TWI412593B

TWI412593B - 基因變異檢體的檢測方法及用具組

Info

Publication number: TWI412593B
Application number: TW096128464A
Authority: TW
Inventors: Ming-Sheng Lee; Chung-Han Lee
Original assignee: Ming-Sheng Lee; Chung-Han Lee
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2013-10-21
Also published as: TW200827449A

Description

基因變異檢體的檢測方法及用具組

本發明係關於一種檢測方法；特別關於一種高靈敏且應用範圍廣泛的基因變異檢驗法。經由其涵具固體界面上操作的特性，簡化了檢驗的程序，也使檢驗的操作得以全自動或半自動化，甚至可達成同時在多種不同樣本內同步偵測多種不同基因突變的可行性。此外，本發明也揭露了一些建造自動化操作本基因變異檢體的檢測方法的儀器的建構藍圖。

由致癌的起因開始、以及接下來一連串細胞內的演變、乃至於惡性細胞的轉移和最後癌細胞對治療所產生的抗葯性，基因的突變都扮演著一個非常重要的角色。目前有許多基因變異的檢測法可供臨床醫師和研究者使用，譬如，單鏈去氧核醣核酸構造多形性(SSCP)化驗法、去氧核醣核酸差異性雙鏈形成(Heteroduplex Formation)化驗法、高性能液態色層分離(HPLC)篩選法、核糖核酸酶保護(Ribonuclease Protection)化驗法、和去氧核醣核酸序列分析(DNA Sequencing)等等。然而，這些檢測法的靈敏度頂多止於百分之十左右，根本無法在成千上萬的正常細胞中偵測到少數的突變細胞。因此，若要偵測早期剛出現的微量惡性細胞或治療後殘餘的少數癌細胞，對研究者或臨床醫師而言，仍是很大的挑戰。

除了靈敏度的限制外，檢測效率則是另一個難題。以目前最先進的去氧核醣核酸微陣列技術(microarray technologies)為例，單只為了檢測一個基因的突變，就需要動用成千上萬不同序列的去氧核醣核酸作為探針。以此類推，若要同時檢測多種基因的突變，所需的探針數目將難以勝數。因此，要在許多不同的樣品裡，同步檢驗多種基因的突變，更是難上加難。除此之外，目前的技術也無法在顯微鏡下、細胞的原位(in situ)上，一方面觀察細胞形態，另一方面也同時檢測出細胞內基因的突變。換句話說，以目前的技術而言，即使得知基因突變的存在，也無從辨識突變細胞的來源。

因此，有必要提出一種方法、儀器和相關產品，克服上述的困難與瓶頸，並且能夠很靈敏地在數以百萬計的正常細胞中，發現極少數帶有突變基因的異常細胞。

以下僅是一般性地簡單敘述，其目的在讓參讀者對本發明所揭露的基因突變檢測法、檢測儀、及相關產品有基本的理解，並非涵蓋所有可能的應用及操作的廣泛性綜述。更不是為了要揭露及描繪本發明的關鍵元素，而限制了本專利申請所能涵蓋的範圍。本簡述僅概略地描繪本發明的基本概念，乃隨後更加詳盡描述的前奏。

本發明提供了一種應用範圍廣泛的基因變異檢體的檢測方法。簡言之，此基因變異檢體的檢測方法包括了下列幾個主要步驟：(1)以正常野型反向序列的單鏈去氧核醣核酸(antisense single-stranded wild-type DNA)為探針，使之與欲檢測樣品內的核糖核酸(RNA)雜交，而形成核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈(RNA：DNA heteroduplex)。因此，可能形成兩類不同的混合雙鏈：其一、核糖核酸的序列與探針完全吻合配對無差異，其二、核糖核酸的序列與探針無法完全配對，而含帶至少一個不吻合的差異處；(2)以核糖核酸酶(ribonuclease)水解上述的混合雙鏈，導致沒吻合配對的核糖核苷酸被水解，而釋出一個三偏端的羥基(3' -OH group)；反之，完全配對的混合雙鏈卻被完整無缺地保護住；(3)加入能利用核糖核酸的三偏端羥基為引物(primer)的去氧核醣核酸聚合酶(RNA-primed DNA polymerase)，由新釋出的三偏端羥基開始，沿著去氧核醣核酸的探針，合成延伸新的去氧核醣核酸鏈；(4)使新合成的混合雙鏈產生兼具特異性及黏著性的三偏端(3' sticky end)；(5)利用此新生的黏著端來接合攜帶有標記的適配鏈(adapter)。由於正常的混合雙鏈並無新序列延伸，而突變型的混合雙鏈因被水解產生缺口並釋出三偏端新羥基而得以延伸新序列。這差別在本發明稱謂為差異性序列延伸(differential sequence extension；或簡稱DSE)。由於只有突變型混合雙鏈才能產生新序列的延伸，並與攜帶標記的適配鏈(adapter)接合，使得含帶突變型的檢體可簡單且具特異性地被檢測到。甚至，可利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction)，把檢體裡微量的突變型-適配鏈雜合體複製並放大，而得以很靈敏地被檢測出來。

以上述的基因變異檢體的檢測方法為基礎，為了簡化繁複地操作程序，本發明揭露了一個無限制性的應用體現，亦即把本基因變異檢體的檢測方法建立於固體界面上。簡而言之，先把包埋有限制酶(restriction enzyme)序列的單鏈去氧核醣核酸的探針固定於固體界面上，致使緊接下來一連串的反應得以簡便地在固體界面上進行，其中包括：(1)與欲檢測樣品的核糖核酸雜交而形成核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈；(2)核糖核酸酶水解未吻合配對的核糖核苷酸，致使突變型核糖核酸被水解而在缺口處釋出三偏端羥基；(3)以新釋出的三偏端羥基為起點，開始合成延伸新去氧核醣核酸的序列，致使隱藏的限制酶序列因而顯露；(4)利用該限制酶把突變型混合雙鏈切離固體界面，同時製造出不平整且具特異性的三偏端。最後，使之與適配鏈接合，再利用聚合酶連鎖反應把檢體內微量的突變型-適配鏈雜合體複製放大而靈敏地檢測出來。或者，上述的單鏈探針並不一定得包埋有限制酶序列，而藉由差別性序列延伸，令突變型混合雙鏈產生不平整且具特異性的三偏端，而在固體界面上直接與帶有標記的適配鏈接合及檢測；此外，也可藉由任何已知的方法，令突變型-適配鏈雜合體脫離固體界面，再施行聚合酶連鎖反應來複製、放大與偵測。

本發明也提供了另一個無限制性的應用體現，亦即成套或半套的基因變異檢測用具組合，以便操作施行本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法。一般而言，這些成套或半套的試劑組合，包含單一或多種反向序列的單鏈去氧核醣核酸的探針。這些探針可溶於液體、可製成粉劑、或可固定於固體界面上。各探針所涵蓋的範圍，各自代表某一片段或某一區基因的序列。端視所需，各探針可以單獨使用於單一樣品或分配到多個不同的樣品。各個探針亦可各自固定於固體界面上的某一定點，或混合後再固定在固體界面上。這些成套或半套的用具組合，亦可包含與操作本發明有關的基因變異檢體的檢測方法所需的所有或部分的試劑。另外，亦可包括解說及執行本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法的使用者指南。

本發明也提供了另一個無限制性的應用體現，亦即全自動或半自動儀器來操作本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法。簡言之，此儀器的組成包括至少一個反應室，其內設有至少一個可移動的設備以及牆壁、頂蓋和地板，其中至少設有一扇門。此儀器也設有一個溫度調控器，來控制調節反應室與試劑的溫度。此儀器也設有一套液體分配汲吸設備，以便給于各檢體加入必要的試劑、洗濯和排出不用的溶液與試劑。倘若探針乃固定於帶磁性的固體界面上，此儀器還可設置一個電磁構造，隨電源的調控與試劑反應所需，令磁性時有時無。或者，藉由械臂或軌道上的運送，使檢體端視所需，而在帶磁或無磁的環境或反應室進出。此外，上述的溫度控制器、電磁構造和液體分配汲吸設備均可由械臂調控，端視反應之需，或靠近、或移離欲檢測的樣品。若欲採用螢光檢測法，此儀器的反應室內，還可設置一個螢光計來偵測各樣品內螢光的變化。同理類推，若是採用其他的方法來偵測，此儀器的反應室內則可設置一個適用的偵測器來檢測各檢體的變化。

為了使參讀者對本發明有基本的理解，以下所展示的圖式簡要地描繪本發明欲揭露的一些實施例、應用實例、與觀念。這些圖繪尚未能詳盡地概括了本發明所有可能涵蓋的範圍，而僅僅簡要地描繪與本發明有關的關鍵元素。因此，若要對本發明所揭露的概念與應用有深入的理解，仍必須參讀以下有關本發明實施方式的章節，並參照比對以下所展示的圖式。各圖均循序給予編號，且各自代表與本發明所揭露的各個不同的關鍵元素、實施例或應用實例。

第15圖繪示根據本發明一較佳實施例，一種基因變異檢體的檢測方法流程示意圖。請參閱第15圖，該實施例所揭露的基因變異檢體的檢測方法，需先使一檢體內的核糖核酸50，與正常野型(normal wild-type)反向序列的單鏈去氧核醣核酸61、62的探針(probes)，相雜交。因而，形成核糖核酸：去氧核醣核酸的第一混合雙鏈71以及第二混合雙鏈72。其中，該第一混合雙鏈71是由反向的第一去氧核醣核酸探針61與正向的第一核糖核酸51雜交而形成。所述的第一核糖核酸51攜有一個變異點(圖內以實心三角形來表示)。又其中，第二混合雙鏈72是由反向的第二去氧核醣核酸探針62與正向的第二核糖核酸52雜交而形成。

雜交後，檢體內正常的核糖核酸(第二核糖核酸)52與去氧核醣核酸的探針(第二去氧核醣核酸探針)62形成完全吻合配對的第二混合雙鏈72。意即，第二混合雙鏈72的第二核糖核酸52的複數個第二核苷酸，皆可配對接合第二去氧核醣核酸的探針62。

反之，突變序列(第一核糖核酸)51則與探針61則產生不吻合配對的第一混合雙鏈71。意即，第一混合雙鏈71，即一突變型混合雙鏈71，其第一核糖核酸51至少有一第一核糖核苷酸51a無法配對接合第一去氧核醣核酸的探針61。

之後，再經由核糖核酸酶的水解處理，使突變型混合雙鏈71上不吻合沒配對接合的第一核糖核苷酸51a被水解而產生缺口71a，並釋出一個三偏端的羥基(3' -OH group)。相反地，檢體內正常的第二核糖核酸52則因完全吻合配對而被完整地保護住。

請繼續參閱第15圖，在以核糖核酸酶進行水解處理後，隨即進行本發明所稱謂的差異性序列延伸。詳言之，利用去氧核醣核酸聚合酶(RNA-primed DNA polymerase)，以第一核糖核酸51為引物、以第一去氧核醣核酸探針61為模板，來進行本發明所稱謂的差異性序列延伸(differential sequence extension；稱DSE)。在此，可使用的聚合酶包括但不局限於，大腸桿菌的Klenow酶(Klenow enzyme)、缺外切核酸特性的Klenow exo-酶等等。此等聚合酶能利用在突變型混合雙鏈71上被核糖核酸酶水解所產生的缺口71a及其三偏端羥基為起點，開始以第一去氧核醣核酸的探針61為模板，沿著第一去氧核醣核酸的探針61，來複製延伸新的去氧核醣核酸的序列(合成延伸新的去氧核醣核酸鏈)。

由於正常的混合雙鏈72並無新序列延伸，而突變型的混合雙鏈71因被水解產生缺口71a並釋出三偏端新羥基而得以延伸新序列。這差別在本發明稱謂為差異性序列延伸。

另外，有鑒於Klenow酶或Klenow exo-酶所能延伸的序列長度有限，為了使序列的延伸更加長遠，可先以Klenow酶或Klenow exo-酶先自核糖核酸酶水解所產生的缺口71a開始延伸一小段去氧核醣核酸的序列，再藉著更具活性的Taq DNA聚合酶來加長序列的延伸。此等雙酶並用的組合，包括而不限於，Klenow酶或Klenow exo-酶再加上Taq DNA聚合酶。由於序列的延伸更加長遠，雙酶並用的組合使得本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法所能檢測的核酸序列大為增長。其檢測所涵蓋的範圍，可由三、四百個核苷酸序列倍增為上千個核苷酸序列。

一般而言，為了有助於突變型混合雙鏈71與適配鏈的接合，核糖核酸酶水解後所誘發的差異性序列延伸，必須能製造出不平整且具特異性的三偏黏著端(三偏端；3' sticky end)80。依採用的RNA-primed DNA聚合酶、聚合酶組合或方法的不同，其所產生的三偏端80也不同。譬如，執行差異性序列延伸時，使用Klenow酶與雙脫氧核苷酸(dideoxyrinucleotide)把正向核糖核酸鏈阻斷，由於序列的延伸僅止於單一核苷酸，致使原本含帶五偏端雙腺嘌呤核苷酸懸突(5' "AA" dinucleotide overhang)的單鏈探針，變成只含帶單一腺嘌呤核苷酸懸突的五偏端(5' single nucleotide "A" overhang)。以正鏈而言，即是帶有退隱性的單一腺嘌呤核苷酸的三偏端(3' single nucleotide "A" recessive end)。再譬如，若合併採用Klenow酶與Taq DNA聚合酶來執行差異性序列延伸，由於Taq DNA聚合酶具有類似末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxyribonucleotide transferase，簡稱TdT)的活性，會在去氧核醣核酸的三偏端80多增添一個脫氧腺嘌呤核苷酸，因而在正鏈上產生了一個三偏端單一脫氧腺嘌呤核苷酸的懸突(3' single nucleotide "A" overhang)。此外，若在單鏈反向序列的探針61隱埋一段或超過一段的限制酶序列，可經由差異性序列延伸而使該限制酶序列在突變型混合雙鏈71上顯現。再利用該限制酶來切開這新合成的限制酶序列，使得突變型混合雙鏈71產生該限制酶所特有的不平整黏著端80。藉由本發明所謂的差異性序列延伸，致使突變型混合雙鏈產生黏著端的方法，包括但不局限於，上述幾個可茲利用的方法。

請繼續參閱第15圖，在突變型混合雙鏈71上製出不平整的黏著端80後，即可利用目前已知的分子生物學或其它技術接合上恰當的適配鏈(adapter)81。由於正常型的混合雙鏈72為平端或帶有不同序列的偏端，因而無法與加入的適配鏈81接合。藉此高特異性的接合反應，令反應而得的突變型-適配鏈雜合體91得以簡易並具特異性地被檢測與定量。一般而言，本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法所使用的適配鏈81，其長度至少含有十個核苷酸，然而端視情況所需，也可長達數百個核苷酸。在一個無限制性的應用體現，其長度約略有18到30個核苷酸。

有很多不同的方法可用來檢測接合反應後所形成的突變型-適配鏈雜合體91。其中一個精確又靈敏的方法，即是利用聚合酶連鎖反應，搭配衍生自去氧核醣核酸的探針61以及適配鏈81的序列作為正向與反向引物(forward and reverse primers)的組合，來進行。此法使突變型-適配鏈雜合體得以高選擇性、等比級數的效率，被複製放大出千萬以上的拷貝數。因此，即使在檢體內數以百萬計的正常細胞中僅含極少量的突變型，也能很靈敏地被檢測出來。

適配鏈81上也可攜帶標記，例如包埋或標貼可供識別的標記，以便檢測與定量。在此所謂的標記，包括任何可偵測的分子、原子或基群。此等標記可被標貼於核糖核酸、去氧核醣核酸、蛋白質或任何生化領域內已知的分子或原子上。任何已知的標記均可使用，包括而不限於，螢光染劑、一般染色劑、放射性同位素、化學照明劑(chemiluminescent substrate)、螢光素酶的受質(luciferase substrate)、或是以上各標記的不同組合。此等標記可用各種不同的方法或儀器來偵測，包括而不局限於，螢光測識器、色澤辨識儀、自體放射造影術、任何光學或數位攝影機、照明術、化學酵素反應等等。

接合反應後所形成的突變型-適配鏈雜合體91，也可更進一步地利用基因工程重組的技術或其它分子生物的技術來分析與辨識，譬如，去氧核醣核酸序列鑒定術。

任何目前已知的技術均可用來製作本發明所稱謂的核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈71、72。其中包括但不限於下面描述的一個實例，亦即令含帶欲檢測基因序列的核糖核酸檢體與野型單鏈反向序列的去氧核醣核酸探針，於適當的雜交環境與條件下相配對，而產生核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈。

以上所描述的單鏈核糖核酸51、52，可直接來自於任何檢體、細胞、體液或培養基。也可利用任何已知的生化或分子生物的技術複製放大後再取用，以期減少所需的檢體並增強檢測的靈敏度。複製放大單鏈核糖核酸51、52的方法，包括而不限於，試管內核糖核酸轉錄術(in vitro transcription)、回饋轉錄核糖核酸放大術(transcription-mediated amplification)、或並用聚合酶連鎖反應與試管內核糖核酸轉錄術。此等單鏈核糖核酸51、52，可衍生自某特定基因的片段、全長或多種不同基因的片段或全長。該單鏈核糖核酸，可代表該特定基因的片段、全長或多種不同基因的片段或全長的序列。

在此舉例描述一個適用於本發明的單鏈核糖核酸複製放大法，此法並用聚合酶連鎖反應與試管內核糖核酸轉錄術。首先，把檢體內的核糖核酸51、52利用反向轉錄酶(reverse transcriptase)來合成互補性去氧核醣核酸(cDNA)，再利用聚合酶連鎖反應把欲檢測的基因序列複製放大。由於，所採用的正向引物含帶T7 RNA轉錄酶促進因子(promoter)的序列，使得聚合酶連鎖反應後的產物也因而帶有T7 RNA轉錄酶促進因子的序列。因此，以其為模板，加入T7 RNA轉錄酶，即可複製放大出含帶欲檢測基因序列的單鏈核糖核酸51、52。採用相同的原理與方法，仍有其它不同的RNA轉錄酶與促進因子的序列可供利用，譬如但不限於，T3 RNA轉錄酶及其促進因子的序列、SP6 RNA轉錄酶及其促進因子的序列等等。在複製放大單鏈核糖核酸51、52後，應再經由去氧核醣核酸酶(DNase)的處理，以袪除檢體內不必要的去氧核醣核酸。

本發明所需的單鏈反向序列野型探針61、62可由許多不同的方法來合成，包括而不限於，藉由欲檢測基因的反向序列為引物以及上述聚合酶連鎖反應的產物為模板，再次進行聚合酶連鎖反應來複製而產生。一般而言，探針61、62的長度可短自二、三十個核苷酸，而長至數千個核苷酸。最理想的長度，則是數百到一千個核苷酸左右。

若採用上述聚合酶連鎖反應的方法來合成單鏈反向序列的野型探針61、62，必須考慮到聚合酶連鎖反應會產生一些不必要的雙鏈產物。因而，須再經過處理與純化方能使用。

第1圖所描繪的淨化與阻斷背景雜訊的方法，乃針對單鏈反向序列的野型探針61、62(第15圖)各隱埋有某一段或超過一段Res限制酶序列而言。其中一種方法而並不限於此法，即利用一個或數種不同頻切限制酶(譬如Hha I,Hpa II與Mbo I等等)，再加上該Res限制酶來切斷雙鏈產物。然後，再加入Klenow酶、與雙脫氧核苷酸來阻斷暴露出的三偏端羥基而使其失去活性，並改造Res限制酶切斷後所暴露出懸突序列。上述的阻斷法也得以末端脫氧核苷酸轉移酶與雙脫氧核苷酸來施行，或並用Klenow酶、脫氧核苷酸轉移酶與雙脫氧核苷酸來處理。最後，再把被切短的片段與不必要的雙脫氧核苷酸清除淨化，而保留住純化的單鏈反向序列的野型探針51、52。此等純淨處置，可避免往後進行差異性序列延伸時產生非特異性的序列延伸，有助袪除檢測的雜訊。

另一個減弱檢測雜訊的方法，是針對並用Klenow酶與Taq DNA聚合酶來執行差異性序列延伸所產生的三偏端單一脫氧腺嘌呤核苷酸的懸突而設計。如第2圖所描繪，在執行差異性序列延伸之前，須把檢體內一些因聚合酶連鎖反應所增添的非特異性單一去氧腺嘌呤核苷酸的懸突，先用本發明所稱謂的阻斷適配鏈(blocking adapter)63來阻斷。其目的在避免此等含帶非特異性的單一去氧腺嘌呤核苷酸的三偏端懸突物與檢測用的適配鏈81(第15圖)接合。如第1圖所描繪，此阻斷適配鏈的反向三偏端，帶有單一脫氧胸腺嘧啶核苷酸的懸突(3' single nucleotide "T" overhang)，可與三偏端帶有單一脫氧腺嘌呤核苷酸的懸突相吻合配對。因此，在進行差異性序列延伸之前，可先把所有非特異性單一脫氧腺嘌呤核苷酸的懸突接合阻斷。必須提及的是，為了使這阻斷適配鏈63能與單一去氧腺嘌呤核苷酸的懸突接合，其正向鏈的五偏端需先被燐酸基化(phosphorylation)以促成接合反應。此外，為了使這阻斷適配鏈63完全失去被序列延伸的可能，其正向鏈三偏端的羥基也必得先被燐酸基化。除了燐酸基化之外，此三偏端也可接合其它任何無化學活性的鈍性分子、原子或群基來阻斷羥基。倘若差異性序列延伸所製成的是限制酶切斷後所形成的其它不平整的三偏端，則無須使用上述的阻斷處置。

還有一個減弱檢測雜訊的方法，是用來阻擋不完全轉錄的核糖核酸(轉錄不全的核糖核酸55；第3圖)以及其它任何因素所造成的游離暴露的三偏端羥基，而使之失去活性。如第3圖所描繪，在雜交形成核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈71、72後，可加入Klenow酶或Klenow exo-酶與雙脫氧核苷酸來阻斷游離暴露的三偏端羥基76。在此阻斷處置時，可採用任何已知的RNA-primed DNA聚合酶，譬如而不限於，上述的Klenow酶或Klenow exo-酶或並用Klenow酶與Taq DNA聚合酶。經由如此阻斷處置後，進行核糖核酸酶水解反應，可確保此後差異性序列延伸所利用的三偏端羥基(-OH；第15圖)，乃來自於突變型混合雙鏈71上因未配對而被切啄而釋出。如此阻斷處置的完全與否，是影響往後差異性序列延伸的特異性一個很重要的關鍵。

還有一些可供應用的雜訊減弱措施。它們適用於以限制酶切割所造成的黏著端。其一、在前述單鏈探針61、62(第15圖)的處理所使用的限制酶，特意包含了在將於差異性序列延伸後所採用的限制酶。如此一來，使得該限制酶的黏著端提前暴露，而得以在執行差異性序列延伸前，被 Klenow酶與雙脫氧核苷酸改造與阻擋。其二、在前述核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈71、72形成後，尚未進行核糖核酸酶水解反應之前，先以該限制酶處理。如此處置可暴露任何因先前限制酶切割處理不完全或其他任何因素而隱藏於背景的限制酶黏著端。此時，再用Klenow酶與雙去氧核苷酸來改造與阻擋。若要確認這些黏著端的改造與阻斷完全與否，可取用一小部份的阻斷反應後的產物，來與帶螢光或任何可供偵測的標記的適配鏈接合以便鑒認。若成陽性反應，則表示背景雜訊消除不全，有導致假陽性之虞。此預先鑒測的措施有助確認背景雜訊的消除，但並非絕對必要。

上述反向野型去氧核醣核酸的探針61、62，可衍生自單一基因、單一基因的片段、多種基因或多種基因的片段。上述反向野型去氧核醣核酸的探針61、62，各可代表該單一基因、單一基因的片段、多種基因或多種基因片段的序列。譬如，探針甲是針對甲基因或甲基因的片段，探針乙是針對乙基因或乙基因的片段，探針丙是針對丙基因或丙基因的片段等等。因此，所形成的核糖核酸：去氧核醣核酸的混合雙鏈，有甲、乙、丙等等不同的混合雙鏈。而每種混合雙鏈內可有一個或多個不同的突變，譬如，甲基因上有甲1、甲2、甲3等等，乙基因上有乙1、乙2、乙3等等，丙基因上有丙1、丙2、丙3等等。而任何一個突變可來自於個別不同的細胞、檢體、或個體。每個不同的細胞、檢體、或個體，也可能帶有兩個或更多個來自於同一基因或不同基因的突變。此外，所述的去氧核醣核酸探針61、62，可以是來自於突變基因、基因重組、或基因多形性差異的序列。

第4圖描繪了本發明所揭露的一種無限制性的基因變異檢體的檢測方法。如第4圖所示，在一個無限制性的應用體現裡，某一檢體內含帶了正常的核糖核酸52與攜有一個變異點(圖內以實心三角形來表示)的突變型核糖核酸51。檢體與反向野型去氧核醣核酸的探針62雜交後，正常的核糖核酸52與探針62形成了完全吻合配對的核糖核酸：去氧核醣核酸的混合雙鏈72。反之，突變型的混合雙鏈71則在變異處出現無法吻合配對的核糖核苷酸51a。經由核糖核酸的水解，這無法吻合配對的核糖核苷酸51a被水解，而在核糖核酸51鏈上產生缺口71a並釋出一個新的三偏端羥基(-OH)。這被啄斷並帶有三偏端羥基的核糖核酸51則可成為RNA-primed DNA聚合酶的引物，並以去氧核醣核酸的探針61為模板，開始序列延伸而複製新的去氧核醣核酸鏈，進而產生一個具特異性的黏著三偏端80。反之，正常的核糖核酸52則因與探針62完全吻合配對而被完全保護住。因此，無法被RNA-primed DNA聚合酶利用來進行序列延伸，而維持原本平整的三偏端。此後，再加入相吻合的適配鏈81，選擇性地與突變型混合雙鏈71上的黏著端80相接合，而產生突變型-適配鏈雜合體91。反之，正常的混合雙鏈72卻無法與適配鏈81相接合。如此形成的突變型-適配鏈雜合體91，則可經由聚合酶連鎖反應的複製放大，而很靈敏地被檢測與定量。假若適配鏈81攜帶有可供辨識的標記，也可藉由該標記直接進行檢測與定量。

為了使以上一連串的分子生化反應易於操作，甚至能被全自動、或半自動化，本發明更進一步地把本基因變異檢體的檢測方法建構於固體界面上。在此所謂的固體界面，包括而不限於，一種可供固定的薄膜、玻片、多井盤(multiwell microplate)、試管、顆粒、晶片、以及以上不同的組合。而用來固定去氧核醣核酸或核糖核酸於固體界面上的方法，可以是任何已知的方法，包括而不限於，streptavidin、silicane、磁性、或其他晶片及微陣列用的黏著法。

第5圖描繪一種固體界面上、無限制性的應用體現。此法可用來檢測單一檢體內的某一基因或序列片段，也可用來檢測多個不同檢體內的多種不同基因或序列片段。一般而言，先行固定單鏈野型反向序列的去氧核醣核酸探針於固體界面上，譬如，利用攜有biotin的探針，以共價鍵的力量牢固地固定於streptavidin的磁性顆粒、或固定於鋪了streptavidin的多井盤。再使之與檢體內的核糖核酸雜交，而形成核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈。經由上述的阻斷淨化處理後，再以核糖核酸水解並進行差異性序列延伸。由於固定於固體界面上的探針，預先隱埋了內切限制酶的序列，含帶突變型的混合雙鏈因而藉由差異性序列延伸，使得隱埋的限制酶序列顯現。由於以上一連串的生化反應及步驟乃於固體界面上操作，僅靠簡便的反覆洗濯與更換必要的試劑即可順利施行。直至最後因差異性序列延伸而使得突變型混合雙鏈顯現限制酶序列時，再利用該限制酶輕易地把突變型混合雙鏈切離固體界面，並使之產生該限制酶特有的黏著端。此刻，即可輕易地吸汲出，並與相吻合的適配鏈接合，而形成突變型-適配鏈雜合體。接著，藉由聚合酶連鎖反應的複製放大，即可靈敏地檢測與定量檢體內所含帶的基因變異。

如第6圖所描繪，本發明更進一步地揭露了另一個無限制性的、應用於固體界面上的檢測法。此法擴增本發明所能檢測的涵蓋範圍，亦即以高效率、自動化的方式來同步檢測多個不同檢體內多種不同基因序列或片段的變異。此法沿自第5圖所描繪的方法，但略加修飾。簡而言之，如第5圖所描繪，本檢測法以帶磁性的streptavidin顆粒或鋪有streptavidin的多井盤為固體界面。與第5圖所描繪的方法相較，其最主要的差別在於用來檢測的野型反向序列探針的三偏端帶有T7及M13的反向序列。經由如此修飾，使得藉由差別性序列延伸、限制酶切離固體界面、適配鏈接合所產生的突變型-適配鏈雜合體，無論其基因變異的來源，均於其正向鏈的五偏端含帶T7-M13的序列，而三偏端均帶有適配鏈序列。因此，檢體內所有的基因變異，無論來源如何，均可用T7與適配鏈的序列為引物以及M13的序列為探針，經由聚合酶連鎖反應的複製與放大，而很靈敏地檢測出。由於檢體內可能含帶類似基因的核糖核酸，與欲檢測基因的序列可能造成混淆。因此，施行此基因變異檢體的檢測方法之前，若先把欲檢測基因的核糖核酸複製放大，可避免因類似核糖核酸的存在所造成背景雜訊。

如第7a圖以及第7b圖所描繪，本發明更進一步地揭露了另一個無限制性、可應用於固體界面上或一般液體溶液的檢測法。此法可避免類似基因所造成的背景雜訊，無需在檢測前繁複地複製放大多種不同欲檢測基因的核糖核酸，得以直接採用檢體內原有的核糖核酸；或為了增強檢測的靈敏度，得先以簡便的方法整體性地把檢體內所有的核糖核酸複製放大。此法的特點在於採用雙適配鏈接合，其一為阻斷適配鏈，而另一則為可供偵測、帶標記的適配鏈。第7a圖以及第7b圖所描繪僅為一例，其施行不限於此例。簡而言之，先行製作多種五偏端帶有"TT"雙胸腺嘧啶脫氧核苷酸的反向野型探針，此等探針可如前述被固定於固體界面上、或懸浮於液體內。令此等探針與檢體內的核糖核酸雜交，而形成多種不同的核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈後，即並用Klenow酶、Taq DNA酶與脫氧腺瞟昤核苷酸進行序列延伸，使得各不同混合雙鏈的三偏端均帶有單一腺瞟昤核苷酸的懸突物。此時，加入前述的阻斷適配鏈，來阻斷混合雙鏈三偏端上的單一腺瞟昤核苷酸懸突，再以核糖核酸酶來水解。水解後的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體有三大類：其一、完全吻合配對不被水解的正常野型混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體；其二、多處且多核苷酸不吻合配對而被水解的類似基因序列與正常野型探針所形成的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體；其三、單一核苷酸不吻合配對而被水解的突變序列與正常野型探針所形成的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體。若採用的是游離懸浮於液體的探針，此時應把水解後的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體等分為四；若採用的是固體界面檢測法，則應預先把檢體等分為四，再使之與固體界面上的探針雜交。等分為四的目的，乃欲分別以脫氧腺嘌呤核苷酸、脫氧鳥瞟呤核苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸、脫氧胸腺嘧啶核苷酸及Klenow酶施行單一序列延伸。倘若被水解的突變序列為鳥瞟呤核苷酸，水解的缺口即可因脫氧腺嘌呤核苷酸單一序列延伸而被補位充填，而其它脫氧核苷酸的序列因無法延伸而仍含缺口；此外，多處且多核苷酸不吻合配對而被水解的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體，在單一脫氧核苷酸序列延伸後，仍無法完全被補位充填而呈多處缺口。此時，加入嗜單鏈S1核酸酶，於缺口處切斷混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體。經由單一脫氧核苷酸補位充填及S1核酸酶處理後的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體有四大類：其一、完全吻合配對不被水解的正常野型混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體，此等雜合體因不帶可茲利用的三偏端羥基，無法再序列延伸；其二、多處被水解、切斷的類似基因序列與正常野型探針所形成的混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體，也因不帶可茲利用的三偏端羥基，無法再序列延伸；其三、未被適確充填的突變形混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體，被切斷也不帶可茲利用的三偏端羥基，而無法再序列延伸；其四、適確充填而被保護住的突變形混合雙鏈-阻斷適配鏈雜合體，在充填處含帶可滋利用的三偏端羥基，因而得以序列延伸。此時，同時加入四種脫氧核苷酸及Taq DNA聚合酶(或Klenow酶、或並用Klenow/Taq DNA酶)，即能藉由充填處為起點、以接合了阻斷適配鏈的野型探針為模板，來複製新脫氧核酸鏈。此新合成的脫氧核酸鏈，不僅取代了阻斷適配鏈，更在三偏端造成單一脫氧腺嘌呤核苷酸懸突。因此，與帶標記的適配鏈接合後，便形成可供偵測定量的突變型-雙適配鏈雜合體。此雙適配鏈雜合體具有高特異性，僅在單一核苷酸基因序列突變方能形成。此雙適配鏈雜合體又具廣泛性，無論基因突變的來源如何，雙適配鏈的接合均一致。因而，得以藉此等序列為引物及探針，施行聚合酶連鎖反應來複製、放大、偵測與定量。

本發明還揭露了另一個應用於固體界面上的檢測法。如第8圖所描繪，此法包括但不限於，把不同的單鏈野型反向序列的探針，以微陣列的格式固定於固體界面上的不同位置。為了確認檢測的可靠性，可把相同的探針重複地固定於兩個、或兩個以上的不同位置上。譬如，A1及B1；A2及B2；A3及B3；A4及B4；乃至於An及Bn各自成對。假若A1(B1)、A3(B3)及A4(B4)的位置上，有突變的核糖核酸與之雜交，則可藉由核糖核酸酶的水解與差異性序列延伸而製造出不平整且具黏著性的三偏端，因而能與帶有標記的適配鏈相接合；反之，其它位置上的混合雙鏈未被水解、無序列延伸，因而無法與帶標記的適配鏈相接合。此時，藉由適當的檢測器或檢測法，則可於而A1(B1)、A3(B3)及A4(B4)的位置上，很簡易地檢測出帶有突變型的雜合體。倘若這些不同位置上相同的探針都呈現相吻合的反應結果，更能肯定本檢測法的可靠性。值得一提的是，倘若並用Klenow酶及Taq DNA聚合酶進行差異性序列延伸，為了避免固體界面上的探針的三偏端被加接單一脫氧腺嘌呤核苷酸，而形成單一脫氧腺嘌呤核苷酸的突出，此等探針的三偏端應先以雙脫氧鳥瞟呤核苷酸(2',3'-dideoxyguanidine 5'-triphosphate)、雙脫氧胞嘧啶核苷酸(2',3'-dideoxycytidine 5'-triphosphate)或雙脫氧胸腺嘧啶核苷酸(2',3'-dideoxythymidine 5'-triphosphate)來阻斷。另外，如第一、二、三圖所描繪的雜訊減弱措施，在此也都可施用。誠如前述，施行此檢測法之前，若先把多種不同欲檢測基因序列的核糖核酸複製放大，再與固定於固體界面上的探針雜交，得以避免類似基因序列可能造成的雜訊。

本發明還揭露了另一個應用於固體界面上的檢測法。如第9圖所描繪，此法合併第7a圖以及第7b圖雙適配鏈接合的原理與第8圖微陣列固定多種不同野型探針的格式。其操作的流程及應用的生化反應，與第7a圖以及第7b圖所描繪的相同，在此不再重複贅述。其差別在於所採用的探針乃以微陣列的格式被固定於固體界面上；此外，各檢體均得一分為四，而個別採用不同的單一脫氧核苷酸充填。如同第8圖所描繪，為了確認檢測的可靠性，可把相同的探針重複地固定於兩個、或兩個以上的不同位置上。與第8圖所描繪的檢測法相比較，此法簡化了複製放大多種不同欲檢測基因核糖核酸的繁覆操作程序。因此，得以簡便地、廣泛性地複製放大檢體內所有的核糖核酸，或直接以檢體內的核糖核酸與固定於微陣列上的探針雜交，而不虞因類似基因序列的存在而造成雜訊。

本發明又揭露了另一個應用於固體界面上的檢測法。如第10圖所描繪，此法先把欲檢測的細胞或組織切片固定於玻片上。此時，所述的核糖核酸是位於該細胞內或該組織切片內。在固定的過程中，特意保存了細胞的形態以及細胞內核糖核酸的完整。為了增強檢測的訊號，可藉用任何已知核糖核酸轉錄術來複製欲檢測基因或序列片段的核糖核酸。譬如，包括而不限於，回饋式核糖核酸錄製放大術。之後，即於玻片鋪上單鏈野型反向序列的探針，使之與細胞內的核糖核酸雜交而形成核糖核酸：去氧核醣核酸混合雙鏈。一如前述，在必要的阻斷處置後，便接著在玻片上進行核糖核酸水解、差異性序列延伸、以及使之與帶有標記的適配鏈相接合。由於，僅限於含帶突變型混合雙鏈的細胞可與帶有標記的適配鏈相接合，突變細胞可因而在顯微鏡下、或經由顯微攝影術，觀察細胞形態也同時於細胞原位檢測到基因的變異。更進一步地，惝若並用幾個不同探針，而各探針各自帶有不同的標記與其獨特的黏著端，即可於細胞原位上，同時檢測到兩種或更多不同基因的變異。譬如，探針"甲"隱埋"甲"限制酶序列並攜有"甲"螢光劑、探針"乙"隱埋"乙"限制酶序列並攜有"乙"螢光劑、探針 "丙"隱埋"丙"限制酶序列並攜有"丙"螢光劑等等。如此一來，此等基因的變異是否發生在同一細胞內，或者不同的細胞上各有其不同的變異組合，均可一目瞭然地辨識出。

第11圖及第12圖代表性地描繪兩種自動化基因變異檢測儀的鳥瞰圖。以相似的原理在固體界面上自動化操作本基因變異檢體的檢測方法的儀器，包括而不限於這兩種設計裝置。在此僅以帶磁性的streptavidin顆粒為例而描繪，其調控、操作的生化反應則如第5圖、第6圖所示。第11圖所描繪的檢測儀設有兩間反應室，其中一室至少設有一個磁性裝置。第10圖所描繪的檢測儀則僅有一個反應室，而其內也至少設有一個磁性裝置；且該磁性裝置可藉由電源或其它方法，而使磁性時有時無，使磁性裝置得以與檢體相靠近或或相分離。於帶磁的環境裡，固定於固體界面上的探針、核糖核酸混合雙鏈等等，均被緊密地吸附於管壁或井壁上，因而即使反覆洗濯與更換試劑也不虞丟失檢體及其產物。反之，當磁性消失時，試劑與固體界面上的探針、檢體及其產物等等，即可充分混勻，以便操作本發明所需的一連串的生化反應。

第11圖所描繪的儀器"10"內，設有標示為"13"及"14"兩間反應室。這兩間反應室相連，而兩室之間隔了一片標示為"15"的門。此門隨著檢測反應的需要可開可關，關閉時可避免標示為"13"及"14"的兩間反應室相互連通，而各自成為獨立的反應室。另外，反應室"14"內設有溫度調控器及螢光測量器"19"，可隨檢體反應的需求而改變溫度，也可追蹤偵測檢體內螢光的累積與變化。一般而言，由於檢體的洗濯與更換試劑可在室溫進行，反應室"13"可以不裝設溫度調控器。標示為"12"的是檢體容器，包括而不限於，多井盤、微試管、小水瓶或其它適用的容器。一般而言，若使用的是微試管、小水瓶之類的容器，則被放置於支架、平臺或板面上而成一個單元，以便同時一起被移動。若使用的容器是多井盤，可讓數個多井盤一起放置在同一平臺或板面上。以上的安排設計，其目的在於省時又高效率地同步偵測多個不同檢體。此外，"13"及"14"的兩間反應室可設有標示為"16"的軌道，以便依反應、洗濯與更換試劑所需，藉由標示為"17"的馬達推動，而使檢體在兩室間進出。倘若不使用上述的軌道，也可在兩室間的門框"15"設置械臂，藉由械臂的擺動來使檢體在兩室間進出。而標示為"13"的反應室，至少設有一個標示為"11"的磁性裝置。此磁性裝置的數目並無限制，只要能使得與標示為"12"的檢體容器適當地接觸即可。標示為"11"的磁性裝置可以是任何形狀，但必須能與標示為"12"的檢體適當地接觸。第9圖所描繪的反應室"13"設有三條磁棒，當檢體被移近磁棒時，固定在固體界面上的探針、核糖核酸混合雙鏈等等，均被緊密地吸附於標示為"12"的容器壁上，使洗濯與更換試劑得以很簡易地操作而不虞丟失。而標示為"14"的反應室，並無磁性裝置。此反應室乃為進行本發明所需的各種生化反應及掃描偵測檢體而設。最後，反應室"13"的頂壁或其它位置，應設有一個械臂來推動操控多管腔吸汲器"18"，以便適時移近標示為"12"的檢體容器，來進行洗濯固定於固體界面上的探針與檢體以及更換必要的試劑。標示為"18"的多管腔吸汲器與標示為"19"的溫度調控器及螢光測量器，在第9圖內並無具體勾劃出來，僅以文字描述以茲代表。

第12圖所描繪的儀器"20"內，設有一間反應室，且有標示為"25"的一扇門。此門關閉時，可使標示為"23"的反應室與外界隔離。與第9圖所描繪的儀器"10"一樣，儀器"20"內有標示為"22"的檢體容器。此容器包括而不限於，多井盤、微試管、小水瓶或其它適用的容器。此外，儀器"20"設有標示為"21"的電磁裝置，隨著電流的開關，磁性時有時無。只要能與標示為"22"的檢體適當地接觸，此電磁裝置可以是任何形狀。第12圖的上半描繪的是當反應室在帶磁的情況(標示為"23")，而下半圖則描繪反應室在無磁的情況(標示為"24")。一般而言，帶磁時固體界面上的探針、核糖核酸混合雙鏈等等，均被緊密地吸附於標示為"22"的容器壁上，以便洗濯與更換試劑。反之，無磁時固體界面上的探針、核糖核酸混合雙鏈等等，可與試劑充分均勻混合，使得必要的生化反應能在最合適的條件下，簡易而有效率地進行。若使用的固體界面不帶磁性，譬如但不限於鋪蓋一層streptavidin的多井盤，則第12圖所描繪的儀器"20"也可不設磁性裝置。雖然第12圖並沒描繪到，儀器"20"內還有一個標示為"28"的械臂來推動操控多管腔吸汲器。與第11圖的儀器"10"一樣，它是用來移近檢體容器，以便進行洗濯固體界面上的探針與檢體以及更換必要的試劑。另外，在第12圖內並無具體勾劃出來，而僅以文字描述以茲代表的是標示為"29"溫度調控器與螢光測量器，以便隨檢體反應的需求而改變溫度及追蹤偵測螢光的累積與變化。

儀器"10"與儀器"20"內設有的溫度調控器"19"與"29"，可以是而不限於是，一個可由械臂控制移動的調溫板蓋。隨檢測反應的須要，可適時移近而蓋住檢體容器，使得檢體能改變或保持反應所須的溫度；在洗濯檢體及更換試劑時，此控溫板則被移開，以便多管腔吸汲器得以移近檢體。一般而言，此控溫板的溫度低可至攝氏零度，而高可達攝氏一百多度。另外，裝置"19"與"29"還有螢光偵測的功能，以便追蹤記錄螢光的變化。換言之，若在差別性序列延伸與適配鏈接合反應後，於檢體內加入帶螢光劑的探針以及適當的引物，即可直接在儀器"10"或儀器"20"內進行所謂的"即時聚合酶連鎖反應(realtime PCR)"來偵測突變型-適配鏈雜合體。"19"與"29"所謂的溫度調控器與螢光測量器可合二為一，亦可是兩個個別獨立的裝置。

本發明還包括了另一個無限制性的應用體現，亦即與本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法相關的產品。簡言之，乃是提供成套或半成套的用具組合以及教導如何操作本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法的使用指南。這使用指南可以是印刷品，也可以是任何經由電腦解讀的媒體，或是兩者並用。這成套或半成套的用具組合，可以是因應特定需求，而特別製作組合來分析偵測與某種疾病或病變有關的某一或某些基因序列的變異；也可以是因應廣泛需求，而選定某一或某些常見疾病或病變，而製作組合來檢測有關的某一或某些基因序列的變異；或者與病變無關，僅廣泛性地組合了施行本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法所需的全部或部分的試劑。一般而言，這成套或半成套的用具組合，包含了操作本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法所需的部份或全部的試劑，以及執行聚合酶連鎖反應所需的引物、酶、探針合成單鏈反向野型去氧核醣核酸探針的方法來製作，也可以使用任何目前已知的分子生物學的方法、人工或機械式生化合成的方法來製作。一如前述，這些探針得以接貼可供偵測辨識的標記。這些探針可以是粉劑、溶解於液體的溶液、或固定於固體界面上。這些粉劑或液體的探針可以個別單獨存在，也可以相互混合使用。同樣地，固定於固體界面上的探針，也可以各自分別地固定於固體界面上的某特定點，或混合後再固定於固體界面上的某特定點。在此所謂的固體界面，包括而不限於，玻片、薄膜、微試管、多井盤等等可固定核糖核酸或去氧核醣核酸的媒介物。而其固定的形式，包括而不限於，微陣列或其它任何排列。其固定法不限於前述的Streptavidin與biotin間所形成的共價鍵，目前任何已知的固定核糖核酸或去氧核糖核酸的方法均適用。而被檢測的核糖核酸，可直接來自檢體或經由前述的各種核糖核酸複製法，加以複製放大後再檢測。一般而言，這成套的用具組合可用來檢測至少下列任何一個、一類或各類不同基因或基因序列的變異，包括而不限於：(1)一套偵測致癌基因(oncogenes)變異的試劑組合，包括而不限於，K-ras,N-ras,H-ras,Src,BCR-ABL,c-myc等等；(2)一套偵測腫瘤壓制基因(tumor suppressor genes)變異的試劑組合，包括而不限於，TP53,P16,Rb1,NF1等等；(3)一套偵測不吻合序列修復基因(mismatch repair genes)變異的試劑組合，包括而不限於，MLH1,MSH2,MDM2,ATM,BRCA1等等；(4)一套偵測酪氨酸激酶基因族群(tyrosine kinase genes，又統稱為kinome)變異的試劑組合，包括而不限於，NTRK2,NTRK3,FES,KDR,EPHA3,MLK4,GUCY2F,c-kit,FLT3,JAK2等等；(5)一套偵測生長因子接受體基因族群(growth factor receptor genes)的變異的試劑組合，包括而不限於，EGFR,PDGFR,PDGFR,VEGFR1,VEGFR2,TGF1,TGF 2等等；(6)一套偵測粒腺體內去氧核醣核酸(mitochondria DNA)變異的試劑組合，包括而不限於，粒腺體去氧核醣核酸的D環(D-loop)，或非D環(non-D-loop)的序列；(7)一套偵測單核苷酸多形性差異(single nucleotide polymorphism；簡稱為SNP)的試劑組合，包括而不限於，目前已知的各種多形性差異；(8)一套偵測微衛星序列多形性差異(microsatellite polymorphism)的試劑組合，包括而不限於，目前已知的各種單核苷酸多形性差異；(8)一套偵測免疫球蛋白基因族群(immunoglobulin genes)或T-細胞接受體基因族群(T-cell receptor genes)單克隆重組(monoclonal rearrangement)的試劑組合，包括而不限於，免疫球蛋白重鏈基因(immunoglobulin heavy chain gene)、輕鏈基因(immunoglobulin light chain genes)、T-細胞接受體基因(T-cell receptor,α,β and γ genes)等等；(9)一套偵測致病性微生物或病毒體基因變異的試劑組合，包括而不限於，細菌或病毒體基因變異所導致的抗藥性，譬如第一型人類免疫缺失病毒(HIV-1)pol基因突變、結核桿菌Rpo基因突變、第二型單純性泡疹病毒HSV2的胸腺嘧啶激酶(Thymidine Kinase)基因突變所引起的抗藥性等等。

除了探針與使用指南之外，這成套或半套的用具組合還可包含至少一對引物，各對引物的序列來自於欲檢測基因的序列。另外，還包括了反向轉錄酶(reverse transcriptase)及其緩衝液(buffer)、核糖核酸聚合酶(RNA polymerase)及其緩衝液、Taq DNA聚合酶及其緩衝液、Klenow酶或Klenow exo-酶及其緩衝液、核糖核苷酸及脫氧核糖核苷酸、去氧核醣核酸酶(DNase)及其緩衝液等等，以上部份或全部試劑，以便用來複製放大檢體內的核糖核酸。此外，這成套的試劑組合，還可提供本發明所揭露的背景雜訊減弱阻斷試劑，包括而不限於，Klenow酶或Klenow exo-酶、緩衝液、雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)、偏端脫氧核糖核苷酸轉移酶(TdT)及其緩衝液等等。進而，這成套或半套的用具組合，還可包含本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法所需用的適配鏈、阻斷適配鏈、接合酶及其緩衝液等等。

本發明還揭露其他一些無限制性的應用體現，其中包括利用器械以全自動化或半自動化的方式，來操作上述一連串的反應中的某一步驟、某些步驟或全部所有的反應步驟。另外，也包括在多個檢體裡，以單一整體性的方式，來同步操作必要的反應步驟。這包括了任何適用於操作上述反應步驟的全自動化或半自動化的器械，包括而不限於，移動檢體的馬達械臂、以械臂推動操控的多管腔吸汲器、設有溫度調控器的反應室、電磁裝置、承載檢體的支架等等。以上所闡述的全自動化或半自動化的操作，其目的乃在於以高效率、高容度、同步偵測的方式，來達成同步檢測許多不同檢體的目的。

實例

實例壹、利用具有磁性的Streptavidin顆粒為固體界面來檢測BCR/abl基因的突變

本實例示範藉由固定於Streptavidin磁性顆粒上的野型單鏈反向序列探針為支撐點，來施行一連串的分子生化反應，而達成本發明所描繪的差別性序列延伸。進而，藉由突變型混合雙鏈上新合成的制切酶序列，把突變型混合雙鏈切離固體界面，並與適配鏈接合。如此產生的雜合體，再經聚合酶連鎖反應的複製放大，而很靈敏地偵測到檢體內微量的BCR/abl突變序列。

首先，以涵蓋正常野型c-abl酪氨酸激酶(tyrosine kinase,或簡稱TK)領域的互補性去氧核醣核酸為模板，加上帶有Biotin及Bam H1限制酶序列的反向引物[biotinylated ABL7-Bam(-) reverse primer]，藉由聚合酶連鎖反應來合成單鏈反向序列野型探針。再經由前述的阻斷淨化處理後，利用零點一摩爾濃度的氫氧化鈉(0.1 M NaOH)把聚合酶連鎖反應的產物變成單鏈。接著，讓單鏈帶有Biotin並包埋Bam H1限制酶序列的反向野型探針，於室溫下與帶磁性的Streptavidin顆粒在微離心管內或多井盤內混勻。約十五分鐘後，探針即可以共價鍵的力量，牢牢地固定在具有磁性的Streptavidin顆粒上。此時，把攜帶探針與Streptavidin磁性顆粒的微離心管或多井盤放置於磁架或帶磁的裝置上，含帶探針的Streptavidin磁性顆粒，便被緊密地吸附在管壁或井壁上。因而，可很簡易地以低鹽中性的沖洗溶劑反覆洗濯，而不虞丟失。

之後，即可使檢體內的核糖核酸與固定在Streptavidin磁性顆粒上的野型探針，在無磁的環境裡混勻雜交。為了增強檢測的靈敏度，檢體內的核糖核酸需先轉化成互補性去氧核醣核酸(cDNA)，再經由聚合酶連鎖反應來複製放大含帶T7 RNA聚合酶促進因子及涵蓋酪氨酸激酶領域的去氧核醣核酸。此時，利用T7 RNA聚合酶來複製放大檢體內涵蓋酪氨酸激酶領域的核糖核酸。更具體地說，即先把檢體內的核糖核酸轉化成互補性去氧核醣核酸，再利用兩回合的聚合酶連鎖反應來複製放大涵蓋c-abl酪氨酸激酶領域的去氧核醣核酸。在第一回合的聚合酶連鎖反應，使用的正向引物BCR2(+)，5'-CATTCCGCTGACCATCAAT-3'，和反向引物ABL7 Bam(-)，5'-TAGGGGAACTTGGATCCAGC-3’，分別來自於BCR的第二exon及ABL的第七exon。此外，反向引物ABL7 Bam(-) 還包埋有Bam H1限制酶序列。其實，它與上述被用來製作探針的反向引物ABL7 Bam(-)的序列相同，其差異僅在不帶Biotin。而在第二回合聚合酶連鎖反應，仍然使用ABL7 Bam(-)為反向引物，只是正向引物則使用來自於ABL的第三exon的T7ABL3(+),5'-TAATACGACTCACTATAGGGATCATTCAACGGTGGCCGAC-3'。必須一提的是，T7ABL3(+)的五偏端帶有T7 RNA聚合酶促進因子的序列。如此複製放大的產物約有650 bp的長度。經由淨化處理後，即可利用T7 RNA聚合酶以及核糖核苷酸(rATP，rCTP，rGTP，和rUTP)來複製涵蓋酪氨酸激酶領域的核糖核酸。其後，再使用去氧核醣核酸酶把檢體內的去氧核醣核酸水解，僅保留住涵蓋c-abl酪氨酸激酶領域的核糖核酸。接著，使之與固定在Streptavidin磁性顆粒上的野型探針，在無磁的環境裡混勻雜交。雜交反應是在含有1.25 M NaCl及10mM Tris pH7.5的緩衝溶液內，於70℃的溫度下進行一小時。

然後再把檢體放回磁架上，使雜交後的核糖核酸、探針、Streptavidin磁性顆粒混合體緊密地吸附於管壁或井壁上。再以低鹽中性的沖洗溶劑反覆洗濯後，把檢體移離磁架。再加入Klenow exo-酶和雙脫氧核苷酸於37℃處理四小時，以便把檢體內游離的三偏端羥基阻斷。其後，也可再用TdT酶和雙脫氧核苷酸處理，使得三偏端游離羥基的阻斷更加完善。

再把檢體放置於磁架上，使阻斷後的核糖核酸、探針、 Streptavidin磁性顆粒混合體，又緊密地吸附於管壁或井壁。再以低鹽中性的沖洗溶劑反覆洗濯後，即把檢體移離磁架，並加入核糖核酸酶於37℃水解一小時，以便把突變型上不吻合配對的核糖核苷酸水解，而釋放出游離的三偏端羥基。

水解後再把檢體放回磁架上，使固定於Streptavidin磁性顆粒上的混合體，又緊密地吸附於管壁或井壁。再以低鹽中性的沖洗溶劑反覆洗濯後，又把檢體移離磁架，並加入Klenow酶、Taq DNA聚合酶和脫氧核糖核苷酸混勻。先於37℃中處理三十分鐘，以便藉由Klenow酶所擁有的RNA-primed DNA polymerase的特性，使被水解的突變型核糖核酸能以探針為模板而開始進行序列延伸。再把反應溫度提昇至70℃中執行三十分鐘，以便藉由Taq DNA聚合酶使序列延伸更加長遠。此時，由於差別性序列延伸的效應，突變型混合雙鏈上的核糖核酸鏈，由水解缺口處起，為去氧核醣核酸鏈所取代。因此，隱埋於探針裡的Bam H1限制酶序列完全顯現。反之，正常野型混合雙鏈由於無法序列延伸，仍然保留住原有的核糖核酸鏈。因此，探針裡的Bam H1限制酶序列依舊被隱埋保護著。

差別性序列延伸後，再把檢體放置於磁架上，使固定於Streptavidin磁性顆粒上的混合體，又緊密地吸附於管壁或井壁。再以低鹽中性的沖洗溶劑反覆洗濯後，又把檢體移離磁架，並加入Bam H1限制酶，以便把突變型混合雙鏈切離帶磁的雜合體。Bam H1限制酶處理所需的時間，端視該限制酶的活性而不一。快者僅需五~十分鐘，慢者則需數小時不等。

Bam H1限制酶處理後，再把檢體放置於磁架上。此時，正常野型混合雙鏈仍舊被固定於Streptavidin磁性顆粒上，而緊密地吸附於管壁或井壁。反之，突變型混合雙鏈則因被切離帶磁的混合體，而得以輕易地吸汲出，再與預先準備好的Bgl II適配鏈做接合反應。

Bgl II適配鏈乃由兩段序列互補的寡脫氧核糖核苷酸鏈(oligonucleotide)雜交後，先以Bgl II限制酶切斷，再去燐基而形成。此正向序列的寡脫氧核糖核苷酸鏈稱謂為Adp Bgl(+)，其序列如下：5'-GAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCT-3’。而反向序列鏈稱謂為Adp Bgl(-)，其序列如下：5'-AGGCAGTTTCGGGCAGCAAGATCTC-3’。在50 mM NaCl和10 mM Tris,pH8.3的緩衝液中，以克分子數相等的Adp Bgl(+)與Adp Bgl(-)於65℃雜交三十分鐘後，把溫度降為37℃再加入Bgl II限制酶處理四小時。此時切斷點的五偏端懸突帶有“GATC”四個核苷酸序列。此序列恰與BamHII限制酶切斷所形成的黏性末端相容而得以相接合。

接合後形成的突變型-適配鏈雜合體，即再以兩回合的聚合酶連鎖反應來複製放大而檢測。第一回合所採用的正反向引物分別為：TKF1(+)，5'-GAGAACCACTTGGTGAAGGT-3’，和AdpR(-)，5'-AGGCAGTTTCGGGCAGCAAGATC-3’。正向引物 TKF1(+)的序列來自於abl TK；而反向引物AdpR(-)的序列與上述Adp Bgl(-)相同，但在三偏端短少了"TC"兩個脫氧核糖核苷酸。如此設計乃因Bgl II適配鏈在被Bgl II限制酶切斷後，"TC"這兩個脫氧核糖核苷酸已被切離丟失。而第二回合的聚合酶連鎖反應，則在含帶螢光測試器的即時聚合酶連鎖反應器內進行。其施行除了使用反向引物AdpR(-)外，還有正向引物TKF2(+)，5'-TGAGCAGGTTGATGACAGG-3'，以及帶有雙螢光標記的探針ABLTKR，5'-(6-FAM)-GCATGGGCTGTGTAGGTGTC-(TAMRA)-3’。此外，並把一個已知含有百分之一百費城染色體(Philadelphia chromosome，簡稱Ph chromosome)又有E355G突變的陽性檢體，以十倍的係數做一系列的稀釋而成一套由1：10，1：10²，1：10³，1：10⁴，乃至1：10⁵不同濃度的陽性樣本做比照標準，以便確定本BCR/abl TK突變檢測法的靈敏度。這套不同濃度的陽性樣本，也可用來與欲偵測的檢體相比較，而推測定量檢體內含帶突變型的濃度。

如第13a圖所展現，五個不同濃度的陽性檢體均呈現出清晰的螢光累積放大圖形，其強度隨著陽性的濃度減低而變弱。以另一種方式來表達，即隨著陽性濃度的減低，所需要的聚合酶連鎖反應的循環數也隨之增多，方足以被螢光檢測器偵測出來。以本實驗為例，即使在1：10⁵的陽性濃度，螢光累積放大圖仍然清晰易辨。反之，在陰性對照組裡的十二個檢體，全都無法形成平穩可辨識的放大圖形。

第13b圖展示三個不同濃度的陽性檢體(1：10，1：10³及 1：10⁵)，一個對Imatinib有抗藥性的檢體(標示為"A")，一個Imatinib治療後費城染色體消失但仍可被本發明所揭露的檢測法偵測出含帶BCR/abl TK突變的檢體(標示為"B")，一個Imatinib治療後費城染色體消失而本實驗呈陰性的檢體(標示為"C")，以及三個陰性控制組的檢體(標示為"D","E"，及"F")。

本實驗總共檢測了二十八個檢體，其中四個對Imatinib有抗藥性並含帶百分之三十五以上的費城染色體。這四個檢體在本實驗均呈陽性，而其濃度與上述的陽性對照組相較，分別為9 x 10^-2、2.76 x 10^-1、1.71 x 10^-1、及4.89 x 10^-1。把這些檢體施行去氧核醣核酸序列分析，如第13c圖所示，更進一步地確定其突變分別是：Y253D、E255V、T351I、及F317L。

另外，還有十二個是Imatinib治療後費城染色體消失的檢體。由於去氧核醣核酸序列分析的靈敏度僅止於百分之十左右，這十二個檢體均無法以序列分析來檢測出突變。但是，藉由本發明所揭露的檢測法，其中兩個呈現陽性，其濃度陰性分別為7.65 x 10^-3及1.36 x 10^-2。最後，如圖13a所示，陰性對照組裡的十二個檢體在本實驗全呈陰性。

實例貳、以鋪有Streptavidin的多井盤為固體界面，固定住接合了T7M13序列的野型K-ras及TP53的探針，來偵測出K-ras及TP53基因的突變。

本實例示範藉由固定於鋪有Streptavidin的多井盤上的多種不同野型反向序列的探針為支撐點，來施行一連串的分子生化反應，而達成本發明所描繪的差別性序列延伸。除此以外，本實例的特點在於所採用的野型探針均接合了T7M13的序列。因此，在突變型混合雙鏈被限制酶切離固體界面後，與適配鏈接合所形成的雜合體，無論其突變基因的來源如何均具有一個共同特性，亦即其五偏端均帶有T7M13的序列，而三偏端均帶有適配鏈的序列。因而，得以T7與適配鏈的序列為正反向引物、以M13的序列為探針，再經聚合酶連鎖反應的複製放大，而簡易並靈敏地偵測到檢體內欲檢測基因的突變。

首先，以帶有T7M13的序列的正向引物與帶有Bam H1限制酶序列的反向引物，施行聚合酶連鎖反應來複製涵蓋正常野型Abl TK、K-ras及TP53的去氧核醣核酸。此等引物的序列分別為：T7M13K-ras(+),5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTTTTCCCAGTCACGACGGCCTGCTGAAAATGACT GAA-3'及K-ras Bam(-),5'-GTCCTCATGTACTGGATCCCTCATTG-3'；T7M13TP53(+),5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATTCGTTTTCCCAGTCACGACGTCTGGGCTTCTTGCATTCTG-3'及TP53 Bam(-),5'-TCTGAGTCAGGATCCTTCTGTC-3'。以如此產物為模板，分別各自使用帶有Biotin的反向引物[biotinylated K-ras Bam(-)及biotinylated TP53 Bam(-)]，即可藉由聚合酶連鎖反應來合成帶有Biotin的單鏈正常野型K-ras及TP53的探針。再經由前述的阻斷淨化處理後，利用零點一摩爾濃度的氫氧化鈉(0.1 M NaOH)把聚合酶連鎖反應的產物變成單鏈。接著，讓單鏈帶有Biotin並包埋Bam H1限制酶序列的反向野型探針，於室溫下與鋪有Streptavidin的多井盤接合固定十五分鐘。探針即可以共價鍵的力量，牢牢地被固定在多井盤上。此後，即可很簡易地以低鹽中性的沖洗溶劑，在自動化的多井盤洗濯器上反覆洗濯而不虞丟失。

吸乾沖洗劑之後，即可於多井盤上的井內，個別加入欲檢測的檢體，使檢體內的核糖核酸與固定在多井盤上的野型探針雜交。為了增強檢測的靈敏度，檢體內的核糖核酸需先轉化成互補性去氧核醣核酸，再經由聚合酶連鎖反應來複製放大含帶T7 RNA聚合酶促進因子與涵蓋K-ras及含帶T7 RNA聚合酶促進因子與涵蓋TP53的去氧核醣核酸。此時，利用T7 RNA聚合酶來複製放大檢體內涵蓋K-ras及TP53的核糖核酸。更具體地說，即先把檢體內的核糖核酸轉化成互補性去氧核醣核酸，再利用上述的T7M13K-ras(+)及K-ras Bam(-)、T7M13TP53(+)及TP53 Bam(-)為引物，施行聚合酶連鎖反應來複製放大檢體內涵蓋K-ras及TP53的去氧核醣核酸。由於此等產物的五偏端帶有T7 RNA聚合酶促進因子的序列，經由淨化處理後，即可利用T7 RNA聚合酶以及核糖核苷酸(rATP，rCTP，rGTP，和rUTP)來複製檢體內涵蓋K-ras及TP53的核糖核酸。其後，再使用去氧核醣核酸酶把檢體內的去氧核醣核酸水解，僅保留住涵蓋K-ras及TP53的核糖核酸。接著，使之與固定在鋪有Streptavidin的多井盤上的單鏈野型 K-ras及TP53的探針雜交。雜交反應是在含有1.25 M NaCl、30% formamide及10mM Tris pH7.5的緩衝溶液內，於50℃的溫度下進行兩小時。

然後再把多井盤內的檢體放置於多井盤洗濯器上，以低鹽中性的沖洗劑反覆洗濯。再加入Klenow exo-酶和雙脫氧核苷酸於37℃處理兩小時，以便把檢體內游離的三偏端羥基阻斷。其後，再把檢體放回多井盤洗濯器上，以低鹽中性的沖洗劑反覆洗濯。之後，再用TdT酶和雙脫氧核苷酸處理，使得三偏端游離羥基的阻斷更加完善。再以低鹽中性的沖洗劑，於多井盤洗濯器上反覆洗濯後，加入核糖核酸酶於37℃水解一小時，以便把突變型上不吻合配對的核糖核苷酸水解，而釋放出游離的三偏端羥基。

水解後，再以低鹽中性的沖洗劑反覆洗濯，再加入Klenow exo-酶、Taq DNA聚合酶和脫氧核糖核苷酸。先於37℃中處理三十分鐘，以便藉由Klenow exo-酶所擁有的RNA-primed DNA polymerase的特性，使被水解的突變型核糖核酸能以探針為模板而開始進行序列延伸。再把反應溫度提昇至65℃中執行三十分鐘，以便藉由Taq DNA聚合酶使序列延伸更加長遠。此時，由於差別性序列延伸的效應，突變型混合雙鏈上的核糖核酸鏈自水解缺口處起，轉變成去氧核醣核酸鏈。因此，隱埋於探針裡的Bam H1限制酶序列完全顯現。反之，正常野型混合雙鏈由於無法序列延伸，仍然保留住原有的核糖核酸鏈。因此，探針裡的Bam H1限制酶序列依舊被隱埋保護著。

差別性序列延伸後，再把檢體放置於多井盤洗濯器上，以低鹽中性的沖洗劑反覆洗濯，再加入Bam H1限制酶把突變型混合雙鏈切離多井盤。反之，正常野型混合雙鏈仍舊被固定於多井盤上。因此，突變型混合雙鏈得以輕易地被吸汲出，而與預先準備好的Bgl II適配鏈做接合反應。

於此所採用的Bgl II適配鏈的合成，乃由Bgl II限制酶切斷含帶Bgl II序列的Abl TK cDNA，再去燐基而形成。此Bgl II適配鏈約為~180 bp長，其切斷點的五偏端懸突帶有“GATC”四個核苷酸序列，恰與BamHII限制酶切斷所形成的黏性末端相容而得以相接合。

接合後形成的突變型-適配鏈雜合體，即再以兩回合的聚合酶連鎖反應來複製放大而檢測。第一回合所採用的正反向引物分別為：T7M(+)，5'-ATACGACTCACTATAGGGAATTC-3’，和Abl7D(-)，5'-TCAGCTACCTTCACCAAGTG-3’。正向引物T7M(+)的序列，來自於上述T7M13K-ras(+)與T7M13TP53(+)；而反向引物Abl7D(-)的序列，來自於上述Bgl II適配鏈。而第二回合的聚合酶連鎖反應，則在含帶螢光測試器的即時聚合酶連鎖反應器內進行。其施行除了使用正向引物T7M(+)外，還有上述的反向引物AdpR(-)，以及帶有雙螢光標記的探針M13R，5'-(6-FAM)-GTCGTGACTGGGAAAACGAATTCC-(TAMRA)-3’。另外，並把一個含有百分之一百K-ras G012V突變的大腸癌細胞株SW480的陽性檢體，以十倍的係數做一系列的稀釋而成一套由1：10，1：10²，1：10³，1：10⁴，乃至1：10⁵不同濃度的陽性樣本做比照標準，以便確定本接合T7M13序列的基因變異檢體的檢測方法的靈敏度。

如第14a圖所展現，五個不同濃度的陽性檢體均呈現出清晰的螢光累積放大圖形，其強度隨著陽性的濃度減低而變弱。以本實驗為例，即使在1：10⁵的陽性濃度，螢光累積放大圖仍然清晰易辨。反之，在陰性對照組裡的兩個檢體，全都無法形成平穩的放大圖形。

第14b圖展示三個不同的陽性檢體SW480大腸癌細胞株，Hct-15大腸癌細胞株及Ryan淋巴癌細胞株，以及兩個陰性控制組的檢體。

把這三個陽性檢體施行去氧核醣核酸序列分析，如第14c圖所示，更進一步地確定其突變分別是：SW480大腸癌細胞株帶有K-ras G012V及TP53 R273H；Hct-15大腸癌細胞株帶有K-ras G013D及TP53 S241F；Ryan淋巴癌細胞株的K-ras同時帶有W019F及T020S，而TP53帶有D281Y。值得一提的是Ryan淋巴癌細胞株的K-ras基因突變發生在罕見的第19及第20 codons。雖然此二變異罕見，經由兩種不同引物、不同聚合酶連鎖反應作基因序列鑒定，均發現此二變異的存在。

由於本實驗僅採用細胞株為檢體，突變型的濃度與定量無關緊要。然而，如實例壹所述，上述陽性檢體的系列稀釋得用來作為比照標準，而推測定量突變型的濃度或拷貝數。

本發明所揭露的儀器、方法和相關產品，能用來檢測發現一個或更多不同基因的變異。在此所謂的“基因變異”包括所有生物、化學、醫藥領域中各種核糖核酸序列與去氧核醣核酸序列的變更，包括但並不局限於，基因單點突變(point mutation)、單一核苷酸序列的多型性差異(single nucleotide polymorphism,SNP)、核酸序列的缺遺(deletion)、核酸序列的加插(insertion)、微衛星序列的不穩定(microsatellite instability)、染色體的移位(translocation)，以及一種或兩種以上不同變異的組合等等。牽涉的範圍無論大小或長短，變異可發生在基因的任何部位或區域。可以發生在去氧核醣核酸(DNA)，也可以在核糖核酸(RNA)。此等基因之變異，可與一種或某些醫學病變或情況有直接或間接關係，譬如是癌症或其它病變。以一個無限制性的實例而言，某些基因的變異可促使細胞的惡性轉變、發展成惡性腫瘤、轉移和導致治療後所引起的抗藥性，也可以是病症演變不同階段的一個特徵。除此之外，還包括而不限於，在正常人之間發現的單一核苷酸序列的多型性差異和微衛星序列多型性差異等等。此等核苷酸序列的多型性差異的變化，可被廣泛地用來檢測細胞內染色體的缺失以及鑒定血液或者骨髓幹細胞移植後細胞的來源。因此，本發明所揭露的儀器、方法和相關產品，可被應用於但並不局限於，以上任何一種、多種或更多其他未提到的不同情況。

本發明所揭露的儀器、方法和相關產品，能用來檢測任何來源的核糖核酸與去氧核醣核酸的樣品。此等樣品可取自於某一個體或器官，更多個體或器官，可以是任何細胞、組織或液體。包括而不限於，血漿、血清、脊椎液、淋巴液、關節液、尿液、眼淚、血液細胞、腫瘤、活體組織切片的樣品。包括而不限於，任何形態樣式的細胞，以及任何培養或重組、複製、分化所衍發出來的細胞、組織或成份。此等樣品可來自任何分子生物學、微生物學或者基因工程重組有關的核糖核酸與去氧核醣核酸。

本發明所揭露的儀器、方法和相關產品，能在數以百萬計的正常細胞中偵測發現到極少量帶有基因變異的突變細胞。比起目前各種基因變異檢體的檢測方法，靈敏度在數十倍到數百倍以上。本發明所揭露的儀器、方法和相關產品，使基因變異的檢測得以在諸多不同檢體裡，同時或依序分別檢查多種不同基因或基因的片段，或是以上任何不同的組合。

本發明所揭露的方法涵具其他基因檢測法所沒有的特異處，亦即結合了核糖核酸酶的處理以及利用本發明所稱謂的差異性序列延伸，導致突變型的序列產生不平整且具特異性的黏著三偏端，以便與相吻合的適配鏈接合。倘若適配鏈帶有標記，此等突變型適配鏈雜合體的存在即可簡易地檢測出。甚至得以利用聚合酶連鎖反應，以"等比級數"的效率來複製放大檢體內微量的突變型-適配鏈雜合體，因而增強了檢測的靈敏度。此外，本發明也揭露了於固體界面上操作本檢測法的可行性。進而，達成了自動化或半自動化同步偵測多個不同檢體內多種不同基因變異的目標。

本發明所揭露描述的各種應用體現，該被視為代表性的展示，不得藉此來限制下述專利所涵蓋的範圍與本質。在研讀本發明專利說明書後，可推演並做出許多不同的修飾與變更。譬如，採用類似試劑的取代物、相同功能的反應等等，又譬如，可斟酌附件的附圖，以推演並做出其他不同的修飾與變更。任何非全面具體性的修飾與變更，均得視為本專利所涵蓋的範圍之內。

50‧‧‧核糖核酸

51‧‧‧第一核糖核酸(突變型的核糖核酸)

52‧‧‧第二核糖核酸(正常的核糖核酸)

61‧‧‧第一去氧核醣核酸探針

62‧‧‧第二去氧核醣核酸探針

71‧‧‧第一混合雙鏈(突變型混合雙鏈)

72‧‧‧第二混合雙鏈(正常的混合雙鏈)

51a‧‧‧第一核糖核苷酸

71a‧‧‧缺口

80‧‧‧三偏黏著端(三偏端)

81‧‧‧適配鏈

91‧‧‧適配鏈雜合體

76‧‧‧游離暴露的三偏端羥基

55‧‧‧轉錄不全的核糖核酸

63‧‧‧阻斷適配鏈

10‧‧‧雙反應室檢測儀

11‧‧‧磁性裝置

12‧‧‧檢體容器

13‧‧‧帶磁反應室

14‧‧‧無磁反應室

15‧‧‧門

16‧‧‧檢體輸送軌道

17‧‧‧檢體容器輸送馬達

18‧‧‧械臂操控多管腔吸汲器

19‧‧‧溫度調控器與螢光測量器

20‧‧‧單一反應室檢測儀

21‧‧‧電磁裝置

22‧‧‧檢體容器

23‧‧‧帶磁環境

24‧‧‧無磁環境

25‧‧‧門

28‧‧‧械臂操控多管腔吸汲器

29‧‧‧溫度調控器與螢光測量器

第1圖描繪一種無限制性的方法，用來減弱本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法的雜訊。於第1圖上方，單鏈反向序列去氧核糖核酸的探針參雜著雙鏈去氧核糖核酸的背景雜訊。此雙鏈的背景雜訊攜有Res限制酶序列。第1圖上方的箭頭，表示以頻切限制酶與Res限制酶切斷雙鏈背景雜訊。

於第1圖中央，雙鏈的背景雜訊被切斷並顯露出Res限制酶序列。

第1圖下方的箭頭，表示以Klenow exo-酶與雙去氧核糖核甘酸阻斷。

於第1圖下方，雙鏈的背景雜訊顯露出的Res限制酶序列懸突端被阻斷並改造單鏈反向序列去氧核糖核酸的探針不受影響。

第2圖描繪另一種無限制性的方法，用來減弱本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法的雜訊。於第2圖上方，單鏈反向序列去氧核糖核酸的探針參雜著雙鏈去氧核糖核酸的背景雜訊。此雙鏈的背景雜訊來自于聚合酶連鎖反應的產物，因此攜有三偏端單一鳥瞟呤懸突。第2圖上方的箭頭，表示以頻切限制酶切斷雙鏈去氧核糖核酸。

第2圖中央，表示阻斷適配鏈。其中，正向鏈的五偏端與三偏端均被磷酸基化。且其中，反向鏈的三偏端攜有單一胸腺密啶懸雙鏈的背景雜訊被切斷並顯露出Res限制酶序列。

第2圖下方的箭頭，表示接合反應。

於第2圖下方，雙鏈的背景雜訊與阻斷適配鏈結合而被阻斷。單鏈反向序列去氧核糖核酸的探針不受影響。

第3圖描繪另一種無限制性的方法，用來減弱本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法的雜訊。

第3圖上方的箭頭，表示與單鏈反向序列的探針()雜交。雜交後，如第3圖中央所示，形成核糖核酸：去氧核糖核酸混合雙鏈。

第3圖下方的箭頭，表示以Klenow exo-酶與雙去氧核糖核甘酸阻斷。此時，如第3圖下方所示，轉錄不全的核糖核酸的三偏端羥基被雙去氧核糖核甘酸阻斷。

第4圖簡單地描繪一種無限制性的方法，以便使用正常野型探針(normal wild-type probe)來施行本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法，而偵測出基因的變異。第4圖由上而下有七個箭頭。第一箭頭表示與正常野型反向序列的探針()雜交。

第二第三箭頭表示以核糖核酸酶水解。此時不配對的核甘酸被水解而釋出三偏端羥基。

第四第五箭頭表示以RNA-primed DNA聚合酶進行差別性序列延伸；此時突變型混合鏈產生特異性的三偏黏著。

第六箭頭表示接合帶標記的適配鏈(Tagged Adapter)81；。接合後，形成可供檢測的突變型適-配鏈雜合體，如第4圖下方左側所示。

第七箭頭表示進行一PCR反應(聚合酶連鎖反應；polymerase chain reaction)。如第4圖下方右側所示，聚合酶連鎖反應(PCR)複製放大增強偵測靈敏度。

第5圖簡單地描繪一種無限制性的方法，此法使本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法得以在帶有磁性的固體界面上操作。

第5圖由上而下，可以分為七個區塊。第5圖由上而下，有八個箭頭。

第5圖第一區塊左方係以帶磁性的Streptvidin顆粒固定住正常野型探針。該些探針，係攜有biotin(biotinalted)的反向序列野型探針(Antisense Wild Type Probe)。各探針隱埋限制酶(Res)序列。

第5圖第一區塊右上方及右下方，分別是正常的核糖核酸與突變型的核糖核酸。

第5圖第一箭頭，表示檢體與探針混勻雜交。雜交後，形成吸附於磁性顆粒的突變型混合雙鏈、及吸附於磁性顆粒的正常混合鏈形成，分別如第二區塊左側與右側所示。

第5圖第二箭頭，表示放上磁架、令檢體吸附于管壁以便洗濯。

第5圖第三箭頭，表示取下磁架、混勻、核糖核酸酶水解。水解後，突變型混合雙鏈釋出三偏端羥基，正常混合鏈完全被保護，分別如第三區塊左側及右側所示。

第5圖第四箭頭，表示於無磁環境內進行差別性序列延伸。延伸後，如第四區塊左方所示，突變型混合鏈顯露出Res序列。至於正常混合鏈的Res序列，則仍被隱埋，如第四區塊右方所示。

第5圖第五箭頭，表示放上磁架、令檢體吸附于管壁以便洗濯；第六箭頭，表示取下磁架、混勻、Res限制酶水解。水解後，突變型混合鏈被切離磁性顆粒，如第五區塊左方所示。至於正常混合鏈，則仍被固定，如第五區塊右方所示。

第5圖第七箭頭，表示放上磁架、吸汲出被切離的突變型混合鏈。第八箭頭，表示與適配鏈(Adapter)結合。結合後，如第六區塊左方所示，形成突變型-適配鏈雜合體，其得以聚合酶連鎖反應(PCR)複製放大。至於正常混合鏈不與適配鏈結合，無法被聚合酶連鎖反應複製放大。

第6圖簡單地描繪一種無限制性的方法，此法不僅使本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法得以在固體界面上操作，更能在多種不同的樣品內同時檢測多種不同基因的突變。施行本檢測法之前，若把欲檢測的基因序列先行複製放大，則可避免類似序列與突變序列相混淆。

第6圖由上而下，可以分為六個區塊。第6圖由上而下，有6個箭頭。

第6圖第一區塊左方表示多種不同反向序列野型探針被固定於固體介面。各探針的三偏端均接合了T7M13序列。各探針的五偏端均隱埋了Res序列。

第6圖第一區塊右方是欲檢測基因的核糖核酸。

第6圖第一箭頭，表示檢體與探針於固體介面上雜交。雜交後，形成吸附於固體介面上的突變型混合鏈(第二區塊左方)，以及吸附於磁性顆粒的正常混合鏈(第二區塊右方)。

第6圖第二箭頭，表示固體介面上洗濯、核糖核酸酶水解。水解後，突變型混合雙鏈釋出三偏端羥基，如第三區塊左方所示，正常混合鏈完全被保護，如第三區塊右方所示。

第6圖第三箭頭，表示固體介面上洗濯、進行差別性序列延伸。延伸後，突變型混合鏈顯露出Res序列(第四區塊左方)，正常混合鏈的Res序列仍被隱埋(第四區塊右方)。

第6圖第四箭頭，表示固體介面上洗濯、進行Res限制酶水解。水解後，突變型混合鏈被切離固體介面(第五區塊左方)，正常混合鏈仍被固定(第五區塊右方)。

第6圖第五箭頭，表示吸汲出切離的突變型混合鏈，第六箭頭，表示突變型混合鏈與適配鏈(Adaptor)結合。結合後，形成突變型-適配鏈雜合體(第六區塊左方)，此時無論突變基因的來源如何，均得以T7與適配鏈的序列為引物、 M13的序列為探針，施行即時聚合酶連鎖反應複製放大來偵測突變型的存在。至於正常混合鏈不與適配鏈結合，不被複製放大。

第7a圖及第7b圖簡單地描繪另一種無限制性的方法，此法可避免類似序列與突變序列相混淆。因此，無需把欲檢測的基因序列先行複製放大，而得以直接檢測多種不同基因的突變；或者，預先以簡便的轉錄複製法，把檢體內所有的核糖核酸全面性地複製放大，也不虞因類似序列的存在而造成雜訊。

第7a圖由上而下，可以分為六個區塊。第7a圖由上而下，有6個箭頭。

第7b圖由上而下，可以分為三個區塊。第7b圖由上而下，有4個箭頭。

第7a圖第一區塊右方的三個圖樣，由上而下分別表示正常的轉錄物、同源的轉錄物、突變型的轉錄物。

第7a圖第一箭頭，表示轉錄物與多種五偏端接有"TT"雙核甘酸的反向野型探針雜交。雜交後，形成核糖核酸：去氧核糖核酸混合雙鏈，如第二區塊所示。

第7a圖第二箭頭，表示以Klenow/Taq DNA酶及去氧腺瞟昤核甘酸施行序列延伸。延伸後，混合雙鏈的三偏端產生單一腺瞟昤核甘酸懸突，如第三區塊所示。

第7a圖第三箭頭，表示與阻斷適配鏈結合。

第7a圖第四箭頭，表示核糖核酸酶水解。

第7a圖第五箭頭，表示檢體分四等份；並分別以去氧腺瞟昤、鳥瞟昤、胞嘧啶、胸腺嘧啶充填(以下僅以去氧腺瞟昤核甘酸充填為例來描繪)。

第7a圖第六箭頭，表示嗜單鏈S1核酸酶水解。水解後的情形，如第7b圖第一區塊所示。

第7b圖第一至第三箭頭，表示袪除被S1核酸酶水解的小片段，並用Klenow/Taq DNA酶或單獨使用Taq DNA酶進行序列延伸。此時，突變型上的阻斷鏈被取代；並產生單一腺瞟昤核甘酸懸突。至於正常野型的混合雙鏈及類似序列的混合雙鏈仍為阻斷鏈阻斷，如第二區塊所示。

第7b圖第四箭頭，表示與帶標記的適配鏈結合。結合後，形成突變型雙適配鏈雜合體(如第三區塊所示)得以直接偵測或聚合酶連鎖反應複製放大再檢測定量。

第8圖簡單地描繪一種無限制性的方法，以便以微陣列的格式來同時檢測多種不同基因的變異。施行本檢測法之前，若把欲檢測的基因序列先行複製放大，可避免類似序列造成的雜訊。

第8圖由上而下，可以分為四個區塊。第8圖由上而下，有7個箭頭。

第8圖第一區塊左方，是正常檢體。第8圖第一區塊右方，含有突變型的檢體。

第8圖第一至第三箭頭，表示選擇性地複製放大多種不同基因的核糖核酸。與微陣列格式固定住的多種不同基因的單鏈反向序列野型探針雜交後，情形如第二區塊下方所示。

第8圖第四箭頭，表示於微陣列上不同位置、各自形成混合雙鏈。

第8圖第五箭頭，表示核糖核酸酶水解。水解後，在微陣列上的A1(B1),A3(B3)及A4(B4)的位置，因含突變型的混合雙鏈釋出三偏端羥基，如第三區塊所示。

第8圖第六箭頭，表示差別性序列延伸並產生三偏端黏著端。

第8圖第七箭頭，表示接合帶標記的適配鏈。接合後，如第四區塊所示，A1(B1),A3(B3)及A4(B4)的位置上，含帶有標記的突變型-適配鏈雜合體而被偵測出。

第9圖簡單地描繪另一種無限制性的方法，以便以微陣列的格式來同時檢測多種不同基因的變異。此法沿用第7圖描繪的雙適配鏈接合原理，來袪除類似序列造成的雜訊。

第9圖由上而下，可以分為四個區塊。第9圖由上而下，有8個箭頭。

第9圖第一區塊左方，表示檢體內各種核糖核酸。第9圖第一區塊右方，表示以微陣列格式固定住五偏端帶"TT"的反向野型探針。

第9圖第一箭頭，表示於微陣列上不同位置、各自形成混合雙鏈。

第9圖第二箭頭，表示以Klenow/Taq DNA酶及去氧腺瞟昤核甘酸施行序列延伸。

第9圖第三箭頭，表示與阻斷適配鏈結合。結合後，一組四份，如第二區塊所示。

第9圖第四箭頭，表示核糖核酸酶水解；一組四份同式。

第9圖第五箭頭，表示各份分別以去氧腺瞟昤、鳥瞟昤、胞嘧啶、胸腺嘧啶核甘酸充填。

第9圖第六箭頭，表示嗜單鏈S1核酸酶水解；袪除被水解的小片段。

第9圖第七箭頭，表示並用Klenow/Taq DNA酶或單獨用Taq DNA酶進行差別性序列延伸。延伸後，帶有突變型的位置上，阻斷鏈被取代，並產生單一腺瞟昤核甘酸懸突；帶正常野型及類似序列的位置上，混合雙鏈仍為阻斷鏈阻斷，如第三區塊所示。

第9圖第八箭頭，表示與帶標記的適配鏈結合。結合後，A1(B1),A3(B3)及A4(B4)的位置上，具帶標記的突變型-雙適配雙鏈雜合體而被偵測出，如第四區塊所示。

第10圖簡單地描繪一種無限制性的方法，以便於顯微鏡下、細胞原位上，觀察細胞形態並檢測細胞內基因的變異。

第10圖由上而下，可以分為六個區塊。第10圖由上而下，有6個箭頭。

第一區塊左方，有正常細胞。第一區塊右方，有突變細胞。

第10圖第一箭頭，表示固定細胞於玻片上。

第10圖第二箭頭，表示轉錄複製欲檢測基因的核糖核酸。

第10圖第三箭頭，表示與反向序列野型探針於玻片上雜交。雜交後，細胞原位上形成核糖核酸去氧核酸核酸混合雙鏈，如第三區塊所示。

第10圖第四箭頭，表示于玻片上施行核糖核酸酶水解。水解後，突變型核糖核酸被水解、釋出三偏端羥基，如第四區塊右方所示；正常細胞的核糖核酸被保護住，如第四區塊左方所示。

第10圖第五箭頭，表示進行差別性序列延伸。延伸後，突變細胞的混合鏈產生具黏著性的三偏端，如第五區塊右方所示；正常細胞內混合雙鏈仍為平端，如第五區塊左方所示。

第10圖第六箭頭，表示與帶標記的適配鏈結合。結合後，突變細胞含有標記的突變型-適配鏈雜合體而被偵測出，如第六區塊右方所示；正常細胞不能接合帶標記的適配鏈，如第六區塊左方所示。

第11圖簡單地描繪一種無限制性的自動化儀器藍圖，以便在帶有磁性的固體界面上，操作本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法。

第11圖上方，係裝設有磁棒的反應室，可吸附帶有核糖核酸的磁粒於容器的管壁，以便以械臂操控的多腔吸移器來進行洗濯及更換試劑與緩衝液。

第11圖下方，係無磁反應室，設有調控溫度的裝備，以及配有螢光偵測器的聚合酶連鎖反應器，以便進行核糖核酸的雜交、與本發明有關的各種反應、和即時聚合酶連鎖反應。

第12圖簡單地描繪另一種無限制性的自動化儀器藍圖，以便在帶有磁性的固體界面上，操作本發明所揭露的基因變異檢體的檢測方法。

第12圖上方，係通電以產生電磁，在帶磁狀況下，以便利用械臂操控的多腔吸移管，來進行洗濯及更換試劑與緩衝液。

第12圖下方，係無(中斷電流使電磁消失，在無磁狀況下)，以便進行核糖核酸的雜交、與本發明有關的各種反應、和即時聚合酶連鎖反應。

第13a圖、13b圖和13c圖為使用本發明而偵測到檢體內ABL TK變異的一個實例。

第13a圖係以Streptavidin顆粒為支撐點，來進行差別性序列延伸反應的酪氨激酶突變檢測法放大圖形。其中，橫軸表示循環次數，縱軸表示螢光亮度變化值，偵測器：ABL，門限值：0.55053897。

第13b圖係應用差別性序列延伸反應的酪氨激酶突變檢測法放大圖形。其中，橫軸表示循環次數，縱軸表示螢光亮度變化值，偵測器：ABL，門限值：1.521371。

第13c圖上方有一組圖樣，中央左右各有兩組圖樣，下方左右各有兩組圖樣。

第13c圖上方圖樣左邊是陽性對照控制組，右邊是野型。至於第13c圖中央及下方各組圖樣的右邊都是野型。

第14a圖、14b圖和14c圖為使用本發明而偵測到檢體內K-ras及TP53基因變異的一個實例。

第14a圖係以Streptavidin顆粒為支撐點，利用接連T7M13已知序列所施行的基因變異檢測法放大圖形。第14a圖下方的曲線無法形成平穩的放大圖形，是陰性對照控制組。

第14a圖橫軸表示循環次數，縱軸表示螢光亮度變化值，偵測器：M13，門限值：0.35351305。

第14b圖展示三個不同的陽性檢體SW480大腸(Colon)癌細胞株，Hct-15大腸(Colon)癌細胞株及Ryan淋巴瘤癌細胞(B-cell)株，以及兩個陰性控制對照組的檢體。

第14b圖係以Streptavidin顆粒為支撐點，利用接連T7M13已知序列所施行的基因變異檢測法放大圖形。

第14b圖橫軸表示循環次數，縱軸表示螢光亮度變化值，偵測器：M13，門限值：0.35351305。

第14c圖上方有一組圖樣，中央左右各有兩組圖樣，下方左右各有兩組圖樣。

第14c圖是K-Ras及TP53基因的去氧核醣核酸序列分析圖第15圖繪示根據本發明一較佳實施例，一種基因變異檢體的檢測方法流程示意圖。