TWI486171B - 具有增進之體內穩定性之抗神經生長因子（ｎｇｆ）抗體 - Google Patents

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具有增進之體內穩定性之抗神經生長因子(NGF)抗體

神經生長因子(NGF)為一種50多年前發現之分泌蛋白質，其為一種促進感覺神經元及交感神經元存活及分化之分子。NGF之β鏈僅負責NGF之神經生長刺激活性。β鏈均二聚化且併入較大蛋白質複合物中。NGF為被稱為神經營養素(neurotrophin)之神經營養因子家族之成員。NGF以高親和力結合至被稱為TrkA之原肌凝蛋白受體激酶。NGF亦能夠結合被稱為p75^NTR 之受體，該受體為腫瘤壞死因子受體超家族之成員，其亦與其他神經營養素交互作用。NGF之結構及功能綜述於例如Sofroniew,M.V.等人，(2001)Annu. Rev. Neurosci. 24 :1217-1281；Weismann,C.及de Vos,A.M.(2001)Cell. Mol. Life Sci. 58 :748-759；Fahnestock,M.(1991)Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165 :1-26中。

儘管NGF最初因其能夠促進神經元之存活及分化而被鑑別，但是越來越多的證據表明此等發展效應(developmental effect)僅為NGF生物學之一個態樣。特定言之，NGF已牽涉於持續性疼痛或慢性疼痛之傳輸及維持中。舉例而言，局部與全身投與NGF已顯示可引起痛覺過敏及異常疼痛(Lewin,G.R.等人，(1994)Eur. J. Neurosci. 6 :1903-1912)。在人體內靜脈輸注NGF會產生全身肌痛，而局部投藥除引發全身效應外亦引發注射部位痛覺過敏及異常疼痛(Apfel,S.C.等人，(1998)Neurology 51 :695-702)。此外，在某些形式之癌症中，過量NGF促進神經纖維之生長及浸潤，及誘導癌症疼痛(Zhu,Z.等人，(1999)J. Clin. Oncol .17 :241-228)。

慢性疼痛中牽涉NGF使得基於抑制NGF效應之治療方法備受關注(參見例如Saragovi,H.U.及Gehring,K.(2000)Trends Pharmacol. Sci. 21 :93-98)。舉例而言，使用一種可溶形式之TrkA受體阻斷NGF之活性，此顯示在不損傷病變神經元之細胞體的情況下顯著減少負責神經痛之神經瘤的形成(Kryger,G.S.等人，(2001)J. Hand Surg. (Am.)26 : 635-644)。

中和NGF活性之另一方法為使用抗NGF抗體，該等抗體之實例已經描述(參見例如PCT公開案第WO 2001/78698號、第WO 2001/64247號、第WO 2002/096458號、第WO 2004/032870號、第WO 2005/061540號、第WO 2006/131951號、第WO 2006/110883號；美國專利第7,449,616號；美國公開案第US 20050074821號、第US 20080033157號、第US 20080182978號及第US 20090041717號)。在神經痛(例如神經幹或脊神經結紮)之動物模型中，全身注射NGF之中和抗體預防異常疼痛與痛覺過敏(Ramer,M.S.及Bisby,M.A.(1999)Eur. J. Neurosci. 11 :837-846；Ro,L.S.等人，(1999)Pain 79 :265-274)。此外，用中和抗NGF抗體之治療在鼠類癌症疼痛模型中產生顯著的疼痛減輕(Sevcik,M.A.等人，(2005)Pain 115 :128-141)。

因此，鑒於上文，需要其他NGF拮抗劑。

本發明提供展現增進之體內穩定性的抗NGF抗體。特定言之，本發明提供一種包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變，較佳為鉸鏈區突變，且其中該抗體展現極長末端消除半衰期(terminal elimination half life)，諸如在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天且通常在約15天至約22天之範圍內(或在15天至22天之範圍內)、或在約15天至28天之範圍內(或在15天至28天之範圍內)、或在約21天至約28天之範圍內(或在21天至28天之範圍內)。此穩定抗NGF抗體(例如鉸鏈穩定抗體(hinge-stabilized antibody))亦展現在大鼠中之末端消除半衰期為至少8天，通常在約8天至約9天之範圍內(或在8天至9天之範圍內)。在其他實施例中，該穩定抗NGF抗體(例如鉸鏈穩定抗體)可展現在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天、或至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內(或在10天至40天之範圍內、或在15天至30天之範圍內)。

IgG4恆定區中之突變較佳為鉸鏈區突變。IgG4恆定區中之鉸鏈區突變甚至更佳包含SEQ ID NO: 9(其顯示人類IgG4恆定區之野生型胺基酸序列)之胺基酸位置108處之絲胺酸的突變。SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸更佳突變成脯胺酸。在一較佳實施例中，抗NGF抗體之人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。或者，其他可能的IgG4穩定突變描述於本文中。

本發明之較佳抗NGF抗體為抗體PG110，其重鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 13中且其輕鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 16中。因此，本發明提供一種包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該抗體包含含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的重鏈及含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的輕鏈。在另一實施例中，本發明提供一種包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸序列編碼的重鏈及由SEQ ID NO: 14之核苷酸序列編碼的輕鏈。在另一實施例中，本發明提供一種包含含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之重鏈的抗NGF抗體，其中該抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天(且通常在約15天至約22天之範圍內、或在15天至22天之範圍內、或在約15天至28天之範圍內、或在15天至28天之範圍內、或在約21天至約28天之範圍內、或在21天至28天之範圍內)，及/或在人體內之末端消除半衰期為至少10-30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在10天至40天之範圍內、或在15天至30天之範圍內)。重鏈較佳由SEQ ID NO: 11之核苷酸序列編碼。抗體較佳包含含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列的輕鏈。輕鏈較佳由SEQ ID NO: 14之核苷酸序列編碼。

在另一實施例中，抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 1(其顯示PG110之重鏈可變區)之胺基酸序列的重鏈可變區。在另一實施例中，抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 2(其顯示PG110之輕鏈可變區)之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一實施例中，抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一實施例中，抗NGF抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。

在另一實施例中，抗NGF抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3(其中SEQ ID NO: 3、4及5分別顯示PG110之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3)。在另一實施例中，抗NGF抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3(其中SEQ ID NO: 6、7及8分別顯示PG110之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3)。在另一實施例中，抗NGF抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。

抗NGF抗體較佳具有一或多種下列功能性質:

a)會與人類NGF結合，但不與衍生自人腦之神經營養因子(human brain-derived neurotrophic factor)(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合；

b)以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF；

c)抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ；

d)抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖；

e)抑制NGF依賴型雞背根神經節存活；

f)抑制NGF依賴型PC12細胞神經突生長。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體在投與個體時不會出現反彈效應(rebound effect)。舉例而言，可選擇抗體之投藥劑量及給藥頻率以使抗體在投與個體時不會出現反彈效應。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體能夠在投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後長時間減輕個體疼痛，例如持續至少約1週、或至少約2週、或至少約4週、或至少約8週、或至少約12週、或至少約1週至約12週，或持續至少1週、或至少2週、或至少4週、或至少8週、或至少12週、或至少1週至12週。

在一特定較佳實施例中，本發明提供一種抗NGF抗體，其具有長末端消除半衰期與長疼痛減輕持續時間之組合有利特徵。因此，本發明亦提供一種包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變(較佳為鉸鏈區突變)，其中該抗體在人體內之末端消除半衰期為至少10-30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內(或在10-40天之範圍內、或在15-30天之範圍內)，且其中該抗體減輕疼痛之持續時間為投與人類個體單次劑量之該抗體之後至少約1週至約12週(或投與人類個體單次劑量之該抗體之後至少約1週、或至少4週、或至少8週、或至少12週、或至少1週至12週)。鉸鏈區突變較佳包含SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸突變，較佳位置108處之絲胺酸突變成脯胺酸。人類IgG4恆定區更佳包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在各種實施例中，抗體可展現一或多種本文所述之功能性質。在一較佳實施例中，抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。

在另一實施例中，本發明提供一種包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，且其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。抗體在人體內之平均末端消除半衰期較佳為至少10-30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內(或在10-40天之範圍內、或在15-30天之範圍內)。抗體可進一步展現一或多種額外的功能性質，諸如會與人類NGF結合，但不與衍生自人腦之神經營養因子(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合；抑制NGF依賴型雞背根神經節存活；及/或抑制NGF依賴型PC12細胞神經突生長。該抗體減輕疼痛之持續時間較佳為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週至約12週(或至少1週、或至少4週、或至少8週、或至少12週)。較佳地，抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，或抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，或抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區及含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區。較佳地，抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，或抗體包含含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，或抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，或抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。

在各種較佳實施例中，本發明提供具有下列特徵之抗NGF抗體：抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之人類IgG4恆定區，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之人類IgG4恆定區，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之恆定區，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之恆定區，其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，且其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖，且其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之人類IgG4恆定區，其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變之人類IgG4恆定區，其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變的恆定區，其中該抗體以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，(ii)包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，及(iii)包含鉸鏈區突變的恆定區，其中該抗體以100 pM 或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF，以250 pM或250 pM以下之IC₅₀ 抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ，且以50 ng/ml或50 ng/ml以下之IC₅₀ 抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖。

包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變，且其中該抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天。

包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變，且其中該抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天。

在各種實施例中，本發明之抗NGF抗體可為例如嵌合抗體、人類化或人類抗體、或已除去潛在T細胞抗原決定基之抗體。

在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之抗NGF抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。

在另一態樣中，本發明提供一種減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀之方法，該方法包含投與該個體本發明之抗NGF抗體。NGF相關疾病及病狀之非限制性實例包括炎性疼痛、術後疼痛、神經痛、骨折疼痛(fracture pain)、痛風關節疼痛、帶狀疱疹後神經痛(post-herpetic neuralgia)、癌症疼痛、骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛、坐骨神經痛、與鐮狀細胞危象相關之疼痛、頭痛、痛經、子宮內膜異位、肌肉骨骼痛、慢性下背痛、肌肉纖維疼痛、扭傷、內臟疼痛(visceral pain)、卵巢囊腫(ovarian cyst)、***炎、膀胱炎、間質性膀胱炎(interstitial cystitis)、切口疼痛(incisional pain)、偏頭痛、三叉神經痛、灼傷及/或創傷疼痛、與外傷相關之疼痛、與肌肉骨骼疾病相關之疼痛、僵直性脊椎炎(ankylosing spondilitis)、關節囊病變(periarticular pathology)、骨轉移疼痛、HIV疼痛、由胰臟炎(pancreatitis)或腎結石引起之肢端紅痛症(erythromelalgia)或疼痛。NGF相關疾病及病狀之其他實例包括惡性黑素瘤(malignant melanoma)、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)及哮喘，諸如不受控制之哮喘伴隨嚴重氣管過度反應、及難醫治之咳嗽。對根據本發明之方法之治療而言，特定較佳疾病及病狀包括炎性疼痛(尤其骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛)、肌肉骨骼疼痛(尤其慢性下背痛)、神經痛(尤其糖尿病性神經病變)、癌症疼痛及骨轉移疼痛、間質性膀胱炎/疼痛性膀胱症候群、與慢性非細菌性***炎(chronic abacterial prostatitis)相關之疼痛、與子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤(uterine fibroid)相關之疼痛及術後疼痛。

雖然抗體可例如經靜脈內、皮下(例如經由注射筆(injection pen)或皮下植入物)、肌肉內、或關節內投與，但本文中描述了其他適合之投藥途徑。抗體之投與劑量較佳在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內。抗體之投與劑量可例如在約3 μg/kg至約3000 μg/kg之範圍內，其中較佳劑量包括100 μg/kg或300 μg/kg。在其他實施例中，雖然抗體之投與劑量在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內，但本文中描述了其他適合之劑量及劑量範圍。此外，可使用抗體之固定劑量調配物。

抗體可單獨投與或組合一或多種額外醫藥劑投與。舉例而言，可與本發明之抗NGF抗體組合投與第二醫藥劑，諸如NSAID、止痛劑(例如類鴉片止痛劑)、局部麻醉劑、神經阻斷劑(nerve block)、酚阻斷劑(phenol block)、治療性抗體、抗驚厥劑、抗抑鬱劑、局部辣椒鹼(topical capsaicin)、類固醇或抗病毒劑。用於與本發明之抗體組合治療之特定較佳第二醫藥劑包括類鴉片止痛劑，諸如嗎啡及其類似物。用於組合治療之其他較佳第二醫藥劑包括TrkA抑制劑及蛋白激酶C(PKC)抑制劑。

在一較佳實施例中，本發明提供一種減弱或抑制個體疼痛之方法，該方法包含投與該個體包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，且其中該抗體減輕個體疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少12週。抗NGF抗體較佳包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。抗NGF抗體較佳包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區。疼痛較佳選自由以下組成之群:骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛、骨轉移疼痛、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、與慢性非細菌性***炎相關之疼痛、與子宮內膜異位相關之疼痛、與子宮纖維瘤相關之疼痛及術後疼痛。抗NGF抗體之投與劑量較佳在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內。抗體較佳經靜脈內或皮下投與。抗體在人體內之末端消除半衰期較佳為至少10-30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在10天至40天之範圍內、或在15天至30天之範圍內)。

在另一較佳實施例中，本發明提供一種減弱或抑制個體神經生長因子(NGF)相關疾病或病狀以使該個體避免反彈效應的方法，該方法包含投與該個體包含人類IgG4恆定區的抗NGF抗體，其中該人類IgG4恆定區包含鉸鏈區突變，且其中該抗體在人體內之末端消除半衰期為至少10-30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在10天至40天之範圍內、或在15天至30天之範圍內)，且其中該抗體以一定的劑量及頻率投與以使個體避免反彈效應。人類IgG4恆定區較佳包含SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之突變。SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸較佳突變成脯胺酸。人類IgG4恆定區較佳包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。抗NGF抗體較佳包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。抗NGF抗體較佳包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區。抗體較佳與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。NGF相關疾病或病狀較佳為選自由以下組成之群的疼痛：骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛、骨轉移疼痛、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、與慢性非細菌性***炎相關之疼痛、與子宮內膜異位相關之疼痛、與子宮纖維瘤相關之疼痛及術後疼痛。抗NGF抗體之投與劑量較佳在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內。抗體較佳經靜脈內或皮下投與。

在另一態樣中，本發明提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀之藥劑中的用途。NGF相關疾病及病狀之非限制性實例包括上文所述者。較佳NGF相關疾病或病狀為疼痛。疼痛較佳選自由以下組成之群：骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛、骨轉移疼痛、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、與慢性非細菌性***炎相關之疼痛、與子宮內膜異位相關之疼痛、與子宮纖維瘤相關之疼痛及術後疼痛。

在另一態樣中，本發明提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體疼痛以致個體之疼痛減弱或抑制之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少12週的藥劑中的用途。

在另一態樣中，本發明提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀以使該個體避免反彈效應之藥劑中的用途。特定言之，抗體以一定的劑量及頻率投與以使個體避免反彈效應。

在其他態樣中，本發明提供編碼本發明之抗NGF抗體重鏈及/或輕鏈之核酸分子，以及包含此等載體之載體(例如表現載體)、包含此等載體之宿主細胞及使用本發明之宿主細胞表現抗NGF抗體之方法。

在另一態樣中，本發明提供一種減弱或抑制個體神經生長因子(NGF)相關疾病或病狀以使該個體避免反彈效應的方法。該方法包含投與該個體包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變(較佳為鉸鏈區突變)，且其中該抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天，更佳至少21天，且其中該抗體以一定的劑量及頻率投與以使個體避免反彈效應。在另一實施例中，抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期在約15天至約22天(或15-22天)之範圍內、或約15天至約28天(或15-28天)之範圍內、或約21天至約28天(或21-28天)之範圍內。在另一實施例中，抗體在大鼠中之末端消除半衰期為至少8天。在另一實施例中，抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在10-40天之範圍內、或在15-30天之範圍內)。較佳突變包括上文所述者。較佳抗體包括具有如上所述之序列及/或額外功能性質者。NGF相關疾病及病狀之非限制性實例包括上文所述者。

本發明亦提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀以使該個體避免反彈效應之藥劑中的用途。

本文中亦提供包含本發明之抗NGF抗體的套組。舉例而言，套組包含抗NGF抗體及使用該抗體治療NGF相關疾病或病狀的說明書。

本發明係關於如由例如食蟹獼猴之極長末端消除半衰期所證明展現增進之體內穩定性的抗神經生長因子抗體。本發明之抗體包括該抗體之人類IgG4恆定區之修飾，該修飾為在IgG4恆定區中引入突變，較佳在恆定區之鉸鏈區中引入突變。

為了可更輕易地瞭解本發明，首先定義某些術語。其他定義在通篇實施方式中闡述。

I.　定義

術語「神經生長因子」或「NGF」在本文中可互換使用，且包括變異體、同功異型物、同源物、直系同源物及旁系同源物。舉例而言，對人類NGF具有特異性之抗體可在某些情況下與來自除人類之外之物種的NGF交叉反應。在其他實施例中，對人類NGF具有特異性之抗體可對人類NGF具有完全特異性，且可能不會出現物種交叉反應性或其他類型之交叉反應性。術語「人類NGF」係指人類序列NGF，諸如包含人類NGF-β鏈之胺基酸序列，人類NGF-β鏈之前驅體形式之Genbank寄存編號為NP_002497，由Genbank寄存編號NM_002506之核苷酸序列編碼。人類NGF-β鏈序列與Genbank寄存編號NP_002497之人類NGF-β之不同之處在於具有例如保守取代或非保守區中之取代，其中人類NGF-β具有與Genbank寄存編號NP_002497之人類NGF-β實質上相同之生物功能。術語「大鼠NGF」係指大鼠序列NGF，諸如包含大鼠NGF-β鏈之胺基酸序列，大鼠NGF-β鏈之前驅體形式之Genbank寄存編號為XP_227525，由Genbank寄存編號XP_227525之核苷酸序列編碼。術語「小鼠NGF」係指小鼠序列NGF，諸如包含小鼠NGF-β鏈之胺基酸序列，小鼠NGF-β鏈之前驅體形式之Genbank寄存編號為NP_038637，由Genbank寄存編號NM_013609之核苷酸序列編碼。

如本文所用之術語「TrkA受體」係指NGF受體，此項技術中亦稱為原肌凝蛋白激酶受體A及1型神經營養性酪胺酸激酶受體(NTRK1)。人類TrkA受體之非限制性例示性序列包括Genbank寄存編號NP_001012331(同功異型物1)、NP_002520(同功異型物2)及NP_001007793(同功異型物3)之胺基酸序列。

如本文所用之術語「p75^NTR 受體」係指分子量為約75 kDa且結合NGF及其他神經營養素的神經營養素受體，該受體描述於例如Bothwell,M.(1996)Science 272 :506-507中。人類p75^NTR 受體之非限制性例示性序列為Genbank寄存編號NP_002498之胺基酸序列，由Genbank寄存編號NM_002507之核苷酸序列編碼。

如本文關於抗NGF抗體所用之術語「末端消除半衰期」係指一旦抗體之吸收與再分佈完成之後，如在投與抗體之個體血清中量測之抗體濃度降低一半所需之時間量。當使用一組個體時，可使用個體之幾何平均末端消除半衰期作為抗體之末端消除半衰期的量度。

如本文所用之術語「鉸鏈區突變」係指在免疫球蛋白恆定結構域之鉸鏈區中的突變，諸如點突變、取代、添加或缺失。

如本文所用之術語「抑制」係指生物活性之任何統計上顯著的減少，包括活性完全阻斷。舉例而言，「抑制」可指生物活性減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

如本文中可互換使用之術語「抗體」或「免疫球蛋白」包括完整抗體及保留本文所述之增進之體內穩定性的任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」包含經由二硫鍵互相連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為V_H )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域CH1、CH2及CH2。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為V_L )及輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。V_H 區及V_L 區可進一步再分為高變區(稱作互補決定區(CDR))，其間穿插有較保守區(稱作構架區(FR))。各V_H 及V_L 由按以下順序自胺基末端排列至羧基末端之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。

如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得的抗體，亦即除可極少量存在之可能的天然存在之突變以外，構成該群體之個別抗體為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。單株抗體可使用任何此項技術公認之技術製備，例如如Kohler等人，(1975)Nature ,256:495描述之融合瘤法、如例如參見例如Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474): 856-859描述之轉殖基因動物、重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)、或使用利用例如Clarkson等人，Nature ,352: 624-628(1991)及Marks等人，J. Mol. Biol. ,222: 581-597(1991)中描述之技術的噬菌體抗體文庫。單株抗體包括嵌合抗體、人類抗體及人類化抗體，且可天然存在或重組產生。

術語「重組抗體」係指利用重組方法製備、表現、產生或分離之抗體，諸如(a)自免疫球蛋白基因(例如人類免疫球蛋白基因)為轉殖基因的或轉染色體的動物(例如小鼠)分離的抗體或由其製備之融合瘤，(b)自經轉化以表現抗體的宿主細胞(例如轉染瘤)分離的抗體，(c)使用噬菌體呈現自重組組合性抗體文庫(例如含有人類抗體序列)分離的抗體，及(d)利用包括拼接免疫球蛋白基因序列(例如人類免疫球蛋白基因)至其他DNA序列之任何其他方法製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組抗體可具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，此等重組人類抗體可進行活體外突變誘發，且因此重組抗體之V_H 區及V_L 區之胺基酸序列為可能不天然存在於體內人類抗體生殖系譜系內的序列，儘管該等序列源自人類生殖系V_H 及V_L 序列及與人類生殖系V_H 及V_L 序列相關。

術語「嵌合免疫球蛋白」或嵌合抗體係指可變區源自第一物種且恆定區源自第二物種之免疫球蛋白或抗體。嵌合免疫球蛋白或抗體可例如經由遺傳工程改造自屬於不同物種之免疫球蛋白基因區段構築。

術語「人類化抗體」或「人類化免疫球蛋白」係指包括至少一條人類化抗體鏈或免疫球蛋白鏈(亦即至少一條人類化輕鏈或重鏈)的抗體或免疫球蛋白。術語「人類化免疫球蛋白鏈」或「人類化抗體鏈」(亦即「人類化免疫球蛋白輕鏈」或「人類化免疫球蛋白重鏈」)係指具有包括實質上來自人類免疫球蛋白或抗體之可變構架區及實質上來自非人類免疫球蛋白或抗體之互補決定區(CDR)(例如至少一個CDR，較佳兩個CDR，更佳三個CDR)之可變區的免疫球蛋白鏈或抗體鏈(亦即分別為輕鏈或重鏈)，且其另外包括恆定區(例如在輕鏈情況下，為至少一個恆定區或其一部分，且在重鏈情況下，較佳為三個恆定區)。術語「人類化可變區」(例如「人類化輕鏈可變區」或「人類化重鏈可變區」)係指包括實質上來自人類免疫球蛋白或抗體之可變構架區及實質上來自非人類免疫球蛋白或抗體之互補決定區(CDR)的可變區。

如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有可變區的抗體，在該等可變區中構架區與CDR區均源自如例如Kabat等人(參見Kabat等人，(1991)Sequences of proteins of Im munological Interest ，第五版，U.S. Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)所述之人類生殖系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自人類生殖系免疫球蛋白序列。人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或位點特異性突變誘發或由體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用之術語「人類抗體」不意欲包括源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。

如本文所用之「分離之抗體」意欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如特異性結合至NGF之分離之抗體實質上不含特異性結合除NGF以外之抗原之抗體)。此外，分離之抗體通常實質上不含其他細胞物質及/或化學物。

如本文所用之術語「特異性結合」及「選擇性結合」意謂抗體或其抗原結合部分對特定抗原或抗原決定基展現明顯的親和力，且一般不會與其他抗原及抗原決定基出現顯著交叉反應性。「明顯」結合或較佳結合包括結合親和力為至少10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹ M^-1 或10¹⁰ M^-1 。更佳親和力大於10⁷ M^-1 、較佳大於10⁸ M^-1 。本文所述數值之中間值亦欲屬於本發明之範疇內，且較佳結合親和力可由親和力範圍表示，例如10⁶ 至10¹⁰ M^-1 ，較佳為10⁷ 至10¹⁰ M^-1 ，更佳為10⁸ 至10¹⁰ M^-1 。「不會出現顯著交叉反應性」之抗體為不會明顯結合至非所要實體(例如非所要蛋白實體)的抗體。特異性或選擇性結合可根據此項技術中公認之任何測定該結合之方法(包括例如根據斯卡查德分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析法)測定。

如本文所用之術語「K_D 」意欲指特定抗體-抗原交互作用之解離平衡常數或抗體對抗原之親和力。在一實施例中，本發明之抗體結合抗原(例如NGF)之親和力(K_D )如使用表面電漿共振分析法或細胞結合分析法所測定，為約100 pM或100 pM以下(亦即或更佳)(例如為約90 pM、或約80 pM、或約70 pM、或約60 pM、或約50 pM、或約40 pM、或約30 pM)。在一較佳實施例中，抗體結合NGF之親和力(K_D )在約25-35 pM之範圍內。

如本文所用之術語「K_ass 」意欲指抗體締合成抗體/抗原複合物之締合速率常數。

本文所使用之術語「K_diss 」意欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數。

如本文所用之術語「IC₅₀ 」係指在體外或體內分析法中抑制反應至最大抑制反應之50%的程度(亦即介於最大抑制反應與未治療反應的中間值)的抗體濃度。

如本文所用之術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，但較佳為雙股DNA。如本文提及編碼結合至NGF之抗體或抗體部分(例如V_H 、V_L 、CDR3)之核酸時所用的術語「分離之核酸分子」意欲指該核酸分子中編碼抗體或抗體部分之核苷酸序列不含其他編碼與除NGF以外之抗原結合的抗體之核苷酸序列，其中其他序列可天然側接人類基因組DNA中之核酸。

術語「可操作地連接」係指使一核酸序列與另一核酸序列在功能上相關。舉例而言，若信號序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白，則其可操作地連接至該多肽的DNA；若啟動子或強化子影響編碼序列轉錄，則其可操作地連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點經定位以便促進轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為鄰接的，且在分泌前導序列之情況下，為鄰接的並處於閱讀相(reading phase)中。然而，強化子並不必需為鄰接的。連接係藉由在適宜的限制性位點處接合來實現。若此等位點不存在，則根據習知實務使用合成寡核苷酸接附子(adaptor)或連接子(linker)。當一核酸與另一核酸序列功能相關時，該核酸經「可操作地連接」。舉例而言，若啟動子或強化子影響編碼序列轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。就轉錄調控序列而言，可操作地連接意謂所連接之DNA序列為鄰接的，且當需要結合兩個蛋白質編碼區時，為鄰接的並處於閱讀相中。對於轉換序列(switch sequence)，可操作地連接指該等序列能夠實現轉換重組。

如本文所用之術語「載體」意欲指能夠轉運所連接之另一核酸分子的核酸分子。一類載體為「質體」，指內部可接合額外DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段接合至病毒基因組中。某些載體能夠在被引入該等載體的宿主細胞中自主複製(autonomous replication)(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中之後整合於宿主細胞基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因的表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，適用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。術語「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括起等效作用之其他形式的表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

如本文所用之術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指內部已引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此等術語不僅意欲指特定個體細胞，而且意欲指此類細胞之子代。因為在後續代中可能會因突變或環境影響而出現某些變化，所以實際上，雖然此子代可能不同於母細胞，但仍包括在本文所用之術語「宿主細胞」的範疇內。

如本文所用之術語「治療」係指本文所述之治療性或預防性措施。「治療」方法使用投與個體(例如患NGF相關疾病或病狀之個體)本發明之抗體以預防、醫治、延遲、降低該疾病或病狀之嚴重性或改善該疾病或病狀之一或多種症狀。

如本文所用之術語「NGF相關疾病或病狀」係指NGF活性牽涉或關聯或介導或促進疾病或病狀之一或多種症狀的疾病及病狀。

如本文所用之術語「個體」包括任何人類或非人類動物。在一特定實施例中，個體為人類。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、母牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。

如本文所用之術語「反彈效應」係指在單次或重複投藥之後的初期效用之後，個體中發生NGF螯合劑(諸如抗NGF抗體)療效消減。舉例而言，用抗NGF抗體之治療最初可減輕例如由發炎或神經損傷或其他病因引起之疼痛，此後為疼痛的劇烈程度最終變得與治療前大致相同或比治療前更劇烈的止痛療效消減時期。在另一實例中，在單次或重複投藥之後，抗NGF抗體可在個體中展示初始效用持續一段時間，諸如投藥後一週的時間(例如，投藥後第1-7天)，此後為療效消減時期，諸如投藥後1-2週的時間(例如，投藥後第7-14天)。此「反彈」時期之後可為抗NGF抗體療效恢復時期。舉例而言，在單次或重複投與抗NGF抗體之後可存在痛覺缺失之兩相分佈，伴隨療效降低或甚至痛覺放大之中間時期。此反彈效應可在例如臨床疼痛研究、疼痛實驗模型及/或抗NGF療效之其他模型中評估。此反彈效應可在反彈時期期間導致例如個體疼痛增加及/或不利事件(諸如自異常疼痛至感覺不良、感覺倒錯及感覺過敏或感覺遲鈍之感覺異常)增加。儘管不意欲受機制限制，但反彈效應可由NGF表現改變、TrkA或p75受體表現改變或信號傳導或在單次或重複投與抗NGF之後的初期療效之後導致療效暫時消減之任何其他機制引起。

以下子章節中進一步詳述本發明之各種態樣。

II.　本發明之抗體

A.增進之體內穩定性

本發明之抗NGF抗體之特徵在於如由體內所觀察到之長末端消除半衰期所表明，具有增進之體內穩定性。儘管不意欲受機制限制，但吾人認為抗體之長末端消除半衰期係由抗體之清除率降低引起，而非由抗體之分佈體積增加引起。本發明之抗體包含人類IgG4恆定區，該人類IgG4恆定區包含突變。較佳突變為鉸鏈區突變。鉸鏈區突變較佳包含SEQ ID NO: 9(其中SEQ ID NO: 9顯示野生型人類IgG4恆定區之胺基酸序列)之胺基酸位置108處之絲胺酸突變。鉸鏈區突變更佳包含SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸突變成脯胺酸。在一較佳實施例中，人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。

本發明之抗NGF抗體展現極長末端消除半衰期，諸如在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天，且通常在約15天至約22天之範圍內(或在15-22天之範圍內)、或在約15天至約28天之範圍內(或在15-28天之範圍內)、或在約21天至約28天之範圍內(或在21-28天之範圍內)。此穩定抗NGF抗體亦展現在大鼠中之末端消除半衰期為至少8天，通常在約8至約9天之範圍內(或在8-9天之範圍內)。如實例4中所詳述，PG110，一種本發明之抗NGF抗體，展現在食蟹獼猴中之平均末端消除半衰期為至少15天，且通常更長。舉例而言，在食蟹獼猴研究中，觀察到平均末端消除半衰期在約15天至約22天之範圍內。在另一食蟹獼猴研究中，觀察到平均末端消除半衰期在約21天至約28天之範圍內。此外，PG110展現在大鼠中之平均末端消除半衰期為約8天至約9天。此外，如此項技術中已知，人體內IgG之末端消除半衰期為猴中之約兩倍，吾人預測，本發明之抗NGF抗體(諸如PG110)在人體內之末端消除半衰期為至少10-30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或更佳至少30天、或至少40天、或在約10天至約40天之範圍內(或在10-40天之範圍內)、或在約15天至約30天之範圍內(或在15-30天之範圍內)。

PG110在食蟹獼猴中之末端消除半衰期顯著長於此項技術中業已報導之其他IgG4抗體在食蟹獼猴中之半衰期。舉例而言，業已報導CDP571(一種IgG4抗TNF抗體)在食蟹獼猴中之半衰期為約40-90小時(約1.6-3.8天)(參見Stephens,S.等人，(1995)Immunol. 85 : 668-674)。類似地，業已報導那他珠單抗(natalizumab)(一種IgG4抗整合素抗體)在食蟹獼猴中之半衰期為約3天(參見Refusal CHMP Assessment Report for Natalizumab,European Medicines Agency,London,2007年11月15日，參考文獻EMEA/CHMP/8203/2008)。

用於本發明中之較佳鉸鏈區突變為SEQ ID NO: 9中之位置108處之絲胺酸突變成脯胺酸的突變。此項技術中先前已描述此突變(參見Angal,S.等人，(1993)Mol. Immunol. 30: 105-108)且業已報導此突變可消除IgG4分子之異質性，詳言之形成含有單一重鏈及單一輕鏈之半抗體。因此，本發明亦涵蓋SEQ ID NO: 9之位置108處之除脯胺酸以外的胺基酸取代，其中該取代在消除IgG4分子之異質性(例如形成半抗體)方面實現與Ser突變成Pro之突變相同的效應。可如Angal等人，(1993)，同上中所述，評估位置108處之突變消除IgG4分子之異質性的能力。

除SEQ ID NO: 9之位置108處之修飾外或替代SEQ ID NO: 9之位置108處之修飾，亦已描述改良FcRn-IgG交互作用之親和力從而導致修飾之IgG半衰期延長的其他IgG鉸鏈區突變。此等額外或替代修飾之實例包括位於一或多個對應於以下之IgG恆定區殘基處的突變：Thr250、Met252、Ser254、Thr256、Thr307、Glu308、Met428、His433及/或Asn434(如Shields,R.L.等人，(2001)J. Biol. Chem .276 : 6591-6604；Petkova,S.B.等人，(2006)Int. Immunol. 18 : 1759-1769；Hinton,P.R.等人，(2004)J. Biol. Chem .279 : 6213-6216；Kamei,D.T.等人，(2005)Biotechnol. Bioeng. 92 :748-760；Vaccaro,C.等人，(2005)Nature Biotechnol .23 :1283-1288；Hinton,P.R.等人，(2006)J. Immunol. 176 :346-356中所進一步描述)。

此外，替代鉸鏈區突變，已描述IgG4恆定區之其他穩定修飾。舉例而言，在其他實施例中，如美國專利公開案20080063635中另外所述，人類IgG4恆定區之突變包含用IgG1 CH3區取代IgG4 CH3區、用IgG1 CH2及CH3區取代IgG4 CH2及CH3區、或用離胺酸取代IgG4恆定區之位置409(根據Kabat編號)處的精胺酸。在其他實施例中，如PCT公開案WO 2008/145142中另外所述，人類IgG4恆定區之突變包含取代Arg409、Phe405或Lys370(根據Kabat編號)，諸如用Lys、Ala、Thr、Met或Leu取代Arg409，或用Ala、Val、Gly或Leu取代Phe405。

可使用標準重組DNA技術，諸如編碼人類IgG4恆定區之核酸的定點突變誘發或PCR介導之突變誘發，將所要突變引入人類IgG4恆定區結構域中。此外，可將編碼抗體重鏈可變區之DNA引入編碼突變人類IgG4恆定區之表現載體中，以致可變區與恆定區可操作地連接，從而產生編碼恆定區為突變的人類IgG4恆定區之全長免疫球蛋白重鏈的載體。接著可使用表現載體利用標準重組蛋白質表現方法來表現全長免疫球蛋白重鏈。舉例而言，本發明之抗NGF抗體可如實例1中進一步詳述來構築。

可使用此項技術中已知之標準方法測定抗體之末端消除半衰期。舉例而言，在投與個體(例如食蟹獼猴、史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat))抗體之後，可在投藥之後各時間點獲得血液樣本，且可使用此項技術中已知之抗體濃度測定技術(諸如ELISA分析法)測定血液樣本之血清抗體濃度。可使用已知的藥物動力學方法計算抗體之末端半衰期，例如使用經設計用於計算藥物動力學參數之電腦系統及軟體(一個非限制性實例為使用WinNonlin軟體之SNBL美國藥物動力學分析系統(SNBL USA Pharmacokinetics Analysis System))。

B.抗體可變區

用於本發明之抗NGF抗體中之較佳抗體可變區為PG110抗體之重鏈及輕鏈可變區。PG110之重鏈可變區顯示於SEQ ID NO: 1中，且PG110之輕鏈可變區顯示於SEQ ID NO: 2中。因此，在一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區。在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區。

PG110重鏈(可變區及恆定區)之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 13中。此重鏈可由前驅體重鏈製備，該前驅體重鏈包括前導序列或信號序列，諸如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列。SEQ ID NO: 12之前驅體重鏈由SEQ ID NO: 11中所示之核苷酸序列編碼。

PG110輕鏈(可變區及恆定區)之全長胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 16中。此輕鏈可由前驅體輕鏈製備，該前驅體輕鏈包括前導序列或信號序列，諸如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列。SEQ ID NO: 15之前驅體輕鏈由SEQ ID NO: 14中所示之核苷酸序列編碼。

因此，在另一實施例中，本發明提供一種包含含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之重鏈的抗NGF抗體，其中該抗體在食蟹獼猴中之血清半衰期為至少15天。在另一實施例中，在食蟹獼猴中之血清半衰期可在約15天至約22天之範圍內(或在15-22天之範圍內)。在其他實施例中，在大鼠中之血清半衰期可為至少8天或在約8天至約9天之範圍內(或在8--9天之範圍內)。在其他實施例中，人體內之血清半衰期可為至少10-30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或至少40天、或在約10天至約40天之範圍內(或在10-40天之範圍內)、或在約15天至約30天之範圍內(或在約15-30天之範圍內)。重鏈較佳由SEQIDNO：11之核苷酸序列編碼。抗體之輕鏈較佳包含SEQIDNO：16之胺基酸序列。輕鏈較佳由SEQIDNO：14之核苷酸序列編碼。

在另一實施例中，本發明提供一種包含含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之重鏈及含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之輕鏈的抗NGF抗體。

在另一實施例中，本發明提供一種包含由SEQ ID NO: 11之核苷酸序列編碼之重鏈及由SEQ ID NO: 14之核苷酸序列編碼之輕鏈的抗NGF抗體。

倘若PG110之結合特異性由可變結構域之互補決定區(CDR)提供，則在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含PG110之重鏈的CDR、PG110之輕鏈的CDR或兩者皆有。PG110之重鏈CDR1、CDR2及CDR3分別顯示於SEQ ID NO: 3、4及5中。PG110之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3分別顯示於SEQ ID NO: 6、7及8中。因此，在一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區。在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區。在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，且包含含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體可包含含有與PG110之重鏈及/或輕鏈可變區同源之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可變區，且其中抗體保留PG110所展現之增進之體內穩定性。舉例而言，抗NGF抗體之重鏈可變區可包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列具有至少90%同源性、更佳至少95%同源性、更佳至少97%同源性且甚至更佳至少99%同源性的胺基酸序列。抗NGF抗體之輕鏈可變區可包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少90%同源性、更佳至少95%同源性、更佳至少97%同源性且甚至更佳至少99%同源性的胺基酸序列。

如本文所用，兩個胺基酸序列之間的同源性百分比等同於兩個序列之間的一致性百分比。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有之相同位置數的函數(亦即同源性百分比=相同位置數/位置總數×100)，此情形考慮為達成兩個序列之最佳比對所需引入之間隙數及各間隙之長度。可使用數學演算法進行序列比較及確定兩個序列之間的一致性百分比。舉例而言，可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller之演算法(Comput. Appl. Biosci .,4 :11-17(1988))確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該ALIGN程式使用PAM120權重殘差表(weight residue table)、間隙長度罰分(gap length penalty)12及間隙罰分(gap penalty)4。此外，可使用已併入GCG套裝軟體(可在http://www.gcg.com上獲得)之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J. Mol. Biol. 48 :444-453(1970))演算法確定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比，該GAP程式使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，及間隙權重(gap weight)16、14、12、10、8、6或4及長度權重(length weight)1、2、3、4、5或6。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體可包含含有PG110重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可變區，但其中一或多個保守取代已引入該(等)序列中，而抗體仍保留PG110所展現之增進之體內穩定性。舉例而言，抗NGF抗體之重鏈可變區可包含與SEQ ID NO: 1相比，除1、2、3、4或5個保守胺基酸取代以外，與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列一致的胺基酸序列。抗NGF抗體之輕鏈可變區可包含與SEQ ID NO: 2相比，除1、2、3、4或5個保守胺基酸取代以外，與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列一致的胺基酸序列。

如本文所用之術語「保守胺基酸取代」意欲指胺基酸修飾不顯著影響或改變含該胺基酸序列之抗體的結合或穩定性特徵。此等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可利用此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發，將修飾引入本案之抗體中。保守胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)。因此，PG110之可變區內之一或多個胺基酸殘基可經同一側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所述之功能分析法來測試改變之抗體之保留功能。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體包含抗原結合區(亦即可變區)，該等抗原結合區在NGF上與PG110抗體結合相同之抗原決定基，或與PG110交叉競爭結合至NGF。因此，在一實施例中，本發明之抗NGF抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。

此等交叉競爭抗體可基於其在標準NGF結合分析法中與PG110交叉競爭之能力鑑別。舉例而言，可使用標準ELISA分析法，其中重組NGF蛋白(例如人類NGF-β)固定於培養盤上，螢光標記一個該等抗體，且評估未標記抗體競爭以解離標記抗體之結合的能力。或者或另外，可使用BIAcore分析來評估該等抗體交叉競爭之能力。實例2中進一步詳述可適用於測試抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF之能力的結合分析法。

在其他實施例中，本發明之抗NGF抗體展現PG110抗體之一或多種功能性質。舉例而言，本發明之抗NGF抗體可展現一或多種下列功能性質：

a)會與人類NGF結合，但不與衍生自人腦之神經營養因子(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合；

b)以100 pM或100 pM以下之K_D 結合至人類或大鼠NGF；

c)抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR ；

d)抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖；

e)抑制NGF依賴型雞背根神經節存活；

f)抑制NGF依賴型PC12細胞神經突生長。

可使用實例2及3中詳述之體外分析法來評估此等功能性質。就抗體至人類NGF之特異性結合而言，如本文所用之術語「不與衍生自腦之神經營養因子(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合」意欲意謂在標準結合分析法(例如ELISA或如實例中所述之其他適合的體外分析法)中所觀察到之抗體結合至BDNF、NT-3或NT-4的量與結合之背景含量(例如對照抗體)相當，例如不高於背景含量之2倍，或相較於與人類NGF之結合(其中將與人類NGF之結合量設為100%結合)，與BDNF、NT-3或NT-4之結合少於5%。

在另一實施例中，本發明提供一種包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列(或其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸突變，較佳為位置108處之絲胺酸突變成脯胺酸)，且其中該抗體結合至人類或大鼠NGF之K_D 為100 pM或100 pM以下(或者，KD為300 pM或300 pM以下、200 mP或200 mP以下、150 pM或150 pM以下、75 pM或75 pM以下、或50 pM或50 pM以下)，抑制NGF結合至TrkA或p75^NTR 之IC₅₀ 為250 pM或250 pM以下(或者，IC₅₀ 為500 pM或500 pM以下、400 pM或400 pM以下、300 pM或300 pM以下、或200 pM或200 pM以下)，且抑制TF-1細胞之NGF依賴型增殖之IC₅₀ 為50 ng/ml或50 ng/ml以下(或者，IC₅₀ 為150 ng/ml或150 ng/ml以下、100 ng/ml或100 ng/ml以下、75 ng/ml或75 ng/ml以下、或40 ng/ml或40 ng/ml以下)。抗體在人體內之平均末端消除半衰期較佳為至少10-30天、或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或在約10天至約40天之範圍內(或在10-40天之範圍內)、或在約15天至約30天之範圍內(或在15-30天之範圍內)。或者或另外，抗體可展現在食蟹獼猴中之平均末端消除半衰期為至少15天，且通常在約15天至約22天之範圍內(或在15-22天之範圍內)、或在約15天至約28天之範圍內(或在15-28天之範圍內)、或在約21天至約28天之範圍內(或在21-28天之範圍內)。或者或另外，抗體可展現在大鼠中之末端消除半衰期為至少8天，通常在約8天至約9天之範圍內(或在8-9天之範圍內)。抗體可進一步展現一或多種額外的功能性質，諸如會與人類NGF結合，但不與衍生自人腦之神經營養因子(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合；抑制NGF依賴型雞背根神經節存活；及/或抑制NGF依賴型PC12細胞神經突生長。抗體減輕疼痛之持續時間較佳為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週至約12週。抗體較佳包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，或抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，或抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列的CDR1、CDR2及CDR3。抗體較佳包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區，或抗體包含含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，或抗體包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的輕鏈可變區，或抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體當投與個體時不會出現反彈效應(例如該抗體以一定的劑量及頻率投與以使個體避免反彈效應)。其他抗NGF抗體之動物模型與臨床研究中業已報導反彈效應，在該反彈效應中，在單次或重複投藥之後的效用初期之後，抗NGF抗體在個體中展現療效消減。舉例而言，業已在大鼠慢性縮窄損傷(CCI)模型中關於抗大鼠NGF抗體報導此類效應(亦稱為「反彈現象」)(Ro,L-S.等人，(1999)Pain 79 :265-274)。另外，業已報導使用抗NGF抗體他尼珠單抗(tanezumab)(亦稱為RN624、E3、CAS登記編號880266-57-9)之臨床疼痛研究，其中在初始止痛時期之後觀察到一段時期之不利事件(諸如對觸摸敏感及「麻痹」感(「pins & needles」sensation))增加(參見Hefti,Franz F.,Rinat Neuroscience,LSUHSC,Shreveport,Louisiana,2006年9月26日之陳述)。儘管不意欲受機制限制，但吾人認為本發明之抗NGF抗體之長末端消除半衰期使其避免展現反彈效應。因此，本發明之抗NGF抗體之其他優點包括相較於其他先前技術抗NGF抗體更穩定且更延長之體內活性。鑒於本發明之抗NGF抗體之長末端消除半衰期，可使用較低劑量(相較於其他抗NGF抗體)，且該抗體必要時可在更頻繁間隔下使用，從而可選擇劑量及定時治療方案(timing treatment regimen)以使個體避免反彈效應。

在另一實施例中，本發明之抗NGF抗體能夠長時間減輕個體疼痛，例如抗體能夠減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週至約12週(或1週至12週)。在一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週(或至少1週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約2週(或至少2週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約4週(或至少4週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約8週(或至少8週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約12週(或至少12週)。

可使用此項技術中建立之分析法評估抗體減輕個體疼痛的能力。適用於評估抗NGF抗體減輕疼痛之持續時間的動物模型描述於例如PCT公開案第WO 2006/131951號及美國專利公開案20080182978中。此等動物模型之非限制性實例包括由坐骨神經慢性縮窄引發之神經痛模型、涉及後爪切口之外科術後疼痛模型、涉及佛氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)誘導之關節炎的類風濕性關節炎疼痛模型及諸如Halvorson，K.G.等人，(2005)Cancer Res. 65: 9426-9435及Sevcik,M.A.等人，(2005)Pain 115: 128-141中所述之癌症疼痛模型。此外，可臨床評估人類疼痛減輕，且可基於用抗NGF抗體治療之人類個體所報導之疼痛程度來確定疼痛減輕的持續時間。

在其他實施例中，本發明之抗NGF抗體可包含此項技術中所述之抗NGF抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區。舉例而言，在本發明之抗NGF抗體中可使用如以下文獻中所述之抗NGF抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區：PCT公開案第WO 2001/78698號、PCT公開案第WO 2001/64247號、PCT公開案第WO 2002/096458號、PCT公開案第WO 2004/032870號、PCT公開案第WO 2004/058184號、PCT公開案第WO 2005/061540號、PCT公開案第WO 2005/019266號、PCT公開案第WO 2006/077441號、PCT公開案第WO 2006/131951號、PCT公開案第WO 2006/110883號、PCT公開案第WO 2009/023540號、美國專利第7,449,616號、美國公開案第US 20050074821號、美國公開案第US 20080033157號、美國公開案第US 20080182978號或美國公開案第US 20090041717號。

在其他實施例中，本發明之抗NGF抗體可包含由此項技術中已知用於產生單株抗體之標準方法製備之抗NGF抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該標準方法為諸如由Kohler及Milstein(1975)Nature 256: 495所述用於產生非人類單株抗體(該等抗體接著可人類化)的標準體細胞雜交技術以及噬菌體呈現文庫技術或使用表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物的方法。用於選擇抗體之噬菌體呈現文庫技術描述於以下中：例如McCafferty等人，Nature, 348:552-554(1990)；Clarkson等人，Nature,352: 624-628(1991)；Marks等人，J. Mol. Biol .,222: 581-597(1991)及Hoet等人，(2005)Nature Biotechnology 23,344-348；Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。使用表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物產生抗體之方法描述於以下中:例如Lonberg等人，(1994) Nature 368(6474): 856-859；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93；Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann. N.Y. Acad.Sci . 764: 536-546；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號(全部屬於Lonberg及Kay)；Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號(全部屬於Lonberg及Kay)；Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478；Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號。

在各種實施例中，本發明之抗NGF抗體可為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。此外，抗體可為潛在T細胞抗原決定基已消除之抗體。此項技術中已描述消除潛在T細胞抗原決定基以藉此降低抗體之潛在免疫原性的方法(參見例如Carr等人之美國專利公開案第20030153043號)。

可使本發明之抗體或抗體部分衍生或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)。因此，本發明之抗體及抗體部分意欲包括本文所述之衍生形式及其他修飾形式的PG110抗體。舉例而言，本發明之抗體或抗體部分可(藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式)功能性地連接至一或多個其他分子實體，諸如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙功能抗體)、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可介導抗體或抗體部分與另一分子(諸如抗生蛋白鏈菌素核心區或聚組胺酸標籤)締合的蛋白質或肽。

一種類型之衍生抗體係藉由交聯兩個或兩個以上抗體(相同類型，或不同類型，例如產生雙特異性抗體)而產生。適合之交聯劑包括具有兩個由適當間隔基隔開之反應性顯著不同之基團的雜雙官能交聯劑(例如間順丁烯二醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)；或同雙官能交聯劑(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)。該等鍵聯劑可購自Pierce Chemical Company,Rockford,IL。

可適用於衍生本發明之抗體或抗體部分之可偵測劑包括螢光化合物。例示性螢光可偵測劑包括螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素及其類似物。亦可用諸如鹼性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶及其類似酶之可偵測酶來衍生抗體。當用可偵測酶衍生抗體時，藉由添加被酶用於產生可偵測反應產物之額外的試劑來偵測。舉例而言，當存在可偵測劑辣根過氧化物酶時，添加過氧化氫及二胺基聯苯胺會產生可偵測之有色反應產物。亦可用生物素衍生抗體，且藉由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合來偵測抗體。

III.　抗體產生

本案之另一態樣係關於編碼本案之抗體的核酸分子。核酸可存在於完整細胞中、細胞溶解產物中或呈部分純化或實質上純之形式。當核酸由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶(CsCl banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術)自其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)純化時，其為「分離」或「變成實質上純」之核酸。參見F. Ausubel等人編，(1987) Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本案之核酸可為例如DNA或RNA，且可能含有或可能不含內含子序列。在一較佳實施例中，核酸為cDNA分子。本案之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。

本發明之一較佳核酸分子包含SEQ ID NO: 11之核苷酸序列。本發明之另一較佳核酸分子包含SEQ ID NO: 14之核苷酸序列。

一旦獲得編碼V_H 及V_L 區段之DNA片段，即可利用標準重組DNA技術進一步操縱此等DNA片段，例如將可變區基因轉換成全長抗體鏈基因以便可變區可操作地連接至恆定區(參見例如實例1)。如在此情形下所用之術語「可操作地連接」意欲意謂使兩個DNA片段接合以便由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框(in-frame)。

可使用此項技術中已知之方法在宿主細胞中產生抗體(例如Morrison,S.(1985)Science 229 :1202)。舉例而言，為了表現抗體，可將編碼重鏈及輕鏈之DNA***表現載體中，從而使基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列中。在此情形下，術語「可操作地連接」意欲意謂抗體基因接合至載體中，從而使該載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇而與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因***各別載體中，或更通常地，將兩種基因***同一表現載體中。利用標準方法(例如抗體基因片段及載體上互補限制性位點之接合，或若不存在限制性位點，則為鈍端接合(blunt end ligation))將抗體基因***表現載體中。另外，重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，從而使信號肽與抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即非免疫球蛋白之信號肽)。

除抗體鏈基因以外，重組表現載體通常載有控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、強化子及控制抗體鏈基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此等調控序列描述於例如Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可視諸如待轉化之宿主細胞之選擇、所要蛋白質之表現量等因素而定。供哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括引導蛋白質在哺乳動物細胞內高量表現的病毒元件，諸如源自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多形瘤的啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒性調控序列，諸如泛素啟動子或β-血球蛋白啟動子。此外，由不同來源之序列組成之調控元件，諸如SRα啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列(Takebe,Y.等人，(1988)Mol. Cell. Biol. 8 :466-472)。

除抗體鏈基因及調控序列以外，重組表現載體可載有額外序列，諸如調控該載體在宿主細胞中之複製的序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於內部已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，全部屬於Axel等人)。舉例而言，通常可選擇標記基因賦予內部已引入載體之宿主細胞對藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤)的耐藥性。較佳可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞中的甲胺喋呤選擇/擴增中)及neo基因(用於G418選擇)。

對於輕鏈及重鏈之表現，利用標準技術將編碼重鏈及輕鏈的表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。儘管理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表現抗體，但最佳在真核細胞(且最佳為哺乳動物宿主細胞)中表現抗體，因為此等真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更有可能裝配且分泌適當摺疊且具免疫學活性的抗體。業已報導抗體基因之原核表現不能以高產率產生活性抗體(Boss,M. A.及Wood,C. R.(1985)Immunology Today 6 :12-13)。

用於表現本案之重組抗體的較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括描述於Urlaub及Chasin,(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216-4220中之dhfrCHO細胞，其與例如如R. J. Kaufman及P. A. Sharp(1982)J. Mol. Biol. 159 :601-621中所描述之DHFR可選擇標記一起使用)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。另一較佳表現系統為揭示於WO 87/04462(屬於Wilson)、WO 89/01036(屬於Bebbington)及EP 338,841(屬於Bebbington)中之GS基因表現系統。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以使抗體在宿主細胞中表現或更佳使抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化法自培養基中回收抗體。

在一較佳實施例中，本發明提供一種編碼抗NGF抗體之表現載體，其中該載體包含編碼抗體重鏈之SEQ ID NO: 11的核苷酸序列及編碼抗體輕鏈之SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。本發明之較佳表現載體包含GS(麩醯胺酸合成酶)基因。在另一較佳實施例中，本發明提供一種包含本發明之表現載體的宿主細胞。本發明之較佳宿主細胞為CHO(中國倉鼠卵巢)細胞。在另一較佳實施例中，本發明提供一種表現抗NGF抗體之方法，該方法包含培養包含表現載體之宿主細胞，該表現載體包含SEQ ID NO: 11之核苷酸序列(編碼抗體重鏈)及SEQ ID NO: 14之核苷酸序列(編碼抗體輕鏈)，從而表現包含由SEQ ID NO: 11編碼之重鏈及由SEQ ID NO: 14編碼之輕鏈的抗NGF抗體。

在另一態樣中，本發明係關於一種製備在抗體恆定區中具有突變(例如鉸鏈區突變)之抗NGF抗體的方法，該方法包含例如利用標準重組DNA技術將適當突變引入恆定區中。舉例而言，本發明提供一種製備抗NGF抗體之方法，其中該抗體包含(i)包含分別具有SEQ ID NO: 3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)人類IgG4恆定區，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列(且例如其中抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天)，其中製備該抗體之方法包含使SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸突變成脯胺酸，產生包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列的人類IgG4恆定區。重鏈可變區較佳包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。輕鏈可變區較佳包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。重鏈較佳包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。輕鏈較佳包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。

IV.　醫藥組合物

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如一種含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配之本發明抗體的醫藥組合物。在較佳實施例中，雖然醫藥組合物適於經靜脈內、皮下(例如經由注射筆)或關節內投與，但本文中描述其他適合之投藥途徑。在一實施例中，組合物可包括本發明之多種(例如兩種或兩種以上)抗體(例如結合NGF上不同抗原決定基的抗體)之組合。

如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及全部溶劑、鹽、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。視投藥途徑而定，可以物質包覆活性化合物以保護化合物免受酸及可使化合物失活之其他自然條件作用。

「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所要生物活性且不賦予任何不想要毒理學效應的鹽(參見例如Berge,S.M.等人，(1977)J .Pharm .Sci . 66: 1-19)。此等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括由非毒性無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及類似物)以及由非毒性有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及類似物)衍生之鹽。鹼加成鹽包括由鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物)以及由無毒性有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物)衍生之鹽。

本發明之醫藥組合物可單獨投與或以組合療法(亦即與其他藥劑組合)投與。舉例而言，組合療法可包括本發明之組合物及至少一或多種額外醫藥劑。舉例而言，至少一或多種額外醫藥劑可分開投與或亦可併入組合物中。在一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體與第二醫藥劑組合投與，其中該第二醫藥劑係選自由以下組成之群：NSAID、止痛劑(包括類鴉片止痛劑及非典型止痛劑)、局部麻醉劑、神經阻斷劑、酚阻斷劑、治療性抗體、類固醇、抗驚厥劑、抗抑鬱劑、局部辣椒鹼或抗病毒劑。一類特別較佳之用於減輕疼痛之第二醫藥劑為類鴉片止痛劑。或者或另外，第二治療方案可與本發明之抗體組合使用，例如在減輕疼痛方面。此等第二治療方案之實例包括放射線療法(例如針對癌症疼痛)、外科手術(例如針對三叉神經痛之半月神經結及半月神經結後根燒蝕(針刺)手術)、催眠術及針灸術。

NSAID之實例包括乙醯化水楊酸類，包括阿斯匹靈(aspirin)；未乙醯化水楊酸類，包括雙水楊酸(salsalate)、二氟苯水楊酸(diflunisal)；乙酸類，包括依託度酸(etodolac)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)；丙酸類，包括非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉、奧沙普嗪(oxaprozin)；甲芬那酸類，包括美洛芬那酸鹽(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)；苯基丁氮酮(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)；COX-2抑制劑類，包括塞內昔布(celecoxib)、依託昔布(etoricoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)、盧米羅可(lumiracoxib)。止痛劑之實例包括撲熱息痛(paracetamol)(乙醯胺苯酚)、曲馬多(tramadol)、他噴他多(tapentadol)、辣椒鹼(局部)、類鴉片止痛劑及非典型止痛劑。類鴉片止痛劑之實例包括嗎啡、可待因(codeine)、蒂巴因(thebaine)、氫嗎啡酮(hydromorphone)、氫可酮(hydrocodone)、氧可酮(oxycodone)、氧化嗎啡酮(oxymorphone)、二氫脫氧嗎啡(desomorphine)、二乙醯嗎啡(diacetylmorphine)、菸鹼醯嗎啡(nicomorphine)、二丙醯基嗎啡(dipropanoylmorphine)、苄嗎啡(benzylmorphine)、乙基嗎啡、芬太尼(fentanyl)、哌替啶(pethidine)、持殺酮(methadone)、曲馬多及丙氧芬(propoxyphene)。非典型止痛劑之實例包括三環抗抑鬱劑、卡馬西平(carbazepine)、加巴噴丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、度洛西汀(duloxetine)及咖啡鹼(caffeine)。類固醇之實例包括關節內皮質類固醇(IAC)及強的松(prednisone)。治療性抗體之實例包括抗TNF抗體，諸如Remicade及Humira；以及抗CD20抗體，諸如Rituxan及Arzerra^TM 。抗病毒劑之實例包括阿昔洛韋(acyclovir)及磷酸奧斯他偉(oseltamivir phosphate)(Tamiflu)。

在一較佳實施例中，組合療法可包括本發明之抗NGF抗體及至少一或多種TrkA抑制劑(例如拮抗TrkA活性之化合物)。TrkA抑制劑可例如藉由與TrkA受體細胞外交互作用或藉由與TrkA信號轉導機構(signaling transduction machinery)細胞內交互作用(例如抑制TrkA激酶活性)而起作用。細胞外TrkA抑制劑之非限制性實例包括抗TrkA抗體(諸如美國專利公開案第20090208490號及美國專利公開案第20090300780號中所述之人類化抗TrkA抗體)及拮抗TrkA之NGF肽模擬劑(諸如Debeir,T.等人，(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :4067-4072中所述)。細胞內TrkA抑制劑之非限制性實例包括拮抗TrkA功能之細胞穿透肽(cell-penetrating peptide)(例如如Hirose,M.等人，(2008)J. Pharmacol. Sci. 106 :107-113；Ueda,K.等人，(2010)J. Pharmacol. Sci. ,2010年3月30日期中所述)及小分子抑制劑，諸如TrkA激酶抑制劑(例如如Wood,E.R.等人，(2004)Bioorg .Med .Chem .Lett . 14 :953-957；Tripathy,R.等人，(2008)Bioorg .Med .Chem .Lett . 18 :3551-3555中所述)。TrkA抑制劑之其他非限制性實例包括ARRY-470及ARRY-872(Array Biopharma)。

在另一較佳實施例中，組合療法可包括本發明之抗NGF抗體及至少一或多種蛋白激酶C(PKC)抑制劑(例如拮抗PKC活性之化合物)。

本發明之組合物可經由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或投藥模式將視所要結果而變化。載劑較佳適於靜脈內、關節內、皮下、肌肉內、非經腸、瘤內、鼻內、囊泡內、滑膜內、經口、黏膜、舌下、脊椎或表皮投藥，或經由滴入體腔(例如腹腔、胸膜腔、鼻竇)、或滴注於眼睛表面上、或經由吸入投藥滴入肺中。對於特定投藥途徑，可選擇適合之傳遞裝置以供使用。舉例而言，對於皮下或肌肉內投藥，可使用注射筆(例如可自投之注射筆)。此等注射筆(亦稱為注射器)在此項技術中為已知的，包括含有液體劑量之抗體者(諸如用於投與Humira之單次用注射筆)，且更佳為含有在即將注射之前復原成液體形式之固體劑量之抗體者。對於皮下投藥，亦可使用皮下植入物(subcutaneous implant)。另外，可藉由使用外部皮膚貼片(例如黏著貼片)達成經皮傳遞。亦可藉由注射乾粉(諸如可購自Glide Pharma之市售注射劑)達成經皮傳遞。此外，對於傳遞入肺中(例如在治療哮喘或難醫治咳嗽中)，可使用於噴霧裝置中的噴霧溶液。

活性化合物可與可防止化合物快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法均已取得專利權或一般為熟習此項技術者所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems ,J.R. Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

為了經由某些投藥途徑投與本發明之化合物，可能有必要用防止化合物失活之材料包覆化合物或將化合物與該等材料一起共投與。舉例而言，可投與個體於適當載劑(例如脂質體或稀釋劑)中之化合物。醫藥學上可接受之稀釋劑包括生理食鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及習知脂質體(Strejan等人，(1984)J. Neuroimmunol. 7:27)。

醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液，及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。醫藥活性物質之此等介質及試劑的使用在此項技術中為已知的。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其在本發明之醫藥組合物中之使用。亦可在組合物中併入輔助性活性化合物。

治療組合物通常須在製造及儲存條件下無菌且穩定。組合物可調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之規則結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)之溶劑或分散介質及其適合混合物。可例如藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒度、及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)，可使可注射組合物之吸收延長。

無菌可注射溶液可如下製備：藉由將所要量之於適當溶劑中之活性化合物與一種上文所列舉之成分或其組合合併，必要時，隨後進行滅菌微過濾。一般而言，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基礎分散介質及上文所列舉之所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其自無菌粉末之前述無菌過濾溶液中得到活性成分加任何其他所要成分的粉末。

給藥方案經調整以提供最佳所要反應(例如治療性反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可如由治療情況之緊急需要所指示，按比例降低或增加劑量。典型的單次劑量(其可根據如下文進一步所述之給藥時程來投與)視本文所述之因素而定，可在約0.1 μg/kg至1 μg/kg至3 μg/kg至30 μg/kg至300 μg/kg至3000 μg/kg(3 mg/kg)至30 mg/kg至100 mg/kg或100 mg/kg以上之任一範圍內。舉例而言，抗NGF抗體之投與劑量可為約1 μg/kg、約10 μg/kg、約20 μg/kg、約50 μg/kg、約100 μg/kg、約200 μg/kg、約300 μg/kg、約400 μg/kg、約500 μg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg或約3 mg/kg。在一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量在約3 μg/kg至約3000 μg/kg之範圍內。在另一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量為100 μg/kg。在另一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量為200 μg/kg。在另一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量為300 μg/kg。在另一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量為400 μg/kg。

對於數天、數週或數月或更長時間內之重複投藥，視病狀而定，持續治療直至出現症狀之所要抑制，或直至達成足夠的治療程度(例如降低疼痛)。例示性給藥方案包含投與約3 μg/kg至500 μg/kg之範圍內的初始劑量，隨後投與約3 μg/kg至500 μg/kg之抗NGF抗體的每月維持劑量。在另一實施例中，每月投與一次約200 μg/kg之劑量。在另一實施例中，每兩月投與一次約400 μg/kg之劑量。然而，視醫師所希望達成之藥物動力學衰減模式而定，其他給藥方案亦可能適用。舉例而言，在一些實施例中，涵蓋一週給藥一至四次。然而，倘若抗NGF抗體減輕疼痛之持續時間較長，則使用之給藥頻率可較低。在一些實施例中，每週一次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每7週一次、每8週一次、每9週一次、每10週一次、每15週一次、每20週一次、每25週一次、每26週一次或更長時間一次投與抗NGF抗體。在一些實施例中，每月一次、每2月一次、每3月一次、每4月一次、每5月一次、每6月一次或更長時間一次投與抗NGF抗體。

如實例6中另外所論述，在一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體經靜脈內投與(例如人類)之劑量在0.1 mg/kg至0.2 mg/kg之範圍內，較佳為0.15 mg/kg，每12週一次。在另一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體經皮下投與(例如人類)之劑量在0.2 mg/kg至0.4 mg/kg之範圍內，較佳為0.3 mg/kg，每12週一次。在其他實施例中，本發明之抗NGF抗體之投與劑量在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內。

出於投藥簡便性及劑量均一性考慮，尤其宜調配非經腸組合物呈單位劑型。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的物理不連續單位(physically discrete unit)；各單位含有經計算會產生所要治療效果之預定量的活性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格係藉由下列情況指定或直接取決於下列情況：(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效果，及(b)複配此類用於治療個體敏感性之活性化合物之技術中的固有限制。舉例而言，單位劑型之非限制性實例包括0.2 mg(針對約70 kg之人相當於3 μg/kg之劑量)、2 mg(針對約70 kg之人相當於30 μg/kg之劑量)及7 mg(針對約70 kg之人相當於100 μg/kg之劑量)。

醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血基酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。

調配物宜呈單位劑型，且可利用藥劑學技術中已知之任何方法來製備。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的物理上不連續單位；各單位含有經計算會產生所要治療效果之預定量的活性化合物以及所需醫藥載劑。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分的量應視所治療之個體及特定投藥模式而定。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成分的量一般將為產生治療效果之組合物的量。一般而言，以100%計，此量應在約0.001%至約90%活性成分，較佳約0.005%至約70%，最佳約0.01%至約30%之範圍內。

如本文所用之片語「非經腸投藥」及「非經腸投與」意謂除經腸及外部投藥以外的投藥模式，通常藉由注射達成，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、包膜內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、包膜下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。

可於本發明之醫藥組合物中使用之適合的水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用包衣物質(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒度、及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。

此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。此項技術中熟知之佐劑的特定實例包括例如無機佐劑(諸如鋁鹽，例如磷酸鋁及氫氧化鋁)、有機佐劑(例如角鯊烯)、油基佐劑、病毒顆粒(virosome)(例如含有膜結合血球凝集素及源自流行性感冒病毒之神經胺酸酶的病毒顆粒)。

可經由滅菌程序(同上)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物存在。亦可能希望在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之試劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。

當本發明之化合物以藥品形式投與人類及動物時，其可單獨給予或呈含有例如0.001至90%(更佳為0.005%至70%，諸如0.01%至30%)之活性成分以及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物給予。

不管所選擇之投藥途徑如何，可利用熟習此項技術者已知之習知方法將本發明之化合物(其可呈適合之水合形式使用)及/或本發明之醫藥組合物調配成醫藥學上可接受之劑型。

本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量可改變以獲得有效達成對特定患者、組合物及投藥模式而言所要的治療反應且對患者不具有毒性的活性成分之量。所選擇之劑量將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所用之本發明之特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之分泌速率；治療持續時間；與所用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或物質；所治療之患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史(medical history)；及醫學技術中所熟知的類似因素。一般熟習此項技術之醫師或獸醫可容易地確定並開具所需醫藥組合物之有效量。舉例而言，醫師或獸醫可以給予數次低於所需量之含量之醫藥組合物中所用之本發明化合物開始以達成所要治療效果，且逐漸增加劑量直至達成所要效果。一般而言，本發明之組合物之適合的日劑量應為有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。此類有效劑量一般將視上述因素而定。

治療組合物可用此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一較佳實施例中，本發明之治療組合物可用無針皮下注射裝置投與，該等裝置諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。適用於本發明之熟知植入物及模組的實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示一種用於以受控速率分配藥物的可植入式微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其揭示一種用於經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其揭示一種用於以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示一種用於連續藥物傳遞之可變流速可植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示一種具有多腔隔室之滲透式藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示一種滲透式藥物傳遞系統。熟習此項技術者已知許多其他此等植入物、傳遞系統及模組。

在某些實施例中，本發明之單株抗體可經調配以確保其適當的體內分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)會排除許多高親水性化合物。為確保本發明之治療化合物穿過BBB(若需要)，其可調配於例如脂質體中。關於製造脂質體之方法，參見例如美國專利4,522,811、5,374,548及5,399,331。脂質體可包含一或多個選擇性傳輸至特定細胞或器官中的部分，從而增進靶向之藥物傳遞(參見例如V.V. Ranade(1989)J. Clin. Pharmacol. 29: 685)。例示性靶向部分包括葉酸酯或生物素(參見例如Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗體(P.G. Bloeman等人，(1995)FEBS Lett. 357: 140；M. Owais等人，(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人，(1995)Am. J. Physiol. 1233: 134)，其不同種類可構成該等發明之調配物以及所發明分子之組分；p120(Schreier等人，(1994)J. Biol. Chem. 269: 9090)；亦參見K. Keinanen;M.L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion;I.J. Fidler(1994)Immunomethods 4: 273。

V.　使用本發明抗體之方法

在另一態樣中，本發明提供一種治療(例如減弱或抑制)個體NGF相關疾病或病狀之方法，該方法包含投與該個體本發明之抗NGF抗體。抗NGF抗體較佳用於減弱或減輕疼痛，例如與疾病或病狀相關之疼痛，其中該疼痛之發展或維持至少部分由NGF介導。NGF相關疾病或病狀之非限制性實例包括炎性疼痛、外科術後疼痛、術後疼痛(包括牙痛)、神經痛、周邊神經病變、糖尿病性神經病變、骨折疼痛、痛風關節疼痛、疱疹後神經痛、癌症疼痛、骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛、坐骨神經痛、與鐮狀細胞危象相關之疼痛、頭痛(例如偏頭痛、緊張性頭痛(tension headache)、叢集性頭痛)、痛經、子宮內膜異位、子宮纖維瘤、肌肉骨胳痛、慢性下背痛、肌肉纖維疼痛、扭傷、內臟疼痛、卵巢囊腫、***炎、慢性骨盆疼痛症候群、膀胱炎、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群及/或膀胱疼痛症候群、與慢性非細菌性***炎相關之疼痛、切口疼痛、偏頭痛、三叉神經痛、灼傷及/或創傷疼痛、與外傷相關之疼痛、與肌肉骨骼疾病相關之疼痛、僵直性脊椎炎、關節囊病變、骨轉移疼痛、HIV疼痛、由胰臟炎或腎結石引起之肢端紅痛症(erythromelalgia)或疼痛、惡性黑素瘤、休格倫氏症候群、哮喘(諸如不受控制之哮喘伴隨嚴重氣管過度反應)、難醫治之咳嗽、脫髓鞘疾病(demyelinating disease)、慢性酒精中毒、中風、丘腦性疼痛症候群、毒素所致之疼痛、化學治療所致之疼痛、肌肉纖維疼痛、炎性腸道病症、腸激躁症候群、炎性眼部病症、炎性或不穩定膀胱病症、牛皮癬、皮膚病患伴隨炎性組分、曬傷、心肌炎、皮炎、肌炎、神經炎、膠原蛋白血管疾病、慢性炎性病狀、炎性疼痛且伴隨痛覺過敏及異常疼痛、神經痛且伴隨痛覺過敏或異常疼痛、糖尿病性神經病變疼痛、灼性神經痛(causalgia)、交感神經維持疼痛(sympathetically maintained pain)、傳入神經阻滯症候群、上皮組織損傷或功能障礙、呼吸區、泌尿生殖區、腸胃區或血管區之內臟運動(visceral motility)失調、過敏性皮膚反應、搔癢症(pruritis)、白斑病、一般性腸胃障礙(general gastrointestinal disorder)、結腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管舒縮性鼻炎或過敏性鼻炎、支氣管病症、消化不良、胃食道逆流(gastroesophageal reflux)、胰臟炎及內臟痛(visceralgia)。

此外，NGF已牽涉於諸如***癌、甲狀腺癌、肺癌、泌乳素瘤及黑素瘤之癌症的增殖中。因此，在另一實施例中，可使用本發明之抗NGF抗體治療的NGF相關疾病或病狀為癌症，較佳為***癌、甲狀腺癌、肺癌、泌乳素瘤或黑素瘤。因此，在另一實施例中，本發明亦提供一種治療個體癌症之方法，該癌症較佳為***癌、甲狀腺癌、肺癌、泌乳素瘤或黑素瘤，該方法包含投與該個體本發明之抗NGF抗體。

此外，在另一實施例中，NGF相關疾病或病狀可為HIV/AIDS。使用本發明之抗NGF抗體阻斷NGF可阻斷經HIV感染的巨噬細胞，藉此治療HIV/AIDS。因此，在另一實施例中，本發明亦提供一種治療個體HIV/AIDS之方法，該方法包含投與該個體本發明之抗NGF抗體。

根據本發明之方法治療之特定較佳疾病及病狀包括炎性疼痛(尤其為骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛)、肌肉骨骼疼痛(尤其為慢性下背痛)、癌症疼痛、神經痛(尤其為糖尿病性神經痛)、骨轉移疼痛、間質性膀胱炎/疼痛性膀胱症候群、與慢性非細菌性***炎相關之疼痛、由子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤所致之疼痛及術後疼痛。

與子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤相關之疼痛及/或其他症狀包含痛經；慢性非月經性骨盆疼痛；***困難(dyspareunia)；排便困難(dyschexia)；月經過多(menorrhagia)；下腹部痛或下背痛；***症及低生育力(subfertility)；排尿困難(dysuria)；排尿腫脹及疼痛；噁心、嘔吐及/或腹瀉。症狀亦可包含與子宮內膜異位病變或位於腹腔外部之纖維瘤相關的症狀，包括例如表現為咯血、氣胸或血胸的胸子宮內膜異位症候群及表現為呼吸困難及肺部腫塊(pulmonary mass)的肺平滑肌症(pulmonary leiomyosis)。

在一特定較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體用於治療疼痛。所治療之疼痛類型較佳選自由骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛及子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛組成之群。因此，在一較佳實施例中，本發明提供一種治療個體疼痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體疼痛。疼痛較佳選自由骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛及子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛組成之群。因此，在一實施例中，本發明提供一種治療個體骨關節炎疼痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體骨關節炎疼痛。在另一實施例中，本發明提供一種治療個體慢性下背痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體慢性下背痛。在另一實施例中，本發明提供一種治療個體糖尿病性神經痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體糖尿病性神經痛。在另一實施例中，本發明提供一種治療個體癌症疼痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體癌症疼痛。在另一實施例中，本發明提供一種治療個體子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛之方法，該方法包含投與本發明之抗NGF抗體以治療該個體子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛。

在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療NGF相關疾病的抗NGF抗體。NGF相關疾病或病狀之非限制性實例包括上文所列者。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療疼痛的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療選自由以下組成之群之疼痛的抗NGF抗體：骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛及子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療骨關節炎疼痛的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療慢性下背痛的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療糖尿病性神經痛的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療癌症疼痛的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種如本文所述用於治療子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛的抗NGF抗體。

在一特定實施例中，本發明提供一種減弱或抑制個體疼痛之方法，該方法包含投與該個體包含人類IgG4恆定區之抗神經生長因子(NGF)抗體，其中該人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，且其中抗體減輕個體疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約12週(或至少12週)。疼痛較佳選自由骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛、子宮內膜異位疼痛及子宮纖維瘤疼痛組成之群。抗NGF抗體之投與劑量較佳在約0.1 mg/kg至約30 mg/kg之範圍內，或在一個本文所述之其他劑量範圍內。

在另一特定實施例中，本發明提供一種減弱或抑制個體神經生長因子(NGF)相關疾病或病狀以使個體避免反彈效應的方法，該方法包含投與個體包含人類IgG4恆定區的抗NGF抗體，其中人類IgG4恆定區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之鉸鏈區突變，且其中抗體在人體內之末端消除半衰期為至少10-30天(或至少10天、或至少15天、或至少20天、或至少25天、或至少30天、或至少40天、或在約10天至約40天之範圍內、或在10-40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在15-30天之範圍內)，其中抗體以一定的劑量及頻率投與個體以使個體避免反彈效應。SEQ ID NO: 9之胺基酸位置108處之絲胺酸較佳突變成脯胺酸。人類IgG4恆定區較佳包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。較佳地，抗體與包含含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合至NGF。NGF相關疾病或病狀較佳為選自由骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛、子宮內膜異位疼痛及子宮纖維瘤疼痛組成之群的疼痛。抗NGF抗體之投與劑量較佳在約0.001 mg/kg至約30 mg/kg之範圍內或在一個本文所述之其他劑量範圍內。更佳地，為了避免反彈效應，抗體之投與劑量在較低劑量範圍內，例如在0.001 mg/kg至1 mg/kg之範圍內、或在0.001 mg/kg至1 mg/kg之範圍內、或在0.001 mg/kg至0.5 mg/kg之範圍內、或在0.001 mg/kg至0.3 mg/kg之範圍內、或在0.01 mg/kg至1 mg/kg之範圍內、或在0.01 mg/kg至0.5 mg/kg或0.01 mg/kg至0.3 mg/kg之範圍內。更佳地，為了避免反彈效應，抗體之投與劑量在較低劑量範圍(如上所述者)內，且抗體之投與間隔更頻繁，諸如每週一次、或每兩週一次、或每四週一次。

本發明亦提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀之藥劑中的用途。NGF相關疾病或病狀之非限制性實例包括上文所列者。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療疼痛之藥劑之本發明的抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療疼痛之藥劑之本發明的抗NGF抗體，該疼痛係選自由以下組成之群：骨關節炎疼痛、慢性下背痛、糖尿病性神經痛、癌症疼痛及子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療骨關節炎疼痛之藥劑之本發明抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療慢性下背痛之藥劑之本發明抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療糖尿病性神經痛之藥劑之本發明抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療癌症疼痛之藥劑之本發明抗NGF抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於製造治療子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤疼痛之藥劑之本發明抗NGF抗體。在一較佳實施例中，抗NGF抗體之投與劑量在約3 μg/kg至約3000 μg/kg之範圍內，或投與劑量為100 μg/kg，或投與劑量為300 μg/kg。在另一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體之經靜脈內投與(例如人類)的劑量在0.1 mg/kg至0.2 mg/kg之範圍內，較佳為0.15 mg/kg，每12週一次。在另一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體之經皮下投與(例如人類)的劑量在0.2 mg/kg至0.4 mg/kg之範圍內，較佳為0.3 mg/kg，每12週一次。在其他實施例中，本發明之抗NGF抗體之投與劑量在0.1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在0.1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至30 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至20 mg/kg之範圍內、或在1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內。然而，上文醫藥組合物章節中闡述其他適合之劑量範圍及劑量。

在一較佳實施例中，抗NGF抗體經靜脈內投與。在另一較佳實施例中，抗NGF抗體經皮下或關節內投與。然而，上文醫藥組合物章節中闡述其他適合之投藥途徑。

在一較佳實施例中，本發明之抗NGF抗體減輕個體之疼痛，其中抗體已投與個體一段較長時間。舉例而言，在一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週至約12週(或至少1週至12週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約1週(或至少1週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約2週(或至少2週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約4週(或至少4週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約8週(或至少8週)。在另一實施例中，抗體減輕疼痛之持續時間為投與個體單次劑量之抗NGF抗體之後至少約12週(或至少12週)。

在另一實施例中，抗NGF抗體連同第二醫藥劑或第二治療方案一起投與。抗體及第二藥劑、或抗體及第二治療方案可同時投與或同時進行，或者，可首先投與抗體，隨後投與第二醫藥劑或進行第二方案，或可首先投與第二醫藥劑或進行方案，隨後投與抗體。適合之第二醫藥劑及第二治療方案的非限制性實例闡述於上文醫藥組合物章節中。與本發明之抗體組合使用之特別較佳之第二醫藥劑為類鴉片止痛劑。與本發明之抗體組合使用之其他較佳第二醫藥劑為TrkA抑制劑(例如細胞外TrkA抑制劑或細胞內TrkA抑制劑，如醫藥組合物章節中所詳述)及蛋白激酶C(PKC)抑制劑。

在另一態樣中，本發明提供一種減弱或抑制個體神經生長因子(NGF)相關疾病或病狀以使個體避免反彈效應的方法，該方法包含投與個體本發明之抗NGF抗體，諸如包含人類IgG4恆定區之抗NGF抗體，其中該人類IgG4恆定區包含突變(較佳為鉸鏈區突變)，且其中該抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期為至少15天。在另一實施例中，抗體在食蟹獼猴中之末端消除半衰期在約15天至約22天之範圍內(或在15-22天之範圍內)、或在約15天至約28天之範圍內(或在15-28天之範圍內)、或在約21天至約28天之範圍內(或在21-28天之範圍內)。在另一實施例中，抗體在大鼠中之末端消除半衰期為至少8天。在另一實施例中，抗體在人體內之平均末端消除半衰期為至少10-30天(或至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少40天、或在約10天至約40天之範圍內、或在10-40天之範圍內、或在約15天至約30天之範圍內、或在15-30天之範圍內)。較佳突變包括上文詳述者。較佳抗體包括具有上文詳述之序列及/或功能性質的抗NGF抗體。NGF相關疾病或病狀之非限制性實例包括上文詳述者。本發明亦提供本發明之抗NGF抗體在製造用於減弱或抑制個體NGF相關疾病或病狀以使個體避免反彈效應(例如，該抗體以一定的劑量及頻率投與以使個體避免反彈效應)之藥劑中的用途。

VI.　製品

包含本發明之抗體的套組亦在本發明之範疇內，該等套組視情況包括用於治療NGF相關疾病或病狀的說明書。套組可包括指示套組內含物之預定用途的標籤。術語標籤包括提供於套組上或與套組一起提供或以另外方式隨附於套組的任何書面行銷材料或記錄材料。

舉例而言，本發明亦提供一種包裝醫藥組合物，其中如本文所述之PG110抗體(具有SEQ ID NO: 13中所示之重鏈且具有SEQ ID NO: 16中所示之輕鏈)或衍生形式包裝於套組或製品內。本發明之套組或製品含有適用於治療(包括預防、治療及/或診斷)個體NGF相關疾病或病狀的材料。在較佳實施例中，NGF相關疾病或病狀為炎性疼痛(尤其為骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛)、肌肉骨胳疼痛(尤其為慢性下背痛)、神經痛(尤其為糖尿病性神經痛)、癌症疼痛(尤其為骨轉移疼痛)、與子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤相關之疼痛及術後疼痛。套組或製品包含容器及附於容器上或與容器一起之標籤或藥品說明書或印刷材料，該材料提供關於使用PG110抗體治療本文所述之NGF相關疾病或病狀的資訊。

套組或製品係指包含供投與治療NGF相關疾病或病狀之PG110抗體用之組分的包裝產品。套組較佳包含容納套組組分之盒子或容器，且亦可包括投與PG110抗體之方案及/或「藥品說明書」。該盒子或容器容納本發明之組分，其較佳包含於塑膠、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯器皿中。舉例而言，適合PG110抗體之容器包括例如瓶、小瓶、注射器、筆等。

術語「藥品說明書」用於指通常包括在治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於此等治療性產品使用之適應症、用法、劑量、投藥、禁忌症及/或警告的資訊。在一實施例中，本發明之藥品說明書告知將投與PG110用於治療之讀者(包括個體，例如購買者)PG110抗體指示用於治療如本文所述之NGF相關疾病或病狀。在一實施例中，藥品說明書描述PG110抗體之某些治療益處，包括減輕疼痛。在另一實施例中，藥品說明書可包括關於PG110抗體之劑量的說明。在另一實施例中，藥品說明書可包括關於PG110抗體之投藥途徑及投藥頻率的說明。在另一實施例中，本發明之藥品說明書亦可提供將接受PG110抗體之個體關於出於安全及療效目的之組合使用的資訊。舉例而言，在某些實施例中，套組進一步包含含有另一治療劑的第二醫藥組合物，其與關於投與該兩種治療NGF相關疾病或病狀之藥劑的說明書一起包裝或共同宣傳。使用本發明之套組治療之特別較佳之疾病及病狀包括炎性疼痛(尤其為骨關節炎或類風濕性關節炎疼痛)、肌肉骨骼疼痛(尤其為慢性下背痛)、神經痛(尤其為糖尿病性神經病變)、癌症疼痛及骨轉移疼痛、與子宮內膜異位及/或子宮纖維瘤相關之疼痛及術後疼痛。

以下實例中描述本發明之其他實施例。

以下實例進一步說明本發明，該等實例不應視為進一步限制本發明。本申請案通篇引用之序列表、圖及所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容皆明確以引用的方式併入本文中。

實例

實例1：構築具有突變IgG4鉸鏈區之抗NGF抗體PG110

在此實例中，藉由在IgG4恆定區之鉸鏈區中引入絲胺酸突變成脯胺酸之突變來產生一種突變形式的人類化抗NGF抗體。

使用人類化抗NGF抗體αD11之重鏈可變區及輕鏈可變區。人類化αD11抗體進一步詳述於PCT公開案WO 2005/061540及WO 2006/131951中。αD11之重鏈可變區的胺基酸序列(Hu-αD11 V_H )顯示於SEQ ID NO: 1中。αD11之輕鏈可變區的胺基酸序列(Hu-αD11 V_L )顯示於SEQ ID NO: 2中。Hu-αD11 V_H 之CDR1、CDR2及CDR3區分別顯示於SEQ ID NO: 3、4及5中。Hu-αD11 V_L 之CDR1、CDR2及CDR3區分別顯示於SEQ ID NO: 6、7及8中。

編碼Hu-αD11 V_H 之核酸序列之3'端連接至Lonza Biologic之IgG4-Pro恆定區(其編碼使恆定序列之胺基酸殘基108自絲胺酸變成脯胺酸的突變)。在5'端處引入鼠類IgG1衍生之信號序列以產生完全Hu-αD11重鏈cDNA序列。野生型人類IgG4恆定區之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 9中，而突變人類IgG4恆定區之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 10中。在SEQ ID NO: 9及10內，自絲胺酸(SEQ ID NO: 9)突變成脯胺酸(SEQ ID NO: 10)的胺基酸位於胺基酸位置108處。

編碼Hu-αD11 V_L 之核酸序列之3'端連接至人類κ恆定區(由Lonza Biologics提供)且在5'處引入鼠類IgG1衍生之信號序列以藉此編碼全長輕鏈可變區。

因為抗體欲在中國倉鼠卵巢(CHO細胞)中表現，所以進行包括使抗體序列適應灰倉鼠(Cricetulus griseus )(中國倉鼠)基因之密碼子偏好(codon bias)的密碼子優化(Geneart；使用GeneOptimizer^TM 軟體)。另外，若有可能，則避免GC含量極高(>80%)或極低(<30%)之區。在優化過程期間，避免以下順式作用序列基元:內部TATA盒、chi位點及核糖體進入位點；富含AT或富含GC之序列段；ARE、INS、CRS序列元件(涉及細菌中之載體複製)；重複序列及RNA二級結構；(隱蔽)剪接供體及受體部位及分支點；指定內部限制酶位點(Eco RI、Hind III、Pvu I及Not I)。抗體基因序列優化(包括密碼子優化)及抗體基因在CHO細胞中之表現進一步詳述於Lonza Biologics PLC所擁有的PCT申請案WO 2006/122822中。

將優化之重鏈及輕鏈可變區序列(包括信號序列)分別選殖於GS載體pEE6.4及pEE12.4(由Lonza Biologics提供)中，產生兩個單基因載體(SGV)。接著，藉由將重鏈載體之完全表現卡匣接合至輕鏈載體中來構築雙基因載體(DGV)以產生表現完全重鏈與輕鏈基因以及GS(麩醯胺酸合成酶)基因的單一載體。

所得突變抗體稱為PG110。完全PG110重鏈之核苷酸序列(包括信號序列、可變區及突變IgG4恆定區)顯示於SEQ ID NO: 11中。完全PG110重鏈之胺基酸序列(包括信號序列、可變區及突變IgG4恆定區)顯示於SEQ ID NO: 12中，其中胺基酸殘基1-19構成信號序列且胺基酸20-141構成可變區。不含信號序列之成熟PG110重鏈的胺基酸序列(包括可變區及突變IgG4恆定區)顯示於SEQ ID NO: 13中。

完全PG110輕鏈之核苷酸序列(包括信號序列、可變區及κ恆定區)顯示於SEQ ID NO: 14中。完全PG110輕鏈之胺基酸序列(包括信號序列、可變區及κ恆定區)顯示於SEQ ID NO: 15中，其中胺基酸殘基1-20構成信號序列且胺基酸21-127構成可變區。不含信號序列之成熟PG110輕鏈的胺基酸序列(包括可變區及κ恆定區)顯示於SEQ ID NO: 16中。

為了驗證PG110抗體之表現，將編碼PG110之重鏈及輕鏈的DGV短暫轉染至CHOK1SV細胞(由Lonza Biologics提供)中。將於補充有10%胎牛血清及6 mM L-麩醯胺酸之基於DMEM之培養基中的細胞(每孔0.125×10⁶ 個活細胞)塗於24孔培養盤中，且在37℃(10% CO₂ 培育箱)下培育隔夜。在轉染之前，用800 μl新鮮培養基替換接種培養基且在37℃下培育細胞1小時。

對於各轉染，將5 μg PG110 DGV再懸浮於100 μl轉染培養基(OptiMEM,Invitrogen)中。使用編碼另一IgG₄ /κ抗體之載體作為陽性對照組，且使用單獨緩衝液作為陰性對照組。對於各轉染，用100 μl轉染培養基稀釋5 μl脂染胺-2000(Lipofectamine-2000)試劑(Invitrogen)。在室溫下培育5分鐘之後，組合DNA及稀脂染胺試劑、混合且於環境溫度下靜置20分鐘。接著將此205 μl混合物添加至含有細胞之24孔培養盤之一個孔中。在37℃下培育細胞68-72小時。藉由離心收集培養物上清液且使之澄清，之後分析抗體之存在。

使用標準ELISA方法分析轉染細胞之培養基中的裝配IgG。此包括捕捉樣本及標準物於塗有抗人類IgG Fc之96孔培養盤上。用連接至辣根過氧化酶之抗人類κ鏈抗體及顯色受質四甲基聯苯胺來突顯出結合之分析物。顯色與樣本中所存在之裝配抗體的量成比例。由自市面上獲得之IgG₄ /κ抗體儲備液製備標準樣本。結果顯示編碼PG110重鏈及輕鏈之DGV能夠表現裝配抗體。

實例2：突變抗NGF抗體PG110之結合特徵

在此實例中，檢查PG110(如實例1中所述製備之突變抗NGF抗體)之結合特異性及結合動力學。

A.結合特異性

使用酶聯免疫吸附分析法(ELISA)結合分析法來確定PG110結合至人類神經營養素的選擇性概況。用以下塗佈ELISA培養盤：100奈克/孔之人類NGF(R&D Systems，目錄號256-GF)、腦衍生神經營養因子(BDNF)(R&D Systems，目錄號248-BD)、神經營養素3(NT3)(R&D Systems，目錄號267-N3)或神經營養素4(NT4)(R&D Systems，目錄號268-N4)。向塗有神經營養素之孔中添加濃度範圍在3 pM-3 nM之PG110。洗滌(含PBS之0.5%(v/v)Tween 20，pH 7.3)之後，使用與連接有抗生蛋白鏈菌素之鹼性磷酸酯酶(Sigma Aldrich，目錄號S2890)偶聯的生物素標記之抗人類IgG抗體(Rockland Immunochemical Inc.，目錄號609-1602)偵測PG110結合，隨後藉由添加4-甲基香豆素磷酸酯(4-methylumbelliferyl phosphate)(Sigma Aldrich，目錄號M3168)進行顯色反應。使用螢光計(在360 nm下激發；在440 nm下發射)定量反應產物。

結果概述於圖1之圖形中。PG110以濃度依賴方式結合至塗有人類NGF之孔中，半數最大結合濃度(half-maximal binding concentration)為726 pM(由單一分析培養盤上之一式三份測定得出)。相比之下，PG110對塗有人類BDNF、NT3或NT4之分析孔不顯示可量測結合，而該人類BDNF、NT3或NT4使用對此等神經營養素具有特異性之陽性對照抗體則可偵測到。此等結果表明當在至多3 nM之濃度下體外測試時，PG110特異性結合至人類NGF，且顯示與相關神經營養素無交叉反應性。

B.結合動力學

使用BIAcore分析來評估PG110與重組大鼠NGF(rrNGF)或重組人類NGF(rhNGF)之間的交互作用之結合動力學。

使用胺偶聯套組(GE Healthcare)經由一級胺基團將重組人類β神經生長因子(rhNGF)(R&D Systems，目錄號256 GF/CF)或重組大鼠β神經生長因子(rrNGF)(R&D Systems，目錄號556 GF/CF)共價固定於CM5感應器晶片(GE Healthcare，先前為Biacore AB,Uppsala,Sweden)上，以HBSEP(10 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，150 mM NaCl，3 mM乙二胺四乙酸(EDTA)及0.005% Tween20，pH 7.4)作為操作緩衝液。藉由以10 μl/min之流速注射400 mM N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺(EDC)與100 mM N-羥基丁二醯亞胺(NHS)(1:1，v/v)之混合物持續7分鐘來活化感應器晶片表面。用10 mM乙酸鈉(pH 4.0)稀釋β-NGF(rh或rr)至200 ng/ml，且將該稀溶液注射於活化表面上持續各種時間，得到不同表面密度。進行定量交互作用分析時，藉由注射50 μl稀β-NGF(接觸時間為5分鐘)來製備60 RU的表面密度。用70 μl(接觸時間為7分鐘)乙醇胺溶液(1 M，pH 8.5)使未反應之NHS酯失活。

用固定之NGF進行之實驗的參數如下：操作緩衝液：含有100 μg/ml牛血清白蛋白之HBSEP；流速：25 μl/min；溫度：37℃；配位體密度：60 RU/60 RU(針對rhNGF/rrNGF)；分析物：PG110；濃度：於操作緩衝液中2 nM、4 nM、8 nM、17 nM、33 nM及66 nM；接觸時間：240秒；解離時間：600秒；再生：2×1 min，10 mM甘胺酸，pH 1.5。

用GraphPad Prism軟體(5.01版，GraphPad Software Inc.,San Diego,CA)及BIAevaluation軟體(4.0.1版，GE Healthcare)進行數據及動力學評估，針對1:1朗繆爾結合模型(1:1 Langmuir binding model)擬合數據。

結果概述於下表1中(其中K_ass 指締合速率常數，K_diss 指解離速率常數，且K_D 指平衡解離常數)。數據指3組各別測定之平均值±(平均標準誤差)。

研究結果顯示，PG110與NGF之交互作用之特徵在於高親和力結合，且偵測到對於任一同源物種(人類對大鼠)而言親和力(K_D )無顯著差異。

使用藉由於木瓜蛋白酶-瓊脂糖凝膠(Thermo Scientific)上碎裂PG110所產生的PG110 Fab材料進一步分析結合動力學。在25℃下使用HBSEP作為操作緩衝液固定rhNGF。藉由以10 μl/min之流速注射200 mM EDC與50 mMNHS(1:1，v/v)之混合物持續7分鐘來活化感應器晶片表面。用10 mM乙酸鈉(pH 4.0)稀釋rhNGF至500 ng/ml，且將20 μl(接觸時間為2分鐘)該稀溶液注射於三種細胞之每一種的活化表面上以產生93.1、100.3及88.7 RU之固定程度。用70 μl(接觸時間為7分鐘)乙醇胺溶液(1 M，pH 8.5)使未反應之NHS酯失活。

在37℃下以50 μl/min之流速使250 μl含一系列濃度之PG110 Fab(0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5及25 nM)的含100 μg/ml牛血清白蛋白之HPSEP操作緩衝液穿過新鮮固定的rhNGF表面。監測解離30分鐘，且在交互作用分析完成之後，用一脈衝(30 μl)10 mM甘胺酸(pH 1.5)實現再生。另外，為了更精確確定極低k_diss ，監測各rhNGF表面上一種高濃度(100 nM)之PG110 Fab之解離，持續8小時，且用於定量解離速率常數(k_diss )。使用根據長時間解離量測所測定的固定k_diss 由1:1朗繆爾結合模型全面擬合數據。為了評估動力學常數之再現性，在三個新鮮固定之表面上一式三份進行分析。計算之動力學常數概述於表2中。

實例3：　突變抗NGF抗體PG110之功能特徵

在此實例中，在體外分析法中檢查PG110(如實例1中所述製備之突變抗NGF抗體)之各種功能性質。

A.抑制NGF結合至TrkA及p75 ^NTR 受體

進行放射性配位體結合研究以比較PG110對NGF與人類TrkA及p75^NTR 受體之結合的抑制效應。在最終濃度為0.01-100 nM之PG110存在下，將表現全長人類TrkA或p75^NTR 受體之HEK293細胞與2 nM¹²⁵ I-NGF一起培育。反應中亦包括未標記NGF(濃度自0-1 μM不等)。在高壁PT1276平底拋棄式管(Thermo Life Sciences)中進行反應。首先，組合放射性標記之NGF、未標記NGF及PG110抗體，且在室溫下在管中於結合緩衝液(1×PBS，0.9 mM CaCl，0.5 mM MgCl，0.1% BSA Fraction V，0.1%(w/v)葡萄糖)中在震盪下培育10分鐘。接著，添加200 μl製備之細胞(稀釋至5×10⁵ 個細胞/毫升)。在室溫下在劇烈震盪下再培育30分鐘之後，將各反應分入三個塑膠管(0.4 ml Microtube PE,Sarstedt 72.700)，各管添加100 μl反應。各微管已含有200μl含150 mM蔗糖之結合緩衝液。接著在4℃下以20,000×g離心此等管30秒以使細胞集結。蔗糖提供密度梯度，該密度梯度起螯合任何經置換之放射性標記NGF的作用。接著在乾冰/乙醇浴中冷凍管。接著將此等冷凍管之尖端移入各別塑膠管(Naiad Ltd)中以使用LKB Wallac小型γ計數器計數，藉此定量結合至細胞的¹²⁵ I-NGF。

結果說明於圖2A及2B之圖形中，其中PG110對NGF結合至TrkA之效應顯示於圖2A中，且PG110對NGF結合至p75^NTR 之效應顯示於圖2B中。PG110以濃度依賴方式抑制¹²⁵ I-NGF結合至TrkA及p75^NTR 受體，幾何平均(95% CI)IC₅₀ 值分別為170(88-331)pM及206(86-491)pM(兩者n=3)。同型對照抗體不抑制¹²⁵ I-NGF結合至任一受體。此等結果表明PG110體外有效阻斷人類NGF與其兩種受體的結合交互作用。

B. TF-1細胞增殖分析法

TF-1為表現人類TrkA且應答NGF而增殖的人類紅白血病細胞株。在此等實驗中，在10 ng/mL人類、大鼠或小鼠重組NGF存在下，與遞增濃度之PG110抗體一起培養TF-1細胞，且40小時後，使用基於黃色四唑鎓鹽MTT[溴化3-(4,5-二甲基噻唑2-基)-2,5-二苯基四唑鎓]代謝還原成紫色甲的比色法來定量細胞增殖。

在用於分析法之前，在含10%胎牛血清(FBS)之RPMI-1640中與2 ng/mlGM-CSF(R&D Systems，目錄號215-GM-50)一起培養TF-1細胞1週。洗滌細胞，再懸浮於RPMI-1640+10% FBS中，濃度為300,000個細胞/毫升，且再塗於96孔微量培養盤上(15,000個細胞/孔，50 μl)。在添加至96孔分析培養盤之後至少60分鐘，使細胞暴露至於含有PG110抗體之含10% FPB之RPMI-1640(50微升/孔)中的人類、大鼠或小鼠重組NGF(10 ng/ml)。製備含有NGF及測試抗體之培養基，2×最終分析濃度，至少30分鐘後，添加至預接種過的細胞中。分析0.6 ng/ml至24 μg/ml濃度範圍內之測試抗體。包括含有單獨培養基或含有TF-1細胞但無NGF(「細胞空白」)的對照孔。一式三份進行各處理。在40小時培育期(37℃，5% CO₂ )之後，使用MTT細胞增殖套組(ATCC，目錄號30-1010K)定量增殖。添加10 μl MTT試劑，之後在37℃下再培育4小時。隨後在室溫下在黑暗中在清潔劑(100微升/孔；輕輕混合)存在下培育各孔隔夜。此後，記錄570 nm下之吸光度。藉由減去細胞空白之平均值計算一式三份量測之最終平均OD值。

在PG110(0.6 ng/mL-24 μg/mL)存在下與NGF一起培育TF-1細胞產生細胞增殖之濃度相關抑制。結果說明於圖3A-3C之圖形中，其中圖3A顯示PG110處理對受人類NGF刺激之TF-1細胞增殖的效應，圖3B顯示PG110處理對受大鼠NGF刺激之TF-1細胞增殖的效應，且圖3C顯示PG110處理對受小鼠NGF刺激之TF-1細胞增殖的效應。PG110對測試NGF之所有同源物顯示類似的抑制效能，且IC₅₀ 值為約30 ng/mL。IC₅₀ 值概述於下表3中(IC₅₀ 值以ng/ml表示)：

TF-1細胞增殖分析法表明PG110等效中和人類或齧齒動物NGF對人類TrkA受體的活化。

C.抑制雞背根神經節存活

為了測試PG110抑制NGF對感覺神經元之效應的能力，使用利用自第8天雞胚獲得之背根神經節(DRG)細胞之初級培養物的體外分析法。在此等條件下，雞DRG之存活依賴於添加至培養基中的外源NGF的存在。

自第8天雞胚分離背根神經節，且收集於50 ml Falcon管中(5 ml F-12漢氏營養混合物(F-12 Ham's nutrient mixture)+Glutamax 1：GIBCO 31765-027)。在各實驗中，所收集之神經節總數為約400，其對應於約20個胚胎。隨後在37℃下以胰蛋白酶處理神經節5分鐘(胰蛋白酶-EDTA，Euroclone，ECB3052D)，且用10 ml注射器(20G「黃」針(「yellow」needle))解離4-5次，之後在800 rpm下離心3分鐘。

小心移除含胰蛋白酶之培養基之後，將細胞再懸浮於10 ml新鮮培養基(F-12漢氏營養混合物+Glutamax I)中，隨後重複解離程序，且調整培養基體積以使接種濃度為100,000-400,000個細胞/毫升。將細胞接種於無治療劑之含20%馬血清(Euroclone ECS0091L)之一半最終體積中，使用已塗有溶解於蒸餾水中之聚L-離胺酸(100×=1 mg/ml聚L-離胺酸氫溴酸鹽溶液；Sigma P2636)的24多孔培養盤(Falcon 353047)(在UV下30分鐘，隨後在無菌通風櫥中乾燥30分鐘)。

當細胞黏著於培養盤(於5%CO₂ 培育箱中30分鐘，37℃)時，製備2×濃度一半最終體積的NGF溶液或NGF/抗NGF抗體溶液，且逐孔添加以獲得正確的最終濃度(亦即，馬血清之最終%=10%；NGF之最終濃度=5 ng/ml)。包括含有DRG細胞而無NGF的對照孔。一式兩份測試各條件。在添加NGF或NGF/抗NGF混合物之後，將培養盤放回培育箱(5% CO₂ ，37℃)。48小時後藉由計數沿各孔之垂直直徑所觀測之所有DRG細胞來對細胞數目進行計分(Nikon TMS顯微鏡，放大10倍)。計數中僅包括DRG細胞，該等細胞可根據其形態特徵容易地鑑別，亦即具有長神經突之圓形鮮亮折射光的細胞。

在10 ng/ml至25 μg/ml之濃度範圍內測試PG110抗體中和重組人類NGF(rhNGF)、重組大鼠NGF(rrNGF)或重組小鼠NGF(rmNGF)的NGF中和效能。在此等實驗中，存活之100%抑制等同於在不存在抗NGF抗體情況下，細胞在無NGF下培養時所計數的細胞數目。反之，0%抑制等同於在不存在抗NGF抗體情況下，細胞暴露於5 ng/ml相關NGF同功異型物時所計數的細胞數目。

在PG110(10 ng/mL-25 μg/mL)存在下培育細胞導致細胞存活之濃度依賴型降低，所有NGF同源物種(n=1)之IC₅₀ 皆在10與50 ng/mL之間。此等數據顯示PG110抑制NGF對感覺神經元的活性。

D.抑制PC12細胞神經突生長

PC12為表現大鼠TrkA與p75NTR受體之大鼠嗜鉻細胞瘤(嗜鉻細胞衍生之腫瘤)細胞株。當在NGF存在下在塗有膠原蛋白之培養盤上培養時，PC12細胞分化成交感神經樣神經元，變成扁平且延伸之贅生物(神經突)。採用NGF介導之神經突生長之抑制作為PG110抑制NGF與大鼠TrkA及p75NTR受體之交互作用的能力之半定量體外量度。

藉由用無血清之培養基(含GlutamaxI之RPMI-1640，Gibco-Invitrogen 61870-010)洗滌100,000個細胞且於含有10% FBS及重組大鼠NGF(R&D Systems，目錄號556-NG-100)(100 ng/ml)之含Glutamax I的RPMI-1640中再塗於經膠原蛋白處理之塑膠培養瓶上(採用I型膠原蛋白(BD 35-4236)作為0.5 mg/ml工作溶液)來預致敏PC12細胞(ECAAC 88022401)(亦即預暴露於NGF中)。在接種之前，使細胞平緩穿過21G針至少5次以分解細胞凝塊。在預致敏1週期間，移除含NGF之培養基並更換兩次。

在此時期結束時，用無血清之培養基洗滌預致敏之PC12細胞，且在含濕氣培育箱(5% CO₂ ，37℃)中以胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA，Euroclone，ECB3052D)處理2-3分鐘。藉由添加含血清之培養基阻斷胰蛋白酶，且離心細胞，用無血清之培養基洗滌且再懸浮於含有10% FBS之含Glutamax-I的RPMI-1640中。使細胞平緩穿過21G針至少5次以分解細胞凝塊，之後再塗於經膠原蛋白處理之皮氏培養皿(Petri dish)上，密度為50,000個細胞/毫升。每個分析條件準備三個培養皿。進行抗體測試時，製備2×培育混合物(重組大鼠NGF+抗NGF)，1小時後，添加至預接種過的細胞中。NGF之最終濃度為20 ng/ml，而在以下四個稀釋濃度下測試抗NGF抗體：20 μg/ml、2 μg/ml、200 ng/ml及20 ng/ml。

72小時後，對NGF誘導之神經突生長進行計分。此時，移除培養基，且用無鈣及鎂之PBS(GIBCO，10010)洗滌細胞，且用含4%甲醛之PBS固定30分鐘。使用Nikon EclipseTE2000-E顯微鏡及Leica IM1000影像處理軟體獲得顯微鏡影像(放大20倍)。評估神經突生長之抑制，且基於顯示無分化表型(=不存在明顯確定之神經突)之細胞的數目得出計分(++；+/-；--)。

在PG110(20 ng/mL-20 μg/mL)存在下培育細胞會抑制NGF介導之神經突生長，其中在200 ng/mL下總抑制明顯，重點表明PG110為大鼠重組NGF與其天然大鼠神經營養素受體之間的交互作用之有效抑制劑。

實例4：突變抗NGF抗體PG110之體內穩定性

在此實例中，體內測定PG110抗體在大鼠中及在食蟹獼猴中之末端消除半衰期(T_1/2 )。

A.大鼠研究

在研究第1天及第56天，給予史泊格多利大鼠劑量為3 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg之PG110抗體的10分鐘靜脈內(IV)輸注。使用平均血清濃度及時間點進行毒動學數據評估，每組每時間點6隻動物。額定血液收集時間為：研究第1天給藥前及給藥後0.25、1、3、6及24小時以及研究第1天給藥後48、96、168、336、504、672、840、1008及1176小時。由Alta分析實驗室(Alta Analytical Laboratory)使用驗證之ELISA方法進行血清樣本生物分析。使用SNBL美國藥物動力學分析系統2.0(SNBL USA Pharmacokinetics Analysis System 2.0)及WinNonlin 4.0專業版軟體(Pharsight Corp.)進行藥物動力學數據分析。

靜脈內投藥後，T_max 值(達到最大血清濃度之時間)在0.25至1小時範圍內，即頭兩個樣本收集時間點。所有動物皆顯示兩相分佈(biphasic disposition)，其中末端消除半衰期為約8至9天。更特定言之，三個處理組之T_1/2 (以小時計)概述於下表4中：

因此，在大鼠中之組平均半衰期值在192-217小時(8-9天)範圍內。

B.第一猴研究

給予食蟹獼猴劑量為3 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg之PG110抗體之約30分鐘的單次靜脈內(IV)輸注。將動物分成雄性及雌性；對2隻雄性及2隻雌性測試各劑量(但僅1隻雌性在30 mg/kg下測試)。進行毒動學數據分析之額定血液收集時間為：給藥後即刻(輸注結束後2分鐘內)、輸注結束後0.25、1、3、6、24、48、96、168、336、504、672、840、1008、1176、1344、1512及1680小時。由Alta分析實驗室使用驗證之ELISA方法進行血清樣本生物分析。使用SNBL美國藥物動力學分析系統2.0及WinNonlin 4.0專業版軟體(Pharsight Corp.)進行藥物動力學數據分析。

靜脈內投藥後，自輸注開始量測之T_max 值(達到最大血清濃度之時間)在輸注結束至約1.6小時之範圍內。所有動物皆顯示兩相分佈(但僅1隻雌性經30 mg/kg處理，其在504小時時間點後顯示突然下降)，其中末端消除半衰期為約15-22天。更特定言之，六個處理組之T_1/2 (以小時計)概述於下表5中：

因此，食蟹獼猴中之組平均半衰期值在370-531小時(15-22天)範圍內。雖然雄性之平均半衰期值一般長於雌性，但鑒於所研究之動物數目較少，此是否為統計上顯著的差異並不明確。

C.第二猴研究

在四週時間內，每週給予食蟹獼猴PG110抗體之靜脈內輸注。在第1、8、15及22天，給予劑量為3 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg之PG110抗體之約30分鐘的靜脈內(IV)輸注。將動物分成雄性及雌性；對3隻雄性及3隻雌性測試各劑量。在以下額定時間點收集連續血液樣本：第1天及第22天給藥前、給藥後即刻(輸注結束2分鐘內)、輸注結束後0.25、1、3、6、24及168小時。在第15天給藥前自所有動物及在第22天最終劑量投與之後336、504、672、840、1008、1176、1344、1512、1680、1848、2016及2208小自恢復動物收集額外的樣本。輸注後24小時開始所列之小時數對應於藥物動力學第1、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84及92天。所有實際血液時間均轉換成自開始輸注起始。

由Alta分析實驗室使用驗證之ELISA方法進行血清樣本生物分析的PG110濃度分析。使用SNBL美國藥物動力學分析系統2.0及WinNonlin 4.0專業版軟體(Pharsight Corp.)(進行藥物動力學數據分析。

靜脈內投藥後，自輸注開始所量測之組平均T_max 值(達到最大血清濃度之時間)在約0.6小時至2.6小時範圍內。所有動物皆顯示兩相分佈，其中末端消除半衰期為約21-28天(503至685小時)。更特定言之，六個處理組之T_1/2 (以小時計)概述於下表6中：

*基於n=2值

因此，食蟹獼猴中之組平均半衰期值在約21-28天範圍內。雖然雄性之平均半衰期值一般長於雌性，但鑒於所研究之動物數目較少，所以此是否為統計上顯著的差異並不明確。

實例5：PG110人類藥物動力學

預期PG110在人體內之多相分佈下之半衰期為約10-30天(在10至40天之範圍內)。基於約0.25 μg/mL(在約0.13 μg/mL至約0.40 μg/mL之範圍內)之靶C_min 值，預期每4-12週10 mg(約0.15 mg/kg；在約0.1 mg/kg[5 mg]至約0.2 mg/kg[15 mg]範圍內)人類靜脈內劑量及每4-12週20 mg(約0.3 mg/kg；在約0.2 mg/kg[15 mg]至約0.4 mg/kg[30 mg]範圍內)皮下劑量為有效的。

人類藥物動力學推演(Human pharmacokinetics projection)係基於兩個物種(大鼠及猴)之濃度數據。使用多種方法推演人類藥物動力學，該等方法包括猴及大鼠藥物動力學參數尺度律、固定異速生長尺度律、及基於其他單株抗體之臨床前及臨床數據的方法。進行單相分佈與兩相分佈之推演。

方法1 ：人類藥物動力學推演係基於擬合兩個物種(大鼠及猴)之PG110濃度-時間概況的雙室模型。使用猴及大鼠藥物動力學參數之固定指數型異速生長尺度律來推演PG110之人類藥物動力學參數。

對於清除率：

對於分佈體積：

接著基於預測之人類CL及V₁ 計算PG110人類半衰期。預測之PG110人類半衰期為26天。

方法2 ：人類藥物動力學推演係基於兩個物種(大鼠及猴)之觀察數據。使用與方法1 中相同之方法推演人類CL及V。使用經修改的固定指數為0.25之異速生長尺度律推演PG110之人類半衰期：

使用方法2 ，預測之PG110人類半衰期為36天。

方法3 ：人類藥物動力學推演係基於大鼠及猴中之PG110數據及其他單株抗體之臨床前及臨床藥物動力學參數。尺度律係基於大鼠及猴中所觀察到之PG110半衰期且基於其他單株抗體之半衰期的大鼠/人類及猴/人類比率。首先比較大鼠及猴中之其他單株抗體之估算藥物動力學參數(清除率、分佈體積及半衰期)與臨床研究中之彼等參數。估算大鼠、猴與人類之間的差異，以大鼠/人類及猴/人類比率表示。接著基於PG110在大鼠或猴中之藥物動力學參數且以其他單株抗體之大鼠/人類或猴/人類比率為修正值估算PG110之人類藥物動力學參數。使用方法3 ，預測之PG110人類半衰期為11-29天。

R/H：大鼠/人類，M/H：猴/人類

方 法4 ：人類藥物動力學推演係基於擬合兩個物種(大鼠及猴)之PG110濃度-時間概況的雙室模型。使用猴及大鼠藥物動力學參數之回歸型異速生長尺度律推演PG110之人類藥物動力學參數。

對於清除率與分佈體積：

Log (藥物動力學參數)=a ×Log (BW )+b

基於大鼠及猴藥物動力學參數及體重(BW)進行線性回歸以估算斜率(a)及截距(b)。接著使用典型的人類BW及估算之斜率及截距估算PG110之人類藥物動力學參數。

接著基於預測之人類藥物動力學參數計算PG110人類半衰期。預測之PG110人類半衰期為12天。

基於此等方法，預期PG110在人體內之兩相分佈下之半衰期為約15-30天(在10至40天之範圍內)，(預測之藥物動力學參數：V₁ =2.5 L，CL=5.0 mL/hr，V₂ =2.5 L，CL_D =40 mL/hr)。

實例6：用PG110處理人類之骨關節炎

起始人類臨床研究以測試PG110在患膝部骨關節炎所致之疼痛的患者中的安全性、耐受性及藥物動力學。研究之設計及初步結果描述如下。

在此I期單中心安慰劑對照雙盲單遞升劑量研究中，評估六個(6)劑量：0.003、0.01、0.03、0.1、0.3及1 mg/kg。每個劑量，一組患膝部骨關節炎所致之疼痛的7位患者(總計42名患者)，每組按6:1比率隨機分配至活性劑處理或安慰劑處理。在第0天早晨清淡早餐之後，在2小時間隔內，靜脈內投與各患者單次劑量之PG110或安慰劑。患者留在臨床藥理中心(Clinical Pharmacology Unit，CPU)直至輸注開始後約24小時(第1天)，且在研究之第4、7、14、21、28、56及84天復診。

在第0天(給藥前、1、2、3、6及12小時)及給藥後第1、4、7、14、21、28、56及84天獲取PG110分析用血液樣本。使用驗證之ELISA分析法測定PG110之血清濃度。亦對第0(給藥前)、14、28、56及84天之樣本進行抗PG110分析法。

在研究中進行藥效學評估，包括患者疼痛評估、西安大略大學(Western Ontario University)及麥克馬斯特大學(McMaster University)(WOMAC^TM )骨關節炎指數問卷、麥-吉疼痛問卷(McGill pain questionnaire)、6分鐘步行測試、膝部超音波及hs-CRP。

患者疼痛評估之初步結果概述於表11中。使用患者疼痛評估作為疼痛強度評估。要求患者按0-100 mm VAS計分其回答，其中0 mm等同於無疼痛且100 mm等同於最強烈疼痛。

基於初步藥效學數據，在0至0.3 mg/kg PG110劑量範圍內觀察到明顯的劑量反應。

基於維持藥效之平均時間(藥效之MRT)估算藥理學半衰期。其以第一瞬時基線修正之效果-時間曲線下面積(AUMEC)對隨時間累積之基線修正之藥效(效果-時間曲線下面積，AUEC)的比率計算。估算之藥理學半衰期概述於下表12中：

藥理學半衰期之估算係基於PG110給藥後多達84天所收集之數據。因為在第84天PG110仍有持續效應(尤其在0.1 mg/kg及0.3 mg/kg劑量下)，所以PG110之估算平均藥理學半衰期為至少5-7週，其在至少4-8週範圍內。

初步藥效學數據與所推演之治療劑量(0.10至0.3 mg/kg或7-21 mg)一致。初步藥理學半衰期表明每4-12週給藥可能有效。

實例7：　PG110相較於大鼠前驅抗體之效能

在此實例中，使用TF1細胞增殖分析法(如上文實例3B中所描述)進行額外實驗以比較PG110與其前驅體大鼠αD11之NGF中和效能。大鼠αD11抗體以兩個各別批次供應，一批之儲備濃度為0.73 mg/ml且另一批之儲備濃度為0.63 mg/ml。在由人類NGF或大鼠NGF介導之TF1細胞增殖的分析法中使用MTT細胞增殖套組(ATCC目錄號30-1010K)評估PG110及大鼠αD11抗體。

將TF1細胞在用於分析法中之前與2 ng/ml GM-CSF(R&D Systems，目錄號215-GM-50)一起在含10%胎牛血清(FBS，Cambrex DE14-801F，批號6SB0006)之RPMI-1640(ATCC目錄號30-2001)中培養1週。洗滌細胞，再懸浮於RPMI-640+10% FBS中，濃度為300,000個細胞/毫升，且再塗於96孔微量培養盤上(15,000個細胞/孔，50 μl)。

在添加至96孔分析培養盤中之後至少60分鐘，將細胞暴露於含抗NGF抗體之培養基(含10% FBS之RPMI-1640；50微升/孔)中之人類或小鼠重組NGF(10 ng/ml)。製備含NGF及測試抗體之培養基，2×最終分析濃度，至少30分鐘之後，添加至預接種過的細胞中。分析0.6 ng/ml至24 μg/ml濃度範圍內之測試抗體。始終包括含有單獨培養基或含有TF1細胞但無NGF之(「細胞空白」)的對照孔。一式三份進行各處理。在40小時培育時期(37℃，5% CO₂ )之後，添加10 μl MTT試劑，之後在37℃下再培育4小時。隨後在室溫下在黑暗中在清潔劑(100微升/孔；輕輕混合)存在下培育各孔隔夜。此後，記錄570 nm下之吸光度。藉由減去細胞空白之平均值計算一式三份量測之最終平均OD值。對應於無測試抗體存在下關於無NGF下培養之細胞所觀察到的平均OD值設定最大抑制。對應於無測試抗體存在下關於暴露於10 ng/ml NGF之細胞所觀察到的平均OD值設定零抑制。

使用GraphPad Prism v5.01軟體，以IC₅₀ 值(亦即使NGF介導之增殖反應降低50%所需的抗體濃度)定量NGF抗體之抑制效能。個別繪製抑制曲線以獲得各實驗中各測試抗體之離散IC₅₀ 值。相對於在無添加之測試抗體存在下該分析中獲得之最大OD值校正細胞增殖之量測。接著針對對數標度之測試抗體濃度繪製校正之反應，且使用GraphPadPrism非線性曲線擬合函數「log(抑制劑)對反應-可變斜率」推導IC₅₀ 值。

PG110相較於其前驅抗體大鼠αD11之抑制效應概述於下表16中。

結果表明，PG110抗體中和NGF活性之效能為其前驅抗體大鼠αD11的約2倍。此外，關於第2批次大鼠aD11所獲得之效能值表明，此批次可能具有低於第1批次材料之效能。

實例8：抗NGF抗體PG110在動物模型中不會出現反彈效應

在此實例中，使用大鼠皮膚病灶模型檢查PG110 mAb之活性。基於以下觀察開發大鼠皮膚病灶模型：經抗NGF抗體處理之大鼠會產生瘙癢反應，所觀察到之抓痕呈劑量依賴型增加。病灶與表皮神經分佈減少無關。此外，去除抗體之後，大鼠展現快速恢復。此皮膚病灶活性僅在具有清整行為之齧齒動物中觀察到。儘管不意欲受機制限制，但假定在經抗NGF處理之大鼠中，因終止抓痕反應之反饋迴路異常而繼續清整，此導致皮膚損傷。接著可給予皮膚病灶定量計分以作為抗NGF抗體在大鼠中之活性的量度。

在關於抗NGF抗體(諸如人類化抗體RN-642，其進一步描述於美國專利公開案第20040237124號及Abdiche,Y.N.等人，(2008)Protein Sci. 17 :1326-1335中)之活性的各種臨床研究中，業已報導抗體之效用在給藥後一段時間(例如給藥後第14-21天)會減弱，隨後抗體活性恢復。有報導稱在給藥後抗體活性減弱之此時期期間，疼痛增加及/或不利事件(諸如感覺異常，自異常疼痛至發麻、刺痛或麻痹感)增加。此給藥後一段時間抗體活性的減弱在本文中稱為「反彈效應」。

為了評估PG110抗體對有意識大鼠之清整及抓痕行為之效應，用以靜脈內推注投與之PG110 mAb(0.003、0.01、0.03、0.3或3 mg/kg)或用媒劑對照物處理雄性及雌性史泊格多利大鼠。大鼠每週接受一次劑量，持續四週。評估標準為：清整及抓痕發作之次數、體溫、舔爪等待時間、跳躍等待時間(企圖逃脫)及隨時間之皮膚病灶數目及嚴重性計分。

結果表明，在投與媒劑之大鼠中觀察到無皮膚病灶，而在投與PG110之大鼠組中，在所有測試之抗體劑量下所有動物中均觀察到皮膚病灶。此外，皮膚病灶之數目及嚴重性隨時間增加，且隨抗體劑量增加而增加。雖然在經抗體處理之動物中抓痕發作之次數亦增加，但抗體處理對清整行為、體溫、舔爪等待時間或跳躍等待時間(企圖逃脫)不產生任何效應。

使用病灶計分定量皮膚病灶之嚴重性，該病灶計分等於病灶數目乘以病灶面積(以mm² 計)。PG110處理相較於媒劑之隨時間之病灶計分顯示於圖4之圖形中。結果顯示經PG110處理之大鼠顯示病灶計分隨時間增加，尤其較高測試劑量(0、3 mg/kg及3 mg/kg)下。亦即，抗體在實驗過程中不會出現顯著的反彈效應，表明有可能選擇用於人類之劑量及投藥頻率參數，從而避免反彈效應。

因此，概括而言，大鼠皮膚病灶模型說明PG110抗NGF抗體之優點在於PG110抗體不會出現顯著的反彈效應，而關於其他抗NGF抗體業已報導該反彈效應，表明PG110展現更穩定且更長期之體內活性。儘管不意欲受機制限制，但吾人認為PG110之此避免體內反彈效應之能力與關於此抗體所觀察到的長末端消除半衰期相關。

等效物

熟習此項技術者將認識到或僅使用常規實驗即能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。此等等效物意欲由隨附申請專利範圍涵蓋。隨附申請專利範圍中所揭示之實施例的任何組合涵蓋在本發明之範疇內。

以引用的方式併入

因此，本文中所提及之所有公開案、專利及申請中之專利申請案皆以全文引用的方式併入本文中。

序列表之概述

SEQ ID NO: 1(PG110 V _H )

SEQ ID NO: 2(PG110 V _L )

SEQ ID NO: 3(PG110 V _H CDR1)

SEQ ID NO: 4(PG110 V _H CDR2)

SEQ ID NO: 5(PG110 V _H CDR3)

SEQ ID NO: 6(PG110 V _L CDR1)

SEQ ID NO: 7(PG110 V _L CDR2)

SEQ ID NO: 8(PG110 V _L CDR3)

SEQ ID NO: 9(野生型人類IgG4恆定區)

SEQ ID NO: 10(絲胺酸突變成脯胺酸之人類IgG4恆定區)

SEQ ID NO: 11(PG110完全重鏈核苷酸序列，包括信號序列)

SEQ ID NO: 12(PG110完全重鏈胺基酸序列，包括信號序列)

SEQ ID NO: 13(PG110成熟重鏈胺基酸序列，不包括信號序列)

SEQ ID NO: 14(PG110完全輕鏈核苷酸序列，包括信號序列)

SEQ ID NO: 15(PG110完全輕鏈胺基酸序列，包括信號序列)

SEQ ID NO: 16(PG110成熟輕鏈胺基酸序列，不包括信號序列)

<110>　荷蘭商總遺傳學110有限公司

<120>　具有增進之體內穩定性之抗神經生長因子(NGF)抗體

<130>　PNJ-013TW

<140>　099114298

<141>　2010-05-04

<150>　61/252,314

<151>　2009-10-16

<150>　61/238,813

<151>　2009-09-01

<150>　61/227,251

<151>　2009-07-21

<150>　61/175,228

<151>　2009-05-04

<160>　16

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　122

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　1

<210>　2

<211>　107

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　2

<210>　3

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　3

<210>　4

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　4

<210>　5

<211>　14

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　5

<210>　6

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　6

<210>　7

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　7

<210>　8

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成肽

<400>　8

<210>　9

<211>　327

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　9

<210>　10

<211>　327

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　10

<210>　11

<211>　1407

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成聚核苷酸

<400>　11

<210>　12

<211>　468

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　12

<210>　13

<211>　449

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　13

<210>　14

<211>　705

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成聚核苷酸

<400>　14

<210>　15

<211>　234

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　15

<210>　16

<211>　214

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之描述：合成多肽

<400>　16

圖1為顯示如由ELISA所測定，PG110會與人類神經生長因子(NGF)結合，但不與衍生自人腦之神經營養因子(BDNF)、人類神經營養素3(NT-3)或人類神經營養素4(NT-4)結合的圖形。

圖2A為顯示如由經放射性標記之配位體結合實驗所測定，PG110抗體抑制NGF結合至TrkA受體的圖形。

圖2B為顯示如由經放射性標記之配位體結合實驗所測定，PG110抗體抑制NGF結合至p75^NTR 受體的圖形。

圖3A為顯示PG110抗體對經人類NGF刺激之TF-1細胞增殖之抑制效應的圖形。

圖3B為顯示PG110抗體對經大鼠NGF刺激之TF-1細胞增殖之抑制效應的圖形。

圖3C為顯示PG110抗體對經小鼠NGF刺激之TF-1細胞增殖之抑制效應的圖形。

圖4為顯示PG110抗體處理對大鼠皮膚病變之效應的圖形。

(無元件符號說明)

Claims (15)

1. 一種抗神經生長因子(NGF)抗體，其包含：(i)包含分別具有SEQ ID NO：3、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區，(ii)包含分別具有SEQ ID NO：6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區，及(iii)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之人類IgG4恆定區。
2. 如請求項1之抗體，其包含含有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區及含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的輕鏈可變區。
3. 如請求項1或2之抗體，其包含含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：16之胺基酸序列的輕鏈。
4. 如請求項1或2之抗體，其為人類化抗體。
5. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項之抗NGF抗體及醫藥學上可接受之載劑。
6. 一種套組，其包含如請求項1至4中任一項之抗NGF抗體。
7. 一種核酸，其編碼如請求項1至4中任一項之抗體之重鏈。
8. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至4中任一項之抗體之重鏈及如請求項1至4中任一項之抗體之輕鏈之序列。
9. 一種表現載體，其包含如請求項7或8之核酸。
10. 如請求項9之表現載體，其包含SEQ ID NO：11及14。
11. 一種宿主細胞，其包含如請求項9或10之表現載體。
12. 一種表現如請求項1之抗NGF抗體之方法，其包括培養如請求項11之宿主細胞。
13. 一種如請求項1至4中任一項之抗NGF抗體的用途，其用於製造治療疼痛之藥劑。
14. 如請求項13之用途，其中該疼痛為骨關節炎疼痛。
15. 如請求項13之用途，其中該疼痛為慢性下背痛。