TWI545131B

TWI545131B - 抗單股鏈ｉｖ型膠原纖維多胜肽抗體、含該抗體的醫藥、及腫瘤之診斷藥、或治療藥

Info

Publication number: TWI545131B
Application number: TW100140943A
Authority: TW
Inventors: 森田誠; 戶村有宏; 雑賀寬; 林利彥; 杉原英光; 德中一寬; 佐藤學道; 今村保忠
Original assignee: 日本化藥股份有限公司
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2016-08-11
Also published as: EP2639243A4; AU2011327208C1; EP2639243A1; CN103201291B; CA2820590A1; TW201305199A; JP5876833B2; AU2011327208B2; CN103201291A; WO2012063839A1; US20130224854A1; KR20130135869A; US9163080B2; AU2011327208A1; JPWO2012063839A1

Description

抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體、含該抗體的醫藥、及腫瘤之診斷藥、或治療藥

本發明係關於一種單株抗體，其係與為IV型膠原纖維基因產物之呈單股被分泌的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合，且抑制表現前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的腫瘤組織之增殖的單株抗體。又，本發明係關於包含前述單株抗體的醫藥、及腫瘤之診斷藥、預防藥、或治療藥。

活體組織係由為生命單位的細胞及其細胞周圍或細胞間存在的細胞外基質所構成。前述細胞外基質係以膠原纖維(collagen)、層黏連蛋白(laminin)、彈性蛋白(elastin)、蛋白聚糖(proteoglycan)等之受到糖鏈修飾的蛋白質等作為主成分的巨大蛋白質複合體。膠原纖維佔活體蛋白質之約30%，大多存在於結締組織。又膠原纖維係於上皮及結締組織之交界、或內皮及結締組織之交界構成基底膜。已知作為前述細胞外基質之機能係關於細胞增殖及/或分化之控制，現已明瞭於正常組織之生長、修復、再生等活動中，前述細胞外基質與細胞之間的相互作用係為重要的。

現已明瞭此細胞外基質與細胞之相互作用對於腫瘤形成中的腫瘤細胞增殖及血管新生亦扮演重要任務。腫瘤細胞經重複前述細胞外基質之分解及合成而再構築細胞外微小環境，促進腫瘤細胞的增殖或新血管的形成而腫瘤組織會成長。再者，已知腫瘤細胞的浸潤及/或轉移係由於此經再構築的細胞外基質之分解所引起。

前述膠原纖維已知有20種類以上的基因型為相異者，例如，由纖維芽細胞或間質細胞等構成的結締組織主要存有I型膠原纖維，但於基底膜主要存有IV型膠原纖維。

前述IV型膠原纖維除了由纖維芽細胞或間質細胞分泌以外，可自上皮細胞、內皮細胞等各式各樣的細胞分泌。一般認為此經分泌的IV型膠原纖維會彼此會合而構築具有網眼(mesh)構造的基底膜骨格。正常組織之基底膜係存在於上皮組織及間質組織之交界、或內皮組織及間質組織之交界等，而調節組織之形態及機能。

膠原纖維分子係由3股左旋的多胜肽鏈彼此結合、且具有鬆散的右旋之3個重複構造。前述IV型膠原纖維存有6種類之基因型，已知來自此等基因的α1~α6之多胜肽鏈，而一般認為藉由前述多胜肽鏈之組合的不同，有3種類以上之分子種類。最廣泛存在的基底膜係由2股α1多胜肽鏈與1股α2多胜肽鏈經分子間雙硫鍵(disulfide)而被交聯的IV型膠原纖維分子之聚集體(aggregate)所構築，α3~α6之多胜肽鏈所構成的IV型膠原纖維分子僅存在於有限組織之基底膜。

如此前述IV型膠原纖維係指以分子間雙硫鍵交聯的3股α多胜肽鏈形成3重螺旋構造的3聚體分子或此等之聚集體。一般而言，已知IV型膠原纖維係呈3聚體分子被分泌至細胞外，於細胞外形成聚集體。然而，本發明者們發現人類培養細胞除了前述IV型膠原纖維之外，分泌不具有分子間雙硫鍵，或呈未採取螺旋構造的單獨之多胜肽鏈(以下，有稱為「單股鏈IV型膠原纖維多胜肽」的情形)(參照非專利文獻1)。尤其培養基不含維生素C的情形，與前述IV型膠原纖維相比，培養細胞會壓倒性地產生較多前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(參照非專利文獻2)。又，已知前述IV型膠原纖維會受到蛋白質分解酵素(明膠酶(gelatinase)、基質金屬蛋白酶-2(metalloproteinase-2)等)的分解，但前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽因並未採取螺旋構造，與具有3重螺旋構造的前述IV型膠原纖維相比，更容易受到分解酵素的分解，於活體內要測出完全長度之單股鏈IV型膠原纖維多胜肽被認為是困難的，而本發明者們，於人類胎盤發現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(參照非專利文獻3)。

本發明者們，進一步明瞭了自細胞被分泌的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽係經歷了與IV型膠原纖維不同的轉譯後修飾。已知於IV型膠原纖維，脯胺酸(proline)氫氧化及離胺酸(lysine)氫氧化參與3重螺旋構造之形成及/或安定化，但單股鏈IV型膠原纖維多胜肽，與IV型膠原纖維相比，脯胺酸氫氧化及離胺酸氫氧化的程度較低。又，單股鏈IV型膠原纖維多胜肽會與辨識Galβ1-3GalNAc糖鏈的洋菇(Agaricus bisporus)凝集素(ABA)(lectin)反應，但IV型膠原纖維不會與ABA凝集素反應。

如此之單股鏈IV型膠原纖維多胜肽具有與IV型膠原纖維或經其變性所產生的多胜肽相異的化學構造，推測單股鏈IV型膠原纖維多胜肽具有與IV型膠原纖維相異的生物學上機能。

固體性腫瘤為了增殖必須有新的血管。因此，抑制血管新生為腫瘤增殖之抑制方法之一。前述IV型膠原纖維由膠原纖維區域及非膠原纖維區域而成，為C末端之非膠原纖維區域之多胜肽的血管生成抑制因子(Arresten)已被報告會抑制管腔形成，抑制血管新生的結果，抑制腫瘤之增殖(參照非專利文獻4)。

就作為抗前述IV型膠原纖維的單株抗體而言，已報告JK199(參照專利文獻1)及血清中之IV型膠原纖維之測量套組所含的抗體(參照非專利文獻5、非專利文獻6、及專利文獻2)。

又，就作為抗經變性的IV型膠原纖維的單株抗體而言，已報告對「隱蔽的膠原纖維部位(cryptic collagen site)」作用的抗體(參照專利文獻3)。然而，並未揭示或暗示此等抗體會辨識被分泌至細胞外且安定地存在的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。

另一方面，就作為辨識單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的抗體而言，已報告JK132(參照非專利文獻1、及非專利文獻7)會辨識單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。然而，由此等報告未能明瞭單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之生物學上的角色及與癌症的關連性，關於含有抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的抗體的醫藥有用於作為腫瘤之診斷藥及治療藥的內容並未被揭示或暗示。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]　特開昭63-78067號公報

[專利文獻2]　特開平2-1553號公報

[專利文獻3]　特開2009-240324號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]　Takahashi，S.et al. Connective Tissue(1999) vol.31；p.161-168

[非專利文獻2]　Yoshikawa，K.et al. J.Biochem.(2001) vol.129；p.929-936

[非專利文獻3]　Kajimura，D.et al. Biochemical and Biophisical Research Communication(2004)vol.314；p.11-16

[非專利文獻4]　Thomas M.Mundel et al. Microvascular Research(2007) vol.74；p.85-89

[非專利文獻5]　IV型膠原纖維測量套組「Panassay IV‧C(latex)」使用說明書；第一化學藥品(2006年改訂版)

[非專利文獻6]　Obata，K.et al.Clinical Chimica Acta181，p293-304，1989

[非專利文獻7]　Iwata，N.et al.Journal of Biochemistry(1995) vol.117(6)；p.1298-1304

本發明係以解決向來之前述諸問題，達成以下之目的為課題。即，本發明之目的係提供對腫瘤組織之選擇性為優異的單株抗體、以及含有該單株抗體的醫藥、及於腫瘤之治療、診斷為有用的腫瘤診斷藥、預防藥或治療藥。

本發明者們為了達成前述目的而致力進行研究的結果，發現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽於人類癌細胞株、帶有癌症的動物之癌組織及人類臨床腫瘤會高度表現，又與前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽特異性結合的單株抗體會抑制前述帶有癌症的動物之癌組織之增殖，遂而完成本發明。

本發明係本發明者們基於前述知識，就作為用以解決前述課題的手段而言，如以下之內容。即，

＜1＞　一種單株抗體，其特徵為其係由抗NK-抗原單株抗體(Anti NK-Antigen monoclonal antibody)＃141(寄存編號：FERM BP-11300(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439))之融合瘤株所產生，且特異性地與單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合。

＜2＞　如前述＜1＞記載之單株抗體，其包含至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜3＞　如前述＜1＞記載之單株抗體，其包含至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜4＞　如前述＜1＞至＜3＞項中任一項記載之單株抗體，其辨識含有GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位(epitope)。

＜5＞　一種單株抗體，其特徵為包含前述＜1＞記載之單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)。

＜6＞　一種單株抗體，其特徵為包含如前述＜2＞記載之單株抗體所具有的至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜7＞　一種單株抗體，其特徵為包含如前述＜3＞記載之單株抗體所具有的至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜8＞　一種單株抗體，其特徵為包含如前述＜4＞記載之單株抗體所辨識的含有GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位。

＜9＞　如前述＜5＞至＜8＞項中任一項記載之單株抗體，其係經人類型化而成。

＜10＞　一種單株抗體，其特徵為其係將前述＜1＞記載之單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)移植至人類抗體而成。

＜11＞一種單株抗體，其特徵為包含至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜12＞一種單株抗體，其特徵為包含至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，且包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。

＜13＞一種單株抗體，其特徵為其辨識包含GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位。

＜14＞如＜11＞至＜13＞項中任一項記載之單株抗體，其係經人類型化而成。

＜15＞一種融合瘤株，其特徵為其係抗NK-抗原單株抗體＃141(寄存編號：FERM BP-11300(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439))。

＜16＞一種醫藥，其特徵為包含前述＜1＞至＜14＞項中任一項記載之單株抗體。

＜17＞一種腫瘤之診斷藥、預防藥或治療藥，其特徵為包含前述＜1＞至＜14＞項中任一項記載之單株抗體。

＜18＞如前述＜17＞記載之腫瘤之診斷藥、預防藥或治療藥，其中腫瘤包含表現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的癌細胞的腫瘤。

＜19＞一種單株抗體之部分構造，其為前述＜1＞、＜2＞、＜4＞至＜6＞、＜8＞至＜11＞、＜13＞、及＜14＞項中任一項記載之單株抗體之部分構造，其特徵為：該單株抗體之部分構造包含前述單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)，前述CDR包含至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列者，且包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列。

＜20＞一種單株抗體之部分構造，其為前述＜1＞、＜3＞至＜5＞、＜7＞至＜10＞、及＜12＞至＜14＞項中任一項記載之單株抗體之部分構造，其特徵為：包含前述單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)，前述CDR含有至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列，且包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列。

依據本發明，可解決向來的前述諸問題，而達成前述目的，可提供對腫瘤組織之選擇性優異的單株抗體、以及包含該單株抗體的醫藥、及於腫瘤之治療、診斷為有用的腫瘤之診斷藥、預防藥或治療藥。

[用以實施發明之形態]

(單株抗體)

本發明之單株抗體(以下，有稱為「抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體」、「NK46141」等的情形)包含以下之第1~第3之形態。

作為前述第1形態之前述單株抗體係由抗NK-抗原單株抗體＃141(寄存編號：FERM BP-11300(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439))之融合瘤株所產生，為特異性地與單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合的抗體。前述抗NK-抗原單株抗體＃141係於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心以國際寄存的融合瘤株(寄存接受日為2010年10月5日)(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439，臺灣食品工業發展研究所之寄存日為2011年12月28日)。

作為前述第2形態之前述單株抗體係包含至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈的單株抗體；或包含至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈的單株抗體。

作為前述第3形態之前述單株抗體係辨識包含GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位的單株抗體。

又，前述第1~第3形態之單株抗體係任一者皆特異性地與單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合的抗體。又，前述第1~第3形態之單株抗體只要具有前述特徴即可，彼此可為相同者，亦可為不同者。

於本發明之「單股鏈IV型膠原纖維多胜肽」係指作為IV型膠原纖維基因產物之以單股狀態自細胞分泌的蛋白質。通常，「IV型膠原纖維」係指3股之IV型膠原纖維基因產物藉由分子間雙硫鍵被交聯，而具有3重螺旋構造的蛋白質，但「單股鏈IV型膠原纖維多胜肽」並不具有分子間雙硫鍵。

前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(分子量約180kDa)係具有與將IV型膠原纖維(分子量約500kDa)還原而獲得的單體或藉由其變性所產生的多胜肽不同的化學構造。前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽與前述IV型膠原纖維相比，氫氧化脯胺酸殘基或氫氧化離胺酸殘基之比率較低。又，與前述IV型膠原纖維不同，前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽具有洋菇凝集素(ABA)凝集素所辨識的Galβ1-3GalNAc糖鏈。又，單股鏈IV型膠原纖維多胜肽亦包含其基因多型體、基因變異體、拼接變異體(splicing variant)、轉譯後修飾變異體。

就產生前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的細胞而言，可為來自天然者，亦可為將編碼該單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的基因導入的基因重組體任一者，產生該單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的細胞並無任何限制。前述基因重組體可藉由習知手法而獲得。

於本發明之「特異性地與單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合的抗體」(抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體)係指不會辨識前述IV型膠原纖維，只要係特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的抗體即可，其來源、種類、形狀等並不會限制。不限於單株抗體，多株抗體亦包含於本發明之範疇。

前述多株抗體可以習知手法，自前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽敏感化的動物之血清免疫球蛋白(globulin)劃份獲得。又，此時，被敏感化的動物只要為可獲得多株抗體的動物的種類即可，並未受限。

＜第1形態＞

前述第1形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體除了由前述抗NK-抗原單株抗體＃141(寄存編號：FERM BP-11300(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439))之融合瘤株所產生的抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，發明之範圍內於亦包含例如，含有該抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之部分構造的嵌合抗體、人類型化抗體、人類抗體、小鼠抗體等。此等中，以人類型化抗體、人類抗體為特佳。

就前述部分構造而言，只要為會特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之一部份即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例包含與抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)結合之Fab、F(ab’)₂、可變區(V區域)、互補性決定區(CDR；complementarity determining region)、scFv(單股鏈抗體)等的部分構造等。

前述「嵌合抗體」係意指包含來自2個以上相異的抗體之區域抗體。一形態係前述嵌合抗體包含來自抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之V區域的區域。其他形態係前述嵌合抗體於嵌合抗體中含有複數個來自抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體的V區域。

前述「人類抗體」係指具有來自人類之免疫球蛋白序列的V區域的抗體。製作人類抗體的技術亦為習知，藉由基因工程的手法所製作的方法已被確立。

前述「人類型化抗體」係將人類以外的哺乳動物，例如，小鼠抗體之1個或複數個CDR移植至人類抗體之CDR者，其一般的基因重組手法亦為已知(參照歐洲申請公開公報EP125023號、國際公開第96/02576號小冊)。

具體而言，將小鼠抗體之CDR與人類抗體之框架區(framework region；FR)連結所設計的DNA序列，製作於CDR及FR兩者之末端區具有重疊的部分的數個寡核苷酸作為引子來使用，藉由PCR(聚合酶連鎖反應)法合成人類型化抗體的方法為已知(參照國際公開第98/13388號小冊記載之方法)。

介隔著前述CDR所連結的人類抗體之FR係以形成抗體對抗原之結合親和性高的抗原結合部位者被選擇。因應必要，可將於抗體之可變區中的FR之胺基酸作置換以形成抗體對抗原之結合親和性高的抗原結合部位。

前述CDR意指重鏈多胜肽及輕鏈多胜肽兩者之可變區內可見的非連續的抗原結合部位。此等之特定區域為本項技術領域內所習知，已被Kabat等人(J.Biol.Chem.252：6609~6616(1977))、Kabat等人(美國保健社會福祉省、「Sequences of proteins of immunological interest」(1991))、Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901~917(1987))、及MacCallum等人(J.Mol.Biol.262：732~745(1996))記載。

又，亦可獲自如IMGT/LIGM-DB資料庫[Giudicelli et al、2006、Nucleic Acids Research 34(Database Issue)：D781-D784及Lefranc et al、1995、LIGM-DB/IMGT：An Integrated Database of Ig and TcR、Part of the Immunogenetics Database. Annual of the New York Academy of Science 764(1)、47-47doi；10.1111/j.1749-6632.1995.tb55805.x記載(http：//www.imgt.org/IMGTlect/)]、IMGT Repertoire資料庫(http：//www.imgt.org/IMGTrepertoire/)、IMGT/GENE-DB資料庫[Giudicelli et al、2005、Nucleic Acids Res.2005 Jan 1；33(Database Issue)：D256-61記載(http：//www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect)]、Kabat資料庫(http：//www.kabatdatabase.com)的許多資料庫。經由與此等資料庫註冊的CDR序列情報加以比較，亦可鑑定於前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體所含的CDR。

就前述第1形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之CDR而言，包含至少一種選自序列識別號5~7及11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及包含至少一種選自序列識別號8~10及14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈為較佳；含有至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及含有至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈之組合；或含有至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及含有至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈之組合為更佳。

又，前述第1形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之前述CDR中的序列識別號5~16所表示的胺基酸序列之至少任一者也可為1個或數個胺基酸經刪除、置換、***、或添加的胺基酸序列。

又，前述第1形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體係以辨識含有GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位(epitope)的抗體為較佳。又，於前述抗原決定位，前述序列識別號41所表示的胺基酸序列可為1個或數個之胺基酸經刪除、置換、***、或添加的胺基酸序列。

又，前述第1形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，例如，該抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之部分構造亦包含於本發明之範圍內。

就前述部分構造而言，只要為特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之一部份即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例包含與抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)結合的Fab、F(ab’)₂、V區域、互補性決定區(CDR；complementarity determining region)、scFv(一股鏈抗體)等的部分構造等。

＜第2形態＞

前述第2形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體只要為含有至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及含有至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈的單株抗體；或含有至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈、及含有至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈的單株抗體即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇。

前述第2形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體係包含前述H鏈及前述L鏈之嵌合抗體、人類型化抗體、人類抗體、小鼠抗體等皆包含於本發明之範圍內。此等中，以人類型化抗體、人類抗體為特佳。

又，於前述第2形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體，前述序列識別號5~16所表示的胺基酸序列之至少任一者可為1個或數個之胺基酸經刪除、置換、***、或添加的胺基酸序列。

又，前述第2形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，例如，該抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之部分構造亦包含於本發明之範圍內。

就前述部分構造而言，只要為特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之一部份即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例與抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)結合之包含Fab、F(ab’)₂、V區域、CDR、scFv(單股鏈抗體)等的部分構造等。

＜第3形態＞

前述第3形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體只要為辨識含有GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇。

前述第3形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體，辨識前述序列識別號41所表示的胺基酸序列之嵌合抗體、人類型化抗體、人類抗體、小鼠抗體等皆包含於本發明之範圍內。此等中，人類型化抗體、人類抗體為特佳。

又，關於前述抗原決定位，前述序列識別號41所表示的胺基酸序列可為1個或數個之胺基酸經刪除、置換、***、或添加的胺基酸序列。

又，除了前述第3形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，例如，該抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之部分構造亦包含於本發明之範圍內。

就前述部分構造而言，只要為特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之一部份即可，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例與抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)結合之包含Fab、F(ab’)₂、V區域、CDR、scFv(單股鏈抗體)等部分構造等。

於本發明，「抗原決定位」係指抗體所結合的蛋白質(抗原)中之特定部位，此特定部位包含直鏈及非直鏈之抗原決定位兩者。

前述抗原決定位之鑑定方法可使用習知之分子生物學的手法或細胞工程學的手法或生化學的手法。

舉例而言為以下所示之抗原決定位之鑑定方法。

使用自產生前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的人類細胞株所調製的總RNA，將IV型膠原纖維α1基因(COL4A1、NCBI Gene ID：1282)之全長選殖，製作COL4A1表現載體(野生型)。其次，以經選殖的COL4A1之cDNA作為模板，與各式各樣的COL4A1之變異體之表現載體(變異型)合併而製作。將前述製作的野生型或變異型COL4A1表現載體導入適當培養細胞株(例如，人類細胞株)，使野生型或變異型單股鏈IV型膠原纖維多胜肽暫時性地過度表現。使用使野生型或變異型單股鏈IV型膠原纖維多胜肽暫時性地表現的培養細胞之上清液或細胞萃取液，藉由使用作為1次抗體之前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體實施西方氏墨漬(Western blotting)，可鑑定抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體所辨識的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之抗原決定位。

又，除上述方法以外，亦可化學合成IV型膠原纖維多胜肽之部分序列胜肽，使用點墨漬(dot blot)法或ELISA(酵素-連結免疫吸收性檢測)法等，而鑑定前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體所辨識的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之抗原決定位。

再者，經由組合上述2種類方法，亦可能鑑定前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體所辨識的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之抗原決定位。

＜＜抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之製作方法＞＞

就前述第1~第3形態之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之製作方法而言，並未特別限制，可由習知之手法中因應目的而適宜選擇，例如，可舉例免疫學的手法、噬菌體展示(phage display)法、核糖體展示(ribosome display)法等。此等中，以免疫學的手法為較佳。

舉例而言為如下所示經由免疫學的手法之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之製作。

就前述免疫學的手法所使用的抗原而言，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例化學合成的抗原、重組抗原、自活體試料純化的抗原等。此等可單獨使用1種，亦可併用2種以上。此等中，就前述抗原而言，使用由前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之全長之胺基酸序列而成的蛋白質為較佳。前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之調製之際，因抗原為低分子量，無法期待引起有效的免疫作用時，使用經結合載體(carrier)蛋白質的抗原者為較佳。

就前述載體蛋白質並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例KLM(鑰孔血藍蛋白(Keyhole Light Hemocyanin))、BSA(牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin))、OVA(卵白蛋白(Ovalbumin))等。此等可單獨使用1種，亦可併用2種以上。

就前述載體蛋白質之結合方法而言並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，例如，可舉例碳化二亞胺(carbodiimide)法、戊二醛(glutaraldehyde)法、重氮(diazo)縮合法、MBS(順丁烯二醯亞胺苯甲醯氧基琥珀醯亞胺(maleimide benzoyloxy succinimide))法等。

又，就前述抗原而言，單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(或其一部份)亦可使用作為與GST、β半乳糖苷酶(galactosidase)、麥芽糖結合蛋白質、His-Tag等之融合蛋白質使表現的抗原。如此融合蛋白質可藉由常用的方法而簡便地純化。

就以前述免疫學的手法調製前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之方法之具體例而言，可舉例使前述抗原於所冀望的動物中敏感化，因應必要重複免疫敏感化，於抗體力價充分上升的時點加以採血，藉由離心處理等而獲得血清的方法等。於抗體力價充分上升的時點自免疫動物取出抗體產生細胞。

其次，將獲得的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞株融合而獲得融合瘤。接著，將此融合瘤單株化後，對於前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽，選擇產生具有高特異性的抗體的選殖株。藉由純化經選擇的選殖株之培養液，獲得目的之抗體。

另一方面，亦可使前述融合瘤增殖為所欲數目以上後，將其移植至動物(例如，小鼠等)之腹腔內，使於腹水內增殖，經純化腹水而獲得目的之抗體。

前述培養液之純化或腹水之純化使用protein G、protein A等的親和性層析(affinity chromatography)為適合的。又，亦可使用將抗原固相化的親和性層析。再者，亦可使用離子交換層析、凝膠過濾層析、硫酸銨分級分離(ammonium sulfate fractionation)、及離心分離等之方法。此等之方法可單獨使用或任意地組合來使用。

就特異性地辨識前述單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的抗體而言，除了本發明之前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，可舉例JK132(參照非專利文獻1及非專利文獻7)等習知之抗體，但前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體，與前述習知之抗體加以比較，於對抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)的親和性高的點係有利的。

(融合瘤株)

本發明之融合瘤株被稱為抗NK-抗原單株抗體＃141株，寄存編號：FERM BP-11300(寄存接受日為2010年10月5日)，國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄存中心(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439，臺灣食品工業發展研究所之寄存日為2011年12月28日)。

前述融合瘤株可產生前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體。

(醫藥)

本發明之醫藥至少包含本發明之前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造，因應必要，進一步包含其他成分。於本發明，前述部分構造係含有單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之CDR或辨識抗原決定位的部分，即抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之抗原結合部位為較佳。

本發明之醫藥可適合使用作為後述之本發明之腫瘤之診斷藥、預防藥或治療藥(例如，抗癌劑等)。

前述醫藥亦包含含有抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造的醫藥組成物。前述醫藥組成物中除了抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之外，亦包含醫藥上所使用的載體。

前述醫藥上所使用的載體只要為生理上可容許之適合投與人類或人類以外之哺乳類的溶劑、分散媒、被覆劑、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑等即可，並未特別限定。

就前述醫藥上所使用的載體之具體例而言，可舉例為水、生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等之1種以上、之以及此等之組合等。於許多情形，組成物內含有等張性的物質，例如，糖類、甘露糖醇、山梨糖醇等之多元醇、或氯化鈉為較佳。醫藥上所使用的載體可進一步含有濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑等之微量輔助物質，此等於提高抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體或該抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之部分構造的保存性或有效性為有利的。

＜劑型＞

前述醫藥劑型並未特別限定。例如，為液體、半固體及固形之劑型，具體而言，可舉例溶液(例如，可注射的溶液及不溶性的溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸藥、粉劑、脂質體(liposome)、栓藥等。

前述劑型係因應投與路徑或適應症而適宜選擇，較佳為可注射的劑型。就可注射的劑型之較佳組成而言，可舉例可注射的溶液或不溶性之溶液的劑型，可舉例肌肉內注射，較佳為適合皮下注射者。

前述醫藥只要於製造及保存之條件下為無菌且安定即可，不限於溶液、微乳劑、分散液、脂質體、或適合其他投與的態樣之任一者。抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造因應必要可與上述列舉的成分之1種或其組合一起，併入必要量的適當溶劑內，接著藉由過濾滅菌，而調製可注射的無菌溶液。

於包含基本的分散媒、上述所列舉之必要的其他成分的無菌媒體內，藉由併入抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造，而調製分散液係為一般的技術。為了調製可注射的無菌溶液之無菌粉劑的情形，較佳調製方法係作真空乾燥及冷凍乾燥，獲得自含有有效成分的已過濾滅菌的溶液之任意所欲追加成分之粉劑。例如，藉由使用卵磷脂等之被覆劑，於分散液的情形，經由維持必要粒子徑，並使用界面活性劑，可維持溶液之適當的流動性。藉由於組成物內包含單硬脂酸鹽及明膠等之使吸收延遲的藥劑，可達成可注射的組成物之持續的吸收。

＜投與＞

前述醫藥之投與路徑以靜脈內、皮下、腹腔內、肌肉內等之非經口為較佳。較佳為皮下，但除了注射之外，包含植入物(implant)、經皮貼布、及微膠囊送達系統的控制釋放製劑(參照Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編，Marcel Dekker Inc.公司，NY，1978)等，亦可使用急遽釋放前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造後加以保護的載體來調製活性化合物。可使用伸乙基乙酸乙烯酯、聚乙二醇(PEG)、聚無水物、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原纖維、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乳酸等之生物分解性、生物適合性聚合物。

又，前述醫藥亦可經口投與。於此場合，以防止前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造不活性化的材料將化合物加以被覆、或將前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造與防止不活性化的材料同時投與者為較佳。

例如，亦可將前述醫藥封入硬質或軟質明膠膠囊內及/或壓縮作成錠劑。又，亦可與不活性稀釋劑或可吸收的食用載體一起經口投與。進一步亦可直接併入被驗體的食物中。關於用於治療的經口投與，亦可將前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造與賦形劑一起併入，且以攝取用之錠劑、舌下錠、含錠(troche)、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、扁囊劑(cachets)等之劑型來使用。

前述醫藥所含前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造之含量並未特別限制，因應治療或預防目的可適宜調整。

又，實際之投與量可因應個體的病狀、年齡、性別及體重等加以適宜調整。又，於本發明之預防用的投與係指術後防止再發生、或於疾病之初期階段抑制惡化用之投與。

就每1次投與的投與量而言，並未特別限制，可因應目的而適宜選擇，但通常為0.1mg/kg~250mg/kg，0.5mg/kg~50mg/kg為更佳，約5mg/kg為特佳。前述投與量可因應治療症狀而調整投與度。又，考量患者的症狀、全身狀態等，亦可適用未落入此範圍的投與量。

前述醫藥的投與時程可為單次或連續投與任一者。又，亦可設計一定期間之投與後經過休藥期間，再進行投與。

前述醫藥亦可與其他1種以上之醫藥併用，併用的醫藥係考慮症狀或副作用而適宜選擇。於本發明之併用係與其他醫藥同時或前後投與之外，亦包含與其他醫藥同時一起製劑化。

可與前述醫藥組合的醫藥可因應症狀而適宜選擇。例如，可舉例具有抗腫瘤活性的醫藥品之順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)等之白金製劑；環磷醯胺(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)等之烷基化劑；吉西他賓(gemcitabine)、TS-1、5-氟尿嘧啶(5-flurpuracil)、甲胺喋呤(methotrexate)等之代謝拮抗劑；博來黴素(bleomycin)、道諾霉素(daunomycin)、阿黴素(adriamycin)等之抗腫瘤性抗生素；愛萊諾迪肯(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、依托泊(etoposide)、長春新鹼(vincristine)等之生物鹼類(alkaloid)；賀爾蒙類等之抗癌劑；埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、索拉菲尼(sorafenib)等之分子標的藥；曲妥珠單抗(trastuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)等之抗體醫藥等。

將前述醫藥作為預防用醫藥或醫藥組成物使用的情形之劑型、投與路徑、投與量、投與時程，係與用於治療的情形相同。

本發明之前述醫藥亦包含治療用套組。前述治療用套組包含與本發明之前述醫藥或醫藥組成物併用的其他之1種以上的醫藥。

就本發明之診斷、預防、或治療之對象而言，並未特別限制，可適用於肺癌、胃癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、胰臓癌、膽囊癌、卵巢癌等全部之固體性癌、及造血器官腫瘤，可對確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽表現的患者進行診斷、預防、或治療。實施本發明之診斷、預防、或治療之際，亦可使用本發明之前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體及/或其部分構造之本發明之前述醫藥、或本發明之前述醫藥組成物之任一者。又，將本發明之前述醫藥或前述醫藥組成物作為預防用醫藥或醫藥組成物來使用的情形，作為用於固體性癌外科手術時之轉移預防及再發預防的轉移預防劑為有效的。

(腫瘤之診斷藥、預防藥或抗癌劑)

本發明之腫瘤之診斷藥、預防藥或抗癌劑至少含有前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體。前述腫瘤之診斷藥有以診斷用套組之形態被提供的情形，前述套組亦包含於本發明。

前述腫瘤之診斷用套組至少包含前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體，因應必要，除此之外，亦可包含將標識物質、或抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體或其標識物加以固定的固相化試藥等。

前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之標識物係意指被酵素、放射性同位素、螢光化合物、或化學發光化合物標識者。前述套組除了前述之構成要素之外，亦可包含用以實施檢測的其他試藥，例如，標識物為酵素標識物的情形，可包含酵素基質(發色性基質等)、酵素基質溶解液、酵素反應停止液、或檢體用稀釋液等。

使用前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體的腫瘤檢測，可藉由下列方式進行：將自被驗者採取的活體試料作為檢體，例如，血液等，與前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體或其構造，藉由抗原抗體反應而結合，基於經結合的抗體量，而測量試料中的目的抗原(單股鏈IV型膠原纖維多胜肽)的量。

前述抗原量之檢測可依據習知免疫學的測量法來進行，例如，可使用免疫沉降法、免疫凝集法、標識免疫測量法、免疫濁度測定法(immuno-nephelometry)、西方氏墨漬法、流式細胞測量法(flow cytometry)法等。

前述標識免疫測量法係將前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體之訊號，使用標識抗體而以直接檢測的標識量表示外，亦可將已知濃度或已知抗體價的抗體作為標準液而以相對量表示。即，經由測量計來測量標準液及檢體，將標準液的值作為基準，可相對地表示試料中之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體訊號。就前述標識免疫測量法而言，例如可舉例ELISA法、EIA法、RIA法、螢光免疫測量法(FIA)、化學發光免疫測量法(luminescence immunoassay)等。此等中，以ELISA法為簡便且高敏感度的觀點為較佳。

基於使用前述抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體的腫瘤檢測，經前述檢測方法所獲得的檢測結果作為指標可評價或診斷腫瘤狀態。例如，檢測結果超出規定基準值者為腫瘤陽性，規定基準值以下者為腫瘤陰性，陽性的情形，判斷有發生任一腫瘤的可能性，而可評價腫瘤的狀態。

前述腫瘤之狀態係意指腫瘤罹患的有無或其進行度，例如，可舉例腫瘤發病之有無、進行度、惡性度、轉移之有無及再發病之有無等。前述評價之際，可選擇1個此等腫瘤狀態1，亦可組合複數個來選擇。

評價前述腫瘤之有無係基於前述檢測結果，將規定基準值作為是否罹患腫瘤的邊界加以判斷。腫瘤之惡性度係將癌症進行到何種程度作為指標，基於前述檢測結果，將病期(Stage)分類而評價，或亦可分類為早期癌、進行癌而評價。例如，將上述檢査結果作為指標亦可能評價為早期癌或進行癌。前述腫瘤之轉移係將前述檢測結果作為指標，由是否離原發病位置的部位出現新生物加以評價。前述腫瘤之再發係於間隔期或緩和後，檢測結果是否再次超出規定基準值來評價。

[實施例]

以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但此僅為一例，本發明並未限於此等例。又，實施例提及的市售試藥只要未特別表示，依據製造者之使用說明來使用。

(實施例1)

使用添加10體積%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals公司製)的RPMI1640培養基(Mediatech公司製)，將人類肝癌細胞株HLF(獲自RIKEN CELL BANK)及人類腎臓癌細胞株UO31(National Cancer Institute製)，各別於37℃、5%CO₂的條件下培養。細胞成為融合的時點，與無血清RPMI1640培養基交換後培養48小時，之後回收培養上清液。於此培養上清液中添加1/4量(體積比)之4×電泳樣品用緩衝液[8(質量/體積)%月桂基硫酸鈉(SDS)、40(體積)%甘油、20(體積)%2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、0.008(質量/體積)%溴酚藍(bromphenol blue)、0.25M Tris-HCl、pH6.8，(以下之實施例，電泳樣品用緩衝液使用相同組成者)]，於90℃加熱5分鐘而製作樣品[還原處理(+)]。又，除了於前述4×電泳樣品用緩衝液中未含有2-巰基乙醇之外，亦製作進行同樣的操作的樣品[還原處理(-)]。

對此等樣品，使用XV PANTERA MP System(DRC公司製)，進行4.5(質量/體積)%SDS聚丙烯醯胺膠體電泳及聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride(PVDF))膜的轉印。準備2片PVDF膜，以5(質量/體積)%脫脂牛奶加以阻斷後，JK132(抗人類IV型膠原纖維α1多胜肽小鼠單株抗體，獲自工學院大學工學部應用化學科細胞工學研究室，今村保忠氏，以下使用相同物)或Ab6586(抗IV型膠原纖維兔多株抗體，Abcam公司製，以下使用相同物)之各抗體溶液，於室溫下培育1小時。藉由TBS-Tween 20(20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、0.1(體積)%Tween 20)進行3次10分鐘之洗淨後，以抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare公司製)作為HRP標識的2次抗體之抗體溶液，於室溫培育1小時。以TBS-Tween 20進行10分鐘之洗淨3次後，以ECL plus(GE Healthcare公司製)使化學發光反應，以X射線於底片感光。

結果示於第1圖。Ab6586及JK132之各抗體檢測出1條或移動度不同的2條而成的大約同樣的帶圖案。由非還原處理樣品[還原處理(-)]，檢測出(1)移動度小、保有分子間雙硫鍵之直接SDS化的IV型膠原纖維(於第1圖，以「3股鏈COL4」呈示)、(2)約180kDa之移動度大、且於最初不具有分子間雙硫鍵的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(於第1圖，以「單股鏈COL4」呈示)被檢測出。自還原處理樣品[還原處理(+)]，僅前述(2)與不具有分子間雙硫鍵的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽相同移動度之帶被檢測出。還原處理樣品[還原處理(+)]之帶，包含保有前述(1)分子間雙硫鍵之直接SDS化的IV型膠原纖維之分子間雙硫鍵被切斷所產生的單股、及前述(2)不具有分子間雙硫鍵之單股鏈IV型膠原纖維多胜肽兩者。因此可知，此等癌細胞株會表現不具有分子間雙硫鍵的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。

(實施例2)

將裸大鼠(F344/N-rnu/rnu、7週齡、日本CLEA公司製)皮下繼代的人類肺癌Lu65A(獲自JCRB：Japanese Collection of Research Bioresources)腫瘤塊取約3mm³之塊，使用套管針移植於裸大鼠的背側部皮下，腫瘤體積成為約200mm³以上的時點，採取癌組織。將組織萃取緩衝液(pH7.4、0.1M NaCl/PBS、5mM EDTA、蛋白酶抑制雞尾酒(Roche公司製)、1mM PMSF)以濕重量的4倍量添加並均質化。之後，以12,000回轉離心5分鐘，回收離心上清液。於此上清液中添加1/4量(體積比)之4×電泳樣品用緩衝液，於90℃加熱5分鐘製作樣品[還原處理(+)]。又，除了於前述4×電泳樣品用緩衝液中不含有2-巰基乙醇之外，亦製作進行相同操作的樣品[還原處理(-)]。

對此等樣品，使用XV PANTERA MP System(DRC公司製)，進行對4.5(質量/體積)%SDS聚丙烯醯胺膠體電泳及PVDF膜之轉印。準備2片此PVDF膜，以5(質量/體積)%脫脂牛奶阻斷後，以JK132或Ab6586之各抗體溶液，各自於室溫培育1小時。藉由TBS-Tween 20進行3次10分鐘的洗淨後，各自於室溫培育抗小鼠IgG抗體、抗兔IgG抗體(GE Healthcare公司製)作為經HRP標識的2次抗體1小時。進行以TBS-Tween 20之10分鐘洗淨3次後，以ECL使化學發光反應，以X射線於底片使感光。

結果示於第2圖。JK132及Ab6586之各抗體自非還原處理樣品[還原處理(-)]，檢測出不具有分子間雙硫鍵的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽(於第2圖，呈示「單股鏈COL4」)之帶。因此可知人類肺癌Lu65A之腫瘤組織，表現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。又，JK132抗體與人類之單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽反應，但因為不與小鼠之單股鏈IV型膠原纖維多胜肽反應，故可知人類肺癌Lu65A之腫瘤組織(裸大鼠皮下移植人類腫瘤組織)係表現來自Lu65A細胞之人類單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。

(實施例3)

除了將於實施例1之人類肝癌細胞株HLF及人類腎臓癌細胞株UO31變換為人類癌細胞株[Lu65A(獲自JCRB：Japanese Collection of Research Bioresources)、NCI-H460(National Cancer Institute製)、NCI-H226(National Cancer Institute製)、MDA-MB-157(獲自ATCC:American Type Culture Collection)、A498(獲自ATCC)、Panc-1(獲自東北大學老年醫學研究所附屬醫用細胞資源中心)、OVCAR3(獲自東北大學老年醫學研究所附屬醫用細胞資源中心)、或HT1080(大日本製藥股份有限公司製)]之外，以與實施例1相同之方法，於各人類癌細胞株確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現。

又，除了將實施例2之人類肺癌Lu65A變換為HLF(獲自RIKEN CELL BANK)之外，以與實施例2相同之方法，確認裸大鼠皮下移植人類腫瘤組織中單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現。

再者，人類臨床肺癌組織(Asterand公司製，樣品ID:110443A1、112523A1、107811A1、111540B1、112294A1及111541A1)、或獲自肺癌患者的人類臨床正常肺組織(Asterand公司製，樣品ID：98859B2、112279B1及112301B1)添加濕重量4倍量之組織萃取緩衝液(pH7.4、0.1M NaCl/PBS、5mM EDTA、蛋白酶抑制雞尾酒(Roche公司製)、1mM PMSF)加以均質化。之後，以12,000回轉離心5分鐘，回收離心上清液。於此上清液中添加1/4量(體積比)前述4×電泳樣品用緩衝液中不含有2-巰基乙醇的前述4×電泳樣品用緩衝液，並於90℃加熱5分鐘製作樣品[還原處理(-)]。

於人類臨床肺癌組織及獲自肺癌患者的人類臨床正常肺組織中單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現，為了調查作為內部標準之β-肌動蛋白(actin)量，係使用抗β-肌動蛋白抗體(SIGMA公司製)。

又，於前述人類臨床組織，癌組織及正常肺組織係由專門人員作病理學上的判別。

合併實施例1及2之結果，以與實施例1相同方法確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的表現的人類癌細胞株(活體外)及與實施例2相同方法確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的表現的裸大鼠皮下移植人類腫瘤組織(活體內)之結果示於表1。又，人類臨床肺癌組織及人類臨床正常肺組織之結果示於第3圖。

如表1所示，於10種人類癌細胞株及2種裸大鼠皮下移植人類腫瘤組織中確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的表現。又，如第3圖所示，6例之全部的人類臨床肺癌組織中確認單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之高表現。另一方面，獲自肺癌患者的人類臨床正常肺組織中的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現僅為些微。

由以上結果可知，於表1記載之人類癌細胞株及裸大鼠皮下移植人類腫瘤組織會表現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。又，由第3圖之結果可知，單股鏈IV型膠原纖維多胜肽於腫瘤組織中會特異性地高發現。

(實施例4)

＜單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽之調製＞

-細胞及細胞培養-

使用添加10體積%胎牛血清(Tissue Culture BioIogicals公司製)的RPMI1640培養基(Mediatech公司製)，於37℃、5%CO₂之條件下培養、維持人類肝癌細胞株HLF(RIKEN CELL BANK)。

-單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽之調製-

參考Takahashi，S等人的方法(Takahashi，S.et al.“Connective Tissue”(1999)vol.31；p.161-168)，自無血清RPMI1640培養基(Mediatech公司製)中培養7日的人類肝癌HLF細胞之培養基，以免疫親和性純化單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽。

簡潔地記載，首先，於HiTrap NHS-活化HP管柱(GE Healthcare公司製)將4.2mg之JK132抗體固定化，製作JK132親和性管柱。JK132親和性管柱以0.2M甘油-HCl、pH2.5洗淨。

培養上清液450ml通過1ml之JK132親和性管柱，以磷酸緩衝生理食鹽水洗淨後，以0.2M甘油-HCl、pH2.5收集的劃份藉由SDS-PAGE及西方氏墨漬法加以分析。將獲得的溶出餾份透析，冷凍乾燥物保存於-80℃。純化的單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽以4.5(質量/體積)%聚丙烯醯胺膠體電電泳後，銀染色(第一化學藥品股份有限公司製)的結果示於第4圖。分子量標記(MW)使用BioRad公司之Precision Plus Protein Standard Dual Color。

(實施例5)

＜單株抗體(NK46141)之篩選＞

-免疫-

使用實施例4調製的單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(抗原)，雌Balb/c小鼠(日本SLC股份有限公司)經腹腔注射免疫。次免疫係於每一隻投與費氏(Freund)完全佐劑(DIFCO公司製)中之100μg或20μg的單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽，之後，投與RIBI佐劑(Corixa公司製)中之20μg~50μg的單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽。免疫係各自以2週~3週的間隔來進行。最後於免疫7日後，經由以含有25μg之單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽的食鹽加磷酸緩衝液(PBS)追加免疫而提高動物的抗體力價。

-融合瘤之製作-

追加免疫3日後，自免疫的高抗體力價動物藉由通常方法調製脾臓細胞，將該脾臓細胞及P3.X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞(獲自ATCC，＃CRL-1580)，使用聚乙二醇4000(SIGMA公司製)加以融合。使用習知的Kohler及Milstein技術，將融合瘤細胞懸浮於HAT培養基[FBS(Hyclone公司製)10質量%、D(+)-葡萄糖(和光純藥工業股份有限公司製)500μM、盤尼西林-鏈黴素(penicillin-streptomycin)(Invitrogen公司製)2質量%、次黃嘌呤(hypoxanthine)鈉(Invitrogen公司製)100μM、胺基喋呤(aminopterin)(Invitrogen公司製)0.1μM、及胸腺嘧啶(thymidine)(Invitrogen公司製)16μM RPMI1640(Invitrogen公司製)來製作；以下之實施例亦使用同樣組成者]中以微定量盤(NUNC公司製)選擇。

-抗體價之測量-

將前述經免疫的動物之抗體力價，藉由使用下述所示ELISA法的血清中之抗體力價的測量來選擇。首先，微定量盤(NUNC公司製)以單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(抗原)塗覆。其次，以1(質量/體積)%BSA/TBS(20mM Tris-HCl、150mM‧NaCl、pH7.5)-0.05(體積)% Tween 20阻斷的孔中添加連續稀釋的血清並培育。與單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(抗原)結合的抗體以對小鼠免疫球蛋白的過氧化酶結合抗體檢測。

-藉由融合瘤之ELISA法的篩選-

將單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(抗原)(50mM碳酸緩衝液中1μg/ml濃度)於室溫固定於96孔微定量盤(NUNC公司製)2小時。其次，此盤以TBS/0.05體積%Tween 20洗淨，平盤表面游離的吸著部分使用1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20阻斷(室溫下30分鐘)，再以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨。將融合瘤培養上清液加入各別孔，於室溫使反應1小時。之後，平盤以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，其次，以50μL/孔添加1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20中稀釋的過氧化酶結合小鼠抗IgG抗體(BETHYL Laboratories、＃E90-131)。於室溫培育1小時後，平盤以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，以100μL/孔添加基質溶液(檸檬酸緩衝液(pH5)、0.05(質量/體積)%o-伸苯基二胺、0.03體積% H₂O₂)。20分鐘~30分鐘後，以2N硫酸停止反應，並以分光光度計測量490nm之吸光度。

如此獲得的融合瘤株作為抗NK-抗原單株抗體＃141(以下，稱為「＃141株」)，國際寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(寄存日2010年10月5日)(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960439，臺灣食品工業發展研究所之寄存日為2011年12月28日)。

-單株抗體之純化-

前述抗體產生融合瘤＃141株使用HAT培養基，調製於37℃、5%CO₂條件下培養的培養上清液。又，將前述抗體產生融合瘤＃141株投與腹腔內，7日~10日後採取的小鼠腹水以過濾器過濾除去不溶物。

前述抗體產生融合瘤培養上清液、或前述小鼠腹水依據通常方法，通過填充Protein G-sepharose 4B(GE Helthecare)的管柱使抗體成分吸附後，除去非特異吸著分後置於酸性條件，回收游離的單株抗體並作成純化抗體。獲得的純化抗體於100倍量(體積比)之PBS緩衝液透析加以置換。本發明者們將此單株抗體命名為「NK46141」。

-單株抗體NK46141同型物(isotype)之測量-

使用三明治ELISA法，測量NK46141之同型物。抗小鼠IgG山羊多株抗體(DAKO公司製)50μl(固相抗體，以50mM碳酸緩衝液1,000倍稀釋)分注於96孔微定量盤(NUNC公司製)6孔中，於室溫固定2小時。其次，孔以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，孔表面游離的吸著部分使用1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20加以阻斷(於室溫30分鐘)，再次以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨。

於各孔中，添加50μl之NK46141產生融合瘤的培養上清液，於室溫使反應1小時。之後，孔以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，以1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20作1,000倍稀釋的6種類之檢測用抗體(HRP標識抗小鼠IgG1山羊抗體、HRP標識抗小鼠IgG2a山羊抗體、HRP標識抗小鼠IgG2b山羊抗體、HRP標識抗小鼠IgG3山羊抗體、HRP標識抗小鼠IgA山羊抗體、HRP標識抗小鼠IgGM山羊抗體；全部為BETHYL公司製)於孔中各添加50μL之1種類。於室溫培育1小時後，以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，於各孔中添加100μl基質溶液(檸檬酸緩衝液(pH5.0)、0.05(質量/體積)% o-伸苯基二胺、0.03體積%H₂O₂)。20分鐘~30分鐘後，以2N硫酸停止反應，以分光光度計測量490nm之吸光度。

其結果可知NK46141之同型物為IgG2b。

-免疫沉降分析-

免疫沉降分析係將0.5μg之純化單株抗體(NK46141)、以與實施例1相同方法培養的500μl之表現單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽的人類肝癌胞株HLF之培養上清液，於4℃下一邊旋轉一邊培育30分鐘。就陽性對照而言，除了使用JK132替代NK46141之外，進行前述同樣的操作。就同型物對照組而言，除了使用小鼠IgG2b(同型物對照組(Isotype Control))(Functional Grade，MBL公司製，M077-3M2)替代NK46141之外，進行前述同樣的操作。又，就陰性對照組而言，除了使用不含有免疫沉降用之1次抗體之僅有PBS者以外，進行前述同樣的操作。

其次，添加10μl之鏈黴親和素磁珠(Dynabeads)M-280羊抗-小鼠IgG二次抗體(鏈黴親和素磁珠結合山羊抗小鼠IgG，Veritastk公司製、# DB11201)，於4℃一邊旋轉一邊培育1小時。又，作為陰性對照組，於人類肝癌胞株HLF之培養上清液中添加鏈黴親和素磁珠M-280綿羊抗-小鼠IgG二次抗體，同樣地培育。

於磁鐵上靜置2分鐘，去除上清液，以500μl之洗滌緩衝液(PBS中含0.05(體積)% Tween 20、2mM EDTA)將鏈黴親和素磁珠洗淨3次。於鏈黴親和素磁珠添加50μl之不含有2-巰基乙醇的1×電泳樣品用緩衝液，於90℃加熱5分鐘，調製樣品。對此樣品，進行SDS聚丙烯醯胺膠體電泳及PVDF膜對的轉印。並將PVDF膜以Ab6586培育，與實施例1同樣地進行分析。

結果示於第5圖。於第5圖，「Sup.」為免疫沉降前之人類肝癌胞株HLF的培養上清液，藉由Ab6586，檢測出複數個帶。此樣品以NK46141或JK132作免疫沉降時，顯示僅單股鏈IV型膠原纖維多胜肽被選擇性地回收。於免疫沉降法顯示，NK46141並未辨識IV型膠原纖維，而特異性地辨識單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。

由以上所述，獲得特異性辨識單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽的單株抗體NK46141。

(實施例6)

＜單株抗體NK46141之結合親和性＞

參考Djavadi-Ohaniance L.等人之方法[Djavadi-Ohaniance L.等人(1996)In Antibody Engineering(Eds.：McCafferty J.等人)，Chapter 4、pp.77-97.IRL Press、Oxford.]，使用ELISA法，求得純化單株抗體NK46141之解離常數。

簡潔地記載時，準備預先將單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(抗原)固相化的免疫盤(Nunc公司製)。另一方面，將一定濃度(0.10μg/ml)之JK132及NK46141以充分時間培育至達到與各種濃度之抗原的平衡。將此培育液添加至ELISA孔，求得游離(Free)抗體的量。抗原抗體反應係藉由質量作用法則，套入下述式1之實測值，求得下述式2之X及Y而描繪圖表，而自其斜率(1/Kd)求得解離常數。

(式1)

x/[全抗體濃度]×1/[Free抗原]=(1-x/[全抗體濃度])×1/Kd

其中，

X=x/[全抗體濃度]、Y=x/([全抗體濃度]×[Free抗原](式2)

Y=(1-X)×1/Kd

其結果示於表2。

JK132及NK46141之解離常數各別為15.3×10^-8M及3.4×10^-8M，顯示NK46141與JK132相比，對單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽的親和性高。

(實施例7)

＜單株抗體NK46141所辨識的抗原決定位部位之解析＞

使用三明治ELISA法，評價對抗原(單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽)的反應性。將實施例5所純化的單株抗體NK46141(固相抗體、50mM碳酸緩衝液中5μg/ml濃度)於96孔微定量盤(NUNC公司製)中，室溫下固定2小時。其次，將平盤以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，平盤表面游離之吸著部分使用1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20阻斷(於室溫30分鐘)，再以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨。於孔中添加作為抗原之單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽(1(質量/體積)% BSA/TBS-0.05(體積)% Tween 20中1μg/ml)，於室溫使反應1小時。之後，將平盤以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，其次，使用過氧化酶標識的套組-SH(WAKO公司製)，以50μL/孔添加單選殖株抗體作為檢測用HRP標識抗體。於室溫培育1小時後，平盤以TBS/0.05(體積)% Tween 20洗淨，於孔中添加100μL/孔之基質溶液(檸檬酸緩衝液(pH5)、0.05(質量/體積)% o-伸苯基二胺、0.03體積%H₂O₂)。20分鐘~30分鐘後，以2N硫酸停止反應，以分光光度計測量490nm之吸光度。其結果示於表3。

本試驗之結果，於固相抗體使用JK132，且於HRP標識抗體使用JK132或單株抗體NK46141時之吸光度各別為0.273及3.354。又，於固相抗體使用NK46141，且於HRP標識抗體使用JK132或NK46141時之吸光度各別為3.284及0.209，故可知NK46141及JK132對單股鏈IV型膠原纖維α1胜肽的結合並未競合。因此，顯示NK46141所辨識的抗原決定位與JK132所辨識的抗原決定位係存於相異的部位，可知NK46141與JK132所辨識的抗原決定位不同。

由此等分析得知，單株抗體NK46141與JK132之結合親和性及辨識的抗原決定位部位為不同的結果，顯示NK46141係具有與JK132相異活性的抗體。

(實施例8)

＜對裸小鼠移植人類肺癌細胞株的抗腫瘤效果＞

將人類肺癌細胞株Lu65A(獲自JCRB)使用添加10體積%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals公司製)的RPMI1640培養基(Mediatech公司製)，於37℃、5%CO₂之條件下培養、維持。使用注射筒，將2×10⁶個/0.2ml的Lu65A細胞懸浮液移植於裸小鼠(Balb/cAJcl-nu/nu、9週齡、日本CLEA公司製)之背側部皮下。

單株抗體NK46141於腫瘤移植前日、移植後第3日、第7日、第10日、及第14日共計5次投與至尾靜脈。NK46141以生理食鹽水(大塚製藥股份有限公司製)稀釋使用。對照組使用生理食鹽水。

測量Lu65A移植後第7日、第10日、第14日、第17日、及第21日之腫瘤體積。又，腫瘤體積係由計量腫瘤的長徑(Lmm)及短徑(Wmm)，由(L×W²)/2算出。

結果示於第6圖。於人類肺癌細胞Lu65A皮下移植小鼠模式，NK46141(30mg/kg)投與組與未投與NK46141的對照組相比，因腫瘤體積有意義(p值＜0.05、t檢定)地變小，故可知NK46141會抑制腫瘤組織的增殖。

(實施例9)

＜NK46141之CDR序列的決定＞

自融合瘤＃141株，使用RNeasy(QIAGEN公司製)獲得總RNA。自獲得的總RNA，藉由5’-RACE PCR法，進行增幅NK46141的H鏈及L鏈的可變區的cDNA選殖。經由DNA定序及N末端胺基酸序列分析，決定NK46141的H鏈或L鏈的可變區的基因序列(序列識別號1及2)及胺基酸序列(序列識別號3及4)。

NK46141的CDR係將NK46141的胺基酸序列與已知抗體的CDR胺基酸序列作比較而決定。即，使用IMGT Repertoire資料庫(http：//www.imgt.org/IMGTrepertoire/)、IMGT資料庫(IMGT/LIGM-DB資料庫(http：//www.imgt.org/IMGTlect/)及Kabat資料庫(http：//www.kabatdatabase.com)，檢索與NK46141相同性高的已知抗體基因，由此抗體基因的CDR胺基酸序列情報，決定NK46141的CDR。

藉由前述2種類的IMGT資料庫的解析結果，決定H鏈的CDR1為GFTFTDYY(序列識別號5)、CDR2為ISEGGSYT(序列識別號6)及CDR3為ASPYYGDGGFAY(序列識別號7)，L鏈的CDR1決定為QSIVHSDGNTY(序列識別號8)、CDR2為KVS(序列識別號9)及CDR3為FQGSHVPPT(序列識別號10)。

經由Kabat資料庫的解析，H鏈的CDR1決定為DYYMY(序列識別號11)、CDR2為TISEGGSYTYYPDSVKG(序列識別號12)及CDR3為PYYGDGGFAY(序列識別號13)，L鏈的CDR1決定為RSSQSIVHSDGNTYLE(序列識別號14)、CDR2為KVSNRFS(序列識別號15)及CDR3為FQGSHVPPT(序列識別號16)。

(實施例10)

＜NK46141所認識的抗原決定位序列的鑑定＞

為了實施NK46141所辨識的抗原決定位部位的驗證，以下列所示方法，製作各式各樣的變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽。

-野生型IV型膠原纖維α1基因之選殖-

由生產單股鏈IV型膠原纖維胜肽的人類肝癌細胞HLF細胞株，使用RNeasy(QIAGEN公司製)獲得總RNA。自獲得的總RNA，使用反轉錄酶(SuperscriptIII，Invitrogen公司製)，調製來自HLF細胞的cDNA。將來自HLF細胞的cDNA作為模板，使用序列識別號17及18所表示的引子序列，藉由PCR增幅野生型IV型膠原纖維α1基因(COL4A1、NCBI Gene ID：1282)，進行選殖。經選殖的野生型COL4A1，經由DNA定序，確認並無變異。

-野生型COL4A1表現載體之製作-

將前述野生型COL4A1次選殖至pENTR1A(Invitrogen公司製)，使用LR clonase(Invitrogen公司製)，製作野生型COL4A1表現載體。

-變異型COL4A1表現載體1之製作-

為了獲得使單股鏈IV型膠原纖維α1多胜肽的第29個殘基~第488個殘基的胺基酸欠缺的變異型COL4A1重組蛋白質，以下列方法製作變異型COL4A1表現載體1。

為了用以使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽的第29個殘基~第488個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺，將前述野生型COL4A1表現載體作為模板，使用序列識別號19及20所表示的引子序列，藉由PCR，使cDNA增幅。其次，於前述野生型COL4A1表現載體之製作，除了將野生型COL4A1變換為前述PCR產物之外，以與前述野生型COL4A1表現載體之製作相同的方法製作變異型COL4A1表現載體1。

-變異型COL4A1表現載體2之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作中的序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號21及22所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體2。

前述變異型COL4A1表現載體2係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽的第29個殘基~第989個殘基的胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

-變異型COL4A1表現載體3之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作中的序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號23及24所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同的方法製作變異型COL4A1表現載體3。

前述變異型COL4A1表現載體3係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第29個殘基~第1,066個殘基的胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

所製作的野生型COL4A1表現載體及變異型COL4A1表現載體1~3，因存有來自COL4A1的訊號序列，於哺乳類細胞中暫時性地被過度表現的野生型或變異型之單股鏈IV型膠原纖維胜肽會被分泌於培養上清液。

因此，將製作的野生型COL4A1表現載體及變異型COL4A1表現載體1~3，各自導入來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞(Invitrogen公司製)，使暫時性地表現野生型或變異型的單股鏈IV型膠原纖維胜肽。以下，將使用野生型COL4A1表現載體使表現的具有單股鏈IV型膠原纖維胜肽的胺基酸序列全長的野生型重組蛋白質稱為「FL」，將使用變異型COL4A1表現載體1而使表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ29~488」，將使用變異型COL4A1表現載體2而使表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ29~989」，將使用變異型COL4A1表現載體3而使表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ29~1,066」。

製作的野生型COL4A1表現載體及變異型COL4A1表現載體1~3、以及由此等表現的FL、Δ29~488、Δ29~989、及Δ29~1,066，整理呈示於下述表4及第7A圖。

第7A圖係顯示野生型單股單股鏈IV型膠原纖維胜肽(FL)或3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽(Δ29~488、Δ29~989、及Δ29~1,066)的概略說明圖。

回收分泌野生型單股鏈IV型膠原纖維胜肽或3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽的培養上清液，進行以NK46141作為探針的西方氏墨漬，實施NK46141之抗原決定位的驗證。此時，將僅不含COL4A1基因的載體導入前述同樣來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞所獲得的培養上清液作為陰性對照組(Mock)。再者，將辨識與NK46141相異的抗原決定位的抗單股鏈IV型膠原纖維胜肽抗體的JK132使用作為基因表現確認用的對照組。結果示於第7B圖。

此結果可知Δ29~1,066並未檢測出帶，NK46141所辨識的抗原決定位存在於單股鏈IV型膠原纖維胜肽之胺基酸序列之第990個殘基~第1,066個殘基。又，JK132所辨識的IV型膠原纖維α1多胜肽之抗原決定位已知係存在於胺基酸序列之第1,165個殘基~第1,179個殘基。

再者，為了驗證NK46141所辨識的抗原決定位，製作以下之變異型COL4A1表現載體4~6。

-變異型COL4A1表現載體4之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作的作為模板的野生型COL4A1表現載體變換為前述變異型COL4A1表現載體2，將序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號25及26所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體4。其次，於變異型COL4A1表現載體4的C末端，藉由習知方法來附加myc抗原決定位。

前述變異型COL4A1表現載體4係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第29個殘基~第989個殘基及第1,067個殘基~第1,669個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

-變異型COL4A1表現載體5之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體4之製作的序列識別號25及26所表示的引子序列變換為序列識別號27及28所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體4之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體5。其次，於變異型COL4A1表現載體5之C末端，藉由習知方法來附加myc抗原決定位。

前述變異型COL4A1表現載體5係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第29個殘基~第989個殘基及第1,020個殘基~第1,669個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

-變異型COL4A1表現載體6之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體4之製作之作為模板的變異型COL4A1表現載體2變換為前述變異型COL4A1表現載體4，將序列識別號25及26所表示的引子序列變換為序列識別號29及30所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體4之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體6。其次，於變異型COL4A1表現載體6之C末端，藉由習知方法來附加myc抗原決定位。

前述變異型COL4A1表現載體6係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第29個殘基~第1,019個殘基及第1,067個殘基~第1,669個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

將製作的變異型COL4A1表現載體4~6各自導入來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞(Invitrogen公司製)，使野生型或變異型之單股鏈IV型膠原纖維胜肽暫時性地於培養上清液中被表現。以下，將使用變異型COL4A1表現載體4而被表現的變異型重組蛋白質稱為「990~1,066myc」，將使用變異型COL4A1表現載體5而被表現的變異型重組蛋白質稱為「990~1,019myc」，將使用變異型COL4A1表現載體6而被表現的變異型重組蛋白質稱為「1,020~1,066myc」。

關於製作的變異型COL4A1表現載體4~6、以及由此等表現的990~1,066myc、990~1,019myc、及1,020~1,066myc，整理呈示於下述表5及第8A圖。

第8A圖係呈示3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽(990~1,066myc、990~1,019myc、及1,020~1,066myc)的概略說明圖。

回收分泌3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽的培養上清液，進行以NK46141作為探針的西方氏墨漬，實施NK46141之抗原決定位之驗證。此時，將僅不含COL4A1基因的載體導入前述同樣來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞而獲得的培養上清液作為陰性對照組(Mock)。又，使用抗myc抗體(SIGMA公司製)作為用以確認單股鏈IV型膠原纖維胜肽的表現之陽性對照組。結果示於第8B圖。

此結果得知990~1,019myc未檢測出帶，NK46141辨識的抗原決定位存在於單股鏈IV型膠原纖維胜肽之胺基酸序列之第990個殘基~第1,019個殘基。

再者為了驗證NK46141所辨識的抗原決定位，製作以下之變異型COL4A1表現載體7~9。

-變異型COL4A1表現載體7之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作的序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號31及32所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同方法來製作變異型COL4A1表現載體7。

前述變異型COL4A1表現載體7係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第1,020個殘基~第1,066個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

-變異型COL4A1表現載體8之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作的序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號33及34所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體8。

前述變異型COL4A1表現載體8係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第1,020個殘基~第1,049個殘基的胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

-變異型COL4A1表現載體9之製作-

除了將於前述變異型COL4A1表現載體1之製作的序列識別號19及20所表示的引子序列變換為序列識別號35及36所表示的引子序列之外，以與前述變異型COL4A1表現載體1之製作相同的方法來製作變異型COL4A1表現載體9。

前述變異型COL4A1表現載體9係使相當於前述單股鏈IV型膠原纖維胜肽之第1,050個殘基~第1,066個殘基之胺基酸欠缺部位的鹼基欠缺的表現載體。

將製作的變異型COL4A1表現載體7~9各自導入來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞(Invitrogen公司製)並使於培養上清液暫時性表現野生型或變異型之單股鏈IV型膠原纖維胜肽。以下，將使用變異型COL4A1表現載體7而被表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ1,020~1,066」，將使用變異型COL4A1表現載體8而被表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ1,020~1,049」，將使用變異型COL4A1表現載體9而被表現的變異型重組蛋白質稱為「Δ1,050~1,066」。

與前述野生型COL4A1表現載體合併，製作的變異型COL4A1表現載體7~9、以及由此等表現的Δ1,020~1,066、Δ1,020~1,049、及Δ1,050~1,066，整理呈示於下述表6及第9A圖。

第9A圖係呈示3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽(Δ1,020~1,066、Δ1,020~1,049、及Δ1,050~1,066)的概略說明圖。

回收分泌3種類之變異型單股鏈IV型膠原纖維胜肽的培養上清液，進行將NK46141作為探針的西方氏墨漬，實施NK46141之抗原決定位之驗證。此時，將僅不含COL4A1基因的載體導入前述同樣來自人類胎兒腎細胞的293FT細胞而獲得的培養上清液作為陰性對照組(Mock)。再者，使用辨識與NK46141不同的抗原決定位的抗單股鏈IV型膠原纖維胜肽抗體JK132作為基因表現確認用之對照組。結果示於第9B圖。

此結果，於Δ1,020~1,066及Δ1,050~1,066並未檢測出帶，可知NK46141所辨識的抗原決定位存在於單股鏈IV型膠原纖維胜肽之胺基酸序列之第1,050個殘基~第1,066個殘基。

於實施例10，野生型COL4A1表現載體及變異COL4A1表現載體1~9之製作所使用的引子序列整理呈示於下。

再者，為了決定NK46141辨識的抗原決定位，化學合成下述所示序列識別號37~42所表示的胜肽序列，將NK46141作為探針，進行點墨漬(dot blot)。於第10圖，＃1表示序列識別號37所表示的胜肽序列，＃2表示序列識別號38之所表示的胜肽序列，＃3表示序列識別號39所表示的胜肽序列，＃4表示序列識別號40所表示的胜肽序列，＃5表示序列識別號41所表示的胜肽序列，＃6表示序列識別號42所表示的胜肽序列。

由其結果可知，NK46141所辨識的抗原決定位係存在於IV型膠原纖維α1多胜肽之胺基酸序列之第1,056個殘基~第1,064個殘基的胺基酸序列“GIGIPGLRG”(序列識別號41)所表示的胜肽(第10圖之＃5)。

以上，基於實施例說明本發明。此等實施例徹底地係作為例示用，可有各種可能的變形例，又如此變形例亦於本發明之範籌內係本項技術領域者能理解的。

[寄存編號]

FERM BP-11300(臺灣食品工業發展研究所寄存編號BCR C960439)

[產業上之利用可能性]

如以上所述，將腫瘤組織中特異性表現的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽作為標的的本發明之抗體，係有用於作為對正常組織或正常器官、正常細胞不會作用的醫藥或診斷藥或腫瘤之治療用套組或診斷用套組。

<110>　NIPPON KAYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120>　抗單股IV型膠原纖維多胜肽抗體、含該抗體之預防或治療劑及診斷劑

<130>　N-ST015-11P-TW

<160>　42

<170>　PatentIn版本3.5

<210>　1

<211>　458

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　1

<210>　2

<211>　475

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　2

<210>　3

<211>　152

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　3

<210>　4

<211>　158

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　4

<210>　5

<211>　8

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<213>　人類

<400>　5

<210>　6

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<210>　7

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<213>　人類

<400>　7

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<211>　11

<212>　PRT

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<213>　人類

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<210>　10

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<400>　10

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<212>　PRT

<213>　人類

<400>　11

<210>　12

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<212>　PRT

<213>　人類

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<213>　人類

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<400>　14

<210>　15

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人類

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<213>　人類

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<211>　42

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　17

<210>　18

<211>　38

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　18

<210>　19

<211>　36

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　19

<210>　20

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<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　20

<210>　21

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　21

<210>　22

<211>　36

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　22

<210>　23

<211>　36

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　23

<210>　24

<211>　36

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　24

<210>　25

<211>　42

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　25

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<211>　40

<212>　DNA

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<223>　反向引子

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<210>　27

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<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　27

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<223>　反向引子

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<212>　DNA

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<220>

<223>　前向引子

<400>　29

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<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　30

<210>　31

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<212>　DNA

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<220>

<223>　前向引子

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<210>　32

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工序列

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<223>　反向引子

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<212>　DNA

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<223>　反向引子

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<212>　DNA

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<223>　前向引子

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<212>　DNA

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<220>

<223>　反向引子

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<213>　人類

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<212>　PRT

<213>　人類

<400>　38

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<213>　人類

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<211>　8

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　42

第1圖係呈示腫瘤細胞株(人類肝癌細胞株HLF或人類腎臓癌細胞株UO31)中的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現的一例的圖。JK132及Ab6586(Abcam公司製)任一者皆於西方氏墨漬(Western blotting)辨識單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的抗體。「3股鏈COL4」係表示於3股鏈分子間保持雙硫鍵並經SDS化而變性的IV型膠原纖維，「單股鏈COL4係表示單股鏈IV型膠原纖維多胜肽，還原處理之「-」係表示電泳樣品用緩衝液中不含2-巰基乙醇，還原處理之「+」係表示電泳樣品用緩衝液中含有2-巰基乙醇。

第2圖係呈示帶有癌症(人類肺癌Lu65A)的裸鼠之癌組織中的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現的一例的圖。「3股鏈COL4」係表示於3股鏈分子間保持雙硫鍵並經SDS化變性的IV型膠原纖維，「單股鏈COL4」係表示單股鏈IV型膠原纖維多胜肽，還原處理之「-」係表示電泳樣品用緩衝液中不含有2-巰基乙醇，還原處理之「+」係表示電泳樣品用緩衝液中含有2-巰基乙醇。

第3圖係比較人類臨床肺癌組織及自肺癌患者獲得的人類臨床正常肺組織中的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之表現量的圖。「3股鏈COL4」係表示於3股鏈分子間保持雙硫鍵並經SDS變性的IV型膠原纖維，「單股鏈COL4」表示單股鏈IV型膠原纖維多胜肽。

第4圖係呈示人類肝癌細胞株HLF所產生的單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之純化品之一例的圖。「MW」表示分子量標記。

第5圖係呈示抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體(NK46141)特異性地辨識單股鏈IV型膠原纖維多胜肽之一例的圖。「Sup.」表示人類肝癌細胞HLF之培養上清液，「CNT」表示不含有免疫沉降用之1次抗體的僅PBS的陰性對照，「IgG2b」各自表示Mouse IgG2b同型物對照。

第6圖係呈示人類肺癌Lu65A皮下移植裸小鼠模式中，抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體(NK46141)抑制腫瘤增殖之一例的圖。-△-表示對照組，-○-表示本發明之抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體(NK46141)投與組。

第7A圖係呈示使用野生型IV型膠原纖維α1基因(COL4A1)之全長(FL)及變異型COL4A1之表現載體而使表現的野生型重組蛋白質(FL)及變異型重組蛋白質(Δ29~488、Δ29~989、Δ29~1,066)的概略說明圖。

第7B圖係呈示用以驗證抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體(NK46141)所辨識的抗原決定位的西方氏墨漬的結果的圖。「Mock」表示陰性對照，JK132表示基因表現確認用之對照。

第8A圖係呈示使用表示變異型COL4A1表現載體而使表現的變異型重組蛋白質(990~1,066myc、990~1,019myc、1,020~1,066myc)的概略說明圖。「myc」為附加的基因表現確認用標記，被抗myc抗體辨識。

第8B圖係呈示用以驗證抗單股鏈IV型膠原纖維多胜肽抗體(NK46141)所辨識的抗原決定位之西方氏墨漬之結果的圖。「Mock」表示陰性對照，抗myc抗體表示基因表現確認用之對照。

第9A圖係呈示使用野生型COL4A1之全長及變異型COL4A1表現載體而使表現的野生型重組蛋白質(FL)及變異型重組蛋白質(Δ1,020~1,066、Δ1,020~1,049、Δ1,050~1,066)的概略說明圖。

第9B圖係呈示用以驗證NK46141所辨識的抗原決定位之西方氏墨漬之結果的圖。「Mock」表示陰性對照，JK132表示基因表現確認用之對照。

第10圖係呈示用以驗證NK46141所辨識的抗原決定位之點墨漬(dot blot)之結果的圖。＃1：序列識別號37所表示的胜肽序列、＃2：序列識別號38所表示的胜肽序列、＃3：序列識別號39所表示的胜肽序列、＃4：序列識別號40所表示的胜肽序列、＃5：序列識別號41所表示的胜肽序列、＃6：序列識別號42所表示的胜肽序列。

Claims

一種單株抗體，其特徵為其係由抗NK-抗原單株抗體#141之融合瘤株所產生、且會特異性地與單股鏈IV型膠原纖維多胜肽結合。
如申請專利範圍第1項記載之單株抗體，其包含至少一種選自序列識別號5~7之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，及包含至少一種選自序列識別號8~10之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。
如申請專利範圍第1項記載之單株抗體，其包含至少一種選自序列識別號11~13之任一者所表示的胺基酸序列的H鏈，及包含至少一種選自序列識別號14~16之任一者所表示的胺基酸序列的L鏈。
如申請專利範圍第1至3項中任一項記載之單株抗體，其係辨識含有GIGIPGLRG(序列識別號41)所表示的胺基酸序列的抗原決定位。
一種單株抗體，其特徵為包含如申請專利範圍第2項記載之單株抗體所具有的序列識別號5~7所表示的胺基酸序列的H鏈、及包含序列識別號8~10所表示的胺基酸序列的L鏈。
一種單株抗體，其特徵為包含如申請專利範圍第3項記載之單株抗體所具有的序列識別號11~13所表示的胺基酸序列的H鏈、及包含序列識別號14~16所表示的胺基酸序列的L鏈。
如申請專利範圍第5至6項中任一項記載之單株抗體，其係經人類型化。
一種單株抗體，其特徵為包含序列識別號5~7所表示的胺基酸序列的H鏈、及序列識別號8~10所表示的胺基酸序列的L鏈。
一種單株抗體，其特徵為包含序列識別號11~13所表示的胺基酸序列的H鏈、及序列識別號14~16所表示的胺基酸序列的L鏈。
如申請專利範圍第8至9項中任一項記載之單株抗體，其係經人類型化。
一種融合瘤株，其特徵為其係抗NK-抗原單株抗體# 141株。
一種醫藥，其特徵為包含如申請專利範圍第1至10項中任一項記載之單株抗體。
一種腫瘤之診斷藥或治療藥，其特徵為包含如申請專利範圍第1至10項中任一項記載之單株抗體。
如申請專利範圍第13項記載之腫瘤之診斷藥或治療藥，其中腫瘤為包含表現單股鏈IV型膠原纖維多胜肽的癌細胞的腫瘤。
一種單株抗體之部分構造，其係如申請專利範圍第1、2、4、5、7、8、及10項中任一項記載之單株抗體之部分構造，其特徵為包含前述單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)，前述CDR包含序列識別號5~7所表示的胺基酸序列，及序列識別號8~10所表示的胺基酸序列。
一種單株抗體之部分構造，其係如申請專利範圍第1、3、4、6、7、9、及10項中任一項記載之單株抗體之部分構造，其特徵為包含前述單株抗體所具有的互補性決定區(CDR；complementarity determining region)，前述CDR包含序列識別號11~13所表示的胺基酸序列，及序列識別號14~16所表示的胺基酸序列。