1 rs193100333標記為+1時，位於+4612bp)之引子利用PCR反應來放大200奈克(ng)之基因體DNA。純化及末端修復放大之DNA片段後，將其與SMRTbell定序轉接子連結。以0.6倍體積之Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman Coulter Genomics,Denver,CO)純化製得的定序資料庫三次。將SMRTbell定序資料庫、定序引子及聚合酶(polymerase)均勻混合後，利用PacBio RS儀器(定序週期為120分鐘)進行Pacific Biosciences定序。再分析初步結果(Pacific Biosciences,Menlo Park,CA)。依據使用操作說明，以v.2化學(v.2 chemistry)及v.1.3.3分析軟體(Pacific Biosciences,Menlo Park,CA)對所有的資料庫進行定序分析。

生物資料分析

利用標準SOLiD軟體BioScope(Life Technologies,Foster City,CA)來分析包含影像分析、比對人類參照基因體(UCSC Hg19)及偵測單一核苷酸突變等定序資料。以SIFT軟體註釋偵測到的基因體變異。

本發明包含四個篩選風險對偶基因(risk alleles)的步驟。第一步驟整合了「研究族群」部分所述之選自GELAC計畫、具有六位肺癌病患之家族成員間的遺傳關係。由於父親(無法取得其DNA)、母親及四位女兒皆為肺腺癌病患，而兒子則非肺腺癌病患，因此推論雙親中至少一位帶有風險對偶基因，並將該基因遺傳給罹患肺腺癌的女兒，而將非風險基因遺傳給非患病之兒子。據此，女兒可能帶有異型組合(heterozygous)或同型組合(homozygous)的風險對偶基因。篩選由NGS偵測到且符合遺傳特性的突變。

以MALDI-TOF MS分析資料進行第二步驟之篩選。利用MALDI-TOF MS平台來確認由第一篩選步驟所得到之非同義突變(non-synonymous)。

排除經MALDI-TOF MS確認之不正確的基因型(genotype)後，篩選的第三步驟係將剩下的候選突變與已發表之四種基因體(包含YH1、Korean、Watson及Venter)進行比對。排除該四種基因體的突變。

在最後的篩選步驟中，由於假設致病對偶 基因在台灣具有很低的對偶基因頻率，因此利用MALDI-TOF MS對30位選自CSP之正常個體進行基因定序以分析候選突變。進一步排除於30位正常個體中任一位個體所偵到的突變，去確保疾病候選突變在非患病個體的低發生率。利用1312位肺癌病患及1135位正常個體、分二步驟來確認本研究之發現。在第一確認步驟中，利用MALDI-TOF MS對1135位正常個體及651位肺線癌病患進行定序分析，藉以驗證經前述四項篩選步驟篩選出的候選突變。在第二確認步驟中，再利用TaqMan型qPCR定序分析第一步驟中顯著的風險對偶基因。

細胞聚落形成試驗

為了解細胞之非貼附生長的能力，將溶於生理食鹽水之0.7%瓊脂糖(agarose)置於6-孔洞盤之底層。再於上層置入溶於包含10%胎牛血清之細胞培養液的0.3%瓊脂糖。將A549肺癌細胞懸浮於1毫升之包含0.35%低熔點瓊脂糖的RPMI細胞培養液中，再以每孔洞2 x 10³個細胞的密度種植於6-孔洞盤之上層。三週後，以生理食鹽水洗滌各孔洞，再以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)進行固定，最後利用0.1%結晶紫染劑染色細胞。之後，於三次獨立實驗分別計數超過0.5毫米之細胞聚落。

基底膜基質侵犯試驗(Matrigel Invasion Assay)

本研究進一步利用博登細胞移形器(Boyden chamber)來評估細胞的侵犯能力；博登細胞 移形器是由二個填充細胞培養液的隔室(compartment，即上隔室及下隔室)所組成，二隔室中間隔有一微孔洞聚碳酸酯薄膜(polycarbonate membrane)。在具有8微米孔洞的聚碳酸酯薄膜(Costar,Cambridge,MA)上塗佈基底膜基質(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)，再置入二隔室之間。將1 x 10⁴個A549肺癌細胞種植至移形器的上層隔室(該層隔室包含200微升、無血清的細胞培養液)，使其可穿透薄膜的孔洞移動至下層隔室(該層隔室具有包含10%胎牛血清的細胞培養液)。培養16小時後，以甲醇固定穿透基底膜基質塗佈薄膜之細胞，再以吉姆沙溶液(Giemsa solution,Sigma,St Louis,MO)進行染色。於光學顯微鏡下，以200倍的放大倍率計數移動至下層隔室的細胞。實驗重複三次。

統計分析

以Fisher正確檢定(Fisher’s exact test)來檢測不同組別間發生頻率的差異。利用包含個體年齡、性別及吸煙狀況共變數(covariate)的多變數邏輯回歸分析(multivariate logistic regression)來評估風險對偶基因的風險程度。以SAS 8(SAS Institute Inc.,Cary,NC)進行統計分析。所以試驗皆為雙尾檢定(two-tailed)，當p值<0.05時代表具有統計差異。

實施例1 於肺癌病患確認 YAP1 R331W突變

1.1 基因定序及驗證YAP1 R331W

為驗證SNP與肺癌之間的關聯性，對一選自上述GELAC計畫之高密度肺腺癌家族(以下簡稱「原發病家族」(original family))進行全基因體定序，其中該家族的母親(編號：502，以箭頭指示)及其四位女兒(編號：601-604)皆罹患肺癌，而其兒子(編號：605)則無罹患肺癌(第1A圖)。NGS試驗的平均產量(throughput)約為73Gb，且具有24倍的覆蓋率(coverage)。每個體平均可由NGS試驗檢測出約3百萬個單一核苷酸突變(表1)。

為比較罹患或無罹患肺癌之個體間的差異，使用顯性模式(dominant)來進行分析，結果指出有70,827個SNP僅於母親及其四位女兒體內偵測到，而不會於兒子體內偵測到。在該些SNP中，可確認240個非同義對偶基因。

進一步於選自上述CSP計畫之30位正常華人個體中，以MALDI-TOF定序分析該240個對偶基因，以排除正常個體之SNP。篩選後，剩下6個對偶基因，其中之一位於染色體11q之YAP1基因的外顯子(exon)6。該SNP的SNP參考識別碼為rs193100333，可對應至YAP1蛋白之突變，在該突變中蛋白位置331 之精胺酸會取代為色胺酸。

接著，為驗證YAP1 R331W於肺癌病患體內的表現，以MALDI-TOF MS試驗及qPCR試驗對1312位肺癌病患(以下簡稱「驗證族群」(validation cohort))及1135位正常個體進行定序分析。如表2所示，YAP1 R331W於正常個體的低發生率(0.18%)與1,000基因體計畫之亞洲族群的報導頻率一致(每286人有1人，或0.35%，結果未顯示)。同時，在肺癌病患中，突變帶因者的發生率會提高至1.1%(p=0.0095)，風險對比值(odd ratio,OR)為6.1。調整年齡、吸煙及性別等變數後，得到的OR為5.9(p=0.019)(表3)。該比例遠高於之前全基因體肺癌研究所報導之風險對比值(<2.0)。

該些結果指出，YAP1 R331W突變可作為一種用以對肺腺癌進行風險評估的潛力指標。

1.2 肺腺癌家族之族譜

1.2.1 原發病家族之族譜

有鑑於基因突變及/或SNP基因座與疾病(例如癌症)的遺傳罹病性(susceptibility)相關，進一步追蹤原發病家族中指標個案之親戚的YAP1 R331W表現，其中箭頭所指為指標個案(編號：502)，且該家族包含四代(第1A圖)。檢測能取得DNA之所有個體的YAP1突變。指標個案的父親有二位妻子，因此指標個案有一個姐妹及三位同父異母的兄弟；其中二位(編號：532及501)已確診罹患肺腺癌。個體532帶有YAP1突變，個體501的DNA檢體則無法取得。然而，由YAP1的遺傳模式推測，個體編號：501亦應為一突變帶因者。

個體編號：501有五個孩子。在可取得DNA的四個孩子中，二位檢測結果為陽性(編號：653及654)，進而接受低劑量電腦斷層(low dose computed tomography,LDCT)掃描。個體編號：653為一非吸煙者，LDCT檢測結果為陽性，進一步檢查發現罹患第I期肺腺癌。至於個體編號：654，經診斷 後發現其肺部右上葉(right upper lobe,RUL)具有一8毫米的部毛玻璃陰影(pulmonary ground-glass opacity,GGO)病變，並持續接受觀察中。二位非帶因者(編號：651及655)的肺部病變檢測結果則為陰性。

個體編號：532(已過世)有三個孩子，分別取得其DNA進行研究分析(編號：656、657及659)。個體編號：656罹患肺腺癌，卻為YAP1野生型(wild-type)帶因者，由其四個孩子取得之DNA(編號：753、754、755及756)對YAP1突變為陰性，且皆為健康個體。個體編號：657帶有YAP1突變，且其三年前的LDCT掃描顯示雙側肺部有4個4到8毫米的GGO病變；然而，該個體並未參與本研究後續的訪談。個體編號：659亦帶有YAP1突變，且肺部之左下葉(left lower lobe,LLL)有一5毫米的GGO病變。

1.2.2 驗證族群的族譜

在驗證族群之1312個體中，14位肺腺癌病患帶有YAP1突變。可取得其中六位的家族資料(第1B圖)。收集六位病患之親戚的基因體DNA進行YAP1突變檢測。

在家族A中，指標個案(編號：53，箭頭標示者)之帶有YAP1突變的兄弟(編號：54)在拜訪前二個月即診斷出患有晚期肺腺癌。

在家族E中，經LDCT掃描後發現三位YAP1突變帶因者(編號：61、38及39)之肺部皆具有GGO病變(姐妹之肺部左下葉具有一8毫米的GGO病變； 而二位女兒則分別在肺部右上葉具有一6毫米的GGO病變，以及肺部左下葉具有一5毫米的GGO病變)。相較之下，帶有野生型基因的女兒(編號：40)則無GGO病變。

在家族D中，指標個案(編號：57，箭頭標示者)的三個兄弟姐妹患有其他類型的癌症，然而研究人員無法取得其DNA檢體。值得注意的是。家族D及E中，帶有YAP1突變基因的指標個案分別患有乳癌。

基於上述發現，可將原發病家族及六個新帶因家族依其成員的健康狀況分為肺腺癌、GGO、無罹患癌症及無更新健康狀況。該些結果指出，帶有YAP1 R331W突變基因之個體罹患肺腺癌的機率顯著地高於帶有野生型基因的個體(10：0及1：7；p=0.0003)(表4)。

綜合上述，該些結果指出YAP1 R331W 突變與肺腺癌或GGO的發生具有緊密的關聯性。

實施例2 利用YAP1 突變細胞來確認 YAP1 R331W突變及肺腺癌或GGO的功能關聯性

在本實施例中，是利用會表現野生型YAP1的人類肺腺癌細胞株A549來研究YAP1 R331W突變在肺腺癌或GGO扮演的角色。利用可標的至YAP1之3’UTR的shRNA-YAP1慢病毒(lentivirus)來靜默(silenced)內源性YAP1的表現；為進行比較，分別將會表現野生型YAP1及YAP1 R331W的載體轉染至YAP1-靜默A459細胞中，使其過量表現。依據「材料及方法」部分所述之步驟，分別利用細胞聚落形成及細胞侵犯試驗來評估實驗結果。第2A圖及第2B圖分別闡述該些結果。

如第2A圖所示之西方墨點法結果，相較於對照組(即A549或sh-lacZ)，shRNA-YAP1載體會成功地抑制YAP蛋白的表現；在YAP1表現抑制細胞(YAP1 knockdown cell；即YAP1-野生型或YAP1-突變型)中，過量表現野生型YAP1或YAP1 R331W可回復YAP1的表現。此外，轉入YAP1 R331W突變會顯著地增加YAP1表現抑制細胞的細胞聚落形成能力，該細胞聚落形成能力甚至會強於對照組細胞的細胞聚落形成能力。

第2B圖之細胞侵犯試驗結果指出，相較於正常的A549細胞、shRNA-lacZ表現抑制細胞(sh-lacZ)、shRNA-YAP1表現抑制細胞(sh-YAP1)、 過量表現對照載體的YAP1表現抑制細胞(載體)及過量表現野生型YAP1的YAP1表現抑制細胞(YAP1-野生型)，過量表現YAP1 R331W(YAP1-突變型)的細胞具有較強的侵犯能力。

該些結果指出，將YAP1 R331W突變轉入至野生型YAP1蛋白會增加細胞之細胞聚落形成及侵犯的能力。

總結上述，該些實施例的結果指出YAP1 R331W突變可能會導致癌細胞的細胞聚落形成及侵犯；該結果與臨床試驗之結果一致，即YAP1 R331W突變具有遺傳性，且與肺癌的發生密切相關。因此，YAP1 R331W點突變可作為一種指標，用以評估一個體的肺癌發生風險。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

<110> 何 炳慶 俞 松良 張 松晟 李 克昭 楊 泮池 陳 璿宇

<120> 用以偵測肺癌發生的方法及套組

<130> P2806-TW

<160> 2

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YAP1-F

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YAP1-R

<400> 2

Claims (11)

1. 一種以一個體之一生物檢體來評估該個體是否罹患肺腺癌或是否有發生肺腺癌之風險的方法，包含：由該生物檢體萃取DNA；以及偵測該經萃取之DNA是否具有一rs193100333之單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因座；其中，若該經萃取之DNA具有該rs193100333之SNP基因座，代表該個體罹患肺腺癌或有發生肺腺癌之風險。
2. 如請求項1所述之方法，更包含利用一對引子來放大該經萃取之DNA，其中該對引子分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列。
3. 如請求項1所述之方法，其中該SNP基因座是利用直接定序(direct sequencing)、引子延伸法(primer extension)、動態對偶基因特異性雜交(dynamic allele-specific hybridization,DASH)、分子信漂(molecular beacon)、SNP微陣列(SNP microarray)、限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、定量聚合酶連鎖反應(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、瓣狀核酸內切酶(flap endonuclease,FEN)、單股結構多形性(single strand conformation polymorphism)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)、變性高效液相層析法(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)、全擴增高解析熱熔解(high-resolution melting of the entire amplicon)或DNA誤配結合蛋白(DNA mismatch-binding protein)來進行偵測。
4. 如請求項3所述之方法，其中該引子延伸法是基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)。
5. 如請求項1所述之方法，其中該生物檢體可以是一皮膚切片檢體、一全血檢體、一膚色血球層(buffy coat)檢體、一血漿檢體、一血清檢體、一尿液檢體或一黏液檢體。
6. 如請求項1所述之方法，其中該個體是一華人。
7. 如請求項1所述之方法，其中該rs193100333的SNP基因座對應於一YAP1蛋白的突變，在該突變中蛋白位置331之精胺酸(arginine)會取代為色胺酸(tryptophan)。
8. 一種用以偵測一個體之生物檢體中是否有rs193100333之SNP基因座的套組，該套組包含：一對分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列的引子，可藉由一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)來放大該生物檢體中一包含該rs193100333之SNP基因座的DNA片段；以及PCR反應試劑。
9. 如請求項8所述之套組，更包含一作為正對照組的DNA模板，其中該DNA模板的核苷酸序列具有該rs193100333之SNP基因座。
10. 如請求項8所述之套組，更包含一作為負對照組的DNA模板，其中該的DNA模板的核苷酸序列不具該rs193100333之SNP基因座。
11. 如請求項8所述之套組，其中該PCR反 應試劑包含PCR反應酵素、MgCl₂、去氧核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphate,dNTP)、PCR反應緩衝液及二次蒸餾水。