TWI415940B - 超順磁氧化物與聚乙烯二胺複合式磁性錯合物的奈米粒子作為基因轉染載體 - Google Patents

超順磁氧化物與聚乙烯二胺複合式磁性錯合物的奈米粒子作為基因轉染載體 Download PDF

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Description

超順磁氧化物與聚乙烯二胺複合式磁性錯合物的奈米粒子作為基因轉染載體
本案係關於一種奈米粒子，尤其，係關於一種超順磁氧化物與聚乙烯二胺複合式磁性錯合物的奈米粒子，其可將攜帶之遺傳物質轉染至細胞內，可應用於臨床醫學。
轉染(transfection)或轉形(transformation)係將遺傳物質送入細胞或生物體的技術，例如：施加電場於質體DNA，而將質體DNA送入細胞內表現；混合帶正電的微脂粒與帶負電的DNA形成複合體，藉由複合體與細胞膜融合或經胞飲作用而將DNA送至細胞質。
美國專利號US 6,846,809公開一種運送DNA的載體，其係將核酸與聚陽離子混合以形成液態轉染組合物，該液態轉染組合物直接與癌細胞或具有癌細胞的組織接觸，以將核酸送入癌細胞而抑制癌細胞生長。然而，由於沒有外在電場或磁場施加於液態轉染組合物，轉染效率並不高。
近年來，另發展出磁性轉染技術，其係結合DNA、小干擾RNA等遺傳物質及磁性奈米粒子而藉由施加磁場運送遺傳物質。例如，美國專利公開號US 2008/0075701公開一種磁性轉染之組合物，其係以親水性載體(微脂粒)封裝磁性奈米粒子及遺傳物質，形成球狀載具。首先，磁性奈米粒子先被表面活性劑(有機酸)包覆，再以超音波震盪去除表面活性劑，磁性奈米粒子再封裝於微脂粒內，而表面活性劑並未被封裝於微脂粒內。之後，將遺傳物質加至含有微脂粒封裝之磁性奈米粒子的溶液，遺傳物質通過微脂粒之脂雙層結構進入微脂粒，形成最終的球形載具。然而，該發明的磁性奈米粒子處理步驟過於繁複，且遺傳物質需通過脂雙層結構才被微脂粒包覆，此也將降低微脂粒同時包裹磁性奈米粒子及遺傳物質的機率。
以氧化鐵奈米粒子為基礎的磁性奈米粒子與基因載體共同被攝入細胞中，磁性奈米粒子在約一個月的期間內在生理條件下由於鐵蛋白的合成而分解(Briley-Saebo et al.,2004)。由於被攝入的氧化鐵奈米粒子經生物轉化，使用磁性奈米粒子作為藥物運送系統將不具安全性憂慮。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案發明，且能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了克服先前技術的磁性奈米粒子安全性問題，本發明所製備的磁性奈米粒子為高水分散性且可長期保存，並具有超順磁特性、低細胞毒性、高穩定度及良好的轉染效率，可取代聚乙烯二胺，成為非病毒性的基因載體。
本發明提供一種製備奈米粒子的方法，包括步驟：混合聚乙烯二胺以及聚丙烯酸鍵結的氧化鐵，以獲得一聚合物；以及混合該聚合物與遺傳物質，形成奈米粒子。本發明的製備方法僅需在一反應容器內進行，無須另行移轉至其他容器內進行反應，減少中間產物及中產物之流失。
本發明另提供一種由前述製備方法所獲得的奈米粒子，其包括：聚合物，包括聚乙烯二胺及被聚乙烯二胺包圍之聚丙烯酸鍵結的四氧化三鐵；以及遺傳物質，經由電荷性地耦合於聚乙烯二胺。
本發明另提供一種奈米粒子，其包括：聚合物，包括帶正電分子及被該帶正電分子圍繞之金屬粒子；以及遺傳物質，電耦合於正電分子。
帶正電分子包括但不限於聚乙烯二胺，金屬粒子為水溶性，且包括但不限於金奈米粒子、銀奈米粒子及鐵奈米粒子，遺傳物質可為DNA、RNA、互補DNA或小干擾RNA。
本案所提出之「超順磁氧化物與聚乙烯二胺複合式磁性錯合物的奈米粒子作為基因轉染載體」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
本發明的磁性奈米粒子包括聚合物及遺傳物質，聚合物進一步包括金屬粒子及帶正電分子，而遺傳物質包括但不限於DNA、RNA、互補DNA、小干擾RNA等核酸分子。金屬粒子上可鍵結酸分子，而遺傳物質電耦合於帶正電分子。
請參閱第1圖，為本發明PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子之示意圖。PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子包括氧化鐵1、聚乙烯二胺2(簡稱PEI)及質體DNA3，氧化鐵1上還鍵結聚丙烯酸4，該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵1(簡稱PAAIO)係藉由一步反應合成四氧化三鐵，同時四氧化三鐵的表面裹覆聚丙烯酸而獲得。帶負電之質體DNA 3電耦合於帶正電之聚乙烯二胺2形成PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子。PEI及PAAIO所形成的PEI-PAAIO奈米粒子(或稱為聚錯合物)可作為非病毒性的基因載體。作為PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子核心的金屬粒子為水溶性，且包括但不限於金奈米粒子、銀奈米粒子及鐵奈米粒子。
實驗部份 1.主要試劑：
氯化鐵(FeCl3 )及聚丙烯酸(poly(acrylic acid),PAA,Mw 2,000 g/mol)獲自TCI(Tokyo,Japan)。聚乙烯二胺(polyethylenimine,PEI,branched,Mw 25,000 g/mol)獲自Polyscience(Warrington,PA,USA)。六氰亞鐵酸鉀(potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate)購自Showa(Tokyo,Japan)。報導基因pEGFP-C1購自Clontech(Palo Alto,CA,USA)，而pGL3-control及其螢光素酶試驗套組及報導溶解緩衝液購自Promega(Madison,WI,USA)。前述的質體DNA(pDNA)─pEGFP-C1及pGL3-control─由勝任型大腸桿菌DH5α(GibcoBRL,Gaitherbury,MD,USA)增殖，且以Viogene大量質體套組(Viogene,Sunnyvale,CA,USA)純化。
2.合成PAAIO及PEI包覆之PAAIO奈米粒子(PEI-PAAIO)：
PAAIO係根據中華民國專利申請號098134199之記載完成，其係將一步反應四氧化三鐵同時裹覆聚丙烯酸而成。將PEI混合於PAAIO製備出PEI包覆之PAAIO奈米粒子(PEI-PAAIO)。以PEI:PAAIO重量比1:1或1:2製備之總體積15 mL的PEI-PAAIO用於量測粒子尺寸及zeta電位。以超音波振盪PEI-PAAIO奈米粒子5分鐘，再以永久磁鐵(6000高斯(G)的銣鐵硼磁鐵)靠近試管以移去未鍵結之PEI，且小心地移除上清液。將受磁力吸引的PEI-PAAIO奈米粒子再懸浮於15 mL去離子水，並以6000 rpm離心5分鐘，且將上清液與先前移除的上清液混合，以測定未鍵結之PEI濃度。將沈澱物再懸浮於15 mL去離子水，作為後續實驗的原液。
3.PEI-PAAIO奈米粒子之特性：
PEI是否成功地包覆於PAAIO表面由傅立葉轉換紅外線(FTIR)光譜加以確認。以Perkin-Elmer system 2000光譜儀進行FTIR光譜。將乾燥樣本與溴化鉀粉末進行研磨且壓成適用於FTIR試驗的小粒(pellet)。以4 cm-1 解析度從4000至400 cm-1 範圍進行64次平均訊號之掃瞄。而化學分析電子顯微鏡(ESCA)測量則使用ST PHI 5000 Versa Probe(Sliedrecht,Netherlands)光譜儀及單色鋁(monochromated Al Kα) X光光源。使用原子靈敏度因子並由波峰區域記算每一元素在樣本表面的相對原子濃度。以0至800電子伏特(eV)的束縛能、用於寬掃瞄測量的100 eV通過能量及用於N1s 區域的高能解析光譜的20 eV通過能量來記錄光譜。使用Quantum Design公司的磁性測量系統(MPMS,MPMS-XL 7)以測量磁性，其使用超導量子干擾磁量儀(SQUID)在25℃、-15至15 K Oe的磁場範圍測量磁場。
4.PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子之製備及特性：
由於磁性奈米粒子(或稱磁性錯合物)中的質體DNA濃度為固定，因此控制PEI-PAAIO濃度來調整非病毒性的基因載體(即PEI-PAAIO奈米粒子)與質體DNA間的比例(N/P比值)。相同體積的PEI-PAAIO奈米粒子及質體DNA溶液以1至30的N/P比值混合，並立即以高速振盪。PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子在分析前先置於室溫30分鐘以進行完全錯合。
DNA之結合：奈米粒子對DNA的結合能力以洋菜膠體電泳加以評估。以前述方法及不同N/P比值製備出磁性奈米粒子，在有或無10%胎牛血清(FBS)的條件下混合0.5小時或4小時後，以0.8%洋菜膠體電泳測定磁性奈米粒子的穩定度。
動態光散射(DLS)及zeta電位：使用Zetasizer Nano ZS instrument(Marlvern,Worcestershire,UK)及雷射都卜勒流速計測量PAAIO、PEI-PAAIO及PEI-PAAIO/pDNA的平均流體直徑及zeta電位。動態光散射係以633 nm雷射及90度散射角進行測量。樣本濃度為0.1 mg/mL且溫度維持於25℃。以保麗龍奈米球(220±6 nm及-50 mV；Duke Scientific,USA)驗證儀器的性能。每一樣本的粒子尺寸及zeta電位進行三重複實驗。
穿透式電子顯微鏡(TEM)技術：磁性奈米粒子的尺寸及外觀以cryo-TEM(Jeol JEM-1200,Tokyo,Japan)觀察。以碳蒸鍍的銅網(200 mesh,Agar Scientific Ltd. Essex,UK)輝光放電1.5分鐘，將一滴樣本溶液置於銅網上並於室溫風乾，再以電子顯微鏡觀察。
5.細胞毒殺作用試驗：
將HEK 293T(人類胚胎腎293T細胞株)細胞以1×105 cells/well之密度種入12孔培養盤的孔洞並培養24小時。在將細胞及PEI-PAAIO奈米粒子(或PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子)培養於無FBS之DMEM培養液4小時後，再培養於含10% FBS之DMEM培養液72小時，藉由測定細胞存活率來評估PEI-PAAIO奈米粒子的細胞毒殺作用。此外，在4小時培養期間內，可在細胞下方置放銣鐵硼圓盤狀磁鐵，並施加平均3000高斯的靜磁場來測定經奈米粒子或磁性奈米粒子處理的細胞之細胞毒殺作用。以MTT呈色法估計活細胞的粒腺體還原酶活性而測定出活細胞數目。
6.轉染效率：
將HEK 293T細胞以1×105 cells/well之密度種入12孔盤並培養於添加10% FBS的DMEM培養液24小時。當細胞長至50～70%聚滿程度時，更換為添加或不添加10% FBS的1 mL DMEM培養液。此外，準備4 μg pEGFP-C1(控制組)以及PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子，在有或無施加靜磁場的條件下將pEGFP-C1或磁性奈米粒子與細胞共同培養4小時後，更換新鮮培養液，再培養細胞72小時。在螢光顯微鏡下直接觀察綠螢光蛋白表現，以分析轉染效率。
至於螢光素酶試驗，步驟如上所述，比較磁性奈米粒子、單獨的DNA(作為負控制組)及N/P值為10的PEI/pDNA聚複合物(作為正控制組)對HEK 293T細胞及U87細胞(人類神經膠母細胞瘤細胞株)的轉染效率。為了定量螢光素酶的表現，以1 mL的0.1 M PBS溫和地潤濕經轉染的細胞兩次，再加入200 μL/well的裂解緩衝液(0.1 M Tris-HCl,2 mM EDTA,and 0.1% TritonX-100,pH 7.8)並於-20℃隔夜靜置。第二天，將細胞裂解產物(lysate)回溫至室溫，以高速離心30分鐘。混合上清液與螢光素酶試劑(Promega,Madison,WI,USA)後，使用TopCount NXTTM 盤式閃爍及冷光計數器(Perkin Elmer,NJ,USA)偵測螢光素酶活性。以Bicinchoninic acid(BCA)蛋白試劑套組(Pierce Rockford,IL,USA)測定細胞裂解產物的總蛋白量。
7.細胞吞噬作用：
此係以感應耦合電漿發射光譜分析儀(ICP-OES,Optima 7000DV,Perkin Elmer,Boston,MA,USA)定量細胞中PEI-PAAIO奈米粒子被攝入的鐵含量。以BCA蛋白試劑套組測定一半的細胞裂解產物之蛋白含量。將另一半的細胞裂解產物溶於37%鹽酸溶液並於70℃培養1小時，該樣本被稀釋至最終體積3 mL。以硝酸鐵Fe(NO3 )3 迴歸曲線計算樣本的鐵含量。
以普魯士藍(Prussian blue)對鐵染色而觀察HEK 293T細胞內被攝入的PEI-PAAIO奈米粒子。普魯士藍溶液係由混合10 mL之2%六氰亞鐵酸鉀溶液及5 mL之2%鹽酸而製得。當與亞鐵氰化離子(ferrocyanide ions)反應時，PAAIO中被攝入的鐵離子(Fe3+ )變成寶藍色色素。如同前述，在細胞與PEI-PAAIO奈米粒子培養4小時後，以0.1 M PBS清洗細胞三次，並以3.7%福馬林固定細胞10分鐘，再以PBS清洗細胞三次。加入1 mL/well的普魯士藍溶液，並與細胞培養30分鐘。在光學顯微鏡下觀察寶藍色色素。
8.統計方法：
由前述實驗結果計算出數據的平均、標準差、標準誤。實驗組及對照組之間的差異以Student’s-Newman-Keuls測試進行，P<0.05視為有顯著性差異。
結果部分 1.PEI-PAAIO奈米粒子之特性：
使用pH 2.0、6.8及11作為以不同PEI及PAAIO重量比形成穩定的PEI-PAAIO奈米粒子的最佳化條件，以PAAIO:PEI重量比1:1及2:1測定PEI-PAAIO的粒子尺寸及zeta電位。PAAIO的平均流體直徑為35 nm(第2圖(a))，且具有-25 mV的負zeta電位(第2圖(b))。請繼續參閱第2圖(b)，在pH 6.8時，兩種PEI-PAAIO奈米粒子顯示出相近的+22 mV zeta電位，但PEI-PAAIO奈米粒子(PEI:PAAIO=1:2)具有較小的粒子直徑。因此，以PEI-PAAIO奈米粒子(PEI:PAAIO=1:2)進行後續實驗。具有正zeta電位的奈米粒子表示PEI成功地修飾於PAAIO。請參閱第3圖(a)的FTIR光譜示意圖，PAAIO顯示出延伸於1568、1455及1406 cm-1 的3個特徵，而PEI顯示出延伸於1647、1576及1470 cm-1 的3個特徵。由於靜電交互作用，PEI-PAAIO奈米粒子的PEI初級胺延伸從1647 cm-1 偏移至1632 cm-1 ，而非對稱羧酸波峰從1568 cm-1 偏移至1562 cm-1 。再者，由於PEI包覆於PAAIO表面，PAAIO在1562 cm-1 的羧酸延伸的波峰強度降低，為PEI修飾於PAAIO的進一步證據。亦由ESCA加以測量，其在283、400及530 eV分別顯示C1s 、N1s 及O1s 原子的束縛能(第3圖(b)及(c))。在PAAIO無法偵測N的原子百分比，但在PEI-PAAIO奈米粒子測定為4.7%。PEI-PAAIO奈米粒子及PAAIO的飽和磁化量分別為76 emu/g Fe及103 emu/g Fe(第3圖(d))。當PEI包覆於PAAIO時，飽和磁化量降低。PEI-PAAIO奈米粒子在室溫仍維持超順磁特性並具有可忽略的磁滯現象。
PEI-PAAIO奈米粒子中的PEI濃度係使用紫外光-可見光光譜儀，在630 nm測量PEI和二價銅之間形成的銅胺複合物(Namgung et al.,2010)。由PEI校正曲線獲得PEI在PEI-PAAIO中的濃度為0.135±0.03 mg/mL。當PAAIO分子量為2232 g/mol及PEI分子量為25,000 g/mol時，PEI-PAAIO中的PEI莫耳百分比為1.37。以此數值計算PEI-PAAIO奈米粒子及pDNA之間的N/P比值。理論的PEI投入值為33 wt%。PEI的胺基官能基與聚丙烯酸(PAA)的羧酸官能基之間的理論莫耳分率大約為3:1。13.5 wt%的PEI可對應於胺基及羧基之間的1.25:1比值。
2.PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子之特性：
不同N/P比值的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子係藉由改變PEI-PAAIO奈米分子的含量及恆定pDNA含量為恆定值而加以製備。由洋菜膠體電泳遲滯試驗分析PEI-PAAIO奈米粒子與pDNA之間的結合能力。結果顯示，pDNA可在N/P比值高於5時充分包覆PEI-PAAIO奈米粒子。在N/P比值高於15時，pDNA充分被保護，避免PEI-PAAIO/pDNA被FBS分解。因此，可確定PEI-PAAIO中的pDNA不被血清分解並具有穩定度，並以4小時的培養時間進行後續的轉殖基因表現。
請參閱第4圖(a)，以DLS測定之PAAIO及PEI-PAAIO奈米粒子的粒子直徑分別約為30 nm及50 nm。N/P比值為3及5的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子的粒子平均直徑增至150 nm；在N/P比值為7時直徑最大(250 nm)；而在N/P比值大於9時，直徑顯著地降低至小於100 nm。請參閱第4圖(b)，PAAIO的表面電荷為-30 mV，且在PEI修飾後變為+16 mV。此正值的zeta電位也確定PEI成功地包覆於PAAIO上。少量的PEI-PAAIO所形成的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子(N/P比值為3及5)顯示出負值的表面電荷。N/P比值為7的磁性奈米粒子顯示出zeta電位在正值及負值之間變動。zeta電位的連續變動可助於在此N/P比值下帶正電的PEI-PAAIO及帶負電的pDNA之間的電荷平衡。N/P比值大於7將導致磁性奈米粒子的正值zeta電位增加。
PAAIO的穿透式電子顯微鏡形態影像顯示平均粒子直徑為8.62±1.82 nm。經PEI修飾後的PEI-PAAIO之平均粒子直徑略微增加至931±3.21 nm。N/P比值分別為15、20、25及30之PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子呈現平均分佈、無裝飾的氧化鐵粒子之叢集(cluster)，所測量出的叢集粒子直徑依序為103.6±16.5、105.4±19.9、128.8±14.4及95.8±11.2 nm。Chorny等人(2007)曾報導較大尺寸的磁性奈米粒子與較小尺寸的磁性奈米粒子相較具有較高的轉染速率。因此，較大尺寸的PEI-PAAIO/pDNA比較小尺寸的磁性奈米粒子具有更佳的磁性轉染作用。
3.細胞存活率：
PEI-PAAIO奈米粒子對HEK 293T細胞之細胞存活率以前述的MTT試驗法測定。請參閱第5圖(a)，PEI-PAAIO奈米粒子在所有測試濃度均沒有細胞毒性。PEI-PAAIO奈米粒子的高細胞存活率可歸因於低PEI含量(PEI僅佔PEI-PAAIO奈米粒子的13.5 wt%)。請參閱第5圖(b)，N/P比值介於1至30的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子亦顯示出低細胞毒性。譬如N/P比值為30的磁性奈米粒子之PEI濃度為16.2 μg/mL，在此濃度下HEK 293T細胞仍有80%存活度。在N/P比值為30的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子之細胞毒性明顯地低於N/P比值為10的PEI/pDNA複聚合物。因此，若以基因載體的細胞毒性作為主要考量，那麼PEI-PAAIO將優於純化之PEI而可作為非病毒性的基因載體。此外，在細胞培養盤下方施加外部磁場並未影響細胞存活率。
4.細胞外的基因轉染作用：
由前述實驗已證實本發明的PEI-PAAIO奈米粒子與pDNA具有良好的結合能力，且僅具有極微小的細胞毒性如同前述的「轉染效率」實驗方法，使用兩種質體DNA來測試作為非病毒基因載體的PEI-PAAIO之轉染效率，其中質體pEGFP-C1及pGL3-control分別被用於螢光及冷光測定。
來自pEGFP-C1的相對綠螢光表現以螢光顯微鏡技術加以記錄。第6圖(a)及(b)分別為在缺乏10% FBS及含有10% FBS的條件下所顯示的相對螢光強度。請參閱第6圖(a)，當細胞培養液缺乏FBS時，轉染效率隨著PEI-PAAIO與pEGFP之間的N/P比值增加而增加，且在N/P比值為25時達到最大。當施加磁場時，轉染效率在N/P比值為15及20時增加，但在N/P比值為25及30時降低。請參閱第6圖(b)，當10% FBS加至細胞培養液時，PEI/pDNA的綠螢光強度劇烈地降低，此係由於FBS與pDNA競爭PEI，而PEI會降低磁性奈米粒子中的pDNA濃度。此外，FBS吸附於PEI/pDNA表面也會抑制轉殖基因之表現。當N/P比值小於9時，在具有FBS及不同的N/P比值(PEI-PAAIO:pEGFP)的條件下的基因轉染效率並不被磁場增強所影響。相反地，N/P比值大於15的PEI-PAAIO/pEGFP磁性奈米粒子出現了磁性增強效應，此應是高N/P比值的磁性奈米粒子在培養期間迅速地被攝入細胞內而避免被FBS干擾所引起的pDNA不穩定。
接著，使用pGL3-control質體、藉由測量螢光素酶基因表現來定量地比較磁性奈米粒子及PEI-PAAIO奈米粒子在有或無10%FBS的轉染能力。請參閱第7圖(a)及(b)，其一致顯示出：在有或無FBS的條件下，當施加磁場推動PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子進入細胞時，出現顯著地增強的轉殖基因表現。
5.細胞攝入：
PEI-PAAIO被攝入HEK 293T細胞係以普魯士藍直接染色細胞。在缺乏10% FBS時，有或無施加磁場並沒有顯著的差異；然而，當使用10% FBS及施加磁場時，寶藍色色素隨著PEI-PAAIO及pDNA之間的N/P比值增加而更顯清楚(結果未顯示)。當施加磁場時，本發明證明具有較大粒子直徑之PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子明確地證實具有較高的細胞攝入作用。
此外，以感應耦合電漿發射光譜分析儀(ICP-OES)測定對整體細胞量正常化的鐵含量。請參閱第8圖(a)及(b)，其分別為(a)缺乏10% FBS及(b)有10% FBS以及在有或無磁場的條件下之細胞鐵含量。當無磁場時，細胞攝入的鐵含量並未與增加的N/P比值有關。相反地，在有磁場時，細胞攝入的氧化鐵粒子隨著N/P比值增加而增加。當缺乏FBS時，施加磁場將增加攝入的氧化鐵粒子。在N/P比值為30時，施加磁場所被攝入的鐵含量大約為未施加磁場的鐵含量的2倍。綜上所述，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子在FBS環境下有助於將基因轉殖於HEK 293T細胞。
請參閱第9圖(a)及(b)，其分別為U87細胞在(a)缺乏10% FBS及(b)有10% FBS以及在有或無磁場的條件下的磁性轉染作用，其轉染效率隨N/P比值增加而增加。在第9圖(b)中，在有FBS時由磁場引起的刺激仍顯著地提高轉染效率。當N/P比值大於7時，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子比PEI/pDNA複聚合物有較高的轉染效率。請參閱第9圖(c)及(d)，其分別為以ICP-OES測量U87細胞在(c)沒有FBS及(d)有FBS的條件下所攝入的鐵含量。同樣地，在沒有FBS時，有無磁場下所攝入的鐵含量沒有顯著的變化。然而，在有FBS的條件下，當施加磁場時，U87細胞與HEK 293T細胞相較，U87細胞顯現出顯著的攝入鐵含量的增加及基因轉染作用。
6.結論：
本發明成功地在聚丙烯酸鍵結的氧化鐵上包覆聚乙烯二胺，形成PEI-PAAIO奈米粒子，而且質體DNA經由靜電耦合作用吸附於聚乙烯二胺，形成穩定、具超順磁性的PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子，其比PEI還具有更好的轉染效率，可作為良好的非病毒性基因載體。藉由施加磁場及FBS存在的條件下，本發明的磁性奈米粒子更增強其基因轉染效率，而且PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子能抵抗血清蛋白的干擾而有助於臨床上應用，例如基因治療，或者可作為強大的基因轉殖工具。
實施例：
1.一種製備一奈米粒子的方法，包括步驟：混合一聚乙烯二胺以及一聚丙烯酸鍵結的氧化鐵，以獲得一聚合物；以及混合該聚合物與一遺傳物質，形成該奈米粒子。
2.根據實施例1所述的方法，其中該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵係藉由反應一聚丙烯酸及一四氧化三鐵而獲得。
3.根據實施例1-2中任意一個實施例所述的方法，其中該奈米粒子為一磁性奈米粒子。
4.根據實施例1-3中任意一個實施例所述的方法，其中該磁性奈米粒子被一磁鐵吸引，以去除未與該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵耦合之該聚乙烯二胺。
5.根據實施例1-4中任意一個實施例所述的方法，其中該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一。
6.根據實施例1-5中任意一個實施例所述的方法，其中該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵為水溶性。
7.一種奈米粒子，包括：一聚合物，包括一聚乙烯二胺及被該聚乙烯二胺包圍之一聚丙烯酸鍵結的氧化鐵；以及一遺傳物質，電荷性地耦合於該聚乙烯二胺。
8.根據實施例7所述的奈米粒子，其中該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一，該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵中的氧化鐵為水溶性。
9.一種奈米粒子，包括：一聚合物，包括一帶正電分子及被該帶正電分子圍繞之一金屬粒子；以及一遺傳物質，電耦合於該正電分子。
10.根據實施例9所述的奈米粒子，其中該帶正電分子包括一聚乙烯二胺，該金屬粒子為水溶性，該金屬粒子包括一金奈米粒子、一銀奈米粒子及一鐵奈米粒子，該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
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1．．．氧化鐵
2．．．聚乙烯二胺
3．．．質體DNA
4．．．聚丙烯酸
第1圖為本發明PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子之示意圖。
第2圖(a)及(b)分別為使用兩種不同PAAIO及PEI重量比所製備之不同pH值與PEI-PAAIO奈米粒子的(a)粒子尺寸及(b) zeta電位關係圖。
第3圖(a)為PEI、PAAIO及PEI-PAAIO奈米粒子的FTIR光譜示意圖。
第3圖(b)及(c)為PAAIO及PEI-PAAIO奈米粒子的ESCA光譜示意圖。
第3圖(d)為PAAIO及PEI-PAAIO奈米粒子在25℃之SQUID磁化強度曲線圖。
第4圖(a)及(b)分別為PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子在不同N/P比值之(a)粒子尺寸及(b) zeta電位。
第5圖(a)及(b)分別為(a)不同濃度之PEI-PAAIO對HEK 293T細胞之細胞毒殺作用，及(b)不同N/P比值之PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子在有或無磁場下對HEK 293T細胞之細胞毒殺作用。
第6圖(a)及(b)分別為(a)在缺乏10% FBS及(b)含有10% FBS的條件以及在有或無磁場的條件下，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子與HEK 293T細胞培養4小時，再培養72小時後之pEGFP-C1之表現。
第7圖(a)及(b)分別為(a)在缺乏10% FBS及(b)含有10% FBS的條件以及在有或無磁場的條件下，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子與HEK 293T細胞培養4小時，再培養72小時後之螢光素酶活性。
第8圖(a)及(b)分別為(a)在缺乏10% FBS及(b)含有10% FBS的條件以及在有或無磁場的條件下，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子與HEK 293T細胞培養4小時後，以感應耦合電漿發射光譜分析儀(ICP-OES)測定HEK 293T細胞攝入之鐵含量。
第9圖(a)及(b)分別為(a)在缺乏10% FBS及(b)有10% FBS的條件以及在有或無磁場的條件下，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子與U87細胞培養4小時，再培養72小時後之螢光素酶活性。
第9圖(c)及(d)分別為(c)在缺乏10% FBS及(d)有10% FBS的條件以及在有或無磁場的條件下，PEI-PAAIO/pDNA磁性奈米粒子與U87細胞培養4小時，再培養72小時後，以感應耦合電漿發射光譜分析儀(ICP-OES)測定U87細胞攝入之鐵含量。
1．．．氧化鐵
2．．．聚乙烯二胺
3．．．質體DNA
4．．．聚丙烯酸

Claims (10)

  1. 一種製備一奈米粒子的方法，包括步驟：將一聚乙烯二胺靜電地修飾於一聚丙烯酸鍵結的氧化鐵之表面，以獲得一聚合物；以及將一遺傳物質靜電地耦合於該聚合物中的該聚乙烯二胺，以製備該奈米粒子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵係藉由反應一聚丙烯酸及一四氧化三鐵而獲得。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該奈米粒子為一磁性奈米粒子。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該磁性奈米粒子被一磁鐵吸引，以去除未與該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵耦合之該聚乙烯二胺。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該聚丙烯酸鍵結的四氧化三鐵為水溶性。
  7. 一種奈米粒子，包括：一聚合物，包括一聚丙烯酸鍵結的氧化鐵及一聚乙烯二胺，其中該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵具有一表面，且該聚乙烯二胺被靜電地修飾於該聚丙烯酸鍵結的氧化鐵的該表面；以及一遺傳物質，靜電地耦合於該聚乙烯二胺。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的奈米粒子，其中該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一，該聚丙烯酸鍵結的四氧化三鐵為水溶性。
  9. 一種奈米粒子，包括：一聚合物，包括一聚乙烯二胺及一聚丙烯酸鍵結的金屬粒子，其中該聚丙烯酸鍵結的金屬粒子具有一表面，且該聚乙烯二胺被靜電地修飾於該聚丙烯酸鍵結的金屬粒子的該表面；以及一遺傳物質，靜電地耦合於該聚乙烯二胺。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的奈米粒子，其中該聚丙烯酸鍵結的金屬粒子中的金屬粒子為水溶性，該金屬粒子係選自由一金奈米粒子、一銀奈米粒子及一鐵奈米粒子所組成的群組其中之一，該遺傳物質係選自由一DNA、一RNA、一互補DNA、一小干擾RNA所組成的群組其中之一。
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