TWI413528B - 使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物 - Google Patents

使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物 Download PDF

Info

Publication number
TWI413528B
TWI413528B TW097107631A TW97107631A TWI413528B TW I413528 B TWI413528 B TW I413528B TW 097107631 A TW097107631 A TW 097107631A TW 97107631 A TW97107631 A TW 97107631A TW I413528 B TWI413528 B TW I413528B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
group
exendin
immunoglobulin
insulinotropic peptide
region
Prior art date
Application number
TW097107631A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200930408A (en
Inventor
Dae Hae Song
Chang Ki Lim
Tae Hun Song
Young Hoon Kim
Se Chang Kwon
Gwan Sun Lee
Sung Youb Jung
In Young Choi
Original Assignee
Hanmi Science Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Science Co Ltd filed Critical Hanmi Science Co Ltd
Publication of TW200930408A publication Critical patent/TW200930408A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI413528B publication Critical patent/TWI413528B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物
本發明係關於適用於促胰島素肽之長效調配物的促胰島素肽共軛物。明確地說，本發明係關於經修改之促胰島素肽共軛物，其具有明顯經改善之活體內效力持續時間，其係藉著共價連接促胰島素肽與非-肽基聚合物和免疫球蛋白Fc來產製，以及製備其之方法。
肽因其低穩定性，被活體內的蛋白水解酵素降解，而有容易變性之傾向，因此喪失活性，並具有相對較小的尺寸，藉此容易通過腎臟。因此，為了維持包括肽(作為在藥學上有效成份)之醫藥品的血液水平和力價，必須經常對患者投予肽藥物，以維持想要的血中水平和力價。然而，肽藥物通常以注射用製劑之形式被投予，而該等頻繁的投藥引起患者嚴重的疼痛。欲解決這些問題，已經做了許多努力。如同該等努力之一，已經藉著增加肽藥物通過生物學膜的傳送，嘗試經由口咽或鼻咽吸入運送肽藥物。然而，該方法在維持肽藥物之活體內活性上仍是困難的，因為與注射相比較，其具有低的活體內轉移效率。
另一方面，已經對改善肽藥物之血液穩定性，以及在血液中以高水平維持藥物持續長時間做了許多努力，藉此使藥物的藥學效力達到最大。因此需要該等肽藥物的長效 製劑，以增加肽藥物的穩定性，並使力價維持在足夠高的水平，不會在患者中引起免疫反應。
作為使肽穩定並抑制被蛋白水解酵素降解的方法，已經進行一些試驗，以修改對蛋白水解酵素敏感的特定胺基酸序列。例如，GLP-1(7-37或7-36醯胺)，其功能為降低血糖濃度以治療第2型糖尿病，具有短的生理學活性半衰期，大約4分鐘或更少(Kreymann等人，1987)，歸因於經由在第8個胺基酸(Ala)和第9個胺基酸(Asp)之間被二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase，DPP Ⅳ)切開而喪失GLP-1力價。因此，已經對具有對DPP Ⅳ有抵抗力之GLP-1類似物進行各種調查，並已經進行以Gly(Deacon等人，1998;Burcelin等人，1999)，或以Leu或D-Ala(Xiao等人，2001)取代Ala8的試驗，藉此增加對DPP Ⅳ的抵抗力，同時維持活性。N-端胺基酸，GLP-1的His7是對GLP-1活性很重要的，並作為DPP Ⅳ的標靶。因此，美國專利第5，545，618號描述以烷基或醯基基團修改N-端，且Gallwitz等人描述了使第7個His接受N-甲基化，或α-甲基化，或以咪唑取代整個His，以增加對DPP Ⅳ的抵抗力，並維持生理學活性。
除了這些修改之外，exendin-4，其為純化自希拉毒蜥(Gila monster)之唾液腺的GLP-1類似物(美國專利第5，424，686號)，對DPP Ⅳ有抵抗力，並具有比GLP-1更高的生理學活性。因此，其具有比GLP-1更長而為2至4小時的活體內半衰期。然而，僅利用增加對DPP Ⅳ之抵抗 力的方法，不足以維持生理學活性，且例如在市售之exendin-4(exenatide)的情況下，需要每天兩次注射至患者，這對患者仍是困難的。
這些促胰島素肽有一問題，通常是該肽的尺寸太小。因此，其不能在腎臟中被回收，然後以體外之方式排出。因此，已經使用以化學方式將具有高溶解度之聚合物質(如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG))加在肽的表面上，以抑制在腎臟中流失的方法。
PEG非-專一地與標靶肽的特定位置或各種位置結合以給予增加肽分子量的效果，並因此抑制由腎臟流失且防止水解而不會引起任何副作用。例如，國際專利公開案第WO 2006/076471號描述PEG與B-型利尿鈉肽或BNP結合，該利尿鈉肽(或BNP)與NPR-A結合以活化cGMP的產生，其導致動脈血壓的降低，因此用來作為鬱血性心衰竭的治療劑，藉此維持生理學活性。美國專利第6，924，264號描述PEG與exendin-4的離胺酸殘基結合，以增加其活體內停留時間。然而，該方法雖增加了PEG的分子量，藉此增加肽藥物的活體內停留時間，但隨著分子量的增加，肽藥物的力價明顯降低，且亦降低了與該肽的反應性。因此，不合意地降低了產量。
國際專利公開案第WO 02/46227號描述藉著使用遺傳重組技術，偶聯GLP-1、exendin-4或其類似物與人類血清白蛋白或免疫球蛋白區(Fc)而製備的融合蛋白。美國專利第6，756，480號描述藉著偶聯副甲狀腺激素(parathyroid hormone，PTH)及其類似物和Fc區而製備的Fc融合蛋白。這些方法可解決諸如低聚乙二醇化產量和非-專一性之類的問題，但其等仍有增加血中半衰期之效果不如預期顯著而且有時力價還是很低的問題。為了使增加血液半衰期的效果達到最大，使用各種肽連接子，但很可能引起免疫反應。此外，若使用具有雙硫鍵的肽，例如BNP被使用，則有錯誤摺疊的高度可能。因此，該等肽難以被使用。
此外，GLP-1衍生物，NN2211，係藉著GLP-1之胺基酸取代來製備，並與醯基側鏈結合以與白蛋白形成非-共價鍵，藉此增加其活體內停留時間。然而，它具有11到15小時的半衰期，與exendin-4相比較，不代表有明顯增加的半衰期。因此GLP-1衍生物仍需要每天注射一次(Nauck等人，2004)。此外，CJC-1131是GLP-1衍生物，其具有順丁烯二醯亞胺反應基，用以使GLP-1與血液中的白蛋白共價結合，並已經為了增加活體內半衰期而努力嘗試發展CJC-1311，但該等努力現在已停止。後續提出的物質，CJC-1134，則是與重組白蛋白共價結合的exendin-4，但沒有展現出增加血液穩定性的明顯效果，具有大約17小時的血液半衰期(大鼠)(Thibauoleau等人，2006)。
因此，本發明者以位置-專一性之方式，在N-端以外的胺基酸殘基處，藉著共價鍵使免疫球蛋白Fc和非-肽基 聚合物與促胰島素肽連接，並發現本發明之共軛物發揮明顯增加的活體內效力和半衰期。尤其是他們發現，在促胰島素肽共軛物中，諸如Exendin-4、脫-胺基-組胺醯基exendin-4(其中刪除exendin-4的N-端胺基團)、β-羥基-咪唑-丙醯基exendin-4(其中以羥基基團取代exendin-4的N-端胺基團)、二甲基-組胺醯基exendin-4(其中以兩個甲基基團修改exendin-4的N-端胺基團)，以及咪唑-乙醯基-exendin-4(其中刪除第一個組胺酸的α碳和與其連接的N-端胺基團)之肽的共軛物，發揮明顯增加的活體內效力和半衰期。
本發明的目標是提供促胰島素肽的長效製劑，其具有維持促胰島素肽之活體內活性的效果，並增加血液半衰期。
 最佳形式
在本發明之一具體事實中，提供長效的促胰島素肽共軛物，該促胰島素肽與在其兩端均具有反應基的非-肽基聚合物彼此共價連接。
本發明之促胰島素肽是具有促胰島素功能，為在胰臟β細胞中提升胰島素之合成和表現的肽。這些肽包括前驅物、激動劑、衍生物、片段和變體，且較佳的是GLP(胰高血糖素樣多肽)-1、exendin-3和exendin-4。GLP-1是由小腸分泌的激素，通常提升胰島素的生物合成和分泌，抑制 胰高血糖激素的分泌，並提升細胞中葡萄糖吸收。在小腸中，胰高血糖激素前驅物被分解成三個肽，即胰高血糖激素、GLP-1、和GLP-2。在這裡，GLP-1意指GLP-1(1-37)，其本來是沒有促胰島素功能的形式。但然後將其加工並轉變為經活化之GLP-1(7-37)形式。GLP-1(7-37)胺基酸的序列如下：GLP-1(7-37)
HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EPIAW LVKGR G
GLP-1衍生物意指胺基酸序列與GLP-1之胺基酸序列展現出至少為80%同源性的肽，可能是經化學修改的形式，並展現出與GLP-1至少相等或更高的促胰島素功能。
GLP-1片段意指為其中在天然GLP-1的N-端或C-端處添加或刪除一或多個胺基酸之形式的片段，其中經添加的胺基酸可能是非-天然存在的胺基酸(例如D-型胺基酸)。
GLP-1變體意指具有促胰島素功能的肽，其具有一或多個與該等天然GLP-1不同的胺基酸序列。
exendin3和exendin4是由39個胺基酸構成的促胰島素肽，其與GLP-1具有53%的胺基酸序列同源性。exendin-3和exendin-4的胺基酸序列如下：exendin-3
HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
exendin-4
HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS
exendin激動劑意指在活體內與受體反應的化合物，並具有與exendin相等的生物活性，其與exendin的結構無關。exendin衍生物意指與天然的exendin具有胺基酸序列同源性至少為80%的肽，其可能在胺基酸殘基上有一些基團以化學方式被取代(例如α-甲基化、α-羥基化)、被刪除(例如脫胺基化)或被修改(例如N-甲基化)，並具有促胰島素功能。
exendin片段意指在天然exendin的N-端或C-端具有一或多個被添加或被刪除的胺基酸之片段，其中可添加非-天然存在的胺基酸(例如D-型胺基酸)，並具有促胰島素功能。
exendin變體意指具有至少一個與天然exendin之序列不同的胺基酸序列的肽，其具有促胰島素功能。
可分別或併用製備每個exendin激動劑、衍生物、片段和變體的方法。例如，本發明包括促胰島素肽，其具有與該等天然促胰島素肽的序列至少有一個不同胺基酸的胺基酸序列，並具有在N-端經脫胺基的胺基酸殘基。
在一特定的具體事實中，在本發明中使用天然的促胰島素肽，並可使用固相合成法合成經修改的促胰島素肽，而大多數天然的肽都包含可藉著重組技術產生的天然促胰島素肽。
此外，在本發明中使用的促胰島素肽可在各種位置與非-肽基聚合物結合。
根據本發明製備之肽共軛物可具有活性，其依據欲與促胰島素肽連接的位置而改變。例如，其可分別與N-端，和N-端以外的其他端，如C-端偶聯，代表在試管內活性上的差異。在低pH值下，醛反應基選擇性地與N-端結合，並可在高pH值-如pH9.0下與離胺酸殘基結合，形成共價鍵。允許聚乙二醇化反應在各種pH值下進行，然後可使用離子交換管柱，從反應混合物中分離位置異構物。
若欲在N-端以外的位置(其為對活體內活性很重要的位置)偶聯促胰島素肽，則可將反應性硫醇基團導入在天然胺基酸序列中欲修改之胺基酸殘基的位置，使用在非-肽基聚合物處的順丁烯二醯亞胺連接子形成共價鍵。若欲在N-端以外的位置(其為對活體內活性很重要的位置)偶聯促胰島素肽，則可將反應性胺基團導入在天然胺基酸序列中欲修改之胺基酸殘基的位置，使用在非-肽基聚合物處的醛連接子形成共價鍵。
當在非-肽基聚合物處使用醛連接子時，其與在N-端和離胺酸殘基處的胺基基團反應，並可使用促胰島素肽的經修改形式，選擇性地增加反應產量。例如，可使用N-端阻斷法、離胺酸殘基取代法、在羧基端導入胺基團之方法，或類似者，將唯一一個欲反應的胺基團保持在想要的位置，藉此增加聚乙二醇化和偶聯反應的產量。保護N-端的方法包括二甲基化，以及甲基化、脫胺、醯化等等，但不限於該等烷基化方法。
在一較佳的具體事實中，本發明之促胰島素肽共軛物 是免疫球蛋白Fc區與在該促胰島素肽之N-端胺基團以外的胺基團專一性結合的促胰島素肽共軛物。
在一特定的具體事實中，本發明者在pH9.0下誘導天然exendin-4的聚乙二醇化，選擇性地使PEG與促胰島素肽之離胺酸殘基偶聯。或者，在Lys殘基處聚乙二醇化，在pH7.5下進行具有N-端經刪除或經保護之exendin-4衍生物的聚乙二醇化。藉著刪除N-端組胺酸的α胺基團、藉著以羥基基團取代N-端胺基團、藉著以兩個甲基基團修改N-端組胺酸的α胺基團，或藉著刪除第一個胺基酸(組胺酸)之α碳和與其連接的N-端胺基團，留下咪唑-乙醯基基團及等等，阻斷在N-端的PEG化。可以下列化學式代表該等衍生物：
不像N-端偶聯，當PEG與離胺酸殘基而不是N-端偶聯時，將試管內活性維持在大約8.5%(表1)。此外，即使藉著刪除exendin-4的N-端胺基團製備脫-胺基-組胺醯基exendin-4的Fc共軛物(在後文中稱為DA-exendin-4)、藉著以羥基基團取代exendin-4的N-端胺基團製備β -羥基-咪唑丙基exendin-4(在後文中稱為HY-exendin-4)、藉著以兩個甲基基團修改exendin-4的N-端胺基團製備二甲基組胺醯基exendin-4(在後文中稱為DM-exendin-4)，以及藉著刪除exendin-4之第一個組胺酸的α 碳和與其連接之N-端胺基團製備咪唑乙醯基-exendin-4(在後文中稱為CA-exendin-4)，均顯示可與天然的exendin-4共軛物相比擬的試管內活性和血液半衰期(表1)，這些共軛物顯示出意外高的活體內效力持續時間(圖14)。根據本發明製備的DM-exendin-4-免疫球蛋白Fc共軛物、DA-exendin-4-免疫球蛋白Fc共軛物、CA-exendin-4-免疫球蛋白Fc共軛物和HY-exendin-4-免疫球蛋白Fc共軛物，顯示血液半衰期增加50小時或更多。亦藉著與Lys殘基偶聯-其不影響該肽之活性，將力價降低減至最少。此外，藉著在N-端移除胺基團或α 碳，觀察到意外高的葡萄糖降低活性。
免疫球蛋白Fc區，在用來當做藥物載劑方面是安全的，因為它是在活體內代謝之生物可降解的多肽。再者，當與整個免疫球蛋白分子相比時，免疫球蛋白Fc區具有相對較低的分子量，並因此其在共軛物之製備、純化、和產量上是有利的。因為免疫球蛋白Fc區不含Fab片段， 其的胺基酸序列根據抗體亞型有所不同而因此為高度非-均質的，可預期免疫球蛋白Fc區可大大地增加物質的均一性，並為較低抗原性的。
在本發明中使用的促胰島素肽與載劑物質和非-肽基聚合物連接。可用在本發明中之載劑物質，可選自由免疫球蛋白Fc區、白蛋白、運鐵蛋白、和PEG所組成之群組，而較佳的是免疫球蛋白Fc區。
當在本文中使用”免疫球蛋白Fc區”一詞時，意指免疫球蛋白的重-鏈恆定區2(constant region 2，CH2)和重-鏈恆定區3(CH3)，且沒有重和輕鏈的可變區、免疫球蛋白的重-鏈恆定區1(CH1)、和輕-鏈恆定區1(CL1)。更可含有在重-鏈恆定區的絞鏈區。再者，本發明之免疫球蛋白Fc區可含有一部分或全部的Fc區，其包含重-鏈恆定區1(CH1)及/或輕-鏈恆定區1(CL1)，除了重和輕鏈的可變區，只要其具有實質上類似或比天然蛋白質更好的生理學功能即可。再者IgFc區也可以是在CH2及/或CH3之胺基酸序列相對較長部分中具有一刪除的片段。也就是說，本發明之免疫球蛋白Fc區可包括1)CH1功能部位、CH2功能部位、CH3功能部位、和CH4功能部位，2)CH1功能部位、和CH2功能部位，3)CH1功能部位、和CH3功能部位，4)CH2功能部位、和CH3功能部位，5)一或多個功能部位、和免疫球蛋白絞鏈區(或一部分絞鏈區)的組合，以及6)重-鏈恆定區、和輕-鏈恆定區之每個功能部位的二聚體。
本發明之免疫球蛋白Fc區包含天然的胺基酸序列，以 及其序列衍生物(突變種)。胺基酸序列衍生物是起因於一或多個胺基酸殘基的刪除、***、非-保留性或保留性取代或其組合，而與天然胺基酸序列有差異的序列。例如，在IgG Fc中，可使用已知在結合時很重要的胺基酸殘基，在位置214到238、297到299、318到322或327到331，作為修改的適當目標。再者，其他的各種衍生物都是可能的，包括其中刪除能夠形成雙硫鍵之區域，或在天然Fc形式之N-端排除某些胺基酸殘基，或在其上添加甲硫胺酸殘基的衍生物。此外，欲移除效應物功能，可在補體-結合位置，如Clq-結合位置和ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，抗體依賴性細胞介導之胞毒性)位置發生刪除。在國際專利公開案第WO 97/34631號和WO 96/32478號中揭示了製備該等免疫球蛋白Fc區之序列衍生物的技術。
在蛋白質和肽中通常不改變分子活性的胺基酸交換，為在技術領域中被熟知的(H. Neurath，R. L. Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最常發生的交換是以兩個方向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
Fc區，若需要可藉著磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化(farnesylation)、乙醯基化、醯胺化以及類似者修改。
前述的Fc衍生物是具有與本發明之Fc區相同之生物活性，或經改善之結構穩定性，例如對抗熱、pH值或類似者的衍生物。
此外，這些Fc區可獲自分離自人類和其他動物，包括牛、山羊、豬、老鼠、兔子、倉鼠、大鼠、和天竺鼠的天然形式，或可以是其重組體或衍生物，獲自經轉型之動物細胞或微生物。在本文中，其等可獲自天然的免疫球蛋白，藉著從人類或動物生物中分離整個免疫球蛋白，並以蛋白水解酵素處理之。木瓜蛋白酶消化天然免疫球蛋白成為Fab和Fc區，而胃蛋白酶處理結果產生pF’c和F(ab)2片段。可使這些片段接受，例如尺寸排除層析法(size exclusion chromatography)以分離Fc和pF’c。較佳的是，人類-衍生之Fc區是獲自微生物的重組免疫球蛋白Fc區。
此外，本發明之免疫球蛋白Fc區可以是具有天然糖鏈的形式、與天然形式相比較增加糖鏈或減少糖鏈的，或可以是經脫糖基化的形式。可藉著在技術領域中常用的方法，如化學方法、酵素方法、和使用微生物的基因工程方法，達成免疫球蛋白Fc糖鏈的增加、減少或移除。從Fc區中移除糖鏈，結果劇烈地降低了對第一個補體成份C1之C1q部分的結合親和力，並減少或喪失了抗體-依賴性細胞-介導之胞毒性或補體-依賴性之胞毒性，藉此不在活體內引起不必要的免疫反應。關於這一點，經脫糖基化或無糖基化形式的免疫球蛋白Fc區可能較適合作為本發明之藥物載劑的對象。
當在本文中使用時，”脫糖基化”一詞意指以酵素方式從Fc區中移除糖部分，而”無糖基化”一詞意指由原核生物，較佳的是大腸桿菌產生未經糖基化形式的Fc區。
另一方面，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其他動物，包括牛、山羊、豬、老鼠、兔子、倉鼠、大鼠、和天竺鼠，且較佳的是人類。此外，免疫球蛋白Fc區可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、和IgM的Fc區，或藉著其組合或其雜化物而構成。較佳的是，其衍生自IgG或IgM-其為在人類血液中最豐富的蛋白質，而最佳的是衍生自IgG-已知其提高配體-結合蛋白質的半衰期。
另一方面，當在本文中使用”組合”一詞時，意指編碼相同來源之單-鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不同來源之單-鏈多肽連接，形成二聚體或多聚體。也就是說，二聚體或多聚體可由二或多個片段形成，其選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc片段所組成之群組。
當在本文中使用”雜化物”一詞時，意指在單-鏈免疫球蛋白Fc區中出現編碼二或多個不同來源之免疫球蛋白Fc區的序列。在本發明中，各種類型之雜化物都是可能的。也就是，功能部位雜化物可由一到四個功能部位構成，其選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc、和IgD Fc的CH1、CH2、CH3、和CH4所組成之群組，並可含有絞鏈區。
另一方面，將IgG分成IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亞型，且本發明包含其組合和雜化物。較佳的是IgG2和IgG4亞型，而最佳的是IgG4的Fc區，罕見地具有效應物功能， 如CDC(complement dependent cytotoxicity，補體依賴性之胞毒性)。
也就是說，作為本發明之藥物載劑，最佳的免疫球蛋白Fc區是人類IgG4-衍生之未經糖基化的Fc區。人類-衍生之Fc區比非-人類衍生之Fc區更好，後者在人體內可能扮演抗原，並引起不受歡迎的免疫反應，如產生對抗該抗原的新抗體。
當在本文中使用”非-肽基聚合物”一詞時，意指生物可相容的聚合物，包括二或多個重複單位，彼此藉著肽鍵以外的任何共價鍵連接。
可用在本發明中之非-肽基聚合物，可選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解之聚合物，如PLA(polylactic acid，聚乳酸)、和PLGA(polylactic-glycolic acid，聚乳酸-乙醇酸)、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸、及其組合所組成之群組，而較佳的是聚乙二醇。亦將其在技術領域中已熟知的，且在技術領域中可輕易製備的衍生物，納入本發明之範圍內。
在藉著傳統符合讀框之融合(inframe fusion)方法獲得的融合蛋白中使用的肽連接子，具有在活體內容易被蛋白水解酵素切開的缺點，並因此不能如預期獲得藉著載劑增加活性藥物之血液半衰期的充分影響。然而，在本發明中，聚合物具有對蛋白水解酵素的抵抗力，可用以將肽的血液半衰期維持在類似載劑之血液半衰期的程度。因此， 可使用任何可用在本發明中之非-肽基聚合物，沒有任何限制，只要它是具有前述功能的聚合物，即該聚合物具有對活體內蛋白水解酵素的抵抗力即可。非-肽基聚合物較佳的是具有範圍在1到100kDa的分子量，而更佳的是1到20kDa。再者，與免疫球蛋白Fc區連接的本發明之非-肽基聚合物，可以是一聚合物或不同類型之聚合物的組合。
在本發明中使用的非-肽基聚合物，具有能夠與免疫球蛋白Fc區和蛋白質藥物結合的反應基。
非-肽基聚合物在兩端具有反應基，其較佳的是選自由反應性醛基團、丙醛基團、丁醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。琥珀醯亞胺衍生物可以是琥珀醯亞胺基丙酸基、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或琥珀醯亞胺基碳酸基。特別是在非-肽基聚合物在兩端具有反應性醛基團時，其有效地在兩端連接具有生理活性之多肽和免疫球蛋白，具有最低的非-專一性反應。藉著經由醛鍵結之還原烷基化產製的終產物，比藉著醯胺鍵結連接時更穩定得多。醛反應基在低pH值下選擇性地與N-端結合，並可在高pH值，如pH9.0下，與離胺酸殘基結合，形成共價鍵。
在非-肽基聚合物兩端的反應基可以是相同或不同的。例如，非-肽基聚合物可在一端具有順丁烯二醯亞胺基團，並在另一端具有醛基團、丙醛基團或丁醛基團。當使用在其兩端具有反應性羥基基團的聚乙二醇作為非-肽基聚合物時，可藉著已知的化學反應使羥基基團活化成各種反應 基，或可使用具有市售之經修改反應基的聚乙二醇，而得以製備本發明之促胰島素肽共軛物。
本發明之促胰島素肽共軛物維持促胰島素肽的傳統活體內活性，如提升胰島素的合成和分泌、食慾控制、體重減輕、增加β細胞對血糖的敏感性、提升β細胞增殖、延遲胃排空，以及胰高血糖激素抑制，且更顯著地增加促胰島素肽的血液半衰期，並因此維持該肽的活體內效力，其可用來治療糖尿病、肥胖、急性冠狀動脈徵候群或多囊性卵巢徵候群。
在另一具體事實中，本發明提供製備促胰島素肽共軛物的方法，包括下列步驟：(1)使在其兩端具有選自由醛、順丁烯二醯亞胺、和琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組的反應基的非-肽基聚合物，其與促胰島素肽的胺基團或硫醇基團共價連接；(2)從(1)之反應混合物中分離包括該促胰島素肽的共軛物，其中該非-肽基聚合物與N-端以外的位置共價連接；並(3)使免疫球蛋白Fc區與該經分離共軛物之非-肽基聚合物的另一端共價連接，產生包括與該非-肽基聚合物每一端連接之免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽共軛物。當在本文中使用”共軛物”一詞時，意指藉著共價連接非-肽基聚合物與促胰島素肽製備的中間物，且隨後將免疫球蛋白Fc區與該非-肽基聚合物的另一端連接。
在較佳的具體事實中，本發明提供製備促胰島素肽共軛物的方法，包括下列步驟：(1)使在其兩端具有醛反應基的非-肽基聚合物，與促胰島素肽的離胺酸殘基共價連接； (2)從(1)之反應混合物中分離包括該促胰島素肽的共軛物，其中該非-肽基聚合物與離胺酸殘基共價連接；並(3)使免疫球蛋白Fc區與該經分離共軛物之非-肽基聚合物的另一端共價連接，產生包括與該非-肽基聚合物每一端連接之免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的蛋白質共軛物。更佳的是，在pH7.5或更高下，將(1)之非-肽基聚合物與促胰島素肽的離胺酸殘基連接。
在更進一步的具體事實中，本發明提供治療糖尿病的醫藥組合物，其包括本發明之促胰島素肽共軛物。包括本發明之共軛物的醫藥組合物，更可包括在藥學上可接受之載劑。為了口服投藥，在藥學上可接受之載劑可包含黏合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、促溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色劑、和香料。為了注射用製劑，在藥學上可接受之載劑可包含緩衝劑、防腐劑、止痛藥、促溶劑、等張劑、和穩定劑。至於局部投藥之製劑，在藥學上可接受之載劑可包含基底、賦形劑、潤滑劑、和防腐劑。可將本發明之醫藥組合物與前述在藥學上可接受的載劑一起調配成各種劑型。例如，為了口服，可將醫藥組合物調配成錠劑、***錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或糯米紙囊劑。為了注射用製劑，可將醫藥組合物調配成呈單一劑劑型或單位劑型形式的安瓿，如多劑量容器。亦可將醫藥組合物調配成溶液、懸浮液、錠劑、藥丸、膠囊、和長效製劑。
另一方面，載劑的實例，適合藥學調配物的賦形劑和稀釋劑包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、 木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、***膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、和礦物油。此外，藥學調配物亦可進一步含有填料、抗-凝固劑、潤滑劑、濕潤劑、香料、和防腐劑。
根據本發明之共軛物，可用來治療糖尿病、肥胖、急性冠狀動脈徵候群或多囊性卵巢徵候群。因此，可投予包含該共軛物之醫藥組合物以治療該疾病。
當在本文中使用”投藥”一詞時，意指藉著某些適當的方法，將預定量的物質導入患者內。可經由任何常用的途徑投予本發明之共軛物，只要能夠達到想要的組織即可。考慮到各種投藥模式，包括腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺臟內、和直腸內，但本發明不限於這些舉例的投藥模式。然而，因為肽在口服投藥後被消化，故應該將口服投藥之組合物的活性成分塗膜，或調配以保護對抗在胃中的降解。較佳的是，以注射用形式投予本發明之組合物，此外，亦可使用某些能夠將活性成分運送至標靶細胞內的裝置以投予本發明之醫藥組合物。
可藉著數個相關因素決定本發明之醫藥組合物的投藥頻率和劑量，該因素包括待治療之疾病的類型、投藥路徑、患者的年齡、性別、體重、和疾病的嚴重性，以及作為活性成份之藥物的類型。因為本發明之醫藥組合物具有優異 的活體內效力持續時間和力價，故可明顯降低本發明之藥學藥物的投藥頻率和劑量。
經由下列的實施例，可獲得對本發明更佳的了解，所陳述之實施例僅為了說明，不可解釋為本發明之限制。
實施例 實施例1. exendin-4的PEG化和位置異構物的分離
藉著在4℃下使exendin-4(AP，USA)與3.4K丙醛(2)PEG(具有兩個丙醛基團的PEG，IDB Inc.，South Korea)以1:15之莫耳比例反應90分鐘，其中肽濃度為3mg/ml，使PEG和肽之N-端接受PEG化。在此時，在pH4.0濃度100mM的NaOAc緩衝溶液中進行反應，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB (NaCNBH3 )，以完成反應。藉著在4℃下使exendin-4與3.4K丙醛(2)PEG以1:30之莫耳比例反應3小時，其中肽濃度為3mg/ml，使PEG和肽之離胺酸(Lys)殘基接受PEG化。在此時，在pH9.0濃度100mM的Na-磷酸緩衝溶液中進行反應，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB，以完成反應。使用SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)從每個反應溶液中純化經單-PEG化的肽，並使用SOURCE S(XK 16ml，Amersham Biosciences)分離異構物。發現較早發現經PEG化之N-端的高峰，然後轉而發現經PEG化之離胺酸殘基的兩個高峰。藉著肽作圖法證實所沖提之高峰的經PEG化區域。較早沖提出Lys12-經PEG化之共軛物，在最後部分沖提出Lys27-經PEG化之共軛物，並從彼此完全分離出N-端的位置異構物和 Lys12的位置異構物。
管柱：SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A 0->40% 80 min B(A:20mM Tris pH8.5，B:A+0.5M NaCl)
管柱：SOURCE S(XK 16ml，Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A 0->100% 50 min B(A:20mM檸檬酸pH3.0，B:A+0.5M KCl)
實施例2.製備exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物
使用與在實施例1中之描述相同的方法，使3.4K丙醛(2)PEG與exendin-4的N-端反應，並僅純化N-端異構物，然後與免疫球蛋白Fc偶聯。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和50mg/ml之總蛋白質濃度，進行17小時。在100mM K-P(pH6.0)的溶液中進行反應，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB。使用兩個純化管柱純化偶聯反應溶液。首先，使用SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)，以移除大量未曾參與偶聯反應的免疫球蛋白Fc。使用20mM Tris (pH7.5)和1M NaCl作為鹽梯度，較早沖提出具有相對較弱結合力的免疫球蛋白Fc，然後沖提出exendin-4-免疫球蛋白Fc。經由這第一次純化程序，移除免疫球蛋白Fc至某種程度，但因為免疫球蛋 白Fc和exendin-4-免疫球蛋白Fc在離子交換管柱中具有彼此類似的結合力，故不能將它們彼此完全分開。因此，使用兩個材料各自的疏水性，進行第二次純化。在SOURCE ISO (HR 16ml，Amersham Biosciences)中使用20mM Tris (pH7.5)1.5M硫酸錠，偶聯第一個經純化的試樣，並利用逐漸降低的硫酸銨濃度沖提該試樣。在HIC管柱中，較早沖提出具有弱結合力的免疫球蛋白Fc，然後沖提出具有強結合力的exendin-4-免疫球蛋白Fc試樣。因為它們有顯著不同的疏水性，故比在離子交換管柱中更容易將其等彼此分開。然而，因為使用過量的免疫球蛋白Fc-歸因於莫耳比例的差異，故僅使用HIC管柱不能獲得高純度。藉著逆相HPLC測得之純度為91.6%(圖1)。
管柱：SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A 0->25% 70 min B(A:20mM Tris pH7.5，B:A+1M NaCl)
管柱：SOURCE ISO (HR 16ml，Amersham Biosciences)
流速：7.0ml/min
梯度：B 100->0% 60 min B(A:20mM Tris pH7.5，B:A+1.5M硫酸銨)
實施例3.製備exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用與在實施例1中之描述相同的方法，使3.4K丙醛 (2)PEG與exendin-4的離胺酸(Lys)反應，僅純化Lys異構物，然後與免疫球蛋白Fc偶聯。在兩個異構物高峰中，使用最後的異構物高峰(Lys27的位置異構物)來進行偶聯反應，其有較大的反應並很容易與N-端異構物高峰區別。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和50mg/ml之總蛋白質濃度，進行16小時。在100mM K-P(pH6.0)的溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，其與在實施例2中的相同。藉著逆相HPLC測得之純度為91.7%(圖2)。
實施例4.製備脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
欲PEG化3.4K丙醛(2)PEG對脫-胺基-組胺醯基exendin-4(DA-exendin-4，AP，USA)的離胺酸(Lys)殘基，藉著在4℃下以1:30之莫耳比例，其中肽濃度為3mg/ml，使肽與3.4K丙醛(2)反應12小時，進行PEG化。反應溶液是在100mM Na-磷酸緩衝溶液，pH7.5中，並加入作為還原劑的20mM SCB。藉著兩-步驟純化過程純化經PEG化的肽，使用SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)和SOURCE S(XK 16ml，Amersham Biosciences)。在兩個異構物高峰中，使用最後的異構物高峰(Lys27的位置異構物)進行偶聯反應，其有較大的反應並很容易與N-端異構物高峰區別。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc 之比例，在60mg/ml之總蛋白質濃度下，進行20小時。在100mM K-P(pH6.0)中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，與在實施例2中描述的相同。藉著逆相HPLC測得之純度為95.8%(圖3)。
管柱：SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A 0->20% 70 min B(A:20mM Tris pH9.0，B:A+1M NaCl)
管柱：SOURCE S(XK 16ml，Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A 0->50% 50 min B(A:20mM檸檬酸pH3.0，B:A+1M KCl)
實施例5.製備羥基-咪唑-丙醯基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用與在實施例4中之描述相同的方法，使3.4K丙醛(2)PEG與β-羥基-咪唑-丙基exendin-4(HY-exendin-4，AP，USA)的離胺酸(Lys)殘基反應。在兩個異構物高峰中，使用最後的異構物高峰(Lys27的位置異構物)進行偶聯反應，其有較大的反應並很容易與N-端異構物高峰區別。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和60mg/ml之總蛋白質濃度，進行20小時。在100mM K-P(pH6.0)中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。 在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml以進行兩-步驟純化過程mlml，其如同在實施例2中所描述。藉著逆相HPLC測得之純度為93.9%(圖4)。
實施例6.製備咪唑-乙醯基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用與在實施例4中之描述相同的方法，使3.4K丙醛(2)PEG與咪唑-乙醯基exendin-4(CA-exendin-4，AP，USA)的離胺酸(Lys)殘基反應。在兩個異構物高峰中，使用最後的異構物高峰(Lys27的位置異構物)進行偶聯反應，其有較大的反應並很容易與N-端異構物高峰區別。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和60mg/ml之總蛋白質濃度，進行20小時。在100mM K-P(pH6.0)中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，如同在實施例2中描述的。藉著逆相HPLC測得之純度為95.8%(圖5)。
實施例7.製備Ser經突變之DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
藉著在25℃下以1:30之莫耳比例，其中肽濃度為3mg/ml，使Ser經突變之DAexendin-4與3.4K丙醛(2)PEG反應3小時，使3.4K丙醛(2)PEG與肽的離胺酸(Lys)殘基接受PEG化。在此時，在pH7.5濃度100mM的Na-磷酸 緩衝溶液中進行反應，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB，以完成反應。如同在實施例4中的描述，使用SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)而不使用SOURCE S(XK 16ml，Amersham Biosciences)，進行經單-PEG化肽的純化過程。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和60mg/ml之總蛋白質濃度，進行20小時。在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。因為Ser經突變之DAexendin-4具有強很多的陰離子特性，故僅藉著使用SOURCE Q的純化過程，便有效排除了未參與該反應的過量免疫球蛋白Fc。因此，省略使用SOURCE ISO的純化過程，而使用SOURCE Q之純化過程的條件與在實施例2中的相同。藉著逆相HPLC測得之純度為92.5%(圖6)。
實施例8.製備Arg12經突變之DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用與在實施例7中之描述相同的方法，使3.4K丙醛(2)PEG與Arg12經突變之DAexendin-4(AP，USA)的離胺酸(Lys)殘基反應，並純化之。然後進行偶聯過程。該反應在4℃下，以1:8的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和60mg/ml之總蛋白質濃度，進行20小時。在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，其與在實施例2中的相同。藉著逆相 HPLC測得之純度為99.2%(圖7)。
實施例9.製備脫胺基-組胺醯基exendin-4(Lys27)-白蛋白共軛物
使用與在實施例4中之描述相同的方法，使3.4K丙醛(2)PEG與脫-胺基-組胺醯基exendin-4(AP，USA)的離胺酸(Lys)殘基反應，並純化之。該反應在4℃下，以1:7的肽：作為載劑物質的人類血液-衍生之白蛋白(Green cross，South Korea)之比例，和50mg/ml之總蛋白質濃度，進行24小時。在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，其與在實施例2中的相同。藉著逆相HPLC測得之純度為90.3%(圖8)。
實施例10.製備二甲基-組胺醯基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用二甲基-組胺醯基exendin-4(DMexendin，AP，USA)，以與在實施例4中之描述相同的方法，製備二甲基-組胺醯基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物。藉著逆相HPLC測得之純度為96.4%(圖9)。
實施例11.製備GLP-1(N)-免疫球蛋白Fc共軛物
藉著在4℃下，以1:5之莫耳比例，其中肽濃度為 3mg/ml，使GLP-1(AP，USA)與3.4K丁醛(2)PEG(具有兩個丁醛基團的PEG，Nektar，USA)反應90分鐘，使PEG和肽之N-端接受PEG化。在此時，在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB(NaCNBH3 )。然後，在4℃下以1：10的肽：免疫球蛋白Fc之莫耳比例，和50mg/ml之總蛋白質濃度，進行反應16小時。在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，其與在實施例2中的相同。藉著逆相HPLC測得之純度為91%(圖10)。
實施例12.製備脫-胺基-組胺醯基GLP-1(Lys20,28)-免疫球蛋白Fc共軛物
藉著在4℃下，以1：30之莫耳比例，其中肽濃度為3mg/ml，使脫-胺基-組胺醯基GLP-1(AP，USA)與3.4K丙醛(2)PEG反應4小時，使PEG和肽之離胺酸(Lys)殘基接受PEG化。在此時，該反應在pH7.5濃度100mM之Na-磷酸緩衝溶液中進行，並在其中加入作為還原劑的20mM SCB，以完成反應。使用SOURCE Q(XK 16ml，Amersham Biosciences)進行經單-PEG化肽的純化過程。該反應在4℃下，以1：6的肽：免疫球蛋白Fc之比例，和60mg/ml之總蛋白質濃度，進行16小時。在100mM K-P(pH6.0)之溶液中進行反應，並加入作為還原劑的20mM SCB。在偶聯反 應之後，使用SOURCE Q 16ml和SOURCE ISO 16ml的兩-步驟純化過程，其與在實施例2中的相同。然而，在SOURCE ISO 16ml中的解離降低，因為在GLP-1免疫球蛋白Fc共軛物與免疫球蛋白Fc之間的疏水性差異，比在exendin-4免疫球蛋白Fc與免疫球蛋白Fc之間的低。因此，對以上的純化過程，更進一步進行使用SOURCE ISO 16ml的純化過程。藉著逆相HPLC測得之純度為91.9%(圖11)。
實施例13.使用丁醛連接子PEG製備共軛物
以與在實施例1中之描述相同的方法，使用3.4K丁醛(2)PEG(具有兩個丁醛基團的PEG，Nektar，USA)，製備3.4K-exendin-4。如在實施例3中之描述相同的方法，將其與免疫球蛋白Fc偶聯。藉著逆相HPLC測得之純度為92.3%(圖12)。
實施例14.測量持續釋放之exendin-4的試管內活性
欲測量exendin-4之長效製劑的效力，使用測量試管內細胞活性的方法。典型地，為了測量GLP-1的試管內活性，分離胰島瘤細胞或胰島，並判定在GLP-1處理之後，是否增加細胞中的cAMP's。
關於在本測試中用來測量試管內活性的方法，使用RIN-m5F(ATCC)細胞，已知其為大鼠胰島瘤細胞。這些細胞具有GLP-1受體，並因此經常在測量GLP-1家族之試管內活性的方法中使用它們。以各種濃度的GLP-1、exendin-4和受試材料處理RIN-m5F。測量由受試材料引起cAMP's 的出現，其為在細胞中發送信號的分子，並由此產生EC50值，然後互相比較。在表1中出示結果。
-DMexendin-4：二甲基-組胺醯基exendin-4
-DAexendin-4：脫-胺基-組胺醯基exendin-4
-HYexendin-4:β-羥基-咪唑-丙基exendin-4
-CAexendin-4：咪唑-乙醯基exendin-4
-Ser12 DAexendin-4:DAexendin-4，其中以絲胺酸取代exendin-4的第12個離胺酸殘基
-DA GLP-1：脫-胺基-組胺醯基-GLP-1
-exendin-4(N)-PEG-Fc：其中exendin-4之N-端和Fc區與PEG連接的共軛物
-exendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中exendin-4的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-DMexendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中二甲基組胺醯基exendin-4的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中脫-胺基-組胺醯基exendin-4的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-HYexendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中β-羥基-咪唑-丙基exendin-4的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-CAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中咪唑-乙醯基exendin-4的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-Ser12 DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc：其中Ser12脫-胺基-組胺醯基exendin-4(其中exendin-4的第12個離胺酸殘基被絲胺酸取代)的第27個離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物
-DAexendin-4(Lys27)-PEG-白蛋白：其中脫-胺基-組胺醯基exendin-4的第27個離胺酸殘基和白蛋白與PEG連接的共軛物
-DA GLP-1(Lys20，28)-PEG-Fc：其中脫-胺基-組胺醯基GLP-1的離胺酸殘基和Fc區與PEG連接的共軛物。
實施例15.測試長效exendin-4的活體內效力
欲測量exendin-4之長效製劑的活體內效力，使用作為糖尿病模式之在db/db老鼠中測量血糖濃度降低效果的方法。在2週的期間內，對大約6-7週齡的糖尿病模式老鼠投予100微克/公斤的長效exendin-4製劑一次，以及每天投予100微克/公斤之天然exendin-4，不限制食物供應。在投予受試材料之後，每天收集血液，並測量血糖水平的改變。特別是在天然exendin-4的情況下，在投藥1小時後測量血糖濃度(圖14)。exendin-4衍生物的共軛物，維持血糖濃度降低持續10天或更久，甚至是在投藥一次時，而天然exendin-4之共軛物使葡萄糖降低的活性，在8天之後消失。
產業利用性
本發明之促胰島素肽共軛物具有維持相對上較高的活體內活性，且具有明顯增加的血液半衰期，並因此可能想要用以發展各種肽藥物的長效調配物。
圖1顯示逆相HPLC測量天然exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖2顯示逆相HPLC測量天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖3顯示逆相HPLC測量脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖4顯示逆相HPLC測量(2-羥基-3-(1H-咪唑-4-基)丙醯基)exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的 結果；圖5顯示逆相HPLC測量(2-(1H-咪唑-4-基)乙醯基)exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖6顯示逆相HPLC測量經Ser12突變之脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖7顯示逆相HPLC測量Arg12-經突變之脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖8顯示逆相HPLC測量脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG-人類血清白蛋白(HSA)共軛物之純度的結果；圖9顯示逆相HPLC測量二甲基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖10顯示逆相HPLC測量GLP-1(N)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖11顯示逆相HPLC測量脫-胺基-組胺醯基GLP-1(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖12顯示逆相HPLC測量天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；圖13顯示藉著12% SDS-PAGE測量(2-(1H-咪唑-4-基)乙醯基)exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果；以及圖14顯示測量脫-胺基-組胺醯基exendin-4(Lys)-PEG- 免疫球蛋白Fc共軛物，在血液中降低葡萄糖濃度之效果的結果。
<110> 韓美控股股份有限公司(Hanmi Holdings Co.,Ltd.)
<120> 使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物
<130>
<140> TW 097107631
<141> 2008-03-05
<150> KR 10-2008-0001479
<151> 2008-01-04
<160> 11
<170> PatentIn 3.4版
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 美國毒蜥
<400> 1
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exendin-4(N)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> His連接至-PEG-Fc
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 3
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DM Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是二甲基-組胺醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 4
<210> 5
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DA Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是脫-胺基-組胺醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 5
<210> 6
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HY Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是β -羥基-咪唑-丙醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是咪唑-乙醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 7
<210> 8
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ser12 DA Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是脫-胺基-組胺醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至-PEG-Fc
<400> 8
<210> 9
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DA Exendin-4(Lys27)-白蛋白
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是脫-胺基-組胺醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Lys連接至白蛋白
<400> 9
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DA GLP-1(Lys20,28)-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是脫-胺基-組胺醯基
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (20)..(20)
<223> 位置20及28中的一個Lys連接至-PEG-Fc
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (28)..(28)
<223> 位置20及28中的一個Lys連接至-PEG-Fc
<400> 10
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11

Claims (19)

  1. 一種促胰島素肽共軛物，其包括促胰島素肽和免疫球蛋白Fc區，其藉著非-肽基聚合物連接，其中該促胰島素肽係選自由以下者所組成之群組：脫-胺基-組胺醯基exendin-4(藉由刪除exendin-4的N-端胺基團製備)、β-羥基-咪唑-丙醯基exendin-4(藉由以羥基基團取代exendin-4的N-端胺基團製備)、二甲基組胺醯基exendin-4(藉由以兩個甲基基團修改exendin-4的N-端胺基團製備)、以及咪唑乙醯基-exendin-4(藉由刪除exendin-4之第一個組胺酸的α碳和與其連接的N-端胺基團製備)，其中該非-肽基聚合物係選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解之聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸、及其組合所組成之群組，且其中該非-肽基聚合物的一端與該促胰島素肽的離胺酸殘基連接。
  2. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其係以以下化學式1代表，R1-X-Y-Z-R2<式1>其中R1係選自由脫-胺基-組胺醯基基團、N-二甲基-組胺醯基基團、β -羥基咪唑丙基基團、和4-咪唑乙醯基基團所組成之群組；R2係選自由-NH、-OH和-Lys所組成之群組；X係Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Ph e-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、或Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly；R3係選自由Lys、Ser和Arg所組成之群組；R4係選自由Lys、Ser和Arg所組成之群組；Y係選自由以下者組成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙基化之多元醇、聚乙烯醇、多醣類、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解之聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸、及其組合；且Z為免疫球蛋白Fc區。
  3. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其中該非-肽基聚合物具有兩端，分別與免疫球蛋白Fc區的胺基團或硫醇基團和促胰島素肽結合。
  4. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區是經脫糖基化的。
  5. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區係由一到四個選自由CH1、CH2、CH3、和CH4功能部位所組成之群組的功能部位構成。
  6. 如申請專利範圍第5項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區更包含絞鏈區。
  7. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區是衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE、和 IgM所組成之群組的免疫球蛋白之Fc區。
  8. 如申請專利範圍第7項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區的每個功能部位是不同來源的功能部位雜化物，其衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE、和IgM所組成之群組的免疫球蛋白。
  9. 如申請專利範圍第7項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區是由相同來源之單-鏈免疫球蛋白構成的二聚體或多聚體(免疫球蛋白Fc之組合)。
  10. 如申請專利範圍第7項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區是IgG4 Fc區。
  11. 如申請專利範圍第10項之促胰島素肽共軛物，其中該免疫球蛋白Fc區是人類經脫糖基化的IgG4 Fc區。
  12. 如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物，其中該非-肽基聚合物的反應基係選自由醛基團、丙醛基團、丁醛基團、順丁烯二醯亞胺基團、和琥珀醯亞胺基團所組成之群組。
  13. 如申請專利範圍第12項之促胰島素肽共軛物，其中琥珀醯亞胺衍生物係選自由琥珀醯亞胺基丙酸基、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基或琥珀醯亞胺基碳酸基所組成之群組。
  14. 如申請專利範圍第12項之促胰島素肽共軛物，其中該非-肽基聚合物在兩端都具有反應性醛基團。
  15. 如申請專利範圍第14項之促胰島素肽共軛物，其中該非-肽基聚合物為聚乙二醇。
  16. 一種製備如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物的方法，包括下列步驟，(1)使在其兩端具有選自由醛、順丁烯二醯亞胺、和琥珀醯亞胺基團所組成之群組的反應基的非-肽基聚合物，與該促胰島素肽的胺基團共價連接；(2)從(1)之反應混合物中分離包括該促胰島素肽的共軛物，其中該非-肽基聚合物與該促胰島素肽之胺基團共價連接；並(3)使免疫球蛋白Fc區與該經分離的共軛物之非-肽基聚合物的另一端共價連接，以產生包括與該非-肽基聚合物各端連接之免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的肽共軛物；其中該促胰島素肽係選自由以下者所組成之群組：脫-胺基-組胺醯基exendin-4(藉由刪除exendin-4的N-端胺基團製備)、β-羥基-咪唑-丙醯基exendin-4(藉由以羥基基團取代exendin-4的N-端胺基團製備)、二甲基組胺醯基exendin-4(藉由以兩個甲基基團修改exendin-4的N-端胺基團製備)、以及咪唑乙醯基-exendin-4(藉由刪除exendin-4之第一個組胺酸的α碳和與其連接的N-端胺基團製備)。
  17. 一種製備如申請專利範圍第1項之促胰島素肽共軛物的方法，其包括下列步驟，(1)使在其兩端具有醛反應基的非-肽基聚合物，在pH7.5或更高下，與促胰島素肽的離胺酸殘基共價連接；(2)從(1)之反應混合物中分離包括該促胰島素肽的共軛物，其中該非-肽基聚合物與離胺酸殘基共價連接；並 (3)使免疫球蛋白Fc區與該經分離的共軛物之非-肽基聚合物的另一端共價連接，以產生包括與該非-肽基聚合物各端連接之免疫球蛋白Fc區和促胰島素肽的蛋白質共軛物；其中該促胰島素肽係選自由以下者所組成之群組：脫-胺基-組胺醯基exendin-4(藉由刪除exendin-4的N-端胺基團製備)、β-羥基-咪唑-丙醯基exendin-4(藉由以羥基基團取代exendin-4的N-端胺基團製備)、二甲基組胺醯基exendin-4(藉由以兩個甲基基團修改exendin-4的N-端胺基團製備)、以及咪唑乙醯基-exendin-4(藉由刪除exendin-4之第一個組胺酸的α碳和與其連接的N-端胺基團製備)。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之方法，其中該非-肽基聚合物是聚乙二醇。
  19. 一種醫藥組合物，其係用以治療糖尿病、肥胖、急性冠狀動脈徵候群、或多囊性卵巢徵候群，其包括如申請專利範圍第1項之肽共軛物。
TW097107631A 2007-01-05 2008-03-05 使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物 TWI413528B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070001662 2007-01-05
KR1020080001479A KR101058290B1 (ko) 2007-01-05 2008-01-04 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린분비 펩타이드 약물결합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200930408A TW200930408A (en) 2009-07-16
TWI413528B true TWI413528B (zh) 2013-11-01

Family

ID=39588830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW097107631A TWI413528B (zh) 2007-01-05 2008-03-05 使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8476230B2 (zh)
EP (1) EP2114438B8 (zh)
JP (2) JP2008169195A (zh)
KR (3) KR101058290B1 (zh)
CN (3) CN103435700B (zh)
AR (2) AR065639A1 (zh)
AU (1) AU2008203574B2 (zh)
BR (1) BRPI0806262A2 (zh)
CA (1) CA2674538C (zh)
DK (1) DK2114438T3 (zh)
ES (1) ES2394121T3 (zh)
HK (1) HK1136504A1 (zh)
IL (1) IL199566A (zh)
MX (1) MX2009007267A (zh)
MY (1) MY164479A (zh)
NZ (1) NZ577812A (zh)
PT (1) PT2114438E (zh)
RU (1) RU2436589C2 (zh)
TW (1) TWI413528B (zh)
WO (1) WO2008082274A1 (zh)
ZA (1) ZA200904337B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI773699B (zh) * 2016-10-27 2022-08-11 比利時商健生藥品公司 免疫球蛋白及其用途
US11530249B2 (en) 2017-09-28 2022-12-20 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting conjugates of GLP-2 derivatives

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US8110665B2 (en) * 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
RU2483081C2 (ru) * 2008-07-23 2013-05-27 Ханми Сайенс Ко.,Лтд.,Kr Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами
WO2010118384A2 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Amylin agonist compounds for estrogen-deficient mammals
US9194011B2 (en) 2009-11-17 2015-11-24 Protalix Ltd. Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
MX2012005912A (es) 2009-11-23 2012-10-05 Amylin Pharmaceuticals Inc Conjugado de polipeptido.
JP5758920B2 (ja) * 2010-03-02 2015-08-05 プロタリクス リミテッド 安定化α−ガラクトシダーゼおよびその使用
WO2011107494A1 (de) 2010-03-03 2011-09-09 Sanofi Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
KR101324828B1 (ko) * 2010-06-08 2013-11-01 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
US8933024B2 (en) 2010-06-18 2015-01-13 Sanofi Azolopyridin-3-one derivatives as inhibitors of lipases and phospholipases
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
ES2563091T3 (es) 2010-09-28 2016-03-10 Amylin Pharmaceuticals, Llc Polipéptidos modificados genéticamente que tienen duración de acción potenciada
WO2012050930A2 (en) 2010-09-28 2012-04-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc Engineered polypeptides having enhanced duration of action
JP2014521594A (ja) * 2011-05-25 2014-08-28 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 長持続期間デュアルホルモンコンジュゲート
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
PE20140765A1 (es) 2011-06-10 2014-06-14 Hanmi Science Co Ltd Derivados de oxintomodulina novedosos y composicion farmaceutica para tratar la obesidad que comprende los mismos
ES2710356T3 (es) 2011-06-17 2019-04-24 Hanmi Science Co Ltd Conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y uso del mismo
CN104271588B (zh) 2011-07-08 2017-10-10 安米林药品有限责任公司 具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的多肽
WO2013009539A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
CN103172745A (zh) * 2011-12-21 2013-06-26 北京韩美药品有限公司 包含免疫球蛋白Fc片段的长效人内皮抑素
KR101895047B1 (ko) * 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
KR102041412B1 (ko) 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR101665009B1 (ko) * 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
AR092862A1 (es) 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
US10441665B2 (en) 2012-07-25 2019-10-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long acting insulinotropic peptide conjugate
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
US20150297573A1 (en) 2012-10-24 2015-10-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) TPL2 KINASE INHIBITORS FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES AND FOR PROMOTING Beta-CELL SURVIVAL
PH12018501454A1 (en) * 2012-11-06 2020-02-17 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglubin fragment
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
KR20140088837A (ko) 2013-01-03 2014-07-11 한미약품 주식회사 Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체
PE20151409A1 (es) * 2013-02-26 2015-10-07 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Analogo de insulina novedoso y su uso
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
CN116987172A (zh) 2014-01-20 2023-11-03 韩美药品株式会社 长效胰岛素及其用途
CA2944138C (en) * 2014-03-31 2023-06-20 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) * 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
US20160151511A1 (en) * 2014-12-02 2016-06-02 Antriabio, Inc. Proteins and protein conjugates with increased hydrophobicity
MA40709B1 (fr) 2014-12-30 2019-07-31 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Dérivé du glucagon à stabilité améliorée
KR102418477B1 (ko) 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
EP3273981B1 (en) 2015-03-24 2020-04-29 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method and pharmaceutical composition for use in the treatment of diabetes
DK3322437T3 (da) 2015-06-30 2024-03-25 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Glukagonderivat og en sammensætning omfattende et langtidsvirkende konjugat af samme
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
CN108136276B (zh) 2015-09-24 2023-02-28 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白片段的特异性位点进行连接的蛋白质复合物
TN2018000231A1 (en) 2015-12-31 2019-10-04 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Long-acting conjugate of triple glucagon/glp-1/gip receptor agonist
EP3479841A4 (en) 2016-06-29 2020-03-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. GLUCAGON DERIVATIVE, CONJUGATE THEREOF, COMPOSITION COMPRISING SAME, AND THERAPEUTIC USE THEREOF
TWI774694B (zh) 2016-09-23 2022-08-21 南韓商韓美藥品股份有限公司 具有降低對胰島素受體之親和力之胰島素類似物及其用途
EP3549950A4 (en) 2016-12-05 2020-08-19 Hanmi Pharm. Co., Ltd. CONJUGATE WITH MITIGATED IMMUNE RESPONSE
CN110545849A (zh) * 2017-02-03 2019-12-06 韩美药品株式会社 具有增加的持续性的生理活性物质的缀合物及其应用
KR101941975B1 (ko) 2017-03-17 2019-01-25 고려대학교 산학협력단 Atpif1을 함유하는 당뇨 치료용 약학조성물
CA3054899A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
CN111406073A (zh) 2017-09-29 2020-07-10 韩美药品株式会社 具有提高功效的持久性蛋白质缀合物
WO2022266467A2 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Recombinant histone polypeptide and uses thereof
KR20230000682A (ko) 2021-06-25 2023-01-03 한미약품 주식회사 심혈관 질환 또는 신장 기능장애 발생의 위험을 감소시키기 위한 에페글레나타이드

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
WO2005047344A1 (de) * 2003-11-07 2005-05-26 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von polymerisatpulvern aus wässrigen polymerisatdispersionen
WO2006107124A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Immunoglobulin fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
US5705483A (en) 1993-12-09 1998-01-06 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods
US5424686A (en) 1994-04-20 1995-06-13 Philips Electronics North America Corporation Negative-resistance-compensated microwave buffer
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US7157555B1 (en) * 1997-08-08 2007-01-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Exendin agonist compounds
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
KR20040074587A (ko) 2001-02-19 2004-08-25 메르크 파텐트 게엠베하 감소된 면역원성을 갖는 인공 단백질
US7790681B2 (en) * 2002-12-17 2010-09-07 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of cardiac arrhythmias with GLP-1 receptor ligands
DK1605897T3 (da) 2003-03-19 2012-08-20 Lilly Co Eli Polyethelen-glycol-link-glp-1-forbindelser
CN101974090B (zh) * 2003-06-12 2015-06-17 伊莱利利公司 Glp-1类似物融合蛋白质
PT2256134E (pt) * 2003-11-13 2014-03-05 Hanmi Science Co Ltd Fragmento fc de igg para um veículo de fármaco e método para a preparação do mesmo
JP2006514649A (ja) * 2003-12-17 2006-05-11 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 腎症の治療および予防のための組成物
BRPI0417684A (pt) 2003-12-18 2007-03-20 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
US7638299B2 (en) * 2004-07-21 2009-12-29 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
AU2005319432A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion protein formulations
US20080207505A1 (en) 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
SI1881850T1 (sl) 2005-05-13 2011-01-31 Lilly Co Eli Glp-1 pegilirane spojine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046227A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
WO2005047344A1 (de) * 2003-11-07 2005-05-26 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von polymerisatpulvern aus wässrigen polymerisatdispersionen
WO2006107124A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Immunoglobulin fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI773699B (zh) * 2016-10-27 2022-08-11 比利時商健生藥品公司 免疫球蛋白及其用途
US11530249B2 (en) 2017-09-28 2022-12-20 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting conjugates of GLP-2 derivatives
TWI794897B (zh) * 2017-09-28 2023-03-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 Ｇｌｐ-２衍生物之長效接合物
TWI795443B (zh) * 2017-09-28 2023-03-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 Ｇｌｐ-２衍生物之長效接合物

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110092253A (ko) 2011-08-17
CN103435699A (zh) 2013-12-11
HK1136504A1 (zh) 2010-07-02
CN101646451A (zh) 2010-02-10
CN101646451B (zh) 2014-03-26
RU2009129953A (ru) 2011-02-10
KR20080064750A (ko) 2008-07-09
EP2114438B8 (en) 2012-10-03
DK2114438T3 (da) 2012-12-17
EP2114438A1 (en) 2009-11-11
PT2114438E (pt) 2012-10-11
CN103435699B (zh) 2015-04-15
ES2394121T3 (es) 2013-01-21
EP2114438A4 (en) 2010-09-01
TW200930408A (en) 2009-07-16
US20100105877A1 (en) 2010-04-29
RU2436589C2 (ru) 2011-12-20
CN103435700A (zh) 2013-12-11
CA2674538A1 (en) 2008-07-10
BRPI0806262A2 (pt) 2011-08-30
CN103435700B (zh) 2015-12-23
AU2008203574B2 (en) 2011-12-01
IL199566A (en) 2016-09-29
ZA200904337B (en) 2010-10-27
MX2009007267A (es) 2009-11-11
MY164479A (en) 2017-12-29
US8476230B2 (en) 2013-07-02
KR101058315B1 (ko) 2011-08-22
EP2114438B1 (en) 2012-08-29
AR065639A1 (es) 2009-06-17
KR20100061786A (ko) 2010-06-09
AU2008203574A1 (en) 2008-07-10
WO2008082274A1 (en) 2008-07-10
JP2008169195A (ja) 2008-07-24
JP2010515677A (ja) 2010-05-13
AR110853A2 (es) 2019-05-08
KR101058290B1 (ko) 2011-08-22
CA2674538C (en) 2013-12-17
JP5399265B2 (ja) 2014-01-29
NZ577812A (en) 2012-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI413528B (zh) 使用免疫球蛋白片段的促胰島素複合物
JP7341263B2 (ja) オキシントモジュリン誘導体を含む糖尿病又は肥満性糖尿病の治療用組成物
JP6231522B2 (ja) 免疫グロブリン断片を用いたインスリン薬物結合体
EP3248611B1 (en) Novel long-acting glucagon conjugate and pharmaceutical composition comprising the same for the prevention and treatment of obesity
US20080124347A1 (en) Insulinotropic peptide conjugate using carrier substance
US20180271995A1 (en) A protein conjugate comprising multiple physiologically active polypeptides and an immunoglobulin fc region
US20090238838A1 (en) Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
JP6336394B2 (ja) 生理活性ポリペプチド複合体の製造方法
TW202235101A (zh) 包含長效胰島素類似物接合物及長效促胰島素肽接合物之治療糖尿病組成物
KR20080098216A (ko) 캐리어 물질을 이용한 나트륨 배설 펩타이드 약물 결합체
TW201340981A (zh) 用於預防或治療非酒精性脂肪肝疾病之醫藥組合物
US10744187B2 (en) Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
KR20120043208A (ko) 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
KR20120043205A (ko) 면역글로불린 단편을 이용한 글루카곤 유사 펩타이드?２（ｇｌｐ?２）약물 결합체
KR20190062332A (ko) 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법