TWI422535B - Microcapsules for removing organic toxicants in sludge, methods for their manufacture and their application - Google Patents

Description

用於去除污泥中有機毒化物之微膠囊，其製造方法及其應用

本發明係關於去除污泥中有機毒化物之微膠囊，更特別地，係關於利用天然高分子材料與鈣之交聯產物包埋木質素分解酵素及/或具分解能力之菌株，製造成可用於去除污泥中有機毒化物的微膠囊。

污泥本身含有豐富營養鹽與有機質，研究學者指出若將污泥添加到土壤中，可幫助肥沃土壤、改善土壤的性質，也會讓土壤中原有的菌相產生變化(1994，Barr等人Environmental Science and Technology 28: 78A-87A.)。歐美各國已有利用污泥作為土壤改良劑，使污泥資源化並回收再利用，但由於傳統的生物處理程序無法有效去除有機毒化物質，因此污泥中所含之養份及有機毒化物的濃度含量非常高，這些污泥若未經適當處理、清除其中的有機毒化物質，就直接投入環境中做為土壤改良劑，則其中的污染物不僅會在生物中造成累積，且會對土壤中之生物產生危害。Harrison等人(2006，Science of the Total Environment. 367： 481-497)曾研究指出，污泥中可能含有的有機毒化物質包括壬基酚(NP)、多溴二苯醚(PBDEs)、四溴雙酚A(TBBPA)、雙酚A(BPA)及雙酚F(BPF)，四環素類抗生素(TC)等等。

其中壬基酚(nonylphenol,NP)是工業上常用來做為清潔劑之壬基酚類非離子型介面活性劑(nonylphenol polyethoxylate,NPEOs)經部分降解後的不完全產物。這些非離子型界面活性劑具有疏水以及親水兩種特性，故已被廣泛使用在清潔劑、潤滑劑以及乳化劑等泡沫製劑中。除了清潔劑以外，也常被用於添加在農藥中。壬基酚是一種能干擾生物體內分泌之化學物質，也就是環境賀爾蒙(Environmental hormones)的一種，其結構與人體的***荷爾蒙類似，故會干擾人體中荷爾蒙與受器結合，進而阻礙生殖、發育等機能，甚至可能引發惡性腫瘤與生物喪失性徵的危害，台灣環境保護署已將其公告為第一類毒性化學物質。

雙酚A(Bisphenol A,BPA)是一種重要的工業製造原料，其主要用於生產聚碳酸酯塑化產品。除此之外，它也是常用來做為阻燃劑原料的四溴雙酚A經生物降解後的產物，此類化合物可能藉由罐頭封膜、奶瓶、牙齒的填充劑，或是其他電子的阻燃劑等方式間接進入人體。其中較令人擔憂的是嬰兒用的奶瓶，因為嬰兒對化學物質及環境荷爾蒙最敏感，造成的影響亦最為嚴重。Frhacker等人(2000，Chemosphere 41 ：751-756)認為，工廠排放之廢水是雙酚A進入河川、溪流、或其他水資源的主要途徑。McLachlan(2001，Endocrine Reviews 22 ：319-341)證實，雙酚A會干擾動物體內內分泌的調節，使得動物失去性徵，嚴重者喪失生殖能力，台灣環保署也將其公告為第四類毒性化學物質。

多溴二苯醚(Polybrominated diphenyl ether,PBDEs)也是常見的溴化阻燃劑的一種，大多運用在電子電器產品、建築材料及汽車內裝等。Alaee等人(2003，Chemosphere 46 ：579-582)指出，多溴二苯醚存在於空氣、地表水、底泥、土壤及污泥中，並且污染場址附近之居民的母乳也檢出。而我國環保署已經將十溴二苯醚公告為第四類毒性化學物質。

四環黴素類抗生素(Tetracycline antibiotics,TC)為，分離自Streptomyces spp.的一種廣效性抗生素不但對革蘭氏陽性、陰性菌有抑制作用，對鉤端螺旋體、放線菌、立克次體、類菌質體及大型病毒均有抑制作用。四環黴素類抗生素主要包括羥四環黴素(oxytetracycline,OTC)、四環黴素(tetracycline,TC)以及氯四環黴素(chlortetracycline,CTC)等。四環素類抗生素易與鈣、鐵等金屬離子螯合影響腸道吸收，在幼童牙齒發育期間服用可能使牙齒永久性變色，孕婦若服用可能經由胎盤影響應而之骨骼發育，因此受到關注。

關於去除有機毒化物的研究非常多，而如何節省成本並且提高去除效率縮短處理時間，已成為一個重要的課題。利用微生物方法去除環境毒化物是可行的方法，包括生物刺激以及生物添加兩種方法，生物添加則是添加酵素或確定有分解毒化物能力的菌株，去除環境中有機污染物；而生物刺激是改變環境條件促進微生物生長使其利用有機毒化物。過去研究顯示，添加具有分解能力之菌株或木質素分解酵素可去除多種有機毒化物。但直接添加具有分解毒化物能力之菌株，可能受到環境條件影響而無法發揮其分解能力。

白腐真菌特有之胞外木質素分解酵素系統中，以漆氧化酵素(Laccases,Lac)、木質素過氧化酵素(Lignin peroxidases,LiP)、和錳離子過氧化酵素(Manganese peroxidases,MnP)為最主要的酵素。其特點在於受質專一性低，可對芳香類化合物做非專一性鍵結攻擊，進而達到分解難分解之有機毒化物，且能將有機毒化物完全礦化成二氧化碳和水，並降解環境中之諸如多環芳香族碳氫化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)、二氯二苯基三氯乙烷(4,4-dichlorodiphenyl trichloroethane,DDT)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)及氯酚(Chlororphenol)等毒化物(Schultz等人，2001，Applied and Environmental Microbiology 67 :4377-4381.)；Lee等人，2004，Enzyme Microbiology Technology 35 :417-423.)；Couto與Sanromn，2005，Biochemical Engineering Journal 22 ：211-219)。

白腐真菌產生之木質素分解酵素的來源有，固態、液態培養及利用栽培後基質，P. eryngii BCRC 36213在固態培養下的漆氧化酵素產量較液態培養高，而固態培養中的最適溫度為30℃~38℃培養，pH值為5~7(張臆民，2011，東吳大學微生物系碩士論文)。Rttimann等人(1994,Applied and Environmental Microbiology 60:599-605.)指出在培養環境中加入適當濃度的錳離子，可以促進Pleurotus eryngii 產生木質素分解酵素，以增加酵素產量。

固定化是指以物理或化學方法用人工方式，將生物觸媒的移動性限制在固定化基質中的方法，生物觸媒也就是酵素以及細胞，包含增殖細胞、動植物細胞等。而固定化後的生物觸媒仍然保有其生物活性，可以減少操作程序中的耗損，提高績效。目前最常使用的酵素固定化方法有載體結合法(carrier-binding method)、包埋法(entrapment method)、交聯法(cross-linking method)等三種，而其中最被廣泛使用的是包埋法。

包埋法又分為微膠囊型以及平面的格子型，其中以利用微包埋產生之微膠囊的應用性最廣。現已知的微膠囊主要多利用在控制藥物釋放，或用來包覆益生菌的保護其不受胃酸或膽鹼危害。利用其半透膜系統可選擇性的通透物質，僅讓生長所需之小分子可自由進出，以保護細胞免受如抗體等大分子的破壞(Karel等人，1985，Chemical Engineering Science .40 ：1321-1354)。而單純包埋在食品微生物及水產也廣泛被使用，例如王等人(1994，中國水產科學研究院黃海水產研究所)利用1.5%褐藻酸羧甲基纖維素包埋貝類的肉，並冷凍保存使其口感及色澤不會變差。在環境上也有人使用包埋去除dinirobutyl phenol(DNBP)(Wang等人，2009，Journal of Hazardous Materials 169 ,448-453)。

進行細胞及酵素包埋固定化的材料有許多種，其中對細菌、細胞不會產生傷害的為褐藻酸鈣包埋法。褐藻酸(alginic acid)是一種由褐藻(brown algae)中所萃取出來的多醣類共聚合物，由單醣醛酸以線性聚合而成的多醣，其單體為β-D-甘露醛酸(β-D-mannuronate,M)和α-L-古羅糖醛酸(α-L-guluronate,G)M和G兩個單體透過1,4-糖苷鍵相連成為M-M，G-G或M-G的組合而成多醣共聚物。

褐藻酸在室溫下可溶於水或鹼性溶液，形成有彈性、韌性之黏稠溶液，可與多種二價陽離子型交聯反應形成膠體。而根據不同二價陽離子有不同的親和力，以致彼等經交聯反應產生之膠囊或微膠囊的機械強度也不同。而機械強度也就是，載體可忍受可能作用於酵素或菌體之壓力或剪力(shear forces)。而在二價陽離子中最常被使用的為氯化鈣水溶液，因為其對生物的危害較小，包埋的方法亦較溫和。

包埋後顆粒越小則應用範圍越廣，但是微膠囊多應用於醫療及食品或細胞培養方面，例如Lim等人(1980，Science 210: 908-910)曾以微膠囊包覆小白鼠之胰島組織，並將其用來治療糖尿病。而固定化微生物應用在生物復育或環境解毒方面，大多是使用單純包埋的方式。例如，Kim等人(2010，Water Science & Technology 62: 1991-1997)藉由將Pseudomonas putida 及Bacillus spp.包埋於PEG聚合物中，以提升該等微生物對三氯乙烯(TCE)之去除效率。Ha等人(2009，Bioresource Technology 100 :1138-1142)曾利用Ca-藻酸鹽來固定化具分解能力之細胞，製成內含固定化細胞之珠粒(beads)，測試其對於有機磷酸殺蟲劑coumaphos及其有毒水解產物chlorferon與DETP的分解能力，其研究結果顯示，將具分解能力之菌株包埋後，在去除有機污染物之初期，可有效提升對有機毒化物之去除效果。Karamalidis等人(2010，Bioresource Technology 101 ：6545-6552)曾以褐藻酸/澱粉與鈣之交聯產物包埋具有石油分解能力的Pseudomonas aeruginosa strain Spet菌株，由其結果暗示，面對養分貧瘠並且受複雜含有生物急毒性的有機毒化物的廠址，可以利用包埋的方式提高分解效率。然而，以上皆未提及利用微膠囊包埋具有機毒化物分解能力之物質。

而於本發明之較佳具體實例，已藉由實驗結果建立褐藻酸微包埋酵素及菌株之最佳條件，測試利用微包埋技術所製成包含栽培後基質、固態培養生產之木質素分解酵素及具分解能力之菌株的微膠囊，對污泥中有機毒化物，包括壬基酚、雙酚A、雙酚F、四溴雙酚A、二溴二苯醚與四環素類抗生素的去除效果，以及以小球藻觀察不同毒化物代謝產物對生物之毒性；並且在小型生物反應器中，進一步分析本發明之微膠囊對於有機毒化物之去除效效果，進而完成本發明。

因此，於一方面，本發明係提供一種用於去除污泥中有機毒化物之微膠囊，其特徵在於包含經微包埋於天然高分子與鈣交聯之產物中的具有機毒化物分解能力之物質。於本發明之具體實施例，該微膠囊粒徑大小較佳地為不大於1000 μm，更佳地係介於500 μm至800 μm之間。

於本發明之具體實施例，前述之與鈣交聯之天然高分子材料可選自褐藻酸、果膠及任何可與鈣進行交聯反應之高分子材料。於本發明之一項具體實施例，該與鈣交聯之天然高分子材料係褐藻酸或果膠。

於本發明之一項具體實施例，前述之微膠囊所包含之具有機毒化物分解能力之物質為木質素分解酵素。於一項具體實施例，該木質素分解酵素係萃取自白腐真菌之栽培後基質，或白腐真菌之固態培養物。

於本發明之另一項具體實施例，前述之微膠囊所包含之具有機毒化物分解能力之物質為具分解能力之菌株。於另一項具體實施例，該具分解能力之菌株係選自煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae )、蘇力桿菌(Bacillus thuringiensis )、圓形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus )，或其經馴化之混合菌株。

於另一方面，本發明係提供一種製備前述之微膠囊的方法，其包含：將具有機毒化物分解能力之物質的溶液與可與鈣進行交聯反應之高分子材料溶液均勻混合；將該所成之混合物以電噴霧擠壓注射器注入氯化鈣水溶液中，進行陽離子交聯反應；及以濾網收集交聯反應後之固體化微膠囊產物等步驟。

於本發明之具體實施例，前述方法中以電噴霧擠壓注射之步驟所使用之電壓較佳為5-30 kV，且更佳為10-20 kV。於本發明之其他具體實施例，前述方法中以電噴霧擠壓注射之步驟係使該混合物較佳地以每小時5-40 ml(更佳地，以每小時15-30 ml)之流速噴入該氯化鈣水溶液。

於本發明之一項較佳具體實施例，本發明之微膠囊係藉由將具有機毒化物分解能力之物質的溶液，與褐藻酸水溶液均勻混合；以針頭吸取該所成之混合物，並以電壓為10-15 kV之電噴霧擠壓注射器，使該混合物以每小時20-30 ml之流速噴入氯化鈣水溶液，進行陽離子交聯反應；及以濾網收集交聯反應後之固體化微膠囊產物而製備得。

於本發明之具體實施例，前述方法可進一步包含將所得之固體化微膠囊產物冷凍乾燥的步驟。

於另一方面，本發明提供一種用於去除污泥中有機毒化物之組成物，其包含至少一種經本發明方法製得之微膠囊，及一種賦形劑或載劑。

在本發明所使用的特殊術語有其原本的意義，如下所用的某些特殊術語是提供熟悉該技藝者能更進一步了解本發明內容。為了方便起見一些特殊術語將會使用斜體字或引號標示出來，但這些被標示出來的部分並不會影響到特殊術語本身的範圍或意義。除非另有規定，本發明所涉及的科學和技術所用詞彙和一般普通技能所使用的詞彙為相同的，若是有所衝突的情況下，本發明將會給予名詞新的定義。

本發明所使用的“天然高分子材料”意指可與鈣交聯之天然高分子材料，其包括(例如)褐藻酸、果膠及任何可與鈣進行交聯反應之高分子材料。

本發明所使用的“污泥中有機毒化物”意指污泥中可能含有之有機毒化物，包括壬基酚(NP)、雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、四溴雙酚A(TBBPA)、二溴二苯醚及四環素類抗生素(TC)等。

本發明所使用的“具有機毒化物分解能力之物質”意指能夠分解有機毒化物的生物觸媒，包括酵素以及細胞等，而較佳用於本發明之具有機毒化物分解能力之物質包括(例如)木質素分解酵素及具有機毒化物分解能力之微生物。

於本發明之具體實例，所述之木質素分解酵素可萃取自白腐真菌之栽培後基質，或白腐真菌經固態培養生產之培養物。於本發明之其他具體實例，所述之具有機毒化物分解能力之微生物可為(但不限定於)，本案發明人實驗室分離自桃園中油煉油廠活性污泥之菌株，可選自煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae )簡稱CT1菌株、蘇力桿菌(Bacillus thuringiensis )簡稱CT2菌株及圓形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus )簡稱為CT7菌株。

實施例

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例一：以微包埋技術製備用於去除污泥中有機毒化物之微膠囊

於本實施例已測試不同褐藻酸濃度在不同電壓及注射流速下之微包埋之包覆情形，發現使用濃度為2-4%之褐藻酸溶液，以每小時20-30 ml之注射流速，通以10-15 kV電壓，以電噴灑方式噴入氯化鈣水溶液為最佳條件。

(1)　木質素分解酵素微膠囊

木質素分解酵素來源：栽培後基質取自台中百菇莊菇類培養農場之杏鮑菇栽培後基質，其中成分為木屑、米糠、麥糠。戴養蕈農場之金針菇、白玉菇、鴻喜菇及巴西蘑菇之栽培後基質其中成分為木屑、米糠、麥糠。固態培養所使用之菌株購買自新竹食品工業發展研究所生物資源中心，側耳屬菌株Pleurotus eryngii BCRC 36213，接種於PDA平板培養基(potato dextrose agar plat)上，於30℃下恆溫培養30天。木質素分解酵素之製備： 以固態培養或栽培後基質之粗萃液進行鹽析，緩慢地加入事先烘乾並磨細的硫酸銨，利用硫酸銨與水分子的作用力大於水分子與蛋白質的作用力，使蛋白質的水合程度降低，使蛋白質沉降出來。25℃下飽和度先加硫酸銨到50%的飽和度，以防局部硫酸銨濃度過高造成蛋白質沉澱，一邊緩慢加入並攪拌。蛋白質會在不同的飽和度沉降出來，若有混濁或沉澱表示蛋白質析出，將混合液離心取沉澱物(Beckman JA-18，8000 rpm，4℃，15分鐘)，上清液繼續加入硫酸銨至100%的飽和度，將此培養液分裝於離心管中，取沉澱物。鹽析後的產物須將鹽分去除，需進行透析步驟。將沉澱物以乾淨的刮勺移入透析膜，透析膜內避免有空氣，接著將其浸泡於0.01 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中，於4℃下加以緩慢攪拌進行透析，透析2小時後，置換新的緩衝液再進行第二次長時間整夜透析。透析結束後，收集樣品蛋白質，即為木質素分解酵素，將樣品置於-20℃冷凍庫中保存。含木質素分解酵素微膠囊之製備： 於4%褐藻酸水溶液，分別加入栽培後基質粗萃液、固態培養粗萃液、經純化之栽培後基質木質素分解酵素及經純化之固態培養之木質素分解酵素的溶液，以1:1方式，於4℃下均勻混合12小時，並以針頭吸取，以電噴霧擠壓注射器，以15 kV電壓、每小時25.2 ml流速噴入1.5%之氯化鈣水溶液，以濾網收集交聯反應後之固體化產物，以倒立式顯微鏡確定包埋後之產物大小及活性，並在三天內使用。圖1(A)為所製備之木質素分解酵素微膠囊，在顯微鏡下放大40倍的外觀型態。酵素釋放率： 於125 ml血清瓶中，加入40 ml滅菌後去離子水與10 g包埋後產物，每兩天取20 μl混合溶液，並測量其中木質素分解酵素之活性。在第0小時到第1天，酵素活性開始有明顯的提升，但到第2天有短暫的平緩，到第6天酵素活性又快速的升高，在第10天趨於平緩不再上升(參見圖2)。

(2)　菌株微膠囊

菌株來源： 用於本實例之具有降解能力之菌株，包括本案發明人實驗室分離自桃園中油煉油廠活性污泥之菌株，煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae )簡稱CT1菌株、蘇力桿菌(Baciｌｌus thuringiensis )簡稱CT2菌株；及具有不同有機毒化物去除能力之菌株：具有分解壬基酚之能力的圓形芽孢桿菌(Baciｌｌus sphaericus )簡稱為CT7菌株(Chang，2005，Chemosphere. 60 : 1652-1659)、具有分解雙酚A及雙酚F之能力的L2菌株，由本案發明人實驗室分離自淡水河底泥、具有分解四溴雙酚A及二溴二苯醚之能力的假單孢菌屬(Pseudomonas sp.)之菌株，分離自二仁溪底泥簡稱為W4菌株。菌株微膠囊之製備： 菌株進行包埋前先將菌株接種於TSB培養基內，待菌增殖至O.D.₆₀₀ =0.6後，將菌液與4%褐藻酸水溶液以1:1方式，於4℃混合12小時，並以23g針頭吸取，以電噴霧擠壓注射器，以10 kV、每小時25.2 ml流速噴入1.5%之氯化鈣水溶液，以濾網收集交聯反應後固體化之產物，以倒立式顯微鏡確定包埋後之產物大小，並以50 mM檸檬酸打破膠囊並測其菌數，並保存於4℃備用。圖1(B)為菌株CT7經褐藻酸鈣微包埋後，以顯微鏡放大40倍之微膠囊外觀型態。

實施例二：微膠囊對於污泥中有機毒化物之去除效果

壬基酚之去除測試方法： 於125 ml血清瓶中加入35 ml無菌好氧基礎培養基與5 ml污泥，加入壬基酚使其最終濃度為2 mg/l，並添加含CT7菌株之微膠囊。以透氣塞封住瓶口，在30℃下以120 rpm震盪培養，使壬基酚能均勻散佈於好氧基礎培養基中，經由萃取後以GC-MS偵測壬基酚之殘留量。其他毒化物之去除測試方法： 於125 ml血清瓶中加入40 ml無菌好氧基礎培養基與5 ml活性污泥後，加入5 ml最佳去除效率之包埋菌株及5 ml最佳去除效率之包埋酵素，分別加入四溴雙酚A、雙酚A、雙酚F、二溴二苯醚及四環素類抗生素，分別使其最終濃度為2 μg/l，以透氣塞封住瓶口，在30℃下以120 rpm震盪培養，於不同時間取樣，偵測各種有機毒化物之殘留量。

木質素分解酵素微膠囊

從圖3(A)之結果可以看出，純化自栽培後基質及固態培養之木質素分解酵素經過微包埋後對20 mg/l壬基酚之去除效果，在第6小時含栽培後基質木質素分解酵素之微膠囊去除43%的壬基酚，含固態培養之木質素分解酵素之微膠囊去除62%。而所有添加酵素的處理組都在第24小時內去除完畢。由圖3(A)也可以觀察到，含固態培養之木質素分解酵素之微膠囊，去除效果較含栽培後基質木質素分解酵素之微包埋微膠囊好。

而從圖4(A)可以發現，木質素分解酵素之微膠囊對有機毒化物的去除效率，在第3小時，雙酚A已被去除97.18%，而雙酚F已被100%完全去除完畢，但四溴雙酚A只有減少34.02%，而四環素類抗生素中的羥四環黴素及四環黴素分別去除了56.25%及54.22%，而同樣在第3小時，氯四環黴素已被去除81.12%，但四溴雙酚A之濃度並沒有顯著的減少。在第2天氯四環黴素已被去除完畢，而其他四素環素類抗生素，羥四環黴素及四環黴素仍有8.98%及9.62%的殘留，二者在第4天才被去除完畢。而二溴二苯醚在第2天仍有57.21%殘留，直到第5天才被去除完畢。而四溴雙酚A在第8天有15.89%的殘留量。

菌株微膠囊

圖3(B)之結果顯示，直接添加菌株之菌液的實驗組，在第3小時到第2天有延遲的現象發生，直到第3天才開始有明顯的去除效果，在第2天減少了34%，第4天殘留19%，最後在第5天去除完畢。但經過微包埋後之菌株，在第9小時汙泥中的壬基酚就有微量的減少，在第一天有明顯的73%減少，並且持續減少至第4天即完全降解完畢。效果比直接添加菌株菌液之實驗組快了1天。

從圖4(B)可顯示，具有分解能力之菌株微膠囊對不同有機毒化物的去除效率，在第9小時，雙酚A已被去除91.33%，而雙酚F已被100%完全去除完畢，而在第1天，四環素類抗生素中的羥四環黴素及四環黴素，分別被去除了51.45%及51.79%，而在4天兩者皆被去除完畢。雖然，氯四環黴素在第1天已被去除63.17%，第4天仍然殘留16.31%未被去除。而四溴雙酚A在第3天只被去除了38.52%，到第6天仍然有28.34%四溴雙酚A未被菌株分解。二溴二苯醚去除效果不同於添加酵素微膠囊，添加菌株微膠囊之處理組從第2天開始二溴二苯醚之濃度就有逐漸的減少，在第12天即去除完畢。

由上述結果可知，以褐藻酸鈣包埋後，具分解能力之菌株有明顯的提升效果，可能是因為包埋後之具分解能力之菌株，不需要與污泥中微生物競爭養分、生存空間等，故可發揮其應有之對有機毒化物之去除效果，而且包埋後菌株能有效的提升菌株對環境壓力之抗性，進而提升去除毒化物之效果。而微包埋的去除效率又比包埋之去除效率高，此乃因為微包埋之表面積增大，故去除效率比單純使用包埋法之去除效率高，上述數據亦證明，用本發明方法微包埋之菌株，對有機毒化物具有持續的去除效果。

綜合上述，利用微包埋技術包埋木質素分解酵素並無促進其去除效率，但可延長對有機毒化物之去除時間，因此雖然不能達到重複使用的目的，但可延長處理時間。而以微包埋技術包埋具有去除能力之菌株，可增加其對環境之抗性及競爭力，進而發揮其良好之去除能力。故在利用微生物去除有機毒化物時，可利用微膠囊包埋菌株，以增加其去除效率。而添加木質素分解酵素與具分解能力之菌株，兩者皆有優缺，因此在處理有機毒化物時，可同時添加木質素分解酵素微膠囊及具分解能力之菌株微膠囊以增加去除效率。

生物毒性試驗

利用小球藻做生物毒性之分析，首先將小球藻培養在基礎培養基，將其培養至生長速率大於0.03/hr時，取1 ml小球藻震盪培養48 hr並以分光光度計測定其葉綠素含量，依此數值做為Blank；取0.5ml小球藻並加入0.5ml待測水樣培養24hr，測量其葉綠素之含量。小球藻生存率百分比(%)=加入待測水樣培養48 hr之葉綠素含量/小球藻培養48 hr產生之葉綠素含量×100%。結果列示於下表1。

從表1之結果顯示，不同毒化物在去除前對小球藻的生長都是有抑制的，壬基酚在去除前小球藻之生存率為54%，雙酚A、雙酚F及四環素類抗生素去除前之小球藻存活率分別為20%、13%及14%，四溴雙酚A在去除前小球藻之存活率為51%，而二溴二苯醚在去除前小球藻之存活率為41%。

表1亦列示，不同毒化物經過菌株微膠囊處理三天後對小球藻的存活率的影響。於壬基酚去除後，小球藻之生存率提升了2%，達到約為56%；而雙酚A及雙酚F去除後，小球藻之生存率則是分別提升了3%及18%；於四溴雙酚A及二溴二苯醚去除後，小球藻之生存率分別提升了7%、9%。在四環素類抗生素組，於菌株微膠囊處理後小球藻之生存率提升最多，為57%。

又，在酵素微膠囊處理三天後，各毒化物對小球藻影響之改善較為明顯，壬基酚之生存率提升7%，雙酚A及雙酚F提升31%~32%，四環素類抗生素僅提升了16%比菌株處理的效果差，而二溴二苯醚及四溴雙酚A組經酵素微膠囊處理後，小球藻之生存率分別提升了14%及15%。

綜合以上的生物毒性試驗結果顯示，本發明之菌株微膠囊及酵素微膠囊可藉由清除有機毒化物，而有效提高環境指標微生物的存活率，有助於生物復育。

實施例三：以小型生物反應器測試微膠囊之有機毒化物去除率

本實驗中所使用之小型生物反應器，包括反應槽、加熱恆溫循環水槽、攪拌器。使用量筒取180 ml迪化污水處理廠之曝氣池污泥於小型生物反應器中。溫度控制在30℃，小型生物反應器攪拌速度為500 rpm。反應槽有編號1~6共六組，每一組並且加入20 mg/l壬基酚與20 mg/l四環素類抗生素，並且加入20 ml最佳去除效率之酵素及菌株微膠囊，並每隔一段時間從反應槽中取樣，測定毒化物殘留量。

從圖5之結果可以發現，在含有20 mg/l壬基酚之污泥中，未添加微膠囊之處理組也有緩慢的去除效果，而添加菌株微膠囊之處理組則有促進其去除的效果。但以添加酵素微膠囊之去除效果最佳，第1天就將壬基酚去除完畢，故在第3天再次添加20 mg/l壬基酚，同樣在第4天即去除完畢。而菌株微膠囊在第一天可去除76%壬基酚，而未添加微膠囊之處理組則仍有61%壬基酚殘留，相當於12.2 mg/l壬基酚殘留。在第3天二次添加20 mg/l壬基酚3小時後，未添加微膠囊之對照組中，壬基酚的殘留含量高達31.12 mg/l，去除效果明顯較第一次緩慢許多；而添加菌株微膠囊及酵素微膠囊之處理組，經二次添加20 mg/l壬基酚後，其殘餘量分別為20.48 mg/l及15.5 mg/l，且酵素微膠囊在第2次添加後，仍然為一天內去除完畢，效果不受反應時間的影響。而添加菌株微膠囊之處理組，在第8天可將壬基酚完全去除完畢，相較於未添加任何微膠囊之對照組，其仍有71%的壬基酚殘留。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

圖1顯示固態培養產生之木質素分解酵素微膠囊(A)及菌株CT7微膠囊(B)在倒立式顯微鏡放大40倍之外觀型態。

圖2顯示含木質素分解酵素微膠囊之酵素累積釋放率。

圖3顯示含固態培養之木質素分解酵素及含栽培後基質木質素分解酵素微膠囊(A)，菌液及菌株微膠囊(B)對壬基酚之去除效率。

圖4顯示木質素分解酵素微膠囊(A)及菌株微膠囊(B)對不同有機毒化物之去除效果。

圖5為壬基酚在小型生物反應器下之殘留量與作用時間關係圖。

Claims (16)

1. 一種用於去除污泥中有機毒化物之微膠囊，其特徵在於其包含不經二氧化矽固定而包埋於天然高分子材料與鈣交聯產物中之具有機毒化物分解能力之物質，該微膠囊之粒徑係介於500μm至800μm之間。
2. 如申請專利範圍第1項所述之微膠囊，其中該天然高分子材料係選自褐藻酸、果膠及可與鈣進行交聯反應之高分子材料。
3. 如申請專利範圍第1項所述之微膠囊，其中該具有機毒化物分解能力之物質為木質素分解酵素。
4. 如申請專利範圍第3項所述之微膠囊，其中該木質素分解酵素係萃取自白腐真菌之栽培後基質。
5. 如申請專利範圍第3項所述之微膠囊，其中該木質素分解酵素係萃取自白腐真菌經固態培養生產之培養物。
6. 如申請專利範圍第1項所述之微膠囊，其中該具有機毒化物分解能力之物質為具分解能力之菌株。
7. 如申請專利範圍第6項所述之微膠囊，其中該具分解能力之菌株係選自煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae )、蘇力桿菌(Bacillus thuringiensis )、圓形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus )、具有分解雙酚A及雙酚F之能力之菌株、及具有分解四溴雙酚A及二溴二苯醚之能力的假單孢菌屬(Pseudomonas sp.)之菌株，或其他經馴化具毒化物分解能力之菌株。
8. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之微膠囊的方法，其包含：(a)將具有機毒化物分解能力之物質的溶液與可與鈣進行交聯反應之高分子材料的溶液以1：1方式均勻混合；(b)將該所成之混合物以電壓設為5-30kV之電噴霧擠壓注 射器注入氯化鈣水溶液，進行陽離子交聯反應；以及(c)以濾網收集交聯反應後之固體化微膠囊產物。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該可與鈣進行交聯反應之高分子材料為褐藻酸或果膠。
10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該步驟(b)之電噴霧所使用之電壓為10-20kV。
11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該步驟(b)之電噴霧所使用之電壓為10-15kV。
12. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該步驟(b)之電噴霧係使該混合物以每小時5-40ml之流速噴入該氯化鈣水溶液。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該步驟(b)之電噴霧係使該混合物以每小時15-30ml之流速噴入該氯化鈣水溶液。
14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中，該步驟(b)之電噴霧係使該混合物以每小時20-30ml之流速噴入該氯化鈣水溶液。
15. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其進一步包含將所得之固體化微膠囊產物冷凍乾燥的步驟。
16. 一種用於去除污泥中有機毒化物之組成物，其包含至少一種根據申請專利範圍第1項所述之微膠囊及一種賦形劑或載劑。