TWI594768B - Topical liposomes and their use - Google Patents

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Description

局部投予用脂質體及其用途
本發明係關於一種局部投予用脂質體及利用該脂質體之抗腫瘤劑。
脂質體包含構成活體之細胞膜之磷脂質，而生物相容性較高，又，於活體內可一面保護藥物或活性成分免受分解酶等之影響一面將其運送，作為藥物遞送系統(Drug Delivery System)之有用工具而受到關注。現今，為了提高血中滯留性，業界開發出經聚乙二醇(PEG，Polyethylene Glycol)修飾的脂質體，或者為了提高血中穩定性及強度而含有不含不飽和鍵之氫化磷脂醯膽鹼、或提高膜之相轉移溫度之膽固醇作為構成脂質的脂質體，並被廣泛使用。
另一方面，引起RNA干擾(以下記作「RNAi」)之RNAi分子作為用以治療腫瘤等之有用工具而受到關注，業界開發出可抑制腫瘤增殖之各種RNAi分子。又，業界開發出使用包含RNAi分子與脂質體之複合體(脂複合體(lipoplex))，而將作為活性成分之RNAi分子傳遞至腫瘤細胞之方法(非專利文獻1~3)。
迄今為止，本發明者等人開發出以參與DNA合成之胸腺嘧啶核甘酸合成酶(以下記作「TS」)作為標靶之RNAi分子(專利文獻1)，並報告有使用利用PEG修飾該RNAi分子並且以特定之比率含有膽固醇之脂質體，藉由靜脈內投予而傳遞至腫瘤，藉此，可抑制表現TS(thymidylic acid synthase，胸腺嘧啶核甘酸合成酶)之腫瘤之增殖； 進而，藉由將該脂質體與化學療法劑併用，可提高對腫瘤之指向性，而使由RNAi分子所獲得之抗腫瘤效果顯著提高(專利文獻2)。
然而，於該領域仍然謀求能夠將可抑制腫瘤增殖之RNAi分子更有效率地導入腫瘤細胞的方法。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO 2010/113844
[專利文獻2]WO 2012/161196
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Qixin Leng et al., Drug Future. 2009 September; 34 (9): 721.
[非專利文獻2]Sherry Y. Wu et al., The AAPS Journal, Vol.11, No.4, December 2009.
[非專利文獻3]B. Ozpolat et al., Journal of Internal Medicine 267; 44 - 53 2009.
本發明之目的在於提供一種可將活性成分有效率地傳遞至標靶細胞之新穎傳遞方法。
更詳細而言，本發明之目的在於提供一種能夠將可抑制腫瘤增殖之RNAi分子有效率地傳遞至腫瘤細胞之新穎脂質體。
本發明者等人為了解決上述課題反覆進行努力研究，結果發現：藉由於包含二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE，Dioleoyl Phosphoethanolamine)、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質，未經PEG修飾，且不含膽固醇的脂質體上擔載活性成分，並局部投予至含有標靶細胞之部位或其附近，而可將活性成分有效率地傳遞至標靶細胞，從而完成本發明。
即，本發明如下所述。
[1]一種局部投予用脂質體，其包含二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質，該磷脂醯膽鹼具有選自下述(i)~(iii)中之一個以上之特徵：(i)包含至少一條含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(ii)包含至少一條順式之含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(iii)相轉移溫度未達0℃。
[2]如[1]之脂質體，其中陽離子性脂質為氯化O,O'-二(十四碳醯基)-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺(DC-6-14，O,O'-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride)。
[3]如[1]之脂質體，其中磷脂醯膽鹼為1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC，Palmitoyloleoyl Phosphatidylcholine)、或1,2-二(二十碳烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC，1,2-Dieicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。
[4]如[1]之脂質體，其中磷脂醯膽鹼為DOPC。
[5]如[1]之脂質體，其包含DOPE、DOPC及DC-6-14。
[6]如[5]之脂質體，其中DOPE、DOPC及DC-6-14係以3：2：5之莫耳比含有。
[7]一種組合物，其含有如[1]至[6]中任一項之脂質體及活性化合物。
[8]如[7]之組合物，其中活性化合物為核酸。
[9]如[8]之組合物，其中核酸結合於脂質體之外膜表面。
[10]一種抗腫瘤劑，其含有如[1]至[6]中任一項之脂質體、及可藉由RNAi作用而抑制胸腺嘧啶核甘酸合成酶之表現的短髮夾 RNA(shRNA，short hairpin RNA)。
[11]如[10]之抗腫瘤劑，其中shRNA結合於脂質體之外膜表面。
[12]如[10]之抗腫瘤劑，其中shRNA包含序列編號8所表示之鹼基序列。
[13]如[10]之抗腫瘤劑，其與癌症化學療法或癌症化學療法劑併用。
[14]一種組合物，其含有如[10]至[13]中任一項之抗腫瘤劑及癌症化學療法劑。
[15]如[14]之組合物，其中癌症化學療法劑為具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
[16]如[15]之組合物，其中具有TS抑制作用之抗腫瘤劑為5-FU(5-氟尿嘧啶)系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉水合物。
根據本發明，可提供一種可藉由局部投予而將活性成分有效率地傳遞至標靶細胞之新穎脂質體。
更詳細而言，根據本發明，可提供一種可藉由局部投予而將可抑制腫瘤增殖之RNAi分子有效率地傳遞至腫瘤細胞之新穎脂質體。
本說明書包含作為本案之優先權基礎的日本專利申請案2013-095950號之說明書及/或圖式所記載之內容。
圖1表示利用癌症化學療法劑、TS-shRNA、NS-shRNA、以及該等shRNA與癌症化學療法劑之併用對人惡性胸膜間皮瘤細胞所產生之腫瘤生長抑制效果。(A)表示將最終濃度設為5nM之shRNA之結果。(B)表示將最終濃度設為10nM之shRNA之結果。***：p<0.005。
圖2表示利用TS-shRNA及NS-shRNA所產生之人惡性胸膜間皮瘤細胞中之TS表現抑制效果。(A)表示西方墨點法之結果。(B)表示基於西方墨點法之結果的TS表現量之定量結果。TS/β-肌動蛋白係以將 shRNA未處理之對照設為100%之相對值表示。
圖3表示藉由雙螢光素酶檢定(Dual-luciferase assay)的利用各種陽離子脂質體所產生之Luc-shRNA導入效果之比較結果。
圖4係表示惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤增殖之結果的照片圖。各照片之天數表示移植惡性胸膜間皮瘤細胞後之天數。
圖5-1係表示利用各種陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之比較結果的照片圖。(A)對照：表示9%之蔗糖之結果。(B)DEPC：表示含有DEPC之脂質體之結果。(C)DMPC：表示含有DMPC之脂質體之結果。(D)DOPC：表示含有DOPC之脂質體之結果。(E)POPC：表示含有POPC之脂質體之結果。
圖5-2表示基於圖5-1之結果的利用各種陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之定量結果。*：p<0.005。
圖6-1係表示利用DC-6-14之含量不同之陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之比較結果的照片圖。照片自上部起，表示以莫耳比計(A)含有20%之DC-6-14之脂質體、(B)含有35%之DC-6-14之脂質體、(C)含有50%之DC-6-14之脂質體之結果。
圖6-2係基於圖6-1之結果的利用DC-6-14之含量不同之陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之定量結果。*：p<0.005。
圖7-1係表示利用經PEG修飾及未經PEG修飾之各種陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之比較結果的照片圖。(A)PEG修飾POPC：表示經PEG修飾之含有POPC之脂質體之結果。(B)PEG未修飾POPC：表示未 經PEG修飾之含有POPC之脂質體之結果。(C)PEG修飾DOPC：表示經PEG修飾之含有DOPC之脂質體之結果。(D)PEG未修飾DOPC：表示未經PEG修飾之含有DOPC之脂質體之結果。
圖7-2表示基於圖7-1之結果的利用各種陽離子脂質體對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之Luc-shRNA導入效果之定量結果。**：p<0.01。
圖8-1表示利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、癌症化學療法劑(PMX)、以及脂複合體與癌症化學療法劑(PMX)之併用對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之腫瘤生長抑制效果之比較結果的照片圖。(A)對照：表示9%之蔗糖之結果。(B)NS-shRNA：表示僅利用將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體進行處理之結果。(C)TS-shRNA：表示僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體進行處理之結果。(D)PMX：表示僅利用癌症化學療法劑進行處理之結果。(E)PMX+NS-shRNA：表示藉由癌症化學療法劑與將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體之併用而進行處理之結果。(F)PMX+TS-shRNA：表示藉由癌症化學療法劑與將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體之併用而進行處理之結果。
圖8-2表示基於圖8-1之結果的利用各種處理對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之腫瘤生長抑制效果之定量結果。*：p<0.05，***：p<0.01。
圖8-3表示利用對照(9%之蔗糖)、僅利用癌症化學療法劑(PMX)、僅利用將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、或藉由脂複合體與癌症化學療法劑(PMX)之併用而進行處理之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之存活率(%)。
圖8-4表示利用對照(9%之蔗糖)、僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、僅利用將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、僅利用癌症化學療法劑(PMX)、或藉由脂複合體與癌症化學療法劑(PMX)之併用而進行處理之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之平均存活時間(MST)及存活時間增加率(ILS)。
圖9表示利用對照(9%之蔗糖)、僅利用將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體、僅利用癌症化學療法劑(PMX)、或藉由脂複合體與癌症化學療法劑(PMX)之併用而進行處理之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞中之TS mRNA表現量之定量結果。TS mRNA表現量係以將對照設為100%之相對值表示。*：p<0.05，**：p<0.01。
圖10表示藉由雙螢光素酶檢定所獲得的利用各種陽離子脂質體及陽離子脂質體中間體所產生之Luc-shRNA導入效果之比較結果。
圖11表示利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體中間體、癌症化學療法劑(PMX)、以及脂複合體或脂複合體中間體與癌症化學療法劑(PMX)之併用對惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之腫瘤細胞所產生之腫瘤生長抑制效果之比較結果的照片圖。(A)對照：表示9%之蔗糖之結果。(B)PMX：表示僅利用癌症化學療法劑進行處理之結果。(C)TS脂複合體中間體：表示僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體中間體進行處理之結果。(D)PMX+TS脂複合體中間體：表示藉由癌症化學療法劑與將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體中間體之併用而進行處理之結果。(E)TS脂複合體：表示僅利用將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體進行處理之結果。(F)PMX+TS脂複合體：表示藉由癌症化學療法劑與將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體之併用而進行處理之結果。
圖12表示利用癌症化學療法劑及/或將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體或脂複合體中間體進行處理之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之體重之測定結果。
1.脂質體
本發明之脂質體係包含含有二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質之脂質雙層膜的球狀中空體。
作為本發明中可利用之「磷脂醯膽鹼」，具有選自下述(i)~(iii)中之一種以上之特徵：(i)包含至少一條含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(ii)包含至少一條順式之含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(iii)相轉移溫度較低(例如未達0℃、未達-10℃、未達-20℃)。
作為此種「磷脂醯膽鹼」，可列舉：1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、1,2-二(二十碳烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)。較佳為DOPC。
作為本發明中可利用之「陽離子性脂質」，可利用選自氯化O,O'-二(十四碳醯基)-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺(DC-6-14)、氯化N,N-二油醯基-N,N-二甲基銨(DODAC，N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB，N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium bromide)、氯化N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP，N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride)、氯化N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA，N-[2,3-(dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride)、N,N-二甲基-(2,3-二油醯氧基)丙胺(DODMA，N,N-dimethyl-(2,3-dioleoyloxy)propylamine)、及該等之衍生物中之任一種。較佳為陽離 子性脂質為DC-6-14。
較佳為本發明中之脂質體包含DOPE、DOPC及DC-6-14。
脂質體中之DOPE、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質之含有比(莫耳比)可選自DOPE：磷脂醯膽鹼：陽離子性脂質=2~4：1~3：4~6之範圍內。較佳為DOPE：DOPC：DC-6-14=3：2：5。
本發明之脂質體可基於公知方法、例如薄膜振搖法(Bangham法)而製作(A.D.Bangham et al.,J.Mol.Biol.,13,238-252(1965)；A.D.Bangham and R.W.Horne,J.Mol.Biol.,8,660-668(1964))。即，將磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質分別溶解於氯仿等有機溶劑中，以成為上述特定量之方式分取各者並於燒瓶等容器內混合。繼而，使有機溶劑揮發而於容器之底部形成脂質膜後，向其中加入緩衝液等水溶液並進行攪拌，藉此可獲得含有脂質體之懸浮液。再者，於本說明書中，存在將「脂質體」稱為「陽離子脂質體」之情形，該等用語可彼此互換使用。
或者，本發明之脂質體可藉由如下方式獲得：將磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼及陽離子性脂質分別溶解於氯仿等有機溶劑中，以成為上述特定量之方式分取各者，添加有機溶劑(例如總脂質之5~30倍重量、較佳為5~15倍重量、進而較佳為10倍重量之環己烷與環己烷之1~10重量%、較佳為1~5重量%、進而較佳為2重量%之醇(較佳為乙醇))並升溫至50~80℃、較佳為65~75℃，進行混合、溶解。繼而，過濾所獲得之溶液，使用乾冰及丙酮而將有機溶劑冷凍，並藉由乾燥操作而去除後(視需要進行粉碎)，向其中加入緩衝液等水溶液並進行混合，藉此可獲得含有脂質體之懸浮液。於本說明書中，存在將藉由此種方式所獲得之脂質體稱為「脂質體中間體(Presome)」或「陽離子脂質體中間體」之情形。脂質體中間體可於經冷凍乾燥之形態下保存。
本發明之脂質體之粒徑為80nm~200nm，較佳為約100nm。又，本發明之脂質體之ζ電位為40~60mV，較佳為約50mV。於本發明之脂質體為上述脂質體中間體之情形時，粒徑為100nm~600nm，較佳為約100nm~200nm。
本發明之脂質體可用作用以局部投予活性成分之載體。此處，所謂「局部投予」，其目的在於將活性成分直接投予至患部/病灶及/或其附近，而可使該活性成分作用於患部/病灶。因此，於本發明中，所謂「局部投予」，並非意圖使用靜脈注射等而使活性成分作用於全身。局部投予例如可列舉：注射至肌肉內、腹腔內、胸腔內、皮下、皮內、眼內、腦內、腦脊髄內、***內、直腸內、內臟器官內、腫瘤內、塗抹於表皮等，但並不限定於該等。較佳為「局部投予」為腔內投予，進而較佳為胸腔內投予或腹腔內投予。作為「活性成分」，意指醫藥品或化妝品之有效成分，例如可列舉DNA、RNA、DNA-RNA雜合體、蛋白質、肽、化合物等。
2.組合物
本發明之組合物含有上述本發明之脂質體及活性成分，並可將該活性成分用於局部投予。
活性成分可列舉上述者，並無特別限定，例如可列舉：可藉由RNAi作用而抑制編碼於腫瘤細胞中表現並且參與腫瘤細胞之增殖之因子的基因之表現之siRNA或shRNA等。作為「編碼於腫瘤細胞中表現並且參與腫瘤細胞之增殖之因子的基因」，例如可列舉：編碼胸腺嘧啶核甘酸合成酶、VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor，血管內皮細胞生長因子)、EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮細胞生長因子受體)、PDGF(platelet derived growth factor，血小板衍生生長因子)、HGF(Hepatocyte Growth Factor，肝細胞生長因子)、Wint、Bcl-2、存活素(Survivin)等增殖調節因子群、核糖核苷酸還原 酶、DNA聚合酶等核酸合成相關酵素群等之基因，但並不限定於該等。該等基因之基因資訊被揭示於基因庫(GenBank)等公知之資料庫，可基於該等基因資訊而設計、合成siRNA或shRNA。關於可藉由RNAi作用而抑制胸腺嘧啶核甘酸合成酶之表現的shRNA，可使用下文所詳細說明者。又，作為活性成分，亦可使用抗癌劑或癌症化學療法劑。
於本發明之組合物中，活性成分可含有於由脂質體之脂質雙層膜所包圍之中空部，或者亦可結合於脂質雙層膜之外膜表面。較佳為活性成分結合於脂質體之脂質雙層膜之外膜表面。
又，本發明之組合物亦可一併含有脂質體與活性成分、以及醫藥品或化妝品之製造中通常使用之賦形劑、黏合劑、崩散劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解助劑、懸浮劑、等張劑、pH值調整劑、緩衝劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑、組胺酸等。
作為賦形劑，例如可列舉：乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、肌醇、葡聚糖、山梨糖醇、白蛋白、尿素、澱粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素、矽酸、甲基纖維素、甘油、海藻酸鈉、***膠及該等之混合物等。作為潤滑劑，例如可列舉：精製滑石、硬脂酸鹽、硼砂、聚乙二醇及該等之混合物等。作為黏合劑，例如可列舉：單糖漿、葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、蟲膠、甲基纖維素、乙基纖維素、水、乙醇、磷酸鉀及該等之混合物等。作為崩散劑，例如可列舉：乾燥澱粉、海藻酸鈉、瓊脂粉末、昆布糖粉末、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類、月桂基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、澱粉、乳糖及該等之混合物等。作為稀釋劑，例如可列舉：水、乙醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙氧基化異硬脂醇、聚氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類 及該等之混合物等。作為穩定劑，例如可列舉：焦亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、硫代乙醇酸、硫代乳酸及該等之混合物等。作為等張劑，例如可列舉：氯化鈉、硼酸、葡萄糖、甘油及該等之混合物等。作為pH值調整劑及緩衝劑，例如可列舉：檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、磷酸鈉及該等之混合物等。
本發明之組合物可製成適合於局部投予之劑型，可製備成注射劑、懸浮劑、乳化劑、軟膏劑、乳霜劑、錠劑等各種製劑型態。
3.抗腫瘤劑
本發明之抗腫瘤劑含有上述本發明之脂質體及作為活性成分之可藉由RNAi作用而抑制胸腺嘧啶核甘酸合成酶(以下記作「TS」)之表現的shRNA。
本發明中之可抑制TS之表現的shRNA係藉由以TS之mRNA作為標靶，可發揮TS特異性RNAi作用，顯著地抑制TS之表現。此處，所謂「以mRNA作為標靶」，係指下文所詳細說明之shRNA之反義鏈可於嚴格條件下與標靶mRNA雜合。
所謂嚴格條件下，可基於依據常法而形成雜合體之核酸之融解溫度(Tm)而求出。例如作為可維持雜合狀態之清洗條件，可列舉通常為「1×SSC(saline sodium citrate，檸檬酸鈉緩衝溶液)、0.1%之SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)、37℃」之程度之條件，更嚴格為「0.5×SSC、0.1%之SDS、42℃」之程度之條件，進而嚴格為「0.1×SSC、0.1%之SDS、65℃」之程度之條件。
本發明中之shRNA包含：具有與編碼TS之ORF(open reading frame，開放閱讀框)之鹼基序列或其一部分同源之鹼基序列的正義鏈、及於嚴格條件下與該正義鏈雜合的反義鏈。此處，所謂「與ORF之鹼基序列或其一部分同源之鹼基序列」，意指與將ORF之鹼基序列中之胸腺嘧啶置換為尿嘧啶而表示之鹼基序列或其一部分同源的鹼基 序列。
該正義鏈包含15~25個鹼基，較佳為包含19個鹼基。正義鏈之鹼基序列理想為與編碼TS之ORF之鹼基序列同源，但亦可為實質上同源、即相同之序列。即，正義鏈之鹼基序列亦可於ORF之鹼基序列中置換、缺失、***及/或附加1個或複數個、即1~3個鹼基、較佳為1~2個鹼基、更佳為1個鹼基。
該反義鏈具有可於嚴格條件下與正義鏈雜合之鹼基序列。反義鏈只要可於嚴格條件下進行雜合，則亦可為具有包含置換、缺失、***及/或附加1~3個鹼基、較佳為1~2個鹼基、更佳為1個鹼基之錯配者。較佳為反義鏈包含與正義鏈完全互補之鹼基序列。
正義鏈及反義鏈之鹼基序列可基於編碼TS之公知之鹼基序列(基因庫：CR601528.1)進行選擇。作為選擇該等鹼基序列之方法已知有各種方法，例如可使用siRNA Design Support System(siRNA設計支援系統)(TAKARA BIO股份有限公司)等。
於本發明中，作為正義鏈，可列舉包含下述鹼基序列者，但並不限定於該等：5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(序列編號1)；5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(序列編號3)；5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(序列編號5)；5'-GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(序列編號9)。
較佳為本發明中之shRNA含有正義鏈5'-GUAACACCAUCGAUCAUGA-3'(序列編號1)與反義鏈5'-UCAUGAUCGAUGGUGUUAC-3'(序列編號2)；正義鏈5'-GAAUACAGAGAUAUGGAAU-3'(序列編號3)與反義鏈5'-AUUCCAUAUCUCUGUAUUC-3'(序列編號4)；或正義鏈5'-CGAUCAUGAUGUAGAGUGU-3'(序列編號5)與反義鏈5'-ACACUCUACAUCAUGAUCG-3'(序列編號6)；正義鏈5'- GGGUGUUUUGGAGGAGUUGTT-3'(序列編號9)與反義鏈5'-AACAACUCCUCCAAAACACCC-3'(序列編號10)。
進而較佳為本發明中之shRNA含有包含序列編號1所表示之鹼基序列之正義鏈與包含序列編號2所表示之鹼基序列之反義鏈。
正義鏈與反義鏈藉由經由連結子部分而連結，該連結子部分形成環並被摺疊，該反義鏈與該正義鏈雜合，形成雙鏈部分。shRNA分子所含之連結子部分只要可連結正義鏈與反義鏈而形成莖環結構，則可為多核苷酸連結子，亦可為非多核苷酸連結子，並無特別限定，較佳為從業者公知之2~22個鹼基之多核苷酸連結子。具體而言，可例示UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)、UUCAAGAGA、CCACC、CUCGAG、CCACACC、UUCAAGAGA、AUG、CCC及UUCG，較佳為UAGUGCUCCUGGUUG(序列編號7)。
於本發明中之shRNA於3'末端具有包含至少2個鹼基之懸突部。
於本發明中，所謂懸突部，係指附加於反義鏈之3'末端且於正義鏈所對應之位置不存在可互補結合之鹼基的鹼基。於反義鏈之3'末端不具有懸突部之情形時，與具有懸突部之情形相比，於使用本發明之脂質體之轉染(transfection)中由shRNA所獲得之TS之表現抑制之程度降低約40~60%。該懸突部之鹼基之種類、數目並無限定，例如可列舉包含1~5個、較佳為1~3個、進而較佳為1或2個鹼基之序列，例如可列舉：TTT、UU或TT。較佳為UU。
於本發明中，作為較佳之shRNA，為包含序列編號8所表示之鹼基序列之單鏈RNA。
又，關於正義鏈或反義鏈，視需要可將5'末端磷酸化，亦可於5'末端結合三磷酸(ppp)。
上述shRNA係藉由共價鍵或非共價鍵而結合於本發明之脂質體之脂質雙層膜之外膜表面。於上述shRNA與脂質體之結合時，較佳為將 含有上述shRNA與脂質體之混合液劇烈攪拌(例如超音波攪拌等)1~15分鐘、較佳為10分鐘左右。藉由實施攪拌，可將所獲得之具備shRNA之脂質體之粒徑製備成數百nm之尺寸(Barichello,J.M.,et al.,Int.J.Pharm.(2011))。又，藉由實施攪拌，可於脂質體上均勻地分散結合上述shRNA，可防止因由shRNA之不均勻結合所產生之組織而導致之脂質體取入之不均勻性。或者於脂質體為脂質體中間體之情形時，可藉由於上述含有脂質體中間體之懸浮液中添加shRNA並進行混合(例如渦旋操作等)，而使shRNA結合於脂質體中間體之脂質雙層膜之外膜表面。
於本發明中，具備shRNA之脂質體之粒徑為200~600nm，較佳為約300~400nm。又，於本發明中，具備shRNA之脂質體中間體之粒徑為200nm~2μm，較佳為約300nm~1μm。於本發明中，具備shRNA之脂質體之ζ電位為0~50mV，較佳為約25~35mV。
本發明中之具備shRNA之脂質體除了含有可抑制TS之表現之shRNA以外，亦可含有可藉由RNAi作用而抑制編碼於腫瘤細胞中表現並且參與腫瘤細胞之增殖之因子的基因之表現之siRNA或shRNA。作為此種siRNA或shRNA，可使用上述所定義者。可抑制TS之表現之shRNA與其他siRNA或shRNA可結合於同一脂質體上，或亦可分別結合於各別脂質體上。
再者，於本說明書中，有時將具備shRNA之脂質體稱為「脂複合體」。又，有時將具備shRNA之脂質體中間體稱為「脂複合體中間體(preplex)」。
如下述實施例中所詳細說明般，上述具備shRNA之脂質體可藉由局部投予而抑制腫瘤細胞之增殖，可用於治療癌症。
作為可使用本發明之抗腫瘤劑進行治療之癌症，可列舉高度表現TS之癌症，並無特別限制，例如可列舉：結腸/直腸癌、肝癌、腎 癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、膽道癌、膽囊/膽管癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、攝護腺癌、惡性胸膜間皮瘤、睾丸瘤、卵巢癌、骨/軟組織肉瘤、皮膚癌、腦腫瘤等。又，癌性胸膜炎或癌性腹膜炎亦可利用本抗腫瘤劑進行治療。作為治療候補，較佳為胃癌、肺癌、膽道癌、肝癌、惡性胸膜間皮瘤、卵巢癌、癌性胸膜炎或腹膜炎，尤佳為惡性胸膜間皮瘤、無遠端轉移之非小細胞肺癌、癌性胸膜炎、胃癌之腹膜散播轉移、卵巢癌之腹膜散播轉移、癌性腹膜炎。
又，本發明之抗腫瘤劑亦可一併含有具備shRNA之脂質體及醫藥之製造中通常使用之賦形劑、黏合劑、崩散劑、潤滑劑、稀釋劑、溶解助劑、懸浮劑、等張劑、pH值調整劑、緩衝劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑、組胺酸等。作為賦形劑、潤滑劑、黏合劑、崩散劑、稀釋劑、穩定劑、等張劑、pH值調整劑，可使用上述所定義者。
本發明之抗腫瘤劑可藉由局部投予而投予。局部投予可列舉上述所定義者。又，本發明之組合物可製成適合於局部投予之劑型，可製備成注射劑、懸浮劑、乳化劑、噴劑等各種製劑型態。
本發明之抗腫瘤劑之效果可對源自上述癌症之細胞或組織、及患有上述癌症之個體投予該抗腫瘤劑，將腫瘤大小與未投予該抗腫瘤劑(或投予前)之細胞或組織、及個體之腫瘤大小加以比較，以腫瘤縮小或消失作為指標而進行評價。又，本發明之抗腫瘤劑之效果可對源自上述癌症之細胞或組織、及患有上述癌症之個體投予該抗腫瘤劑，與未投予該抗腫瘤劑之個體加以比較，以存活率之提高(延命效果)、胸水或腹水減少或消失作為指標而進行評價。
本發明之抗腫瘤劑可與現有之癌症化學療法或癌症化學療法劑一併使用。作為可與本發明之抗腫瘤劑併用之癌症化學療法或癌症化 學療法劑，只要為可改變腫瘤環境以使本發明之脂質體易侵入腫瘤組織者即可，例如作為現有之癌症化學療法，可列舉使用以下所記載之「具有TS抑制作用之抗腫瘤劑」之化學療法，作為現有之癌症化學療法劑，可列舉具有TS抑制作用之抗腫瘤劑。
作為「具有TS抑制作用之抗腫瘤劑」，只要可抑制TS之功能則無特別限定，例如可列舉：5-FU系抗腫瘤劑、培美曲塞鈉水合物、雷替曲塞(Tomudex)、甲胺喋呤(MTX，methotrexate)等。
業界報告有TS之表現量與5-FU系抗腫瘤劑之敏感性之關係(Patrick G.Johnston et al.,Cancer Res 1995；55：1407-12.及Kun-Huei Yeh et al.,Cancer 1998；82：1626-31)。對於癌症患者中TS之表現相對較低之癌症患者，5-FU系抗腫瘤劑顯著發揮作用，另一方面，癌症患者中TS之表現相對亢進之癌症患之多數對5-FU系抗腫瘤劑具有抗藥性。對於培美曲塞鈉水合物，亦於與TS之表現量之間可見相同之關係。藉由投予本發明之抗腫瘤劑，可抑制腫瘤組織內之TS之產生，可提高該腫瘤組織對具有TS抑制作用之抗腫瘤劑之敏感性。又，於將本發明之抗腫瘤劑與具有TS抑制作用之抗腫瘤劑併用之情形時，可選擇性地使該等蓄積於腫瘤內，可將shRNA有效率地傳遞至腫瘤細胞。藉此，於與具有TS抑制作用之抗腫瘤劑併用之情形時，與單獨使用具有TS抑制作用之抗腫瘤劑或本發明之抗腫瘤劑之情形相比，本發明之抗腫瘤劑可獲得顯著高之抗腫瘤效果。
作為「5-FU系抗腫瘤劑」，可列舉5-FU及活性代謝物質為5-FU的5-FU衍生物。作為5-FU衍生物，例如可列舉含有替加氟(tegafur)者。作為5-FU衍生物，較佳為含替加氟之調配劑，具體而言，可例示：替加氟-尿嘧啶調配劑(例如UFT(註冊商標)(大鵬藥品工業股份有限公司))、替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀調配劑等。其中，尤佳為替加氟-吉美嘧啶-奧替拉西鉀調配劑、例如TS-1(註冊商標)(大鵬藥品工業股 份有限公司)。
又，作為培美曲塞鈉水合物，可列舉：愛寧達(Alimta)(註冊商標)(Japan Eli Lilly股份有限公司)。與上述5-FU系抗腫瘤劑相同，培美曲塞鈉水合物亦藉由與本發明之抗腫瘤劑之併用，而與單獨使用該培美曲塞鈉水合物或本發明之抗腫瘤劑之情形相比，可獲得顯著高之抗腫瘤效果。
本發明之抗腫瘤劑可將上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑與其他現有之癌症化學療法劑一併使用，或者改變上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑而與其他現有之癌症化學療法劑一併使用。作為此種癌症化學療法劑，可列舉：環磷醯胺、氮芥N-氧化物、異環磷醯胺、美法侖、白消安、二溴甘露糖醇、卡波醌、噻替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、卡莫司汀、培美曲塞二鈉、甲胺喋呤、6-巰基嘌呤核苷、巰基嘌呤、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽、依諾他濱、吉西他濱、氟達拉濱、培美曲塞、順鉑、卡鉑、奧賽力鉑、紫杉醇、歐洲紫杉醇、鹽酸伊立替康、卡培他濱等，可使用選自該等中之一種或複數種之癌症化學療法劑。與上述具有TS抑制作用之抗腫瘤劑同樣地，該等癌症化學療法劑亦藉由與本發明之抗腫瘤劑之併用而可將shRNA有效率地傳遞至腫瘤細胞，又，與單獨使用該癌症化學療法劑或本發明之抗腫瘤劑之情形相比，可獲得顯著高之抗腫瘤效果。
只要將本發明之抗腫瘤劑與上述現有之癌症化學療法劑併用投予，則可以組合物之形式提供。
本發明之抗腫瘤劑可與上述現有之癌症化學療法劑一併製成「組合物」之形態。「組合物」可為含有本發明之抗腫瘤劑與上述現有之癌症化學療法劑作為有效成分的調配劑，以及亦可為以使本發明之抗腫瘤劑與上述現有之癌症化學療法劑適合於併用投予之單一封裝 體(套組製劑)之形式進行製造、包裝、流通者。
「併用投予」不僅包括同時投予本發明之抗腫瘤劑與上述現有之癌症化學療法劑之情形，亦包括空出間隔而投予本發明之抗腫瘤劑及上述現有之癌症化學療法劑之情形。本發明之抗腫瘤劑與上述現有之癌症化學療法劑之投予途徑及投予方法可相同或亦可不同。
本發明之抗腫瘤劑之投予量及投予次數可根據患者之年齡、體重、疾病之嚴重度等要因而變化，可將以shRNA之量計每1次、每1kg體重為適當選自0.0001mg~100mg之範圍內之量1天1~3次地每天或每1~21天進行投予。
上述現有之癌症化學療法劑之投予量可根據作為有效成分之化學物質之種類、患者之年齡、體重、疾病之嚴重度等要因而變化，可以每次每kg體重為適當選自0.0001mg~1000mg之範圍內之量進行投予，1天1~3次，每天或每1~14天進行投予。例如於現有之癌症化學療法劑為5-FU系抗腫瘤劑之情形時，可以替加氟計1天投予60~160mg，每天或每1~7天進行投予。又，於現有之癌症化學療法劑為培美曲塞鈉水合物之情形時，可1天投予500~1000mg，每天或每1~7天進行投予。與單獨使用上述現有之癌症化學療法劑之情形相比，可以低用量多次投予。藉此，可抑制或延緩有可由上述現有之癌症化學療法劑之投予所引起之副作用(例如骨髄抑制、溶血性貧血、散播性血管內凝固症候群、猛爆性肝炎、脫水症狀、腸炎、間質性肺炎、口炎、消化道潰瘍、消化道出血、消化道穿孔、急性腎功能衰竭、皮膚黏膜眼症候群、中毒性表皮壞死症、精神性神經症、急性胰腺炎、橫紋肌溶解症、無嗅覺症等，並不限定於該等)之發病。
4.治療方法
又，本發明係關於一種使用上述本發明之抗腫瘤劑的癌症之治療方法。作為可藉由該方法而治療之癌症，包括如上文所定義之癌 症。又，於該方法中，上述本發明之抗腫瘤劑及現有之癌症化學療法劑之用法及用量如上所述。
(實施例)
以下，揭示實施例而更詳細地說明本發明。然而，本發明並不限制於該等實施例。
[實施例1]
活體外(In vitro)之藉由以TS作為標靶之shRNA與愛寧達之併用所獲得之細胞增殖抑制效果
(以TS作為標靶之shRNA)
以TS作為標靶之shRNA(以下記作「TS-shRNA」)係基於可抑制TS之表現並且已確認出抗腫瘤效果之公知之shRNA(參照WO 2012/161196)，而合成具有以下之序列者。
TS-shRNA：5'-GUAACACCAUCGAUCAUGAUAGUGCUCCUGGUUGUCAUGAUCGAUGGUGUUACUU-3'(序列編號8)
另一方面，作為對照，使用不存在成為標靶之mRNA的具有以下序列之shRNA。以下，將對照之shRNA記作「NS-shRNA」。
NS-shRNA：5'-UCUUAAUCGCGUAUAAGGCUAGUGCUCCUGGUUGGCCUUAUACGCGAUUAAGAUU-3'(序列編號11)
(MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide，溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)檢定)
於本實驗中，以96孔板規模進行實驗。轉染係依據製造商之說明書，使用陽離子脂質體之一種的Lipofectamine(註冊商標)RNAi MAX(Lf RNAi MAX)而進行。
以使300pmol之上述shRNA(TS-shRNA或NS-shRNA)與15μL之Lf RNAi MAX分別成為500μL之方式利用Opti MEM進行稀釋，將兩種溶液混合並於室溫下放置10~20分鐘而形成複合體(脂複合體)。向預先在24小時前接種人惡性胸膜間皮瘤細胞(MSTO-211H)懸浮液(2,000細胞/100μL)之孔中添加50μL之脂複合體，將最終合計體積設為150μL(以使孔中之shRNA最終濃度成為5nM與10nM之方式進行調整)。自轉染開始起24小時之後，去除培養基，添加200μL之以0.01μg/mL之濃度含有現有之癌症化學療法劑「愛寧達(培美曲塞鈉水合物：PMX(pemetrexed))」(Eli Lilly)之培養基、或不含該癌症化學療法劑之新的培養基。於添加新的培養基0、24、48、72、96小時之後去除培養基，添加0.5%之MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)溶液50μL，於4小時、37℃、5%之CO2條件下進行培養。又，亦於未加入細胞之孔中添加0.5%之MTT溶液，將其設為背景(background)。
培養結束後，向各孔中添加150μL之酸性異丙醇，使用攪拌器將甲臢晶體溶解，使用讀板儀，於570nm之波長下測定吸光度，並使用下述式算出細胞之增殖率。
細胞之增殖率(%)=[A570(於添加新的培養基X小時後)/A570(於添加新的培養基0小時後)]×100
將結果示於圖1。
如圖1所示，TS-shRNA係於PMX之存在下，時間相關性地顯著抑制MSTO-211H細胞之增殖。
[實施例2]
由TS-shRNA所獲得之TS表現抑制
(轉染)
轉染係依據製造商之說明書，使用陽離子脂質體之一種的Lipofectamine(註冊商標)RNAi MAX(Lf RNAi MAX)而進行。
於本實施例中亦使用實施例1所製備之脂複合體。
於10cm培養皿中以成為500,000細胞/培養皿之方式添加MSTO-211H細胞懸浮液10mL，預先培養24小時。向其中直接添加各脂複合體(最終合計體積為15mL)，進行轉染。此時，以使TS-shRNA或NS-shRNA之最終濃度成為5nM或10nM之方式進行調整。對照係未經shRNA處理。開始轉染，再於37℃、5%之CO2條件下在培養基中培養72小時，其後藉由下述方法而製備細胞萃取液。
(細胞萃取液之製備)
自開始轉染起經過72小時後去除培養基，利用冷PBS(-)(Phosphate-Buffered Saline，磷酸鹽緩衝生理食鹽水)進行清洗，其後，使用胰蛋白酶溶液剝離細胞，進行離心而去除上清液。進而利用冷PBS(-)清洗後，添加100~150μL之冷裂解緩衝液(Lysis buffer)(50mM之Tris-HCl(pH值7.4)、1%之NP-40、0.25%之去氧膽酸鈉、150mM之NaCl及Protease Inhibitor Cocktail(蛋白酶抑制劑混合物)(Sigma-Aldrich,MO,USA))，於1小時、冰上(4℃)之條件下進行培養而溶解細胞。其後進行離心分離(15,000×g，15分鐘，4℃)，將所獲得之上清液設為細胞萃取液。
(SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)用樣品之製備)
將上述細胞萃取液與2份樣品緩衝液分別等量混合，使用設定為95℃之微型管用加熱板加熱3分鐘。其後離心30秒，於室溫下進行冷卻，製成SDS-PAGE用樣品。
(SDS-PAGE)
將上述樣品每6μL(9μg蛋白質/區帶)供至12%之聚丙烯醯胺凝 膠，與電源(Bio-Rad laboratories)連接，利用2片凝膠以40mA(1片凝膠為20mA)之定電流進行約80分鐘之電泳。
(西方墨點法(western blotting))
作為預處理，將切成適當大小之濾紙及Hybond-ECL浸漬於轉漬緩衝液(blotting buffer)中。SDS-PAGE後，使用轉移裝置，將蛋白質轉移至Hybond-ECL。將所轉移之Hybond-ECL浸漬於阻斷緩衝液(5%脫脂乳)中，於室溫下阻斷1小時，利用Tween緩衝液(Tween buffer)進行5分鐘之清洗3次。
為了檢測TS及β-肌動蛋白，於4℃下使經Tween緩衝液稀釋之各一級抗體(小鼠單株抗人TS抗體(Mouse monoclonal anti-human TS antibody)(1：1000)(ANASPEC,Inc.CA,USA)、小鼠單株抗人β-肌動蛋白抗體(Mouse monoclonal anti-human β-actin antibody)(1：500)(Abcam,Tokyo,Japan))反應一夜。利用Tween緩衝液進行5分鐘之清洗3次後，於室溫下使經Tween緩衝液稀釋之二級抗體(HRP(Horseradish peroxidase，山葵過氧化酶)-複合山羊抗小鼠二級抗體(conjugated goat anti-mouse secondary antibody)(1：2000)(ICN Biomedical,CA,USA))溶液反應1小時。利用Tween緩衝液進行5分鐘之清洗3次後，使之與ECL化學發光試劑(ECL Chemiluminescence Reagent)(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)反應約1分鐘。目標蛋白質之條帶係使用LAS-4000 EPUVmini(Fujifilm)進行可視化並拍攝，使用軟體(Multi Gauge版本3.2(FujiFilm,Tokyo,Japan))進行定量。
將結果示於圖2。
如圖2所示，明確得知實施例1所製備之將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體可序列特異性且濃度相關性地顯著抑制MSTO-211H細胞中之TS之表現。
[實施例3]
於活體外之利用螢光素酶(Luciferase)-shRNA所獲得之螢光素酶表現抑制
(螢光素酶表現細胞株之製作)
導入有源自螢火蟲之螢光素酶基因之表現質體(pGL3-control，Promega公司)及導入有源自海紫羅蘭科之螢光素酶基因之表現質體(pRL-TK，Promega公司)之轉染係使用陽離子脂質體之一種的Lipofectamine(註冊商標)2000(Lf 2000)，依據製造商之說明書而進行。
以成為100,000細胞/孔(1mL)之方式將HT-1080細胞懸浮液添加至12孔細胞培養用培養板中，預先培養12小時。於去除培養上清液並使用PBS清洗一次後，向各孔中添加含有兩種螢光素酶表現質體之轉染溶液(200μL)，進行螢光素酶表現質體之轉染。此時，以使各質體之最終濃度成為1μg/200μL之方式進行調整。開始轉染，再於37℃、5%之CO2條件下進行培養。
(陽離子脂質體之製備)
藉由以下所示之方法而製備陽離子脂質體。
構成脂質體之脂質係選用自下述者：DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPC(1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DOPE(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DC-6-14(氯化O,O'-二(十四碳醯基)-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺)。預先利用氯仿使該等脂質溶解，製成儲備溶液。
以使脂質組成成為DOPE：X：DC-6-14=3：2：5(莫耳比，X=DOPC或POPC)之方式使用玻璃注射器自各儲備溶液精確量取，並裝至附有塞之試驗管中進行混合(以總脂質量計為200mmol)。繼而，使用旋轉蒸發器(IWAKI，東京)於減壓下去除氯仿，其後為了完全地去除氯仿而將試驗管在真空泵中放置一夜，從而於試驗管內形成脂質薄 膜。對該脂質薄膜添加2mL之9%之蔗糖溶液(30mL，pH值7.4)作為內水相，於37℃下劇烈攪拌，藉此使脂質薄膜完全水合，獲得MLV(multilamellar vesicle，多薄片層微脂粒)(最終脂質濃度為100mM)。一面將該溶液升溫至37℃一面使用200nm、100nm、50nm之聚碳酸酯膜(Nucleopore,CA,USA)，藉由擠壓法而製備粒徑成為約100nm之LUV(large unilamellar vesicle，單層大微脂粒)。
(以螢光素酶(Luc)作為標靶之shRNA)
以Luc作為標靶之shRNA(以下記作「Luc-shRNA」)具有下述序列。
Luc-shRNA：5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAUAGUGCUCCUGGUUGUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3'(序列編號12)
(脂複合體之製備)
脂複合體係藉由以成為陽離子脂質體：shRNA=800、400或200：1(莫耳比)之方式將上述陽離子脂質體與shRNA進行混合，並劇烈攪拌10分鐘而製備。關於shRNA是否完全吸附於陽離子脂質體上，係藉由於2%之瓊脂糖凝膠上進行電泳，藉由不存在游離之shRNA而確認。
(於活體外之螢光素酶表現抑制)
以使shRNA量之最終濃度成為50nM之方式向上述螢光素酶表現細胞株分別投予各脂複合體，於37℃、5%之CO2條件下培養48小時。培養結束後，使用雙螢光素酶報告檢定系統(Dual Luciferase Reporter Assay System)(Promega公司)，依據製造商之說明書，製備細胞萃取液、及測定螢光素酶活性。即，於培養結束後去除培養基，利用冷PBS(-)進行清洗，其後以150μL/孔添加被動裂解緩衝液(Passive Lysis Buffer)，一面藉由回旋型振盪器進行振盪一面於室溫下培養15分鐘而溶解細胞。其後，移至樣品管中，於-80℃下冷卻30分鐘後恢復至室溫。進行離心分離(9,000×g，30秒，4℃)，將所獲得之上清液設為細胞萃取液。繼而，向每孔分注50μL螢光素酶鑑定試劑II(Luciferase Assay Reagent II)溶液之96孔白色微量盤中，每孔添加10μL上述細胞萃取液，並使用移液管進行混合。將微量盤設置於亮度計Infinite M200 Pro(Tecan公司)上，對由螢火蟲螢光素酶活性產生之化學發光測定10秒。測定後取出培養盤，向各孔加入50μL之Stop & Glo試劑(Reagent)溶液，輕微地進行渦旋而混合後，立即使用亮度計同樣地測定由海紫羅蘭科螢光素酶活性產生之化學發光。資料分析係將海紫羅蘭科螢光素酶活性值設為內部對照而進行標準化，求出相對於未進行shRNA處理之對照群的螢火蟲螢光素酶相對活性而進行評價。
將結果示於圖3。再者，圖3之結果係以將對照之螢光素酶活性設為100%之相對值表示。
如圖3所示，與未進行Luc-shRNA處理之對照群相比，於使用含有DOPC或POPC之任一脂複合體之情形時均未見螢光素酶活性之降低。其顯示出將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體可抑制HT-1080細胞中之螢光素酶表現。進而顯示出與含有POPC之脂複合體相比，含有DOPC之脂複合體之由Luc-shRNA所獲得之表現抑制效果更高。進而顯示出於Luc-shRNA：陽離子脂質體之莫耳比為1：800之情形時，由Luc-shRNA所獲得之表現抑制效果更高。
[實施例4] 惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之建立
於2,2,2-三溴乙醇(Avertin，Sigma-Aldrich)麻醉下，向裸小鼠(5週齡，雄性)之左胸腔內投予100μL之穩定表現螢光素酶的MSTO-211H細胞(MSTO-211H-Luc細胞)懸浮液，進行移植。於移植細胞後 3、7、14、21天後，於使用異氟烷之麻醉下將100μl之D-螢光素鉀鹽(D-luciferin potassium salt)(Wako Pure Chemical)溶液(7.5mg/ml)投予至腹腔內，使用IVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)，對與胸腔內增殖之MSTO-211H-Luc細胞之活性相關之生物發光之強度進行評價。
將結果示於圖4。
如圖4所示，於移植後第3天略觀察到伴隨MSTO-211H-Luc細胞之增殖所產生之生物發光，其後隨時間經過，生物發光增強。根據本研究明確得知，所移植之MSTO-211H-Luc細胞於胸腔內充分增殖，可建立惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠。
[實施例5] 於活體內(In vivo)之shRNA導入效果較高之陽離子脂質體之選定 (陽離子脂質體之製備)
藉由以下所示之方法而製備陽離子脂質體。
構成脂質體之脂質係選用自下述者：DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPC(1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DMPC(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DEPC(1,2-二芥醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DOPE(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DC-6-14(氯化O,O'-二(十四碳醯基)-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺)。預先利用氯仿將該等脂質溶解，而製成儲備溶液。
以使脂質組成成為DOPE：X：DC-6-14=3：2：5(莫耳比)之方式使用玻璃注射器自各儲備溶液精確量取，依據上述實施例3所示之方法製備陽離子脂質體。脂質體之粒徑(動態光散射法)及ζ電位(電泳光散射法)係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)進行測定。脂質體之表面電荷均為約+50mV。
(以螢光素酶(Luc)作為標靶之shRNA)
使用上述實施例3所示之Luc-shRNA。
(脂複合體之製備)
脂複合體係藉由以成為陽離子脂質體：shRNA=2000：1(莫耳比)之方式將上述陽離子脂質體與shRNA進行混合，並劇烈攪拌10分鐘而製備。關於shRNA是否完全吸附於陽離子脂質體上，係藉由於2%之瓊脂糖凝膠上進行電泳，藉由不存在游離之shRNA而確認。
所製備之脂複合體之平均粒徑及ζ電位分別為約350nm及約+15mV。
(使用原位移植模型小鼠之於活體內之螢光素酶表現抑制)
於2,2,2-三溴乙醇(Avertin，Sigma-Aldrich)麻醉下，向裸小鼠(5週齡，雄性)之左胸腔內投予100μL之穩定表現螢光素酶的MSTO-211H細胞(MSTO-211H-Luc細胞)懸浮液。於細胞移植後第10、13、16、19天，將以shRNA之量計每20μg(50μL)之脂複合體直接投予至胸腔內。於最終投予脂複合體2天後，於使用異氟烷之麻醉下，將100μL(7.5mg/mL)之D-螢光素鉀鹽溶液投予至腹腔內，利用IVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)對與胸腔內增殖之MSTO-211H-Luc細胞之活性相關之生物發光之強度進行評價。
對照係投予9%之蔗糖溶液。
將結果示於圖5-1及圖5-2。
如圖5-1及圖5-2所示，明確得知根據所使用之陽離子脂質體之脂質組成，螢光素酶之表現抑制會產生差異，顯示出使用具有DOPE/DOPC/DC-6-14(3：2：5)之脂質組成之陽離子脂質體所製備之脂複合體顯著最強地抑制移植於胸腔內之MSTO-211H-Luc細胞中之螢光素酶之表現。
[實施例6] 於活體內之shRNA導入下之正電荷脂質(DC-6-14含量)之影響 (陽離子脂質體之製備)
依據實施例3所示之方法而製備脂質體。其中，將脂質體之脂質組成設為DOPE：POPC：DC-6-14=3：2+X：5-X(莫耳比，X=0、1.5、3.0)。脂質體之粒徑及表面電荷係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)而測定。確認出所製備之LUV(large unilamellar vesicle，單層大微脂粒)之粒徑均為約100nm。又，關於其表面電荷，確認含有20%之DC-6-14之脂質體約為+25mV，含有35%之DC-6-14之脂質體約為+35mV，含有50%之DC-6-14之脂質體約為+50mV。
(脂複合體之製備)
脂複合體係將實施例3所示之Luc-shRNA利用實施例3所示之方法與脂質體進行混合而製備。脂複合體之粒徑(動態光散射法)及ζ電位(電泳光散射法)係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)而測定。含有20%之DC-6-14之脂複合體之粒徑約為350nm，表面電荷約為+25mV，含有35%之DC-6-14之脂複合體之粒徑約為350nm，表面電荷約為+30mV，含有50%之DC-6-14之脂複合體之粒徑約為350nm，表面電荷約為+35mV。
(使用原位移植模型小鼠之於活體內之螢光素酶表現抑制)
依據實施例5所示之方法，對所製備之脂複合體之於活體內基因表現抑制效果(shRNA細胞內導入效率)進行評價。
將結果示於圖6-1及圖6-2。
如圖6-1及圖6-2所示，得知隨著脂質體中之正電荷脂質(DC-6-14)之量增加，脂複合體之於活體內之螢光素酶表現抑制效果受到亢進。表面電荷之增加不僅於與帶負電之shRNA形成複合體時較為有利，而且變得容易與帶負電之腫瘤細胞相互作用，結果可大量且效率良好地將shRNA導入細胞內。
[實施例7] 於活體內之shRNA導入下之PEG修飾之影響 (PEG修飾陽離子脂質體之製備)
依據實施例3所示之方法而製備脂質體。
構成脂質係使用下述者：DOPC、POPC、DOPE、DC-6-14及1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](mPEG2000-DSPE，1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000])。將PEG修飾脂質體之脂質組成設為DOPE：X：DC-6-14：mPEG-DSPE=3：2：5：0.1(莫耳比，X=DOPC或POPC)，PEG未修飾脂質體之脂質組成設為DOPE：X：DC-6-14=3：2：5(莫耳比，X=DOPC或POPC)，而製備LUV(large unilamellar vesicle)。脂質體之粒徑係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)而測定。含有DOPC之脂質體(PEG未修飾脂質體)之粒徑約為100nm，表面電荷約為+50mV。含有POPC之脂質體(PEG未修飾脂質體)之粒徑約為110nm，表面電荷約為+50mV。經PEG修飾之含有DOPC之脂質體(PEG修飾脂質體)之粒徑約為106nm，表面電荷約為+50mV。經PEG修飾之含有POPC之脂質體(PEG修飾脂質體)之粒徑約為100nm，表面電荷約為+50mV。
(脂複合體之製備)
脂複合體係將實施例3所示之Luc-shRNA與PEG修飾脂質體或PEG未修飾脂質體利用實施例3所示之方法進行混合而製備。脂複合體之粒徑(動態光散射法)及ζ電位(電泳光散射法)係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)而測定。含有DOPC之脂複合體之粒徑約為350nm，表面電荷約為+30mV。含有POPC之脂複合體之粒徑約為360nm，表面電荷約為+30mV。含有DOPC之經PEG修飾之脂複合體之粒徑約為370nm，表面電荷約為+30mV。含有POPC之經PEG修飾之脂複合體之粒徑約為370nm，表面電荷約為+30mV。
(使用原位移植模型小鼠之於活體內之螢光素酶表現抑制)
依據實施例5所示之方法，對所製備之PEG修飾脂複合體或PEG未修飾脂複合體之於活體內基因表現抑制效果(shRNA細胞內導入效率)進行評價。
將結果示於圖7-1及圖7-2。
如圖7-1及圖7-2所示，明確得知不論所使用之陽離子脂質體之脂質組成如何，藉由實施PEG修飾，均會抑制脂複合體之螢光素酶之表現抑制效果。顯示出於靜脈內投予時必須進行PEG化，但於胸腔內投予時PEG修飾反而會抑制shRNA之細胞內導入效率。
[實施例8] 由將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體之胸腔內投予所獲得之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠中之腫瘤增殖抑制效果 (惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠之建立)
使用MSTO-211H-Luc細胞之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型小鼠係利用實施例3所示之方法而製作，將移植細胞經充分固定之移植第7天之小鼠供於活體內實驗。
(陽離子脂質體之製備)
依據實施例3所示之方法而製備脂質體。其中，脂質體之脂質組成係設為DOPE：POPC：DC-6-14=3：2：5。
(脂複合體之製備)
脂複合體係將實施例1所示之shRNA與上述脂質體利用實施例3所示之方法進行混合而製備。脂複合體之粒徑(動態光散射法)及ζ電位(電泳光散射法)係藉由NICOMP 370(Particle Sizing System,CA,USA)而測定。將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體(以下記作「TS-shRNA脂複合體」)之粒徑約為400nm，表面電荷約為+30mV。另一方面，將NS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體(以下記作「NS- shRNA脂複合體」)之粒徑約為400nm，表面電荷約為+30mV。
(TS-shRNA脂複合體之腫瘤增殖抑制效果之評價)
針對上述MSTO-211H-Luc細胞患癌小鼠，於腫瘤移植後第7天至第17天每隔一天合計6次將TS-shRNA脂複合體或NS-shRNA脂複合體直接投予至胸腔內。每次投予係投予20μg之shRNA/100μL。
於併用現有之癌症化學療法劑「愛寧達(培美曲塞鈉水合物(PMX))」(Eli Lilly)之情形時，向腹腔內以25mg/kg之用量於腫瘤移植後第7天至第11天每天投予，其後隔2天而自第14天至第18天每天投予相同量，合計投予10次。
對照係投予9%之蔗糖溶液。
抑癌活性(細胞增殖抑制活性)係如實施例5所示般，於MSTO-211H-Luc細胞移植後第21天，於使用異氟烷之麻醉下，將100μL(7.5mg/mL)之D-螢光素鉀鹽溶液投予至腹腔內，利用IVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)對與胸腔內增殖之MSTO-211H-Luc細胞之活性相關之生物發光之強度進行評價。
關於基於抑癌效果之延命效果，藉由將供於上述利用IVIS之評價的模型小鼠在保持不進行治療之狀態下繼續飼養至細胞移植後第47天而進行評價。
平均存活時間(Mean survival time(MST)(天(day)))係基於下述式而算出。
MST(天)=最初之死亡日+最後之死亡日/2
存活時間增加率(Increased life span(%))係基於下述式而算出。
ILS(%)=[處理群之平均存活時間/對照群之平均存活時間]×100
將結果示於圖8-1及圖8-2、以及圖8-3及圖8-4。
如圖8-1及圖8-2所示，與對照群相比，單獨使用NS-shRNA脂複合體進行處理之群完全未顯示出腫瘤增殖抑制效果。另一方面，單獨 使用TS-shRNA脂複合體或PMX進行處理之群確認出約50%之腫瘤增殖抑制效果。又，將NS-shRNA脂複合體與PMX併用而進行處理之群僅可見與PMX單獨投予群所觀察到之大致相同之腫瘤增殖抑制效果，但於將TS-shRNA脂複合體及PMX併用而進行處理之群顯著顯示出約90%之顯著之腫瘤增殖抑制效果。
關於延命效果，如圖8-3及圖8-4所示，與對照群相比，單獨使用NS-shRNA脂複合體進行處理之群幾乎未顯示出延命效果。另一方面，單獨使用TS-shRAN脂複合體或PMX而進行處理之群略顯示出延命效果(120~126%)。又，將NS-shRNA脂複合體與PMX併用而進行處理之群僅可見與PMX單獨投予群所觀察到之大致相同之延命效果(122%)，但於將TS-shRNA脂複合體及PMX併用而進行處理之群中，確認出反映出上述腫瘤增殖抑制效果之最大延命效果(178%)。
再者，於任一處理群均未確認出包括體重增加抑制在內之嚴重毒性。
[實施例9] 由TS-shRNA脂複合體之胸腔內投予所產生之標靶基因表現抑制之研究
針對以與實施例8相同之方式所處理之各群之小鼠，於MSTO-211H-Luc細胞移植後第21天實施利用IVIS之評價，其後將小鼠處死，自胸腔回收腫瘤細胞，使用定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反轉錄-聚合酶鏈反應)法對所回收之腫瘤細胞內之TS基因之表現抑制情況進行評價。
自腫瘤細胞之RNA之萃取係使用RNaqueous微型套組(RNaqueous micro kit)(Ambion,Austin,TX,USA)，根據製造商所推薦之方法而進行。RNA向cDNA之逆轉錄係對RNA添加Oligo(dT)20、dNTP(Deoxynucleotide，去氧核苷酸)、核糖核酸酶抑制劑 (RNase(Ribonuclease，核糖核酸酶)inhibitor)、ReverTra Ace(Toyobo,Osaka,Japan)而進行。即時PCR(Real-time PCR)係使用StepOnePlus即時PCR系統(StepOnePlus real-time PCR system)(Applied Biosystems,CA,USA)，以經逆轉錄之cDNA作為模板而使用，並使用FastStart TaqMan Probe Master(ROX)與Universal ProbeLibrary(通用探針庫)(Roche Diagnostics GmbH,Manheim,Germany)作為試劑，根據製造商所推薦之方法而進行。使用GAPDH(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內部標準。
將結果示於圖9。
如圖9所示，與對照群相比，單獨利用NS-shRNA脂複合體進行處理之群完全未見TS基因之抑制效果。另一方面，單獨使用TS-shRNA脂複合體或PMX進行處理之群分別可見約50%、約25%之TS基因抑制效果。又，將NS-shRNA脂複合體與PMX併用而進行處理之群僅確認出與PMX單獨投予群大致相同之約20%左右之TS基因抑制效果。另一方面，於實施例8中顯示出最高之腫瘤增殖抑制效果的將TS-shRNA脂複合體與PMX併用而進行處理之群反映出較高之效果，遺存胸腔內幾乎未殘留腫瘤細胞，因此無法測定TS基因之表現變化。
[實施例10] 於活體外之shRNA導入下之脂質混合物之形態所造成之影響 陽離子脂質體中間體之製備
構成脂質組成比與上述實施例3相同，使用DOPE：X：DC-6-14=3：2：5(X=DOPC或POPC)。
以使脂質組成成為上述者之方式稱取各脂質，添加總脂質之10倍重量之環己烷、及環己烷之2重量%之乙醇，並溶解於70℃之溫水中。使用0.2μm之PTFE(polytetra-fluoroethylene，聚四氟乙烯)薄膜過濾器對溶解液進行過濾，利用乾冰/丙酮冷凍所過濾之溶液。於完全 冷凍後，使用真空泵進行12小時以上之真空乾燥，從而獲得陽離子脂質體中間體。
用於實驗之陽離子脂質體中間體溶液係藉由以使最終脂質濃度成為100mM之方式向利用上述方法所獲得之陽離子脂質體中間體添加9%之蔗糖溶液(pH值7.4)，並劇烈攪拌10分鐘而製備。該陽離子脂質體中間體之平均粒徑約為440±210(平均±標準偏差)nm。
脂複合體、脂複合體中間體之製備
脂複合體及脂複合體中間體之製備係分別使用實施例3所示之陽離子脂質體、及上述陽離子脂質體中間體。擔載於脂複合體及脂複合體中間體上之shRNA係使用以螢光素酶作為標靶之實施例3中所記載之Luc-shRNA。
將陽離子脂質體或陽離子脂質體中間體與Luc-shRNA以莫耳比計成為1600：1或800：1之方式進行混合，並劇烈攪拌10分鐘，藉此分別製備將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及脂複合體中間體。
對HT-1080細胞之轉染
轉染試劑係使用陽離子脂質體之一種的LipofectamineTM 2000(以下記作「Lf2000」)。又，作為表現源自螢火蟲之及源自裸鰓類之螢光素酶之表現質體，分別使用pGL3-C、及pRL-TK(Promega)。
向兩種螢光素酶表現質體15μg+15μg、及30μL之Lf2000中以分別成為750μL之方式添加OptiMEM進行稀釋，繼而將兩種溶液混合並於室溫下放置10~20分鐘而形成Luc-lipoplex。
自預先在24小時前接種人纖維肉瘤細胞(HT-1080)懸浮液(10,000cell/ml)之12孔(well)培養盤中去除培養液後，添加100μL之上述Luc-lipoplex，於37℃、5%之CO2條件下培養5小時。
於5小時後去除培養液，利用冷PBS(-)清洗一次，其後添加新的DMEM培養基900μL以及將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體溶 液或將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體中間體溶液100μL(各孔中之shRNA最終濃度為50nM)，於37℃、5%之CO2條件下進而培養48小時。
螢光素酶活性測定
螢光素酶活性之測定係使用雙螢光素酶報告檢定系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(Promega)、及96孔微量盤。於培養48小時後去除培養基，利用冷PBS(-)清洗一次，其後向孔中直接添加150μL之被動裂解緩衝液(Passive Lysis Buffer)而溶解細胞。進行一次冷凍融解並進行離心分離(10,000×g，30秒，4℃)後，將所獲得之上清液設為細胞萃取液。
向各孔中添加50μL之螢光素酶鑑定試劑II(Luciferase Assay Reagent II)與10μL之細胞萃取液，使用微盤讀取器Infinite 200(註冊商標)Pro(Tecan公司)，測定由螢火蟲螢光素酶活性產生之生物發光量。其後，進而添加50μL之Stop & Glo(註冊商標)試劑，同樣以相同之方式測定裸鰓類螢光素酶活性。
源自螢火蟲之螢光素酶之相對活性係與Luc-shRNA未處理者進行比較，並使用如下式而算出。
源自螢火蟲之螢光素酶相對活性(%)=(螢火蟲螢光素酶活性/裸鰓類螢光素酶活性)/(Luc-shRNA未處理群之螢火蟲螢光素酶活性/Luc-shRNA未處理群之裸鰓類螢光素酶活性)×100
將結果示於圖10。
如圖10所示，於含有DOPC、POPC中之任一者之情形時，與將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體相比，將Luc-shRNA結合於外膜表面之脂複合體中間體之形態均更進一步抑制螢光素酶之表現。又，於脂複合體中間體投予群中，含有DOPC略高於含有POPC之脂複合體中間體之表現抑制效率。
[實施例11] 由將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及脂複合體中間體之胸腔內投予所產生之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型中之腫瘤增殖抑制效果惡性胸膜間皮瘤原位移植模型之建立
使用MSTO-211H-Luc細胞之惡性胸膜間皮瘤原位移植模型係使用上述實施例4所示之方法而製作，將移植第4天之小鼠供於活體內實驗。
將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及脂複合體中間體之製備
依據上述實施例10所示之方法，製備脂質組成包含DOPE：DOPC：DC-6-14=3：2：5之陽離子脂質體及陽離子脂質體中間體。又，與實施例1中記載之針對TS之shRNA進行混合，而製備脂複合體(TS-脂複合體)及脂複合體中間體(TS-脂複合體中間體)。再者，將脂質體或脂質體中間體與shRNA之莫耳比設為2000：1。所製備之TS-脂質體、TS-脂複合體中間體之平均粒徑分別為約210±100、630±400(平均±標準偏差)nm。
將TS-shRNA結合於外膜表面之脂複合體及脂複合體中間體之腫瘤增殖抑制效果之評價
於腫瘤移植後第4、7、10、13、16天，將以shRNA量計為20μg(50μL)之TS-脂複合體或TS-脂複合體中間體直接投予至胸腔內。
於併用現有之化學療法劑「愛寧達(培美曲塞鈉水合物(PMX))」(Eli Lilly)之情形時，向腹腔內以25mg/kg之用量於腫瘤移植後第4天至第8天每天投予，其後隔2天自第11天至第15天每天投予相同量，合計投予10次。
於最終投予TS-脂複合體或TS-脂複合體中間體之2天後(於腫瘤移植後第18天)，於使用異氟醚(isoflurane)之麻醉下，將100μL(7.5mg/ml)之D-螢光素鉀鹽(D-luciferin potassium salt)溶液投予至腹腔 內，使用IVIS(Xenogen,Alameda,CA,USA)，對與胸腔內增殖之MSTO-211H-Luc細胞之螢光素酶活性相關之生物發光之強度進行評價。
將實施結果示於圖11。
與未處理之對照群相比，單獨使用PMX進行處理之群幾乎未見腫瘤增殖抑制效果。另一方面，於單獨使用TS-脂複合體或TS-脂複合體中間體之群中，與對照群及PMX單獨投予群相比，明顯可見較高之腫瘤抑制效果。進而，於將TS-脂複合體或TS-脂複合體中間體與PMX併用之群中，雖然觀察到最高之腫瘤抑制效果，但脂複合體與脂複合體中間體於效果方面未確認出較大差異。
圖12係對於上述藉由IVIS進行評價時之小鼠體重進行測定者，但於全部群中均未獲得統計學差異，該情況提示此次所使用之投予法並未顯現嚴重之毒性。
[產業上之可利用性]
本發明之脂質體藉由擔載活性成分並進行局部投予，而可將活性成分有效率地傳遞至侷限為投予部及/或其周邊之細胞。又，藉由於本發明之脂質體上擔載可抑制腫瘤增殖之RNAi分子作為活性成分，並局部投予至腫瘤及/或其周邊，可將RNAi分子有效率地傳遞至腫瘤細胞，可有效率地抑制該腫瘤之增殖。期待本發明於藥物遞送之領域、另外於癌症治療之領域發揮巨大貢獻。
本說明書中所引用之全部刊物、專利及專利申請案以參考之形式直接併入本說明書中。
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Claims (15)

  1. 一種局部投予用脂質體，其未經聚乙二醇(PEG)修飾且不含膽固醇(cholesterol)，並包含二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、磷脂醯膽鹼及氯化O,O'-二(十四碳醯基)-N-(α-三甲基銨基乙醯基)二乙醇胺(DC-6-14)，該磷脂醯膽鹼具有選自下述(i)~(iii)中之一個以上之特徵：(i)包含至少一條含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(ii)包含至少一條順式之含有碳-碳間之雙鍵之不飽和脂肪鏈；(iii)相轉移溫度未達0℃。
  2. 如請求項1之脂質體，其中磷脂醯膽鹼為1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、或1,2-二(二十碳烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)。
  3. 如請求項1之脂質體，其中磷脂醯膽鹼為DOPC。
  4. 如請求項1之脂質體，其包含DOPE、DOPC及DC-6-14。
  5. 如請求項4之脂質體，其中DOPE、DOPC及DC-6-14係以3：2：5之莫耳比含有。
  6. 一種組合物，其含有如請求項1至5中任一項之脂質體及活性化合物。
  7. 如請求項6之組合物，其中活性化合物為核酸(nucleic acid)、抗癌劑及/或癌症治療劑。
  8. 如請求項7之組合物，其中核酸結合於脂質體之外膜表面。
  9. 一種抗腫瘤劑，其含有如請求項1至5中任一項之脂質體及可藉由RNAi作用而抑制胸腺嘧啶核甘酸合成酶之表現的短髮夾RNA(shRNA)。
  10. 如請求項9之抗腫瘤劑，其中shRNA結合於脂質體之外膜表面。
  11. 如請求項9之抗腫瘤劑，其中shRNA包含序列編號8所表示之鹼基序列。
  12. 如請求項9之抗腫瘤劑，其與癌症治療劑併用。
  13. 一種組合物，其含有如請求項9至12中任一項之抗腫瘤劑及癌症治療劑。
  14. 如請求項13之組合物，其中癌症治療劑是具有胸腺嘧啶核甘酸合成酶(thymidylic acid synthase，TS)抑制作用之抗腫瘤劑。
  15. 如請求項14之組合物，其中具有胸腺嘧啶核甘酸合成酶(TS)抑制作用之抗腫瘤劑為5-FU系抗腫瘤劑或培美曲塞鈉(Pemetrexed sodium)水合物。
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