TWI593413B - 自牛樟芝提取之純化物質去氫齒孔酸及其用於抗糖尿病及抗高血脂的用途 - Google Patents

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Description

自牛樟芝提取之純化物質去氫齒孔酸及其用於抗糖尿病 及抗高血脂的用途
本發明係關於一種牛樟芝純化物，特別是指從牛樟芝菌絲體提取之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid，簡稱TT)用於製備降低血糖、血脂及/或肝臟脂肪之醫藥化合物之用途。
第一型糖尿病是一種常見的代謝疾病，其病症是慢性高血糖症，而在病理生理學上的表現則是胰腺的β細胞損壞。第一型糖尿病佔所有糖尿病患者的5-10%並與許多被認為造成糖尿病患者發病或死亡的併發症有關。目前第一型糖尿病的治療著重於降低血糖至接近正常血糖範圍內，以避免長期併發症對神經和心血管系統造成影響。
在血糖降低時攝取碳水化合物所產生的主要細胞機轉是使葡萄糖經胰島素刺激而轉運進入骨骼肌。其中，主要介導此吸收過程的葡萄轉運蛋白是GLUT4(glucose transporter 4，葡萄糖轉運蛋白4)，其在血糖穩態(blood glucose homeostasis)的調節中扮演關鍵角色。人體處理外來葡萄糖負荷的主要細胞機轉是使葡萄糖經胰島素刺激而轉運進入骨骼肌。GLUT4是葡萄糖穩態的關鍵因 素，胰島素主要透過誘導GLUT4從細胞內儲存室(細胞質)到細胞膜的淨易位，來刺激骨骼肌或脂肪細胞中的葡萄糖攝取。GLUT4表現、GLUT4轉移及/或胰島素信號傳導的損害可能影響胰島素刺激葡萄糖攝取，從而導致胰島素阻抗及高血糖症。這突顯了改善GLUT4含量及/或轉運至質膜對糖尿病治療具有潛在作用。
GLUT4轉運(GLUT4 translocation)主要經由胰島素訊號傳導路徑及AMPK(AMP-activated protein kinase，腺苷單磷酸活化蛋白激酶)傳導路徑這兩個方式進行調節。AMPK也被認為有利於GLUT4轉運。由於激活AMPK會導致提高的脂質和糖的代謝，使AMPK被認為是治療糖尿病及血脂異常的治療目標。
目前在實驗室中用於誘導第一型糖尿病的方法有數種，其中，鏈脲黴素(streptozotocin，以下簡稱STZ)是一種透過誘發胰島β細胞毒性而導致糖尿病的藥劑，STZ能在數天內以單一大劑量或重複低劑量進行化學誘導的糖尿病模型管理，具有操作方便且簡單易用的優點。STZ已被廣泛地用於誘導第一型糖尿病實驗的動物模型中。STZ誘導糖尿病小鼠模型(STZ-induced diabetic rodent model)通常具有在空腹或非空腹時高血糖以及高脂血症的血清胰島素指數(serum insulin levels)降低之特性，然而，在STZ誘導糖尿病小鼠的模型中往往不存在胰島素阻抗(insulin resistance)。是以，雖然前述STZ誘導模型不適合作為第二型糖尿病的誘導模型，但可以被用於篩選具抗高血糖或促進胰島素分泌效果的藥物和天然藥材。
牛樟芝(Antrodia camphorata)屬於多孔菌科的非褶菌目(Polyporaceae,Aphyllophorales)，其係一種生長於牛樟樹內腔壁的寄生微生物，其子實體和培養菌絲體含有脂肪酸、木脂素、苯基衍生物、倍半萜烯、類固醇和三萜類化合物等成分，其中，牛樟芝的發酵培養液顯示具有抑制細胞毒、抗 發炎及血管擴張等功效，牛樟芝經深層培養而得濾液則顯示具有抗含CCl4肝毒及抗氧化性能的保護作用。如圖1所示，顯示去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid，簡稱TT)的化學結構式，目前去氫齒孔酸已經能夠從茯苓(Poria cocos)及牛樟芝(AC)被分離出來。
然而，作為從牛樟芝的菌絲體中提取獲得的有效活性成分之一的去氫齒孔酸(TT)，目前對於STZ誘導引起的糖尿病在抗糖尿病及抗高血脂的功效則未知。
本發明之第一目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的新用途，其係用於製備治療第一型糖尿病之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
本發明之第二目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的新用途，其係用於製備治療高血脂症之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
本發明之第三目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的新用途，其係用於製備降低血糖及增加胰島素濃度之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
其中，所述牛樟芝純化物的新用途是透過去氫齒孔酸降低肝臟中PEPCK及G6 Pase的mRNA以及增加骨骼肌中GLUT4膜蛋白，達到降低血液中葡萄糖指數。
本發明之第四目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的新用途，其係用於製備降低血液中三酸甘油酯及總膽固醇之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
其中，所述牛樟芝純化物的新用途是以去氫齒孔酸抑制肝臟的FAS和PPAR γ伴隨降低SREBP-1c和DGAT2的mRNA指數，達到降低了血液中三酸甘油酯及總膽固醇指數，而增加了PPAR α的表現量並伴隨著肝臟中脂肪酸氧化增強CPT-1a的rnRNA指數。(FAS，fatty acid synthase，脂肪酸合成酶；PPAR γ，氧化物酶體增殖物活化受體，peroxisome proliferator activated receptor γ；SREBP-1c，膽固醇調節組件結合蛋白1c，sterol response element binding protein-1c；DGAT2，二醯基甘油醯基轉移酶2，diacyl glycerol acyltransferase 2；PPAR α，氧化物酶體增殖物活化受體，peroxisome proliferator activated receptor α；CPT-1a，camitine palmitoyltransferase-1a，肉毒鹼棕櫚醯基轉移酶-1a)
其中，所述牛樟芝純化物的新用途是以去氫齒孔酸減少SREBP-2的mRNA指數，達到降低血液中總膽固醇指數。(SREBP-2，膽固醇調節組件結合蛋白-2，sterol response element binding protein-2)
本發明之第五目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)的新用途，其係用於製備增加骨骼肌及肝臟組織中p-AMPK/t-AMPK蛋白表現量之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。(p-AMPK，phospho-AMPK，磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶；t-AMPK，total-AMPK；AMPK，AMP-activated protein kinase，腺苷單磷酸活化蛋白激酶)
本發明之第六目的在於開發牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸的新用途，其係用於製備治療脂肪肝之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
其中，所述牛樟芝純化物的新用途是透過去氫齒孔酸減少存在於脂肪組織中PPAR γ及FAS脂肪合成基因，達到減少脂肪細胞分化及脂質貯存。
藉此，透過該由牛樟芝純化物中的純化物質去氫齒孔酸，使STZ誘導引起的糖尿病及其他相關症狀，經施予純化物質去氫齒孔酸後，達到以下功效：
(1)施予劑量10、20、40mg/kg/day的去氫齒孔酸治療的小鼠的血糖數值明顯地下降。
(2)透過去氫齒孔酸治療，使STZ誘導糖尿病小鼠的血液三酸甘油酯(circulating triglyceride，TG)及總膽固醇(total cholesterol，TC)濃度下降，顯示去氫齒孔酸具有改善糖尿病和血脂異常的功效。
(3)透過去氫齒孔酸治療，增加STZ誘導糖尿病小鼠的肝臟及骨骼肌中的GLUT4的表現量以及p-AMPK的表現量，顯示去氫齒孔酸具有改善高血糖症的功效。
(4)在透過去氫齒孔酸治療改善高血糖症的過程中，PEPCK及G6 Pase的mRNA表現量會隨之降低，達到抑制肝臟葡萄糖生成以及減弱糖尿病狀態的功效。(PEPCK，Phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；G6-Pase，glucose-6-phosphatase，6-磷酸葡萄糖)
(5)透過增加PPAR α的肝臟蛋白表現量以及CPT-1a的mRNA表現量，顯示去氫齒孔酸治療具有降血脂效果。
(6)透過降低FAS的蛋白表現量，去氫齒孔酸治療具有促進血液三酸甘油酯降低的效果。
(7)透過去氫齒孔酸治療，STZ誘導糖尿病小鼠的SREBP-2的mRNA表現量降低且血液中膽固醇指數減少，顯示去氫齒孔酸能夠透過增加骨骼肌細胞膜GLUT4蛋白，調控PPAR α、FAS以及增加骨骼肌及肝臟組織中p-AMPK/t-AMPK蛋白表現量，達到防止或改善STZ誘導糖尿病小鼠的糖尿病及血脂異常狀態。
圖1係牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸及其衍生物的化學結構式。
圖2A顯示本發明細胞培養實驗中，以西方點墨分析法(Western blot)測定C2Cl2成肌細胞在CON組、DMSO組、Insulin組、TT組(1μg/mL)、TT組(5μg/mL)以及TT組(10μg/mL)中的GLUT4、phospho-Akt(Ser473)、total-Akt(Ser473)及GAPDH的蛋白質含量。(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脫氫酶)
圖2B顯示將圖2A測得之蛋白質含量的定量長條圖。
圖3A、圖3B顯示本發明動物模型實驗中，CON組、STZ組、STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的小鼠附睾白色脂肪組織(圖3A)及肝組織(圖3B)的病理切片圖。
圖4A顯示本發明動物模型實驗中，對CON組、STZ組、STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組之小鼠肝臟組織中的PEPCK、 G6-Pase、PPARalpha、SREBP-1c、DGAT2、CPT1a、SREBP-2、GAPDH的表現進行半定量RT-PCR分析之數據圖式。
圖4B至圖4C顯示將圖4A中的PEPCK、G6-Pase、PPARalpha、SREBP-1c、DGAT2、CPT-1a、SREBP-2、GAPDH測得之信號經圖像分析而定量，且透過GAPDH使每個值標準化。
圖5A顯示本發明動物模型實驗中，以西方點墨分析法(Western blot)對CON組、STZ組、STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組之小鼠骨胳肌中的GLUT4、phospho-AMPK(Thr172)、total-AMPK(Thr172)、GAPDH的蛋白質含量進行測定，以及對前述各組之小鼠肝臟中的phospho-AMPK(Thr172)、total-AMPK(Thr172)、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定。
圖5B顯示將圖5A測得之蛋白質含量的定量長條圖。
圖6A顯示本發明動物模型實驗中，以西方點墨分析法(Western blot)對CON組、STZ組、STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組之小鼠肝臟中的PPAR α、FAS、PPAR γ、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定，以及對前述各組之小鼠脂肪組織中的PPAR γ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量進行測定。
圖6B顯示將圖6A測得之小鼠肝臟中的PPAR α、FAS、PPAR γ、β肌動蛋白的蛋白質含量的定量長條圖。
圖6C顯示將圖6A測得之小鼠脂肪組織中的PPAR γ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量的定量長條圖。
本發明特徵與優點的一些典型實施例將在以下說明中詳細敘述。應理解的是本發明能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本發明的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用於限制本發明。
本發明提供了牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(TT)及其衍生物用於製備降低血糖、肝臟脂質、三酸甘油酯、總膽固醇、以及治療糖尿病之醫藥化合物的新用途。以下將進一步說明牛樟芝純化物的提取方法及其功效試驗。
本發明的牛樟芝純化物是指從牛樟芝菌絲體的凍乾粉提取之單一成分：純化物質去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid，簡稱TT)。本發明純化物質去氫齒孔酸(TT)的具體提取方法，係將3.0kg的牛樟芝菌絲體的凍乾粉，以12公升的甲醇在室溫下萃取三次，每四天萃取一次，共萃取三次。該甲醇萃取液在真空中蒸發，得到棕色殘留物，將該棕色殘留物懸浮於1公升的純水中，然後用1公升的乙酸乙酯分三次將之分離出一混合物。將乙酸乙酯分率(200克)，在矽膠上進行層析，並用己烷與乙酸乙酯的混合物洗提，藉以增加極性並以高效能液相層析儀(High Performance Liquid-chromatography，簡稱HPLC)進一步純化。於本實施例中，本發明的去氫齒孔酸(TT)是在一高壓預填柱(hibar pre-packed column，型號RT 250-10)中透過高效能液相層析法以比例為7：1的氯仿及乙酸乙酯進行分離，其流率為3mL/min，樣品的注射體積為100μL。分離後的氫齒孔酸(TT)並以折射率檢測器(Refractive index，RI，型號Knauer RI detector 2400)分析組成。製得之去氫齒孔酸(TT)的產率為0.2%(w/w)，純度大於99%。
如圖1所示，顯示本發明牛樟芝純化物去氫齒孔酸(TT)的化學結構式。其光譜測定數據如下：去氫齒孔酸(TT)：1H NMR(300MHz,pyridine-d5) δ 1.90(2H,m,H-2),3.43(1H,t,J=7.5Hz,H-3),1.26(1H,m,H-5),2.16(2H,m,H-6),5.61(1H,d,J=5.2Hz,H-7),5.36(1H,d,J=5.1Hz,H-11),2.50(1H,H-12 α),2.33(1H,br s,H-12 β),1.02(3H,s,H-18),1.08(3H,s,H-19),2.64(1H,td,J=11.0,3.0Hz,H-20),2.29(1H,m,H-25),1.03,1.04(3H each,d,J=7.5Hz,H-26 and H-27),4.88(1H,br s,H-28 α),4.92(1H,br s,H-28 β),1.09(3H,s,H-29),1.22(3H,s,H-30),and 1.14(3H,s,H-31).
第一部分：細胞培養實驗
以下說明本發明透過在胰島素或去氫齒孔酸(TT)中培養的C2Cl2肌纖維細胞(C2Cl2 myotube cells)，測試去氫齒孔酸(TT)能否直接調節GLUT4的蛋白表現。
本發明取C2Cl2骨骼成肌细胞(ATCC,CRL-1772)置於生長培養基中進行細胞培養，該生長培養基為達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基(DMEM，Dulbecco's modified Eagle medium；來自Gibco BRL公司)，其添加了10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；來自Hyclone公司)、100U/mL青黴素/100μg/mL鏈黴素(Gibco BRL公司)；當細胞融合(confluent)達到80%時，用0.05%的胰蛋白酶***(split)為1：4。將成肌細胞稀釋並放置在直徑9cm的培養皿中，並培養至其融合狀態(confluency)達到80%-90%，接著將培養基更換為2%的FBS/DMEM，為時5-7天，每隔24小時更換一次。
於本發明中，所述「細胞融合」是指貼附型細胞附著在細胞培養皿上漫延擴散***增殖直至鋪滿整個培養皿底部，此時稱作confluenoy，中文為融合狀態。
在試管中測定GLUT4及p-Akt(Ser473)/t-Akt蛋白的實驗中，先將分化的C2Cl2細胞置於DMEM/BSA培養基中，37℃下持續2小時進行血清飢餓(serumStarved)處理之後，分組對濃度為1、5、10及25μg/mL的去氫齒孔酸(TT，待測純化物質)進行細胞培養，對純化物質去氫齒孔酸與載體(含食鹽水的二甲基亞碸(DMSO，DMSO最終濃度為0.2%)進行30分鐘的細胞培養，對純化物質去氫齒孔酸與100nM的胰島素進行25分鐘的細胞培養。
接著進行治療部分，將C2Cl2細胞以冰冷的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS，Phosphate buffered saline)沖洗三次後分成兩組，。將其中一組C2Cl2細胞置於RIPA裂解液(RIPA buffer)中裂解，該RIPA裂解液添加了蛋白酶抑制剂(complete protease inhibitor cocktail，來自Roche公司)和磷酸酶抑制(phosphatase inhibitor)，接著在離心速率20000g下離心20分鐘。收集離心後的上清液蛋白並貯存在零下20℃的環境。前述RIPA裂解液的pH值約為8，其配方為50mM的三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、150mM的氯化鈉(NaCl)、1%的乙基苯基聚乙二醇(NP-40，Nonidet P-40)、0.5%的去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)及0.1%的十二烷基硫酸鈉(SDS)。
將另一組C2Cl2細胞置於緩衝液中在4℃下進行勻漿。前述緩衝液的pH值約為7.4，其配方為250mmol/L的蔗糖(sucrose)、50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)及0.2mmol/L的乙二胺四乙酸(edetic acid)。將均質液在離心速率9000g及4℃下離心10分鐘。用0.5mL勻漿緩衝液使沉澱物懸浮，然後離心，重複三次。收集三次離心的上清液並將之混合，在離心速率190000g及4℃下離心60分鐘。用0.2mL勻漿緩衝液再次使沉澱物懸浮，接著貯存在零下20℃。前述步驟是在設有過濾膜的情況下進行。
蛋白質濃度是透過BCA蛋白質定量試劑盒(BCA assay，Pierce)測得。取等量的蛋白質，在SDS樣品緩衝液中稀釋四次，並進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)以及西方墨點法(Western blotting)，利用包括Akt、p-Akt Ser473以及GLUT4等特異性抗體進行免疫染色。使用Alpha Easy FCsoftware進行密度墨點(density blotting)分析。
第二部分：動物模型實驗
藥品非諾貝特(Fenofibrate，以下簡稱為Feno)是一種PPAR α的活化劑，並在高三酸甘油酯血症的治療上行之多年。PPAR α是與脂質代謝相關的基因的關鍵調節因子，其通過參與調節脂質生成、脂肪酸氧化、能量消耗等許多靶基因，導致血液三酸甘油酯和脂肪酸的減少。
二甲雙胍(Metformin)是目前相當普遍用於治療第二型糖尿病的抗糖尿病藥品，其能夠激活肝臟及骨骼肌中的AMPK；雖然二甲雙胍會導致包括乳酸性酸中毒的副作用，但仍被認為對第一型糖尿病的治療具有潛力。
因此，非諾貝特及二甲雙胍被選為對照組，用於評估去氫齒孔酸(TT)的抗糖尿病療與作用的對照藥物。為了評估體內GLUT4和p-AMPK進行血糖調節的表現是否改變，以及α次元Thr172的磷酸化對AMPK活性是必要的，故本發明以STZ誘導糖尿病小鼠作為第一型糖尿病的動物模型並對其骨骼肌及肝臟組織進行了檢測，藉以探討去氫齒孔酸(TT)對於抗糖尿病及抗高血脂方面的效果，並測定去氫齒孔酸(TT)在抗糖尿病、脂肪形成以及肝組織中的甘油三酯脂肪酶(triglyceride lipase)，包括PEPCK、G6 Pase、PPAR α、FAS和DGAT2的調控表現。
以下說明本發明於測試牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸(TT)於預防或治療糖尿病之功效的動物模型實驗設計，以及小鼠之血液數據、血清生化值分析、病理組織分析、肝脂質分析與RNA的萃取及mRNA的相對定量標的基因表現量。
2-1動物模型及實驗設計
從國家實驗動物繁育研究中心購買四周大的雄鼠C57BL/6J。通過連續5天對小鼠腹腔注射STZ(Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)誘發糖尿病，其中，STZ劑量為55mg/kg，且STZ是溶解於濃度為0.05M且pH值為4.5的冷檸檬酸鈉緩衝液(cold sodium citrate buffer)中。使控制組(以下簡稱CON組)小鼠僅注射等量(55mg/kg)的檸檬酸緩衝液。經過兩周後，將空腹血糖範圍大於250mg/dL而表現出高血糖症的小鼠，作為具有糖尿病性的小鼠並被選擇用於本發明動物試驗。
將糖尿病小鼠隨機分為五組並施予相當劑量的蒸餾水(vehicle)、去氫齒孔酸(TT，劑量包括TT1：10mg/kg、TT2：20mg/kg或TT3：40mg/kg)、二甲雙胍(metformin，Metf，劑量為300mg/kg)或非諾貝特(fenofibrate，Feno，劑量為250mg/kg)進行治療。所述蒸餾水、去氫齒孔酸、二甲雙胍或非諾貝特是在28天(四周)內，每天口服灌胃一次。在實驗期間，所有小鼠禁食過夜後從眶後竇收集血液樣本。經四周治療餵養後，移走食物使小鼠禁食12小時後將小鼠犧牲。從小鼠收集所需的組織樣本並稱重，部分組織樣本取得後立即送入零下80℃的環境進行冷凍，以用於後續標靶基因分析。
2-2空腹血糖及生化指標測定
將前述從禁食小鼠眶後竇收集的血液樣本(0.8mL)的一部分立即用於葡萄糖指數的分析，另一部分用於血液中三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(TC)及游離脂肪酸(free fatty acids)、胰島素、瘦體素和脂聯素指數的分析。
2-3脂肪細胞因子指數測定
血液中胰島素、瘦體素及脂聯素的指數是以商業可購得的定量試劑盒進行分析。所述的定量試劑盒包括小鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia,Uppsala,Sweden)、小鼠瘦體素ELISA試劑盒(Morinaga,Yokohama,Japan)、小鼠脂聯素ELISA試劑盒(Crystal Chem International,Downers Grove,IL,USA)。其中，ELISA為酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA。
2-4病理組織分析
對收集到的一部分EWAT(附睾白色脂肪組織)和肝組織標本進行檢測，並使用顯微鏡(Olympus BX51,BX51,Olympus,Tokyo,Japan)拍攝顯微圖像。
2-5 mRNA的相對定量顯示基因表現分析
根據製造商的指示，利用Trizol試劑(Trizol reagent)分離來自肝臟組織的總RNA(分子研究中心公司，辛辛那提，美國俄亥俄州)。透過2%瓊脂糖凝膠電泳對前述提取的總RNA完整性進行檢測，並通過2%瓊脂糖凝膠電泳以及260和280nm的紫外線吸光度測定RNA濃度(分光光度計U-2800A，日立)。 總RNA(1μg)反轉錄為cDNA，以及5mL的莫洛尼鼠白血病病毒如前述方案反轉錄為酶(震中，麥迪遜，WI，USA)。聚合酶鏈反應是在最後的25μL中進行，其含有1U的Blend Taq-Plus(TOYOBO公司，日本)、1μL的RT第一鏈cDNA產物、各10μM的正向引子和反向引子、75mM的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)其中含有1mg/L的吐溫20(tween-20，pH值為8.3，又稱：聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯)、2.5mM的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸)以及2mM的MgCl2(氯化鎂)。所述引子如下表1所示。該產物係在2%瓊脂糖凝膠上進行測定，並用溴化乙錠(ethidium bromide)染色。
2-6西方墨點法測定
用於測定GLUT4和p-AMPK(Thr172)蛋白質的蛋白質提取和免疫墨點法(immunoblot)方法，是在前述動物模型的小鼠骨骼肌和肝組織上進行。PPAR α、PPAR γ及FAS蛋白質的測定是在前述動物模型的小鼠肝組織和白色脂肪組織(white adsipose tissue，WAT)上進行。小鼠骨骼肌受到GLUT4表現量分析，且總組織膜體部份(total membrane fraction)和緩衝液一起被收集並以前述方法進行測定。GLUT4、p-AMPK以及總AMPK的蛋白質含量以前述西方墨點法測定。
以下配合表2說明前述測試中，本發明細胞培養、動物模型實驗中，STZ誘導糖尿病小鼠之結果。在本發明細胞培養實驗中，包括C2Cl2成肌細胞在CON組、DMSO組、Insulin組、TT組(1μg/mL)、TT組(5μg/mL)以及TT組(10μg/mL)中的GLUT4、phospho-Akt(Ser473)、total-Akt(Ser473)及GAPDH的蛋白質含量。動物模型實驗中，STZ誘導糖尿病小鼠在體重(圖2A、圖2B)、附睾白色脂肪組織/肝臟組織的病理切片(圖3A、圖3B)、小鼠肝臟組織中PEPCK、G6-Pase、PPARalpha、SREBP-1c、DGAT2、CPT1a、SREBP-2、GAPDH表現的半定量RT-PCR分析(圖4A、圖4B、圖4C)、小鼠骨胳肌中的GLUT4、phospho-AMPK(Thr172)、total-AMPK(Thr172)、GAPDH的蛋白質含量測定(圖5A、圖5B)、小鼠肝臟中的phospho-AMPK(Thr172)、total-AMPK(Thr172)、β肌動蛋白的蛋白質含量測定(圖5A、圖5B)、小鼠肝臟中的PPAR α、FAS、PPAR γ、β肌動 蛋白的蛋白質含量測定(圖6A、圖6B、圖6C)、小鼠脂肪組織中的PPAR γ、FAS、β肌動蛋白的蛋白質含量測定(圖6A、圖6B、圖6C)。
如圖2A、圖2B及表2，顯示在本發明細胞培養實驗中，以不同培養基對C2Cl2骨骼成肌細胞進行細胞培養後的蛋白質含量分析結果。其中，CON(control)表示以DMEM培養的空白對照組(以下簡稱CON組)，DMSO表示以DMSO進行培養的對照組(以下簡稱DMSO組)，Insulin表示以胰島素進行培養的實驗組(以下簡稱Insulin組)，1、5、10、25(μg/mL)分別表示在不同濃度的純化物質去氫齒孔酸(TT)進行培養的實驗組(以下依序簡稱TT組(1)、TT組(5)、TT組(10))。其中，星號係相較於CON組之統計分析結果表示，其中，*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001。
請配合參閱圖2A、圖2B，顯示試管實驗的質膜中GLUT4、p-Akt(Ser473)/t-Akt表現量。在細胞培養實驗結束時，C2Cl2肌纖維細胞在Insulin組、TT組(1)、TT組(5)、TT組(10)及TT組(25)的GLUT4蛋白表現高於CON組，其統計分析結果依序為：Insulin組：P<0.001；TT組(1)：P<0.05；TT組(5)：P<0.05；TT組(10)：P<0.001；TT組(25)：P<0.001。又，C2Cl2肌纖維細胞在Insulin組及TT組(10)、TT組(25)的p-Akt(Ser473)/總Akt蛋白表現量高於CON組，其統計分析結果依序為：Insulin組：P<0.001；TT組(10)：P<0.001；TT組(25)P<0.001。
如圖3A至圖6C及表2，顯示在本發明動物模型實驗中，餵食不同劑量的純化物質去氫齒孔酸(TT)、二甲雙胍(Metformin)或非諾貝特(Fenofibrate) 對於STZ誘導第一型糖尿病小鼠之組織及血液數值分析結果。其中，CON(control)表示空白對照組(以下簡稱CON組)，STZ表示STZ誘導對照組(以下簡稱STZ組)，STZ+TT1、STZ+TT2、STZ+TT3分別表示服用不同劑量的純化物質去氫齒孔酸(TT)的實驗組(以下依序簡稱STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組)，而STZ+Metf表示經STZ誘導並口服藥品二甲雙胍(Metformin，Metf)的實驗組(以下簡稱STZ+Metf組)，STZ+Feno表示經STZ誘導並口服藥品非諾貝特(Fenofibrate，Feno)的實驗組(以下簡稱STZ+Feno組)。井號係相較於CON組之統計分析結果表示，其中，#表示P<0.05、##表示P<0.01、###表示P<0.001，而星號係相較於STZ+水(vehicle)組之統計分析結果表示，其中，*表示P<0.05、**表示P<0.01、***表示P<0.001。
體重、體重增幅、食物攝取量及組織重量
所有小鼠進入飼養室時的體重為15.03±0.17g。在固定溫度、濕度和光照條件下適應環境7天後，進行為時5天的STZ誘導，接著進行為時28天(四周)的去氫齒孔酸(TT)治療。其中，小鼠經過環境適應後進入STZ誘導期間的初始體重為18.55±0.19g，進入投藥治療期間時，CON組的初始體重為20.36±0.76g，STZ組的初始體重為19.59±0.22g。如表2所示，在實驗最後，CON組和STZ組的小鼠在體重和食物攝取量表現上無顯著差異。
接著比較藥物治療組的小鼠體重和食物攝取量，其包括不同劑量的TT治療組(統稱STZ+TT組，包括STZ+TT1組：劑量10mg/kg/day；STZ+TT2組：劑量20mg/kg/day；STZ+TT3組：劑量40mg/kg/day)、Metformin治療組(Metf組，劑量300mg/kg/day)以及Fenofibrate治療組(Feno組，劑量250mg/kg/day)。由表 2可知經STZ誘導後的STZ+TT組、STZ+Metf組及STZ+Feno組與STZ組在小鼠體重及食物攝取量的表現沒有差異。其中STZ+TT3組及STZ+Feno組的體重增幅下降(統計分析結果依序為P<0.01及P<0.05)。STZ+TT3組及STZ+Feno組的肝臟重量相較於STZ組為增加(統計分析結果依序為P<0.01及P<0.05)，STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的肝臟重量相較於CON組為增加(統計分析結果依序為P<0.001、P<0.01及P<0.05)。STZ+TT3組及STZ+Metf組顯示其褐色脂肪組織(BAT)相較於STZ組為增加(統計分析結果依序為P<0.05及P<0.05)。
血漿葡萄糖(Plasma Glucose)指數
於本發明動物試驗中，所有小鼠的初始血糖指數相近，為85.7±3.7mg/dL；經STZ誘導後，CON組的血糖指數為87.1±4.9mg/dL，STZ誘導糖尿病小鼠的血糖指數大於240mg/dL者被選擇進行後續實驗，且STZ誘導糖尿病小鼠的平均血糖指數為259.8±3.8mg/dL。在實驗終止時，STZ組的血糖指數明顯大於CON組(統計分析結果為P<0.001)；STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血漿葡萄糖濃度相較於STZ組顯著地減少(統計分析結果依序為：P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001及P<0.001)；其中，STZ+TT2組或STZ+TT3組的血糖指數相較於CON組沒有區隔。
2-8血脂
本發明實驗終止時，STZ組的血液三酸甘油酯(TG)數值及總膽固醇(TC)數值相較高於CON組(統計分析結果依序為：P<0.001及P<0.001)。STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液游離脂 肪酸(FFA)數值相較低於STZ組。STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液三酸甘油酯數值相較於STZ組是減少的(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01及P<0.01)。STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液總膽固醇數值相較於STZ組是下降的(統計分析結果依序為：P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001及P<0.001)。STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組在血液三酸甘油酯數值及總膽固醇數值的表現上未與CON組產生區隔。
胰島素、瘦體素、脂聯素數值
STZ組的血液胰島素濃度較低於CON組(統計分析結果為P<0.01)；STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液胰島素濃度相較於STZ組顯著地增加(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.001、P<0.001、P<0.001及P<0.001)；其中，STZ+TT3組的血液胰島素濃度相較於CON組是增加的(統計分析結果為P<0.05)；STZ組的血液瘦體素濃度相較高於CON組(統計分析結果為P<0.001)；STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液瘦體素數值相較於STZ組明顯降低(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.001、P<0.001、P<0.05及P<0.001)；STZ組的脂聯素指數相較低於CON組(統計分析結果為P<0.05)；STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的血液脂聯素數值相較於STZ組是顯著增加的(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01及P<0.01)。
組織學
經STZ誘導產生的脂肪細胞與CON組中的附睾白色脂肪組織(epididymal WA)無異，其中，STZ組及CON組的脂肪細胞平均面積分別為6274.8±188.4μm2以及7150.1±221.1μm2。STZ+TT3組的脂肪細胞平均面積為4910.5±104.9μm2，相較小於STZ組。STZ+TT2組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的脂肪細胞平均面積分別為5379.9±187.2、5308.9±204.7及5373.8±194.6μm2。如圖3A、圖3B所示，相較於CON組，STZ組顯示出小鼠有輕微的肝細胞空泡樣變(ballooning degeneration)；經投藥治療，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的小鼠肝細胞顯示已不具有空泡樣變。該些組織與形態的檢測結果強烈地教示去氫齒孔酸(TT)不會造成肝臟的三酸甘油酯累積。
肝臟標靶基因表現
如圖4A、圖4B、圖4C所示，STZ組的PEPCK、G6 Pase、SREBP1c及DGAT2相較於CON組具有較高的mRNA表現量，而STZ組的PPAR α及CPT1a相較於CON組具有較低的mRNA表現量。經給予化合物及對照藥物後，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組顯示出其PEPCK、G6 Pase、SREBP1c及DGAT2的mRNA表現量相較於STZ組是降低的，且STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組中PPAR α及CPT-1a的mRNA表現量是增加的。
不同組織中的標靶基因表現量
如圖5A、圖5B所示，在本發明實驗終止後，STZ組的骨骼肌中GLUT4膜蛋白表現量(membrane expressions levels of GLUT4)相較低於CON組(統 計分析結果為P<0.05)。STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的骨骼肌中GLUT4膜蛋白表現量相較大於STZ組(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.001及P<0.001)；STZ組的骨骼肌及肝臟中p-AMPK/總-AMPK蛋白表現量相較低於CON組(統計分析結果依序為：P<0.01及P<0.05)。經過治療後，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的骨骼肌中p-AMPK/t-AMPK蛋白表現量被增加了(統計分析結果依序為：P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001及P<0.001)。隨著治療，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的肝臟中p-AMPK/t-AMPK肌肉蛋白表現量相較於STZ組是增加的(統計分析結果依序為：P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01及P<0.01)。
如圖6A、圖6B所示，STZ組的肝臟中PPAR α蛋白表現量相較低於CON組(統計分析結果為：P<0.001)；經過治療後，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的肝臟中PPAR α蛋白表現量增加了(統計分析結果依序為：P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001及P<0.001)。STZ組的肝臟中FAS及PPAR γ蛋白表現量相較高於CON組(統計分析結果依序為：P<0.01及P<0.001)；經過治療後，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的肝臟中FAS及PPAR γ蛋白表現量被降低了。STZ組的脂肪組織中FAS及PPAR γ蛋白表現量相較高於CON組(統計分析結果依序為：P<0.001及P<0.001)：經過治療後，STZ+TT1組、STZ+TT2組、STZ+TT3組、STZ+Metf組及STZ+Feno組的脂肪組織中FAS及PPAR γ蛋白表現量被降低了。
綜上所述，本發明開發了牛樟芝純化物之純化物質去氫齒孔酸作為對於糖尿病及血脂異常的治療效果。STZ誘導糖尿病小鼠在口服活性物去氫齒孔酸後，不僅顯著地降低血糖及增高胰島素濃度，也降低了血液中三酸甘油酯及總膽固醇。去氫齒孔酸，其係透過增加肌細胞(C2Cl2 myotube)磷酸化Akt和膜GLUT4表現，以及增加STZ誘導的糖尿病小鼠骨骼肌細胞膜中GLUT4膜蛋白、和增加骨骼肌p-AMPK蛋表現量，及降低肝臟中PEPCK及G6 Pase的mRNA表現量，達到降低血液中葡萄糖濃度，去氫齒孔酸顯著地增加了骨骼肌細胞膜的GLUT4膜蛋白表現量以提升葡萄糖攝取。此外，去氫齒孔酸增加了骨骼肌及肝臟組織中p-AMPK/t-AMPK蛋白表現量。去氫齒孔酸降低了與肝臟葡萄糖生成抑制作用相關的PEPCK及G6 Pase的mRNA指數。增強骨骼肌中GLUT4膜蛋白以及降低肝臟中葡萄糖生成之結合，導致降低血液中葡萄糖濃度。去氫齒孔酸(TT)通過抑制肝臟的FAS和PPAR γ蛋白表現量伴隨降低SREBP1c和DGAT2的mRNA表現量，達到降低了血漿中三酸甘油酯、脂肪肝及總膽固醇指數，而增加了PPAR α的表現量並伴隨著肝臟中脂肪酸氧化增強CPT1A的mRNA表現量。去氫齒孔酸減少了包括存在於脂肪組織中PPAR γ及FAS脂肪合成基因，其可能有利於減少脂肪細胞分化及脂質貯存。進一步地，去氫齒孔酸減少了SREBP2的mRNA表現量，這導致了血液中總膽固醇降低。本研究顯示去氫齒孔酸(TT)對與第一型糖尿病有關的高脂血症有優異的治療潛力。

Claims (11)

  1. 一種牛樟芝純化物之用途，其係用於製備治療第一型糖尿病之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  2. 如請求項1所述之用途，其係用於製備治療第一型糖尿病伴有的高血脂症之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  3. 一種牛樟芝純化物之用途，其係用於製備降低血糖及增加胰島素濃度之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其係透過增加肌細胞(C2Cl2 myotube)Akt磷酸化和膜GLUT4表現，以及增加骨骼肌中細胞膜GLUT4蛋白和增加骨骼肌p-AMPK蛋白表現量，及降低肝臟中PEPCK及G6 Pase的mRNA表現量，達到降低血液中葡萄糖濃度。
  5. 如請求項1所述之用途，其係用於製備降低第一型糖尿病的血液中三酸甘油酯及總膽固醇之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其係以去氫齒孔酸降低肝臟的FAS和PPAR γ的蛋白表現量伴隨減少SREBP1c和DGAT2的mRNA表現，達到降低了血液中三酸甘油酯濃度，而增加了PPAR α的蛋白表現量並伴隨著增加肝臟中CPT1a的mRNA表現以增加脂肪酸氧化。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其係以去氫齒孔酸減少SREBP2的mRNA表現量，達到降低血液中總膽固醇數值。
  8. 如請求項1所述之一種牛樟芝純化物之用途，其係用於製備增加第一型糖尿病的骨骼肌及肝臟組織中p-AMPK蛋白表現量之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  9. 如請求項1所述之用途，其係用於製備治療第一型糖尿病伴有的脂肪肝、降低肝臟空泡樣變之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其係透過去氫齒孔酸下調PPARγ和FAS的脂質生成基因表現，減少脂肪細胞分化、降低脂肪累積在脂肪細胞以及減輕脂肪肝，並透過去氫齒孔酸上調肝臟脂肪酸代謝PPARα表現以降低PPARγ基因表現量，進而減少肝臟脂質和降低血液中三酸甘油酯的含量。
  11. 如請求項1所述之用途，其係用於製備降低第一型糖尿病的血液瘦體素之醫藥化合物，該純化物係自牛樟芝菌絲體提取之純化物質，該純化物質為去氫齒孔酸。
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