TWI470081B - 肺組織模型 - Google Patents

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Description

肺組織模型
本發明係關於一種工程化三維(3D)肺部模型組織培養物，其不含任何人工骨架。可利用健康肺組織以及疾病組織的三維模型。根據本發明之產品可例如以組織培養物，包含此培養物的板或陣列，或試劑盒之形式出售。本發明可應用於醫學與科學研究中，用於測試化合物對肺組織的影響，篩選、測時與/或評估藥物，以及在某些情況下診斷肺部疾病。
組織工程化為生物醫學研究中迅速發展的一個領域，其旨在修復、替換或再生損傷組織。由於最近發生的慘重的II期臨床藥物試驗事件(例如TGN1412)，因此組織工程化的進一步目標包含產生人類組織模型以供醫藥化合物的安全與功效測試。一般組織工程化且尤其我們的模型利用生物形態形成，它係為自組裝的一個實例。
現今，根據若干觀點推行細胞與組織工程化。一方面，用以獲得對細胞生物學與生理學更深入的瞭解。
三維組織模型
組織工程化研究中正在發展兩個主要方向：基於組織骨架之系統與無組織骨架之系統。雖然基於骨架的系統主要使用生物可降解的骨架材料來提供人工三維結構以促進細胞的相互作用，但是無骨架之系統允許指導細胞與細胞的相互作用，並且允許細胞 生長於模型中其分泌的骨架材料上。
在US 2001/0055804 A1(“人類瘤前***疾病的三維活體外模型(Three dimensional in vitro model of human preneoplastic breast disease)”)中，揭示一種三維活體外細胞培養系統，其適用作瘤前***疾病的模型供篩選藥物。此模型透過在包含如生長因子、***等其他添加劑的培養基中在再造基膜上共培養源自***的瘤前上皮細胞、內皮細胞與***成纖維細胞以製備。因此，在此解決方案中，一基膜、較佳Matrigel®用作一組織骨架。根據描述，在此系統中大約3天-7天內形成分支管泡單元脈管系統的網狀物。
此系統涉及***而非肺，並且不建議透過此方法以製造一肺培養物。
在US 2003/0109920(“工程化動物組織(Engineered animal tissue)”)中，自成人肺獲得微血管內皮細胞且放置於存在於三維膠原蛋白凝膠中的兩層人類皮膚成纖維細胞之間。因此，形成一夾層結構。
儘管自人類肺獲得血管內皮細胞，但透過此方法製備的人工組織類似於人類皮膚，因此，其實際上不能夠認為是肺組織模型。
在US 2008/0112890(“胎肺細胞及其用途(Fetal pulmonary cells and uses thereof)”)中，教示一種類三維組織製劑，此製劑基於胎小鼠上皮細胞、內皮細胞與間充質細胞。作者使用小鼠胚胎肺細胞製備此製劑，用以獲得肺假體並對此類三維組織製劑進 行篩選。作為基質，使用水凝膠MATRIGELTM，用以建立適當的細胞-細胞相互作用。自描述中看出，在共培養上皮細胞與成纖維細胞時成纖維細胞過度生長。
WO2008/100555(“供高通量毒性篩選與藥物發現的工程化肺組織構造(Engineered lung tissue construction for high throughput toxicity screening and drug discovery)”)涉及一種肺組織模型製劑，此製劑包含胎肺細胞與用生物相容性材料且較佳成纖維細胞生長因子製成的組織骨架。胎肺細胞包含上皮細胞、內皮細胞與間充質細胞。列出大量適用的生物相容性材料。
WO2004/046322(“生物組織的複製(Replication of biological tissue)”)提議在微重力環境下製備一人工三維組織。此組織為基於人類乳癌細胞並可用作乳癌模型。在旋轉式生物反應器室中，最初培養結締組織細胞，直至形成一三維球狀結構，然後內皮細胞與上皮細胞依序加入至培養物中。應當注意此教示為理論上的，而且雖然提供培養細胞與處理培養物的方案，但實驗的實際結果未揭示。
瓦曲斯(Vertrees,RA)、威申貝格爾(Zwischenberger,JB)等人(2008)在旋轉式有壁容器中，在塗覆微孔性的環狀糊精珠(Cytodex-3微載體珠)的膠原蛋白上培養間充質細胞(人類支氣管氣管細胞)。在24至48小時之後，添加一惡性顯型人類上皮細胞系(BZR-T33)。作者之目的在於開發一肺癌之三維(3D)模型。作者評論在習知技術中，〞人類野馬上皮細胞與人類肺癌的原發 細胞系提供類似體內的上皮細胞之結構及功能的更加分化之模型，然而，這些模型在體外時間很短。〞
尼考勒斯(Nichols,J.E)、考提拉(Cortiella,J)等人(2008)回顧一組織工程肺的發展之最近提高且發現迄今開發的使用特定骨架材料及長時間培養的肺組織模型。作者提到〞肺的...發展中面臨的問題依靠...適當的骨架及基質的發展，用以提高及支撐組織的三維(3D)產生〞。
摩勒納(Molnar T.F.)、彭哥茲(Pongracz J.E.)提供在其他肺組織培養中組織工程的不同應用的概述。作者指出〞三維(3D)培養...產生另外之問題，包含在第三維中氣體及營養物交換的困難。為了防止此問題，骨架...按照形成組織以及允許細胞相互作用，產生營養物及氣體的交換的方式有目的之設計〞。然而，他們推斷〞整形外科中的生物技術仍然為一基於試管的實驗室問題...〞。
這兩種設計中沒有展望無骨架設計。
Wnt信號與Wnt11
Wnt蛋白質係為分泌的成形素，其為基本發育過程中與維護成人組織的動態平衡中所需要的。在肺中，Wnt信號控制增殖，細胞命運確定，祖細胞的成熟與終端分化。肺泡Ⅱ型(ATII)細胞係為產生肺泡的基本氣體交換表面的肺泡I型(ATI)細胞之祖代。然而，如何調節ATII型之分化仍然遠未理解。
Wnt信號調節多種發育過程[多布斯(Dobbs,L.G.)(1989)]。 Wnt或Wnt路徑抑製劑(Dkk3,6、WIF7以及sFRP8)的過度表達(Wnt13與Wnt2,4)或下降調節(Wnt7a,5)，係為包含纖維化與腫瘤的不同類型的肺部疾病之特徵。此外，蓬亂蛋白(disheveled,DVL)，Wnt信號之一訊號變化器的過度表達，已在非小細胞肺癌(NSCLC)病例的75%中報導，突出了Wnt信號路徑在肺癌中的重要性。
信號轉導過程中涉及至少三個信號路徑：規範或依賴β索烴素(β-catenin)，以及兩個非規範之路徑。上皮細胞間充質細胞轉變(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)通常與許多侵入性或轉移性腫瘤中增加的依賴β索烴素(β-catenin)的信號活動相聯繫[瓦格瑞(Voulgari,A.)與帕特(Pintzas)(2009)；再斯波哥(Zeisberg,M.)與尼爾森(Neilson,E.G.)(2009)]。雖然β索烴素(β-catenin)的突變在肺癌中比較少見，但是，沒有對β索烴素(β-catenin)本身的基因改變的不複雜β索烴素(β-catenin)的上調已證明在人類非小細胞肺癌(NSCLC)中高比例[阿克瑞(Akiri G)等(2009)]。依賴β索烴素(β-catenin)的訊號的對肺部再生也必不可少。因此，Wnt含量中的平衡似乎對保持肺的動態平衡之健康平衡為必要的。
在模仿人體組織之特性中非人體模型的缺點在於，往往放棄對在人體組織中的分子間的相互作用的成功理解。近來，因此主要的人體細胞頻繁使用於分子研究中。然而，在傳統的二維細胞培養中，原代細胞失去其特徵分化標誌[沙農(Shannon,J.M.) (1987)]。本發明沒有任何關於三維模型組織培養中Wnt11之功效的技術研究之資訊。
儘管存在大量有關肺模型的文獻，但似乎習知技術僅僅揭示基於組織骨架的三維模型，並且現有技術沒有揭示至少包含上皮細胞與成纖維細胞的無組織骨架之簡單肺組織模型。
本發明者意外地發現，透過簡單的生物化學方法，可迅速建造無組織骨架的肺組織模型系統，此系統具有一定的肺組織形態特徵且在若干方面相比較於二維系統或基於基質的系統更有利。本發明之模型避免了成纖維細胞過度生長之問題。本發明者還認識到且提供Wnt11為ATII型分化的調節之第一個證據。因此，由於Wnt11之效果，此模型可以根據標誌表達與形態方面進一步改善。Wnt11還在肺癌(LC)中表示為下調。因此，根據本發明，提供一肺癌模型，其中Wnt11之表達在模型的組織培養之間充質細胞中下調。
而且，本發明者意識到Wnt11在損傷之後的組織，特別為肺組織的恢復與/或再生中有用。
肺模型組織培養能夠迅速準備。本發明提供一種備用於各種測試的模型組織。此模型適合於研究各種肺組織中細胞-細胞相互作用以模擬正常功能與疾病發展。
因此，鑒於上述問題，本發明之目的在於提供一種工程化三維肺部模型組織培養物，此模型組織培養物具有一個或多個以下 特徵，a)不含一人工組織骨架，b)由培養細胞構成或具有培養細胞材料，其中所述細胞處於與組織材料的一種或一種以上其他細胞類型細胞的直接細胞-細胞相互作用中，c)至少包含培養的肺部上皮細胞與培養的間充質細胞，較佳為肺部間充質細胞，較佳為成纖維細胞，其中模型組織中肺部上皮細胞與間充質細胞的比率較佳為至少1：6，較佳至少1：3，並且至多6：1，較佳至多3：1，d)具有一個或多個以上細胞聚集體的形態，其中聚集體的表面富集肺部上皮細胞，或者其中肺部上皮細胞與間充質細胞，較佳成纖維細胞在此聚集體中至少部分分離，即，一聚集體之上或位於聚集體的上皮細胞之比率相比較於一聚集體之內部或內部部份更大，與/或聚集體包含多個腔，e)其中此上皮細胞表達上皮分化標記物，較佳至少一個肺泡II型(ATII)標記物。
在一較佳實施例中，此模型組織培養物可透過以下獲得，- 準備至少肺部上皮細胞與間充質細胞、較佳為成纖維細胞之一混合懸浮液，- 粒化懸浮液之細胞，- 在存在二氧化碳(CO2)時，培育還粒化懸浮液， - 將此模型組織培養物或模型組織培養物之細胞暴露於ATII型分化的一調節器，較佳為Wnt11，以及其中- 此模型培養物包含長方體狀上皮肺部細胞，較佳地表達至少一個肺泡II(ATII)型上皮分化標記物的這些上皮細胞顯示長方體狀形態。
較佳地，骰骨狀上皮肺部細胞之比率係為肺部上皮細胞或ATII型肺部細胞的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
在一較佳實施例中，此模型組織培養物細胞的至少一個類型表達Wnt11；較佳地此模型組織培養物包含肺部上皮細胞或自其衍生之細胞，這些細胞執行為過度表達克隆的重組Wnt11基因。在一較佳實施例中Wnt11蛋白質的基因透過一可誘發啟動子控制。
在另一較佳實施例中，在作為一三維培養物培養時，Wnt11蛋白質添加至模型組織之細胞中。
a)在一個較佳實施例中，此模型組織培養物不包含人工基質材料以提供三維環境給細胞。在一個實施例中，模型組織培養物不包含任何人工組織骨架材料，無論是生物可降解，還是生物不可降解的組織骨架材料，例如一多孔三維基質，一三維凝膠基質。在一個實施例中，此模型組織培養物不含或不包含微孔膜支撐物。
b)在一個較佳實施例中，此模型組織培養物還包含一細胞外 基質，細胞外基質的細胞外基質蛋白透過構成此組織的至少一種細胞類型，較佳為成纖維細胞所分泌。
c)在其他較佳實施例中，肺部上皮細胞包含至少一種下列細胞類型：
- I型肺細胞[肺泡I型細胞(ATI)]
- II型肺細胞[肺泡II型細胞(ATII)]。
較佳地，此II型肺細胞(具有ATII特徵的肺泡上皮細胞)表達一種或多種下列標記物：TTF1轉錄因數、表面活性蛋白A(SFPA)、表面活性蛋白C(SFPC)以及水通道蛋白3(AQP 3)。
較佳地，此I型肺細胞(具有ATI特徵的肺泡上皮細胞)表達一種或多種下列標記物：TTF1轉錄因數、水通道蛋白3(AQP 3)、水通道蛋白4(AQP 4)以及水通道蛋白5(AQP 5)。
在不同的其他實施例中，肺部上皮細胞與肺部間充質細胞中的至少一個存在於模型中。
這些細胞較佳為兩棲動物、爬行動物、鳥類細胞或更佳為哺乳動物細胞。
較佳地，鳥類細胞係為家禽肺部細胞。
較佳地，哺乳動物細胞為食草動物、較佳為家畜動物的細胞，例如綿羊、山羊的細胞、牛細胞或齧齒動物細胞(例如兔或鼠類細胞)。其他較佳的哺乳動物細胞為例如豬細胞等雜食動物細胞。更佳的細胞為人類細胞。
在其他實施例中，肺部上皮細胞與/或間充質細胞自下列中獲 得：- 建立的細胞系，較佳自商業來源獲得，- 健康供體- 患者供體。
在一較佳實施例中，細胞為原代細胞。在一較佳實施例中，細胞不為去分化細胞或為僅僅部分去分化之細胞。
在另一較佳實施例中，細胞為去分化細胞，或者細胞在其培養成三維模型組織培養物之前去分化。
在一較佳實施例中，肺部上皮細胞包含小氣道上皮細胞，較佳具有ATII特徵的小氣道上皮細胞。
在另一較佳實施例中，本發明的模型組織培養物還包含內皮細胞。在一較佳實施例中，內皮細胞係為HMVEC或HUVEC細胞。
任選地，本發明的模型組織培養物可更包含選自巨噬細胞、肥大細胞、平滑肌細胞的其他類型之細胞。
在一較佳實施例中，空洞的直徑或空洞平均直徑至少為0.1nm、0.5nm、1nm、2nm或5nm，並且至多為40nm、60nm、80nm、100nm、200nm、500nm或者1000nm，通常在1nm至200nm或者2nm至100nm之間變化。
較佳地，上皮細胞與間充質細胞均參與這些空洞的形成，較佳地參與這些空洞壁之形成。較佳地，類似於聚集體之表面，空洞壁之表面富集上皮細胞。
在一較佳實施例中，如果這些細胞或組織培養物使用一ATII型分化之調節物，較佳為Wnt11處理，則相比較於一控制未處理的三維培養物，空洞之尺寸與/或密度與/或數目增加。
在一較佳實施例中，聚集體的平均直徑或典型直徑係為至少10μm、40μm、60μm、80μm、100μm或120μm，並且聚集體的平均直徑或典型直徑係為至多1000μm、800μm、600μm、500μm、400μm或300μm。
極為有利地，聚集體的平均直徑或典型直徑極係為100-300μm，在一較佳實施例中，此直徑係為大約200μm。
聚集體的平均尺寸與空洞的平均直徑可透過任何實驗與數學修正方法以評估及計算或估計。雖然聚集體基本上呈球形，但顯然針對各聚集體多個直徑的直徑可歸因於與準確球形的偏差且視測量期間聚集體的位置與測量方法而確定。在空洞之情況下，在此作為示例，例如組織切片或成像法能夠用於此目的。舉例而言，最小和最大直徑可直接在測量若干聚集體尺寸的顯微鏡中測量並求平均值。為了方便，一顯微鏡宜用於達成此目的。
在一較佳實施例中，大部分聚集體，較佳至少60%、70%、80%或90%的聚集體具有至少10μm、40μm、60μm、80μm、100μm或120μm的直徑與至多1000μm、800μm、600μm、500μm、400μm或300μm的直徑，上述比率的聚集體之直徑極適合為100-300μm，在一較佳實施例中，此直徑為大約200μm。
在一較佳實施例中，各聚集體中或一試劑盒的各容器中培養 樣品包含的細胞的量為，至少103個，較佳至少104個，更佳至少2×104個、3×104個、4×104個、5×104個細胞，以及至多106個，更佳至多5×105個、4×105個、3×105個、2×105個或者至多105個細胞。
在一較佳實施例中，肺部上皮細胞與成纖維細胞基於其表面張力的差異而分離。較佳地，大部分肺部上皮細胞位於聚集體之表面上。
較佳地，大部分肺部上皮細胞在聚集體表面上形成一肺部上皮細胞襯裏，較佳地，此肺部上皮細胞襯裏至少部分地覆蓋聚集體之表面。
在另一較佳實施例中，聚集體還包含內皮細胞。
在一較佳實施例中，相比較於上皮細胞與成纖維細胞，內皮細胞的比率在聚集體的中心或中心區域中高於聚集體表面中，或內皮細胞的比率自聚集體的表面朝向聚集體的中心增加。
在一較佳實施例中，聚集體具有一層狀結構，其中聚集體的核心或中心區域包含最大比率的內皮細胞，聚集體的中間層或區域包含最大比率的成纖維細胞，並且聚集體的外層或表面層包含最大層的上皮細胞。
d)在一較佳實施例中，透過工程化三維肺部模型組織的組織細胞表達的上皮分化標記物為至少一種或多種選自下列群組的標記物： - ATII型分化標記物，較佳為TTF1轉錄因數、細胞角蛋白7(KRT7)、表面活性蛋白A(SFPA)、表面活性蛋白C(SFPC)與水通道蛋白3(AQP 3)，與/或假如存在ATI型細胞- ATI型分化標記物，較佳水通道蛋白4(AQP 4)以及水通道蛋白5(AQP 5)。
所表達的標記物還根據組織培養物中所用的細胞類型而定。
任何標記物之含量均可以mRNA或蛋白含量檢測。因此，標記物的含量可為mRNA含量與/或蛋白含量。
較佳地，本發明之模型組織培養物的AQP3與SFTPA含量中的至少一者增加，即它們相比於一對照二維培養物上調。
相比較於自以下選擇的一對照組織培養物，- 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照三維培養物，- 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照二維培養物，- 暴露於ATII型分化的一調節因子的對照二維培養物，在一較佳實施例中，在工程化三維肺部模型組織培養物中，a)至少一種肺泡上皮細胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)標記物上調，與/或b)至少一種發炎標記物下調，與/或c)上皮細胞間充質細胞轉變(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)禁止，與/或d)至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記物下調。
較佳地，相比較於自以下選擇的一對照組織培養物，- 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照三維培養物，- 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照二維培養物，- 暴露於ATII型分化的一調節因子的對照二維培養物，在另一較佳實施例中，在工程化三維肺部模型組織培養物中，至少一個以下的ATII標記物上調：- 一表面活性蛋白，較佳地自表面活性蛋白C(SFPC)、前表面活性蛋白C(pro-SFTPC)、表面活性蛋白A(SFPA)中選擇的一表面活性蛋白，較佳上調至少10%、20%、40%、50%、100%或200%，- 水通道蛋白3(AQP 3)，較佳上調至少20%、50%、100%或200%，- 甲狀腺轉錄因數1(TTF1)，較佳上調至少10%、20%、40%、50%或100%；與/或相比較於以上定義的一個或多個組織培養物，以下至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記下調：- S100鈣結合蛋白A4(S100A4)，- N-鈣黏蛋白(N-cad)，- 蝸牛同源物2(SLUG)，較佳地相比較於自以下選擇的一對照組織培養物- 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照三維培養物， - 沒有暴露於ATII型分化的一調節因子的對照二維培養物，與/或- E-鈣黏蛋白(E-cad)上調。
較佳地，本發明之模型組織培養物的選自IL1b、IL6和CXCL8的至少一種發炎標記物下調，即相比較於一二維培養物，它們的含量在三維培養物條件下減少。
較佳地，本發明之模型組織培養物的去分化標記物S100A4與N-鈣黏蛋白(N-cad)中至少一個的含量相比較於二維培養條件下或相比較於二維組織培養物中的純化之原代細胞減少。
在不同的其他實施例中，肺部上皮細胞與肺部間充質細胞中的至少一個存在於模型中，並且類似於胚胎肺發育，
- 肺部上皮細胞分泌一種或多種選自FGF4、FGF8、FGF9的成纖維細胞生長因數。
- 肺部上皮細胞在細胞表面FGFR2b受體的細胞表面上表達。
- 肺部間充質細胞、較佳為成纖維細胞分泌FGF7與FGF10以及表達FGFR1c與FGFR2c受體。
在本發明之組織培養物的一較佳實施例中，ATII型分化標記物與/或ATI型分化標記物的表達於高含量，更佳地，此實施例中的表達量相比較於在用作參考的二維組織培養物中所測量的表達量，高至少10%、至少20%或至少30%。
較佳地，此模型組織中上皮標記物的mRNA含量與/或蛋白含 量相比較於以上定義的或以下的一種或多種或每一種的參考培養物為高：- 相同細胞類型的一二維培養物，- 僅僅肺部上皮細胞的一培養物，- 僅僅原代成纖維細胞、較佳為人類成纖維細胞的一培養物。
較佳地，至少兩種標記物的含量升高。
在一較佳實施例中，應用小氣道上皮細胞。
在另一較佳實施例中，應用顯示至少一些ATII型特徵的小氣道上皮細胞。此種情況下，模型組織顯示至少一種或多種選自下列ATII型分化標記物群組(例如上文所列的標記物)之標記物的mRNA含量與/或蛋白含量增加。
本發明的工程化三維肺部模型組織較佳顯示一種或多種促炎性細胞因數與或一種或多種EMT標記物的表達減少。
較佳地，此模型組織中一種或多種的促炎性細胞因數之mRNA含量與/或蛋白含量低於一種或多種以上或每一種下列參考培養物：- 相同細胞組成的一二維培養物，- 僅僅肺部上皮細胞的一培養物，其中肺部上皮細胞類似於模型組織培養物加以處理。
較佳地，促炎性細胞因數選自下列群組：CXCL-8促炎性細胞因數、IL6、IL1a、IL1b、TNFα。
在一極佳實施例中，促炎性趨化因數為CXCL-8化學引誘物。
在一較佳實施例中，模型組織培養物包含肺部上皮細胞與肺部間充質細胞且不包含內皮細胞，其中- 一種或多種下列標記物的含量相對於包含非培養細胞的對照增加：E-cad、IL-1b與/或IL6，- E-cad的含量相對於對照二維培養物增加，- 一種或多種下列標記物的含量相對於對照二維培養物減少：IL-1b、CXCL8、IL6。
在一較佳實施例中，模型組織培養物包含肺部上皮細胞、肺部間充質細胞以及內皮細胞，其中一種或多種下列標記物的含量相對於包含非培養細胞的對照減少：E-cad、N-cad。
- E-cad的含量相對於對照二維培養物增加，- 一種或多種下列標記物的含量相對於對照二維培養物減少：N-cad、S100A4。
在一較佳實施例中，三維肺部模型組織培養物另外包含選自下列群組之細胞：- 內皮細胞，例如以類比脈管系統，- 巨噬細胞，- 肥大細胞。
在後期，模型可使用下列細胞類型擴增：- 平滑肌細胞，- 神經細胞。
疾病模型
本發明還涉及一工程化三維肺部模型組織培養物，其中此模型組織培養物 a)不含一人工組織骨架，其中此人工組織骨架係為一多孔三維基質；一三維凝膠基質或者一多孔膜載體，b)包含培養間充質細胞，較佳成纖維細胞，c)包含培養肺部上皮細胞，d)具有一個或多個細胞聚集體的形態，其中這些聚集體包含多重空洞，在此模型組織培養物中，上皮細胞與/或間充質細胞，較佳為成纖維細胞包含具有患病肺組織的病理特徵的受影響細胞，以使得此模型組織培養物為肺部疾病模型組織培養物。
在較佳實施例中，疾病包含選自組織發炎、腫瘤、纖維化、損傷的病狀，並且模型組織培養物分別被視為一發炎模型、一腫瘤模型、一纖維化模型或者一再生模型。
在本發明之一較佳實施例中，根據本發明之工程化三維肺部模型組織培養物，Wnt11在此模型組織培養物之細胞中，較佳在成纖維細胞中靜默、下調或者麻醉，以及由此模型組織培養物表現出一腫瘤，較佳為非小細胞肺癌，更佳為腺癌的典型EMT特徵。
較佳地，腫瘤模型為非小細胞肺癌模型。
較佳地，此模型培養物表達一腫瘤的典型EMT標記物，較佳為以下標記物的至少一個：S100A4、N-cad、SLUG，較佳地，在 相比較於其中Wnt11沒有靜默、下調與/或麻醉的一對照培養物更高的含量表達。
在一較佳實施例中，Wnt11之含量透過小干擾RNA(siRNA)，透過此模型的間充質量細胞或上皮細胞的轉導下調。在後者的情況下，例如能夠使用不感染成纖維細胞的一充組腺病毒。
疾病模型的受影響細胞可為(但不限於)自患者獲得的細胞(患者細胞)，具有疾病特徵的細胞系，例如腫瘤細胞系；暴露於引起疾病特徵的環境作用(例如促炎性物質)的細胞；暴露於誘變劑作用且針對疾病特徵加以選擇的細胞；或經遺傳改變的細胞，此細胞經轉化以表達一種蛋白質或其中一種基因沉默，以便具有一患病特徵。
在一較佳實施例中，細胞自健康個體獲得，並且在其中誘發疾病病況。在本實施例中，例如可確定腫瘤誘發的信號傳導或潛在藥物靶。
在另一實施例中，腫瘤模型組織自永生細胞製備，例如自惡性轉化或腫瘤細胞或細胞系製備。雖然在本實施例中不存在“健康”對照，但因為與安慰劑藥物接觸的樣品提供藥物治療樣品的對照，所以此系統適用於藥物測試。
在一個實施例中，腫瘤細胞自一患者獲得，並且可測試計劃療法的效率。因此，模型組織培養物可用於建立個人化療法。
製備方法
本發明還提供如本文所定義的工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，此方法包含以下步驟：- 製備至少原代成纖維細胞與肺部上皮細胞的混合懸浮液，- 將混合懸浮液或其等分試樣放置於適於粒化懸浮液細胞之容器中，- 粒化細胞，- 在二氧化碳(CO2)存在下培育粒化懸浮液並且保持足以使得細胞形成包含細胞聚集體的三維肺部模型組織的時間，- 任選分析模型組織，用以a)肺組織所特有的一種或多種上皮分化標記物的表達，並且相較於例如本文所揭示的適合參考培養物，表達量增加被認為指示形成一三維肺部模型組織培養物；與/或b)一種或多種促炎性細胞因數的表達，並且相較於例如本文所揭示的任何適合參考培養物，表達量減少被認為是指示形成三維肺部模型組織培養物，與/或c)至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記物，以及相較於一適合參考培養物(如上所述)，表達量減少被認為是指示形成一三維肺部模型組織培養物，與/或d)一個或多個聚集體之形態
在一較佳實施例中，此培養物之細胞暴露於Wnt11/與Wnt11相接觸，其中較佳地，a)在培養期間，Wnt11添加至培養物， b)提供一細胞培養物，其中至少一個類型之細胞，較佳為上皮細胞或間充質細胞重組及過度表達Wnt11。
較佳地，容器係為非組織培養物處理容器。
較佳地，多個等分試樣放於多個容器中。
較佳地，容器為例如96孔板或384孔板等板之孔。
較佳地，粒化在200g到600g下進行1分鐘至20分鐘、較佳為2分鐘到10分鐘。
較佳地，細胞經供給報導分子，例如用生物相容性染料染色以報導如本文所揭示的細胞特徵。
容器可為V形底、平底或U形底容器，視其用於達成之目的而定。
在製備混合懸浮液時，一種或多種類型的細胞在18小時內，較佳為16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時內，更佳為4小時、3小時、2小時內，極佳為1小時或0.5小時內加入容器中。所用各種類型的細胞較佳在以上定義的時間內加入。
在一較佳實施例中，粒化懸浮液在二氧化碳(CO2)存在下培育不超過50小時、40小時、30小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時或10小時之時期。在一較佳實施例中，粒化懸浮液在二氧化碳(CO2)存在下培育不少於2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時的時期。
在本發明之一實施例中，其他類型的細胞加入細胞的混合懸浮液中。在本發明之一實施例中，其他類型的細胞至少為內皮細 胞。在本發明之一實施例中，其他類型的細胞選自內皮細胞、平滑肌細胞、神經細胞、粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、T/B淋巴細胞、巨噬細胞。粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、T/B淋巴細胞以及巨噬細胞可呈非活性或免疫活性狀態加入培養物中。
任意地，根據本發明之方法包含在製備混合懸浮液前將一種或多種類型細胞去分化。
任意地，根據本發明的方法包含在製備混合懸浮液前繁殖一種或多種類型細胞。如果需要平行測試大量樣品，例如在HTS(高通量篩選)溶液中，那麼此步驟尤其需要。
篩選方法
本發明還涉及針對藥物對肺組織的作用篩選藥物之方法，此方法包含以下步驟：- 提供如本文所定義的工程化三維肺部模型組織培養物，- 取此模型組織培養物的至少一個測試樣品以及一參考樣品，- 使得測試樣品與藥物相接觸，同時維持測試樣品與參考樣品處於相同條件下，- 相比較於參考樣品，檢測測試樣品的任何變化或改變，其中如果檢測到測試樣品的任何變化或改變，則認為是指示藥物的作用。
在此方法的某些變體中，僅僅觀測到變化或改變的方向，並且未計算生理學值。在某些變體中，基於校準曲線，界定預定臨 限值，並且與此值進行比較。
在一較佳實施例中，模型組織培養物為健康肺組織模型且測試藥物的不良作用，其中對測試樣品細胞有害的變化或改變被認為是藥物的有毒或不良作用。
在一較佳實施例中，模型組織培養物為包含具有病理特徵的受影響細胞之一肺部疾病模型組織培養物，並且測試藥物的有益作用，其中- 對此模型組織培養物提供測量或評估病理特徵的分析以獲得疾病量度，- 提供健康肺組織的參考樣品(健康參考樣品)與/或患病肺組織的參考樣品(患病參考樣品)，- 在健康參考樣品與/或患病參考樣品中，以及在至少一種測試樣品中在其與藥物接觸前後，測量或評估病理特徵，其中使得測試樣品中疾病量度移向健康參考樣品中疾病量度與或遠離患病參考樣品中疾病量度的測試樣品中任何變化或改變，被認為是此藥物的有益作用。換句話而言，與患病參考樣品相比較，其更類似於健康參考樣品的狀態。
在一較佳實施例中，應用自患者獲得的原代細胞。在一較佳實施例中，來自既定患者的原代細胞未去分化或僅部分去分化，並且在自此患者獲得後5天、4天、3天、2天或1天內或12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時內用以製備細胞的混合懸浮液。
在用原代細胞製成的模型組織培養物中，可研究既定患者的疾病病況之特徵並可測試治療藥物與/或方案。
試劑盒
本發明還涉及一種工程化三維肺部模型組織試劑盒，此試劑盒包含具有容器陣列的測試板，其中至少兩個容器包含- 一種或多種類型的如習知技術方案中的任一技術方案中所定義的工程化三維肺部模型組織培養物之樣品，各樣品放入此板的單獨容器中，- 用以培養模型組織培養物的之細胞的適當培養基。
較佳地，容器之一子集包含一種或多種對照樣品。對照樣品可為某些細胞類型的純培養物，例如僅上皮細胞與成纖維細胞的培養物與/或二維(2D)培養物。在疾病模型中，對照可為健康細胞的培養物。
較佳地，工程化三維肺部模型組織試劑盒具有一種或多種下列特徵：
- 板為96孔板。
- 板為V形底板或平底板或包含V形底與平底孔之板。
U形底板也可應用。
- 各容器中培養物樣品包含的細胞量為至少103個，較佳至少104個、更佳至少2×104個、3×104個、4×104個、5×104個細胞，以及至多106個，較佳至多5×105個、4×105個、3×105個、2×105 個或至多105個細胞。
- 容器各別或一起密封，並且含有富集二氧化碳(CO2)的適於肺組織培養物的環境或氣氛。
- 富集二氧化碳(CO2)的環境或氣氛包含至少2%、3%、4%的二氧化碳(CO2)環境，至多10%、9%、8%或7%的二氧化碳(CO2)環境，極佳大約5%的二氧化碳(CO2)。
在較佳實施例中，這些樣品包含測試樣品與相應的對照樣品。
在較佳實施例中，測試樣品存在於V形底板上或存在於板上的V形底孔中，並且對照樣品存在於平底板上或存在於板上的平底孔中。
本發明還關於一種Wnt11蛋白，用於組織修復，較佳為肺組織損傷修復，疤痕癒合，肺泡組織再生或自肺組織損傷選擇的一狀況之處理；肺纖維化，例如氣道及間質性肺纖維化，包含石棉肺、肉狀瘤病以及特發性肺纖維化的慢性纖維化；肺炎，產生阻塞氣流的疾病；慢性阻塞性肺部(COPD)。
本發明還關於一種肺泡組織再生、肺組織損傷修復或以上定義的一狀況下的處理，在以上定義的一兩棲動物、一爬行動物、一鳥類或者一哺乳動物中，此方法包含以下步驟，- 提供Wnt11， - 將透過此狀況影響的哺乳動物之細胞與在一有效含量的下Wnt11相接觸以改善此狀態。
在本發明之一實施例中，Wnt11蛋白以蛋白製劑的形式提供，例如以噴霧，較佳為吸入型噴霧，注射液，軟膏或其他適合於目標肺組織的形式。
在本發明之一實施例中，Wnt11蛋白以一細胞療法的形式提供，以及此蛋白透過重組細胞，較佳透過間充質細胞，例如，間充質幹細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞或在此定義的其他類型的細胞表達。
本發明還關於一哺乳動物肺部細胞，此肺部細胞包含執行一Wnt11蛋白的基因編碼的表達盒，此細胞能夠表達此Wnt11蛋白。
在本發明之一實施例中，細胞為一原代成纖維細胞且基因透過一慢病毒載體引入。
在本發明之另一實施例中，細胞為一上皮細胞且基因透過一慢病毒載體或透過一腺病毒載體引入。
較佳地，Wnt11蛋白之基因在習知技術所知的一誘導型啟動子下控制。
較佳地，此細胞用於肺泡組織再生、肺組織損傷修復或以上定義的狀態之處理。
本發明還關於一肺癌或惡性腫瘤，較佳為一非小細胞癌(NSCLC)，較佳為腺癌的診斷，其中 - 一樣本自一患者提供(患者樣本)- Wnt11與/或其受體，即Frizzled(FZ)-7之含量以mRNA或蛋白含量評估，- 在此患者樣本中的估定量與一健康個體的典型量相比較，一健康個體的此典型量或者自一健康個體(健康樣本)獲得的一平行對照樣本獲得，或者確定為多個健康樣本之的一平均或閥值，其中如果此患者樣本中的Wnt11與/或其受體，即Frizzled(FZ)-7之含量相比較於一健康個體的典型量下調，則此患者認為是具有或可能具有對一肺癌或惡性腫瘤，較佳為一非小細胞癌(NSCLC)，較佳為腺癌或對其敏感的個體。
定義
在本發明的上下文中，“人工組織骨架”的含義為一種固體支撐材料，其用於細胞附著與/或輔助組織或細胞培養物中細胞的結構三維佈置之結構。此人工組織骨架較佳在培養組織或細胞前製造且在培養組織或細胞前或在此期間與組織或細胞接觸。因此，人工組織骨架通常為透過影響至少一部分細胞相互作用(例如細胞-細胞相互作用)或細胞環境自身，促進例如組織或細胞培養物三維結構等結構形成的細胞生長支撐結構或材料。因此，如果一組織骨架自組織或細胞培養物中去除，則組織或細胞培養物將瓦解或變混亂。
人工組織骨架可由一生物可降解材料製造。所屬領域的技術人員應瞭解，生物可降解材料之可降解並非組織骨架之去除。換 句話而言，如果人工組織骨架用生物可降解材料製成且其逐漸降解，使得細胞-細胞相互作用形成，那麼不認為此為去除組織骨架且此方法中組織或細胞培養物可能不會瓦解或變混亂。
在一個型式中，人工組織骨架為三維基質，較佳為三維凝膠基質或多孔三維基質，此基質較佳具有細胞所處的微空間或孔。
在一個型式中，人工組織骨架自身為細胞附著於表面上的支撐物，較佳為多孔膜支撐物。在骨架的此型式中，其具有特別設計用於以及適用於細胞附著之結構，例如多孔或彎曲或鋸齒狀或槽形表面，細胞附著於此表面，從而促進三維結構的形成。
較佳地，人工組織骨架- 具有一定義的三維結構，- 係為多孔、較佳為一高度多孔材料或基質，- 係為一多孔膜，- 係為一多孔三維基質，- 係由一生物相容性材料製成，與/或- 係由一聚合物製成。
任意地，“人工組織骨架”為基於多糖之基質，例如為基於纖維素之基質，例如甲基纖維素基質。
任意地，“人工組織骨架”具有珠粒結構。珠粒結構“人工組織骨架”可例如為一大孔性或微孔性珠粒，一覆蓋有一基質，例如一膠原蛋白基質，例如賽德斯珠粒(cytodex bead)。
這裡，“不含任何人工組織骨架的三維組織培養物”應理解 為具有三維結構之組織培養物，其中此組織培養物的三維結構為透過內在的細胞-細胞相互作用形成或促成，並且未得到一人工組織骨架之幫助。
因此，不含任何人工組織骨架的三維組織培養物在缺乏人工組織骨架的情況下未瓦解或變混亂，而是維持其三維結構。即使此不含任何人工組織骨架的三維組織培養物在固體支撐材料上培養與形成，三維結構的形成也未得到此固體支撐材料幫助且並非歸因於細胞附著於此固體支撐材料，而且其可在不破壞三維結構的情況下分離。
在此所使用的“細胞分離”係指組織或細胞培養物的至少兩種類型細胞之空間隔離，由此在此空間隔離(即分離)之後，可定義或發現兩種類型細胞的比率不同於分離前培養物同一區域中相同類型細胞的比率與培養物其他區域中相同類型細胞的比率之培養物區域，例如(部分)體積或表面。較佳地，至少兩種類型細胞之表面張力差異顯著促進其活體外分離。
例如一培養物的某一體積或部分體積或表面或部分表面等區域“富集”某一細胞類型應理解為此區域中某一細胞類型之比率高於參考區域(例如培養物的其他區域)中之現象。通常，培養物的區域“富集”係為細胞分離的結果。
“發炎”係為例如感染與組織損傷等有害刺激物及情況下引發的一適應性反應。
大量細胞因數因加速發炎而統稱為“促炎性細胞因數”，其 還直接或透過其誘發某些細胞類型中的細胞黏著分子或其他細胞因數合成的能力調節發炎反應。負責早期反應的主要促炎性細胞因數為IL1-α、IL1-β、IL6以及TNF-α。其他促炎性介體包含IFN-γ、CNTF、TGF-β、IL12、IL17、IL18、IL8(CXCL8)以及多種化學引誘發炎細胞的其他趨化因數以及各種神經調節因數。發炎反應的實際結果為透過促炎性細胞因數與消炎細胞因數(例如IL4、IL10和IL13、IL16、IFN-α、TGF-β、IL1ra、G-CSF、針對TNF或IL6的可溶性受體)之間的均衡以確定。不同卡斯蛋白酶對IL1-β的活化在稱為發炎體的大型多蛋白複合物中進行。
LIF、GM-CSF、IL11以及OSM係為影響發炎過程的其他細胞因數且其可能適用於製備本發明的疾病模型。
相反，像IL10等“消炎細胞因數”調節發炎過程，以使得它們受到抑制或減輕。
三維組織的“平均直徑”視為透過上述方法產生的三維組織直徑的若干測量值之算術平均值。
“典型直徑”(中值直徑)為標記給定的沉澱物樣品(sediment sample)分成兩個相等重量份的直徑，一重量份包含有大於此直徑的所有聚集體且另一重量份包含有小於此直徑的所有聚集體。
容器之“陣列”應理解為佈置多個具有相同尺寸、形狀以及材料的容器。佈置可為例如一連串容器，或者這些容器的一二維基質。
病毒係為感染細胞的專性細胞內病原體，常常對特定細胞類 型具有巨大之特異性。“重組病毒載體”係為缺失一些基因且相關基因加入病毒基因組中。重組病毒載體可轉導其通常將感染的細胞類型。
“癌症”係為一組細胞顯示不受控制的生長、侵襲(侵入與破壞相鄰組織)且有時顯示轉移(透過淋巴或血液擴散至體內其他位置)的一類疾病。癌症的這三種惡性特性將其與良性腫瘤區分開，良性腫瘤自我限定，不侵襲或轉移。95%的肺腫瘤為支氣管癌；也為支氣管類癌、間充質、混雜贅生物。
“纖維化”為器官或組織中作為一修復或反應過程的過量纖維結締組織形成或出現，與作為器官或組織正常組分的纖維組織形成相反。肺部纖維化為嚴重的慢性疾病，其特徵為彈性消失，並且肺上皮細胞經間質成肌纖維細胞替換，並且肺間質中細胞外基質蛋白沉積，導致肺部結構重塑。
“空洞”在此理解為透過一些物質，特別為透過細胞或細胞組織包圍之空間。特別地，本發明之一空洞係為一天然中空或穴或內腔，位於此模型組織培養物之一聚集體之中，即，內側或內部。多重空洞提供此聚集體的可認為一多孔之結構。
用語“空洞之壁”在此理解為包圍與/或圍繞與/或，整體上環繞此內腔的組織部份。此壁之厚度能夠根據環節需要以多種方式定義。例如，能夠認為由表面層或細胞之層組成。或者，壁之厚度能夠認為是具有一有限厚度的組織部份。
“包含”某物在此理解為包含一些事物或還可能另外的事 情。例如，包含一成分不排除存在另外之元件或其他材料。
如果一組成，例如一組織或組織培養物為“由某成分組成”，則表示此成分為必要的，即參與形成此組成；較佳地，這些成分為構成成分；當然，如果可能，還存在這些成分之外沒有提及的另外的成分。舉例而言，如果一組織或組織培養物由一種多多種類型之細胞組成，則這些細胞在形成此組織中必不可少，即，如果不具有這些成分中的任何一個，此組織或組織培養物將會為一不同類型的組織或組織培養物；然而，這不排除可存在另外的細胞或細胞類型，甚至成分的一些變體。
對一物質“暴露模型組織培養物”或“暴露模型組織培養物之細胞”在此理解為此物質以任何形式添加至此培養物中，例如以隔離形式，例如以上清液或純化形式，或者一重組表達此物質的細胞添加至培養物或隨意地與此培養物共同培養。
本發明者建立一種簡單的工程化三維肺部模型組織培養物，其適用作肺組織模型且備用於不同的測試方法中。
本發明之工程化三維肺部模型組織培養物免去一人工組織骨架，包含至少為肺部上皮細胞及間充質細胞的培養細胞，較佳為成纖維細胞，以及具有肺部組織的典型形態特徵，特別地，此典型形態為一種或多種細胞聚集物體之形式，其中聚集體包含空洞或魯米那(luminal)結構。
在本發明之模型組織培養物培養物中，通常這些聚集體之表 面富集肺部上皮細胞。因此，相比較於間充質細胞，上皮細胞之比率在聚集體之表面相比較於氣體部份，例如聚集體的內部或內部之部份更高。
此三維培養物中的上皮細胞表達上皮分化標記物，典型地，相比較於對照非培養細胞或對照二維培養物以更高之含量表達這些標記物。在本發明之一實施例中，此人工組織骨架係為一多孔三維基質；一三維凝膠基質或一多孔薄膜載體。
在本發明之一極佳實施例中，具有一改良形態及肺部標記物表達外形的模型組織培養物透過使用Wnt11蛋白作為一進一步步驟處理可獲得。在本發明之一實施例中，此模型組織培養物使用表達或過度表達Wnt11蛋白的細胞上清液處理。在另一實施例中，此組織的一種或多種類型之細胞表達或過度表達或重組表達Wnt11蛋白。
本發明之工程化三維肺部模型組織培養物透過一包含以下步驟之方法製備- 準備至少肺部上皮細胞與間充質細胞的一混合懸浮液，- 粒化此懸浮液之細胞，- 在二氧化碳(CO2)存在下，對細胞培育粒化之懸浮液進行一充分時間，用以形成包含一個或多個細胞聚集體的一三維肺部模型組織培養物。
這些細胞較佳為成纖維細胞。
在本發明之一實施例中，此模型組織進行分析用以 a)相比較於認為表現一三維肺部模型組織培養物的一參考培養物，表達對模型組織培養物的一個或多個上皮分化標記物，以及一增加的表達量；與/或b)相比較於認為表現一三維肺部模型組織培養物的一適合參考培養物，表達對模型組織培養物的一個或多個以上定義的促炎性細胞因數，以及一減少的表達量，c)一個或多個聚集體之尺寸及形態。
此參考培養物可為一非培養上皮細胞與間充質細胞之組成物或者可為一類似的二維培養物。
在本發明之一較佳實施例中，此培養物使用一Wnt11蛋白進一步處理且在Wnt11蛋白存在下培養，以使得獲得一改良的形態及標記物表面外形。在本發明之一實施例中，此模型組織培養物使用表達或過度表達Wnt11蛋白的細胞之上清液處理。在本發明之另一實施例中，假設一種或多種類型的組織之細胞表達或過度表達或重組表達Wnt11蛋白。
基於骨架的系統與無骨架的系統如在此所述加以測試。發明者已經對此三維無骨架肺部模型組織培養物進行分析，並且意外地發現根據非組織特有標記物表達與形態，此三維無骨架肺部模型組織培養物顯示與天然肺組織驚人的相似性。
不受理論之束縛，由於具有結構的聚集體之形成，似乎本模型避免了成纖維細胞過度生長之問題。在習知技術中，沒有在聚集體中的成纖維細胞可附著於容器之表面，開始繁殖直至由其獲 得接觸抑制。
可以理解的是，在某些系統中，例如基質等骨架為生物可降解的。然而，因為骨架影響或定義組織培養物的結構或形狀，所以即使在骨架降解之後，這些系統也不應認為為無骨架系統。此外，在活體外系統，如同本發明中，一般未預期可降解膜會溶解。
此外，生物可降解骨架的溶解需要很長時間，相比較於本發明的組織培養物的製備與使用時間更長。
不為去分化細胞的細胞也可應用在本發明中，然而細胞數目應很小。因此，本實施例主要適用於少量細胞足夠用於計劃測試，例如測試足夠敏感的情況下。在快速測試中，可自純化的分化細胞開始製備本發明的模型組織培養物。如此之細胞可自個體新鮮制得。此型式的方法尤其適用於例如藥物或化合物的患者特異性測試，或活性劑的作用有待在特定疾病背景(例如針對潛在製造商)中測試的情況。
原代細胞也可自商業來源獲得。例如小勒尚工業園龍沙韋爾維耶有限公司(Lonza Verviers,S.p.r.l.Parc Industriel de Petit-Rechain)，比利時(Belgium)韋爾維耶B-4800；生物中心有限公司(Biocenter Ltd.)，塞格德(Szeged)塔梅斯瓦利(Temesvári krt.)62 H-6726，英傑公司(Invitrogen Corporation)(生命技術公司(Life Technologies Corporation)(美國(USA)加利福尼亞(California)卡爾斯巴德(Carlsbad)范艾倫路(Van Allen Way)5791，92008)的一部分)。
如果需要大量樣品，則細胞有待在製備模型組織培養物樣品前繁殖。在此過程期間，可能出現去分化。此為篩選(例如HTS)應用中的情況。在患者特異性測試中，較少量的樣品即足夠。
當細胞在聚集體中分化時，繁殖減慢或停止，並且此後聚集體未顯著增加。
如果少量樣品即足夠，則無需預先繁殖。通常，此種情況可能發生在針對幾種藥物的患者樣品測試中或有待觀測例如信號傳導過程等某些現象的情況下。然而，在篩選過程中，需要大量樣品並應在製備模型組織培養物前繁殖細胞。
在本發明的較佳實施例中，使用成人去分化上皮細胞。所屬領域中並不知道在成纖維細胞存在下簡單共培養的成人去分化上皮細胞能夠實現分化，而此情況在三維條件下，尤其在適於形成三維聚集體的條件下進一步增加。因此，在一較佳實施例中，模型組織培養物製備自去分化細胞開始。
保持於例如二維組織培養物等培養物中的原代細胞將顯示某些去分化標記物。因此，如此之細胞可應用於本發明中。去分化標記物包含S100A4、N-鈣黏蛋白以及發炎標記物。從而可應用較大量的細胞。
在添加組織組分與/或因數後，可使得多能或未分化細胞能夠分化。
肺組織內的細胞相互作用 細胞去分化和再分化
幹細胞與組織特異性祖細胞可進行組織特異性分化的定向步驟，因此代表產生器官特異性組織培養材料的理想來源。遺憾的是，此兩種細胞類型在分化組織中只可以有限數目地使用。
因為組織模型需要根據實驗與/或測試要求定期建立，所以組織特異性分化細胞代表更好的原材料來源，這只是因為其更多。本發明的模型系統至少部分利用分化細胞在二維培養條件下可去分化且使用適當的培養條件可迫使其再分化的現象。
細胞相互作用
肺發育，以及上皮損傷修復透過似乎共同調節肺中幹細胞與成人祖細胞的功能之刺激基因與抑制基因之間的精密平衡來緊密協調。舉例而言，FGF受體酪氨酸激酶信號傳導對呼吸器官形成來說不可或缺，並且透過誘導性FGF路徑抑制劑家族反向調節(張(Zhang)、斯塔彭貝克(Stappenbeck)等人，2005)。另外，FGF信號傳導為形成新的肺泡、保護肺泡上皮細胞免受損傷以及肺修復期間假定肺泡幹細胞/祖細胞遷移與增殖所需。反之，藉由Smad 2、3以及4的TGF β受體絲氨酸-蘇氨酸激酶信號傳導抑制肺形態形成，並且可抑制出生後肺泡發育，而透過Smad3的過度TGF β信號傳導則會引起間質性纖維化。
我們目前理解，肺、遠端氣道的整體結構與功能的維護取決於II型細胞(ATII)。II型細胞(ATII)負責肺表面活性劑之合成與分泌以及肺泡I型(ATI)細胞之產生。這些細胞在肺上皮細胞中的比例微調，因此在發育與其後的傷後再生期間為一個決定性 的問題。不過，儘管透過循環多能細胞植入，似乎相比較於其他組織更頻繁地發生於肺損傷為特別重要的事實(克勞斯(Krause DS)，2001年)，但是，確定與調節II型分化的因素仍然知之甚少。
使用主要人體組織尤為重要，因為非人體模型對於成功理解人體組織類型與器官內的分子間的相互作用往往大打折扣。分子生物學研究中頻繁使用，並且在傳統的二維(2D)細胞培養物條件下培養的失去其特徵的分化標記物的主要的人體細胞可應用一三維結構。
因此，需要一種交互之要求，雖然間充質細胞與上皮細胞之間的相互作用的系統相當複雜。本發明者推測，一基本的肺癌模型可透過使用純化的肺泡上皮細胞與成纖維細胞混合創建。
因此，發明者最初僅使用兩種類型的細胞：基本的人類成纖維細胞(NHLF)與小氣道上皮細胞(具有ATII特性的SAEC)，這兩種類型的細胞均可自龍沙公司(Lonza)購得。意外地發現，這兩種細胞類型提供形成一三維肺組織模型必要的因素。本領域之技術人員明白，透過添加其他細胞類型，例如，在此列出的細胞類型，該模型可以進一步發展。
該三維肺模型不使用外部預構建的支架材料或細胞外基質(ECM)而建立，基質膠或其他ECM衍生的水凝膠，使得成纖維細胞與上皮細胞分泌細胞外基質(ECM)且創建自己的支架。
三維培養物中的標記物表達
此模型的分子特性採用實時PCR分析，以上皮分化標記物為基礎。自細胞聚集體純化mRNA且產生cDNA。標記物表達圖譜表示ATII類型分化的一可誘導增加，並且透過ATI類型標記物表達沒有增加進一步得到支持。一旦上皮細胞與成纖維細胞共同培養，則S100A4與N-鈣黏蛋白含量顯著減少，而E-鈣黏蛋白含量增加。“鈣黏蛋白轉換”[茲斯伯格(Zeisberg M)與尼爾森(E.G.Neilson)(2009)]在三維培養條件中相比較於在二維培養條件中更顯著，表明除了存在成纖維細胞，三維結構也需要減少SAEC的去分化。
由於透過肺部感染或肺泡上皮損傷(連續的上皮細胞層之破壞)引發，促炎性細胞因子透過肺泡上皮產生，用以吸引炎性細胞，包含嗜中性白血球。
促炎性與炎性標記物的表達下降在三維條件下培養的SAEC中比較顯著。
成纖維細胞(VIM)與AEC(KRT7，SFTPA和SFTPC)標記物的免疫熒光染色揭露出，表明這兩種類型的細胞分離的不同的標記物之表達的重疊遠未完成。僅使用成人SAEC與NHLF細胞重新創建的類似遠端氣道的結構證明，不僅胚胎細胞，而且純化與分化的成人原代細胞保留自己的能力，用以形成類似體外原組織的組織結構。
在Wnt11處理與非處理模型組織培養物中均使用定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)，包含甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)、 水通道蛋白(AQP)以及表面活性蛋白(SFTP)的肺上皮分化標記物自三維模型純化的肺泡上皮細胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)中進行分析，並且與在傳統的二維(2D)SAEC、三維SAEC以及二維的SAEC加NHLF的混合培養物中培養的培養肺泡上皮細胞(AEC)相比較。自純化SAEC的II型特性漸進的去分化在二維與甚至三維，但沒有在三維共培養下檢測。由於II型標記物表面活性蛋白A(SFTPA)(「第1H圖」)在自二維SAEC與NHLF的共同培養物中純化的SAEC中已經收回，因此NHLF的存在確認為II型分化的一重要組成部分。
當上皮細胞在一三維系統中存在的間充質細胞(成纖維細胞)中孵育時，在一II型分化標記物中檢測到一明顯的增加。而且，去分化標記物的下調表明在此三維模型中具有上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)的抑制。經檢驗，成纖維細胞原來是三維模型中Wnt11的原始來源(「第4C圖」)，表明類似於胚胎肺部組織，在成人的AEC分化中包含Wnt11。
總之，在所有研究的培養條件下Wnt11能夠增加肺泡上皮細胞的ATII型分化，這一點由表面活性劑的表達急劇提高標記。然而，Wnt11在成纖維細胞與上皮細胞的直接相互作用中僅能夠上調表面活性劑，表明在維護成人原代肺部組織中交互的相互作用之重要性。
意外地，發現Wnt11之效果在三維培養物與二維組織培養物中相反(如「第9圖」及「第15圖」所示)。
在本發明之一較佳實施例中，相比較於沒有暴露於Wnt11的一對照三維組織培養物，一個或多個以下的標記物含量，較佳為mRNA含量變化：AQP3含量增加至少1.5、2、2.5或者3倍，TTF-1含量增加至少1.5、2或者2.5倍，KRT7含量增加至少1.2、1.5或者2倍，pro-SFTPC含量增加至少1.2、1.5、2、2.5或者3倍，SFTPA含量增加至少1.2、1.5、2、2.5或者3倍。
相比較於暴露於Wnt11的一對照二維組織培養物，一個或多個以下的標記物含量，較佳為mRNA含量變化：AQP3含量增加至少2.5、3、4、5、6、7或者8倍，TTF-1含量增加至少2、2.5、3、4、5或者6倍，KRT7含量增加至少2.5、3、4、5、6、7或者8倍，pro-SFTPC含量增加至少1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7或者8倍，SFTPA含量增加至少1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7或者8倍。
因此Wnt11產生具有一增加的ATII特性與減少的EMT特性的更加分化的組織，該事實表明Wnt11適合於組織的損傷修復，並且在引起肺組織損傷的疾病及疤痕的治療中有用。
混合培養物中細胞類型的分離(分選)
顯微鏡檢查證明，自發的組織改組-“分選”-發生於三維肺原代 細胞培養物中。本發明者在本文中使用簡單的離心方法使得細胞聚集，類似於製備胎胸腺器官培養物的方法。[海耳(Hare,K.J.)等人(1999)]本文提供的證據證明，原代肺部上皮細胞與成纖維細胞的三維共培養相比較於二維或三維活體外單一培養物中更有利於SAEC維持更多分化的狀態。包含NHLF不僅促進上皮細胞分化，而且相較於僅僅SAEC(「第2圖」)或SAEC-HMVEC(「第10a圖」)培養物，三維微量組織的黏著和結構堅固緻密得多。
由人類小氣道上皮細胞(SAEC)與正常人類肺成纖維細胞(NHLF)組成的本發明兩種細胞類型共培養物系統無需存在外部加入的ECM以形成與維持三維結構(「第2圖」)。粒化單細胞類型與各種比率的細胞混合物的SAEC與NHLF細胞懸浮液顯示，建立肺部微量組織需要存在成纖維細胞以維持緻密穩定的三維結構(「第2圖」)。三維微量組織的形態學檢查顯示，混合培養物中兩種細胞類型的分離為三維微量組織的特徵，成纖維細胞形成內部核心部分，而上皮細胞覆蓋外層(「第2圖」)。分離或“分選”現象為基於細胞類型的不同黏著能量特徵且先前並未針對原代人類肺組織描述。自發細胞“分選”為基於不同細胞類型之間黏合力的差異：肺部微量組織的最黏合核心或中心區域由NHLF群體形成，NHLF群體透過不太黏合的SAEC圍繞。尤其關注原代分化的人類肺組織中的分離過程，因為此想法的基礎為即使分化的人類成人細胞也維持其主動探究其自身微環境的能力。三維共培養物中的細胞能夠與相鄰的細胞交換位置，因此在結構上使得組織 改組。此過程還需要細胞外基質的改組。對三維微量組織模型中各種SAEC/NHLF比率的模型之研究顯示，1：1比率足以使得上皮細胞覆蓋成纖維細胞的內部核心，因此使用1：1設置進一步分析此模型。然而，模型可按其他上皮細胞-間充質細胞比率使用。足以完全覆蓋的比率可在某種程度上視細胞類型而變化。
不受理論束縛，本發明者認為本發明模型中細胞之分離為歸因於細胞類型之黏合性不相同，其中其表面張力的差異起重要作用。
細胞會主動探究其自身的微環境，能夠與相鄰的細胞交換位置或改組其附近的細胞外基質。已知後一過程涉及機械牽引力與基質金屬蛋白酶(MMP)的酶活性。基於不同的黏著能量特徵，實驗上已知混合細胞類型的某些細胞組合物可呈聚集體形式分離。
在懸滴培養物的分離之細胞聚集體中，最黏合的群體佔據中心區域，透過不太黏合的群體圍繞。組織黏合性之量度為細胞的表面張力。因此，作為在實驗上可檢測的量，表面張力可預測分選層次。因此，所屬領域中早期嘗試通過此分選層次可在一定程度上預測是否包含新的細胞類型(內亞古(Neagu),2006)。
然而，並不知道人類肺的特定細胞類型之表面張力因數。現有技術完全沒有提到組織分選的現象是發生在其他培養物中還是僅僅發生在懸滴培養物中。本發明者通過實驗確定，在本文中首次顯示意外地，上皮細胞與成纖維細胞的分離發生在粒化的混合 肺泡上皮細胞與成纖維細胞培養物中。
微聚集體之結構
本發明者意外地發現，根據發明可以形成三維肺部模型組織聚集體，此聚集物表示肺組織的關於形態與標記物表達的某些特徵。進一步的組織學分析揭示了此模型的一複雜結構。雖然三維肺模型沒有外部添加的支架材料或細胞外基質(ECM)、基質膠或其他細胞外基質(ECM)衍生的水凝膠建立起來，用以允許成纖維細胞與上皮細胞分泌ECM且創建其自己的支架，但是，蘇木紫伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色法顯示細胞的一有組織網絡，非常類似於遠端氣道的結構複雜性(「第3圖」及「第8圖」)。發現不僅胚胎細胞，而且純化與分化的成人原代細胞在培養物中保留自己的能力，用以形成類似體外原組織的組織結構。
這些聚集體的肺泡狀空洞由成纖維細胞與上皮細胞組成。這些空洞的直徑變化在2-100納米(m)之間變化。
而且，Wnt11 SN處理的樣本的蘇木紫伊紅(HE)染色然而暴露出來，一類似於ATII細胞的長方體狀形態的細胞之數量增加。相比之下，微組織與僅包含扁平上皮的對照人類肺癌細胞(A549)SN一起培育(「第8d圖」及「第8b圖」)。
微聚集體之尺寸
本發明者意外地發現，即使非常小但具有結構的聚集體顯示組織特徵，因此適於研究相互作用且測試化合物或環境影響。
小聚集體具有若干優點，例如，無需特別的反應容器，其尺 寸與不同細胞類型的比率可再現，從而更易於控制相互作用。在小聚集體中，幾乎不可能發生組織聚集體的內部部分壞死。此外，可實現驚人均勻的粒度分佈，此使其非常適於平行測試。
因此，較佳地，根據本發明，聚集體的尺寸應保持為小的，只要呈現組織特徵，從而可檢驗相互作用即可。
如果聚集體過小，則如本文所揭示的正確形態可能不能夠成形，並且聚集體可能不具有類組織特徵。如果聚集體過大，則其尺寸可能基本上偏離平均值。此外，壞死可能發生在聚集體內部，原因是培養時間較長且聚集體灌注較少。
在缺乏特定添加劑，例如僅接收細胞培養基之情況下，聚集體的生長透過細胞的接觸性抑制以控制。
然而，尺寸取決於聚集體中的細胞數目。所屬領域的技術人員應瞭解，聚集體的尺寸與細胞數目可在本文給出的界限內變化，只要符合上述要求即可。
已經發現加入內皮細胞不顯著改變聚集體之尺寸。
適用於本發明的細胞類型 成纖維細胞
成纖維細胞為結締組織細胞家族中最萬能之細胞，並且其實際上為最普遍存在的細胞類型。成纖維細胞為組織完整性的重要結構成分。成纖維細胞參與包含肺在內幾乎每個人類組織與器官的修復及再生過程。其主要功能為分泌向例如上皮細胞遷移等正常修復事件提供組織骨架之細胞外基質(ECM)蛋白。
成纖維細胞，或者其不同亞群執行作為免疫調節細胞的組織特異性功能，分泌能夠透過吸引發炎細胞與免疫細胞引發免疫反應的趨化因數與細胞因數。來自不同解剖位置的成纖維細胞顯示一系列常見的表型屬性。然而，不同解剖位置的成纖維細胞顯示不同表型。成纖維細胞生長因數與受體之特徵表達也為肺部成纖維細胞的特徵[莫勒魯斯(De Moerlooze)，斯潘塞-迪恩(Spencer-Dene)等人(2000)]。
本發明者發現，可依賴於成纖維細胞生理學，建立無人工組織骨架的組織系統以類比遠端肺組織的一些方面，並且基於人工基質的模型未必為建立三維肺部培養物之必由之路。不受理論束縛，本發明者假定肺中成纖維細胞分泌ECM的事實顯著有助於實現此結果。
肺部上皮細胞(肺細胞)
肺細胞(肺部或肺泡上皮細胞或AEC)係為襯於正常肺泡基底膜(即肺遠端氣道內的周圍氣體交換區)內的上皮細胞。肺細胞或AEC可再分成I型與II型肺細胞。
兩種肺泡上皮細胞類型之特徵標記物容易追蹤，並且可在實驗期間，例如使用RT-PCR反應或免疫組織化學監測。
1型肺細胞
1型肺細胞[肺泡1型肺細胞、1型肺泡細胞、肺泡1型細胞(縮寫ATI細胞)，也稱為小肺泡細胞、鱗狀肺泡細胞、膜肺細胞或1型肺泡上皮細胞]，係為具有多個表示肺泡中氣體交換表面的 細胞質板的複合分支細胞。這些細胞具有代謝活性且具有針對多種物質，包含細胞外基質(ECM)蛋白、生長因數與細胞因數的細胞表面受體。大約95%肺泡表面透過I型肺細胞覆蓋。
2型肺細胞
2型肺細胞(肺泡2型肺細胞、肺泡2型細胞；縮寫ATII細胞、T2P)為立方形上皮細胞，也稱為2型肺泡上皮細胞(縮寫AEC，也稱為EPII細胞)、2型顆粒狀肺細胞、2型細胞、2型肺泡細胞、隔細胞或大肺泡細胞(great alveolar cell)、大型肺泡細胞(large alveolar cell)或顆粒狀肺細胞。這些細胞係由未成熟的上皮細胞祖細胞產生。肺泡2型肺細胞認為是肺泡上皮細胞的祖細胞。其能夠自我更新並分化成鱗狀1型肺細胞。II型細胞為立方形細胞，其僅占據肺泡表面積的4%，但構成肺泡上皮細胞的60%與所有肺細胞的10%-15%(克拉波(Crapo)等人，1982)。
3型肺泡上皮細胞
3型肺泡上皮細胞與扁平1型細胞以及立方形2型細胞的不同之處在於其存在微絨毛頂束且缺乏薄片型分泌顆粒。這些細胞也稱為肺泡刷細胞。
內皮細胞
內皮細胞為呈現單一鱗片狀之上皮細胞層，襯於所有血管管腔內的長方形細胞。內皮細胞來源於血管母細胞與成血管細胞。
巨噬細胞
巨噬細胞為來源於骨髓源性單核細胞之細胞(骨髓源性巨噬 細胞)，巨噬細胞最終遷入組織中。巨噬細胞自骨髓中單能與雙能祖細胞的分化受多種細胞因數控制。其他分化發生於組織中且所得巨噬細胞群體稱為定居巨噬細胞。
肥大細胞
肥大細胞係由骨髓中的多能CD34(+)前驅細胞產生(中幡(Nakahata)與徹(Toru)2002；奧斯丁(Austen)與博伊斯(Boyce)，2001)。未成熟的肥大細胞在遷入組織中時採取其典型的顆粒形態。這些細胞也表達Fc-ε R1且停止表達CD34與Fc-γ R2。肺與腸黏膜中的大部分肥大細胞僅產生類胰蛋白酶(稱為MCT)或僅產生胃促胰酶。肥大細胞在速髮型過敏反應中透過釋放有效的介體起著重要作用。
平滑肌細胞
平滑肌細胞係為高度專化的多功能可收縮細胞，用以短暫(可逆收縮)或長期(歸因於纖維化與肌肉過度生長)調節中空器官之管腔。平滑肌細胞在血管發生中起重要作用，並且使得血管壁成形並維持血管之緊張度。
其他細胞下的觀測
加入內皮細胞可產生包含分化細胞之穩定聚集體。如基於表達的標記物所發現，如果內皮細胞包含於模型組織培養物內，那麼分化度不會降低。似乎這些聚集體維持一種層狀結構，其中內皮細胞位於內部。
實施例 製備一三維模型組織培養物
在本發明之方法中，使用至少肺部上皮細胞與間充質細胞，較佳為成纖維細胞。這些細胞各別培養，用以獲得活的培養物，接著以適當比率混合，並且在二氧化碳(CO2)存在下在如基於本發明與所屬領域方法所瞭解的適當條件下共培養。透過設定細胞比率與選擇條件，可避免一種細胞類型相對於另一種細胞類型的過度生長。
在一較佳實施例中，這些細胞自人類個體作為原代細胞獲得，並且去分化或立即使用。去分化可例如透過已知方法(傳代、去除其他細胞類型、加入生長因數)進行。如果細胞能夠匯合，則認為其去分化。
粒化共培養的細胞混合物為建立細胞-細胞接觸且使得細胞之間存在適當距離的重要步驟。粒化細胞的最便利方式為應用離心。所屬領域之技術人員基於本文提供的教示，能夠選擇合適之粒化方法。
在本發明之模型中，原則上，可使用任何上文所列的細胞，獲得接近天然肺組織的肺模型組織。所應用的每一種細胞類型必須能夠在適用於獲得如本文所揭示的三維模型組織之條件下生長且能夠與模型的其他細胞類型相結合。這些因數應在初步實驗中測試。最初宜應用相對較小比率的其他細胞，接著其他細胞類型的比率可增加，通常直至比率類似於活體內比率。
在較佳實施例中，可包含於模型內的其他細胞類型為例如內 皮細胞與平滑肌細胞。
疾病模型
基於以上模型且使用各種基因傳遞方法以及可變靶基因，以上系統容易適於研究肺部疾病期間之基因變化，從而可鑒別新的藥物靶與發展新的療法：其中疾病包含發炎，受影響細胞、較佳上皮細胞表達發炎性細胞因數(超過正常含量)，並且模型為發炎模型，其中疾病為腫瘤，細胞為轉化、例如惡性轉化或永生細胞，並且模型為腫瘤模型，其中疾病包含纖維化，並且模型為纖維化模型，其中疾病包含組織損傷，並且模型為再生模型。
疾病模型可用於藥物測試。
從患者獲得的細胞
在一實施例中，肺部細胞自患者獲得，並且根據本發明培養。在此實施例中，較佳為未去分化或僅部分去分化。此後，以迅速製備方法，形成三維模型組織培養物，並且測試提議用於治療此患者的藥物，或者可測試計劃的治療方案。此實施例的優點尤其為可製備具有均一組成與尺寸的純且平行的樣品培養物。這些樣品也不包含任何病原體且可按需要純化。
自健康細胞製備的模型
在一較佳實施例中，疾病模型自健康細胞開始以製備，隨後加入實現細胞中疾病特徵(症狀)的因數。
舉例而言，腫瘤模型係由健康細胞製備，並且加入實現惡性轉化的因數，與/或在其中表達引起惡性轉化的基因。觀測到在肺部腫瘤組織中例如Wnt5等Wnt蛋白質的含量增加。因此，預期腫瘤模型可透過加入例如EGF(上皮生長因數)、IGF(胰島素樣生長因數)、胰島素、Wnt因數(例如Wnt5)或其混合物等致瘤因數至本發明的細胞混合物或培養物中以製備。
在此方法的一個替代性方法中，腫瘤細胞添加至培養基中，此培養基中存在根據本發明的模型培養物，但其透過半透膜分離。從而腫瘤細胞產生的因數誘發本發明培養細胞的腫瘤(惡性)轉變。
由肺腫瘤細胞系製成的肺腫瘤模型
肺腫瘤模型可由肺腫瘤細胞系製備。這些細胞系容易在美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC；馬里蘭州羅克維爾市(Rockville,MD))在搜尋腫瘤細胞系時獲得。
明智地，進行尋找適於培養細胞的條件且最佳化細胞混合物中所用細胞類型的比率之實驗。
透過抑制Wnt11表達的腫瘤模型
在本發明之一實施例中，一改良的腫瘤模型能夠透過在該肺部模型中抑制Wnt11表達製備。這一點例如透過間充質，例如成纖維細胞與小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)的轉導獲得(「第12G圖」)。意外地，Wnt11之下調與一個或多個EMT 標記物之上調以及肺泡分化標記物之下調相一致。而且，在存在Wnt11時，上皮細胞之形態出現的更扁平且長方體狀細胞不再充足(「第12A圖」至「第12D圖」)。
Wnt11表達的抑制能夠應用於腫瘤細胞系以及自健康細胞，例如原代細胞中製備的模型中。
發炎模型
對於發炎模型，較佳在製備過程期間，單核細胞與/或巨噬細胞可添加至本發明的模型培養物中。
在此模型中，適合用LPS或WNT5A預處理。
活化的巨噬細胞的細胞因數的產生以及如Wnt5等其他因數的產生影響組織培養物且賦予發炎模型能力。
如果待一檢驗發炎模型系統，則可提供在適當腔室中透過膜與肺部聚集體分離的中性粒細胞。此種情況下，也可測量中性粒細胞的遷移與MMP的產生。
在一替代性實施例中，疾病模型肺部細胞系根據本發明培養。在此實施例中，可測試藥物針對此疾病之效率。
在此疾病模型中，應避免使用過度表達基因，更確切而言，應使用誘導型啟動子。
來自天然三維肺部細胞聚集體的發炎模型
為了模擬發炎病狀，天然三維肺部細胞聚集體可用引起發炎反應的不同材料處理。
這些材料例如為： 引起急性發炎的化學物質，例如血管活性胺、類二十烷酸等。
促炎性多肽，例如生長因數、水解酶等。
活性氧，促炎性細胞因數，例如IFN-γ和其他細胞因數，細菌細胞壁提取物。
發炎病狀透過例如使用生物化學分析、免疫學分析(例如ELISA)、利用一基於PCR的方法(例如即時PCR)，或者利用表達分析(例如應用一基因晶片)檢測細胞因數表達以測試。
原代細胞的遺傳修飾
上皮細胞與間充質細胞均可使用重組病毒傳遞載體(重組腺病毒與重組慢病毒載體)進行遺傳修飾，這些基因傳遞方法不損害細胞聚集之能力。發炎、腫瘤、纖維化以及再生的特徵基因可組成性或誘導性過度表達或沉默，並且可在三維微環境中研究組織形態、細胞反應、基因以及蛋白質表達變化。
舉例而言，已知促進腫瘤形成的一種或多種基因能夠引入至肺部細胞系，例如肺泡I型或II型細胞系，較佳為II型細胞系中，或引入至成纖維細胞系中。此類基因可例如為比如ras基因等致癌基因或例如COX-2基因等代表腫瘤表達模式的基因或一組基因。可能單獨ras基因表達不足以轉化細胞，較佳為永生細胞，但增殖可能增加[王(Wang,XQ)，李(Li,H)等人(2009)]，此結果可提供模型的一疾病特徵。
使用經遺傳修飾且經亞致死照射的細胞系改變原代細胞聚集體中 分泌因數組成
在此實施例中，所有細胞類型均未感染，因此基因表達與任何既定三維肺組織模型中一樣正常。然而，聚集體的細胞組成包含有經亞致死照射的細胞(聚集體全部細胞數目的5-10%)-成纖維細胞(WI-38)或肺泡上皮細胞(A549)系或兩者，這些細胞經遺傳修飾且產生改變聚集體內細胞微環境的分泌因數(Wnt-s、骨形態形成蛋白(BMP)-s、發炎性和促炎性細胞因數、生長因數等)。亞致死照射可減少細胞繁殖並防止一種細胞類型相對於其他細胞類型過度生長。
產品
本發明還提供一種包含三維模型組織培養物的多個樣品之試劑盒。
這些容器較佳為例如96孔板或384孔板等板的孔。
三維模型組織可為健康組織模型或疾病模型(疾病模型試劑盒)。
板適宜包含一容器或孔之陣列，其中多個容器包含有一種或多種類型的工程化三維肺部模型組織培養物的樣品於適當培養基中。
容器可為例如平底、U形底或較佳為V形底容器，在允許平行測試多個樣品的板上。
較佳地，容器為未經組織培養物處理的容器，用以避免細胞黏至容器壁。
在一較佳實施例中，每一容器包含一單一聚集體。在一較佳實施例中，每一容器中的培養物樣品包含如發明內容中所界定的量之細胞。
較佳地，這些容器各別或一起密封，並且包含有如發明內容中所界定的富集二氧化碳(CO2)的適合於肺組織培養物的環境或氣氛。
通常地，疾病模型需要相同環境。
細胞較佳使用適於報導一種或多種下列細胞特徵的生物相容性染料染色：細胞狀態，例如細胞***時相(cell phase)、細胞活力、細胞的凋亡或瀕死狀態；細胞類型；細胞位置；惡性轉化；發炎。
對照
作為對照樣品，試劑盒僅包含有上皮細胞與成纖維細胞的培養物。在一板上，較佳存在至少3個-3個孔對照(分別為上皮細胞與成纖維細胞)。
較佳地，作為二維肺組織的另一對照用以鑒別或評估三維組織特異性特徵。
一可選擇之對照係為一使用Wnt11未處理的培養物
因此，需要時，可包含一二維對照板(較佳為平底黏著組織培養板)以伴隨三維組織。或者，此板還可包含有作為對照的二維肺組織的孔，此組織較佳在平底孔中。
因此，在本發明之一實施例中，使用包含有用於三維組織的 V形底孔與用於二維組織的平底或U形底孔之板。
實例 實例1-材料與方法
原代SAEC、NHLF以及肺部HMVEC細胞自龍沙公司(Lonza)購得。所有細胞類型均自不同性別與年齡的多個隨機供體的肺分離。例如製造商所建議，分別使用SAGM、FGM或EGM-2培養基進行SAEC、NHLF或肺部HMVEC的初始擴增。所有類型的細胞培養物均包含有5%二氧化碳(CO2)的氣氛中於37℃下培育。對於二維與三維培養，純或混合細胞群體在SAGM(小氣道生長培養基，龍沙公司(Lonza))與完全DMEM的50%-50%混合物中培養。對於包含有HMVEC細胞的兩種細胞與三種細胞培養物，HMVEC細胞的適當生長因數補充物添加至SAGM與DMEM的50%-50%之混合物中。細胞培養基的組合物根據製造商的說明書製備。對於二維與三維培養，細胞以所指示的比率混合並分別分配至平底6孔板或96孔V形底板(薩爾施泰特(Sarstedt))上。V形底板在細胞接種後，在室溫下以600×g立即離心10分鐘。
SAEC與NHLF使用下列螢光生理學染料染色：Dil[霍尼格(Honig,M.G.)與休姆(R.I.Hume)(1989)]以及CFSE[王(Wang,X.Q.)，段(X.M.Duan)等人(2005)]，其能夠跟蹤培養過程中細胞的運動。具有或者不具有基質膠的細胞吸移入未經組織培養物處理的V形底96孔板中，並在二氧化碳(CO2)培育箱中於37℃ 下培育1小時。培育之後，細胞在室溫下以2000rpm粒化5分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5%二氧化碳(CO2)，37℃)。
1972年，傑勒德(D.J.Giard)等人(1973)透過對來自58歲男子的肺癌組織進行外植體培養，首創A549細胞系。A549細胞係為腺癌人類肺泡基底上皮細胞。A549細胞歸入上皮細胞的鱗狀分支。在以上培養基中以2×104個細胞/平方釐米的濃度接種的細胞將在5天內100%匯合。
A549細胞可自美國模式培養物保藏所(ATCC；馬里蘭州羅克維爾市(Rockville,MD))作為CCL-185獲得，並且可生長在具有10%胎牛血清(FCS；吉布公司(GIBCO BRL))的漢姆F-12培養基(Ham's F-12 medium)(吉布公司(GIBCO BRL)，紐約州格蘭德艾蘭市(Grand Island,NY))中或根據供應商的建議生長。
1962年，從取自大約3個月胎齡的治療性流產胎兒的肺組織發展WI-38細胞系。胰蛋白酶消化肺組織所釋放的細胞用於原代培養物。細胞形態類似於成纖維細胞。染色體組型為46,XX；正常二倍體女性。自瑞普斯托庫(Repository)獲得此培養物的最大壽命為50群體倍增次數。回收後獲得86%的胸苷標記指數。G6PD為B型同功酶。WI-38的此培養物自獲自呈送者的第9代冷凍細胞擴增。
可自美國模式培養物保藏所(ATCC；馬里蘭州羅克維爾市(Rockville,MD)) http：//www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/tabid/112/Default.aspx作為CCL-75獲得的WI-38細胞根據供應商的建議生長。
CL13或CL30細胞(沃德洛(Wardlaw)等人，2002)在包含有5%胎牛血清與25%微克/毫升慶大黴素(gentamicin)的杜爾貝科改良伊格爾/F12培養基(Dulbecco’s modified Eagles/F12 medium)中培養。
人類細胞較佳在37℃下，按照需要維持於包含有二氧化碳(CO2)的潮濕空氣中。
肺組織樣本
肺組織樣本在匈牙利佩奇大學外科部的常規手術(肺切除術)期間採集。手術前，患者知情同意，並且此項目由佩奇大學倫理委員會批准。在Wnt11-SN中培養肺組織樣本在補充方法中詳細描述。患者數據列於表1
螢光與共焦顯微術
在二維及三維培養之前，SAEC、NHLF以及HMVEC分別使用螢光生理學染料CFSE、DiI以及DiD(均自分子探針公司(Molecular Probes)獲得)染色。細胞在PBS中洗滌兩次，並且在37℃下以0.5μg/ml之濃度與CFSE、DiI或DiD一起培育10分鐘。透過使用DMEM+10% FCS洗滌細胞以去除過量之染料。二維與三維培養物使用螢光標記的細胞，如先前所指示以製備。培育過夜之後，小心地自V形底板去除三維細胞培養物，並轉移至底部為蓋玻片的盤子(馬泰克(MatTek))中。透過螢光顯微術(奧林帕斯(Olympus)IX-81顯微鏡)或共焦顯微術(奧林帕斯(Olympus)FV1000共焦成像系統)研究肺組織微量培養物。
細胞分選
根據製造商之說明書(分子探針公司(Molecular probes))，SAEC與NHLF使用CFSE及DiI染色。
混合細胞並在二維和三維系統中培養72小時。染色細胞透過輕度胰蛋白酶處理，接著PBS+EDTA處理以解離。解離的細胞使用BD FACSVantage細胞分選儀分選至具有用於製備mRNA的裂解緩衝液的管(美天旎生物科技(Miltenyi Biotech))中。
免疫螢光
在培養三維中的細胞三天之後，微組織自V形底板小心地去除且在室溫下在4%的福爾馬林(formaline)中固定十分鐘，這些固定樣本覆蓋組織技術低溫恆溫箱包埋劑且產生8微米厚的冰凍 切片。初級與二級抗體在相同緩衝劑中稀釋，並且與這些樣本培育1-1小時。抗體表如表2所示。使用奧林巴斯IX-81熒光顯微鏡捕獲熒光影像。為了確保在Wnt11-SN-或Wnt11 siRNA處理的樣品中，SFTPC、AQP3以及N-CAD的表達值與其相匹配的未經處理的對照的可比性，所有圖像使用具有相同曝光設置的設置捕獲。
重組腺病毒載體
完全相關基因或僅GFP序列透過PCR反應，使用正向(5')：5'--3'、反向(3')：5'--3'引物序列擴增，並且克隆至穿梭載體中，然後透過同源重組克隆至腺病毒載體中。腺病毒透過使用脂染胺2000(Lipofectamine 2000)(英傑(Invitrogen))轉染線性化質粒DNA至293包裝細胞系(美國模式培養物保藏所，馬里蘭州羅克維爾市(Rockville,MD))中以產生。所得菌斑擴大，使用腺病毒純化試劑盒(BD生物科學(BD Biosciences)純化與濃縮腺病毒。
上皮細胞的腺病毒感染
包含有GFP或相關基因-GFP的腺病毒添加至二維或三維中的SAEC中。在37℃下1×106個細胞再懸浮於250μl細胞培養基與50μl病毒中並保持90分鐘。
慢病毒載體與Wnt11之克隆
構成 慢病毒載體：Lv-CMV-IRES-GFP,Lv-CMV-Wnt11-IRES-GFP
透過使用脂質體Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將質粒DNA轉染293A包裝細胞系(美國模式培養物研究所，洛克維爾，馬里蘭州)，產生逆轉錄病毒。
克隆引物：
Wnt11：正向(5')：5'-gaagatcttc atgcgcaccatcgtgcac-3'(BglII)
反向(3')：5'-gcgtcgacgt tcacttgcagacgtagcg-3'(SalI)
逆轉錄病毒感染
逆轉錄病毒上清液自在293種細胞中，僅包含Wnt11-GFP，或綠色熒光蛋白(GFP)的逆轉錄病毒載體產生。上皮細胞系A549使用上述病毒在24孔板中，在250微升的病毒性上清液與50微升的DMEM聚凝胺混合(終濃度：8微克/毫升)/孔之中，然後在2100轉速及室溫下離心60分鐘而轉化。這些細胞在包含10% FCS的新鮮DMEM中培育3天，然後使用FACSVantage細胞分選儀(BD生物科學公司)根據GFP表達分選。GFP陽性細胞然後按照上述培養。Wnt11蛋白的存在透過使用Wnt11特異多克隆抗體(Abcam公司)，透過免疫印跡與免疫螢光檢驗(「第7圖」)。
CXCL-8分析法
二維與三維細胞培養物上清液的CXCL-8(IL-8)含量使用奎因(Quantikine)CXCL-8/IL-8 ELISA試劑盒(安迪生物(R&D Systems))測量。夾心ELISA分析法根據製造商的說明書進行。簡單地說，同等稀釋的細胞培養物上清液樣品與CXCL-8標準品分配至預先塗有抗CXCL-8單克隆抗體之孔上。在室溫下培育2小時之後，使用所提供的洗滌緩衝液洗滌板4次。接著加入HRPO結合的多克隆抗CXCL-8抗體，保持1小時。最後洗滌步驟之後，TMB底物溶液加入至孔中。光學密度使用iEMS讀數器MF(熱電雷勃(Thermo Labsystems))在450nm與570nm下測定，並且使用阿森特軟體(Ascent software)分析資料。
資料定量
定量實時RT-PCR資料透過例如應用生物系統公司(Applied Biosystems)所提出的δCt(dCt)與相對量(RQ)方法，使用7500系統SDS軟體以分析。所有樣品均建立一式兩份。簡單地說，使用透過7500系統SDS軟體測定的自動閾值水準(threshold level)，測定各樣品的Ct值。δCt(dCt)值根據下式確定：dCt(靶基因)=Ct(靶基因)-Ct(管家基因)。基因表達的變化顯示為RQ值，此值使用下式計算：RQ=2-ddCt，其中ddCt值按ddCt=dCt(樣品)-dCt(參考樣品)計算。
透過比較OD與由7種在31.2-2000pg/ml CXCL-8範圍內的不同濃度計算的標準曲線，確定細胞培養物上清液的CXCL-8含量。樣品分配一式兩份且平均值用於進一步的資料分析。
統計分析
使用可應用的配對樣本t檢定進行統計比較
1序列號：2 β-肌動蛋白1 3 β-肌動蛋白2 4產物長度
實例2-發展三維肺組織模型的實驗 懸滴模型
為類比人類肺結構，自100 000個細胞的三維細胞聚集體開始，這些細胞包含有大致等量的不同成纖維細胞(NHLF)與小氣道上皮細胞群體(SAEC)，隨機互相混合。這些細胞產生疏松之組織結構。然而，此形成不穩定且不可能不對此組織結構產生不可恢復之損傷下，將產生的微組織自初始培養條件轉移至另一試驗板。
含有基質膠的粒化模型
為改進混合的肺微量組織之穩定性，粒化1：1比率的SAEC與NHLF並使得其在基質膠存在下生長。許多三維肺與其他組織模型使用基質膠以建立可使得各種細胞類型生長並彼此相互作用的三維結構。SAEC與NHLF使用能夠跟蹤培養過程中細胞運動的螢光生理學染料Dil(霍尼格(Honig)與休姆(Hume)，1989)與CFSE(王(Wang)，段(Duan)等人，2005)染色。細胞與基質膠吸移入未經組織培養物處理的V形底96孔板中，並且放置於37℃下二氧化碳(CO2)培育箱中1小時。培育之後，細胞在室溫下以2000rpm粒化5分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5%二氧化碳(CO2)，37℃)。
「第1圖」顯示50% SAEC與50% NHLF混合物的基於基質膠的培養物。明顯地，儘管存在基質膠，SAEC與NHLF還是不能夠形成穩定的三維結構。此外，似乎主要包含有上皮細胞的小球形組織結構離開組織/基質膠塊狀物。
實例3-無人工組織骨架的粒化模型
作為模擬人類肺的三維培養條件的下一步，在無基質膠的情況下 分兩個階段粒化同等數目的上皮細胞(SAEC)與成纖維細胞(NHLF)的隨機混合物。細胞吸移入未經組織培養物處理的V形底96孔板中，並放置於37℃下二氧化碳(CO2)培育箱中1小時。培育之後，細胞在室溫下以2000rpm粒化5分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5%二氧化碳(CO2)，37℃)。混合培養前的細胞使用生理學螢光染料Dil(DMSO中1mg/ml原液)與CFSE(DMSO中1mg/ml原液)在PBS(磷酸鹽緩衝生理鹽水，pH 7.2)中的1：1000稀釋液染色。在這些培養條件下，細胞形成穩定聚集體，其中最黏的成纖維細胞(紅色或暗灰色)透過不太黏的上皮細胞類型細胞(綠色或淡灰色)圍繞(「第2圖」)。聚集體直徑為約200μm。
在另一實驗中，有組織地改變SAEC與NHLF細胞之比率，並且分別使用下列SAEC：NHLF比率製備培養物：0%/100%；25%/75%、50%/50%、75%/25%、100%/0%，其他方面如上所述。「第2圖」顯示包含有不同比率的SAEC與NHLF的粒化微量組織培養物。如圖所證明，當應用等量的上皮細胞與成纖維細胞時，形成具有表面上皮細胞襯裏的最顯著三維結構聚集體，在25%/75%的比率下聚集體具有清楚的上皮細胞襯裏，不過略小且形態不太令人信服，而在SAEC細胞過量時，即當細胞上皮細胞與成纖維細胞的比率為75%/25%時，形成平坦得多的上皮細胞襯裏。純培養物不形成三維結構的聚集體(上皮細胞)或者聚集體尺寸小得多(成纖維細胞)。
實例4-無組織骨架的兩種細胞類型三維肺組織模型的表徵 分化標記物
模型的分子表徵為使用實時PCR分析，基於上皮細胞分化標記 物。mRNA自細胞聚集體純化並產生cDNA。使用TTF1(「第4a圖」)、AQ3(「第4b圖」)以及AQ5特異性引物，相對於作為內部對照的β-肌動蛋白分析結果。
「第4a圖」指示三維人類肺微量組織中TTF-1的mRNA含量。TTF1轉錄因數為肺泡上皮細胞的特徵標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示TTF1表達，但TTF1存在於三維SAEC單一培養物中，並且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用。TT1在三維SAEC/NHLF組織中達到最高表達量。
「第4b圖」顯示三維人類肺微量組織中AQP-3水轉運蛋白的mRNA含量。AQ3為肺中ATII上皮細胞類型標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示AQ3表達，但AQ3存在於三維SAEC單一培養物中，並且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用，但在三維SAEC/NHLF組織培養物中仍然觀測到最高含量的AQ3。因此，以上標記物表明ATII型分化的誘導性增加，此增加可由ATI型標記物表達未增加進一步證實。用於實驗中的純化的分化細胞類型自商業來源獲得。雖然這些細胞類型來源於分化組織，但其一旦純化並保持於二維培養條件下，則如S100A4含量增加所指示，細胞幾乎立即顯示去分化跡象(「第5d圖」與表2)。一旦SAEC與NHLF共培養，則S100A4與N-鈣黏蛋白含量顯著減少，而E-鈣黏蛋白含量增加。“鈣黏蛋白轉換”[茲斯伯格(Zeisberg M)與尼爾森(E.G.Neilson)(2009)]在三維培養條件中相比較於在二維培養條件中更顯著(「第4d圖」及「第5d圖」以及「第5f圖」)，表明除了存在NHLF，三維結構也需要減少SAEC去分化。這些變化也是上皮細胞-間充質 細胞轉變(EMT)的特徵，表徵上皮細胞去分化過程。
促炎性細胞因數的表達
如肺部感染或肺泡上皮細胞損傷(連續上皮細胞層破壞)所引發，促炎性細胞因數由肺泡上皮產生以吸引包含中性粒細胞在內的發炎細胞。為了測試CXCL-8促炎性細胞因數的表達，由二維單一培養物與共培養物以及三維組織共培養物(設置可見於「第2圖」中)的細胞上清液測試CXCL-8蛋白含量。使用市售ELISA測試試劑盒(安迪實驗室(R&D Laboratories))，顯而易見相較於常規二維組織培養物，CXCL-8表達量在三維組織系統中顯著降低(「第6a圖」)，且在上皮細胞比率最高的情況下檢測到最低含量，表明透過上皮細胞層的中斷引發CXCL-8表達。
在「第6a圖」的圖式上，顯示人類活體外三維肺模型中的CXCL-8分泌。發現成纖維細胞的三維單一培養物不分泌CXCL-8，而三維SAEC仍產生細胞因數(不過相比較於二維SAEC培養物的程度低-資料未示)。二維共培養物未顯著改變CXCL-8之表達，表明成纖維細胞的存在無法影響細胞因數表達。CXCL-8的表達量在上皮細胞-成纖維細胞比率為75%/25%的三維組織系統中顯著降低，在此系統中上皮細胞基本上完全覆蓋成纖維細胞球，表明CXCL-8表達可透過肺泡上皮細胞層的中斷以引發。所述CXCL-8表達的降低在50%/50%和25%/75%的比率下有點不太顯著。
發炎性細胞因數IL-1β與IL-6 mRNA含量也使用定量實時RT-PCR分析以研究。當對SAEC-NHLF mRNA的混合物進行PCR時，在三維培養物中，相較於各二維培養物，IL-1β與IL-6 mRNA含 量顯著下調(分別為「第6B圖」及「第6C圖」)。一旦SAEC細胞自二維及三維NHLF共培養物中分選出，則在三維條件下培養的SAEC中IL-1β與IL-6的表達減少顯著得多(「第6D圖」)。
實例5-Wnt11對此三維模型之標記物表達的效果
使用定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)，包含甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)[池田(Ikeda K)(1995)]、水通道蛋白(AQP)[柯瑞達(Kreda,S.M.)與加因(Gynn M.C)(2001)]以及表面活性蛋白(SFTP)[多布斯(Dobbs,L.G)(1989)]的肺上皮分化標記物自三維模型純化的肺泡上皮細胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)中進行分析，並且與在傳統的二維(2D)SAEC、三維SAEC以及二維的混合培養物中培養的培養肺泡上皮細胞(AEC)相比較。自純化SAEC的II型特性漸進的去分化在二維與三維，但沒有在三維共培養下檢測。由於II型標記物表面活性蛋白A(SFTPA)(「第4C圖」)在自二維共同培養物中純化的SAEC中收回，因此NHLF的存在確認為II型分化的一重要組成部分。當SAEC在一三維系統(「第4圖」)中存在NHLF進行培育時，僅在其他類型的II型分化標記物中檢測到一明顯的增加。突出了此三維培養物之重要性。
對比傳統的二維培養物中，去分化透過EMT10標記物之上調體現，當透過定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)與/或組織學，透過檢測S100A4、E-鈣黏蛋白以及N-鈣黏蛋白的mRNA含量，檢測標記物之下調時，上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)的抑制在三維模型中發現去分化(「第4D圖」及「第5圖」)。
此外，免疫熒光分析表明在pro-SFTPC蛋白中的根本增加(「第 12E圖」及「第12F圖」)，這一點由在Wnt11處理的培養物中AQP3與E-鈣黏蛋白的額外上調以及上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)的標記物11(N-鈣黏蛋白、S100A4以及SLUG)的平行下調表達(「第5D圖」至「第5F圖」以及「第8E圖」至「第8I圖」)。
PCR研究表明在SFTPA mRNA含量的顯著增加(「第15圖」)。
實例5-具有上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞組分的三種細胞類型模型
為進一步改進肺組織培養物模型的複雜性，原代人類肺源性微血管內皮細胞(HMVEC)加入SAEC與NHLF細胞中，並類似於SAEC和NHLF共培養物建立二維和三維組織微量培養物。
透過螢光與共焦顯微術對微量組織的形態學檢查顯示，HMVEC可成功地在三維條件下與SAEC及NHLF細胞兩者共培養(「第10a圖」)。有趣地，在與SAEC或NHLF的共培養物中，HMVEC形成微量培養物的內部緻密核心。當三種細胞類型(1：1：1)一起在三維條件下培養時，其黏在一起並形成明顯緻密穩定的三維結構(「第10b圖」)。
三種細胞培養物的分子表徵顯示，相較於在二維培養條件下所測量，AQP3與KRT7的表達量在三維培養物中明顯增加(「第10a圖」及表2)。當細胞保持於二維培養物中時，EMT標記物S100A4與N-cad的含量增加，但在三維培養物中穩定。三維培養物中E-cad的輕微減少小於二維培養條件下所檢測到的減少(「第10a圖」及表2)。然而，當對三種細胞類型的混合mRNA進行定量RT-PCR時，需要進一步分析三種細胞類型三維培養物，以發現有助於自純化的組織分子進行組 織構造的三種細胞類型的最佳比例。
表4顯示人類原代肺細胞培養物的基因表達變化。數目為RQ值，根據式RQ=2-ddCt計算，其中ddCt值按ddCt=dCt(樣品)-dCt(參考樣品)計算。除了分選的SAEC**，其中資料以dCt值呈現，計算如下：dCt=Ct(靶基因)-Ct(管家基因)。在建立各種培養物前一部分收集的細胞始終用作參考樣品。δCt(dCt)值計算如下：dCt(靶基因)=Ct(靶基因)-Ct(管家基因)。18S核糖體RNA用作管家基因，除了分選的SAEC**樣品的情況，其中肌動蛋白用作管家基因。
縮寫：N.A.：資料不可用，表達量未測定。N.D.：用即時QPCR未檢測出特定PCR產物。N.D.*：用常規PCR未檢測出特定PCR產物。N.C.：使用即時QPCR，平行孔或樣品中特定表達量未隨之測到。低*：通過常規PCR檢測出相對較低表達量。高*：用常規PCR檢測出相對較高表達量。
細胞分泌的細胞標記物與因數的結果概述
此處，提供證據證明，原代肺部上皮細胞與成纖維細胞的三維共培養相比較於二維或三維活體外單一培養物中更有利於SAEC維持更多分化的狀態。包含NHLF不僅促進上皮細胞分化，而且相較於僅SAEC(「第2圖」)或SAEC-HMVEC(「第10a圖」)培養物，三維微量組織之黏著與結構堅固緻密得多。
TTF1轉錄因數為胚胎發育期間與出生後ATII細胞中肺泡上皮細胞的特徵性通用標記物。細胞角蛋白為細胞骨架的中間絲的組分，並且其表達模式在細胞譜系鑒別中為重要的。在實驗中，肺上皮細胞標記物TTF-1與細胞角蛋白7 KRT7顯示在三維共培養物中表達量升高。
II型肺細胞促進水的經上皮運動(藉由水通道蛋白(AQP)家族成員)。ATII標記物水通道蛋白3顯示在成纖維細胞存在下含量升高(「第5圖」)。分泌表面活性蛋白為ATII肺上皮細胞的獨特特徵。[杜布斯(Dobbs,L.G.)(1989)，艾爾肯(Alcorn,J.L.)等人(1997)]在實驗中，單一培養物中的SAEC細胞未能表達表面活性蛋白，而表面活性蛋白A1 mRNA因而在三維中表達，並且量少於二維共培養物中(「第4c圖」)。然而，三維共培養物系統中未隨之檢測到表面活性蛋白B與C(資料未示)。還檢驗兩種細胞培養物與三種細胞培養物中ATI標記物水通道蛋白4與5的表達，但這些分子的表達未隨之檢測到，估計可能是因為本文所用的細胞(SAEC)為ATII型。此外，ATI分化需要大量時間(資料未示)。在稍微較長的培養時間期間，如果使用具有ATI型特徵的細胞， 則將出現ATI標記物。
因此，除SFPC外，分化標記物AQP3、KRT7、TTF1以及SFPA在成纖維細胞存在下均上調。AQP3與SFTPA而非KRT7或TTF1分化標記物的含量在三維培養條件下進一步增加。
S100A4為上皮細胞-間充質細胞轉化眾所周知的分子標記物，並且其表達量常常在轉移癌[休爾貝特(Sherbet,G.V)等人，2009]以及肺纖維化[伽里諾(Guarino,M.)等人，2009]中較高。S100A4與N-鈣黏蛋白上調以及E-鈣黏蛋白平行下調[茲斯伯格(Zeisberg M)與尼爾森(E.G.Neilson)，(2009)，賽克(Seike,M.)等人(2009)]也是上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)的特徵，其表徵上皮細胞去分化過程且特徵為喪失細胞黏著、E-鈣黏蛋白表達受抑制與細胞運動增加。
去分化標記物S100A4與N-鈣黏蛋白出現於二維培養條件下純化的原代細胞中。
以上去分化標記物在成纖維細胞存在下減少且在三維條件下進一步減少。
相較於二維培養物，可在三維培養物中觀測到包含IL1b、IL6以及CXCL8在內的發炎性標記物減少。此標記物在三維培養條件下顯著下調；例如二維培養物中僅存在成纖維細胞不足以減少其含量。
在兩種細胞培養物中觀測到SFTPA1表達，但在三種細胞培養物中未觀測到(「第4c圖」且數據未示)。
實例6-疾病模型 來自肺腫瘤細胞系的肺腫瘤模型
如實例3中所述，製備人工三維肺組織培養物，改變如下。
代替上皮細胞(SAEC)，使用來源於經NNK[4-(甲基亞硝氨基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮]處理的A/J小鼠(肺腺癌模型[別林斯基(Belinsky)等人(1992)])的II型肺泡上皮細胞(A549)與5%-20% CL13或CL30細胞(沃德洛(Wardlaw)等人，分子藥理學(Molecular Pharmacology),62,326-333 2002)的組合。CL13或CL30細胞攜帶有Ki-ras基因之突變。
進行一系列實驗，尋找A549細胞與CL13或CL30細胞的適當比率。腫瘤自發形成時的比率用以製備用作肺腫瘤疾病模型的三維肺模型組織。
在以上方法的一個替代性方法中，使用患者腫瘤細胞。
透過Wnt11表達抑制製備的肺腫瘤細胞
肺部模型中Wnt11的表達抑制透過使用Wnt11特異小干擾RNA(siRNA)轉導NHLF實現。
在轉染之前，每孔2x105個NHLF細胞在6孔板中，在FGM-2無血清培養基(龍沙(Lonza)公司)中培養過夜。每孔100毫微克(ng)的Cy3共軛陰性對照siRNA或Wnt11的siRNA(陰性對照siRNA第1號與Wnt11特異siRNA第15011號，兩者均來自Ambion公司)根據製造商的建議(Invitrogen公司)，使用脂染胺2000(Lipofectamine 2000)(英傑(Invitrogen))試劑轉染。4小時之後，siRNA之轉染效率透過使用熒光顯微鏡(奧林巴斯IX81)，透過可視化的細胞Cy3螢光檢查。然後，這些細胞胰蛋白 酶化且二維及三維培養物如前所述建立。
Wnt11之下調與作為EMT標記物的S100A4、N-鈣黏蛋白以及SLUG之上調以及肺泡分化標記物之下調相一致(「第12圖」)。上皮細胞之形態出現的更扁平且長方體狀細胞不再充足(「第12A圖」至「第12D圖」)。
為了證實此種模型背後的理論，原發癌組織也尋求Wnt11之表達。我們理論認為，如果Wnt11能夠抑制肺模型研究中EMT的標記物之上調，則由於隨著病情的發展，EMT標記物的增加，Wnt11含量可能會下降。為了調查，在肺部手術期間，收集非小細胞肺癌(NSCLC)樣本之隊列(n=17)，然後Wnt11之含量與其受體Frizzled(FZ)-7使用定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)篩選。在非小細胞肺癌(NSCLC)樣本中，Wnt11與Fz-7相比較於自非惡性肺薄壁組織獲得之它們的自體對照下調(「第13A圖」及「第13B圖」)。
使用經遺傳修飾且經亞致死照射的細胞系改變原代細胞聚集體中分泌因數的組成
所有細胞類型均未感染，因此基因表達與任何給定三維肺組織模型中一樣正常。然而，聚集體的細胞組成包含有經亞致死照射的細胞(聚集體全部細胞數目的5%-10%)-成纖維細胞(WI-38)或肺泡上皮細胞(A549)系，這些細胞經遺傳修飾且產生改變聚集體內細胞微環境的分泌因數(Wnt-s、骨形態形成蛋白(BMP)-s、發炎性和促炎性細胞因數、生長因數等)。
天然三維肺部細胞聚集體
為模擬發炎病狀，使用各種濃度的細菌細胞壁提取物處理天然三維肺部細胞聚集體。使用細胞因數特異性ELISA技術自組織培養基測定細胞因數的產生，上皮細胞與成纖維細胞兩者的基因表達變化可透過實時PCR反應定量。
實例7-三維肺組織試劑盒
在本實例中，製備測試備用的具有下列特徵的3C肺組織試劑盒(「第14圖」)：
1.測試備用的肺組織傳遞於96孔板中。
2.備用於實驗或測試的肺模型組織小(80 000個細胞/孔)樣品存在於孔中。
3.每一組織均由人類原代肺泡上皮細胞與成纖維細胞之混合培養物(分別為25%、50%以及75%上皮細胞)組成。
4.此板包含有3個-3個孔對照(僅僅上皮細胞與成纖維細胞)。
5.此板使用透明、較佳為黏著的塑膠薄膜，例如使用薩拉納普(Saranrap)密封。
組織的品質保用3天，包括傳遞在內。
此板自身為V形底96孔非黏著組織培養板。
此模型組織如在實例3中所述製備。每一組織均浸於200μl的組織培養基中，對於肺培養物，最佳是在5%二氧化碳(CO2)環境中，密封，並且在室溫下或在冰上傳遞。品質控制：自每一孔取出一個組織並測試活力。通過實時PCR測試分化標記物。需要時，可包含二維對照板(組織在96孔平底黏著組織培養板中生長)伴隨三維組織。
實例8-處理
急性肺組織損傷的一動物模型[馬圖特貝羅(Matute-Bello,G)等人(2008)]使用按照通常的製備方法準備的純化Wnt11的一可吸入氣溶膠組成處理。應用一Wnt11蛋白的濃度系列且組織損傷癒合透過以上的馬圖特貝羅(Matute-Bello,G)研究及揭露。
工業應用性
在上文中，建立無組織骨架的ATII型肺模型的基本參數與培養條件，其中可研究細胞的自發自組裝與細胞的相互作用。在理論與應用研究中以及醫藥測試中，此模型容易對複雜組織系統進行處理及基因操作。此模型也容易透過包含用於血管形成的內皮細胞以及甚至平滑肌細胞在內的其他細胞類型擴大，其中可研究其他交互組織與細胞的相互作用。透過一ATII分化標記物之處理使得此模型與遠端氣道非常類似。
在理論或應用研究中以及醫藥測試中，無骨架三維培養允許對簡單或更複雜組織系統進行無故障的基因操作。基於以上模型且使用各種基因傳遞方法以及可變靶基因，三維人類肺部微量組織模型系統容易適於研究肺部疾病期間的基因變化，從而可鑒別新的藥物靶和發展新的療法。這些疾病模型可包含發炎模型、腫瘤模型、肺纖維化模型或一再生模型。
可應用健康的肺組織以及病變組織的三維模型。根據本發明的產品可以組織培養物、包含培養物或試劑盒的板或陣列之形式銷售。
本文介紹的該模型允許方便地處理；以及一簡單的實驗裝置 於一相對較短的培養時間即足夠。此外，不需要複雜的實驗室設備。本系統適合於人體細胞，包含人類原代細胞以及非轉化人類細胞。
參考文獻
第1圖係為50% SAEC與50% NHLF混合物的基於基質膠(Matrigel)之培養物之示意圖； 第2圖係為包含有不同比率的SAEC與NHLF的粒化微量組織培養物。歸因於生理學螢光標記物，SAEC細胞在黑色與白色拷貝上為綠色或淡灰色，而NHLF細胞為紅色或暗灰色。在24小時培育後，粒化或者純的或者以各種比率混合的細胞群體且形成聚集體，接著轉移到24孔細胞培養板中供成像。頂行：相差顯微影像；中間行：螢光顯微影像；底行：共焦影像。SAEC：綠色通道；NHLF：紅色通道。
第3圖係為三維微量組織的冰凍切片之免疫螢光影像。SAEC-NHLF微量組織在V形底之板中培養72小時，條代表200微米(μm)，細胞核使用DAPI染色，如在藍色通道中所示。A組：標記肺微組織切片的肺上皮標記物細胞角蛋白-7。注意到此多孔結構以及細胞角蛋白-7的基本平均之分佈。B組：標記肺微組織切片的波形蛋白。注意到間充質標記物波形蛋白之表達主要限制於中心區域，與透過共焦顯微術(第2圖，底行)顯示的成纖維細胞之定位一致。C組與D組：分別標記肺微組織切片的表面活性蛋白-A及前表面活性蛋白-C。注意到表面活性蛋白的周邊表達，以及表面活性蛋白-A的更密集的染色(C組)。
第4圖係為人類肺微量組織培養物中標記物蛋白的mRNA表達含量。
第4A圖：三維人類肺微量組織中TTF-1的mRNA含量。TTF1 轉錄因數為肺泡上皮細胞的特徵標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示TTF1表達，但TTF1存在於三維SAEC單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用。TT1在三維SAEC/NHLF組織中達到最高表達量。
第4B圖：三維人類肺微量組織中AQP-3水轉運蛋白的mRNA含量。AQ3為一肺中ATII上皮細胞類型標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示AQ3表達，AQ3存在於三維SAEC單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用，但在三維SAEC/NHLF組織培養物中仍然觀測到最高含量的AQ3。
第4C圖：在不同肺細胞培養物中Wnt11與表面活性蛋白-A的mRNA表達。表示一代表性的逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)之凝膠影像。頂組：Wnt11表達；中間組：表面活性蛋白-A(SFTPA)表達；底組：β-肌動蛋白用作內部對照。不管在二維或三維培養物條件下，僅當成纖維細胞存在於樣本中時，偵測到Wnt11。然而，相比較於相應的二維培養物，Wnt11含量在混合三維或僅NHLF的培養物中顯示更高。注意到上皮細胞中表面活性蛋白-A(SFTPA)的表達需要成纖維細胞的存在，並且在三維培養物此含量增加。
第4D圖：在二維及三維培養物分選的肺上皮細胞中測量相對mRNA含量變化。圖式條表示相比較於二維培養物，三維培養物中的mRNA表達含量的交迭變化。AQP3：水通道蛋白3；TTF-1：甲狀腺轉錄因子-1(Nkx 2.1)；E-cad：E-鈣黏蛋白； N-cad：N-鈣黏蛋白。注意到，相比較於二維培養物，在三維培養物中AQP3、TTF-1以及E-cad含量增加以及N-cad含量降低。一個代表圖顯示三個獨立的實驗。
第5圖在肺細胞中不同的培養條件下不同基因的相對mRNA表達。
第5A圖-第5F圖：純的或混合的小氣道上皮細胞(SAEC)正常人類肺成纖維細胞(NHLF)作為二維單層或三維微量組織培養72小時，然後準備cDNA，以用於定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)。圖式中描述的基因表達含量作為相比較於在建立二維或三維培養物之前，表示0小時的純的或混合細胞的〞零樣本〞的交迭變化。圖中：小氣道上皮細胞(SAEC)加正常人類肺成纖維細胞(NHLF)為50-50%之混合物。圖式表示具有類似結果的三個獨立實驗。這些培養物中實驗的原代肺細胞自所有樣本中不同性別及年齡的隨機供體中獲得。
AQP3及KRT7係為SAEC分化標記物(第5A圖及第5C圖)。
TTF-1甲狀腺轉錄因子-1係為肺泡上皮細胞之一特徵標記物(第5B圖)。
S100A4、E-cad以及N-cad係為EMT標記物(第5D圖、第5E圖以及第5F圖)。
第6圖表示人類原代肺細胞培養物中發炎性細胞因數與趨化因數的分泌。第6A圖：在細胞培養上清液中幾乎未檢測到二維及三維NHLF單一培養物的CXCL-8分泌。三維SAEC培養物仍產生CXCL8，不過程度相比較於二維SAEC培養物為低。二維共培 養物未顯著改變CXCL-8的表達，表明成纖維細胞的存在不能夠影響細胞因數的表達。在純SAEC與SAEC-NHLF共培養物中CXCL-8表達量在三維組織系統中顯著降低。
第6B圖及第6C圖：分別為人類原代肺細胞培養物中IL-1b與IL-6 mRNA的表達量。相較於二維培養物，三維培養物中發炎性細胞因數IL-1b與IL-6的發炎性mRNA含量一致較低。在純成纖維細胞培養物中，未檢測到IL-1b mRNA表達，而IL-6含量低得多且表達變化也不太顯著。(另參見表2)
第6D圖：類似於混合細胞培養物樣品，相較於二維培養物中，發炎性細胞因數IL-1b與IL-6含量在自三維培養物純化的SAEC中也顯著減少。所示資料為三個(第6A圖-第6C圖)或兩個(第6D圖)獨立實驗的平均值。用於所有實驗中的純化的原代肺細胞為源自隨機供體。
第7圖表示過度表達A549細胞的Wnt11之構造。A549肺腺癌細胞使用構建編碼全長度Wnt11-IRES-GFP的慢病毒雙順反子轉染。對照A549細胞僅使用GFP轉染。
第7A圖：在A549-GFP與在A549-Wnt11細胞中，Wnt11 mRNA含量的定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)測量。圖式中所示的dCt值根據公式dCt=CtWnt11-Ctb-actin計算。
第7B圖：西方墨點法(Western blotting)檢測Wnt11蛋白。頂部：Wnt11墨跡；底部：β-肌動蛋白墨跡。β-肌動蛋白作為一內部加載對照。Wnt11轉基因細胞中的表達量相比較於對照細胞中顯著更高。
第7C圖：過度表達A549細胞的Wnt11之Wnt11染色。在藍色通道的DAPI核染色中，Wnt11表示為紅色。
第8圖表示Wnt11處理對肺微量模型之影響。
A組及B組：使用對照上清液(SN)對樣本切片蘇木紫伊紅(HE)染色72小時。A組：10倍影像，圖條表示200微米。B組：40倍HE染色影像。注意到上皮細胞(箭頭)之平坦形態及多孔結構。
C組及D組：使用Wnt11上清液(SN)對樣本之切片蘇木紫伊紅(HE)染色72小時。C組：10倍蘇木紫伊紅(HE)染色影像，圖條表示200微米。D組：40倍HE染色影像。注意到特徵立方細胞形態上類似於ATII細胞(箭頭)及立方形上皮細胞。
E組及F組：係分別為對照及Wnt11上清液(SN)處理樣本中的ATII標記物前表面活性蛋白C(pro-SFTPC)之免疫螢光染色。注意到在Wnt11上清液(SN)處理樣本中的前表面活性蛋白C(pro-SFTPC)(F組)，相比較於對照上清液(SN)處理樣本中的前表面活性蛋白C(pro-SFTPC)(E組)急劇增加。
G組及H組：係分別為對照及Wnt11上清液(SN)處理樣本中的ATII標記物AQP3之免疫螢光染色。注意到在對照上清液(SN)處理樣本中的AQP3(G組)，相比較於Wnt11上清液(SN)處理樣本中的AQP3(H組)，具有無法檢測到的低表達。
I組：相對mRNA含量變化在使用對照或Wnt11上清液(SN)處理的三維培養物中分選的肺上皮細胞中測量。圖式條表示Wnt11上清液(SN)處理的樣本中mRNA表達含量相比較於對照上清液 (SN)處理的樣本中mRNA表達含量之交迭變化。AQP3：水通道蛋白3；S100A4：鈣結合蛋白S100A4；E-cad：E-鈣黏蛋白；N-cad：N-鈣黏蛋白；SLUG：SNAI2轉錄因子。注意到在存在過量的Wnt11時，AQP3與E-cad含量增加，以及S100A4、N-cad以及SLUG含量減少。代表圖顯示三個獨立的實驗。
第9圖表示當Wnt11處理時，在SAEC-NHLF培養物中基因表達之變化。mRNA含量的變化相比較於未處理的對照培養物，在二維與三維培養物中均確定。
第10圖表示三維由SAEC、NHLF以及HMVEC組成的三個細胞類型的微量培養物之結構。SAEC、NHLF以及HMVEC分別使用活體染料CFSE、DiI、或DiD染色，然後聚集。在培育24小時之後，自然重新排列的兩種或三種細胞類型的微量培養物小心轉移至24孔細胞培養物板之中用以成像。第10A圖：兩種細胞類型培養物；第10B圖：三種細胞類型培養物。頂行：相差顯微術影像；中間行：螢光顯微影像；底行：共焦顯微影像。SAEC：綠色通道；NHLF：紅色通道；HMVEC：藍色通道。
第11圖表示三個細胞類型培養物中基因表達變化。第11A圖：相比較於二維培養物，在三維培養物中AQP3與KRT7的表達量增加，S100A4與N-cad減少。第11B圖：在三維SAEC-NHLF兩種細胞類型的培養物與SAEC-NHLF-HMVEC三種細胞類型的培養物中的分子標記物之表達變化之對比。AQP3與E-cad增加，S100A4與N-cad減少表明組織分化在三種細胞類型模型中維持。純化的原代肺細胞使用於來源於隨機供體的所有我們的實驗中。
第12圖表示Wnt11靜默對肺微量組織之影響。三維微量組織培養物使用透過應用72小時的負對照或Wnt11特定siRNA轉染的NHLF細胞而建立。A組及B組：蘇木紫伊紅(HE)染色的樣本之切片使用負對照siRNA轉染。A組：10倍蘇木紫伊紅(HE)染色影像，圖條表示200微米。B組：40倍HE染色影像。注意到形態特性細胞類似於ATII細胞(箭頭)及立方形上皮細胞，當存在Wnt11時這些ATII細胞(箭頭)及立方形上皮細胞更加豐富。C組及D組：蘇木紫伊紅(HE)染色的樣本之切片使用Wnt11特定siRNA轉染72小時。C組：10倍影像，圖條表示200微米。D組：40倍HE染色影像。注意到扁平上皮(箭頭)及多孔結構。E組及F組：係分別為對照siRNA及Wnt11特定siRNA轉染樣本中的EMT標記物N-鈣黏蛋白(N-cad)之免疫螢光染色。N-cad螢光表示於紅色通道中，細胞核使用複染劑DAPI染色，在藍色通道中表示。注意到，在存在Wnt11時(F組)，N-cad表達相比較於在對照siRNA轉染微量組織(E組)的N-cad表達增加。G組：在二維及三維SAEC-NHLF共同培養物中，Wnt11之效能靜默。雖然在二維培養物中，在轉染後72小時Wnt11含量表現一明顯的減少，但其含量在三維培養物中依然無法檢測到降低。H組：在使用對照或Wnt11 siRNA轉染的三維肺細胞共同培養物中測量相對mRNA含量之變化。圖式條表示在Wnt11 siRNA樣本中mRNA表達含量相比較於對照siRNA樣本中的mRNA表達含量之交迭變化。AQP3：水通道蛋白3；S100A4：鈣結合蛋白S100A4；E-cad：E-鈣黏蛋白；N-cad：N-鈣黏蛋白；SLUG：SNAI2轉錄因子。注 意到當存在過量的Wnt11時，AQP3與E-cad含量增加，以及S100A4、N-cad以及SLUG含量減少。代表圖顯示三個獨立的實驗。
第13圖表示自患者樣本外科方法獲得的實時定量PCR結果。A組及B組：分別為在非小細胞癌(NSCLC)切除樣本中Wnt11與受體Frizzled(FZ)-7之含量的mRNA表達。在17個肺癌(LC)樣本(在表1中顯示患者的詳細臨床與病理資料)中mRNA表達之QRT-PCR測量。紅色圓圈代表使用公式Ct(靶基因)-Ct(β-肌動蛋白)計算的dCt值，水平黑線代表dCt的平均值。統計比較採用配對樣本t檢定。A組：相對Wnt11 mRNA表達。相比較於自體正常肺組織樣本(p=0.007)，Wnt11在非小細胞癌(NSCLC)組中顯著向下表達。B組：Frizzled(FZ)-7之相對含量的mRNA表達。相比較於正常肺組織，Frizzled(FZ)-7在非小細胞癌(NSCLC)樣本(p=0.001)中顯著下調。
第14圖表示測試備用肺組織試劑盒的製備流程圖。
第15圖表示當Wnt11處理時在SAEC-NHLF培養物中基因表達之變化。相比較於未處理對照培養物，SFTPA之mRNA變化量在二維及三維培養物兩者中透過PCR確定。

Claims (23)

  1. 一種工程化三維肺部模型組織培養物，係包含：a)不含人工組織骨架，其中該人工組織骨架係為一多孔三維基質；一三維凝膠基質或一多孔膜支撐物，b)包含培養的成纖維細胞，c)包含培養的肺部小氣道上皮細胞，其中模型組織中該肺部小氣道上皮細胞與該成纖維細胞的比率介於1：6以及6：1之間，d)具有一個或多個細胞聚集體之一形態，其中該等聚集體包含多重空洞，其中該等聚集體的面富集肺部上皮細胞，e)其中該等肺部上皮細胞表達至少一個肺泡II型(ATII)上皮分化標記物，其中，所述細胞處於與組織材料的一種或一種以上其他細胞類型細胞的直接細胞-細胞相互作用中。
  2. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該等肺部上皮細胞與該等成纖維細胞相比較於一對照二維單細胞培養物或一對照二維共同培養物，透過增加的黏接相連接。
  3. 如請求項第1項或第2項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該模型組織培養物包含自一個體獲得之培養的原代細胞。
  4. 如請求項第1項或第2項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該模型組織培養物包含在培養之前去分化且在培養時再分化的細胞。
  5. 如請求項第3項或第4項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該模型組織培養物還包含腫瘤細胞系。
  6. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該模型組織培養物透過以下可獲得，製備至少肺部小氣道上皮細胞與成纖維細胞的混合懸浮液，粒化該懸浮液之該等細胞，在存在二氧化碳(CO2)時，培育經粒化後的該懸浮液，將該模型組織培養物暴露於Wnt11，以及其中該模型培養物包含長方體狀上皮肺部細胞。
  7. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中a)至少一種肺泡上皮細胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)標記物上調，b)至少一種發炎標記物下調，c)上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)禁止，d)至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記物下調。
  8. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中在該模型組織培養物中至少一個以下的ATII標記物上調：一表面活性蛋白，選自表面活性蛋白C(SFPC)、前表面活性蛋白C(pro-SFTPC)、表面活性蛋白A(SFPA)中選擇的一表面活性蛋白，水通道蛋白3(AQP 3)， 甲狀腺轉錄因數1(TTF1)，以及其中在該模型組織培養物中，以下至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記下調：S100鈣結合蛋白A4(S100A4)，N-鈣黏蛋白(N-cad)，蝸牛同源物2(SLUG)。
  9. 一種用作疾病模型的如請求項1所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該模型組織培養物包含具有患病肺組織的一病理特徵之受影響之細胞。
  10. 如請求項第9項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中Wnt11在該模型組織培養物之該等細胞中靜默、下調或者麻醉，以及由此該模型組織培養物表現出一腫瘤。
  11. 如請求項第10項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中該腫瘤係為一非小細胞肺癌。
  12. 如請求項第9項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中該疾病涉及炎症且該等受影響之細胞表達正常值之上的發炎的細胞激素且該模型係為一發炎模型。
  13. 如請求項第9項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中該疾病係為一腫瘤且該等細胞轉化。
  14. 如請求項第9項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中該疾病涉及纖維化且該模型係為一纖維化模型。
  15. 如請求項第9項所述之用作疾病模型的工程化三維肺部模型組織培養物，其中該疾病涉及組織損傷且該模型係為一再生模型。
  16. 一種工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，係包含以下步驟：製備至少肺部小氣道上皮細胞與成纖維細胞的混合懸浮液，粒化該懸浮液之該等細胞，在二氧化碳(CO2)存在下培育該粒化懸浮液並保持足以使得該等細胞形成包含一個或多個細胞聚集體的一三維肺部模型組織的時間，任選分析該模型組織，用以a)模型組織培養物所特有的一種或多種上皮分化標記物的表達，並且相較於一參考培養物，表達量增加被認為指示形成一三維肺部模型組織培養物；b)一種或多種促炎性細胞因數的表達，並且相較於適合參考培養物，表達量減少被認為是指示形成一三維肺部模型組織培養物，c)至少一個上皮細胞間充質細胞轉變(EMT)標記物，並且相較於一適合參考培養物，一表達量減少認為是指示形成一三維肺部模型組織培養物，d)該一個或多個聚集體之形態，其中模型組織中該肺部小氣道上皮細胞與該成纖維細胞的比率介於1：6以及6：1之間。
  17. 如請求項第16項所述之工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，其中該培養物之細胞暴露於Wnt11或與Wnt11相接觸，其中在培養期間，Wnt11添加至該培養物。
  18. 如請求項第16項所述之工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，其中該培養物之細胞暴露於Wnt11或與Wnt11相接觸，其中提供一細胞培養物，其中至少一個類型之細胞係為重組細胞及過度表達Wnt11。
  19. 一種如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物之用途，用於識別一物質，能夠調整組織恢復與該肺部組織中的分化之蛋白質，針對化合物對肺部組織之作用，平行篩選化合物，針對化合物的治療潛力，對化合物進行患者特異性測試，只要該模型組織培養物自原代患者肺部細胞獲得即可，研究該肺部組織中細胞的相互作用，研究該肺部疾病期間之基因變化，其中該肺部組織為一遠端氣道之組織。
  20. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中模型組織中該肺部小氣道上皮細胞與該成纖維細胞的比率介於1：3以及3：1之間。
  21. 如請求項第16項所述之工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，其中模型組織中該肺部小氣道上皮細胞與該成纖維細胞的比率介於1：3以及3：1之間。
  22. 如請求項第1項所述之工程化三維肺部模型組織培養物，其中該成纖維細胞為原代成纖維細胞。
  23. 如請求項第16項所述之工程化三維肺部模型組織培養物之製備方法，其中該成纖維細胞為原代成纖維細胞。
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