TWI482781B - 多孔狀膠原蛋白基質製備方法 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種自結締組織製備多孔狀膠原蛋白基質的方法。
膠原蛋白基質可用以製造特別是人造組織、人造器官及藥劑輸送載體。膠原蛋白基質一般都是由膠原蛋白纖維重組而成,膠原蛋白纖維係由富含膠質的結締組織萃取出來。習知用以萃取出膠原蛋白纖維的方法需要嚴苛的物理或化學處理,例如研磨、均質化或酸/鹼降解,其都會損壞膠原蛋白纖維的網絡結構。
本發明係基於下列不可預期之發現:以一種實質上不包含鹽類的弱酸溶液處理結締組織時,可使結締組織膨脹至極大的限度而不會破壞膠原蛋白的網絡結構。
因此,本發明一面向的特徵為一種直接自結締組織製備多孔狀膠原蛋白基質的方法。此方法包含(i)提供一結締組織,其表面積為20平方公釐至2平方公尺(較佳為25平方公釐至900平方公分);(ii)以一酸液使該結締組織之體積至少膨脹百分之五十(較佳為100%至500%)而形成一膨脹結締組織;以及(iii)清洗該膨脹結締組織以除去非膠原蛋白物質藉此形成一多孔狀膠原蛋白基質。上述的結締組織係源自真皮組織或筋腱。上述用於膨脹之酸液的酸鹼值(pH值)介於1至6(較佳為2至4),且酸液實質上不包含鹽類,也就是說溶液中沒有鹽類成分,或者是鹽類濃度非常低,使得溶液的離子強度不大於0.005M。在一些實施例中,上述的酸液係可由甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其混合物來製備。較佳的是,上述酸液為0.1-6M的醋酸溶液。
在膨脹步驟之前,可用一溶劑潤洗上述的結締組織,所述溶劑包含一有機溶劑以及選擇性的包含水。當溶劑包含有機溶劑以及水時,溶劑與水的體積比為1:4至9:1。在一些實施例中,有機溶劑包含,但不限於醇、酮、丙酮、乙腈、己烷、氯仿、N,N-二甲基甲醯胺、二甲亞碸及其混合物。當結締組織是源自表皮且含有毛髮或毛根時,較佳的是以一微鹼溶液或蛋白水解酶預先處理含有毛髮或毛根的表皮以移除毛髮或毛根,微鹼溶液可為蘇打、小蘇打、氯化鈣、或低濃度過氧化氫等,蛋白水解酶可為,例如中性蛋白酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶(ficin)或其混合物。
上述的膨脹步驟可藉由將結締組織浸泡於酸液而達成。可選擇地,上述的浸泡步驟係藉由同時以一超音波處理結締組織或同時將一液體噴射至結締組織而達成。
在上述的膨脹步驟之後,可清洗膨脹後的結締組織以除去非膠原蛋白物質,藉此製備出一多孔狀膠原蛋白基質。上述的清洗步驟可藉由將該膨脹結締組織浸泡於一清洗液而達成,該清洗液可進一步包含一清潔劑、蛋白酶或其混合物。可選擇地,上述浸泡步驟可一起將一液體噴射至該膨脹結締組織而達成或一起以一超音波處理該結締組織而達成,或結合二種物理力量而達成。
一種由前述方法所製備的多孔狀膠原蛋白基質亦屬於本發明之範疇內。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯,並視後附之申請專利範圍所界定者為準,下文特舉本發明一些實施例並配合所附圖示,作詳細說明如下。
本發明提供一種方法,係直接自結締組織製備多孔狀膠原蛋白基質,其中膠原蛋白為結締組織中的主要蛋白質。膠原蛋白是一種三股螺旋(triple-helix)桿狀分子,此分子具有約300奈米(nm)的長度及約1.5奈米(nm)的直徑。大量的膠原蛋白分子形成膠原蛋白纖維絲,而一束膠原蛋白纖維絲形成一膠原蛋白纖維。膠原蛋白分子之間以及膠原蛋白分子內部存在著共價的交聯,藉此在結締組織內形成了纖維狀的網絡。
在本發明之方法中,起始材料即為結締組織,可取自於動物,例如牛、豬、馬、羊、雞、鴨、火雞、鹅、鯨魚或者鯊魚等畜類或魚類。適用於本發明方法的結締組織包含,但不限於,真皮組織、皮下組織、韌帶、筋腱、腱膜、軟骨、骨頭組織。假如需要的話,先用人工(例如藉由粗略的切開(gross dissection))或機械清理結締組織以除去不需要的材料,例如脂肪及脂質。在一實施例中,真皮組織係取自新鮮的動物皮,將動物皮除去脂質、以鹽水(saline)清洗皮數次後,以一植皮刀(dermatome)除去動物皮的表面層即可獲得真皮組織。所得的真皮組織可用磷酸鹽緩衝溶液進一步清洗。
假如需要,結締組織可以先用一適合的有機溶劑或者是一有機溶劑與水的混合液進行處理,使有機溶劑可以滲透入結締組織。有機溶劑包含,但不限於醇、酮、丙酮、乙腈、己烷、氯仿、N,N-二甲基甲醯胺、二甲亞碸或其混合物。當使用有機溶劑與水的混合液時,有機溶劑與水的比例高於1:4(例如1:1、2:1或4:1)。
當結締組織含有毛髮或毛根時,可先以一微鹼溶液或蛋白水解酶處理以除去毛髮或毛根,微鹼溶液可為蘇打、小蘇打、氯化鈣、或低濃度過氧化氫等,蛋白酶可為,例如中性蛋白酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶(ficin)或其混合物。
接著,將上述任一結締組織浸泡於適量酸液中,經過適當的時間後,使得結締組織膨脹到所需的標準,亦即比原厚度至少增加50%的厚度(較佳為原厚度的2-10倍)。上述的酸液可以一有機酸來製備,有機酸可為,例如甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸或其混合物。在一實施例中,酸液可為濃度0.1~6M(較佳為0.1~2M或0.5~1.25M)的醋酸。為了獲得較佳的膨脹效果,本發明所使用的酸液實質上不包含鹽類。
在上述的膨脹步驟中,結締組織是懸浮於以上所述的酸液中。假如需要的話,可利用一或數道液體來處理結締組織,促使酸液滲透入結締組織並縮短膨脹結締組織所需的時間。上述的液體可以由一容器的噴嘴或噴孔來噴出,上述的酸液及結締組織係置放於該容器內。
或者,或此外,可將一超音波震動裝置產生一超音波或藉由一電磁場或一凸輪(cam)所產生的高頻率水波施加於浸泡於酸液中的結締組織,以促使酸液滲透入結締組織。
使用一清洗液來清洗上述膨脹步驟所製備的膨脹結締組織,以實質上除去上述膨脹結締組織中的非膠原蛋白物質,藉此以製備一多孔狀膠原蛋白基質。所述的清洗液可含有清潔劑、螯合劑、蛋白酶或其混合物。
用以製備清洗液的範例清潔劑包含,但不限於十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS)、Tego化合物(例如介面活性劑Tween-80、非離子清潔劑TWR(Triton W. R. 1339)、對-異辛烷基聚氧-乙烯苯酚聚合物(p-isooctylpolyoxy-ethylene phenol polymer)與四丁酚醛(Triton A20)表面活性劑)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetyltrimethyl ammonium bromide)、二辛烷鈉磺基琥珀酸酯(dioctyl sodium sulphosuccinate)、購自日本Kao Soap有限公司品名為「Emasol 4130」的聚氧基乙烯山梨糖醇油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monoleate)介面活性劑、購自英國帝國化學工業有限公司品名為「Lubrol W」的非離子介面活性劑、購自歐洲Sigma公司品名為「Nonidet P40」的非離子介面活性劑)。在一實施例中,使用一含有SDS濃度0.01%至10%的清洗液,在4℃至45℃溫度下處理所述膨脹結締組織1小時至150小時。
所述清潔液所含的螯合劑包含,但不限於乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra-acetic acid,EDTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷基-1,4,7,10’-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid,DOTA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷基-1,4,7,10’-四亞甲基磷酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(methylene phosphonic acid),DOTP)、環己二胺四醋酸(trans-1,2-diaminocyclohexantetra-acetic acid,CDTA)、4,5-二羥基苯-1,3-二磺酸(4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulphonic acid,Tiron)、硫脲(thiourea)、8-羥基喹啉-5-磺酸(8-hydroxyquinoline-5-sulphonic acid)、3,6-二磺基-1,8-二羥基萘(3,6-disulpho-1,8-dihydroxy-naphthalene)、Eriochromeschwarz T(1-(1-羥基-2-萘基偶氮)-2-羥基-5-硝基-4-萘磺酸)(Eriochromeschwarz T(1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-2-hydroxy-5--nitro-4-naphthalene sulphonic acid))、紅紫酸銨(ammonium purpurate)等。較佳的螯合劑為0.01mM至100mM的EDTA。
或者,或此外,清洗液可包含一或多種蛋白水解酶,例如無花果蛋白酶(ficin)、胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、溶血素(hermolysin)或其混合物,以除去連接於細胞外基質的蛋白質、其它非膠原蛋白的蛋白質與膠原蛋白分子的末端肽(telopeptide)。在此技術領域中,有限度的酵素切割(亦即使非膠原蛋白的蛋白質降解但仍保持膠原蛋白纖維的完整性)的條件是眾所皆知的。
在清洗步驟中,可將所述膨脹的結締組織浸泡於前面所提到酸液之中的任一種一段適當的時間。在一實施例中,將一或多道液體自一噴嘴或噴孔噴射至所述的結締組織,以促進非膠原蛋白物質的移除。所述液體可為水、包含清潔劑的溶液或包含酵素的溶液。在另一實施例中,使用超音波處理浸泡於清洗液中的膨脹結締組織,可改善清洗效率。
可將已經進行過上述清洗步驟的多孔狀膠原蛋白基質冷凍並控制冷凍速率以使基質含有所需的冰晶尺寸。然後可用冷凍乾燥法進行保存。或者,多孔狀膠原蛋白基質可浸泡於一磷酸鹽緩衝溶液中並儲存於4℃的溫度環境。當有需要時,可藉由一般的化學或物理方法使上述的多孔狀膠原蛋白基質交聯化。用於使上述多孔狀膠原蛋白基質交聯化的交聯劑包含戊二醛(glutaraldehyde)、甲醛(formaldehyde)、碳二醯胺(carbodiimide)或其它聚環氧樹脂化合物(polyepoxy compound),例如乙二醇二缩水甘油醚(glycol diglycidyl ether)、聚醚多缩水甘油醚(polyol polyglycidyl ether)、二羧酸二缩水甘油酯(dicarboxylic acid diglycidyl ester)。
前述用以製備多孔狀膠原蛋白基質的方法在至少兩個面向上不同於習知的方法。第一,本發明之方法不需要嚴苛的物理或化學處理法(例如研磨、均質化或酸/鹼降解),這些方法都會破壞結締組織中膠原蛋白纖維的網絡結構。第二,用以膨脹結締組織的酸液實質上不包含鹽類,而一般習知方法是利用鹽類來穩定膠原蛋白纖維。
在此亦揭露一種多孔狀膠原蛋白基質,其係以前述任一種製備方法所製備。所述的多孔狀膠原蛋白基質可以用來製造人造組織、人造器官、植入物,以及藥劑輸送載體系統,或者作為細胞生長的支架。咸信在此技術領域中的熟悉技藝者基於前述的描述,都可將本發明充分的利用而不需進一步的詳細描述。因此,下文所舉實施例僅僅只是作為範例,並非用以在任何方面限制本發明。在此引用的所有文獻係併入本案以為參照。
實施例1
:由豬皮製備多孔狀膠原蛋白基質
自豬身上取得皮膚組織,除去脂質後,以鹽水清洗皮數次,以植皮刀(dermatome)除去皮的表皮層以獲得一厚度為0.3毫米(mm)的真皮組織。進一步以磷酸鹽緩衝溶液清洗所述的真皮組織。在清洗過後,將所有緩衝溶液殘餘物自真皮組織的表面完全的除去。
將真皮組織置入一裝有濃度0.5M醋酸溶液的容器內,並在37℃定溫放置不同的時間來膨脹真皮組織。在定溫放置期間,容器是置於一震動器上,以使真皮組織懸浮。經由不同時間膨脹後真皮組織的厚度列於下表一:
接著將膨脹後的真皮組織浸泡於室溫下含有0.5%的SDS與0.5mM的EDTA的溶液中兩小時,以除去非膠原蛋白物質而產生一多孔狀膠原蛋白基質。
以一經過殺菌處理的磷酸鹽緩衝溶液清洗上述的多孔狀膠原蛋白基質,以除去殘餘的SDS與EDTA。接著在-20℃下的溫度環境冷凍後以冷凍乾燥保存上述的多孔狀膠原蛋白基質。真空濺鍍金於冷凍乾燥後的多孔狀膠原蛋白基質,並利用掃描式電子顯微鏡(SEM)拍照。如第1圖及第2圖所示,多孔狀膠原蛋白基質不包含細胞以及細胞殘存物,且具有由膠原蛋白纖維所形成的基質結構。
實施例2
:使用液體噴射法製備多孔狀膠原蛋白基質
以實施例1所述的步驟來準備一豬真皮組織並將其浸泡於0.5M的醋酸溶液。詳細言之,用來將真皮組織浸泡於醋酸溶液中的容器具有數個噴嘴,數道醋酸由該些噴嘴噴至真皮組織。此噴射步驟加速了膨脹的過程,如下表二所示:
接著,以實施例1所述的SDS/EDTA溶液清洗前述經過浸泡與噴射的膨脹真皮組織,以製備一多孔狀膠原蛋白基質。
實施例3
:使用超音波處理法製備多孔狀膠原蛋白基質
以實施例2所述的步驟來製備一多孔狀膠原蛋白基質,除了利用一超音波震盪裝置進行超音波處理來取代噴射處理。
所獲得的結果指出,如同噴射處理,超音波處理也明顯的縮短了將真皮組織膨脹至適當標準的時間。
實施例4
:以乙醇預處理豬的真皮組織以製備多孔狀膠原蛋白基質
以實施例1所述的步驟準備豬真皮組織,並將所述的豬真皮組織置入含有30%乙醇(乙醇:水=30:70(體積比))的容器中。將所述的容器放置在一震動器上,使真皮組織可懸浮於乙醇溶液中。將上述真皮組織放置30%乙醇中浸泡14小時。
將30%乙醇倒出後,再倒入0.5M的醋酸溶液至容器中,並放置於震動器上以膨脹浸泡於醋酸溶液中的真皮組織。經過一天後,真皮組織膨脹到0.45毫米(mm)的厚度(原先厚度的1.5倍)。這表示以乙醇預處理也縮短了真皮組織膨脹至厚度0.45毫米的時間。
在移除0.5M的醋酸溶液後,將膨脹真皮組織在室溫下浸泡於20%乙醇中(乙醇:水=20:80(體積比))12小時。將所產生的多孔狀膠原蛋白基質以去離子水清洗,並且在-20℃的溫度環境進行冷凍,最後以冷凍乾燥保存。
實施例5
:使用蛋白分解酶處理法製備多孔狀膠原蛋白基質
將一豬真皮組織清洗後置於含有蛋白酶(15U/ml)的溶液中浸泡一天。接著以實施例2所述的步驟對上述真皮組織進行膨脹及清洗。結果顯示以蛋白酶處理過的真皮組織膨脹至0.45毫米(mm)的厚度只需要六個小時。
比較實施例1
:以習知的方法製備多孔狀膠原蛋白基質
以實施例1的步驟來準備豬的真皮,將其置於溫度37℃ 0.5M的醋酸溶液中轉動12小時。接著將處理過的真皮放置於一含有0.2M醋酸以及0.5M氯化鈉的溶液中浸泡72小時。如此處理過的真皮具有0.36毫米(mm)的厚度(真皮原先厚度的1.2倍)。之後,將處理過的真皮放置於一含有1%(w/v)過氧化氫的溶液中,並且靜置24小時,接著再置入一溫度37℃含有SDS/EDTA的溶液中進一步定溫靜置24小時。最後以一經過殺菌處理的磷酸鹽緩衝溶液進行清洗,並在溫度-20℃下冷凍,接著進行冷凍乾燥。
如上所述,當以一含有醋酸與鹽類(例如氯化鈉)的溶液進行膨脹,需要大於七十二小時的時間,才能使厚度0.3毫米(mm)的真皮達到厚度0.36毫米。不同的是,如實施例1所示,當以一只含有醋酸的溶液進行膨脹三天的時間,就能使厚度0.3毫米的真皮達到厚度0.9毫米(請參照表一)。這表示相較於含有醋酸及鹽類(例如氯化鈉)的溶液,不含鹽類的醋酸溶液可使真皮達到較高的膨脹程度。這也許是因為鹽類的穩定效果。詳細言之,鹽類可以穩定膠原蛋白纖維,使得膠原蛋白可以緊密的結合在一起,而不是膨脹。
本發明所揭露之所有特徵應可以任何結合方式實現。本發明所揭露之每一特徵應可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此,除非有明確的指定,否則所揭露的每一個特徵僅僅只是均等物或相似特徵的一個種類的一實施例。
由上述內容可知,任何在此技術領域中具有通常知識者,將可輕易從本發明之揭露中了解到本發明之特徵,在不偏離后附申請專利範圍所界定之本發明的精神與範圍下,當可在此進行各種改變、取代以及修正。因此,其他實施例亦落於后附申請專利範圍內。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:
第1圖是根據實施例1所描述之方法製備的多孔狀膠原蛋白基質的掃描式電子顯微圖(放大倍率:100)。
第2圖是根據實施例1所描述之方法製備的多孔狀膠原蛋白基質的掃描式電子顯微圖(放大倍率:400)。
Claims (19)
- 一種自結締組織製備多孔狀膠原蛋白基質的方法,該方法依序包含:提供一結締組織,其表面積為20平方公釐至2平方公尺;一膨脹步驟:以一酸液使該結締組織之體積至少膨脹百分之五十而形成一膨脹結締組織,其中該酸液之酸鹼值(pH值)介於1至6且該酸液實質上不包含鹽類;以及一清洗步驟:清洗該膨脹結締組織以除去非膠原蛋白物質藉此形成一多孔狀膠原蛋白基質。
- 如請求項1所述之方法,其中該結締組織的尺寸為25平方公釐至900平方公分。
- 如請求項1所述之方法,其中該酸液為弱酸。
- 如請求項3所述之方法,其中該弱酸液包含由甲酸、羧酸、草酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、硼酸、磷酸及其混合物所組成之群組中選擇的一種酸。
- 如請求項3所述之方法,其中該酸液之酸鹼值(pH值)介於2至4。
- 如請求項5所述之方法,其中該酸液包含濃度 0.1~6M的醋酸。
- 如請求項1所述之方法,其中在該膨脹步驟中,該結締組織膨脹後體積為100%~1000%。
- 如請求項1所述之方法,其中該膨脹步驟包含將該結締組織浸泡於該酸液,且同時將一液體噴射至該結締組織。
- 如請求項1所述之方法,其中該清洗步驟包含將該膨脹結締組織浸泡於一清洗液,該清洗液包含一清潔劑、一蛋白酶或其混合物。
- 如請求項9所述之方法,其中該清洗步驟包含將該膨脹結締組織浸泡於該清洗液中,且同時將一液體噴射至該膨脹結締組織中。
- 如請求項1所述之方法,其中該膨脹步驟包含將該結締組織浸泡於該酸液中,且同時以超音波處理該結締組織。
- 如請求項9所述之方法,其中該清洗步驟包含將該膨脹結締組織浸泡於該清洗液中,且同時以超音波處理該結締組織。
- 如請求項1所述之方法,更包含在膨脹步驟之前,以一溶劑處理該結締組織,該溶劑包含一有機溶劑以及可選擇性的包含水,其中該有機溶劑係選自由醇、酮、丙酮、乙腈、己烷、氯仿、N,N-二甲基甲醯胺、二甲亞碸及其混合物所組成之群組。
- 如請求項13所述之方法,其中該溶劑包含有機溶劑以及水且有機溶劑與水之間的體積比為1:4至9:1。
- 如請求項1所述之方法,其中該結締組織包含複數根毛髮或毛根,且該方法更包含,在該膨脹步驟之前,以微鹼溶液或蛋白水解酶處理該結締組織以鬆弛(loosen)或去除該些毛髮或毛根。
- 如請求項15所述之方法,其中該蛋白水解酶係選自中性蛋白酶(dispase)、胰蛋白酶(trypsin)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、無花果蛋白酶(ficin)及其混合物所組成之群組。
- 如請求項1所述之方法,其中該結締組織係源自於真皮組織或筋腱。
- 如請求項1所述之方法,更包含在該清洗步驟之後,乾燥該多孔狀膠原蛋白基質。
- 如請求項1所述之方法,其中該清洗步驟包含以一第一清洗液以及一第二清洗液處理該膨脹結締組織,該第一清洗液包含一清潔劑、一螯合劑或其混合物,而該第二清洗液包含一蛋白酶。
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