TWI579553B - 以紫外光－可見光檢測之高效能液相層析設備及方法 - Google Patents

以紫外光－可見光檢測之高效能液相層析設備及方法 Download PDF

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Description

以紫外光-可見光檢測之高效能液相層析設備及方法
本發明係關於液相層析和分析物檢測之領域。更具體而言，本發明係關於一種高效能液相層析方法和裝置，用於以紫外光-可見光及其他檢測方法有效地產生分析物之層析圖，以及降低液相層析設備之質量要求，以提升於多個領域之運用。
高效能液相層析(High performance liquid chromatography，HPLC)是最重要的分析技術之一。HPLC技術廣泛地應用於化工、醫藥用途、環境及食品科學等眾多領域。
液相層析採用液體作為分析物試樣的載體。該載體或流動相通過由裝滿顆粒的管柱所構成的固定相。在傳統的HPLC中，該顆粒尺寸約為7μm。
HPLC可被應用於可溶於水的分析物混合物或種類，以及可溶於有機溶劑中的聚合物。
近來，新的HPLC相關技術已開發出改良式檢測方法。例如，超高壓液相層析(Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography，UPLC)、快速解析度液相層析(Rapid Resolution Liquid Chromatography，RRLC)、超快速液相層析(Ultrafast Liquid Chromatography，UFLC)、快速分離液相 層析(Rapid Separation Liquid Chromatography，RSLC)及快速蛋白質液相層析(Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC)。
傳統液相層析方法和系統之缺點在於液相層析設備與質譜 儀設備或其他大型傳統分析物檢測系統結合的困難。質量重且尺寸大的液相層析設備難以與同樣典型為大型的質譜儀合併使用。
此外，在醫療與衛生保健機構，其所需為具備一小型且有效 的液相層析設備，使得某些量測可在門診診療現場進行，而無需在更大型場所如醫療中心或醫院執行。
再者，對於應在田野或遠端地點如熱帶雨林、地質地點如火 山，或在太空船或宇宙地點執行的環境量測，其可能必須具備小型且有效的液相層析設備。此種裝置將允許在來源處進行分析物、化學物、污染物或其他物質之檢測。
傳統液相層析方法和系統之另一缺點係在於使用光電倍增 管(photomultiplier)作為光感測器。當光電倍增管被用作光感測器時，通常需要單色光鏡(monochromator)和反射鏡以從試樣分離出光波長。
另一方面，需要一種具備能同時且有效地檢測一光波長範圍 的液相層析設備。
傳統液相層析方法和系統之另一缺點係在於使用質量重的 螺旋式泵浦頭(screw-operated pump heads)進行液體輸送。
本領域仍持續地需要一種具有能同時量測一光波長範圍之 檢測器裝置的液相層析設備。本領域亦需要能以較輕質量提供有效泵送(pumping)的液相層析設備。此外，本領域長期需要可與其他檢測系統共 用以及進行現場量測的有效液相層析方法和系統。
本發明提供一種高效能液相層析之方法和裝置，用於以紫外光-可見光及其他檢測方法有效地產生分析物之層析圖，及用於降低液相層析設備之質量要求，以提升於多個領域之運用。
本發明之具體實施例包括具有檢測器裝置之液相層析設備，其可同時量測一光波長範圍。本發明之液相層析設備能以較輕質量提供有效泵送。
本發明之具體實施例包括：一種液相層析設備，包括：製備迴路，其包含二線性步進泵浦；試樣迴路，其包含試樣注射器；層析管；及檢測器裝置，包含：閃光燈：液流電池；及光感測器，包括：入射狹縫；光柵；及電荷耦合器件陣列。
如上述設備，其中該光柵為蝕刻矽光繞射光柵，具有用於聚焦繞射光的凸面形狀。
如上述設備，其中該層析管柱係選自吸附、分配、離子交換、親和性及粒徑篩析滯留管柱。
如上述設備，其中該製備迴路可在等度(isocratic)或差動(differential)泵送模式下運作。
如上述設備，其中該檢測器裝置具有從230nm至800nm之掃描範圍。
如上述設備，其中該光感測器為紫外光-可見光感測器。
如上述設備，其中該步進泵浦具有0.8毫微升(nanoliter)之最小步進。
如上述設備，其中該閃光燈為氙氣型閃光燈。
如上述設備，其中該閃光燈在2瓦特(Watt)之功率下以50%或較少之工作週期運作。
如上述設備，更包括微電腦控制器，其構成使該閃光燈之運作同步於該電荷耦合器件陣列之運作。
如上述設備，其中該液流電池為HPLC液流電池。
如上述設備，其中該液相層析設備具有小於10L之總體積。
一種用於執行液相層析的方法，該方法包括：提供在載體液體中之分析物；透過層析管柱以步進泵送該載體液體以分離該分析物；使用檢測器裝置檢測該分離出的分析物，其中該檢測器裝置包含閃光燈及包含光柵和電荷耦合元件陣列之紫外光-可見光感測器。
如上述方法，其中該光柵為蝕刻矽光繞射光柵，具有用於聚焦繞射光的凸面形狀。
如上述方法，其中該層析管柱選自吸附、分配、離子交換、親和性及粒徑篩析滯留管柱。
如上述方法，其中該檢測器裝置具有從230nm至800nm之掃描範圍。
如上述方法，其中該步進泵浦具有0.8毫微升之最小步進。
如上述方法，其中該閃光燈在2W之功率下運作。
如上述方法，更包含運作微電腦控制器以使該閃光燈之運作同步於該電荷耦合器件陣列之運作。
如上述方法，更包括使來自該光柵的繞射光聚焦於該電荷耦合器件陣列上。
10‧‧‧線性步進泵浦
20‧‧‧壓力轉換器
30‧‧‧流量計
35‧‧‧溶劑混合器
40‧‧‧致動載體閥
50‧‧‧致動試樣閥
60‧‧‧試樣注射器
70‧‧‧載體貯槽
80‧‧‧檢測器裝置
90‧‧‧管柱
110‧‧‧閃光燈
120‧‧‧光纖
130‧‧‧液流電池
140‧‧‧紫外光-可見光感測器
150‧‧‧入射狹縫
160‧‧‧光柵
170‧‧‧電荷耦合器件陣列
圖1顯示本發明之液相層析設備之具體實施例示意圖。該液相層析設備可包括二或多個線性步進泵浦10、壓力轉換器20、流量計30、溶劑混合器35、致動載體閥40、致動試樣閥50、試樣注射器60、載體貯槽70、檢測器裝置80、管柱90及微電腦控制器。
圖2顯示本發明之檢測器裝置80之具體實施例示意圖。該檢測器裝置可包括一閃光燈110、光纖120、一液流電池130及一紫外光-可見光感測器140。該紫外光-可見光感測器140可包括一入射狹縫150、一光柵160及一電荷耦合器件(charge-coupled device，CCD)陣列170。
圖3顯示以本發明之HPLC設備所得到的肌紅蛋白 (MyoGlobin)試樣之層析圖。該層析圖顯示滯留時間相對於吸光度，且係以400nm波長的紫外光-可見光吸光度所獲得。本發明之HPLC設備具有一小於10L之總體積，並在小於150瓦特之總功率消耗下運作。
本發明之具體實施例提供一種高效能液相層析設備和方法。本發明之高效能液相層析設備能提供快速檢測和分析物之複雜混合物的分離。
本發明之HPLC設備可具有一或多個泵浦、壓力和流量感測器、開關閥、用於分離分析物混合物的管柱及解析分析物試樣的檢測器。
在部分具體實施例中，本發明之液相層析設備可具有一或多個泵浦、流量控制反饋系統、分析物管柱及檢測器裝置。
在部分具體實施例中，分析物管柱可具有裝滿內部構成固定相的許多小顆粒。分析物之混合物可藉由使流動相混合物通過管柱之固定相而分離。不同的分析物將需要不同的滯留時間以通過該管柱。所分離出或純化的試樣可產生於管柱末端。
本發明之液相層析設備的具體實施例可採用管柱進行吸附、分配(partition)、離子交換、親和性及粒徑篩析滯留。
在部分具體實施例中，本發明之液相層析設備可具有載體液體之貯槽及與該貯槽連通液體的層析管。
本發明之具體實施例包括一種液相層析設備，其能透過管柱提供載體溶劑之連續且穩定的流量。該載體之連續且穩定的流量能提供分離及檢測各別分析物的能力。
在某些具體實施例中，本發明包括液相層析設備，其能提供 分析物和載體之連續且穩定的流量，因此得以執行分析物之定量量測。
在一些方面，本發明之HPLC設備可具有流量控制系統。流 量控制系統可具有一或多個壓力轉換器，其反饋至一或多個泵浦以維持管柱中的恆定壓力。
在某些具體實施例中，流量控制系統可具有流量計，其反饋 至泵浦以維持管柱中的恆定流速。
在某些具體實施例中，本發明之HPLC設備可在等度或差動 泵送模式下運作。
在部分具體實施例中，該載體溶劑可在等度泵送模式下由單 一機械泵浦驅動。於等度泵送時，該流動相之組合物可保持恆定。
在其他具體實施例中，該載體溶劑可在差動泵送模式下由兩 機械泵浦驅動。於差動泵送時，該流動相之組合物在取得HPLC層析圖過程中會有變化，以增進解析度和分離度。於差動泵送時，不同的溶劑可以不同的速度予以泵送及混合。
在一些方面，本發明之設備維持恆定泵送速度。壓力轉換器 和流量感測器可用於提供機械泵浦反饋，以使用微電腦維持恆定泵送速度。
在某些具體實施例中，本發明之HPLC設備可具有一或二泵 浦頭，每一者具有單一活塞。泵浦頭可具有熱應力活塞(sapphire piston)和不鏽鋼泵浦頭。
單一活塞泵浦之實例為東方馬達公司(Oriental Motors)的DRL42PB2-04。
在另一方面，本發明之液相層析設備可具有一或二線性步進 馬達以運作該等泵浦頭。線性步進馬達相較於螺旋式驅動步進馬達可優勢地提供更有效的泵送。線性步進馬達的使用能降低功率消耗，及減少對應泵浦頭所需尺寸且維持恆定泵送速度。
在部分具體實施例中，該泵送步進或解析度可為0.8毫微升 (nanoliter，nl)。
本發明之HPLC之質量流率(mass flow rate)可為從nl/min 至μl/min。在部分具體實施例中，本發明之HPLC之質量流率可為從1nl/min至20ul/min。
在本發明之HPLC中的壓力可為從200至500巴(Bar)。
本發明之HPLC可包括注射器，其將試樣導入流動載體。用於本發明之HPLC的試樣容積可為從1至20μl。
在部分具體實施例中，本發明提供一種用於高效能液相層析之多波長紫外光-可見光檢測器裝置。
本發明之檢測器裝置可包括閃光燈、閃光燈控制器、液流電池及紫外光-可見光感測器。
液流電池之實例為HPLC液流電池。
在一些方面，該閃光燈可為微型氙氣型閃光燈(如Excelitas)。
在某些方面，本發明之設備包括燈控制器，其使該燈之照明與該光感測器之運作同步。藉由使該燈之照明與該光感測器之運作同步，本發明之設備可提供高光度並降低運作設備進行分析物檢測所需的電功 率。
例如，在本發明之檢測器裝置中，閃光燈可以50%或以下之脈衝工作週期運作。燈控制器可被用於確保該光感測器僅在燈亮時運作。此運作可使為得到分析物之紫外光-可見光光譜所需的燈功率從約50瓦特降低至2瓦特。
在部份具體實施例中，該光感測器具有入射狹縫、CCD陣列、及矽光柵。
在一些方面，該矽光柵可為蝕刻矽表面。該矽光柵可具有凸面形狀，用於提供平坦聚焦平面以匹配CCD陣列之平面。
一般而言，CCD(Charge-coupled device，電荷耦合器件)陣列可同時檢測多個光波長。除此之外，本發明設備之光感測器之小型實體尺寸使設備之實體尺寸得以縮減。
使用CCD檢測器優勢地得以同時取得一大範圍波長而無需改變光柵之角度。
在部分具體實施例中，檢測器整體體積和檢測器總功率消耗可分別縮減至少10倍係數。
在進一步之態樣中，本發明之HPLC設備可包括燈控制器微電腦。該燈源通常會在脈衝模式下運作。使用該燈控制器，來自該燈的激發光可同步於光感測器之資料取得。藉由同步於該資料取得，資料係僅在閃光過程中燈亮時取得。
藉由閃光燈之發光同步於光感測器檢測週期，本發明之設備優勢地提供該閃光燈之高峰值功率發射，以進行分析物檢測。
請參考圖1，本發明之液相層析設備可包括二或多個泵浦 10、壓力轉換器20、流量計30、溶劑混合器35、致動載體閥40、致動試樣閥50、試樣注射器60、載體貯槽70、檢測器裝置80、管柱90及微電腦控制器。
本發明之液相層析設備具體實施例可包括二線性步進泵浦 10以在該載體溶劑上產生泵浦頭壓力。藉由使用兩步進泵浦，該泵浦系統能在等度或差動泵送模式下運作。
載體管之流動系統係用於輸送、混合及清除載體液體，以及 提供反饋至該泵浦系統。至該泵浦的反饋可由壓力轉換器20和流量計30所提供。該反饋可被用於控制載體流速和壓力。該反饋控制可維持穩定的連續載體流速和壓力。
該載體管之流動系統可使用多向致動開關閥進行流體連 通。該致動載體閥40運作該製備迴路。致動試樣閥50運作該試樣迴路。
該相同或不同的載體液體可被維持在分開的載體貯槽70 中。如在該泵浦中可包含相同或不同載體液體的分析物試樣，可使用試樣注射器60注入該流動載體。該流動載體可將試樣帶入管柱90，其係裝滿適合用於層析滯留及分析物分離的顆粒固定相。該載體會將所分離出的分析物帶至檢測器裝置80進行分析。該檢測器裝置80可檢測所分離出的分析物成分。
請參考圖2，本發明之檢測器裝置80之具體實施例可包括閃 光燈110、光纖120、液流電池130及紫外光-可見光感測器140。紫外光-可見光感測器140可包括入射狹縫150、光柵160及CCD陣列170。
本發明之液相層析設備具體實施例還可包括微電腦控制 器，其可使該閃光燈之運作同步於該光感測器之資料取得。
利用此配置，本發明之液相層析設備可提供高光度以進行分 析物檢測。此外，可維持恆定的泵送速度。
本發明之液相層析設備可優勢地使用商業用層析管。
本發明之液相層析設備可優勢地被用於現場，在來源處進行 分析物、化學物、污染物或其他物質之檢測。
本發明提供優勢的結果，即使質量縮減，本發明之液相層析 設備仍可提供能保持意想不到的恆定的分析物滯留時間。即使質量縮減，本發明仍可提供意想不到的準確的定量量測。
在部份具體實施例中，在設備中的載體管在製備迴路通道A 為外徑(Outer-diameter，OD)1/16”和1/32”、內徑(Inner-diameter，ID)150um(micrometer，微米)的鐵氟龍(Polytetrafluoroethylene，PTFE)管材，而在通道B為25um ID PTFE管材，製備迴路。
六向開關閥，例如C52-1006I(Valco公司)，可被分別用於製備和試樣迴路。
例示的壓力轉換器包括DF2-SS-01-10K(DJ儀器公司)。
例示的流量感測器包括SLG1430(CMOSens科技公司)。
在某些具體實施例中，本發明之HPLC設備可與1/16”或1/32”或380um OD HPLC管柱相容。
在進一步方面，本發明之設備可具有藉由一或多個不同的管柱取代該管柱而分離多種未知試樣的能力。
在某些具體實施例中，檢測器裝置可包括一由230nm至800 nm之掃描範圍。
在進一步的具體實施例中，本發明之HPLC設備可被連接至 質譜儀、核磁共振譜儀或光散射檢測器。
在一具體實施例中，本發明之HPLC設備係製成具有小於12 kg之質量及小於22L之體積。此設備具有小於200瓦特之總功率消耗，並使用鋰離子電池運作。該設備可視需要以習知的電功率源供電。
在一具體實施例中，用於本發明之HPLC設備的檢測器裝置 係製成具有2瓦特之功率消耗和0.486L(9cm x 18cm x 3cm)之整體尺寸。
本發明之液相層析裝置可優勢地結合有效的小型體積質譜 儀，提供高通量之分析物篩析及檢測。當該液相層析(LC)設備和該質譜儀設備之功率消耗及體積減少時，該結合相較於習知LC-MS設備係有能力進行高通量之分析物檢測。
此外，本發明之液相層析設備可優勢地用於門診診療。
此外，本發明之液相層析設備可優勢地用於在現場或遠端地點進行環境量測以在來源處檢測分析物、化學物、污染物或其他物質。
實施例1：本發明之高效能液相層析係組裝具有紫外光-可見光檢測器裝置。該HPLC具有小於10L之總體積。此HPLC係以小於150瓦特之總功率消耗運作。請參考圖3，其為用此HPLC對MyoGlobin試樣所得到的顯示滯留時間相對於吸光度的層析圖。吸光度係在400nm波長取得。
本文特別提到的所有公開資料和專利和文獻皆為所有目的而併入供參考。
應理解的是本發明不限於所敘述的具體方法、方案、材料及試劑，因此等皆可變化。亦應理解的是本文所使用的術語僅為說明具體實施例之目的，並不欲限制在本發明的範疇，其將被申請專利範圍所涵蓋。
應注意，除非上下文另有明顯指示，否則本文與申請專利範圍所使用的單數形「一」及「該」包括複數參考。同樣地，本文「一」、「一或多個」及「至少一者」等詞可互換使用。亦應注意的是「包含」、「包括」及「具有」等詞可互換使用。
無需進一步闡釋，據信本領域之技藝人士可依據上述說明最大限度地利用本發明。因此，以下特定具體實施例應僅理解為例示性，且不以任何方式限制本發明之其餘部分。
在本說明書中所揭示的全部特徵皆可以任何組合結合。在本說明書中所揭示的各特徵可以提供相同、相等或同樣目的之替代性特徵取代。
10‧‧‧線性步進泵浦
20‧‧‧壓力轉換器
30‧‧‧流量計
35‧‧‧溶劑混合器
40‧‧‧致動載體閥
50‧‧‧致動試樣閥
60‧‧‧試樣注射器
70‧‧‧載體貯槽
80‧‧‧檢測器裝置
90‧‧‧管柱

Claims (21)

  1. 一種液相層析設備，包括：製備迴路，其包含二或多個線性步進泵浦；試樣迴路，其包含試樣注射器；層析管柱；及檢測器裝置，包括：閃光燈：液流電池；及光感測器，包括：入射狹縫；光柵；及電荷耦合器件陣列，其中該液相層析設備具有小於22L之總體積。
  2. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該光柵為蝕刻矽光繞射光柵，其具有用於聚焦繞射光的凸面形狀。
  3. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該層析管柱係選自吸附、分配、離子交換、親和性及粒徑篩析滯留管柱。
  4. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該製備迴路可在等度或差動泵送模式下運作。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之設備，其中該檢測器裝置具有從230nm至800nm之掃描範圍。
  6. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該光感測器為紫外光-可見光感測 器。
  7. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該等步進泵浦具有0.8毫微升之最小步進。
  8. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該閃光燈為氙氣型閃光燈。
  9. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該閃光燈係在2瓦特(Watt)之功率下以50%或較少的工作週期運作。
  10. 如申請專利範圍第1項之設備，更包括微電腦控制器，其構成使該閃光燈之運作同步於該電荷耦合器件陣列之運作。
  11. 如申請專利範圍第1項之設備，其中該液流電池為HPLC液流電池。
  12. 如申請專利範圍第5項之設備，其中該光感測器為紫外光-可見光感測器、該等步進泵浦具有0.8毫微升之最小步進、及/或該閃光燈為氙氣型閃光燈。
  13. 如申請專利範圍第5項之設備，其中該液相層析設備具有小於10L之總體積。
  14. 一種用於執行液相層析的方法，該方法包括：提供在載體液體中之分析物；透過層析管柱以步進泵送該載體液體以分離該分析物；以檢測器裝置檢測該分離出的分析物，其中該檢測器裝置包含閃光燈及包含光柵及電荷耦合器件陣列之紫外光-可見光感測器。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該光柵為蝕刻矽光繞射光柵，其具有用於聚焦繞射光的凸面形狀。
  16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該層析管柱係選自吸附、分配、離子交換、親和性及粒徑篩析滯留管柱。
  17. 如申請專利範圍第14或15項之方法，其中該檢測器裝置具有從230nm至800nm之掃描範圍。
  18. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該步進泵送具有0.8毫微升之最小步進。
  19. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該閃光燈是在2W之功率下運作。
  20. 如申請專利範圍第14項之方法，更包括運作微電腦控制器以使該閃光燈之運作同步於該電荷耦合器件陣列之運作。
  21. 如申請專利範圍第14項之方法，更包括使來自該光柵的繞射光聚焦於該電荷耦合器件陣列上。
TW103140106A 2013-11-24 2014-11-19 以紫外光－可見光檢測之高效能液相層析設備及方法 TWI579553B (zh)

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