TWI493038B - 用以製備流感疫苗之複合物、新型流感疫苗及其製備方法 - Google Patents

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用以製備流感疫苗之複合物、新型流感疫苗及其製備方法
本發明係關於一種用以製備流感疫苗之複合物、新型流感疫苗及其製備方法，尤指一種適用於具有金屬粒子之流感疫苗之複合物、新型流感疫苗及其製備方法。
流感病毒為一種核醣核酸(RNA)病毒，自1580年至20世紀初，曾引發三十多起大流行。每天都有人因流感病毒而感冒，並於季節變換之際，流感病毒常引發大流行，困擾人民的生活，且不分老少皆可能被感染。流感之嚴重性因人而異，大多數人幾天後就會好轉，但若有呼吸道、心臟及腎臟相關疾病、醣尿病或免疫不全者，特別是幼兒及老人，比較容易發生疾病惡化或如肺炎等之併發症之可能性，嚴重者甚至死亡，在美國每年約有兩萬人死於流感。
流感病毒其容易基因突變，使人反覆得病，目前用以對抗流感病毒之方法：使用藥物或施打疫苗，但兩者效果皆易失效。其中，目前抗流感之藥物有M2蛋白抑制劑(M2 blocker)和神經胺酸酶抑制劑(neuraminidase inhibitor)兩種。此外，目前疫苗大多為使用死毒疫苗(inactivated vaccine)，其包括全病毒疫苗(whole virion vaccine)和裂解病毒疫苗(split-particle vaccine)，再合併佐劑幫助免疫反應或延長病毒基因的釋放時間；或利用次單位疫苗(subunit vaccine)做為保護。目前所發展的疫苗雖然可降低罹患流感之嚴重性及其併發症，但對於突變或新型流感病毒，疫苗之保護力不佳且不持久，需要補打疫苗維持保護效力。
有鑑於此，目前亟需發展一種流感疫苗之複合物，製成新型流感疫苗，除了針對多種流感病毒都具有有效之保護力之外，不需合併佐劑也可引起較長且較好的免疫反應。
本發明之主要目的係在提供一種用以製備流感疫苗之金屬粒子-蛋白複合物，俾能形成與病毒間之強親合力，於生物體內可引起良好的免疫反應。
本發明之另一目的係在提供一種流感疫苗，俾能減弱病毒毒性，對突變病毒形成更有效的保護力。
本發明之再一目的係在提供一種流感疫苗之製備方法，俾能簡易製備一含金屬粒子之減毒性疫苗。
本發明之用以製備流感疫苗之金屬粒子-蛋白複合物，包括：一金屬奈米粒子；以及一醣類結合蛋白，其係形成於該金屬奈米粒子之表面上。
於本發明之金屬粒子-蛋白複合物中，該金屬奈米粒子之粒徑可為5-20 nm，較佳為7-18 nm，更佳為10-15 nm。其中，該金屬奈米粒子之材料可為金、鉑、或其合金，較佳為金，即該金屬奈米粒子較佳為一金奈米粒子。此金奈米粒子具有特殊的化學和物理性質，如高穩定性、高生物相容性、及與生物分子有良好的親合力，較佳適合應用於蛋白質或藥物輸送上。此外，金奈米粒子之尺寸最佳為13 nm，在藥物輸送上可達到良好的功效，且即使在高濃度下對生物體也不具生物毒性。更具體地，金奈米粒子對於蛋白質表面上的硫基(thiols)和胺基(amines)具有高親合力，可形成強金-硫(Au-S)鍵結，不易與蛋白質分離；且對於不同亞型之流感病毒，金奈米粒子皆有良好的結合效果。此外，本發明之金屬粒子-蛋白複合物製備後，其可於4℃下保存長達半年以上仍具有使用效力。
於本發明之金屬粒子-蛋白複合物中，該金屬奈米粒子之表面可形成有20-70個該醣類結合蛋白，較佳為30-60個該醣類結合蛋白，更佳為40-55個該醣類結合蛋白。其中該醣類結合蛋白係為甘露醣結合蛋白(mannose-binding protein,MBL)、表面活性蛋白A(surfactant protein A)、表面活性蛋白D(surfactant protein D)、共凝集素(Conglutinin)、CL-43、或半乳醣凝集素-1(galectin-1)；較佳為，半乳醣凝集素-1(galectin-1)。
其中，半乳醣凝集素-1在正常組織和發病組織上的分佈和表現不同，且多種形式細胞皆在病毒感染或發炎情況下產生半乳醣凝集素-1，其具有辨識病原表面之醣類之能力，參與多種生物反應如：細胞間附著、發炎、癌症發展、及宿主-病原間的互動。並且，半乳醣凝集素-1可調控多種先天免疫和後天免疫反應，如激活免疫細胞等。
此外，本發明之流感疫苗，包括：一流感病毒；以及一金屬粒子-蛋白複合物，其係與該流感蛋白結合，且該金屬粒子-蛋白複合物包括：一金屬奈米粒子；以及一醣類結合蛋白，係形成於該金屬奈米粒子之表面上。即，該流感疫苗包括上述金屬粒子-蛋白複合物，以減弱病毒毒性，對新型或突變病毒形成更有效的保護力；且該流感疫苗可提供佐劑功能：吸引樹突細胞(DCs)及刺激免疫反應，增加病毒被抗原呈現細胞吞噬。
另外，本發明更提供一種流感疫苗之製備方法，包括下列步驟：(A)提供一流感病毒、及一金屬粒子-蛋白複合物，其中該金屬粒子-蛋白複合物包括：一金屬奈米粒子、及一醣類結合蛋白，且該醣類結合蛋白係形成於該金屬奈米粒子之表面上；以及(B)混合該流感病毒、及該金屬粒子-蛋白複合物；即可得到如上所述之流感疫苗。
其中該金屬粒子-蛋白複合物可與該流感蛋白之一套膜蛋白結合。並且，一病毒效價單位之流感病毒可與10-1 -107 個金屬粒子-蛋白複合物結合；較佳為，與104 -107 個之金屬粒子-蛋白複合物結合；更佳為與106 -107 個之金屬粒子-蛋白複合物結合。於此，一病毒效價單位之流感病毒可與「10-1 」個之金屬粒子-蛋白複合物結合，即表示：一個金屬粒子-蛋白複合物可與10個流感病毒結合。此外，雖然一個金屬粒子-蛋白複合物最多可與10顆病毒結合，但在本發明之實施例中，並沒有使用最大量之病毒，其係由於本發明之目的係利用金屬粒子-蛋白複合物完全包裹或抑制病毒感染性，所以在比例上，較佳為使用金屬粒子-蛋白複合物數量多於流感病毒數量。
因此，透過本發明提供之簡易製作之流感疫苗，其係使用金屬奈米粒子作為一醣類結合蛋白之載體，以提升醣類結合蛋白與病毒間之親和力。此外，金屬粒子-蛋白複合物與病毒之間形成強烈親和力，進而抑制或減弱病毒之感染能力，使病毒呈現減毒狀態，減毒狀態的病毒對突變病毒形成更有效的保護力，除了針對多種流感病毒都具有有效之保護力之外，不需合併佐劑也可引起較長且較好的免疫反應。
 [製備例1]
首先，將108 ml之0.6 mM HAuCl4 與2 ml之195 mM檸檬酸鈉混合，在強力攪拌下沸騰10分鐘。接著，將所得之酒紅色懸浮液完全冷卻，在無菌下過濾至玻璃瓶內，儲存於室溫或4℃。然後，由穿透式電子顯微鏡(TEM)確認球狀之金奈米粒子(AuNP)為均勻散佈於液體中，且AuNP直徑約為13±1.2 nm。再經由450 nm波長下之吸光值或Au3+ 離子之起始濃度，計算出AuNP之粒子濃度為9.2 nM(235 μg/ml)。最後，取1 ml AuNP(約5-10x1012 個AuNP)加入20-40 μg半乳糖凝集素蛋白-1混合均勻，溫和搖晃後離心，可得金奈米粒子-半乳糖凝集素蛋白-1複合物(AuNP/Gal-1)，並將其懸浮於pH 7之10 nM磷酸鈉緩衝溶液。以下實驗例所使用之AuNP/Gal-1濃度或使用量，皆以改變結合在AuNP之Gal-1含量表示之。
[實驗例1]
取40μg/ml之AuNP/Gal-1加入512 HA之WSN/33(H1N1)病毒混合均勻，於室溫下作用1小時，接著離心以定量此疫苗組合物，再使用pH 6.5之1%(w/v)磷鎢酸與組合物作用3分鐘，以固定及負染該組合物。經由TEM於80 Kv加速電壓下觀察AuNP/Gal-1和WSN/33(H1N1)病毒的結合情形，結果如圖1所示。
請參閱圖1，左邊照片為WSN/33(H1N1)病毒、中間及右邊照片為40ug/ml之AuNP/Gal-1+105 個WSN/33(H1N1)病毒，於兩個不同視野下之TEM結果圖，較小之深色球狀顆粒為AuNP/Gal-1複合物。結果顯示：AuNP/Gal-1複合物可以準確地結合到流感病毒之表面，以不同形式及比例包裹於流感病毒套膜之外，可造成不同毒性之病毒。
[實驗例2]
以ELISA法測量AuNP/Gal-1複合物對流感病毒之親合力。首先，將50 μl之10 μg/ml Gal-1以0.1M碳酸酯/二碳酸酯緩衝溶液(0.1 M carbonate/bicarbonate buffer,pH 9.6)稀釋後，塗佈於96孔盤(Nunc-immuno plate,MaxiSorp surface,Nunc,Roskilde,Denmark)，置於室溫下隔夜。接著，以1%(w/v)BSA處理2小時，清洗後加入50 μl之4HA不同亞型的流感病毒，於4℃中培養24小時。之後，加入生物素化之山羊抗-半乳醣凝集素-1-抗體(10 ng,R&D,Minneapolis,MN)於室溫下作用2小時，再加入HRP-結合卵白素(HRP-conjugated streptavidin,1:200,R&D)於室溫下作用20分鐘。最後，以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(KPL)顯影，於室溫下5-10分鐘後以2N H2 SO4 終止酵素反應，偵測其在波長450 nm下之吸光值，結果如圖2所示；解離常數(Kd)以Prism 5.0套裝軟體(GraphPad Software,San Diego,CA)之非線性回歸分析計算為1/2 Vmax。
請參閱圖2，由上至下分別為WSN/33(H1N1)病毒、台灣/N2723/06(H3N2)病毒、英格蘭/12/64(H2N2)病毒、及菲律賓/2/62(H3N2)病毒，且實心組別為添加AuNP/Gal-1，空心組別為添加Gal-1。結果顯示：由上至下各組之Kd分別為28 nM、8 nM、2.4 nM、3.14 nM、1.07 μM、1.18 μM、0.48 μM、及0.89 μM，與添加Gal-1組別相比，AuNP/Gal-1複合物對於不同亞型的流感病毒有更高的親和力。藉此，本實驗例使用金奈米粒子作為載體，可提升醣類結合蛋白與病毒間之親合力。
[實驗例3]
儲存於4℃之AuNP/Gal-1複合物或Gal-1，於不同的儲存時間下觀察其穩定性。方法步驟同實驗例2，除了將病毒統一置換成2HA之WSN/33(H1N1)病毒，結果如圖3所示。
圖3之結果顯示：AuNP/Gal-1複合物之生物活性可以維持至少六個月，而Gal-1之生物活性在一個月後就減少了一半，二到六個月後更下降至原活性之20%。藉此，本實驗例使用之金奈米粒子可提升生物分子之穩定性。
[實驗例4]
以病毒斑計數試驗(Plaque assay)偵測病毒滴度(Viral titer)。將MDCK細胞懸浮液混合於U形96孔盤(5×104細胞/孔)，加入0.1HA之WSN/33(H1N1)病毒感染，再分別加入1 μg/ml之AuNP/Gal-1、Gal-1、AuNP/BSA、BSA、AuNP/PEG、或作為控制組之緩衝溶液，於室溫下作用2天，結果如圖4所示，且以log10 單位形成之病毒斑(PFU)/ml表示及利用t-test分析組間差異。
請參閱圖4，結果顯示：AuNP/Gal-1複合物表現出強力的抗病毒活性，但若將本實施例之AuNP/Gal-1，其中Gal-1以BSA或PEG取代，則此複合物之優良減毒性將消失；此外，以t-test分析，AuNP/Gal-1組與Gal-1、AuNP/BSA、BSA、及AuNP/PEG組之p值分別為0.033、0.019、0.014、0.0249、及0.0249，在統計上皆具有顯著地差異性。
[實驗例5]
將製備例1得到的AuNP/Gal-1複合物，再與1024HA病毒結合形成流感疫苗。其中，利用不同比例之AuNP/Gal-1複合物(各組濃度分別為10μg、20μg及50μg)包裹流感病毒，經由五週大之雌性C57BL/6小鼠模式檢測病毒感染力，每組使用五隻小鼠進行實驗。於此，從小鼠鼻腔感染此流感疫苗，每日觀察小鼠體重及存活情形，並利用Kaplan-Meier存活曲線及對數秩檢定法(log-rank test)進行存活分析，及利用t-test分析小鼠體重差異，結果如圖5、圖6所示。
圖5為小鼠存活曲線，和單獨注射流感病毒組(0 μg)相比，三組有包裹AuNP/Gal-1複合物之小鼠皆全數存活且具有顯著差異(p=0.03)。此外，單獨注射流感病毒組造成約70%的死亡率，可證實AuNP/Gal-1複合物有效減弱流感病毒之感染力；再配合參閱圖6為小鼠體重變化圖，僅單獨注射流感病毒組之小鼠體重嚴重減少，與另三組相比皆具有顯著差異(p<0.001)。再者，AuNP/Gal-1與單獨Gal-1相比，可較穩定抑制病毒之感染能力，且不會對正常細胞造成生物毒性。藉此，本實施例之流感疫苗為具有有效保護力之減毒性疫苗。
[實驗例6]
利用六~八週大之Balb/c小鼠檢測流感疫苗應用於抗體生產的能力，每組使用五隻小鼠進行實驗。於實驗第0天和第14天，經由肌肉注射兩劑之AuNP/Gal-1/流感病毒的流感疫苗，分別有512HA、256HA及128HA三種不同比例群組及作為控制組之食鹽水。接著，於第28天採集血清，進行流感病毒抗體IgM、IgG及IgA的分析，結果如圖7所示。
圖7顯示：與無流感病毒組相比，三種比例包裹之流感疫苗皆可促進流感抗體的生成，而在256HA比例之流感疫苗可達到最佳抗體生成效果。
綜合以上結果，半乳醣凝集素-1藉由與流感病毒表面蛋白結合進而抑制病毒感染能力，而利用金奈米則可加強半乳醣凝集素-1功能，提供較強的多價鍵結，進而提高與病毒的親和力。因此，AuNP/Gal-1複合物可有效發展為新型抑制流感病毒感染的疫苗。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1係本發明實驗例1之TEM結果圖。
圖2係本發明實驗例2之親和力分析結果圖。
圖3係本發明實驗例3之穩定性測試結果圖。
圖4係本發明實驗例4之病毒斑計數試驗結果圖。
圖5係本發明實驗例5之小鼠存活曲線圖。
圖6係本發明實驗例5之小鼠體重變化圖。
圖7係本發明實驗例6之抗體生產能力結果圖

Claims (16)

  1. 一種金屬粒子-蛋白複合物於製備流感疫苗上之用途，包括：一金屬奈米粒子；以及一醣類結合蛋白，係形成於該金屬奈米粒子之表面上；其中該金屬奈米粒子之粒徑係為10-15nm，且該金屬奈米粒子之表面係形成有30-60個該醣類結合蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之金屬粒子-蛋白複合物，其中該金屬奈米粒子之材料係為金、鉑、或其合金。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之金屬粒子-蛋白複合物，其中該金屬奈米粒子係為一金奈米粒子。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之金屬粒子-蛋白複合物，其中該醣類結合蛋白係為甘露醣結合蛋白(mannose-binding protein,MBL)、表面活性蛋白A(surfactant protein A)、表面活性蛋白D(surfactant protein D)、或半乳醣凝集素-1(galectin-1)。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之金屬粒子-蛋白複合物，其中該醣類結合蛋白係為半乳醣凝集素-1。
  6. 一種流感疫苗，包括：一流感病毒，其為256HA或512HA；以及一金屬粒子-蛋白複合物，係與該流感病毒結合，且該金屬粒子-蛋白複合物包括：一金屬奈米粒子；以及 一醣類結合蛋白，係形成於該金屬奈米粒子之表面上，其中該金屬奈米粒子之粒徑係為10-15nm，且該金屬奈米粒子之表面係形成有30-60個該醣類結合蛋白；其中一病毒效價單位之流感病毒係與10-1 -107 個之金屬粒子-蛋白複合物結合。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之流感疫苗，其中該金屬粒子-蛋白複合物係與該流感病毒之一套膜蛋白結合。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之流感疫苗，其中該金屬奈米粒子之材料係為金、鉑、或其合金。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之流感疫苗，其中該金屬奈米粒子係為一金奈米粒子。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之流感疫苗，其中該醣類結合蛋白係為甘露醣結合蛋白、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、或半乳醣凝集素-1。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之流感疫苗，其中該醣類結合蛋白係為半乳醣凝集素-1。
  12. 一種流感疫苗之製備方法，包括下列步驟：(A)提供一流感病毒、及一金屬粒子-蛋白複合物，其中該流感病毒為256HA或512HA，及該金屬粒子-蛋白複合物包括：一金屬奈米粒子、及一醣類結合蛋白，且該醣類結合蛋白係形成於該金屬奈米粒子之表面上；其中該金屬奈米粒子之粒徑係為10-15nm，且該金屬奈米粒子之表面係形成有30-60個該醣類結合蛋白；以及(B)混合該流感病毒、及該金屬粒子-蛋白複合物； 其中於步驟(B)中，係將一病毒效價單位之流感病毒與10-1 -107 個之金屬粒子-蛋白複合物混合。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製備方法，其中該金屬奈米粒子之材料係為金、鉑、或其合金。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之製備方法，其中該金屬奈米粒子係為一金奈米粒子。
  15. 如申請專利範圍第12項所述之製備方法，其中該醣類結合蛋白係為甘露醣結合蛋白、表面活性蛋白A、表面活性蛋白D、或半乳醣凝集素-1。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之製備方法，其中該醣類結合蛋白係為半乳醣凝集素-1。
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