TWI413527B - 抗ｖｅｇｆｒ－３抗體組合物 - Google Patents

抗ｖｅｇｆｒ－３抗體組合物 Download PDF

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Description

抗VEGFR-3抗體組合物
本發明係有關與血管內皮生長因子受體-3(VEGFR-3)特異性結合之抗體，本文特定言之提供抗VEGFR-3抗體之胺基酸及核酸序列、醫藥組合物、及該等抗體在治療由VEGFR-3介導之醫學病狀之方法中的用途。
咸信內皮細胞特異性生長因子及受體主要負責刺激內皮細胞生長、分化以及某些細胞功能。1個經廣泛研究之生長因子家族包含血管內皮生長因子(VEGF)。
VEGFR-3為於正常成人組織中之表現主要侷限於淋巴內皮的唯一受體酪胺酸激酶(RTK)。新生VEGF-C及VEGF-D與VEGFR-3特異性結合。蛋白水解裂解此等蛋白之N端及C端區會釋放成熟VEGF-CΔNΔC 及VEGF-DΔNΔC ，其獲得對VEGFR-3增加之親和力。此等配位體活化VEGFR-3信號傳導且起始淋巴血管生成(lymphangiogenesis)(亦即自預先存在之淋巴血管形成新淋巴血管)。
VEGFR-3之配位體之表現樣式表明其不僅涉及於正常血管系統之發展及維持中而且亦涉及於腫瘤血管生成及淋巴血管生成中。另外，已在腫瘤內之血液毛細管上偵測到VEGFR-3表現。因此，抑制VEGF-C及/或VEGF-D與VEGFR-3之結合的單株抗體(mAb)有可能抑制腫瘤血管生成。
此外，阻斷VEGFR-3活性已顯示會抑制VEGF-C增強之腫瘤淋巴血管生成。在許多類型之癌症中，轉移之第一部位為淋巴結且因此阻斷VEGFR-3有可能抑制腫瘤轉移。
Persaud等人,J. Cell Science117 :2745-56(2004)描述一種人類抗VEGFR-3單株抗體之某些性質，但既未揭示任何此等抗體之序列，亦未揭示此等抗體可結合之抗原決定基。因此，仍然需要結合VEGFR-3內之新穎抗原決定基且能夠阻斷配位體結合及受體活化之高親和力抗VEGFR-3抗體。另外，仍然需要能夠顯示對抗多種腫瘤類型之抗腫瘤功效而無顯著負面副作用之抗VEGFR-3抗體。
本發明提供一種與人類VEGFR-3結合之抗體或其抗原結合部分，其中：
a)藉由使人類VEGFR-3之Pro-219單一突變成Leu而使該抗體與人類VEGFR-3之結合降低至少90%；及
b)藉由使人類VEGFR-3之Val-175單一突變成Ala而使該抗體與人類VEGFR-3之結合降低至少50%。
較佳地，藉由以下方式檢定該抗體或其抗原結合片段與人類VEGFR-3或突變VEGFR-3之間的結合程度：以與鹼性磷酸酯酶之融合蛋白形式表現人類VEGFR-3或突變VEGFR-3之可溶性細胞外域，且接著使用鹼性磷酸酯酶化學發光檢定測定能夠與該抗體結合之各融合蛋白的量。
本發明另外提供一種包含本發明抗體或其抗原結合部分以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。
此外，本發明提供一種包含本發明抗體或其抗原結合部分以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑且視情況含有至少一種其他治療成分的醫藥組合物。
本發明亦提供一種用作藥劑之本發明抗體或其抗原結合部分。
本發明另外提供一種用於治療或預防卵巢癌、人類紅白血病(erythroleukaemia)、頭頸癌(head and neck cancer)、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、結腸癌及淋巴結轉移之本發明抗體或其抗原結合部分。
本發明另外提供一種治療哺乳動物之選自由卵巢癌、人類紅白血病、頭頸癌、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、結腸癌及淋巴結轉移組成之群之癌症的方法，其包含向需要此治療之哺乳動物投與有效量之本發明抗體或其抗原結合部分。
本發明另外提供一種抗體或其抗原結合部分用於製造用以治療癌症之藥劑的用途，該癌症選自由以下組成之群：卵巢癌、人類紅白血病、頭頸癌、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、結腸癌及淋巴結轉移。
本發明亦提供一種與適於在療法中同時、各別或依序使用之選自順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及多西他賽(docetaxel)之另一抗癌藥劑組合的本發明抗體或其抗原結合部分。
本發明另外提供一種治療哺乳動物之選自由卵巢癌、人類紅白血病、頭頸癌、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、結腸癌及淋巴結轉移組成之群之癌症的方法，其包含向有需要之患者投與本發明抗體或其抗原結合部分與選自順鉑、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸、奧沙利鉑及多西他賽之另一抗癌藥劑的治療有效組合。
本發明抗體結合哺乳動物VEGFR-3之第二免疫球蛋白(Ig)樣域。人類VEGFR-3之第二Ig樣域對應於全長受體之殘基138至226。參見Pajusola等人, Cancer Res.52 :5738-5743(1992)。
術語「哺乳動物/人類/小鼠VEGFR-3之第二Ig樣域」(及其變化形式)意欲涵蓋該域之天然存在之形式(例如自在正常條件下表現該域之細胞純化而來)以及例如由天然存在或合成的點突變體編碼之重組形式或其截短形式。
本發明抗體結合人類VEGFR-3之第二Ig樣域中之抗原決定基，其中P219為該抗原決定基之主要組分，V175為該抗原決定基之次要組分且L221為該抗原決定基之小組分。(此等殘基之編號與全長人類VEGFR-3一致，如Pajusola等人(同上)及EMBL資料庫(寄存編號X 68203)中所報導)。此研究結果係部分基於以下觀測結果：在人類VEGFR-3中包括V175A或P219L或L221V(亦即取代直系同源鼠類VEGFR-3殘基)之突變會消除或顯著降低本發明抗體與突變人類VEGFR-3之結合。
此外，結合人類VEGFR-3中之抗原決定基(其中P219為該抗原決定基之主要組分，V175為該抗原決定基之次要組分且L221為該抗原決定基之小組分)之本發明抗體能夠阻斷配位體VEGF-C與VEGFR-3之結合，且因此中和受體活性。因此，本發明提供一種在人類VEGFR-3上的新穎中和抗原決定基，其可以產生針對人類VEGFR-3之新穎中和抗體，能夠阻斷人類VEGF-C與受體結合。因此，本發明提供一種人類VEGFR-3之抗原決定基，其中P219為該抗原決定基之主要組分，V175為該抗原決定基之次要組分且L221為該抗原決定基之小組分。
本發明亦提供一種結合人類VEGFR-3之包含胺基酸殘基P219及V175之抗原決定基的抗體或其抗原結合部分。較佳地，本發明亦提供一種結合人類VEGFR-3之包含胺基酸P219、V175及L221之抗原決定基的抗體或其抗原結合部分。該種抗原決定基會與本發明抗體(例如抗體1)結合，且因此本發明亦提供一種如同具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15之輕鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 16之重鏈的抗體一樣，會與人類VEGFR-3之相同抗原決定基反應的抗體或其抗原結合部分。如同本發明之某些抗體(例如抗體1)一樣，與人類VEGFR-3之相同抗原決定基反應的抗體將競爭結合人類VEGFR-3，且因此本發明亦提供一種與具有包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15之輕鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 16之重鏈的抗體競爭結合人類VEGFR-3的抗體或其抗原結合部分。
較佳地，本發明抗體亦與具有如SEQ ID NO: 20所示之序列(其包括突變L219P)之突變小鼠VEGFR-3及具有如SEQ ID NO: 21所示之序列(其包括突變A175V)之突變小鼠VEGFR-3結合，其中當相較於與野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO: 19)之結合時，與具有如SEQ ID NO: 20所示之序列之突變小鼠VEGFR-3的結合增加50倍以上；且當相較於與野生型小鼠VEGFR-3之結合時，與具有如SEQ ID NO: 21所示之序列之突變小鼠VEGFR-3的結合增加10倍以上。
較佳地，藉由以下方式檢定該抗體或其抗原結合片段與野生型小鼠VEGFR-3或突變小鼠VEGFR-3之間的結合程度：以與鹼性磷酸酯酶之融合蛋白形式表現野生型小鼠VEGFR-3或突變小鼠VEGFR-3之可溶性細胞外域，且接著使用鹼性磷酸酯酶化學發光檢定測定能夠與該抗體結合之各融合蛋白的量。
較佳地，本發明抗體或其抗原結合部分對人類VEGFR-3具有高親和力。舉例而言，如藉由在20℃下於2000生物感測器上進行之表面電漿子共振所量測，抗體或其抗原結合部分對人類VEGFR-3之K d 介於1×10-9 M與5.6×10-11 M之間。更佳地，如藉由在20℃下於2000生物感測器上進行之表面電漿子共振所量測，抗體或其抗原結合部分對人類VEGFR-3之K d 介於1×10-10 M與5.6×10-11 M之間。
較佳地，本發明提供一種可抑制人類VEGF-CΔNΔC 與人類VEGFR-3結合之IC50 介於2 nM與1.3 nM之間的抗VEGFR-3抗體或其抗原結合部分。
較佳地，本發明提供一種可抑制VEGF-CΔNΔC 刺激之促細胞有絲***反應(mitogenic response)之IC50 介於10 nM與5 nM之間的抗VEGFR-3抗體或其抗原結合部分。更佳地，該抗體或其抗原結合部分在如實例5中所述之檢定中抑制VEGF-CΔNΔC 所刺激促細胞有絲***反應的IC50 介於8 nM與5 nM之間，最佳介於6 nM與5 nM之間。
較佳地，本發明提供一種結合人類VEGFR-3且包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合部分，其中該LCVR包含互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1包含胺基序列SEQ ID NO: 1，LCDR2包含多肽SEQ ID NO: 2，LCDR3包含多肽SEQ ID NO: 3，HCDR1包含多肽SEQ ID NO: 6，HCDR2包含多肽SEQ ID NO: 7且HCDR3包含多肽SEQ ID NO: 8。
更佳地，本發明提供一種結合人類VEGFR-3且包含LCVR多肽SEQ ID NO: 5及HCVR多肽SEQ ID NO: 10之抗體或其抗原結合部分。
更佳地，本發明提供一種結合人類VEGFR-3且包含含有多肽SEQ ID NO: 15之輕鏈及含有多肽SEQ ID NO: 16之重鏈的抗體或其抗原結合部分。
更佳地，本發明提供一種結合人類VEGFR-3且包含2條包含多肽SEQ ID NO: 15之輕鏈及2條包含多肽SEQ ID NO: 16之重鏈的抗體或其抗原結合部分。
較佳地，本發明提供一種與本發明抗體競爭結合人類VEGFR-3之抗體或其抗原結合部分。
較佳地，本發明提供一種作為人類抗體之抗體或其抗原結合部分。
較佳地，本發明提供一種作為人類工程改造抗體之抗體或其抗原結合部分。
定義
如本文所用之術語「抗體」意欲指代可為完全人類抗體或人類工程改造抗體之單株抗體以及其保留與人類VEGFR-3之第二Ig樣域結合之能力的消化片段、指定部分及變異體，包括抗體模擬物、模擬抗體或其指定片段或部分之結構及/或功能之抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。舉例而言，由本發明所涵蓋之能夠特異性結合人類VEGFR-3之第二Ig樣域的抗體片段包括Fab片段(例如藉由木瓜蛋白酶(papain)消化)、Facb片段(例如藉由纖維蛋白溶酶(plasmin)消化)、F(ab')2 片段(例如藉由胃蛋白酶(pepsin)消化)及藉由分子生物學技術產生之二硫化物穩定之可變片段(dsFv)或單鏈可變片段(scFv)。抗體片段亦意欲包括例如保留與人類VEGFR-3之第二Ig樣域結合之能力的域缺失抗體、微型雙功能抗體及微型三功能抗體。
抗體包括包含4條多肽鏈(即由雙硫鍵相互連接之2條重(H)鏈及2條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子。各重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR)及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有3個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中縮寫為LCVR)及輕鏈恆定區。來自任何脊椎動物物種之抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為稱為κ及λ之兩種明顯不同的類型之一。如本文所用之表述LCVR意欲包括來自κ型輕鏈之可變區(Vκ)與來自λ型輕鏈之可變區(Vλ)兩者。輕鏈恆定區包含一個域CL。HCVR及LCVR區包括稱為互補決定區(CDR)之序列高變區，其間散佈有稱為構架區(FR)之較保守的區域。各HCVR及LCVR由3個CDR及4個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。出於本發明之目的，LCVR CDR縮寫為LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR CDR縮寫為HCDR1、HCDR2及HCDR3。
視抗體重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，抗體可歸為不同種類。有5個主要完整抗體種類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。此等種類中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於抗體之不同種類之重鏈恆定域分別稱為α、Δ、ε、γ及μ。熟知不同種類之免疫球蛋白之次單位結構及三維組態。本發明包括屬於任何以上提及之種類或子類(同型)之抗體。
如本文所用，「單株抗體」係指自實質上均質的抗體之群體獲得之抗體，例如除可能天然存在之突變或可能存在之較少轉譯後變異之外，構成該群體之個別抗體實質上相同。單株抗體具有高度特異性，係針對單一抗原位點(亦稱為決定子或抗原決定基)，如本文所教示，該抗原位點含於哺乳動物VEGFR-3之第二Ig樣域中。此外，與通常包括針對不同決定子之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示抗體係自實質上均質之抗體群體獲得之特性，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。
如本文所用，「人類抗體」係指具有對應於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體(如Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號中所述)。如本文所用之術語「人類抗體」不意欲包括源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
本發明之範疇內包括對如本文揭示之抗體1之胺基酸序列的修改，特定言之與抗體之結合親和力及/或其他生物性質改良有關。在此情形下，如本文所用之術語「人類工程改造抗體」係指功能性質與抗體1類似(例如能夠在包含P219及V175之抗原決定基處結合人類VEGFR-3)且圍繞源於抗體1之CDR之構架區實質上或完全來自人類的其他抗體。在本發明之情形下，實質上的人類構架為與抗體1之構架區具有至少80%序列一致性之構架。較佳地，此等實質上的人類構架與抗體1之構架區之序列一致性為至少約85%、約90%、約95%或約99%。人類生殖系序列描述於WO 2007/044411中。舉例而言，生殖系輕鏈構架可選自由以下組成之群：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2及O8，且生殖系重鏈構架區可選自由以下組成之群：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH I-18、VH I-69、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59及VH5-5I。
源於抗體1之人類工程改造抗體可包括在抗體1之序列內缺失及/或***及/或取代殘基。然而，最終構築體必須保留抗體1之所要功能特徵(例如在包含P219及V175之抗原決定基處結合人類VEGFR-3之能力)。
功能性質與抗體1類似之人類工程改造抗體可使用若干不同方法來產生，其中各方法皆以抗體1(亦即具有分別如SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 10所示之LCVR及HCVR序列之抗體)作為模板或親本抗體起始以製備其他抗體。在第一方法中，將抗體1之CDR移植入與抗體1之構架區具有高序列一致性的不同人類構架中。新構架與抗體1中之相應構架之序列一致性將通常為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。相較於抗體1，此移植可使結合親和力降低。若為此種情況，則可基於由Queen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,2869(1991)公開之特定準則在某些位置處使構架回復突變成抗體1之構架。考慮進行回復突變之殘基之鑑別可如下進行：當胺基酸屬於任何以下類別時，所使用之人類生殖系序列之構架(接受體構架)胺基酸經來自抗體1之構架(供體構架)之構架胺基酸置換：
(a)接受體構架之人類構架區中之胺基酸在彼位置處對於人類構架而言為異常的，而抗體1中之相應胺基酸在彼位置處對於人類構架而言為典型的；
(b)胺基酸之位置緊密鄰近於1個CDR；或
(c)在三維免疫球蛋白模型中，構架胺基酸之任何側鏈原子在CDR胺基酸之任何原子之約5至6埃(angstrom)(中心至中心)內。
當接受體構架之人類構架區中之胺基酸及抗體1構架中之相應胺基酸各自在彼位置處對於人類構架而言為異常時，該種胺基酸可經在彼位置處對於人類構架而言為典型之胺基酸置換。此等回復突變準則可實現恢復抗體1活性。
在第二方法中，源於抗體1之保留抗體1之功能性質(例如在包含P219及V175之抗原決定基處結合人類VEGFR-3之能力)的人類工程改造抗體可藉由使抗體1之CDR突變(隨機地或以偏向方式以避免胺基酸碼之簡併性)，同時保留抗體1之構架區來產生。較佳地，源於抗體1之人類工程改造抗體之CDR的胺基酸序列突變(缺失、***及/或取代)限於當相較於抗體1之CDR序列時，人類工程改造抗體之CDR序列中最多有3個突變、更佳有2個突變或最佳為單一突變。當存在1個以上突變時，突變可以多種不同方式跨越CDR序列分佈。舉例而言，所有突變可存在於單一CDR序列(例如LCDR1)中，各突變可存在於不同CDR序列中，或2個突變可見於1個CDR序列中且第三突變可見於另一CDR序列中。此導致產生人類工程改造抗體之組合文庫，其中如上所述在一或多個位置處CDR序列發生突變，同時保留抗體1之構架區。可篩檢該文庫中之當相較於抗體1時，功能性質類似或改良之其他變異體。
產生源於抗體1(且保留抗體1之功能性質，例如在包含P219及V175之抗原決定基處結合人類VEGFR-3之能力)之人類工程改造抗體的另一方法為組合上述2種方法且對構架與CDR兩者作改變。換言之，在將抗體1之CDR移植入不同構架中之後，除對CDR作改變之外，亦可使特定構架殘基回復突變。此方法之一般原理描述於Wu等人(1999),J. Mol. Biol. 294: 151-162中。
胺基酸變化亦會改變人類工程改造抗體之轉譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
取代變異體可藉由取代抗體1之一或多個高變區殘基來產生。一種產生取代變異體之此方法稱為使用噬菌體呈現之親和力成熟法。使若干高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點處產生所有可能的胺基取代。由此產生之抗體變異體以單價方式呈與封裝在各粒子內之M13之基因III產物的融合物形式自絲狀噬菌體粒子呈現。接著篩檢噬菌體呈現之變異體的如本文所揭示之生物活性(例如結合親和力)。
本文揭示之檢定可用於篩檢源於抗體1之人類工程改造抗體以鑑別具有如本文揭示之活體外及活體內功能之彼等抗體。
本發明抗體可為經分離抗體。經分離抗體實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文所用之術語「抗原決定基」係指抗原表面上之能夠引發免疫反應且與由該種反應而產生之特定抗體結合的特定分子區域。抗原決定基可為線性抗原決定基(亦即由皆含於單一的一段短序列內之鄰接胺基酸殘基構成)或其可為構形抗原決定基(亦即由在抗原之線性序列之不同部分中，但一旦抗原呈現其適當二級及三級結構即聚集在一起以形成抗體結合位點的胺基酸殘基構成)。通常，抗原決定基由少數(例如2至5個)關鍵胺基酸殘基構成且破壞彼等殘基(例如藉由突變成不同胺基酸殘基)會導致抗原與抗原決定基之間的結合顯著降低或甚至完全消除。
與本文揭示之分子「競爭」之抗體或其抗原結合片段為在與本發明分子所結合之位點相同或重疊的位點處結合人類VEGFR-3的抗體或其抗原結合片段。競爭性人類工程改造抗體或其抗原結合片段可例如經由抗體競爭檢定來鑑別。舉例而言，經純化或部分純化之人類VEGFR-3之樣品與固體支撐物結合。接著添加本發明抗體及測試單株抗體或抗原結合片段，其中測試抗體或本發明抗體經標記。若經標記抗體及未標記抗體與VEGFR-3上之各別及分散位點結合，則無論是否存在所推測之競爭性抗體，經標記抗體皆將在相同程度上結合。然而，若相互作用位點相同或重疊，則未標記抗體將競爭，且與抗原結合之經標記抗體之量將降低。若未標記抗體過量存在，則無經標記抗體將結合。出於本發明之目的，競爭性人類工程改造抗體或其抗原結合片段為使本發明抗體之結合減少約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%之人類工程改造抗體或其抗原結合片段。關於進行此等競爭檢定之程序之詳情在此項技術中為熟知的且可見於例如Harlow及Lane(1988)Antibodies ,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,第567-569頁,ISBN 0-87969-314-2中。此等檢定可藉由使用經純化抗體而具定量性。藉由相對於自身滴定一種抗體(亦即相同抗體用於標記與競爭劑兩者)來建立標準曲線。以滴定法測定未標記競爭性單株抗體或其抗原結合片段抑制經標記分子與板結合之能力。對結果繪圖，且比較為達成所要結合抑制程度所必需之濃度。
人類VEGFR-3以由長度不同之mRNA轉錄物產生之2種形式存在。當相較於由較短轉錄物編碼之蛋白時，較長轉錄物編碼在C端處含有65個額外胺基酸殘基之蛋白，其中較長蛋白為在組織中偵測之主要形式。2個變異體之N端細胞外域相同。除非另有陳述，否則術語「人類VEGFR-3」係指野生型人類VEGFR-3之由替代mRNA轉錄物獲得之兩種變異體(亦即SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18)。
抗體1之LCVR區之核酸及相應胺基酸序列分別指定為SEQ ID NO: 4及5。
抗體1之HCVR區之核酸及相應胺基酸序列在本文中分別指定為SEQ ID NO: 9及10。
抗體1之輕鏈之核酸及相應胺基酸序列在本文中分別指定為SEQ ID NO: 11及12。SEQ ID NO: 12之胺基酸殘基1-19構成適用於自各種哺乳動物宿主細胞株表現及提取輕鏈但不存在於成熟抗體中之分泌序列。抗體1之成熟輕鏈之胺基酸序列在本文中指定為SEQ ID NO: 15。
抗體1之重鏈之核酸及相應胺基酸序列分別指定為SEQ ID NO: 13及14。如在輕鏈序列之情況下，SEQ ID NO: 14之胺基酸殘基1-19構成適用於自各種哺乳動物宿主細胞株表現及提取重鏈但不存在於成熟抗體中之分泌序列。抗體1之成熟重鏈之胺基酸序列在本文中指定為SEQ ID NO: 16。
抗體之特異性可基於親和力及/或親合力測定。由抗原與抗體解離之平衡常數(K d )表示的親和力衡量抗原決定子與抗體結合位點之間的結合強度。親合力為抗體與其抗原之間的結合強度之量度。親合力與抗原決定基與其在抗體上之抗原結合位點之間的親和力及抗體價數兩者相關，抗體價數係指特定抗原決定基之抗原結合位點之數目。K d 值愈小，抗原決定子與抗體結合位點之間的結合強度愈強。
本發明亦提供一種編碼本發明抗體之重鏈的聚核苷酸(例如抗體1-SEQ ID NO: 13)；或包含本發明抗體(例如抗體1)之任一VH區或其一部分或任一VHCDR(包括其任何變異體)的聚核苷酸。本發明亦提供一種編碼本發明抗體之輕鏈的聚核苷酸(例如抗體1-SEQ ID NO: 11)；或包含本發明抗體(例如抗體1)之任一VL區或其一部分或任一VH CDR(包括其任何變異體)的聚核苷酸。
本發明亦包括包含本文所述之任何聚核苷酸之表現載體。例示性載體包括質體、噬菌粒、黏質體、病毒及噬菌體核酸或能夠在原核或真核宿主(諸如細胞，例如哺乳動物細胞)中複製之其他核酸分子。典型表現載體含有適用於調控本發明核酸分子表現的轉錄及轉譯終止子、起始序列及啟動子。載體亦可含有遺傳表現卡匣，其含有獨立終止子序列、允許載體在真核生物與原核生物兩者中複製之序列(亦即穿梭載體(shuttle vector))及用於原核系統與真核系統兩者之選擇標記。載體通常含有標記，以提供表型性狀，諸如賦予對諸如安比西林(ampicillin)或新黴素(neomycin)之抗生素之抗性，供選拔經轉型宿主。
合適啟動子包括組成性啟動子及誘導性啟動子。代表性表現控制序列/啟動子包括lac 系統、trp 系統、tac 系統、trc 系統、噬菌體λ之主要操縱子及啟動子區、fd 鞘蛋白之控制區、酵母之糖解啟動子(例如3-磷酸甘油酸酯激酶之啟動子)、酵母酸性磷酸酯酶之啟動子(例如Pho5 )、酵母α交配因子之啟動子、源於人類細胞巨大病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳腺腫瘤病毒啟動子、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、多角體蛋白(polyhedrin)啟動子及源於多瘤、腺病毒、反轉錄病毒及猿猴病毒(simian virus)之啟動子，例如SV40之早期及晚期啟動子。
本發明亦包括含有本發明之聚核苷酸或載體之非人類宿主，諸如細胞。「宿主」意謂非人類多細胞有機體或「宿主細胞」，其係指已引入有本發明之聚核苷酸或載體之細胞或細胞群體。本發明之宿主細胞可為真核細胞或細胞株，諸如植物、動物、脊椎動物、哺乳動物、齧齒動物、小鼠、靈長類動物或人類細胞或細胞株。合適真核細胞包括酵母及其他真菌、昆蟲細胞、植物細胞、人類細胞及動物細胞，包括哺乳動物細胞，諸如融合瘤株系、COS細胞、NS0細胞及CHO細胞。「宿主細胞群體」意謂可引入且表現有本發明之聚核苷酸或載體之一組培養細胞。意欲包括將支持本發明之聚核苷酸或載體之表現的任何宿主細胞。
本發明之宿主亦可為原核宿主。適合原核宿主包括例如大腸桿菌(E. coli )，諸如大腸桿菌SG-936、大腸桿菌HB 101、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌X2282、大腸桿菌DHI及大腸桿菌MRC1；假單胞菌屬(Pseudomonas )；桿菌屬(Bacillus )，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis )；及鏈黴屬(Streptomyces )。
本發明亦包括產生本發明抗體之方法，其需要培養表現一或多種編碼本發明抗體之聚核苷酸之宿主細胞，及自培養基回收該抗體。
本發明抗體可用作人類醫學中之藥劑，藉由多種途徑投與。最佳地，包含本發明抗體之醫藥組合物適於非經腸投藥。此等醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之方法(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy ,第19版(1995),A. Gennaro等人,Mack Publishing Co.)製備且包含如本文揭示之抗體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
如本文所用，關於本發明抗體之生物活性之術語「抑制」或「中和」意謂能夠實質上拮抗、阻止、防止、制止、減緩、破壞、消除、終止、降低或逆轉人類VEGFR-3之生物活性，包括(但不限於)如本文實例4或5中量測之人類VEGFR-3生物活性。
如本文所用，術語「治療」係指治療性治療，其中目標在於防止或延緩(減少)與疾病或病症相關之不合需要的生理變化。有益或所要臨床結果包括減輕症狀、減弱疾病或病症程度、穩定疾病或病症(亦即其中疾病或病症不惡化)、延遲或減緩疾病或病症進展、改善或緩和疾病或病症、及緩解(部分或完全)疾病或病症，無論可偵測或不可偵測皆然。「治療」亦可意謂相較於若不接受治療則所預期的存活期，使存活期延長。需要治療者包括已患有疾病或病症者以及傾向於患有疾病或病症者。
本發明組合物可包括「治療有效量」之本發明抗體。「治療有效量」係指在必需劑量下及在必需時段內可有效地達成所要治療結果之量。抗體之治療有效量可視諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及重量以及抗體或抗體部分在個體中引發所要反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效應勝過任何有毒或有害效應的量。
療法可為單獨或與其他治療組合之「第一線」療法，亦即作為尚未採用先前抗癌治療之患者的初始治療；或單獨或與其他治療組合之「第二線」療法，作為己採用一種先前抗癌治療方案之患者的治療；或作為單獨或與其他治療組合之「第三線」、「第四線」等治療。
療法亦可給與已採用已部分成功但不耐受特定治療之先前治療的患者。療法亦可作為輔助治療給與，亦即防止當前無可偵測疾病之患者中或手術移除腫瘤之後的患者中復發癌症。
利用本發明治療之癌症包括原發性腫瘤及已經由淋巴系統轉移之繼發性或轉移性腫瘤(包括自肺、***或***轉移之腫瘤)。
可被治療之癌症包括未血管化或尚未實質上血管化之腫瘤以及血管化腫瘤。癌症可包含非實體腫瘤(諸如白血病及淋巴瘤)或可為實體腫瘤。
欲用本發明抗體治療之癌症類型包括卵巢癌、人類紅白血病、頭頸癌、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌及結腸癌。另外，鑒於VEGF-C/VEGFR-3路徑在促進淋巴血管生成中之作用且鑒於對於大多數癌症類型，第一轉移部位為淋巴結，阻斷VEGF-C/VEGFR-3路徑將預期抑制例如自***癌、胰臟癌、胃癌或結腸直腸癌之淋巴結轉移(Roberts等人,Cancer Res.,66(5),2650-2657(2006))。
抗體可單獨(單一療法)或與一或多種治療有效藥劑或治療組合(組合療法)投與。另一治療有效藥劑可與抗體結合、合併入與抗體相同之組合物中、或可作為各別組合物投與。另一治療有效藥劑或治療可在投與抗體之前、期間及/或之後投與。可投與另一治療有效藥劑以增大抗體之治療效應或減弱抗體之負面副作用。
本文所述之治療方法可用於治療任何適合哺乳動物，包括靈長類動物，諸如猴及人類、馬、母牛、貓、狗、兔；及齧齒動物，諸如大鼠及小鼠。在一實施例中，欲治療之哺乳動物為人類。
藉由參考以下實例，將可看出，抗體1會結合人類VEGFR-3上之包含P219作為主要組分、包含V175作為次要組分及包含L221作為小組分的抗原決定基。另外，可看出，抗體2(相對於鼠類VEGFR-3產生之參考大鼠單株抗體)會結合鼠類VEGFR-3上之包含殘基L219及V221之抗原決定基。此外，該等實例亦證明抗體1對人類VEGFR-3具有高親和力(56 pM)，能夠阻斷配位體VEGF-C與VEGFR-3結合，能夠阻斷VEGF-C所刺激促細胞有絲***反應且在卵巢癌及HEL之活體內異種移植模型中有效。最後，亦可看出，抗體2在頭頸癌、乳癌、肺癌、RCC、胰臟癌及結腸癌之異種移植模型中有效。
 實例1
本發明抗體可使用此項技術中熟知之各種適合方法來製備及純化。舉例而言，諸如HEK 293 EBNA或CHO之適當宿主細胞經用於分泌抗體之使用最佳預定輕鏈與重鏈載體比率的表現系統或編碼輕鏈(例如抗體1之SEQ ID NO: 12)與重鏈(例如抗體1之SEQ ID NO: 14)兩者之單一載體系統短暫或穩定轉染。使用許多常用技術中之任一者純化已分泌有抗體之經淨化培養基。舉例而言，培養基宜施加於已用相容緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)平衡之蛋白A或G瓊脂糖FF管柱。洗滌管柱以移除非特異性結合組分。例如利用pH值梯度(諸如0.1 M磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)至0.1 M檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5))溶離結合之抗體。抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE偵測，且接著合併。視預定用途而定，視情況進行進一步純化。可使用常用技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術有效移除，該等技術包括尺寸排除、疏水性相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析。在此等層析步驟之後，抗體純度大於99%。產物可在-70℃下即刻冷凍或可凍乾。以下提供抗體1之CDR及可變區胺基酸序列(使用Kabat方法確定)。
實例2
在以下實例中，描述能闡明VEGFR-3受體上之由抗體1及抗體2所結合之抗原決定基的實驗。
產生VEGF-C ΔNΔC 及小鼠及人類sR3-AP 。如Pytowski等人(2005) J. Natl. Cancer Inst.97(1) :14-21中所述產生重組成熟人類VEGF-CΔNΔC 。人類及小鼠VEGFR-3之全長(亦即Ig域1-7)可溶性細胞外區域(sR3)與編碼人類鹼性磷酸酯酶(AP)之cDNA融合以產生融合蛋白sR3-AP(Persaud等人(2004) J. Cell Science117 :2745-56；Pytowski等人(2005) J. Natl. Cancer Inst.97(1) :14-21)。
產生小鼠-人類嵌合sR3-AP及sR3-AP之定點突變體 。使用重疊PCR技術(Ho等人(1989),Gene 77:51-59)製備sR3-AP之3個N端免疫球蛋白樣(Ig)域的嵌合小鼠-人類及人類-小鼠構築體且選殖入AP表現載體中(Persaud等人(同上)；Pytowski等人(同上))。sR3-AP構築體之定點突變誘發係根據製造商說明書(Stratagene)使用QuickChange II XL定點突變誘發套組進行。藉由使用ABI Prism 3100遺傳分析器(Applied Biosystems)及BigDye Terminator v3.1循環定序套組(Applied Biosystems)對跨越突變區之cDNA之兩股定序來驗證所要取代之存在。
表現可溶性VEGFR-3蛋白 ：使編碼野生型及突變sR3-AP之細胞外區域之cDNA轉染入懸浮培養於化學確定之無蛋白FreeStyleTM 293表現培養基(Invitrogen,編號12338026)中的FreeStyleTM 293細胞(Invitrogen，編號R79007)中。在一些情況下，使用如先前所述之抗AP抗體親和力層析(Zhu等人,(1998) Cancer Res.58 :3209-14)或藉由本文所述之使用經固定mAb抗體1及抗體2進行之親和力層析來純化所選sR3-AP。
在條件培養基(CM)中校正sR3蛋白 ：使用Tropix TR7171光度計(Applied Biosystems,Foster City,CA)，利用Great EscAPeTM SEAP化學發光套組2.0(Clontech,Mountain View,CA)檢定CM之AP活性。CM以與其AP活性成比例稀釋於含有1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(PBS-BSA)中且藉由AP活性量測及藉由西方墨點法來再測試以驗證校正。
sR3-AP結合檢定 ：將一百(100)μl經校正CM轉移至經VEGF-CΔNΔC 或測試抗體(200奈克/孔)塗覆之96孔微量滴定板中。在培育2小時之後，各板洗滌5次且藉由化學發光偵測所結合之sR3-AP。
藉由使用小鼠及人類VEGFR-3之經固定細胞外部分(Ig域1-7)進行ELISA來測試抗體1及針對小鼠VEGFR-3之參考大鼠單株抗體(稱為『抗體2』)的結合特異性。抗體1及抗體2強烈地且以劑量依賴性方式分別與人類及小鼠VEGFR-3結合。在超過10 nM之濃度下，人類抗體抗體1顯示與小鼠VEGFR-3有微小但可再現的交叉反應性。相反，抗體2未能顯示與人類VEGFR-3有任何可偵測的結合。
抗體1及抗體2之抗原決定基完全含於VEGFR-3之第二免疫球蛋白樣(Ig)域內： VEGF受體家族之所有3個成員之配位體結合位點皆含於細胞外域之3個N端Ig域內。抗體1及抗體2之物種特異性用於確定前3個Ig域中之哪個域含有此等抗體之抗原決定基。以各種組合交換編碼小鼠Ig域1-3之DNA序列與編碼人類Ig域1-3之DNA序列以形成以下VEGFR-3細胞外域構築體：i)野生型人類；ii)野生型小鼠；iii)嵌合體1(人類Ig1-人類Ig2-小鼠Ig3)；嵌合體2(人類Ig1-小鼠Ig2-小鼠Ig3)；(iv)嵌合體3(小鼠Ig1-人類Ig2-小鼠Ig3)；及(v)嵌合體4(人類Ig1-小鼠Ig2-人類Ig3)。構築體以與鹼性磷酸酯酶(AP)之融合蛋白形式表現(Persaud等人(同上))。自經短暫轉染之細胞之條件培養基(CM)分離經編碼蛋白且校正至相等蛋白濃度及AP活性。小鼠及人類sR3-AP以類似親和力結合人類VEGF-CΔNΔC 。因此，測試各種sR3-AP嵌合體結合人類VEGF-CΔNΔC 之能力作為一種確定恰當蛋白摺疊保留在嵌合受體中之手段。抗體1及抗體2能夠與嵌合蛋白1至4結合顯示抗體1及抗體2之抗原決定基分別完全含於人類及小鼠VEGFR-3之第二Ig域(Ig2)內。舉例而言，抗體1將不與在Ig域2處含有小鼠VEGFR3序列之嵌合體2或嵌合體4結合。
鑑別VEGFR-3之構成抗體1及抗體2之抗原決定基的胺基酸 ：鑑別VEGFR-3之第二Ig域之胺基酸序列內的在人類與小鼠蛋白之間不同的十二(12)個位置。此等位置以及人類及小鼠蛋白中之殘基展示於表4中。
定點突變誘發用於將人類及小鼠序列中之各物種特異性胺基酸個別地改變成相對物種之相應直系同源物；接著在編碼第一、第二及第三Ig域之sR3-AP蛋白的情形下表現各突變蛋白。抗原決定基定位藉由2種互補方法來實現。在第一方法中，量測歸因於個別胺基酸取代成小鼠或人類直系同源物之人類特異性抗體1及小鼠特異性抗體2與其各別人類及小鼠sR3-AP之結合損失。在第二方法中，量測藉由個別胺基酸取代成小鼠或人類直系同源物所介導之抗體1及抗體2與相對物種之sR3-AP的結合增加。若上述突變導致在第一方法下之結合損失及在第二方法下之結合增加，則殘基視為構成抗體之抗原決定基之一部分的強力候選物。對於所有突變蛋白，與檢查蛋白質結構之總變化並行量測與VEGF-CΔNΔC 之結合。
一式三份進行結合實驗且結果以3個各別實驗之平均偏差及標準偏差形式計算。在所檢查之於人類sR3-AP之Ig2域中的12個取代中，僅1個取代(V184L)導致與VEGF-CΔNΔC 與抗體1兩者之結合完全損失。因此，此變化視為干擾人類sR3-AP之總體結構。取代V175A導致與VEGF-C與抗體1兩者之結合損失約50%。取代P219L導致與VEGF-C之結合損失約75%且與抗體1之結合接近完全(約95%)損失。L221變化成V不影響人類sR3-AP與VEGF-C結合但會使與抗體1之結合降低約55%。其餘取代不導致與VEGF-C或抗體1之結合的實質性損失。
當針對與人類特異性抗體1之結合增加來檢查小鼠sR3-AP中之個別小鼠至人類突變時，對於取代A175V(約12倍)及L219P(約60倍)而言，觀測到在與野生型小鼠sR3-AP結合以上的顯著增加。其他取代皆不導致在背景以上之顯著的結合增加。
因此，設置準則以考慮構成抗體1之抗原決定基之胺基酸，其中人類sR3-AP中人類至小鼠直系同源物取代將顯著降低與抗體1之結合，同時降低(但並非消除)或不影響與VEGF-CΔNΔc 之結合。此外，對於構成抗體1之抗原決定基之胺基酸，小鼠sR3-AP中小鼠至人類直系同源物取代將導致與抗體1之顯著結合。對於抗體1，人類sR3-AP之V175及P219滿足此等準則。排除V184，因為人類sR3-AP中取代成小鼠直系同源物會消除與VEGF-CΔNΔC 與抗體1兩者之結合，而小鼠sR3-AP中在此位置處相應取代成人類直系同源物不會導致與抗體1結合。將人類sR3-AP中之白胺酸221改變成相應鼠類纈胺酸會使與抗體1之結合降低55%。然而，小鼠sR3-AP中在此位置處相應取代成人類直系同源物不會導致與抗體1結合。因此，L221可對抗體1之抗原決定基有較小貢獻但不滿足以上確立之所有準則。
為了進一步研究位置221處之殘基之作用，將人類sR3-AP中之P219L及L221V突變組合於單一構築體中。相較於保留5%與人類sR3-AP之結合之單一P219L突變體，雙重突變體與抗體1之結合基本上消除。
總之，此等結果鑑別P219為人類VEGFR-3上之抗體1之抗原決定基的主要組分且V175為次要組分且提出L221亦可能為抗原決定基之小組分。
接著使用類似方法進行關於小鼠VEGFR-3之Ig域2之哪些殘基構成抗體2之抗原決定基的檢查。再次，一式三份進行結合實驗且結果以3個各別實驗之平均偏差及標準偏差形式計算。在將小鼠胺基酸改變成相應人類胺基酸之12個個別取代中，4個取代(H177W、P194S、R199H及N214D)顯著降低小鼠sR3-AP與VEGF-C與抗體2兩者之結合。有趣地，位置219及221處之突變(L219P及V221L)降低與抗體2之結合但不降低與VEGF-C之結合。人類VEGFR-3中在位置219及221處之相應人類至小鼠突變(P219L及L221V)允許抗體2與人類sR3-AP結合，結合程度大於抗體2與野生型人類序列之結合分別約55倍及10倍。亦證明在位置219及221處含有人類直系同源物胺基酸之小鼠突變蛋白與VEGF-CΔNΔC 之結合略微增加或未受影響，而此等突變蛋白與抗體2之結合消除(219)或降低約85%(221)。
經設置以考慮構成抗體2之抗原決定基之胺基酸的準則為小鼠sR3-AP中人類直系同源物取代將顯著降低與抗體2之結合，同時降低(但並非消除)或不影響與VEGF-CΔNΔC 之結合。此外，對於構成抗體2之抗原決定基之胺基酸，人類sR3-AP中人類至小鼠直系同源物取代將導致與抗體2之顯著結合。對於抗體2，小鼠sR3-AP之P219及L221滿足此等準則。
表述資料之另一方法為計算抗體2與藉由人類sR3-AP序列內各個別人類至小鼠直系同源物突變而復原之野生型小鼠sR3-AP的最大結合百分比。此證明人類sR3-AP序列內之個別取代性P219L及L221V使得用野生型小鼠sR3-AP所見之與抗體2之最大結合分別復原約5%及1%。因此，推斷L219及V221為抗體2之抗原決定基之組分。
由此可見，抗體1及抗體2分別結合人類VEGFR-3及小鼠VEGFR-3中之高度類似的抗原決定基，其中位置219處之殘基在各情況下皆為關鍵殘基。以下實例中之資料證明抗體1與抗體2兩者為能夠阻斷其各別抗原之活性以及抑制活體內異種移植模型中之腫瘤生長的中和抗體。此資料提供進一步證據來證明本文鑑別之VEGFR-3之Ig2域中的新穎抗原決定基提供作為中和抗原決定基之關鍵有利的特徵。因此，與該抗原決定基結合之抗體能夠阻斷配位體結合、VEGFR-3信號傳導且抑制活體內腫瘤生長。
實例3：抗VEGFR-3抗體之親和力( K d )量測
藉由在20℃下在2000生物感測器(,Piscataway,NY)上進行表面電漿子共振來量測抗體1之結合動力學。人類VEGFR-3之可溶性細胞外域(sR3-AP)固定在感測器晶片上且在感測器之表面上方注射濃度介於0.8與6.25 nM之間的抗體1。使用BIA Evaluation 3.2程式評估感測器圖譜以確定締合速率(ka)及解離速率(kd)。使用等式：K d =ka/kd自ka及kd速率計算解離常數(K d )。BIAcore動力學分析產生抗體與經固定sR3-AP結合之K d 為56 pM。因此，抗體1對人類VEGFR-3具有極高親和力，其中該親和力大於sR3-AP對VEGF-CΔNΔC 之親和力接近2個數量級。
實例4：藉由抗VEGFR-3抗體阻斷VEGF-C與VEGFR-3結合
為了量測VEGFR-3抗體阻斷VEGF-C與人類VEGFR-3結合之能力，利用競爭性VEGF-C阻斷檢定。抗體或可溶性噬菌體粒子在0.001 μg/ml至5 μg/ml下與50 ng sR3-AP混合，在室溫下培育1小時且轉移至經VEGF-CΔNΔC (200奈克/孔)塗覆之96孔微量滴定板中。在又2小時之後，各板洗滌5次且添加磷酸對硝基苯酯(Sigma)以在OD405nm 下定量結合之sR3-AP分子。計算IC50 ，亦即為50%抑制sR3-AP與VEGF-CΔNΔC 之結合所需之Fab或IgG的濃度。抗體1之Fab及IgG形式以分別為2及1.3 nM之IC50 強烈地阻斷sR3-AP與經固定VEGF-CΔNΔC 結合。相反，靶向人類IGF受體且自相同噬菌體文庫獲得之對照抗體為非活性抗體。
實例5：藉由抗體1抑制VEGF-C ΔNΔC 所刺激促細胞有絲***反應
為了測試抗體1抑制由VEGFR-3介導之信號轉導之能力，製備會表現融合人類VEGFR-3之細胞外域與人類cFMS之跨膜域及細胞質域的VEGFR-3嵌合形式之NIH-3T3細胞株。未偵測到母細胞內源性表現VEGFR-3，且藉由FACS分析來顯示嵌合受體在質膜上之定位。VEGFR-3-FMS細胞(5×103 個細胞/孔)於200 ml無血清培養基中塗鋪於96孔組織培養板(Wallac,Gaithersburg,MD)上且在37℃下培育72小時。添加多達20 nM之抗體且在37℃下預培育1小時，此後添加VEGF-CΔNΔC 以達到最終濃度20 ng/ml。在培育18小時之後，0.25 mCi氚化胸腺嘧啶([3 H]-TdR)(Amersham)添加至各孔中且再培育4小時。細胞置放在冰上，用含血清培養基洗滌1次，在4℃下與10% TCA一起培育10分鐘，且溶解於25 ml 2% SDS中。在閃爍計數器(Wallac,1450型Microbeta閃爍計數器)上測定併入放射能(Incorporated radioactivity)。表現VEGFR-3-cFMS之NIH-3T3細胞對[3 H]-TdR之併入藉由添加VEGF-CΔNΔC 而經刺激至少3倍。促細胞有絲***反應以劑量依賴性方式由抗體1以5 nM之IC50 值特定阻斷。
實例6：人類卵巢癌細胞株皮下異種移植模型中之抗VEGFR-3單株抗體
在此實驗中，抗VEGFR3單株抗體抗體1及抗體2單獨或組合用於免疫缺乏SCID小鼠中之人類卵巢癌細胞株OVCAR-8(NCI-60，Developmental Therapeutics Program,NCI/NIH)的異種移植物。OVCAR-8為表現人類VEGFR-3之極少數人類癌細胞株之一。此實驗中之預期在於抗體2將阻斷生長腫瘤之小鼠基質中之血管生成及淋巴血管生成同時對腫瘤無影響。相反，預期抗體1僅作用於人類癌細胞。
OVCAR-8細胞按每隻小鼠1×107 個細胞皮下(s.c.)注射入75隻雌性無胸腺小鼠之左側腹中。當腫瘤在細胞植入之後13天達到約180 mm3 時，小鼠經隨機化且分成5個治療組(n=12)：USP鹽水對照組，0.5毫升/劑量；大鼠IgG，40 mg/kg；抗體1，40 mg/kg；抗體2，40 mg/kg；及抗體1(40 mg/kg)+抗體2(40 mg/kg)。根據星期一-星期三-星期五時程腹膜內(i.p.)給與抗VEGFR-3 mAb及對照物。每週2次記錄腫瘤量測結果。計算各治療組之T/C%，其為各治療組之相對腫瘤體積相對於鹽水對照組之相對腫瘤體積的比率。直至第41天之RM ANOVA用於比較治療組之間的腫瘤生長。
抗體2以71%之T/C%顯著抑制OVCAR-8腫瘤生長(P=0.0299)。抗體1在此模型中傾向於具有功效(T/C%為74%)，但腫瘤抑制程度未達到顯著性(P>0.05)。此可能歸因於此組中第41天之可能已阻止此組達到統計顯著性的寬泛腫瘤體積範圍(335-1504 mm3 )。
抗體1與抗體2一起之組合會增強抗體2之腫瘤抑制效應(T/C%為47%且相較於任一單獨抗體，組合效應達到顯著性(P0.0358))。
抗體2顯著抑制OVCAR-8腫瘤生長而抗體1似乎在此模型中有效而未達到統計顯著性。然而，因為2種單株抗體之組合相較於抗體2單一療法會顯著抑制OVCAR-8腫瘤生長，所以推斷抗體1在此實驗中顯示治療功效。因此，本發明抗體在活體內卵巢癌模型中顯示抗腫瘤功效。
實例7：人類紅白血病(HEL)細胞皮下異種移植模型中之抗VEGFR-3 mAb抗體1
在以下實例中，量測抗體1在人類紅白血病(HEL)細胞皮下異種移植模型中之顯著抗腫瘤效應。
以每隻小鼠5×106 個HEL細胞皮下注射以每籠5-6隻安放之Nu/nu小鼠(雌性，7-8週)。當腫瘤達到約400 mm3 時，根據腫瘤體積將小鼠隨機分入4個治療組(n=11/組)之一中：
1)USP鹽水，10 ml/kg，
2)抗體1，60 mg/kg(在第1天起始劑量為150 mg/kg)
3)抗體1，20 mg/kg(在第1天起始劑量為50 mg/kg)
4)抗體1，6 mg/kg(在第1天起始劑量為15 mg/kg)
抗體1製備於USP鹽水中。每週2次以每公斤體重10 ml給藥溶液腹膜內投與治療劑。在第1天投與第一劑量(起始劑量)，隨後每週2次投與維持劑量持續研究之持續時間。每週2次量測腫瘤體積。至少每週2次記錄體重持續研究之持續時間。計算第18天各治療組之T/C%，其為各治療組之相對腫瘤體積相對於鹽水對照組之相對腫瘤體積的比率(表5)。藉由重複量測ANOVA比較治療組中之腫瘤生長及體重變化。
用抗體1之治療導致劑量依賴性抑制HEL腫瘤生長，其中60 mg/kg抗體1顯著抑制腫瘤生長(p=0.0031)。在此研究中，抗體1治療對體重無影響(表5)。因此，本發明抗體在活體內HEL模型中顯示抗腫瘤功效，同時導致彼模型中之不良副作用最小。
實例8：CAL27鱗狀細胞癌異種移植模型中之抗VEGFR-3mAb抗體2與順鉑組合
為了測試抗VEGFR-3抗體在頭頸癌中之活性，使用CAL27異種移植模型。CAL27細胞懸浮液按每隻小鼠1×107 個細胞皮下注射入60隻雌性無胸腺小鼠之左側腹中。當腫瘤在細胞植入之後8天達到約180 mm3 時，小鼠經隨機化且分成4個治療組(n=12)：1.)USP鹽水對照組，0.5 ml腹膜內，每週3天；2.)抗體2，40 mg/kg，每週3天；3.)順鉑，7 mg/kg，每7天1次；4.)抗體2(40 mg/kg，每週3天)+順鉑(7 mg/kg，每7天1次)。
每週2次記錄腫瘤量測結果；直至第61天之RM ANOVA用於比較治療組之間的腫瘤生長。卡方檢定(Chi Squared test)用於測試治療組之間的腫瘤消退數目之統計顯著性。
相較於USP鹽水對照組，使用抗體2或順鉑之單一療法顯著抑制CAL27腫瘤生長(P 0.0077)。抗體2及順鉑之T/C%值分別為55%及39%。當相較於單一療法時，用抗體2與順鉑兩者之組合療法導致顯著抑制腫瘤生長(P 0.0322)。組合療法之效應大於累加效應，如藉由分數乘積法(Fractional Product Method)所測定。因此，與VEGFR-3之Ig2域中之抗原決定基結合的抗VEGFR-3抗體以單一療法或與順鉑組合形式在活體內頭頸癌模型中顯示抗腫瘤功效。
實例9：MDA-MB-231乳癌異種移植模型中之抗VEGFR-3 mAb抗體2與5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸組合
為了測試抗VEGFR-3抗體在乳癌中之活性，使用MDA-MB-231異種移植模型。用6×106 個MDA-MB-231細胞於0.4 ml(1:1，具有基質膠)中皮下注射於NIH nu/nu無胸腺小鼠(雌性，8週)之乳腺脂肪墊中。當腫瘤達到約300 mm3 時，小鼠根據腫瘤尺寸隨機分入以下治療組(n=12)中：1)USP鹽水，10 μl/g，每週3次；2)40 mg/kg抗體2，每週3次；3)125 mg/kg 5FU(5-氟尿嘧啶)+62 mg/kg LV(甲醯四氫葉酸)，每週1次；4)抗體2(40 mg/kg，每週3次)+5FU/LV(分別為125 mg/kg及62 mg/kg，每週1次)。所有藥劑皆在治療當天製備且腹膜內投與。細胞毒性治療在開始抗體治療之前1天開始。
在投與抗體2或抗體2+5FU/LV之情況下，鹽水對照組之腫瘤體積相對於經治療小鼠之腫瘤體積的比較顯示顯著腫瘤生長抑制(參見表6)。儘管Antibody 2+5-FU/LV之組合之效應不大於單一療法之效應，但存在組合之抗腫瘤效應增加的趨勢。因此，與VEGFR-3之Ig2域中之抗原決定基結合的抗VEGFR-3抗體以單一療法或與5FU/LV組合形式在活體內乳癌模型中顯示抗腫瘤功效(相較於鹽水對照組)。
1 直至第34天之RM ANOVA
實例10：NCI-H292肺癌異種移植模型中之單獨抗VEGFR-3 mAb抗體2及抗VEGFR-3 mAb抗體2與多西他賽組合
為了測試抗VEGFR-3抗體在肺癌中之活性，使用NCI-H292異種移植模型。以每隻小鼠2×106 個NCI-H292細胞皮下注射Nu/nu小鼠(雌性，7-8週齡)。當腫瘤達到約300 mm3 時，小鼠根據腫瘤尺寸隨機分入以下治療組(n=15)中：1)USP鹽水，10 μl/g，每週3次，腹膜內，在第2天開始；2)抗體2，40 mg/kg，每週3次，腹膜內，第2天開始；3)多西他賽，12 mg/kg，每7天1次，第1天開始；4)多西他賽(12 mg/kg，每7天1次，第1天開始)加抗體2(40 mg/kg，每週3次，第2天開始)。
約每週2次量測腫瘤體積且至少每週2次記錄體重持續研究之持續時間。在處死時，藉由CO2 窒息使小鼠安樂死。計算各治療組之T/C%，其為實驗組中之相對腫瘤體積相對於對照組中之相對腫瘤體積的比率。藉由重複量測ANOVA與對照組比較直至第26天之腫瘤生長及體重。
用抗體2及多西他賽之治療顯著抑制NCI-H292腫瘤生長，T/C%值分別為74%及49%。相較於單一療法，抗體2與多西他賽之組合療法顯著增加抗腫瘤功效，T/C%為24%。因此，與VEGFR-3之Ig2域中之抗原決定基結合的抗VEGFR-3抗體以單另一療法(p=<0.0001)或與多西他賽(p=<0.0001)組合形式在另一活體內肺癌模型中顯示抗腫瘤功效。
實例11：皮下SK-RC-29人類腎細胞癌(RCC)異種移植模型中之抗VEGFR-3 mAb抗體2
為了測試抗VEGFR-3抗體在RCC中之活性，使用SK-RC-29人類腎細胞癌異種移植模型。以每隻小鼠2×106 個SK-RC-29 RCC細胞皮下植入雌性無胸腺nu/nu小鼠(n =每組12隻小鼠)中。該等細胞係以1:1 Matrigel基底膜中之混合物(Vt =0.4 ml)形式注射。當腫瘤達到200-250 mm3 時，小鼠經隨機分入各組中且腹膜內給藥，對照組接受USP鹽水(500 μl/注射)，且抗體2組接受第一劑量60 mg/kg及所有後續劑量40 mg/kg。每週2次記錄腫瘤體積量測結果持續43天。在第48天(研究結束)獲取代表性腫瘤樣品(n =每個治療組4個樣品)以供進行組織學分析。為了確定治療組之間抗腫瘤效應之顯著性，使用重複量測(RM)ANOVA進行統計分析。如第47天所量測，歸因於抗體毒性之重量損失未在任何治療組中發生。實際上，在整個研究過程中，用抗體治療之小鼠之重量增加約5.5%。
為了評估抗腫瘤功效及計算T/C%值，所有治療組皆與對照小鼠進行比較直至第32天。抗體2產生62%之T/C%(p=0.012)；此顯示在皮下異種移植模型中抑制腎細胞癌生長且不良副作用最小。
實例12：BxPC-3胰臟癌異種移植物中之抗VEGFR-3 mAb抗體2
為了測試抗VEGFR-3抗體在胰臟癌中之活性，使用BxPC-3胰臟癌異種移植模型。雌性無胸腺nu/nu小鼠(n =36)按每隻小鼠2×106 個BxPC-3人類胰臟細胞(1:1基質膠中混合)皮下注射。當腫瘤達到約350 mm3 時，動物分成3個治療組(n =10)：1)USP鹽水；2)mAb抗體2，10 mg/kg；3) mAb抗體2，40 mg/kg。所有治療劑皆以每10 g體重0.1 ml每週3次腹膜內投與。每週2次記錄腫瘤體積量測結果持續6週。
抗體2治療以劑量依賴性方式抑制BxPC-3腫瘤生長。在第40天研究結束時，10 mg/kg及40 mg/kg劑量組之T/C值分別為75%(p=0.042)及56%(p=0.002)。
實例13：對HT-29結腸異種移植物投與抗VEGFR-3 mAb抗體2與奧沙利鉑之組合
為了測試抗VEGFR-3抗體在結腸癌中之活性，使用HT-29結腸異種移植模型。HT-29細胞懸浮液按每隻小鼠5×106 個細胞皮下注射入60隻雌性無胸腺小鼠之左側腹中。當腫瘤在細胞植入之後8天達到約180 mm3 時，小鼠經隨機化且分成4個治療組(n=12)：1)USP鹽水對照組，0.5 ml腹膜內，每週3次；2)抗體2，40 mg/kg，每週3次；3)奧沙利鉑，12 mg/kg，每7天1次；4)抗體2(40 mg/kg，每週3次)+奧沙利鉑(12 mg/kg，每7天1次)。
每週2次記錄腫瘤量測結果；RM ANOVA用於比較治療組之間的腫瘤生長。單獨抗體2不顯著抑制HT-29腫瘤生長；該抗體具有功效趨勢，T/C%為80%。相較於對照組或任一單一療法，用抗體2與奧沙利鉑兩者之組合療法顯著抑制HT-29腫瘤生長(P 0.0280)，T/C%為47%。因此，當與奧沙利鉑組合使用時，與VEGFR-3之Ig2域中之抗原決定基結合的抗VEGFR-3抗體在活體內結腸癌模型中顯示抗腫瘤功效。
<110>　美商應克隆公司
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<170>　PatentIn version 3.5
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Claims (15)

  1. 一種與人類VEGFR-3特異性結合之抗體或其抗原結合部分，其包含具有SEQ ID NO 1之LCDR1、具有SEQ ID NO 2之LCDR2、具有SEQ ID NO 3之LCDR3、具有SEQ ID NO 6之HCDR1、具有SEQ ID NO 7之HCDR2及具有SEQ ID NO 8之HCDR3。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合部分，其包含具有SEQ ID NO：5之輕鏈可變區及具有SEQ ID NO：10之重鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含具有SEQ ID NO：15之輕鏈及具有SEQ ID NO：16之重鏈。
  4. 如請求項3之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含2條具有SEQ ID NO：15之輕鏈及2條具有SEQ ID NO：16之重鏈。
  5. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中：a)藉由使人類VEGFR-3之Pro-219單一突變成Leu而使該抗體與人類VEGFR-3之結合性降低至少90%；及b)藉由使人類VEGFR-3之Val-175單一突變成Ala而使該抗體與人類VEGFR-3之結合性降低至少50%。
  6. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中藉由使人類VEGFR-3之Leu-221單一突變成Val而使該抗體與人類VEGFR-3之結合性降低至少50%。
  7. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其亦與具有SEQ ID NO.20之突變小鼠VEGFR-3及具有SEQ ID NO.21之突變小鼠VEGFR-3結合，其中當相較於與野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO.19)之結合性時，與該具有SEQ ID NO.20之突變小鼠VEGFR-3之結合性增加50倍以上，且當相較於與野生型小鼠VEGFR-3之結合性時，與該具有SEQ ID NO.21之突變小鼠VEGFR-3之結合性增加10倍以上。
  8. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中如藉由在20℃下於BIACORE® 2000生物感測器上進行之表面電漿子共振所量測，該抗體對人類VEGFR-3之K d 為1×10-9 M至5.6×10-11 M。
  9. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體抑制人類VEGF-C△N△c (SEQ ID NO：22)與人類VEGFR-3結合之IC50 為2 nM至1.3 nM。
  10. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體抑制VEGF-C△N△c 所刺激促細胞有絲***反應之IC50 為10 nM至5 nM。
  11. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其係用作藥劑。
  12. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其係用於治療卵巢癌、人類紅白血病(erythroleukaemia)、頭頸癌(head and neck cancer)、乳癌、腎細胞癌、胰臟癌、肺癌、結腸癌及淋巴結轉移。
  13. 如請求項4之抗體或其抗原結合部分，其係與選自順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、奧 沙利鉑(oxaliplatin)及多西他賽(docetaxel)的另一抗癌藥劑組合，同時、各別或依序在療法中。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體或其抗原結合部分，以及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其進一步含有至少一種其他治療成分。
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