TWI506135B

TWI506135B - 突變型大腸桿菌忌熱毒素、其製備方法、增加免疫反應之佐劑及疫苗

Info

Publication number: TWI506135B
Application number: TW101139193A
Authority: TW
Inventors: Jiunn Horng Lin; Jyh Perng Wang; Ming Wei Hsieh; Chien Yu Fang; Hao Zhen Zeng; Ching Fu Tu
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2015-11-01
Also published as: TW201416441A; CN103773790A

Description

突變型大腸桿菌忌熱毒素、其製備方法、增加免疫反應之佐劑及疫苗

本發明係關於一種突變型大腸桿菌忌熱毒素及其製備方法，特別是關於一種提升突變型大腸桿菌忌熱毒素之產量以降低蛋白質佐劑與疫苗之生產成本及其方法。

大腸桿菌屬在分類學上歸屬於腸道細菌科(Enterobacteriaceae)，為兼性厭氧、不產孢之革蘭氏陰性菌。大多數之大腸桿菌對人畜無害，但部份血清型之大腸桿菌則會引起腹瀉、食物中毒及腸道外感染等症狀。致病型大腸桿菌依發病型態之不同，可分為下痢性大腸桿菌(DiarrheagenicE.coli )及腸道外致病大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicE.coli ,ExPEC)兩類。其中，下痢性大腸桿菌又可分為腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli ；EPEC)、腸毒素產生性大腸桿菌(enterotoxigeicE.coli ；ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveE.coli ；EIEC)、腸道出血性大腸桿菌(enterohemorrageicE.coli ；EHEC)及腸附著性大腸桿菌(enteroadherent aggregativeE.coli ；EAggEC)等五類。腸道外致病大腸桿菌可分為尿道致病性大腸桿菌(UropathogenicE.coli ；UPEC)、腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitisE.coli ；NMEC)、敗血性大腸桿菌(SepticemicE.coli ；SEC)及細胞脫附性大腸桿菌(cell-detachingE.coli ；CDEC)等四類(Kaperet al. ,2004；Pavankumar and Sankaran,2008)。

腸毒素產生性大腸桿菌會產生熱穩定毒素(heat stable toxin；ST)和忌熱毒素(heat labile toxin；LT) (Yamamoto and Nakazawa,1997)。熱穩定毒素可依照其對甲醇之溶解與否及對蛋白酶之抗性再區分為STI(STa)及STII(STb)。其中STI是由18~19個胺基酸所組成之胜肽，分子量約在1500~2000 Daltons，可溶解於甲醇中，對蛋白酶具有抗性。STII則是由48個胺基酸所組成之胜肽，無法溶解於甲醇中，對蛋白酶具有敏感性(Dubreuil,2008)。熱穩定毒素在100℃下加熱30分鐘仍不會失去活性。忌熱毒素與霍亂弧菌(Vibrio cholerae )所產生之霍亂毒素(cholera toxin；CT)具有相似之結構及作用機制，依據其與CT抗血清中和反應與否，又可區分為LTI及LTII。其中LTI可與CT抗血清反應；依照來源宿主之不同，又可區分為LTp-I及LTh-I；LTp-I係由豬隻來源之ETEC所產生，LTh-I則是由人類來源之ETEC所產生。LTh-I及LTp-I胺基酸之相似度達95%以上，但毒性有別。體外及體內試驗之結果顯示，LTp-I之毒性低於LTh-I(Lasaroet al .,2008)。LTII則無法與CT抗血清反應；依據胺基酸組成及抗原性之不同又可區分為LTIIa、LTIIb及LTIIc。這些忌熱毒素在65℃下加熱30分鐘即失去活性。

不同菌株產生毒素之能力有所不同；如鞭毛抗原K88正反應之菌株通常會產生LT及STI，鞭毛抗原K99或987P1正反應之菌株僅會產生STI(Yamamoto and Kakazawa,1997)。

忌熱毒素LTI屬於A-B毒素(A-B toxin)，為一高分子量的複合物，係由一個A次單位(LT-A)及五個B次單位(LT-B)所組成。A次單位之分子量約為30kDa，由A1(1~192)及A2(195~240)兩個多胜肽鏈以雙硫鍵結合所組成，主要扮演毒素之角色。此次單位具有二磷酸腺核苷核糖轉移酶(ADP-ribosyltransferase)活性，在進入細腸細胞後，A次單位之雙硫鍵會被破壞，且被宿主之蛋白酶剪切為A1及A2片段。A1會活化腺苷酸環化酶(adenylate cyclase)，使細胞中之環AMP(cAMP)增加。cAMP之增加會活化蛋白質激酶A(protein kinase A)，將離子通道磷酸化，進而促使細胞中的Na⁺ 、K⁺ 及水分向腸腔內轉移，水份與離子之大量流失會導致腹瀉、脫水和電解質紊亂。B次單位之分子量約為12kDa，其能與腸細胞膜上的GM1神經節苷酯(GM1 ganglioside)受體(receptor)結合，協助A1次單位進入細胞內。研究顯示，LTI除了造成人類及動物之腹瀉外，亦具有做為大腸桿菌疫苗及疫苗佐劑之潛力。

1972年，Northrup及Fauci等學者發現將霍亂毒素(cholera toxin；CT)與綿羊紅血球細胞(sheep red blood cells；SRBC)混合後，經靜脈注射後可增進抗SRBC抗體之效價。1984年，Elson及Ealding等學者發現CT具有黏膜佐劑之效果。1988年，Lycke等學者發現胺基酸組成與結構和CT相似之LTI亦具有黏膜佐劑之效果，且可避免口服耐受性之問題。後續之研究結果顯示，LTI亦可作為注射佐劑。有關LTI增強免疫反應之機制仍為闡明，目前僅知(1)LT的A次單位及B次單位與佐劑活性有關(Rappuoliet al .,1999)。(2)LT可促進抗原呈現細胞表現MHC-II分子，並刺激CD4+T細胞之增殖反應(Yamamotoet al .,1999)。(3)LT會刺激細胞激素之產生，可誘發TH1及TH2免疫反應(Yamamotoet al .,2001)。(4)TH17細胞與大腸桿菌忌熱毒素之佐劑活性有關(Breretonet al .,2011)。

雖然LTI具有佐劑之效果，但以腸毒素產生性大腸桿菌生產LTI作為佐劑具有多項缺點，包括：(1)操作腸毒素產生性大腸桿菌具有感染之風險。(2)不同菌株之毒素生產量有別且產量低(約為60μg~2.5mg)(Lasaroet al .,2006)。(3)天然毒素雖能增進免疫效果，但具有毒性，不適合直接作為疫苗佐劑。以重組DNA技術生產低毒性或無毒性毒素可改善上述之缺點。例如台灣專利案I304838號，利用大腸桿菌表現系統生產無毒性LTI，此毒素LT-A之第61號胺基酸由絲胺酸(Serine)突變為精胺酸(Arginine)或離胺酸(Lysine)；或是美國專利案US7291588號，利用細菌或酵母菌生產無毒素LTI，此毒素LT-A之第72號胺基酸由丙胺酸(alanine)突變為精胺酸(arginine)。然而，該些發明皆無法大量地量產突變型大腸桿菌忌熱毒素；緣此，本發明之主要目的在於提升突變體之產量以降低蛋白質佐劑之生產成本。

有鑒於此，本發明之目的係開發一種可降低毒性甚至無毒之大腸桿菌忌熱毒素，其利用突變其胺基酸序列所製得，其可使突變體之產量提升以降低蛋白質佐劑之生產成本。

同時，本發明之另一目的是製備可同時誘發體液性免疫反應及細胞性免疫反應之佐劑，其可與抗原組合為疫苗。

為達上述目的，本發明提供一種製備突變型大腸桿菌忌熱毒素之方法，其可包含：(a)提供大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列，其至少包含一個A次單位及一個B次單位；(b)將A次單位的第63號胺基酸突變為離胺酸之密碼子；(c)將A及B次單位中轉譯為訊息胜肽之DNA分別取代為轉譯為大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之DNA；(d)將大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸突變為纈胺酸之密碼子；以及(e)將步驟(d)所製得之突變大腸桿菌忌熱毒素之DNA置入大腸桿菌表現系統以製得突變型大腸桿菌忌熱毒素。

較佳地，大腸桿菌忌熱毒素可包含一個A次單位及五個B次單位。

在本發明之一較佳實施例中，當執行(e)步驟時，可先將突變大腸桿菌忌熱毒素之DNA嵌入質體，再將質體轉形入大腸桿菌表現系統。

在本發明之一較佳實施例中，在(e)步驟之後，所產生之突變型大腸桿菌忌熱毒素可採用一固定化半乳糖樹脂進行純化。

較佳地，步驟(a)之大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列可包含SEQ.ID NO 23、24或25。

較佳地，大腸桿菌忌熱毒素之A次單位可包含胺基酸序列SEQ.ID NO.26。

較佳地，大腸桿菌忌熱毒素之B次單位可包含胺基酸序列SEQ.ID NQ.27。

較佳地，大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽可包含胺基酸序列SEQ.ID NO.14。

在本發明之一較佳實施例中，大腸桿菌忌熱毒素之A次單位的第63號胺基酸之密碼子可為絲胺酸。

在本發明之一較佳實施例中，大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸之密碼子為丙胺酸。

在本發明之一較佳實施例中，當執行(b)步驟時，可利用引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應；其中，上述之引子可包含SEQ.ID NO.1、2、3、4、5及6。

在本發明之一較佳實施例中，當執行(c)步驟時，可利用引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應；其中，上述之引子可包含SEQ.ID NO.7、8、9、10、11、12及13。

在本發明之一較佳實施例中，當執行(d)步驟時，可利用引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應；其中，上述之引子可包含SEQ.ID NO.15、16、17及18。

此外，本發明另提供一種突變型大腸桿菌忌熱毒素，其可包含：至少一個A次單位及至少一個B次單位；其中A次單位之第63號胺基酸可為離胺酸；A次單位及B次單位之訊息胜肽係為大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽，且大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸可為纈胺酸。

於本發明之一較佳態樣中，大腸桿菌外膜蛋白質A之訊息胜肽可包含胺基酸序列SEQ.ID NO.14。

較佳地，本發明之突變型大腸桿菌忌熱毒素可包含SEQ.ID NO.30之DNA序列。

較佳地，本發明之突變型大腸桿菌忌熱毒素可為經減毒之大腸桿菌忌熱毒素。

再者，本發明另可提供一種增加個體免疫反應之佐劑，其可為上述突變型大腸桿菌忌熱毒素。

較佳地，佐劑可誘發體液性免疫反應及/或細胞性免疫反應。

最後，本發明再提供一種疫苗，其可包含：抗原及上述之佐劑。

其中，抗原可包含豬肺炎黴漿菌黏附素P97之C端。

其中，此疫苗可為一細菌疫苗或一病毒疫苗。

較佳地，細菌可包含病原性大腸桿菌(Escherichia coli )、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli )、沙門氏桿菌(Salmonella sp.)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )、巴氏桿菌 (Pasteurella multocida )、豬鏈球菌(Streptococcus suis type 2)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis )、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes )、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae )、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis )、丹毒菌(Erysipeloidrix insidiosia )、博德氏支管敗血症桿菌(Bordetella bronchiseptica )、氣腫疽桿菌(Clostridium chauvoei )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )、赤痢螺旋菌(Treponema hyodysenteriae )、雞副嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum )、水禽雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum )、鸚鵡披衣菌(Chlamydia psittaci )、雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum )、骨膜炎黴漿菌(Mycplosma synoviae )、家禽結核菌(Mycobacterium avian )、白色念珠菌(Candida albicans )或其組合。

較佳地，病毒可包含血球凝集性腦炎病毒、(haemagglutinating encephalomyelitis virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)、豬腸病毒(swine enterovirus virus)、假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)、***病毒(foot and mouse disease virus)、豬流行性感冒(swine influenza virus)、第二型豬環狀病毒(porcine circovirus type 2)、豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)、豬痘病毒(swine pox virus)、豬小病毒(porcine parovirus)、豬瘟病毒(classical swine fever)、白血/腫瘤性疾病群病毒(leukosis/sarcoma group virus)、傳染性華氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)、家禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)、雞馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)、關節炎病毒(arthritis virus)、雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus)、禽痘病毒(fowl pox virus)、新城病病毒(Newcastle disease virus)、雞傳染性喉頭氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus)、腫頭症候群病毒(swollen head syndrome virus)、雞產蛋下降症候群病毒(egg drop syndrome virus)或其組合。

本發明透過量產突變型大腸桿菌忌熱毒素之方式來降低製作佐劑之成本，且具備毒性小及免疫效果良好等優點，可做為疫苗佐劑。。

以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含於不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發明。這些實施例之提供使得本發明之揭露完整與完全，熟知此技術之人將能經由該些實施例了解本發明之範疇。

本發明係關於一種製備突變型大腸桿菌忌熱毒素之方法，其可包含：(a)提供大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列，其至少包含一個A次單位及一個B次單位；(b)將A次單位的第63號胺基酸突變為離胺酸之密碼子；(c)將A及B次單位中轉譯為訊息胜肽之DNA分別取代為轉譯為大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之DNA；(d)將大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸突變為纈胺酸之密碼子；以及(e)將步驟(d)所製得之突變大腸桿菌忌熱毒素之DNA置入大腸桿菌表現系統以製得突變型大腸桿菌忌熱毒素。。

較佳地，本發明之大腸桿菌忌熱毒素可包含一個A次單位及五個B次單位。

最後，本發明再提供一種疫苗，其可包含：一抗原及上述之佐劑。

本文中「LT」一詞，係指大腸桿菌忌熱毒素。LT係至少由單一A次單位及單一B次單位所構成，較佳為單一A次單位及五個相同之B次單位構成。

本文中「突變型大腸桿菌忌熱毒素」一詞，相較於野生型大腸桿菌忌熱毒素之下，係指經突變、經減毒、毒性較低或不具毒性之大腸桿菌忌熱毒素。

本文中「elt 」一詞，係指大腸桿菌忌熱毒素之結構基因。

「rmLT」一詞係指重組天然產生之LT所製成之突變型。用於與rmLT相關之「實質上無毒性」一詞係指實質上較其野生型相對物低之毒性。

後述之實例係用於闡明本發明的數種態樣，並使得本領域之通常知識者得以據以實施，以下之實例係僅為例示性，並非用於限制本發明意欲主張之申請專利範圍。

實例

本發明之一種突變型大腸桿菌忌熱毒素及其製備方法，特別是關於一種提升突變型大腸桿菌忌熱毒素之產量以降低蛋白質佐劑之生產成本及其實驗方法步驟與實驗的結果討論，其將以具體實例說明的方式闡述，其過程及結果係僅為例示性，並非用於限制本發明意欲主張之申請專利範圍。本發明所主張之範圍，將以如後文所述之申請專利範圍為主。

實例1 菌株之分離

自發生豬隻下痢之豬場收取豬腸。以滅菌之接種環鉤取豬腸液，並於馬康基氏瓊脂(MacConkey agar)培養基上進行劃線培養。隔夜培養後，挑選單一紅色菌落進行生化試驗，包括吲哚試驗(indole test)、甲基紅試驗(methyl red test)、佛普二氏反應(Voges-Prokauer reaction)及檸檬酸試驗。菌株進行測試後，若吲哚試驗為正反應、甲基紅試驗為正反應、佛普二氏反應為負反應及檸檬酸試驗為負反應，則判定為大腸桿菌。進一步以鞭毛抗原K88抗血清進行血清凝集試驗，若凝集試驗為正反應，代表此菌株為K88⁺ 之大腸桿菌。將不同豬場之菌株分別編號為171、196及286。

實例2 腸毒素產生性大腸桿菌質體之抽取

利用Plasmid Miniprep Purification Kit II(GeneMark,Taiwan)進行大腸桿菌質體之抽取，操作流程依照廠商提供之方法進行。流程中提及之溶液I、溶液II、溶液III、洗滌溶液A、洗滌溶液B及沖提溶液均為套組中所附之試劑。取1.5 mL隔夜培養之菌液至微量離心管，離心(21,000×g，3分鐘，室溫)收集菌體，並倒除上清液，重複此步驟二次。將菌體重新懸浮於200 μL溶液I中。之後加入200 μL溶液II，緩和混合數次。接著加入200 μL溶液III，緩和混合數次。離心 (21,000×g，10分鐘，室溫)收集上清液。將純化管柱(spin column)放置於收集管(collection tube)上，並將上清液置入純化管柱(spin column)中，經離心(21,000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。接著加入500 μL洗滌溶液A至純化管柱(spin column)中，離心(14000 rpm，2分鐘，室溫)後，倒除濾液，此步驟可有效降低核酸內切酶(endonuclease)的污染。緊接著加入700 μL洗滌溶液B，經離心(21,000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。之後，繼續離心(21,000×g，5分鐘，室溫)以去除殘留之酒精。最後將純化管柱(spin column)置於滅菌之微量離心管中，加入適量之沖提溶液至純化管柱(spin column)中並離心(21,000×g，2分鐘，室溫)以沖提質體DNA。將質體貯存於-20℃中備用。

實例3 利用聚合酶連鎖反應增幅elt 操作組(operon)

大腸桿菌忌熱毒素LTp-I之結構基因包括elt A及elt B。elt A基因之上游區域被稱之為A-box，含有基因轉錄所需之啟動子(promoter)；elt B基因之下游區域被稱之為B-box，含有終止基因轉錄所需之終止子(terminator)。這些區域之核苷酸序列在不同菌株間有很高的同源性(Schlöret al. ,2000)。針對同源性為100%之區域設計兩條引子，包括ELTORF(5’-AAGTCGCGACTAATAAAAATAATCAGGTTGCC-3’)(SEQ.ID NO.31)/ELTORR(5’-GATAACCCTGCCATTTTCATCCAGT T-3’)(SEQ.ID NO.32)。以腸毒素產生性大腸桿菌之質體DNA作為模板，利用ELTORF及ELTORR引子組合進行elt 操作組之擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍Ex Taq ^TM 緩衝液，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，100 ng腸毒素產生性大腸桿菌之質體DNA及1.25 UTakaRa Ex Taq ^TM DNA聚合酶。PCR之反應條件為：94℃下5分鐘(1個步驟)；94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分鐘40秒(35個循環)；以及72℃下7分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR Clean-Up kit(GeneMark,Taiwan)回收後，貯存於-20℃中備用。

實例4 elt 操作組(operon)之選殖(TA cloning)

本實驗利用益生TA選殖套組(TA cloning kit)進行。實驗步驟參考廠商提供之yT&A選殖載體試劑組操作手冊進行。取5 μL經PCR清潔處理套組(clean up kit)回收純化之PCR產物(elt operon DNA)與2 μL yT&A載體(vector)、1 μL接合緩衝液A(ligation buffer A)、1 μL接合緩衝液B和1 μL T4 DNA接合酶(1 unit/μL)混合均勻後，於22℃反應30分鐘進行接合反應。將接合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌XL1-blue(Protech,Taiwan)中，轉形之條件依廠商提供之流程進行。轉形後之菌體加入1 mL SOC再生培養液中，於37℃、250 rpm之條件下震盪60分鐘。之後，取適量菌液塗佈於含氨苄西林(ampicillin)(最終濃度為100 μg/mL)之固態培養基上，於37℃下培養16小時。之後，以菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應實驗步驟如下所述。首先，先準備一微量離心管加入反應緩衝液、dNTP、引子、Takara Ex Taq ^TM DNA聚合酶(Takara,Japan)及加入滅菌水調整至適當體積，分裝於PCR小管(10 μL/管)。隨後再以牙籤自培養皿上將菌落點至PCR小管，進行PCR反應。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃，反應1分鐘50秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。以菌落聚合酶連鎖反應確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將含有171、196及286菌株elt 操作組(operon)之質體分別命名為TA-171ELT、TA-196ELT及TA-286ELT。

實例5 大腸桿菌忌熱毒素基因之定點突變

利用重疊延展聚合酶連鎖反應(overlap extension polymerase chain reaction，OEPCR)進行定點突變，突變之位置包括大腸桿菌忌熱毒素基因之第63號胺基酸-絲胺酸(Serine)之密碼子(codon)，使其由變為離胺酸(lysine)之密碼子；此外，基因中之Nde I切位亦進行沉默突變(silent mutation)，使其由CATATG改變為CGTATG(密碼子改變但不改變胺基酸)，以方便基因之選殖。首先設計EltAF(SEQ.ID NO.1)、S63KF(SEQ.ID NO.2)、S63KR(SEQ.ID NO.3)、NdeImutf(SEQ.ID NO.4)、NdeImutR(SEQ.ID NO.5)及EltBR(SEQ.ID NO.6)等六條引子；引子之序列如下列表一所示。

其中EltAF及EltBR為增幅引子，S63KF、S63KR、NdeImutF及NdeImutR則為突變引子。突變過程中，先以帶有elt 操作組之質體TA-196ELT作為模版，以EltAF/S63KR、S63KF/NdeImutR及NdeImutF/EltBR等三組引子組分別進行DNA片段增幅。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng TA-196ELT-1及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應之條件為95℃反應2分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。PCR產物以膠體沖提套組(Gel Elution kit)(GeneMark,Taiwan)回收。之後，以回收之三段PCR產物(各200 ng)作為模版，利用EltAF/EltBR引子進行DNA片段增幅。PCR反應條件為95℃反應2分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。經此步驟後，即可獲得全長定點突變之elt AB。將PCR產物以膠體沖提套組回收後，貯存於-20℃中備用。

實例6 突變大腸桿菌忌熱毒素基因之選殖

定點突變之elt AB以Nde I及Sal I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將接合產物轉形入大腸桿菌XL1-blue中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將DNA序列正確無誤之質體命名為pETELT。

實例7 大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽之改造 1.將大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位之訊息胜肽置換為大腸桿菌外膜蛋白質A之訊息胜肽

利用重疊延展聚合酶連鎖反應進行大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽DNA之改造。使用之引子請參見下列表二。首先，先進行大腸桿菌忌熱毒素A次單位訊息胜肽DNA之改造。試驗中，先以大腸桿菌JM109之染色體DNA作為模板，利用OmpASPF及OmpASPR引子組合進行外膜蛋白質A(outer membrane protein A,OmpA)訊息胜肽DNA之擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，100 ng大腸桿菌JM109之染色體DNA及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃ 反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。另以pETELT質體作為模板，利用OmpASPEltAF及EltAR引子組合進行熟成大腸桿菌忌熱毒素A次單位DNA之擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng pETELT及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR清潔處理套組(GeneMark,Taiwan)進行回收後，以OmpA訊息胜肽DNA片段及熟成大腸桿菌忌熱毒素A次單位DNA為模板，利用OmpASPF及EltAR進行重疊延展聚合酶連鎖反應即可獲得融合有OmpA訊息胜肽DNA片段之elt A基因。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng OmpA訊息胜肽DNA片段、200 ng熟成大腸桿菌忌熱毒素A次單位DNA及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應1分鐘(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以膠體沖提套組回收後，以Nde I及Eco RI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將接合產物轉形入大腸桿菌JM109中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體命名為pETOMPELTA。

在大腸桿菌忌熱毒素B次單位訊息胜肽DNA改造試驗中，先以大腸桿菌JM109之染色體DNA作為模板，利用OmpASPEltBF-1及OmpASPR引子組合進行外膜蛋白質A(outter membrane protein A,OmpA)訊息胜肽DNA之擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，100 ng大腸桿菌JM109之染色體DNA及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。另以pETELT質體作為模板，利用OmpASPEltBF-2及EltBR引子組合進行熟成大腸桿菌忌熱毒素B次單位DNA之擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng pETELT及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將PCR產物以PCR清潔處理套組(GeneMark,Taiwan)進行回收後，以OmpA訊息胜肽DNA片段及熟成大腸桿菌忌熱毒素B次單位DNA為模板，利用OmpASPEltBF-1及EltBR進行重疊延展聚合酶連鎖反應即可獲得融合有OmpA訊息胜肽DNA片段之elt B基因。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP 與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng OmpA訊息胜肽DNA片段、200 ng熟成大腸桿菌忌熱毒素B次單位DNA及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。將P℃R產物以膠體沖提套組回收後，以Eco RI及Sal I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pETOMPELTA中。將接合產物轉形入大腸桿菌JM109中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體命名為pETOMPELT。

2.大腸桿菌外膜蛋白質A訊息胜肽之改造

大腸桿菌外膜蛋白質A之訊息胜肽是由21個胺基酸(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)(SEQ.ID NO.14)所組成，其中第九號胺基酸丙胺酸(alanine)位於疏水性區域。利用重疊延展聚合酶連鎖反應進行大腸桿菌外膜蛋白質A訊息胜肽之改造，使第九號胺基酸突變為疏水性更高之胺基酸纈胺酸(valine)。PCR試驗所使用之引子請參見下列表三。試驗中，以pETOMPELT作為模板，分別利用OmpA9VELTAF/EltAR引子組合進行DNA擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng pETOMPELT及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。利用此PCR反應可獲得融合有突變OmpA訊息胜肽DNA片段之elt A基因。將PCR產物以膠體沖提套組回收後，以Nde I及Eco RI剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將接合產物轉形入大腸桿菌JM109中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體命名為pETOMPA9VELTA。

之後，利用OmpA9VELTBF/EltBR引子組合進行DNA擴增。在50 μL PCR反應混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR緩衝液A，200 μM的dATP、dTTP、dGTP與dCTP，1 μM擴增引子，200 ng pETOMPELT及1 U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反應條件為98℃反應2分鐘(1個步驟)；94℃反應15秒、55℃反應30秒、68℃反應30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個步驟)。利用此PCR反應可獲得融合有突變OmpA訊息胜肽DNA片段之elt B基因。將PCR產物以膠體沖提套組回收後，以Eco RI及Sal I剪切後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET29a中。將接合產物轉形入大腸桿菌JM109中。以菌落聚合酶連鎖反應篩選轉形株。菌落聚合酶連鎖反應條件為95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、60℃反應30秒、72℃反應1分鐘40秒(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。確認轉形株中之重組質體帶有嵌入DNA後，再抽取轉形株中之質體並進行DNA定序。將DNA序列正確無誤之質體命名為pETOMPA9VELT。

實例8 突變大腸桿菌忌熱毒素之表現

將表現載體pETELT、pETOMPELT及pETOMPA9VELT轉形入E.coli BL21(DE3)。挑選單一菌落接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30 μg/mL)之LB培養基中，於37℃、180 rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30 μg/mL)之LB培養基中，振盪培養(37℃，180 rpm)至OD₆₀₀ 約為0.6~0.8左右，以1 mM IPTG進行蛋白質之誘導表現，誘導4小時後，離心(10000×g，10分鐘，4℃)收集菌體部分及周質空間(periplasmic space)部分並以蛋白質電泳觀察突變大腸桿菌忌熱毒素之表現情形。

實例9 利用即時反轉錄聚合酶連鎖反應分析elt AB mRNA之含量 1.總RNA萃取

將轉形株接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30 μg/mL)之LB培養基中，於37℃、180 rpm之條件下進行培養。經隔夜培養後，菌液以1：100之比例接種至含有康那黴素(最終濃度為30 μg/mL)之LB培養基中，振盪培養(37℃，180 rpm)至OD₆₀₀ 約為0.6~0.8左右，以1 mM IPTG進行蛋白質之誘導表現，誘導4小時後，取1.5 mL菌液至微量離心管，離心(21,000×g，5分鐘，室溫)收集菌體部分並以Total RNA Miniprep Kit(GeneMark,Taiwan)進行總RNA之萃取。總RNA萃取流程如下所述，將菌體重新懸浮於100 μL含有40 μg溶菌酶之TE緩衝液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0)中，置於室溫下5分鐘。之後加入350 μL RNA Lysis/2-ME溶液，混合均勻後，離心(21,000×g，2分鐘，室溫)，取上清液置入乾淨之微量離心管中，並加入250 μL 99.5%之酒精，振盪均勻後，取700 μL溶液至RNA純化管柱(spin column)中。經離心(21,000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。加入500 μL RNA洗滌溶液I至純化管柱中，離心(21000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。將80 μL DNase培養緩衝液(incubation buffer)混合2 μL DNase I後，加至純化管柱中，在室溫下靜置15分鐘。之後，加入500 μL RNA洗滌溶液I至純化管柱中，離心(21,000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。再加入600 μL RNA洗滌管柱II至純化管柱中，離心(21,000×g，2分鐘，室溫)後，倒除濾液。之後，繼續離心(21000×g，5分鐘，室溫)以去除純化管柱中殘留之酒精。最後將純化管柱置於乾淨之微量離心管中，加入40 μL經DEPC處理過之去離子水(GeneMark,Taiwan)，於21,000×g下離心1分鐘沖提RNA。利用超微量分光光度計進行RNA定量後，將RNA貯存於-70℃中備用。

2.第一股cDNA合成

取2 μL總RNA(0.5 μg/μL)加入13 μL經DEPC處理過之去離子水及1 μL oligo dT，混合均勻後，置於90℃下反應2分鐘後，再放置於冰上3分鐘。之後，再加入2 μL 10倍M-MuLV RT緩衝液、1 μL反轉錄酶(M-MuLV RTase)及1 μL 10 mM dNTP混合。於42℃下反應1小時後，再放置於75℃下反應15分鐘。之後，將合成之cDNA貯存於-20℃中備用。

3.定量PCR試驗

利用EltB-F/EltB-R及16S-F/16S-R等兩組引子組合進行定量PCR試驗。引子序列見表四。試驗中，先將1.875 ng之cDNA、EltB-F/EltB-R引子混合物(或16S-F/16S-R引子混合物；個別引子濃度為0.75 μM)及LightCycler^® FastStart DNA master SYBR Green I(Roche,Switzerland)混合後，利用Roche LightCycler 1.5^® 儀器進行解離曲線(melting curve)之分析。定量PCR反應條件分為四步驟，包括(1)在95℃下反應10分鐘，使FastStart DNA聚合酶活化及DNA變性。(2)在94℃反應15秒、55℃反應30秒及68℃反應30秒之條件下進行35個循環，擴增目標DNA片段。(3)於65℃反應15秒後，以每秒升高0.1℃的速率加溫至95℃，建構解離曲線。(4)於40℃反應30秒，冷卻即時PCR系統。最後以LightCycler3 Front Screen軟體分析Ct值(threshold cycle value)。elt AB之相對表現量以2^-△△CT 公式計算。

實例10 突變型大腸桿菌忌熱毒素之純化

利用大腸桿菌忌熱毒素能與半乳糖結合之特性，採用固定化半乳糖樹脂(Pierce,USA)進行蛋白質純化。蛋白質純化之方式依照廠商所述之方法加以修飾。將菌體懸浮於HEPES緩衝液(0.1 M HEPES,0.15M NaCl,pH 7.2)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後。離心(10,000×g，30分鐘)收集上清液部分。將上清液注入含有1 mL固定化半乳糖樹脂之管柱中，此階段大腸桿菌忌熱毒素會結合至樹脂上。之後加入30 mL之HEPES緩衝液洗滌樹脂，此步驟之目的在於洗除非特異性結合之蛋白質。檢測流出液之OD₂₈₀ ，當OD₂₈₀ 讀值達平穩時，代表已將非特異性結合之蛋白質洗出。最後加入10 mL沖提緩衝液(0.1 M HEPES,0.15 M NaCl,0.1 M D-galactose,pH 7.2)沖提樹脂上之大腸桿菌忌熱毒素，此步驟乃是利用高濃度之D-半乳糖與重組蛋白質結合致使大腸桿菌忌熱毒素自樹脂上被沖提下來。利用蛋白質電泳觀察重組突變型大腸桿菌忌熱毒素之純化情形。

實例11 抗大腸桿菌忌熱毒素抗血清之製備

本實驗所使用之小白鼠為五週齡BALB/c雌性小鼠，係向國家動物實驗中心所購買。將小鼠飼養在具備空調設備之標準動物房中，並供應小鼠飼料及乾淨飲水。飼養7天後，開始進行免疫試驗。將純化之重組蛋白質(100 μg)與佐劑(完全或不完全的弗氏(Freund’s)佐劑)以三向接頭混合均勻後，利用皮下注射之方式將佐劑/抗原混合液注射至SD大鼠體內。第一次注射弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)乳化疫苗，爾後每隔7天注射一次弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant)乳化疫苗，連續兩次。於第二次注射後，便可利用眼窩採血之方式進行血液之收集。

取得的血液於室溫放置1小時後，再於4℃下放置隔夜，使血液凝固。凝血之血液經離心(5,000×g，30分鐘)後，可獲得血清。此血清中即含有針對重組突變型毒素之特異性抗體。

實例12 以圓點轉漬法(dot blot)測定重組突變型毒素之產量

剪取適當大小之PVDF膜，以甲醇浸潤數秒後，用去離子水及TBS緩衝液(20mM Tris,150 mM NaCl,pH7.4)各沖洗一遍後，放置於適當大小之濾紙片上。將已知濃度之純化重組毒素以PBS緩衝液稀釋成100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL及6.25 μg/mL之濃度後，分別取2 μL蛋白質溶液點至經甲醇活化之PVDF膜上。將轉形株周質空間之蛋白質溶液經5倍稀釋後，取2 μL蛋白質溶液點至經甲醇活化之PVDF膜上。待膜上之蛋白質溶液被風乾後，將PVDF膜浸泡於20 mL阻隔緩衝液(blocking buffer)(20mM Tris,150 mM NaCl,5% skim milk,pH7.4)中。於室溫下填塞一小時後，加入4 μL抗大腸桿菌忌熱毒素之抗血清，於室溫下震盪1小時。之後，將阻隔緩衝液倒除，以20 mL TBST緩衝液(20mM Tris,150 mM NaCl,0.05% Tween-20,pH7.4)洗滌PVDF膜，重複進行洗滌三次(10分鐘/次)後，加入帶有HRP共軛山羊抗鼠抗體(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L))之填塞溶液，避光震盪一小時後，以TBST緩衝液洗滌PVDF膜三次。將TBST倒除後，加入Western Lightning^® Plus-ECL試劑進行呈色反應。利用ImageQuant LAS 4000 mini冷光照像系統進行影像拍攝，並利用Gel-Pro analyzer 4.0進行影像分析。以已知蛋白質濃度對應冷光強度求出相關方程式，並藉此方程式換算為之樣品之濃度。

實例13 以小鼠試驗測試重組突變型毒素之佐劑效果

以增強型綠螢光蛋白質(GFP)及豬肺炎黴漿菌黏附素P97之C端(MHP30)作為模式抗原(model antigen)，分別以腹腔注射及皮下注射之方式免疫小鼠，分析重組突變型毒素(rmLT)之佐劑效果。小鼠試驗如下所述：

1.以GFP作為模式抗原進行小鼠試驗

本實驗所使用之小白鼠為五週齡BALB/c雌性小鼠，係向國家動物實驗中心所購買。將小鼠飼養在具備空調設備之標準動物房中，並供應小鼠飼料及乾淨飲水。飼養7天後，開始進行免疫試驗。將小白鼠分為A、B及C三組，每組3隻老鼠。其中A組之每隻小鼠以腹腔注射免疫0.5 mL GFP溶液(含50 μg GFP、10 mM Na₂ HPO₄ 及1.5 mM NaH₂ PO₄ ，pH 7.5)；B組之每隻小鼠以腹腔注射免疫0.5 mL GFP及rmLT混合溶液(含50 μg GFP、50 μg rmLT、10 mM Na₂ HPO₄ 、1.5 mM NaH₂ PO₄ ，pH 7.5)。C組作為控制組，不進行任何免疫處理。每隔兩週免疫抗原一次，共免疫兩次。免疫7天後，收集血清，以酵素連結免疫吸附法測定抗GFP之IgG、IgG1及IgG2a效價，評估rmLT之佐劑效果及對免疫途徑之影響。

酵素連結免疫吸附法之操作流程如下所述；將純化之GFP以附著性緩衝液(被覆緩衝液(coating buffer)；0.1 M碳酸鹽緩衝液(carbonate buffer),pH 9.6)稀釋後，加至ELISA盤中(0.5 μg/well)，於室溫下放置1小時，使抗原吸附於多孔微盤上。之後，將多孔微盤之液體倒除，並以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗完畢後，每孔盤加入200 μL PBSM，於室溫下放置1小時，進行填塞作用。填塞作用後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。將小鼠血清以PBSMT稀釋成不同倍數後，每孔盤加入100 μL，於室溫下放置1小時。之後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗後，每孔盤再加入100 μL以PBSMT稀釋成5000倍之鹼性磷酸酵素共軛山羊抗鼠抗體(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L))(或IgG1及IgG2a)，於室溫下放置30分鐘。之後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗後，每孔盤加入50 μL受質溶液，於室溫下反應30分鐘。最後，以ELISA讀取器於奈米405下測定每孔盤之吸光值。

2.以MHP30作為模式抗原進行小鼠試驗

本實驗所使用之小白鼠為五週齡BALB/c雌性小鼠，係向國家動物實驗中心所購買。將小鼠飼養在具備空調設備之標準動物房中，並供應小鼠飼料及乾淨飲水。飼養7天後，開始進行免疫試驗。將小白鼠分為A、B及C三組，每組4隻老鼠。其中A組之每隻小鼠以皮下注射免疫0.1 mL MHP30溶液(含100 μg MHP30、10 mM Na₂ HPO₄ 及1.5 mM NaH₂ PO₄ ，pH 7.5)；B組之每隻小鼠以皮下注射免疫0.1 mL MHP30及rmLT混合溶液(含100 μg MHP30、50 μg rmLT、10 mM Na₂ HPO₄ 、1.5 mM Na₂ HPO₄ ，pH 7.5)。C組作為控制組，不進行任何免疫處理。每隔兩週免疫抗原一次，共免疫兩次。免疫7天後，收集血清，以酵素連結免疫吸附法測定抗MHP30之IgG、IgG1及IgG2a效價，評估rmLT之佐劑效果及對免疫途徑之影響。

酵素連結免疫吸附法之操作流程如下所述；將純化之MHP30以附著性緩衝液(被覆緩衝液；0.1 M碳酸鹽緩衝液，pH 9.6)稀釋後，加至ELISA盤中(0.5 μg/well)，於室溫下放置1小時，使抗原吸附於多孔微盤上。之後，將多孔微盤之液體倒除，並以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗完畢後，每孔盤加入200 μL PBSM，於室溫下放置1小時，進行填塞作用。填塞作用後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。將小鼠血清以PBSMT稀釋成不同倍數後，每well加入100 μL，於室溫下放置1小時。之後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗後，每孔盤再加入100 μL以PBSMT稀釋成5000倍之鹼性磷酸酵素共軛山羊抗鼠抗體(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L))(或IgG1及IgG2a)，於室溫下放置30分鐘。之後，將多孔微盤之液體倒除後，以PBST清洗三次。清洗時，每孔盤加入200 μL PBST，靜置2分鐘。清洗後，每孔盤加入50 μL受質溶液，於室溫下反應30分鐘。最後，以ELISA讀取器於奈米405下測定每孔盤之吸光值。

實例14 結果與討論 1.大腸桿菌野外分離株之分離及質體之抽取

於三場發生豬隻下痢之豬場中，可分離出K88⁺ 之大腸桿菌。將不同豬場之菌株分別編號為171、196及286。挑取單一菌落接種於LB培養基中，經隔夜培養後，進行質體之抽取。請參見第一圖，其DNA電泳結果顯示，三株菌株均具有內生性質體(endogenous plasmids)。

2.elt 操作組之擴增、選殖及定序

以171、196及286之內生性質體作為模板，利用ELTORF及ELTORR引子組合進行elt 操作組之擴增。DNA電泳結果顯示，可利用PCR擴增出預期大小之DNA片段(約1.6 kb)(第二圖)。PCR產物經TA選殖及定序後，確認增幅之DNA片段為elt 操作組。三株菌株之elt 操作組與豬隻大腸桿菌UMK88之elt 操作組序列(GenBank：CP002732.1)的相似度最高，達99%。核苷酸序列不同處主要在於elt AB之上游及下游區域。171及196之elt AB序列與UMK88之elt AB完全相同；286之elt AB序列與UMK88之elt AB的相似度為99%。胺基酸序列分析顯示，171、196、286及UMK88菌株之LT-A和LT-B的胺基酸序列完全相同。其中LT-A由258個胺基酸所組成，N端之18個胺基酸(MKNITFIFFILLASPLYA)為訊息胜肽(signal peptide)；LT-B由124個胺基酸所組成，N端的21個胺基酸為訊息胜肽(MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG)。請參見第三圖至第七圖，其為有關三株(171、196、286)菌株之elt 操作組DNA序列、LT-A胺基酸序列及LT-B胺基酸序列。

將三株菌株之elt 操作組選殖於衍生自pUC19質體之yT&A中，並轉型入大腸桿菌XL1-blue中，可獲得轉形株XL1-blue(TA-171ELT)、XL1-blue(TA-196ELT)及XL1-blue(TA-286ELT)。將菌株培養於含氨苄西林(最終濃度為10 μg/mL)之LB培養基中，經培養24小時後，LT之產量分別為4.66 mg/L、4.80 mg/L及5.37 mg/L。在台灣專利案I304838號之LT生產方式，乃是將人類分離株H10407之elt 操作組選殖於衍生自pUC19質體之pBluescript II KS(-)中。發明中並未詳細說明LT產量，但以蛋白質表現概念計算LT產量亦在4~5 mg/L間。

3.大腸桿菌忌熱毒素基因之定點突變及表現載體之建構

利用重疊延展聚合酶連鎖反應將大腸桿菌忌熱毒素基因第63號胺基酸-絲胺酸之密碼子(TCT)突變為離胺酸之密碼子(AAA)；此突變會使大腸桿菌忌熱毒素之毒性降低。此外，基因中之Nde I切位亦進行沉默突變，使其由CATATG改變為CGTATG；此突變並不影響胺基酸之組成。Nde I切位之突變有助於限制酶切位之設計，可方便基因之次選殖(subcloning)。請參見第八圖，其為有關突變之策略方法及PCR產物電泳圖。接著請參見第九圖，其為突變型大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列(SEQ.ID NO.28)(突變部分以粗體字表示)。將定點突變之elt AB嵌入pET29a中，可構築成pETELT。將表現質體轉形入BL21(DE3)，並進行蛋白質之誘導表現。蛋白質電泳結果顯示，EltA及EltB預期分子量位置處之蛋白質條帶並不明顯，代表重組毒素之表現量較低。以原點轉漬(Dot blot)法所估算之分泌表現量約7.35 mg/L。推測可能是由於基因中帶有罕見密碼子或基因之轉譯效果不佳。過去之研究顯示，基因起始密碼會影響基因之轉譯。本發明藉由置換訊息胜肽DNA之方式，可得到且觀察出基因起始密碼對蛋白質表現之影響。

4.大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽之改造及表現載體之建構

利用重疊延展聚合酶連鎖反應將大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位中轉譯為訊息胜肽之DNA(以下簡稱「訊息胜肽DNA」)置換為大腸桿菌OmpA之訊息胜肽DNA。請參見第十一圖，其為置換大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽DNA使用之策略方法及PCR產物之電泳分析結果。請參見第十二圖，其為融合外膜蛋白A(OmpA)之訊息胜肽DNA之突變DNA序列(SEQ.ID NO.29)；OmpA訊息胜肽係以粗體字表示。將融合有OmpA訊息胜肽DNA之elt A及elt B依序嵌入pET29a中，可構築成pETOMPELT。將表現質體轉形入BL21(DE3)，並進行蛋白質之誘導表現。其結果可由第十圖，其中，分析之宿主包括E.coli BL21(DE3)(pET29a)(不表現重組毒素；作為負控制組)、E.coli BL21(DE3)(pETELT)、E.coli BL21(DE3)(pETOMPELT)及E.coli BL21(DE3)(pETOMPA9VELT)。其中總細胞溶解產物(total cell lysate)電泳結果代表總蛋白質之分布情形；周質空間(periplasmic space)代表周質空間蛋白質之分布情形；周質空間蛋白質屬分泌性蛋白質更進一步顯示，重組突變毒素之表現量大幅提升，分泌表現量約10.33 mg/L。此結果說明，基因起始密碼影響重組突變毒素之表現。

5.大腸桿菌外膜蛋白質A訊息胜肽之改造

典型訊息胜肽具有N端區域(N-domain)、H端區域(H-domain)及C端區域(C-domain)等三個功能區塊。其中N端區域至少含有一個精胺酸(arginine)或離胺酸(lysine)，此一功能區塊被認為能與細胞膜上與轉位(translocation)有關之蛋白質(Akitaet al. ,1990)或雙層脂(lipid bilayer)中的磷脂質結合(Deuerlinget al. ,1997)。H端區域緊接於N端區域之後，其帶有較多之疏水性胺基酸，在細胞膜中能形成α-螺旋結構。H端區域的中央之胺基酸通常為甘胺酸(glycine)或脯胺酸(proline)，能使訊息胜肽形成類似髮夾之結構並嵌入膜中。C-domain中含有訊息胜肽酶切割部位。當分泌性蛋白質轉位至胞外後，訊息胜肽酶會辨識C端區域中之切位，並將訊息胜肽切除。過去之研究顯示，訊息胜肽之改造可增進重組蛋白質之分泌表現量。

大腸桿菌外膜蛋白質A之訊息胜肽是由21個胺基酸(SEQ.ID NO.14)所組成。其中第九號胺基酸-丙胺酸位於疏水性區域(H端區域)。本發明利用定點突變技術將此胺基酸突變為疏水性更高之纈胺酸，並探討訊息胜肽之突變對重組突變毒素分泌表現量之影響。利用PCR反應增幅出融合有突變OmpA訊息胜肽之elt A及elt B，並依序嵌入pET29a中，可構築成pETOMPA9VELT。DNA序列見第十三圖(SEQ.ID NO.30)，突變OmpA訊息胜肽以粗體字表示。將表現質體轉形入BL21(DE3)，並進行蛋白質之誘導表現。由第十圖之結果顯示可以看出，重組突變毒素之表現量可進一步提升，分泌表現量約12.04 mg/L，此結果說明，OmpA訊息胜肽之改造可提升重組突變毒素之分泌表現量。

請參見表五Real-time RT-PCR之結果顯示，將大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽DNA置換為OmpA訊息胜肽或突變OmpA訊息胜肽，會提升突變毒素mRNA之總量。此結果顯示，訊息胜肽之置換會影響基因之轉譯或可增進mRNA之穩定度，進而提升重組毒素之表現。

6.重組突變大腸桿菌忌熱毒素之純化

利用大腸桿菌忌熱毒素能與半乳糖結合之特性，採用固定化半乳糖樹脂進行蛋白質純化。結果如第十四圖所示，利用此親和性層析法可獲得純度95%以上之重組突變毒素。

7.重組突變大腸桿菌忌熱毒素之佐劑效果

以增強型綠螢光蛋白質及豬肺炎黴漿菌黏附素P97之C端作為模式抗原，分別以腹腔注射及皮下注射之方式免疫小鼠，分析重組突變型毒素之佐劑效果。結果如表六所示，重組突變毒素具有佐劑效果，可增進免疫反應，所誘發之免疫反應為Th1/Th2混合型免疫反應，意即可同時誘發體液性免疫反應及細胞性免疫反應。

8.佐劑可添加於疫苗中，增加免疫之效力

本發明之重組突變型毒素如上表六所述，具有佐劑之效果；當置入疫苗中，可增強疫苗之效力，以防止病原菌或病毒之感染；具體之病原菌或病毒如下：豬隻病原菌如病原性大腸桿菌(Escherichia coli )、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli )、沙門氏桿菌(Salmonella sp.)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae )、巴氏桿菌(Pasteurella multocida )、豬鏈球菌(Streptococcus suis type 2)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis )、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes )、豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae )、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis )、丹毒菌(Erysipeloidrix insidiosia )、博德氏支管敗血症桿菌(Bordetella bronchiseptica )、氣腫疽桿菌(Clostridium chauvoei )、破傷風梭菌(Clostridium tetani )及赤痢螺旋菌(Treponema hyodysenteriae )等。

豬隻病毒如血球凝集性腦炎病毒(haemagglutinating encephalomyelitis virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)、豬腸病毒(swine enterovirus virus)、假性狂犬病病毒 (pseudorabies virus)、***病毒(foot and mouse disease virus)、豬流行性感冒(swine influenza virus)、第二型豬環狀病毒(porcine circovirus type 2)、豬生殖與呼吸綜合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)、豬痘病毒(swine pox virus)、豬小病毒(porcine parovirus)及豬瘟病毒(classical swine fever)等。

家禽病原菌如病原性大腸桿菌(Escherichia coli )、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli )、沙門氏桿菌(Salmonella sp.)、巴氏桿菌(Pasteurella multocida )、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes )、雞副嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum )、水禽雷氏桿菌(Riemerella anatipestifer )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum )、鸚鵡披衣菌(Chlamydia psittaci )、雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum )、骨膜炎黴漿菌(Mycplosma synoviae )、家禽結核菌(Mycobacterium avian )及白色念珠菌(Candida albicans )等。

家禽病毒如白血/腫瘤性疾病群病毒(leukosis/sarcoma group virus)、傳染性華氏囊病病毒(infectious bursal disease virus)、家禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus)、雞馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)、關節炎病毒(arthritis virus)、雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus)、禽痘病毒(fowl pox virus)、新城病病毒(Newcastle disease virus)、雞傳染性喉頭氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus)、腫頭症候群病毒(swollen head syndrome virus)及雞產蛋下降症候群病毒(egg drop syndrome virus)。

惟，本例示性之疫苗可為豬隻或家禽疫苗，但並不僅限於此；任何可利用本發明具有佐劑效果之重組突變型毒素，皆可製成適合於各生物體可使用之疫苗。

綜上所述，本發明之突變型大腸桿菌忌熱毒素及其製備方，具有下列優點：(1)EltA次單位經定點突變後，可獲得低毒性或無毒性之突變體，適合作為疫苗佐劑。突變體可利用大腸桿菌表現系統進行生產；(2)藉由改造毒素訊息胜肽之DNA的方式，提升毒素mRNA總量，進而增進突變毒素之產量。以此方式可獲得較大量之重組毒素，進而降低蛋白質佐劑之生產成本；(3)重組突變毒素可作為次單位疫苗，預防致病性大腸桿菌之感染。

其它實施態樣

所有揭露於本發明書之特徵係可使用任何方式結合。本說明書所揭露之特徵可使用相同、相等或相似目的的特徵取代。因此，除了特別陳述強調處之外，本說明書所揭露之特徵係為一系列相等或相似特徵中的一個實施例。

此外，依據本說明書揭露之內容，熟悉本技術領域者係可輕易依據本發明之基本特徵，在不脫離本發明之精神與範圍內，針對不同使用方法與情況作適當改變與修飾，因此，其它實施態樣亦包含於申請專利範圍中。

第一圖係本發明171、196及286菌株之內生性質體；第二圖係本發明利用PCR增幅171、196及286菌株之elt 操作組(operon)；第三圖係本發明171菌株elt 操作組之核苷酸序列(SEQ.ID NO.23)；elt A之序列係以斜體表示；第四圖係本發明196菌株elt 操作組之核苷酸序列(SEQ.ID NQ.24)；elt A之序列係以斜體表示；第五圖係本發明286菌株elt 操作組之核苷酸序列(SEQ.ID NQ.25)；elt A之序列係以斜體表示；第六圖係本發明171、196及286菌株EltA之胺基酸序列(SEQ.ID NO.26)；第七圖係本發明171、196及286菌株EltB之胺基酸序列(SEQ.ID NO.27)；第八圖係本發明大腸桿菌忌熱毒素基因突變策略及PCR產物之分析；(A)基因突變使用之引子組合；(B)利用DNA電泳分析PCR產物；第九圖係本發明突變大腸桿菌忌熱毒素DNA序列(SEQ.ID NO.28)；突變位置係以粗體字標示，且elt A之序列係以斜體表示；第十圖係本發明利用蛋白質電泳偵測重組突變大腸桿菌忌熱毒素之表現情形；第十一(A)圖係本發明置換大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽DNA使用之策略；第十一(B)圖係本發明置換大腸桿菌忌熱毒素A次單位及B次單位訊息胜肽DNA之PCR產物之分析圖；第十二圖係本發明融合OmpA訊息胜肽DNA之elt A及elt B之DNA序列(SEQ.ID NO.29)；OmpA訊息胜肽係以粗體字表示，且elt A之序列係以斜體表示；第十三圖係本發明融合突變OmpA訊息胜肽DNA 之elt A及elt B之DNA序列(SEQ.ID NO.30)；突變OmpA訊息胜肽以粗體字表示，且elt A之序列係以斜體表示；第十四圖係本發明重組突變大腸桿菌忌熱毒素之純化結果。

<110> 財團法人台灣動物科技研究所

<120> 突變型大腸桿菌忌熱毒素、其製備方法、增加免疫反應之佐劑及疫苗

<130>

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 10

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 11

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 13

<210> 14

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胺基酸

<400> 14

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 15

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 16

<210> 17

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 22

<210> 23

<211> 1632

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 1632

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 核苷酸

<400> 24

<210> 25

<211> 1628

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 核苷酸

<400> 25

<210> 26

<211> 258

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 胺基酸

<400> 26

<210> 27

<211> 124

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<220>

<223> 胺基酸

<400> 27

<210> 28

<211> 1148

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸

<400> 28

<210> 29

<211> 1358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸

<400> 29

<210> 30

<211> 1358

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸

<400> 30

Claims

一種製備突變型大腸桿菌忌熱毒素之方法，其包含：(a)提供一大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列，其至少包含一個A次單位及一個B次單位；(b)將該A次單位的第63號胺基酸突變為離胺酸之密碼子，其中該A次單位係包含胺基酸序列SEQ.ID NO.26；(c)將該A及B次單位中轉譯為訊息胜肽之DNA分別取代為轉譯為一大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之DNA；及(d)將該大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸突變為纈胺酸之密碼子，其中該大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽係包含胺基酸序列SEQ.ID NO.14；及(e)將該步驟(d)所製得之一突變大腸桿菌忌熱毒素之DNA置入一大腸桿菌表現系統以製得該突變型大腸桿菌忌熱毒素。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當執行該(e)步驟時，係先將該突變大腸桿菌忌熱毒素之DNA嵌入一質體，再將該質體轉形入該大腸桿菌表現系統。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在該(e)步驟之後，所產生之該突變型大腸桿菌忌熱毒素係採用一固定化半乳糖樹脂進行純化。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該突變型大腸桿菌忌熱毒素包含一個A次單位及五個B次單位。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(a)之大腸桿菌忌熱毒素之DNA序列係包含SEQ.ID NO 23、24或25。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該大腸桿菌忌熱毒素之B次單位係包含胺基酸序列SEQ.ID NO.27。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽係包含胺基酸序列SEQ.ID NO.14。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該A次單位的第63號胺基酸為絲胺酸。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該大腸桿菌外膜蛋白質之訊息胜肽之第9號胺基酸為丙胺酸。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當執行該(b)步驟時，係利用一引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該引子係包含SEQ.ID NO.1、2、3、4、5及6。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當執行該(c)步驟時，係利用一引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應。
如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該引子係包含SEQ.ID NO.7、8、9、10、11、12及13。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當執行該(d)步驟時，係利用一引子進行重疊延展聚合酶連鎖反應。
如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該引子係包含SEQ.ID NO.15、16、17及18。
一種突變型大腸桿菌忌熱毒素之表現質體，其包含SEQ ID NO.30。
如申請專利範圍第16項所述之突變型大腸桿菌忌熱毒素之表現質體，其中SEQ ID NO.30係嵌入pET29a中來進行表現。