TWI429460B - 抗凝血劑共軛之奈米碳球、含其之抗血栓劑及其製造方法 - Google Patents

抗凝血劑共軛之奈米碳球、含其之抗血栓劑及其製造方法 Download PDF

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Description

抗凝血劑共軛之奈米碳球、含其之抗血栓劑及其製造方法
本發明關於奈米碳球衍生物的新穎抗血栓藥物，特別是關於奈米碳球表面共軛結合抗凝血劑之抗血栓藥物。
抗凝血劑為用於防止血液凝集的物質，目前臨床上使用的抗凝血劑主要可區分為維生素K拮抗劑(香豆素(coumarin)衍生物)及肝素(heparin)衍生物。
可邁丁(warfarin)為維生素K拮抗劑的一種，臨床上已知可有效地應用於治療人工心臟瓣膜、心房顫動及缺血性中風。但是受到遺傳因素、飲食等的影響，可邁丁(warfarin)通常難以在生物體內穩定維持有效的治療劑量。使用可邁丁(warfarin)的副作用包括腸胃道出血、尿道出血、腦內出血或嚴重的併發症(Kenichi A. et al.,Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation,Anesth Analg 2009;108:1433-46)。
另一個常用的抗凝血劑，肝素(heparin)及其衍生物，有效於血栓的急性及慢性預防。肝素衍生物雖具有良好的抗凝血效果，但是在靜脈注射時相對短的體內半衰期(約30-90分鐘)、皮下投予時的藥物動力無法預期以及高敏感性與血小板過低(thrombocytopenia)，使得肝素衍生物的使用受限。再者，肝素衍生物的抗凝血功能依賴於抗凝血酶(antithrombin)的活性。抗凝血酶的活性會因為懷孕、嚴重燒燙傷、肝功能受損、腎病症候群(nephritic syndrome)、敗血症、以及***或天冬胺酸酶(asparaginase)的使用而降低，間接使肝素衍生物的抗凝血功能降低(Kenichi A. et al.,Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation,Anesth Analg 2009;108:1433-46)。
有鑒於目前使用的抗凝血劑的使用限制以及可能引發的併發症，發展新穎的抗凝血劑有其需要。
因此，本案提供一種奈米碳球，表面共軛結合抗凝血劑。
本案更提供一種抗血栓藥物，包括表面以抗凝血藥物共軛結合的奈米碳球為活性成分。
本案再提供上述奈米碳球之製造方法，包括(i)改質奈米碳球，形成表面官能基化；(ii)將抗凝血劑與步驟(i)表面官能基化的奈米碳球混合；及(iii)分離表面共軛結合該抗凝血劑之奈米碳球。
本案所揭示之奈米碳球(Carbon NanoCapsule,CNC)為多面體的碳簇結構，由多層石墨所構成，具有球中球的結構(balls-within-a ball structure)。本案之奈米碳球可為中空結構或內部含填充物的結構。奈米碳球內部可填充的物質包括金屬、金屬氧化物、金屬碳化物或上述之合金材料。具體例如鈧(Sc)、釩(V)、鉻(Cr)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、釔(Y)、鋯(Zr)、鉬(Mo)、銣(Ru)、鉛(Pd)、鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鎦(Lu)、鉭(Ta)、鋨(Os)、銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、釷(Th)或鈾(U)、或此述金屬的氧化物、碳化物或合金，但不限於此。不論內部中空或填充金屬，奈米碳球的表面仍然維持多層石墨的結構及特性。然而，藉由內部填充的金屬種類，本案之奈米碳球可應用於造影、局部熱治療或者以電磁原理控制奈米碳球的分布等用途。
本案之奈米碳球的平均粒徑可為1-100nm之範圍。當內部為中空結構時，奈米碳球較佳為3-60nm。當內部含有填充物時，奈米碳球較佳為3-100nm。
已知與奈米碳球相似的多層石墨結構還包括單層奈米碳管(Single-Wall Carbon Nanotube,SWCNT)以及多層奈米碳管(Multiple-Wall Carbon Nanotube,MWCNT)。然而在生物毒性及生物相容性的考量上，單層及多層奈米碳管並不適合於醫藥用途。如後敘之實施例的比較結果，相較於單層或多層奈米碳管，奈米碳球具有較低的細胞毒性以及良好的生物相容性，而且在生物體內的清除效率(clearance)高，為理想的醫藥用載體(carrier)。
本案之奈米碳球的特徵之一在於表面共軛結合(conjugate)抗凝血劑。此述抗凝血劑包括具有抗凝血功能之活性物質，具體例如肝素(heparin)、胞漿素(plasmin)、絲胺酸蛋白酶(serine protease)、尿激酶(urokinase)、鏈激酶(streptokinase)、可邁丁(warfarin)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、苯茚二酮(phenindione)、維生素k拮抗劑(vitamin K antagonist)、組織纖維蛋白溶解原活化劑(tissue plasminogen activator)等，但不限於此。本案一實施例係將肝素共軛結合於奈米碳球表面。在此實施例中，肝素共軛結合的奈米碳球可在生物體內局部提高肝素的濃度以加強分解血栓的效果，避免習知單獨使用肝素可能引發的不正常出血或併發症。
根據本案發明，使用奈米碳球作為承載抗凝血劑的載體係為新穎的技術思想。藉由一個奈米碳球的表面可共軛結合至少1個抗凝血劑之結構，本案所揭示之表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球可提高局部抗凝血劑的濃度，進而達到局部分解血栓的效果。本案所述之奈米碳球較佳為一個奈米碳球可共軛結合1~105 個，或者共軛化率(conjugate rate)達到5~40%，較佳的數值範圍20~30%。
具體地說，本案所述之表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球可由下列方法製造：
(i)　改質奈米碳球，形成表面官能基化；
(ii)　將抗凝血劑與步驟(i)表面官能基化的奈米碳球混合；及
(iii)　分離表面共軛結合該抗凝血劑之奈米碳球。
上述步驟(i)之官能基化係指奈米碳球表面進行改質(modification)以形成特定的官能基。本案所述之官能基化沒有特別限定的官能基種類，可根據抗凝血劑種類、交聯劑種類等條件適當選擇。官能基化的方法可例如將奈米碳球浸入適當溶劑中使其表面改質。
本案一具體例為肝素共軛結合於奈米碳球表面。在此例中，奈米碳球藉由浸於酸性溶液中以達到表面改質為羧基(-COOH)官能基。此例中的酸性溶液包括使用鹽酸、硫酸或兩者之混合溶液，較佳為鹽酸與硫酸以等體積混合的混合溶液。
本案所述之表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球的製造方法中，步驟(ii)可進一步包括添加交聯劑(cross-linker)，使抗凝血劑結合於奈米碳球表面。此述之交聯劑可為習知用於共軛聯結合的交聯劑，沒有特別限制。在上述肝素共軛結合於奈米碳球表面之本案一具體例中，可使用的交聯劑包括1-乙基-3-(-3-二甲基胺基丙基)碳二醯胺)(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride,EDC)或N,N’-二環己基碳二醯胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)等的碳二醯胺系化合物。在此具體例中，藉由EDC與羧基官能基化的奈米碳球形成一醯胺活化的O -醯基異脲(O -acylisourea)中間產物，之後由肝素取代EDC，形成以醯胺鍵(amide bond)共軛結合的表面共軛結合肝素的奈米碳球(如第1圖)。在此具體例中，可進一步添加N-羥基硫化琥珀醯亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide)以加速EDC-媒介的交聯反應的進行。
根據本案發明，表面共軛結合抗凝血藥物的奈米碳球可進一步作為抗血栓藥物的使用。根據本案發明所製備的表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球，由於1個奈米碳球的表面可共軛結合1個以上的抗凝血劑，因此可提高局部抗凝血劑的濃度，進而達到局部分解血栓的效果。相較於習知抗凝血劑的全身投藥所造成的非治療部位出血或者過量使用所引起的微血管破裂等副作用，本案所述之表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球可避免發生上述副作用的風險，並且提高欲治療部位(局部)的抗凝血功效，有效地解決習知技術中長期存在的困難。
本案所述之抗血栓藥物除包含本案之表面共軛結合抗凝血劑之奈米碳球作為具有治療效果的活性成分以外，還可包括醫藥容許的載劑或添加物，例如賦形劑、抗氧化劑、乳化劑、分散劑、制菌劑、矯味劑、著色劑、緩衝劑、溶劑、pH調整劑、界面活性劑等，沒有特別的限制。所添加的醫藥容許載劑或添加物可視投藥劑型適當設計、添加。本案之抗血栓藥物的劑型可為錠劑、膠囊劑、膜衣錠、粉末、懸浮液、注射液等，經由口服、經皮投藥、腹腔注射、靜脈注射等的路徑投藥。雖然沒有特別限定劑型及投藥路徑，但本案之抗血栓藥物較佳為靜脈注射投藥。本案所述之醫藥組成物可單獨投藥或者與其他藥劑組合投藥。投藥劑量可根據患者年齡、體重、健康狀況、疾病種類、疾病的進展、患部等因素，由相關醫療人員依該技術領域中共通知識決定。
本案所述之抗血栓藥物可應用於預防手術中血栓的形成或治療心血管疾病。此述之心血管疾病可包括中風、急性冠狀動脈症候群(acute coronary syndrome)、心房顫動(atrial fibrillation)、冠狀動脈閉塞症(coronary occlusion)、深層靜脈栓塞(deep vein thrombosis)或肺栓塞(pulmonary embolism)，但不限於此。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
[實施例l]　碳材的細胞毒性測試
分別取幹細胞MSC(Mouse mesenchymal stem cells,primary,from FVB bone marrow isolation,5000 cells/cm2 ，購自美國ATCC)、癌細胞Hela(cell line,5000 cells/cm2 )、纖維母細胞NIH/3T3(cell line,5000 cells/cm2 )，分別加入磷酸緩衝液(PBS)、聚乙烯醇(PVA)、單層碳管(SWCNT)、多層碳管(MWCNT)、奈米碳球(CNC)與碳60(C60)(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)，培養24和48小時。分別觀測細胞存活率(viability)及細胞凋零(apoptosis)。
細胞存活率的結果如第2A~2E圖所示。以聚乙烯醇作為分散劑的各種碳材在24小時(第2A~2C圖)後，除了C60毒性較小以外，其餘碳材皆會造成輕微之毒性。然而，48小時(第2D~2E圖)後，各碳材所造成之毒性相當低。
細胞凋零的結果如第3A~3D圖所示。奈米碳球在24小時(第3A~3B圖)與48小時(第3C~3D圖)相對於其他碳材如碳60、多層碳管及單層碳管所造成的影響極小。由此可知，奈米碳球相對於其他碳材所造成之生物毒性較低，亦即，生物相容性相對較好。
[實施例2]　碳材的體內毒性測試
選用8-12周大之FVB小鼠分別靜脈注射磷酸緩衝液(PBS)、聚乙烯醇(PVA)、單層碳管(SWCNT)、多層碳管(MWCNT)、奈米碳球(CNC)與碳60(C60)，劑量為50μg/g、25μg/g和12.5μg/g三種。檢測小鼠的累積死亡率，結果如第4A~4F圖所示，圖中三角點表示高劑量(50μg/g)，圓點表示25μg/g劑量，交叉點表示12.5μg/g劑量(CNC及C60的處理組分別為12隻小鼠，PBS、PVA、SWCNT、MWCNT的處理組分別為11隻)。SWCNT及MWCNT顯示劑量依賴(dose-dependent)，以及最高的細胞死亡率。在25μg/g劑量的奈米碳球處理的小鼠未見死亡率。由此可知，奈米碳球相對於其他碳材所造成之生物毒性較低，生物相容性相對較好。
[實施例3]　碳材於肺組織中的殘留
使小鼠分別注射PBS、PVA、SWCNT、MWCNT、CNC及C60各50μg/g。10分鐘後切下小鼠肺組織，觀察肺組織切片中碳材的殘留。以C60、SWCNT、MWCNT處理的小鼠在10內即已死亡。肺組織及切片結果分別如第5A及5B圖所示，顯示CNC在肺組織的殘留量小，不至於對動物體造成傷害。
[實施例4]　碳材於肺組織中的殘留量分析
使小鼠分別注射PBS、PVA、SWCNT、MWCNT、CNC及C60各25μg/g。經過7天後切下小鼠肺組織，觀察肺組織切片中碳材的殘留量，如第6A及6B圖所示。高磁量顯影(放大處)顯示大量的奈米碳管聚集在肺部血管造成阻塞(箭頭標示處)。SWCNT、MWCNT相較於奈米碳球及C60在肺組織的殘留量高。第6A圖中的比例尺為100μm，第6B圖中「***」表示p＜0.0001(相較於CNC和C60)，每群4隻小鼠。
[實施例5]　肝素共軛的奈米碳球之製備
將100mg奈米碳球置於100ml的H2 SO4 與HNO3 等體積的混合溶液中沸騰溫度迴餾2小時。之後離心收集表面具有-COOH官能基的奈米碳球，並以蒸餾水清理，獲得含-COOH官能基的水溶性奈米碳球。
接著，於上述奈米碳球水溶液(0.1mg/ml)懸浮於檸檬酸緩衝液，加入1mg/ml的1-乙基-3-(-3-二甲基胺基丙基)碳二醯胺)(EDC)溶液，使奈米碳球在室溫下活化1-2小時。之後加入2 IU/ml的肝素鈉於4℃過夜。之後，離心收集表面具有肝素共軛的奈米碳球，並清洗去除未鍵結之肝素。
[實施例6]　肝素共軛的奈米碳球之共軛效率
取實施例5所得之肝素共軛的奈米碳球，以穿透式電子顯微鏡(TEM)與電子掃瞄式電子顯微鏡(SEM)觀察奈米碳球的外觀形式。
由TEM下觀察之結果(如第7圖)，可知奈米碳球於修飾後並不會改變其封閉石墨殼結構，亦不會使奈米碳球的粒徑大幅改變。由TEM電子顯微鏡觀察得知奈米碳球於修飾後會有一層薄膜披覆於奈米碳球的表面。
另一方面，以電子能譜分析儀(XPS)初步分析實施例5所得之肝素共軛的奈米碳球的元素組成。由於肝素帶有硫元素，分析奈米碳球上的硫元素之含量可得知肝素共軛連接於奈米碳球的效率。如第8圖所示，元素分析結果得知約30%的肝素量共軛於奈米碳球上。
另一方面再以甲苯胺藍染色反應(Toluidine Blue O,TBO)分析肝素共軛結合於奈米碳球的效率。
首先將實施例5所得的肝素共軛的奈米碳球以PBS清洗，在4℃、14,000rpm離心三次，分別收集上清液。將上清液與0.005%甲苯胺藍染料以比例1:4混合、搖晃3分鐘。之後加入等體積的己烷攪拌混合3分鐘。偵測631nm波長的強度。結果與上述電子能譜分析和元素分析相符，約30%的肝素量共軛於奈米碳球上。
[實施例7]　肝素共軛的奈米碳球之釋放測試
在37℃將實施例5所得之肝素共軛的奈米碳球50 μg加入1ml的磷酸緩衝液(phosphate buffer saline,PBS)混合，訂為第0小時。之後每兩小時離心收集上清液，以xx方法測定肝素濃度。結果如第9A、9B圖所示，於37℃磷酸緩衝液環境下於12小時下，肝素的釋放可達釋放的飽和點。
[實施例8]　部分凝血活酶(APTT)測試模式中肝素共軛 的奈米碳球之抑制凝血功能
體外試驗( in vitro ) ：將收集自野生型大鼠血液於檸檬酸中4℃離心3000g，分離及收集血清。另一方面，將奈米碳球、肝素共軛的奈米碳球和奈米碳球與肝素混合物分別與上述分離的血清及部分凝血活酶(APTT)測試溶液Cephen-5(Liquid APTT)以1:9:10比例混合，於37℃培養3分鐘。之後，各樣本中加入0.025μM氯化鈣開始計時，紀錄纖維蛋白(fibrin)出現的時間。結果如第10A圖所示，肝素共軛的奈米碳球較空白對照組(未添加任何物質的血液)延長血液凝固的時間。
離體試驗( ex vivo ) ：將奈米碳球、肝素共軛的奈米碳球和奈米碳球與肝素混和物分別以2μg/g(w/w)靜脈注射到野生型大鼠(每組3隻)。經過10分鐘後，抽出大鼠血液，製備血漿。將所得血漿與APTT測試溶液(Cephen-5(Liquid APTT))以9:10比例混合，於37℃培養3分鐘。之後，各樣本中加入0.025μM氯化鈣開始計時，紀錄纖維蛋白(fibrin)出現的時間。結果如第10B圖所示，肝素共軛的奈米碳球較空白對照組(未注射任何物質的血液)延長血液凝固的時間。
[實施例9]　氯化鐵模式中肝素共軛的奈米碳球之抑制凝血功能
此實施例所使用之動物模式係根據XinKang Wang & Lin Xu,An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research,Thrombosis Research (2005) 115,95-100，並進行適當的修改。
具體為，以分別添加氯化鐵(FeCl3 patch)、奈米碳球、肝素共軛的奈米碳球、及氯化鐵(FeCl3 patch)與奈米碳球的生理食鹽水以及未添加任何東西的生理食鹽水，分別靜脈注射小鼠。未添加任何東西的生理食鹽水為負對照組，添加氯化鐵的生理食鹽水為正對照組。以雷射杜普勒測量分別以上述生理食鹽水處理前、處理中及處理後的血液流速。手術前及進行處理前使血流測量標準化。在監測血流40分鐘後，犧牲小鼠並收集其血液，進行ELISA分析(每群5隻)。結果如第11圖所示。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示本案一實施例中肝素共軛的奈米碳球之製備流程圖；第2A~2F圖顯示各類碳材的細胞毒性測試結果；第2A圖顯示各類碳材對纖維母細胞NIH/3T3在24小時後的存活率；第2B圖顯示各類碳材對癌細胞Hela在24小時後的存活率；第2C圖顯示各類碳材對幹細胞hMSC在24小時後的存活率；第2D圖顯示各類碳材對纖維母細胞NIH/3T3在48小時後的存活率；第2E圖顯示各類碳材對癌細胞Hela在48小時後的存活率；及第2F圖顯示各類碳材對幹細胞hMSC在48小時後的存活率；第3A~3D圖顯示各類碳材的細胞毒性測試結果；第3A圖顯示各類碳材對纖維母細胞NIH/3T3在24小時後的細胞凋零率；第3B圖顯示各類碳材對癌細胞Hela在24小時後的細胞凋零率；第3C圖顯示各類碳材對纖維母細胞NIH/3T3在48小時後的細胞凋零率；及第3D圖顯示各類碳材對癌細胞Hela在48小時後的細胞凋零率；第4A~4F圖顯示各類碳材對小鼠的累積死亡率；第4A圖顯示注射PBS的累積死亡率；第4B圖顯示注射PVA的累積死亡率；第4C圖顯示注射CNC的累積死亡率；第4D圖顯示注射C60的累積死亡率；第4E圖顯示注射MWCNT的累積死亡率；及第4F圖顯示注射SWCNT的累積死亡率；第5A~5B圖顯示各類碳材於肺組織中的殘留程度；第5A圖顯示注射PBS、PVA、SWCNT、MWCNT、CNC及C60後的小鼠肺組織；以及第5B圖顯示第5A圖所示之肺組織的切片結果；第6A~6B圖顯示各類碳材於肺組織中的殘留量分析；第6A圖顯示注射PBS、PVA、SWCNT、MWCNT、CNC及C60後的小鼠肺組織切片；以及第6B圖顯示第6A圖所示肺組織中各類碳材的殘留量；第7圖顯示本案一實施例之肝素共軛於奈米碳球的電子顯微照片；第8圖顯示本案一實施例之肝素共軛於奈米碳球的元素分析；第9A~9B圖顯示本案一實施例之肝素共軛的奈米碳球之體外釋放結果；第9 A圖顯示在0~24小時中肝素的釋放情形；以及第9 B圖顯示在0~168小時中肝素的釋放情形；第10A~10B圖顯示本案一實施例之肝素共軛的奈米碳球在部分凝血活酶(APTT)測試下的抑制凝血功能；第10A圖顯示體外(in vitro )試驗中奈米碳球、肝素共軛的奈米碳球、奈米碳球與肝素混合物及未添加任何物質的正常血清的凝血情形；第10B圖顯示離體(ex vivo )試驗中奈米碳球、肝素共軛的奈米碳球、奈米碳球與肝素混合物及未添加任何物質的正常血清的凝血情形；第11圖顯示氯化鐵模式中肝素共軛的奈米碳球之抑制凝血的效果。

Claims (22)

  1. 一種奈米碳球，表面共軛結合抗凝血藥物，其中，該抗凝血藥物以醯胺基鍵結於該奈米碳球的表面，且一個該奈米碳球共軛結合的該抗凝血藥物為1~105 個。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之奈米碳球，其中該奈米碳球的直徑為3~100nm。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之奈米碳球，其中該奈米碳球包括中空的奈米碳球。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之奈米碳球，其中該奈米碳球包括內部填充金屬、金屬氧化物、金屬碳化物或上述之合金材料的奈米碳球。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之奈米碳球，其中該金屬、金屬氧化物、金屬碳化物或合金材料中之金屬係選自由鈧(Sc)、釩(V)、鉻(Cr)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、釔(Y)、鋯(Zr)、鉬(Mo)、銣(Ru)、鉛(Pd)、鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鎦(Lu)、鉭(Ta)、鋨(Os)、銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、釷(Th)及鈾(U)所組成之群組。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之奈米碳球，其中該抗凝血藥物包括肝素、胞漿素(plasmin)、絲胺酸蛋白酶(serine protease)、尿激酶(urokinase)、鏈激酶(streptokinase)、可邁丁(warfarin)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、苯茚二酮(phenindione)、維生素k拮抗劑或組織纖維蛋白溶解原(plasminogen)活化劑。
  7. 一種抗血栓藥物，包括表面共軛結合抗凝血藥物的 奈米碳球為活性成分，其中，該抗凝血藥物以醯胺基鍵結於該奈米碳球的表面，且一個該奈米碳球共軛結合的該抗凝血藥物為1~105 個。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之抗血栓藥物，其中該奈米碳球的直徑為3~100nm。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之抗血栓藥物，其中該奈米碳球包括中空的奈米碳球。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之抗血栓藥物，其中該奈米碳球包括內部填充金屬、金屬氧化、金屬碳化物或合金材料的奈米碳球。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之抗血栓藥物，其中該金屬、金屬氧化物、金屬碳化物或合金材料中之金屬係選自由鈧(Sc)、釩(V)、鉻(Cr)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、釔(Y)、鋯(Zr)、鉬(Mo)、銣(Ru)、鉛(Pd)、鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鎦(Lu)、鉭(Ta)、鋨(Os)、銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、釷(Th)及鈾(U)所組成之群組。
  12. 如申請專利範圍第7項所述之抗血栓藥物，其中該抗凝血藥物包括肝素、胞漿素(plasmin)、絲胺酸蛋白酶(serine protease)、尿激酶(urokinase)、鏈激酶(streptokinase)、可邁丁(warfarin)、醋硝香豆素(acenocoumarol)、苯茚二酮(phenindione)、維生素k拮抗劑或組織纖維蛋白溶解原(plasminogen)活化劑。
  13. 如申請專利範圍第7-12項任一項所述之抗血栓藥 物，用於預防手術中血栓的形成或治療心血管疾病。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之抗血栓藥物，其中該心血管疾病包括中風、急性冠狀動脈症候群、心房顫動、冠狀動脈閉塞症、深層靜脈栓塞或肺栓塞。
  15. 一種申請專利範圍第1-6項任一項之奈米碳球之製造方法，包括：(i)改質奈米碳球，形成表面官能基化；(ii)將抗凝血藥物與步驟(i)表面官能基化的奈米碳球混合；及(iii)分離表面共軛結合該抗凝血藥物之奈米碳球，其中，該抗凝血藥物以醯胺基鍵結於該奈米碳球的表面，且一個該奈米碳球共軛結合的該抗凝血藥物為1~105 個。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之奈米碳球之製造方法，其中步驟(i)之官能基化包括羧基(-COOH)官能化。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之奈米碳球之製造方法，其中該羧基(-COOH)官能化係藉由酸溶液處理。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之奈米碳球之製造方法，其中該酸溶液包括鹽酸、硫酸或兩者之組合溶液。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之奈米碳球之製造方法，其中該酸溶液為鹽酸與硫酸等體積的混合溶液。
  20. 如申請專利範圍第15-19項任一項所述之奈米碳球之製造方法，其中步驟(ii)更包括添加交聯劑。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之奈米碳球之製造方 法，其中該交聯劑包括1-乙基-3-(-3-二甲基胺基丙基)碳二醯胺)(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)或N,N’-二環己基碳二醯胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide)。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之奈米碳球之製造方法，其中步驟(ii)更包括添加N-羥基硫化琥珀醯亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide)。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW577856B (en) 2002-12-25 2004-03-01 Ind Tech Res Inst Organically functionalized carbon nanocapsules
TWI242465B (en) 2003-07-21 2005-11-01 Ind Tech Res Inst Carbon nanocapsule as catalyst support
CN1246372C (zh) 2004-04-05 2006-03-22 清华大学 一种聚合物薄膜表面共价接枝肝素的方法
US7985426B1 (en) 2004-10-05 2011-07-26 Hsing-Wen Sung Nanoparticles for targeting hepatoma cells and delivery means
JP2006160664A (ja) 2004-12-07 2006-06-22 Vitamin C60 Bioresearch Kk フリーラジカル疾患予防治療用組成物
US8007768B1 (en) 2005-01-04 2011-08-30 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
US8017237B2 (en) 2006-06-23 2011-09-13 Abbott Cardiovascular Systems, Inc. Nanoshells on polymers
CN101361992B (zh) 2008-09-12 2012-08-22 西南交通大学 一种在TiO2表面固定肝素多层膜的方法
CN101491835B (zh) 2009-02-27 2013-07-17 江南大学 一种制备肝素修饰的金纳米粒子的方法
US8607989B2 (en) 2009-06-15 2013-12-17 Vascular Vision Pharmaceutical Co. Filter composites for drug detoxification
CN101962410B (zh) 2009-07-22 2013-07-31 中国科学院遗传与发育生物学研究所 肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法

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