TWI392502B - 聚己醣抗原及含新穎醣脂質佐劑之相關抗癌疫苗 - Google Patents
聚己醣抗原及含新穎醣脂質佐劑之相關抗癌疫苗 Download PDFInfo
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Description
本申請案係同在審查中之美國專利申請案第12/485,546號(發明名稱:用以誘發對Globo H及SSEA-3有特異性之免疫反應之組合物及其於癌症治療之用途(Compositions for inducing immune responses specific to Globo H and SSEA-3 and uses thereof in cancer treatment),2009年6月16日申請)之部分接續申請案,該案主張美國臨時專利申請案第61/061,968號(2008年6月16日申請)之優先權。此等專利申請案之內容全文皆以參考資料方式納入本說明書中。
本發明係關於癌症疫苗之領域。特定言之,本申請案係關於以醣類為基礎之疫苗,其含有與免疫原性載體DT-CRM197共軛連結之B細胞抗原決定部位Globo H。更特定言之,本發明係針對與新穎醣脂質佐劑(諸如C34)共同投予之抗癌Globo H-DT疫苗。
為設計對抗癌症之療法,有需要尋求不存在於正常細胞中之癌細胞或癌幹細胞的分子標靶。異常的糖基化作用通常與腫瘤發展有關,首先是由Meezan等人於1969年提出,證實了癌細胞之聚醣與正常細胞者不同(Meezan E,et al.
(1969)Biochemistry
8:2518-2524)。異常的糖基化作用包括某些結構之喪失或過度表現、切截結構之存在、以及新穎結構之出現。利用凝集素染色比較健康及惡性組織,前述結構上的差異已於後續獲得許多組織學證據之支持(Turner GA(1992)Clin Chim Acta
208:149-171;Gabius HJ(2000)Naturwissenschaften
87:108-121)。
近來,已由單株抗體及質譜分析辨識出各種腫瘤相關性醣抗原(Shriver Z,et al.
(2004)Nat Rev Drug Disc
3:863-873;Pacino G,et al.
(1991)Br J Cancer
63:390-398)。目前,已針對許多以醣脂質或醣蛋白之形式表現在癌細胞上之腫瘤相關性抗原描述其特徵,並得知其與特定類型之癌症的相關性(Bertozzi CR,Dube DH(2005)Nat Rev Drug Discovery
4:477-488)。儘管對於表面醣類在惡性細胞中所扮演的角色所知有限,但目前已知由被動投予或是由疫苗所誘發之對抗此等抗原的抗體係與改善的預後有相關性。
在有報導過的腫瘤相關性聚醣中,醣脂質抗原Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)首先在1984年由Hakomori等人自乳癌MCF-7細胞分離出來並予以確認(Bremer EG,et al.
(1984)J Biol Chem
259:14773-14777)。以抗Globo H單株抗體進行的進一步研究顯示,Globo H亦存在於許多其他癌症中,包括***癌、胃癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、及結腸癌,且其在無法由免疫系統輕易進入的正常分泌組織的管腔表面僅有微量的表現(Ragupathi G,et al.
(1997)Angew Chem Int Ed
36:125-128)。此外,亦已證實乳癌病患之血清含有高含量之抗Globo H抗體(Gilewski Tel al.
(2001)Proc Natl Acad Sci USA
98:3270-3275;Huang C-Y,et al.
(2006)Proc Natl Acad Sci USA
103:15-20;Wang C-C,et al.
(2008)Proc Natl Acad Sci USA
105(33):11661-11666),且具Globo H-陽性腫瘤之病患相較於具Globo H-陰性腫瘤病患之存活期較短(Chang,Y-J,et al.(2007)Proc Natl Acad Sci
USA 104(25):10299-10304)。此等發現使得Globo H(一種六糖抗原決定部位)成為引人注目之腫瘤標記物以及癌症疫苗研發之可行標靶。
Globo H係一種在各種上皮癌中過度表現之癌症抗原。目前已有研究建議此種抗原可作為癌症免疫治療之標靶。儘管已研發出可誘發對抗Globo H之抗體反應的疫苗,但因Globo H之低抗原性,故其抗癌功效並不令人滿意。因此仍需要可誘發靶向Globo H之高量免疫反應的新疫苗。
幹細胞係定義為具有自我更新與分化成為不同類型細胞及組織之能力的細胞群(Reya T et al.,(2001)Nature
414:105-111)。由於惡性及正常組織兩者皆含有異質之細胞族群,因此癌幹細胞可能在腫瘤生長及維持腫瘤異質性中扮演關鍵角色。目前已從各種不同的實體腫瘤中鑑別出癌幹細胞,諸如,腦瘤、乳癌、結腸癌、及***癌。乳癌幹細胞(BCSCs)係首先由Al-Hajj等人根據其在異種移植進入NOD/SCID小鼠中時可產生具表型多樣性腫瘤之能力而證實存在於乳癌之CD24-
CD44+
亞群中(Al-Hajj M,et al.,(2003)Proc Natl Acad Sci USA
100:3983-3988)。乳癌病患之骨髓中大部分早期散佈的癌細胞皆顯示具有CD24-
CD44+
表型(Balic M et al.,(2006)Clin Cancer Res
12:5615-5621),此暗示了BCSCs具轉移能力。基於BCSCs生長、分化、及轉移之能力以及其對於輻射照射之抗性,BCSCs成為了乳癌治療之主要標靶(Tang C. et al.,(2007)FASEB J
. 21:1-9)。
在乳癌中,在60%以上的腺管癌、乳葉癌、及管狀癌中可觀察到Globo H表現,但未在非上皮乳癌腫瘤中觀察到Globo H表現(Mariani-Constantini R et al.,(1984)Am. J. Pathol
. 115:47-56)。Globo H並不會在正常組織中表現,除了在管腔邊緣之頂端上皮細胞有微弱表現外,而該部位似乎是免疫系統所無法進入之位點(Id
.;Zhang S. et al.,(1997)Int. J. Cancer
73:42-49)。
Globo H亦表現於乳癌幹細胞(BCSCs)中。流式細胞計數顯示有25/41之乳癌樣本(61.0%)表現Globo H。有25/25之非BCSCs及8/40(20%)之BCSCs表現Globo H。有31/40(77.5%)之腫瘤表現階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)(Globo H之五糖前體)。有29/31之非BCSCs及25/40(62.5%)之BCSCs表現SSEA-3(Chang W-W. et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA
105(33):11667-11672)。
Danishefsky及Livingston先前曾報導了對抗多種癌症之Globo H-KLH疫苗(Gilewski Tel al
.(2001)Proc Natl Acad Sci USA
98:3270-3275;Ragupathi G,et al
.(1997)Angew Chem Int Ed
36:125-128;Kudryashov V,et al
.(1998)Glycoconj J
. 15:243-249;Slovin SFet al
(1997)Proc Natl Acad Sci USA
96:5710-5715)及七價疫苗(含個別與KLH共軛連結之GM2、Globo H、Lewis Y、Tn、STn、TF、及Tn-MUC1;Sabbatini PJet al
(2007)Clin Cancer Res
13:4170-4177)的製備。然而,接受該七價疫苗免疫之病患僅誘發了對抗該七種抗原中之五種的抗體反應(除了GM2及Lewis Y抗體之外)。不同於廣泛性表現的抗原(諸如GM2),Globo H係特別地表現於腫瘤細胞上且僅在正常分泌組織上有極微量之表現,因而使其成為疫苗研發之理想標靶。在研究中,當以臭氧分解Globo H配醣基之後,再以KLH載體蛋白進行還原胺化作用,可產生每蛋白約150個醣單元(Ragupathi G,et al
.(1997)Angew Chem Int Ed
36:125-128)。藉由使用MMCCH連接子再進一步製備,可使醣共軛連結比例增加至約720:1(Wang S-K,et al
.(2008).Proc Natl Acad Sci USA
105:3690-3695)。然而,欲精確分析該糖共軛連結之特性有其困難度。此外,在***及轉移性乳癌兩種癌症病患體內,結合免疫佐劑QS-21的合成疫苗顯示主要誘發IgM,而IgG抗體則含量較低。在第一期臨床試驗中,該疫苗亦顯示有微量毒性,且在疫苗接種位點產生短暫之局部皮膚反應(Gilewski Tel al
.(2001)Proc Natl Acad Sci USA
98:3270-3275;Ragupathi G,et al
.(1997)Angew Chem Int Ed
36:125-128;Slovin SFet al
(1997)Proc Natl Acad Sci USA
96:5710-5715)。在部分病患身上亦觀察到輕微類流感症狀,其可能與QS-21之副作用有關。已有報導顯示在ELISA分析中,含有與經馬來醯胺修飾之載體蛋白KLH共軛連結之五種***及乳癌相關醣抗原(Globo-H、GM2、STn、TF、及Tn)的五價疫苗可產生具有高於IgM之IgG效價的抗Globo H血清(Zhu J.et al
.(2009)J. Am. Chem. Soc
. 131(26):9298-9303)。
因此,有需要找出替代的載體以及佐劑,以提升對於Globo H之抗體反應,特別是具較高的IgG效價,並改善疫苗功效,且僅具極低副作用。
本發明係關於一種以醣為基礎之疫苗,其含有經由對-硝基苯基連接子而與免疫原性載體白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)(Th抗原決定部位)化學共軛連結之Globo H(B細胞抗原決定部位)。該合成疫苗結合醣脂質佐劑可在乳癌模型中誘發IgG、IgG1、及IgM抗體,並提供優異的免疫原性,其在異種移植研究中顯示可延緩腫瘤發生。針對該等由Globo H-DT及醣脂質C34所誘發之抗體的聚醣陣列分析顯示,該等抗體不僅可辨識Globo H,亦可辨識SSEA-3(Gb5)及SSEA-4(唾液酸化Gb5)聚醣,其皆對於癌細胞及癌幹細胞有特異性。
本發明係關於一種免疫原性組合物,其包含:(a)聚醣,其基本上由Globo H或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及(b)佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質,其中該免疫原性組合物可誘發免疫反應,該免疫反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體。
在部分態樣中,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。在部分態樣中,該連接子係對-硝基苯基連接子。
在部分態樣中,該佐劑係α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)之合成類似物。在部分具體實例中,該佐劑係C34,其中C34包含結構:
在部分態樣中,該免疫反應較佳係導向IgG同種型抗體之生成。在部分態樣中,該免疫原性組合物包含至少一種可誘發體液或細胞免疫反應之佐劑。
在部分態樣中,由該免疫反應所產生之抗體可中和表現於癌細胞或癌幹細胞上之抗原。在部分具體實例中,由該免疫反應所產生之抗體可中和抗原Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種。在部分具體實例中,該可中和抗原Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種的抗體包含相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體。
本發明係關於一種癌症疫苗,其包含可在對象體內誘發抗癌免疫反應之免疫原性組合物。在部分態樣中,該癌症疫苗適用於治療選自由下列者所組成之群的癌症:乳癌、肺癌、肝癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤、***癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、及膀胱癌。
在部分態樣中,該癌組織在細胞表面表現Globo H抗原。在部分態樣中,該Globo H抗原係表現在乳癌腫瘤之上皮細胞上。
在部分具體實例中,該癌症疫苗可產生能夠中和抗原Globo H、Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種的抗體。在部分態樣中,該等抗原係表現在乳癌幹細胞上。
本發明係關於一種包含抑制腫瘤生長之治療方法,該方法包含:(a)對有需求之對象投予免疫原性組合物,該組合物包含:聚醣,其基本上由Globo H或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質;以及(b)誘發免疫反應,該免疫反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對量的IgG同種型抗體。
在所述方法之部分具體實例中,該連接子係對-硝苯酚,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197),且該佐劑係α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)之合成類似物。在一具體實例中,該佐劑係C34。
在所述方法之部分具體實例中,該免疫原性組合物尚包含癌症疫苗,且其中以有效量之該癌症疫苗所進行之一或多種治療可抑制腫瘤生長。在部分具體實例中,該癌症疫苗之投予可減少腫瘤大小。
在所述方法之部分具體實例中,該免疫反應較佳係導向IgG同種型抗體之生成,該等抗體可中和抗原Globo H、Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種。在部分態樣中,該等抗原Globo H、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種係表現在乳癌幹細胞上。在部分態樣中,該Globo H抗原係表現在乳癌腫瘤之上皮細胞上。
本發明係關於一種癌症疫苗,其包含:(a)免疫原性組合物,該組合物包含:聚醣,其基本上由Globo H或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質,其中該免疫原性組合物可誘發免疫反應,該免疫反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體;以及(b)醫藥上可接受之賦形劑。
在部分態樣中,該癌症疫苗包含免疫原性組合物,其中該連接子係對-硝苯酚,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197),且該佐劑係α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)之合成類似物。在一具體實例中,該佐劑係C34。
在部分態樣中,該癌症疫苗係用於治療癌症,其中以有效量之該癌症疫苗所進行之一或多種治療可抑制腫瘤生長。在部分具體實例中,該癌症疫苗之投予可減少腫瘤大小。在部分具體實例中,該癌症係選自由下列者所組成之群:乳癌、肺癌、肝癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤、***癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、及膀胱癌。
本發明係關於一種免疫原性組合物,其包含:(a)聚醣,其基本上由Globo H-相關性聚醣或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及(b)佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質,其中該Globo H-相關性聚醣係選自由SSEA-3及SSEA-4所組成之群,且其中該免疫原性組合物可誘發免疫反應,該免疫反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體。
在該免疫原性組合物之部分態樣中,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197),該佐劑係α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)之合成類似物,且該連接子係對-硝基苯基連接子。在一具體實例中,該佐劑係C34。
本發明係關於一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之Globo H;及佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質。在該治療劑之部分具體實例中,該佐劑係C34。
本發明係關於一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之SSEA-3;及佐劑,其包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質C34。
本發明係關於一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之SSEA-4。在部分具體實例中,該治療劑尚包含佐劑,該佐劑包含可結合樹狀細胞上之CD1d分子的醣脂質。
該等本發明之治療劑投予對象可誘發抗體生成,該等抗體可辨識表現在乳癌幹細胞(BCSC)上之抗原,其中該抗原係選自由Globo H、SSEA-3、及SSEA-4所組成之群。本發明係關於一種治療乳癌之方法,其包含投予本發明之治療劑。
本發明係關於令人驚訝的發現,即DT-CRM197可作為針對Globo H及SSEA-4之有效載體蛋白,此不僅是因為其已廣泛用於對抗白喉之人類疫苗接種長達數十年,亦是因為其高度的免疫原性,最重要的是,已由FDA核准用於各種醣共軛連結疫苗。白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)係一種DT之無毒性突變物(G52E),其與原始分子一樣具有免疫原性及結合肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)之能力,肝素結合性表皮生長因子係DT之特異性細胞膜受體,常在癌症中過度表現(Buzzi S.et al
.,Cancer Immunology,Immunotherapy(2004),53(11):1041-1048)。
使用C34作為佐劑,GH-DT及SSEA-4-DT兩者皆顯示出最有效的免疫反應,誘發相較於IgM抗體之較多的IgG抗體對抗腫瘤抗原。GH-DT結合C34可誘發出抗體,其不僅可中和Globo H且亦可中和SSEA-3(Gb5)及SSEA-4,此等均對於乳癌細胞及癌幹細胞有特異性。
再者,本發明所揭示的聚醣微陣列可提供作為抗體特異性試驗之強力平台,並可用於辨識病患而進行疫苗試驗以及監測其在免疫接種後之免疫反應。
在下列詳述中,可參照附呈圖式,該等圖式係形成本發明敘述之一部份,且係以說明方式顯示可予實施之特定具體實例。以下描述此等具體實例之細節,俾使熟習技藝者可實施本發明,而須瞭解的是可使用其他具體實例,並在不偏離本發明範圍之情形下進行結構、邏輯、及電學之改變。下文對於例示具體實例之詳述因此不應被視為任何限制,而本發明之範圍係由附呈之申請專利範圍所定義。
除非另外定義,本文中所用之所有技術及科學辭彙具有一般熟習本發明所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。儘管與本文所述者類似或相當之任何方法或材料皆可用於實施或試驗本發明,然而以下係說明較佳方法及材料。所有本文所提及之刊物及專利皆納入作為參考,目的包括敘述及揭示該等刊物中所報導之可結合本發明使用之化學品、細胞系、載體、動物、儀器、統計分析、及方法。本專利說明書中所引述之所有參考文獻可視為本技藝之技術水準指標。本文中並無任何內容視為承認本發明沒有資格憑藉較早之發明而提前揭露內容。
在敘述本發明之材料及方法之前,須明瞭本發明並不限於所述之特定方法、流程、材料、及試劑,因其皆可有所變化。亦須明瞭,本文所使用之術語係僅為敘述特定之具體實例,且其並非用以限制本發明之範圍,本發明之範圍將僅由附呈之申請專利範圍限制。
須注意的是,在本文及在附呈的申請專利範圍中,單數形式「一」及「該」包括其複數意義,除非上下文明確指出並非如此。此外,「一種」、「一或多種」、及「至少一種」可在本文中交換使用。亦須注意的是,名詞「包含」、「包括」、及「具有」可交換使用。
除非另有明示,本發明之實施將使用分子生物學、微生物學、重組DNA、及免疫學之習知技術,其係屬於本技藝之技術。此等技術在文獻中有完整說明。參見,例如,分子選殖:實驗室手冊,第2版(Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Sambrook ed.,Fritsch and Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989);DNA選殖,第I及II冊(DNA Cloning,Volumes I and II,D. N. Glover ed.,1985);動物細胞培養(Culture Of Animal Cells,R. I. Freshney,Alan R. Liss,Inc.,1987);固定化細胞及酶(Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,1986);分子選殖實務指南(B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning,1984);論文,酶學方法(the treatise,Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.,N.Y.);哺乳動物細胞用之基因轉移載體(Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J. H. Miller and M. P. Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);酶學方法,第154及155冊(Methods In Enzymology,Vols. 154 and 155,Wu et al. eds.);細胞及分子生物學中之免疫化學方法(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology,Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);抗體:實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lanes,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);以及實驗免疫學手冊,第I-IV冊(Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV,D. M. Weir and C. C. Blackwell,eds.,1986)。
本文所使用之術語「脂質」係指參與細胞信號傳導途徑之任何脂溶性(親脂性)分子。
本文所使用之術語「醣脂質」係指連附醣之脂質,其可作為細胞辨識之標記物。
本文所使用之術語「α-半乳糖苷基神經醯胺」或「α-GalCer」係指一種醣脂質,其可刺激天然殺手T細胞產生T輔助細胞,TH1及TH2細胞激素兩者。本文所用之醣脂質衍生物C34具有下列結構:
本揭示內容之α-GalCer類似物包括細菌來源之α-GalCer類似物(第I組:C2、C3、及C14),經磺化作用修飾之α-GalCer類似物(第II組:C4、C5、及C9),苯基-烷基鏈α-GalCer類似物(第III組:C6-C8、C10-C11、C15-C16、C18-C34、C8-5、及C8-6),以及植物鞘胺醇(phytosphingosine)切截之α-GalCer類似物(第IV組:C12、C13、及C17)。C34及其他α-半乳糖苷基神經醯胺類似物之結構以及其作為佐劑之用途係詳細揭示於PCT專利申請案PCT/US2008/060275號(2008年4月14日申請)。
合成之α-GalCer類似物(包括C34)可與CD1d分子形成共軛連結物。合成之α-GalCer類似物可由NKTs T細胞受體辨識。合成之α-GalCer類似物可激發TH
1-型、TH
2-型、或TH1-型、以及TH2-型反應。α-GalCer類似物可在試管中活化NKTs。α-GalCer類似物可在活體內活化NKTs。
本文所使用之術語「聚醣」係指多醣或寡醣。在本文中,聚醣亦用以指稱醣共軛連結物之醣部分,諸如,醣蛋白、醣脂質、醣肽、醣蛋白質組、肽聚醣、脂多醣、或蛋白聚醣。聚醣通常僅由單醣間之O-醣苷鍵構成。舉例而言,纖維素係一種聚醣(或者更特定言之為葡聚糖),其由β-1,4-連結性D-葡萄糖構成,而幾丁質係由β-1,4-連結性N-乙醯基-D-葡糖胺構成。聚醣可為單醣殘基之同或異聚物,且其可為直鏈或支鏈。聚醣可被發現連附於蛋白上,諸如在醣蛋白及蛋白聚醣中。一般而言係見於細胞之外表面。O-及N-連結性聚醣極常見於真核細胞,亦可見於原核細胞(儘管較不常見)。N-連結性聚醣係連附於序列子(sequon)的天冬醯胺酸之R-基氮原子(N)上。序列子係Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列,其中X係除了脯胺酸以外之任何胺基酸。
本文所使用之術語「醣蛋白」係指經聚醣共價修飾之蛋白。共有四種類型之醣蛋白:1)N-連結性醣蛋白,2)O-連結性醣蛋白(黏蛋白),3)葡糖胺聚醣(GAGs,其亦稱為蛋白聚醣),4)GPI-錨定蛋白。大部分之醣蛋白具有結構微異質性(在相同糖基化位點連附多種不同的聚醣結構)以及結構巨異質性(有多重位點及類型的聚醣連附)。
本文所使用之術語「抗原」係定義為任何可激發免疫反應之物質。
本文所使用之術語「免疫原」係指抗原或可誘發抗原生成之物質,諸如,DNA疫苗。
本文所使用之術語「免疫原性」係指免疫原、抗原、或疫苗刺激免疫反應之能力。
本文所使用之術語「免疫療法」係指根據調節免疫系統之概念而達成預防及/或治療目標之一系列治療策略。
本文所使用之術語「CD1d」係指一種表現在各種人類抗原呈現細胞表面之CD1(分化群1)醣蛋白家族的成員。經CD1d呈現之脂質抗原可活化天然殺手T細胞。CD1d具有一個深的抗原結合溝槽,供醣脂質抗原結合。表現在樹狀細胞上之CD1d分子可結合及呈現醣脂質,包括α-GalCer類似物,諸如,C34。
本文所使用之術語「適應性免疫系統」係指可排除病原攻毒之高度特化性、全身性之細胞及反應。適應性免疫系統之細胞係一種類型之白細胞,稱為淋巴細胞。B細胞及T細胞是主要類型之淋巴細胞。
本文所使用之術語「T細胞」及「Ts」係指一群稱為淋巴細胞之白血球細胞,其在細胞調節性免疫力中扮演核心角色。藉由細胞表面存在之特殊受體,稱為T細胞受體(TCR),T細胞可與其他淋巴細胞類型區隔,諸如,B細胞及NKs。目前已知有數種不同亞群之T細胞,各自具有獨特之功能。輔助T(TH
)細胞係適應性免疫系統之「中間人」。一旦受到活化,便快速***並分泌出小分子蛋白,稱為細胞激素,該等蛋白可調控或「協助」免疫反應。根據所接收到之細胞激素信號,此等細胞會分化成為TH
1、TH
2、TH
17、或其他亞群之一,其可分泌不同之細胞激素。
本文所使用之術語「抗原呈現細胞」(APC)係指在其表面上展示外源抗原(與主要組織相容性複合體(MHC)複合)之細胞。T細胞可使用其TCR而辨識此種複合體。APCs可分為專職性及非專職性。樹狀細胞(DCs)屬於專職性類型,且其可以CD1對T細胞呈現抗原。在一例示性之實施例中,用於本發明方法中之DCs可以是數種DC亞群中之任何一種,在一實施例中,係由淋巴分化產生,或在另一實施例中,係由骨髓祖細胞分化產生。
本文所使用之術語「原初細胞」(nave cell)係指未分化之免疫系統細胞,例如,CD4T細胞,其尚未經特化以辨識特定病原。
本文所使用之術語「天然殺手細胞」及「NKs」係指一種類型之淋巴細胞,其由干擾素活化,以參與對抗病毒及其他胞內病原之先天性宿主防禦。
本文所使用之術語「天然殺手T細胞」(NKTs)係指一種T細胞亞群,其與習知之Ts及NKs兩者共有相同之特徵/受體。諸多的此等細胞可辨識非多形性之CD1d分子,該分子係一種可結合自體及外源脂質與醣脂質之抗原呈現分子。NKTs之TCR可辨識由CD1d分子呈現(伴護)之醣脂質分子。NKTs之主要反應之一為在刺激之後快速分泌細胞激素,包括IL-4、IFN-γ、及IL-10,並因此影響多種免疫反應及病原作用。NKTs可為同質族群或異質族群。在一例示性之實施例中,該族群可為「非不變型(non-invariant)NKTs」,其可包含人類及小鼠骨髓以及人類肝臟T細胞族群,其係,例如,表現各種TCRs之CD1d反應性的非不變型T細胞,且其亦可產生大量之IL-4及IFN-γ。最為所知之CD1d依賴性NKTs亞群係表現不變的TCR-α鏈。此等稱為第I型或不變型NKTs(iNKTs)。此等細胞在人類(Vα24i NKTs)及小鼠(Vα14i NKTs)間具保守性,且其涉及多種免疫作用。
本文所使用之術語「細胞激素」係指諸多小型、分泌蛋白中之任一者,其可藉由影響免疫細胞之分化作用(通常涉及基因表現之改變,藉此前驅細胞可成為不同的特化細胞類型)而調控免疫反應之強度及持續時間。細胞激素已根據其推測功能、分泌細胞、或作用目標而命名為淋巴激素、間白素、及趨化激素。舉例而言,部分常見之間白素包括,但不限於,IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、及TGF-β。
本文所使用之術語「趨化激素」係指在感染位點所釋出的各種小型趨化性細胞激素中之任何一種,其可提供一種使淋巴細胞移動及活化之工具。趨化激素可將白細胞吸引至感染位點。趨化激素具有保守性之半胱胺酸殘基,其可使其區分為四群組。該等組群及代表性之趨化激素為C-C趨化激素(RANTES、MCP-1、MIP-1α、及MIP-1β)、C-X-C趨化激素(IL-8)、C趨化激素(淋巴細胞趨化因子,Lymphotactin)、及CXXXC趨化激素(分形素,Fractalkine)。
本文所使用之術語「TH
2型反應」係指一種表現細胞激素以產生某些類型之細胞激素、干擾素、趨化激素之模式。典型之TH
2細胞激素包括,但不限於,IL-4、IL-5、IL-6、及IL-10。
本文所使用之術語「TH
1型反應」係指一種表現細胞激素以產生某些類型之細胞激素、干擾素、趨化激素之模式。典型之TH
1細胞激素包括,但不限於,IL-2、IFN-γ、GMCSF、及TNF-β。
本文所使用之術語「TH
1偏性」係指一種免疫原反應,其中TH
1細胞激素及/或趨化激素之生成的增加程度係大於TH
2細胞激素及/或趨化激素之生成。
本文所使用之術語「抗原決定部位」係定義為抗原分子與抗體或T細胞受體之抗原結合位點接觸的部分。
本文所使用之術語「疫苗」係指一種製劑,含有抗原,該抗原係由造成疾病之全生物體(經殺死或減弱者)或是此等生物體之組成份(諸如,蛋白、肽、或多醣)所構成,用以產生對抗由該生物體所造成之疾病的免疫力。疫苗製劑可為天然、合成、或是由重組DNA技術所衍生者。
本文所使用之術語「免疫佐劑」係指一種結合免疫原使用之物質,其可增強或修飾對於該免疫原之免疫反應。本發明之α-GalCer類似物係作為免疫佐劑以修飾或提升疫苗之作用,刺激經該疫苗投予之病患的免疫系統,使其對該疫苗產生更劇烈之反應。在一例示性之實施例中,使用類似物C34作為佐劑。
本文所使用之術語「明礬佐劑」係指一種具有免疫佐劑活性之鋁鹽。此種試劑可吸收溶液中之蛋白抗原並使其沈澱;所得沈澱物可藉由協助抗原從接種位點所形成之疫苗貯集處緩慢釋出而改良疫苗之免疫原性。
本文所使用之術語「抗腫瘤免疫治療活性劑」係指由本發明之疫苗所產生的抗體,其可抑制、減少、或消除腫瘤。
本文所使用之術語「抗原特異性」係指一種細胞族群之特性,使其可藉由提供特定之抗原或抗原片段而造成特定細胞之增殖。
本文所使用之術語「流式細胞計數」或「FACS」意謂一種技術,經由光學及電子偵測裝置,用以檢驗懸浮於液流中之顆粒或細胞的物理或化學特性。
肽中之胺基酸殘基將在後文中如下縮寫:***酸係Phe或F;白胺酸係Leu 或 L;異白胺酸係Ile或I;甲硫胺酸係Met或M;纈胺酸係Val或V;絲胺酸係Ser或S;脯胺酸係Pro或P;羥丁胺酸係Thr或T;丙胺酸係Ala或A;酪胺酸係Tyr或Y;組胺酸係His或H;麩醯胺酸係Gln或Q;天冬醯胺酸係Asn或N;離胺酸係Lys或K;天冬胺酸係Asp或D;麩胺酸係Glu或E;半胱胺酸係Cys或C;色胺酸係Trp或W;精胺酸係Arg或R;且甘胺酸係Gly或G。關於胺基酸之進一步敘述,請參見蛋白:結構及分子特性(Proteins:Structure and Molecular Properties,Creighton,T. E.,W. H. Freeman & Co.,New York 1983)。
本文所揭示之諸等組合物可被包括在醫藥或營養醫學(nutraceutical)組合物中,結合熟習技藝者在閱讀本揭示內容時可辨識之其他活性劑、載體、載劑、賦形劑、或佐劑。
該等醫藥或營養醫學組合物較佳包含至少一種醫藥上可接受之載體。在此等醫藥組合物中,本文所揭示之組合物形成其「活性化合物」,亦稱為「活性劑」。本文所使用之術語「醫藥上可接受之載體」包括溶劑、分散基質、包衣劑、抗菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、及其類似者,其可與醫藥投予相容。補充之活性化合物亦可納入組合物中。醫藥組合物係經調配而使其與所欲之投予途徑相容。投予途徑之實例包括腸外(如,靜脈內、皮內、皮下)、口服(如,吸入)、穿皮(局部)、穿黏膜、及直腸投予。用於腸外、皮內、或皮下施予之溶液或懸浮液可包括下列組成份:無菌稀釋劑,諸如,注射用水、鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶劑;抗菌劑,諸如,苯甲醇或對羥苯甲酸甲酯;抗氧化劑,諸如,抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑,諸如,乙二胺四乙酸;緩衝劑,諸如,醋酸鹽、檸檬酸鹽、或磷酸鹽;以及用以調節滲透度之試劑,諸如,氯化鈉或葡萄糖。pH可以酸或鹼調整,諸如,鹽酸或氫氧化鈉。該等腸外製劑可以裝在玻璃或塑膠製之安瓿、拋棄式針筒、或多劑量小瓶中。
本文所用之對象係指人類及非人類靈長類(如,大猩猩、獼猴、狨猿)、家畜(如,綿羊、牛、馬、驢、及豬)、寵物(如,狗、貓)、實驗室試驗動物((如,小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)、圈養之野生動物(如,狐狸、鹿)以及任何其他可由本發明之試劑獲益之生物。對於可由本發明之試劑獲益之動物類型並無限制。不論其為人類或非人類生物,對象可被稱為病患、個體、動物、宿主、或接受者。
適用於注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液(其為水溶性)或分散液,以及用於即時製備無菌可注射性溶液或分散液之無菌粉末。就靜脈內之投予而言,適當之載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM
(BASF,Parsippany,N.J.)、或磷酸緩衝鹽水(PBS)。在所有情形下,組合物應為無菌,且應為具可輕易注射性程度之液態。在製造及貯存條件下應是安定的,並有防腐性以對抗微生物(諸如,細菌及真菌)的污染作用。該載體可為溶劑或分散基質,其含有,例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及其類似者)、以及其適當混合物。適當之流度可由,例如,使用包衣劑(諸如,卵磷脂),在分散液之情形下維持所需之顆粒大小,以及使用界面活性劑而維持。微生物作用之防止可由各種抗菌及抗真菌劑達成,例如,對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉、及其類似者。在諸多情形下,其較佳在該組合物中將包括等張劑,例如,糖類、多元醇(諸如,甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化鈉。可注射性組合物之延長吸收可藉著在該組合物中納入可延遲吸收之試劑而達成,例如,單硬脂酸鋁及明膠。
無菌可注射性溶液可藉著將所需量之活性化合物納入適當之溶劑中,連同前述成分之一種或其組合,再進行過濾滅菌而製備。一般而言,分散液係藉著將活性化合物納入含有基礎分散基質及選自前述之所需其他成分的無菌載劑中而製備。就用以製備無菌可注射性溶液之無菌粉末而言,製備方法包括真空乾燥或冷凍乾燥,其可產生活性成分加上來自於其先前經無菌過濾溶液之任何其他所欲成份的粉末。
口服組合物一般而言包括鈍性稀釋劑或可食載體。就口服治療性投予之目的而言,可使活性化合物與賦形劑混合,並以錠劑、片劑、或膠囊(如,明膠膠囊)之形式使用。亦可使用液態載體製備口服組合物以作為漱口液。可將醫藥可相容性黏合劑或是佐劑材料包括作為組合物之部分。錠劑、丸劑、膠囊、片劑、及其類似者可含有任何下列成分,或是具有類似性質之化合物:黏合劑,諸如,微晶纖維素、黃蓍膠、或明膠;賦形劑,諸如,澱粉或乳糖;崩解劑,諸如,藻酸、Primogel、或玉米澱粉;潤滑劑,諸如,硬脂酸鎂或Sterotes;助流劑,諸如,膠體二氧化矽;甜味劑,諸如,蔗糖或糖精;或是調味劑,諸如,薄荷、水楊酸甲酯、或柑橘調味劑。
就吸入之投予而言,化合物係以氣溶膠噴霧之形式,由含有適當推進劑(如,氣體,諸如,二氧化碳)之加壓容器或分配器中,或是由噴霧器傳遞。
全身性之投予亦可為穿黏膜或穿皮。就穿黏膜或穿皮投予而言,其在調配物中使用適用於待穿透屏障之穿透劑。此等穿透劑係技藝中一般已知者,且包括,例如,就穿黏膜投予而言,清潔劑、膽鹽、及梭鏈孢酸衍生物。穿黏膜之投予可經由使用鼻噴霧或栓劑而完成。就穿皮投予而言,可將活性化合物調配為油膏、軟膏、凝膠、或乳霜,如技藝中一般已知者。亦可將該等化合物製備為栓劑形式(如,以習知之栓劑基體,諸如,可可脂或其他甘油酯)或是保留灌腸劑以進行直腸傳遞。
根據實施例,可將活性化合物與可保護該化合物使其不會自體內快速排除之載體而共同製備,諸如,控釋調配物,包括植入物及微膠囊傳遞系統。可使用具生物可降解性、生物可相容性之聚合物,諸如,乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、及聚乳酸。用以製備此等調配物之方法將係為熟習技藝者明顯可知。該等材料亦可以商業方式而自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals,Inc.取得。亦可使用脂質體懸浮液(包括可靶向感染細胞之具有對抗細胞特異性抗原之單株抗體的脂質體)作為醫藥上可接受之載體。此等懸浮液可根據熟習技藝者已知之方法製備,例如,如美國專利第4,522,811號所述,其於此併入本文作為參考。
較佳係以劑量單元形式調配口服或腸外組合物,以便利投予並統一劑量。在本文中,劑量單元形式係指物理不連續性之單元,其適合作為該待治療對象之單一劑量;各個單位含有預定量之活性化合物(該量係經計算以產生所欲之治療效應),結合所需之醫藥載體。
此等化合物之毒性及治療功效可依標準的醫藥流程而在細胞培養物或實驗動物體內測定,如,測定LD50
(可使50%之族群致死之劑量)以及ED50
(對於50%之族群具治療有效性之劑量)。毒性及治療功效間之劑量比例係其治療指數,且其可表示為比例LD50
/ED50
。具有高治療指數之化合物係較佳者。儘管可使用具有毒性副作用之化合物,但應小心設計出可使此等化合物靶向至受影響位點之傳遞系統,以使對於未經感染細胞之潛在損害降至最低,並因而減少副作用。
可使用取自細胞培養分析及動物實驗之數據而調配用於人體之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳係落在某一循環濃度範圍內,該範圍包括ED50
並具有極小或無之毒性。劑量可在此範圍內根據所用之劑形及所用之投予途徑而變化。就任何用於本發明方法中之化合物而言,最初可自細胞培養分析估計治療有效劑量。可在動物模式中調配某一劑量,以達成某一循環血漿濃度範圍,該範圍包括在細胞培養物中所測定之IC50
(亦即,可達成一半之最大症狀抑制的試驗化合物濃度)。此等資訊可用以更精確地決定人體內之可用劑量。可使用,例如,高效液相層析測量血漿中之含量。
如本文所定義,活性化合物之治療有效量(亦即,有效劑量)可介於自約0.001至100g/kg體重之範圍,或是熟習技藝者在無須過度實驗情形下即明顯可知且可明瞭之其他範圍。熟習技藝者將可明瞭,某些因子可影響有效治療對象所需之劑量及時機,其包括,但不限於,該疾病或病症之嚴重性、先前之治療、該對象之一般健康情形或年齡、以及其他存在之疾病。
根據另一態樣,熟習技藝者可預期一或多種部件套組,該部件套組可執行至少一種本文所揭示之方法,該部件套組包含二或多種組合物,該等組合物包含根據至少一種上述方法之有效量的本發明組合物(單獨或結合)。
該等套組可能亦包括組合物,其包含活性劑、生物事件辨識劑、或是其他可由熟習技藝者在閱讀本揭示內容時所辨識之化合物。套組亦可包含至少一種包含有效量之本發明組合物或細胞系的組合物。該等部件套組之組合物及細胞可根據由熟習技藝者可辨識之流程而用以執行至少一種本文所揭示之方法。
本文所使用之術語「多肽」係指任何胺基酸殘基之多聚體或聚合物。多肽可由二或多種多肽鏈所構成。多肽包括蛋白、肽、或寡肽。多肽可為直鏈或支鏈。多肽可包含經修飾之胺基酸殘基、胺基酸類似物、或非天然存在之胺基酸殘基,且可由非胺基酸殘基中斷。此定義亦包括可經修飾之胺基酸聚合物,不論該修飾係天然或是藉由介入,如,形成雙硫鍵、糖基化、脂化、甲基化、乙醯化、磷酸化,或是藉由操縱。諸如,共軛連結標記組成份。
本文所使用之術語「特異結合」係指結合配對(如,抗體及抗原)間之交互作用。在各種情形下,特異結合可由約10-6
莫耳/公升、約10-7
莫耳/公升、或約10-8
莫耳/公升、或以下之親和常數表示。
本發明之其中一種實施例是一種治療癌症之方法,其係對有需求之對象投予有效量之免疫原性組合物,該組合物包含Globo H或其片段(如,階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3,亦稱為Gb5)或SSEA-4)以及佐劑。目標癌症之類型包括,但不限於,乳癌(包括1-4期)、肺癌(如,小細胞肺癌)、肝癌(如,肝細胞癌)、口腔癌、胃癌(包括T1-T4)、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤(如,星形細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、及腦脊髓膜瘤)、***癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、以及子宮內膜瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、及胃腸道基質瘤。
由位點分類之癌症包括口腔及咽之癌症(唇、舌、唾腺、口底、牙齦、及其他口部、鼻咽、扁桃腺、口咽、下咽、其他口/咽部);消化系統之癌症(食道;胃;小腸;結腸及直腸;肛門、肛管、及肛門直腸;腹膜、網膜、及腸繫膜;其他消化系統);呼吸系統之癌症(鼻腔、中耳、及鼻竇;喉;肺及枝氣管;胸膜;氣管、縱隔、及其他呼吸系統);間皮瘤;骨及關節;以及軟組織(包括心臟)之癌症;皮膚癌,包括黑素瘤及其他非上皮性皮膚癌;卡波西氏肉瘤及乳癌;女性生殖系統之癌症(子宮頸;子宮體;子宮,未明示(NOS);卵巢;***;陰門;及其他女性生殖系統);男性生殖系統之癌症(***;睪丸;陰莖;及其他男性生殖系統);泌尿系統之癌症(膀胱;腎臟及腎盂;輸尿管;及其他泌尿系統);眼及眼眶之癌症;腦及神經系統之癌症(腦;以及其他神經系統);內分泌系統之癌症(甲狀腺及其他內分泌系統,包括胸腺);淋巴瘤(何杰金氏(Hodgkin)病及非何杰金氏淋巴瘤),多發性骨髓瘤,及白血病(淋巴細胞性白血病;骨髓性白血病;單核細胞性白血病;及其他白血病)。
可為本發明癌症疫苗適當目標之其他由組織學類型分類的癌症包括,但不限於,腫瘤,惡性;癌,NOS;癌,未分化型,NOS;巨細胞及紡綞細胞癌;小細胞癌,NOS;乳突癌,NOS;鱗狀細胞癌,NOS;淋巴上皮癌,NOS;基底細胞癌,NOS;毛母質癌;移形上皮細胞癌,NOS;乳突狀移形上皮細胞癌;腺癌,NOS;胃泌素瘤,惡性;膽管癌;肝細胞癌,NOS;結合性肝細胞癌及膽管癌;小樑腺瘤;腺樣囊性癌;腺瘤性息肉中之腺癌;腺癌,家族性结腸息肉症;實體癌,NOS;類癌,惡性;细支氣管-肺泡腺癌;乳突狀腺癌,NOS;嫌色細胞癌;嗜酸细胞癌;嗜酸性腺癌;嗜鹼细胞癌;透明细胞腺癌,NOS;颗粒细胞癌;濾泡狀腺癌,NOS;乳突狀及濾泡狀腺癌,NOS;非包囊性硬化癌;腎上腺皮質癌;類子宮內膜癌;皮膚附器癌;大汗腺癌;皮脂腺癌;耵聹腺癌;黏液表皮樣癌;囊腺癌,NOS;乳突狀囊腺癌,NOS;乳突狀漿液性囊腺癌;黏液性囊腺癌,NOS;黏液性腺癌;印戒细胞癌;浸潤性腺管癌;髓樣癌,NOS;乳葉癌;炎性癌;柏哲氏(Paget)病,***;腺泡细胞癌;腺鱗狀細胞癌;具鱗狀細胞化生之腺癌;胸腺瘤,惡性;卵巢間質瘤,惡性;卵泡膜細胞瘤,惡性;卵巢颗粒细胞瘤,惡性;男性母细胞瘤,惡性;賽托利(Sertoli)細胞瘤;萊迪希氏(Leydig)細胞瘤,惡性;脂細胞瘤,惡性;副神經節瘤,惡性;***外副神經節瘤,惡性;嗜鉻細胞瘤;血管球肉瘤;惡性黑素瘤,NOS;無黑色素性黑素瘤;表淺散播型黑素瘤;,NOS;巨大色素痣中之惡性黑素瘤;類上皮細胞黑素瘤;藍痣,惡性;肉瘤,NOS;纖維肉瘤,NOS;纖維組織細胞瘤,惡性;黏液肉瘤;脂肪肉瘤,NOS;子宮肌肉瘤,NOS;橫紋肌肉瘤,NOS;胚胎型橫紋肌肉瘤;腺泡型橫纹肌肉瘤;間質肉瘤,NOS;混合腫瘤,惡性,NOS;米勒氏(Mullerian)混合腫瘤;腎母細胞瘤;肝母細胞瘤;癌肉瘤,NOS;間充細胞瘤,惡性;布雷納氏(Brenner)腫瘤,惡性;葉狀莖腫瘤,惡性;滑膜肉瘤,NOS;間皮瘤,惡性;惡性胚胎瘤;胚胎癌,NOS;畸胎瘤,惡性,NOS;甲狀腺腫樣卵巢瘤,惡性;絨毛膜癌;中腎瘤,惡性;血管瘤;血管內皮細胞瘤,惡性;卡波西氏肉瘤;血管周圍細胞瘤,惡性;***肉瘤,惡性;骨肉瘤,NOS;皮質旁骨肉瘤;軟骨肉瘤,NOS;軟骨母細胞瘤,惡性;間葉性軟骨肉瘤;骨之巨細胞瘤;尤文氏(Ewing)肉瘤,惡性;牙原性瘤,惡性;成釉细胞牙肉瘤;成釉細胞瘤,惡性;成釉细胞纖維肉瘤;松果體瘤,惡性;脊索瘤;神經膠質瘤,惡性;室管膜瘤,NOS;星形细胞瘤,NOS;原漿型星形细胞瘤;纖維型星形细胞瘤;星形母细胞瘤;膠質母細胞瘤,NOS;寡樹突膠質細胞瘤,NOS;寡樹突膠質母細胞瘤;原始神經外胚層瘤;小腦肉瘤,NOS;神經節神經母細胞瘤;神經母細胞瘤,NOS;視網膜母細胞瘤,NOS;嗅神經生成性腫瘤;腦膜瘤,惡性;神經纖維肉瘤;神經鞘瘤,惡性;顆粒細胞瘤,惡性;惡性淋巴瘤,NOS;何杰金氏病,NOS;何杰金氏副肉芽腫,NOS;惡性淋巴瘤,小淋巴細胞性;惡性淋巴瘤,大細胞,瀰漫性;惡性淋巴瘤,濾泡性,NOS;蕈狀肉芽腫;其他特定之非何杰金氏淋巴瘤;惡性組織細胞增生症;多發性骨髓瘤;肥大細胞肉瘤;免疫增生性小腸疾病;白血病,NOS;淋巴細胞性白血病,NOS;漿細胞白血病;紅白血病;淋巴肉瘤細胞白血病;骨髓性白血病,NOS;嗜鹼細胞性白血病;嗜伊紅性白血病;單核細胞性白血病,NOS;肥大細胞白血病;巨核母细胞性白血病;骨髓性肉瘤;及多毛狀细胞白血病。
本文所使用之術語「治療」係指對對象施用或投予包括一或多種活性劑之組合物,該對象具有癌症、癌症之症狀、或是傾向癌症之素因,該施用及投予之目的為治癒、治療、緩和、減輕、改變、補救、改善、改進、或影響該癌症、癌症之症狀、或是傾向癌症之素因。本文所用之「有效量」係指在單獨使用或是結合一或多種其他活性劑之情形下,欲對該對象產生治療作用所需之各活性劑的量。如熟習技藝者所知,有效量會根據投予之途徑、賦形劑之使用、以及其他活性劑之共使用而各有不同。
用於上述方法中之免疫組合物可含有聚醣(亦即,含有糖分子部分之分子),其係Globo H或其片段,以及佐劑。Globo H係一種含有六糖抗原決定部位(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4Glc),並視需要含有非糖分子部分的聚醣。其片段係含有六糖抗原決定部位以及(如果有的話)非糖分子部分之片段的聚醣。此等寡醣可由常規方法製備(參見,Huangetal.,Proc. Natl. Acad. Sci
.USA 103:15-20(2006))。如有需要,可與非糖分子部分連結。
原申請案美國專利申請案第12/485,546號係揭示無法預見之發現:(1)SSEA-3,Globo H之直接前驅物,在乳癌幹細胞中有高量之表現,並因此可作為乳癌治療之適當標靶,以及(2)α-半乳糖苷基-神經醯胺(α-GalCer)係一種有效之佐劑,其可促進抗Globo H及抗SSEA-3抗體之生成。
美國專利申請案第12/485,546號提出一種免疫組合物,其含有Globo H或其片段(如,SSEA-3)以及佐劑(α-GalCer)。Globo H或其片段可與匙孔血藍蛋白(KLH)共軛連結。在投予至對象(如,人類)體內時,此種免疫組合物可激發靶向Globo H或其片段之免疫反應(如,抗體生成),並因此可有效治療癌症(如,乳癌、***癌、卵巢癌、及肺癌)。
美國專利申請案第12/485,546號係關於一種製備對於Globo H或其片段具有特異性之抗體的方法,其係對一非人類哺乳動物(如,小鼠、兔、山羊、綿羊、或馬)投予上述之免疫組合物,並自該哺乳動物分離可結合Globo H或其片段之抗體。
本揭示內容中所述之Globo H或其他聚醣係與蛋白載體共軛連結,諸如,DT-CRM197。其接著可與佐劑(諸如,C34)及視需要之醫藥上可接受性載體(如,磷酸緩衝鹽水,或碳酸氫鹽溶液)混合,以經由習知之方法而形成免疫組合物(如,疫苗)。參見,如,美國專利第4,601,903;4,599,231;4,599,230;及4,596,792號。該組合物可被製備為可注射物、液態溶液、或乳液,且該載體係根據投予之方式及途徑並根據標準醫藥實務而選擇。適當之醫藥載體及稀釋劑,及其使用所需的醫藥品,描述於雷明登氏製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。該免疫組合物較佳含有α-GalCer作為佐劑。佐劑之其他實例包括,但不限於,霍亂毒素、大腸桿菌忌熱性腸毒素(LT)、脂質體、免疫刺激性共軛連結物(ISCOM)、或免疫刺激性序列寡去氧核苷酸(ISS-ODN)。該組合物亦可包括可協助體內輸送之聚合物。參見,Audran R. et al.Vaccine
21:1250-5,2003;以及Denis-Mize et al. Cell Immunol.,225:12-20,2003。在需要時,其尚可含有少量之輔助物質,諸如,溼潤及乳化劑,或pH緩衝劑,以增進該組合物激發對抗Globo H或其片段中之糖分子部分之免疫反應的能力。本文所述之免疫組合物可由腸外投予(如,靜脈注射、皮下注射、或肌內注射)。或者,可能需要其他投予模式,包括栓劑及口服調配物。就栓劑而言,黏合劑及載體可包括,例如,聚烯烴基二醇或三酸甘油脂。口服調配物可包括正常使用之賦形劑,諸如,舉例而言,醫藥級之糖精、纖維素、碳酸鎂、及其類似者。此等組合物可為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、或粉末之形式,且其含有10-95%之本文所述免疫組合物。
該免疫組合物係以可與該劑型調配物相容之方式進行投予,且其投予量為具有治療有效性、保護性、及免疫原性之量。投予之量取決於該待治療之對象,包括,例如,該個體之免疫系統合成抗體及(如有需要的話)產生細胞調節性免疫反應的能力。投予所需活性成分之精確量係由執業醫師之判斷決定。然而,適當之劑量範圍可由熟習技藝者輕易決定。起始投予及強化劑劑量之適當治療方案亦為可變化的,可包括起始投予後續投予。疫苗之劑量亦可取決於投予途徑,並根據宿主之大小而有所變化。
本發明之免疫組合物亦可用於在動物體內產生抗體以進行抗體之製備,該等抗體可用於癌症之治療及診斷兩者。在動物(如,小鼠、兔、山羊、綿羊、或馬)體內製備單株及多株抗體及其片段之方法為技藝中所熟知。參見,例如,抗體:實驗室手冊(Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。術語「抗體」包括完整之免疫球蛋白分子以及其片段,諸如,Fab、F(ab')2、Fv、scFv(單鏈抗體)、及dAb(區域抗體);Ward,et. al.(1989)Nature
,341,544)。
以本文所述之方法合成Globo H(1)
及其片段2-10
。為進行蛋白共軛連結,使純化之Globo H半酯12
與個別載體蛋白一起培育,如圖14所示。
以MALDI-TOF分析該等Globo H-蛋白之特徵,以測定各個載體蛋白上之Globo H分子數目。納入Globo H之平均數目列於表1。
GH-KLH共軛連結物顯示納入最大數目之Globo H,主要係因為KLH尺寸較大及具有較多Lys殘基。亦將使用對-硝基苯基連接子之相同流程應用於竹嵌紋病毒,其在病毒外殼上含有超過100,000個離胺酸殘基。然而,該病毒在4℃下於磷酸鈉緩衝液(pH=7.2)中反應時的不安定性是進一步研發之主要考量。此外,GH-BaMV16
因其巨大尺寸而限制其可經由MALDI-TOF分析進行偵測。
使合成的Globo H及切截片段(圖1)以戊胺連接子連附於還原端,並共價固定於經NHS塗覆之玻璃玻片上。在十一種寡醣中,選擇九種壓印在微陣列上。九種Globo H類似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2)分別以50μM(12重複),對各個微陣列玻片進行點漬。
為驗證微陣列上之醣類,使用小鼠單株抗體(針對Globo H之VK9及Mbr1,以及抗SSEA-3)並使用對應之次級抗體(山羊抗小鼠IgG及IgM),以檢驗結合特異性,結果顯示於圖2A-2C。數據顯示,VK9及Mbr1兩者皆可辨識Globo H以及外側之四醣BB4,但MBr1亦可輕微辨識BB3。此外,抗SSEA-3抗體可特異辨識SSEA-3抗原(Gb5)而無任何交叉反應性。該等結果指出,Globo H微陣列可用於描述取自經免疫小鼠之多株抗體的特異性及效價。
如先前之報導,以完全合成之Globo H疫苗及共同投予之QS-21免疫小鼠可造成對抗人類乳癌細胞之抗體的生成;然而,儘管有進行數次的加強免疫接種,該等小鼠抗體主要仍是IgM(Ragupathi G,et al
.(1997)Angew Chem Int Ed
36:125-128)。
以1μg之合成性Globo H共軛連結物,在有或無醣脂質佐劑α-GalCer(C1)之情形下,由皮下免疫一群小鼠。發現GH-KLH、GH-DT、及GH-BV是誘發IgM最有效的免疫原,其次為GH-TT及GH-BSA,如圖3A所述,而α-GalCer可刺激免疫反應以誘發高量的IgM抗體。亦在小鼠IgG抗體上觀察到類似之傾向(圖3B),而該相對IgG含量高於IgM含量。簡言之,儘管合成性醣共軛連結物具有較低之醣密度,但GH-DT具有與GH-KLH類似之免疫原性,而α-GalCer佐劑則顯示可增強免疫反應。
由於α-GalCer已顯示為GH-DT之有效佐劑,針對具有高於C1之較佳佐劑活性的其他醣脂質進行檢驗,如圖4所示。以GH-DT及GH-BV在有或無醣脂質之情形下免疫小鼠群。取得血清,並將其引入聚醣微陣列分析。一般而言,小鼠抗Globo H IgG效價隨著免疫流程之進行而增加,但IgM含量則幾乎與免疫接重次數無關(圖5)。在GH-BV免疫接種組中,醣脂質-疫苗處理及單獨疫苗處理間的IgM含量並無顯著差異。儘管此等結果暗示GH-BV結合醣脂質並非一種有效之免疫方案,但此不良之免疫原性可能是由BaMV之不安定性所造成。然而,α-GalCer類似物,特別是7DW8-5,則可與GH-DT合作良好而誘發小鼠免疫反應。
有趣的是,由GH-DT及各種醣脂質佐劑所產生之小鼠多株IgG抗體不僅可中和Globo H,亦可與Gb5、SSEA-4、及Gb4交叉反應,而C34似乎為最有效之醣脂質佐劑(圖6)。為尋找可誘發較IgM高出許多之效價的IgG的新穎疫苗組合物,測試Globo H-DT共軛連結物與醣脂質C1或C34或是市售可得之佐劑AlPO4
(磷酸鋁)或MF59。
令人意外地,在第三次疫苗接種後,Globo H-DT與醣脂質C34可幾乎完全專一地誘發IgG抗體(圖7)。簡言之,新穎的醣脂質佐劑7DW8-5結合GH-DT共軛連結物可增強抗Globo H IgG及IgM抗體兩者,而醣脂質佐劑C34結合GH-DT可誘發較IgM高出許多之IgG抗體效價。其對於SSEA-3(Gb5)及SSEA-4抗原亦具有不同程度的結合親和力,該兩種抗原皆特異表現於乳癌幹細胞之表面。
為進一步比較不同醣脂質佐劑對於Globo H疫苗之作用,茲以GH-KLH免疫七組小鼠。該等結果顯示,與醣脂質一同進行疫苗接種之小鼠可誘發較高含量之抗Globo H抗體(圖8)。儘管MF59係一種強效佐劑,但其無法與GH-KLH合作以誘發對抗Globo H之抗體。AlPO4
(磷酸鋁)亦顯示對抗體誘發無明顯效應。另一方面,GH-KLH結合C34在第一及第二次免疫接種後顯示較佳之免疫原性,但在第三次免疫接種後則顯示與C1並無顯著差異。整體而言,此等發現暗示該等新穎醣脂質衍生物具有作為以醣為基礎之疫苗的佐劑之潛力。
細胞及體液免疫反應之性質不僅會受抗原及佐劑之組合影響,亦會受載體及免疫途徑影響。如Sesardic及其同事所述,DT-CRM197(一種無毒性之突變毒素)可誘發抗原特異性之T細胞增殖,並增加脾細胞之IL-2、IFN-γ、及IL-6生成,因此暗示其係在由Th1驅動之途徑中扮演某種角色(Miyaji ENet al
.(2001)Infect Immun
69:869-874;Godefroy S,et al
.(2005)Infect Immun
73:4803-4809;Stickings P,et al
.(2008)Infect Immun
76:1766-1773)。儘管其細胞激素內容主要係Th1,但抗CRM197抗體之亞群為IgG1且無可偵測之IgG2a,因此暗示其係混合的Th1/Th2反應。此等結果促使針對Globo H疫苗之抗體同種型內容的評估,而本研究顯示,GH-DT或GH-KLH結合醣脂質佐劑可主要誘發IgG1抗體及微量之IgG2a(圖9)。
儘管醣脂質佐劑在經靜脈(i.v.)單獨投予時可增強TH
1偏性細胞激素分泌,但並未觀察到抗體類型轉換(IgG2a)。整體言之,醣脂質在增強細胞及體液免疫反應兩方面皆扮演關鍵角色。
合成與DT共軛連結之SSEA-3(Gb5)及SSEA-4並進行測試。在第三次疫苗接種後,比較IgM及IgG之抗體效價,發現SSEA-3-DT及SSEA-4-DT亦可誘發較IgM高出許多之IgG效價(圖10)。
由於GH-DT及C34可誘發抗體辨識Globo H、Gb5、及SSEA-4,故使用24種聚醣之陣列,在佐劑之存在下,針對SSEA-3-DT及SSEA-4-DT疫苗之特異性進行檢驗,將重點放在IgG之研究(圖11)。
如圖12所示,以Globo H-DT及C34佐劑免疫之小鼠可誘發高選擇性辨識Globo H、SSEA-3(Gb5)、及SSEA-4之抗體,而疫苗SSEA-3-DT與佐劑MF59則可誘發低選擇性之高免疫反應。另一方面,SSEA-3-DT結合佐劑C34僅可誘發對抗Globo H、SSEA-3、及SSEA-4之抗體。
有趣的是,在有或無佐劑之情形下,SSEA-4-DT(唾液酸化-Gb5)可誘發特異辨識SSEA-4及其切截結構(具有前端乳糖缺失之SSEA-4)的IgG及IgM抗體,在不受理論限制之情形下,假設唾液酸具高度免疫原性,且可誘發高度特異性之免疫反應。
以SSEA-3-DT-C34免疫小鼠可誘發具Globo H、SSEA-3、及SSEA-4反應性之抗體,此暗示以Globo H為基礎之疫苗可靶向表現Globo H、SSEA-3、及SSEA-4之腫瘤細胞及乳癌幹細胞。
以Globo H-DT-C34免疫小鼠可誘發具Globo H、SSEA-3、及SSEA-4反應性之抗體,此暗示以Globo H為基礎之疫苗可靶向表現Globo H、SSEA-3、及SSEA-4之腫瘤細胞及乳癌幹細胞。
以SSEA-4-DT免疫小鼠可誘發具SSEA-4反應性之抗體,此暗示以SSEA-4-DT為基礎之疫苗可靶向表現SSEA-4之腫瘤細胞及乳癌幹細胞。
為直接評估合成性醣共軛連結物疫苗之功效,每週測量腫瘤大小3次,如圖13所示。一般而言,使腫瘤在注射4T1(一種帶有Globo H之乳癌細胞系)後生長2週。在第24天,所有結合醣脂質佐劑之疫苗接種組仍顯示相較於單獨使用GH-DT組及PBS控制組之較小腫瘤進程。該數據暗示,以GH-DT及醣脂質佐劑進行之疫苗接種可在活體內延遲部分程度之腫瘤進程。
已證實Globo H在BCSCs中表現,但其頻率低於非BCSCs,且在乳癌及BCSCs中,SSEA-3以高於Globo H之頻率表現(Chang W-W. et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA
105(33):11667-11672,其以全文納入本文作為參考)。
表2摘述35名乳癌病患之臨床特徵,其中測量其體內之SSEA-3或SSEA-4表現。中數年齡係48歲(介於自31至82歲)。病患包括一名0期、10名I期、19名II期、及5名III期。大部分之腫瘤樣本具有浸潤性腺管癌之病理現象(80.0%),其中51.4%為ER陽性,且65.7%為淋巴結轉移陽性。在表2中,SSEA-3或SSEA-4表現之範圍係以總癌細胞中之陽性細胞百分比表示。使用t
試驗,針對相對於HER-2或淋巴結轉移狀態之SSEA-3或SSEA-4表現進行統計分析。HER-2表現係由免疫組織化學測定。在SSEA-3或SSEA-4在腫瘤上之表現量與各種臨床病理因子之間並無顯著相關,諸如,分期(SSEA-4:P
=0.3498;SSEA-3:,P
=0.9311),或HER-2(SSEA-4:P
=0.0142;SSEA-3:,P
=0.0128)(表2)。
以酶切消化從參與病患分離出原始腫瘤細胞,並以針對CD45、CD24、CD44之特異性抗體進行染色,然後先排除CD45+
細胞以除去白細胞。為比較BCSCs與非BCSCs間之SSEA-3或SSEA-4表現,根據其表面標記物之表現,將CD45-
腫瘤細胞進一步分離成為BCSCs與非BCSCs。BCSCs係以CD45-
/CD24-
/CD44+
細胞辨識;而該CD45-
族群之其他部分則視為非BCSCs。
使用此種方法,在35份腫瘤樣本中評估BCSCs及非BCSCs中之SSEA-3或SSEA-4表現。整體而言,在34/35(97.1%)之腫瘤中偵測到SSEA-4,並在27/35(77.1%)之腫瘤中偵測到SSEA-3(表3)。以流式細胞計數判定SSEA-3或SSEA-4表現。將BCSCs定義為CD45-
CD24-
CD44+
細胞辨識,而非BCSCs則定義為該CD45-
細胞族群之剩餘部份。範圍係以總細胞中之陽性細胞百分比計算。
如表3所摘述,27/35(77.1%)之樣本表現SSEA-3,其陽性細胞百分比之範圍係自1.4%至66.4%。由25/35之腫瘤中分離之非BCSCs表現SSEA-3,其陽性細胞百分比之範圍係自24.3%至70.4%。相較而言,取自35個腫瘤中之23個(65.7%)的BCSCs顯示具有SSEA-3之陽性染色,其陽性細胞百分比之範圍係自5.0%至58.4%。
在表現SSEA-4之34/35(97.1%)個樣本中,其陽性細胞百分比之範圍係自0.5%至77.1%。由32/35之腫瘤中分離之非BCSCs表現SSEA-4,其陽性細胞百分比之範圍係自24.0%至78.1%。相較而言,取自35個腫瘤中之31個(88.6%)的BCSCs顯示具有SSEA-4之陽性染色,其陽性細胞百分比之範圍係自5.6%至83.6%。
為比較BCSCs與非BCSCs之SSEA-4表現,依其表面標記物之表現,將CD45-
腫瘤細胞進一步分成BCSCs與非BCSCs。BCSCs係以CD45-
/CD24-
/CD44+
細胞辨識;而該CD45-
族群之其他部分則視為非BCSCs。此兩種經區隔的族群各自的SSEA-4表現隨腫瘤樣本而有不同,如圖15所示。舉例而言,病患BC0264之BCSCs佔總分離腫瘤細胞中之5.7%,為SSEA-4陰性,而60.3%之非BCSCs則表現SSEA-4。就病患BC0266而言,僅在59.4%之非BCSCs及55.7%之BCSCs中偵測到SSEA-4表現。就病患BC0313而言,則是在32.4%之非BCSCs及83.6%之BCSCs中偵測到SSEA-4表現。共計在34/35(97.1%)之試驗樣本中偵測到SSEA-4,其陽性細胞百分比之範圍係自0.5%至77.1%(表32)。
使用組織微陣列,以免疫組織化學染色,在20種不同之器官中分析SSEA-4表現,如表4所示(E,上皮;C,結締組織)。
SSEA-4係表現在數種腺體組織之上皮細胞上,諸如,***、結腸、胃腸道、腎、肺、卵巢、胰、直腸、胃、睪丸、胸腺、及子宮頸(表4)。此外,SSEA-4之表現類似於Globo H及SSEA-3之方式(Chang W-W. et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA
105(33):11667-11672),主要侷限在上皮細胞之細胞質或頂表面,其基本上係免疫系統所無法進入者,如圖16所示。
相較而言,Globo H係表現在數種腺體組織之上皮細胞上,諸如,***、胃腸道、胰、***、及子宮頸。SSEA3之分布類似Globo H,唯其不存在正常之***組織中,但存在於腎、直腸、睪丸、及胸腺中,該等組織為Globo H陰性(Chang W-W. et al.,(2008)Proc Natl Acad Sci USA
105(33):11667-11672)。
下列之實例係用以說明本發明之較佳具體實例。熟習技藝者應可明瞭,該等實例中所揭示之技術係代表發明人所發現之技術,可充分發揮作用而實施本發明,並因此可被視為構成實施之較佳模式。然而,根據本揭示內容,熟習技藝者應可明瞭,可在所揭示之特定具體實例中進行諸多改變並仍獲得相似或類似之結果,而不偏離本發明之精神及範圍。
市售溶劑及試劑以獲得時的狀態予以使用,不作進一步純化,係購自Sigma-Aldrich、Acros、Merck、Echo chemical、及Senn Chemical。單株抗體Mbr1係購自ALEXIS biochemicals,Cy3-共軛連結性抗小鼠IgG(IgG、IgG1、及IgG2a)以及IgM抗體係購自Jackson Immuno Research
。DT-CRM197蛋白及破傷風類毒素係分別購自Merck及Adimmune。磷酸鋁凝膠佐劑(AlPO4
)係購自Brenntag Biosector。竹病毒及VK9單株抗體係分別自林(Lin)及尤(Yu)博士之實驗室製備。醣脂質衍生物係由王(Wong)博士之實驗室合成及提供。
在使用之前,將用於醣基化作用之分子篩(MS,AW-300)研碎並予以活化。以分析性TLC盤(PLC矽膠-60,F254
,2mm,Merck)監測反應,並在UV(254nm)下或使用對-茴香醛染色而顯影。在矽膠(40-63μm)或LiChroprep RP18(40-63μm)上進行閃蒸管柱層析。在使用前以ddH2
O清洗透析膜(Cellulose Ester,MCCO=10,000)。
以Bruker Advance 600(600MHz/150MHz)NMR光譜儀,記錄質子核磁共振(1
H NMR)光譜、碳核磁共振(13
C NMR)光譜。質子之化學位移之報告係以ppm為單位(δ級),並參照四甲基矽烷(δ=0)。碳之化學位移亦係以百萬分率(ppm單位,δ級)報告。使用DEPT 135(無畸變極化轉移增強法)測定多重性。數據係如下表示:化學位移,多重性(s=單峰,d=二重峰,t=三重峰,q=四重峰,m=多重峰,br=寬闊峰),積分及偶合係數(J)為Hz單位。以BioTOF III取得高解析質譜,並以Ultraflex II TOF/TOF200使用MALDI-TOF MS。
使用可程序化之一鍋化策略(programmable one-pot strategy),合成Globo H(1
;參見圖11)及其片段2-10
(Huang C-Y,et al
.(2006)Proc Natl Acad Sci USA
103:15-20)。1
之反應係以足夠的同質雙功能性(homobifunctional)連接子,於無水DMF溶液中,在室溫下進行(Wu X,et al
.(2004)Org Lett
6:4407-4410;Wu X,Bundle DR(2005)J Org Chem
70:7381-7388)。反應可用TLC輕易監測。一旦自由胺消失並出現較大R f
產物,即蒸發該反應混合物以除去DMF,並以二氯甲烷及水清洗,以除去過量之連接子。最後,以反相(C18)管柱層析純化產物,並以含有1%醋酸至40%甲醇於水中之水漸進溶析。接著對該溶液進行凍乾,以產生淺黃色之產物12
。最後,為進行蛋白共軛連結,使純化之Globo H半酯12
(30-40當量),與個別之載體蛋白,於磷酸鹽緩衝液(10mM,pH 7.2)中,在室溫下共置24小時(圖14)。重要的是,必須將蛋白濃度調整至~5mg/mL,以使離胺酸殘基與Globo H半酯之偶合達到最大程度。24小時後,稀釋該醣共軛連結物,並以去離子水進行透析,以除去剩餘之對-硝基苯基。接著將該溶液凍乾成為白色粉末,以產生13
、14
、及15
。
以MALDI-TOF分析Globo H-蛋白共軛連結物之特性,以測定各個載體蛋白上之Globo H分子數目。Globo H之平均數目列於上文所示之表1。
將醣共軛連結物13
、14
、及15
溶於ddH2
O中,產生約1pmol/μL之終濃度。選擇芥子酸作為基質,並與新鮮製備之乙腈及去離子水(1:1v/v)混合,以產生含0.1% TFA之10mg/mL終基質濃度。在線性正離子模式下偵測各個樣本,以取得m/z
光譜。以m/z
測定各醣共軛連結物之分子量。醣共軛連結物14
顯示異質性,指出平均有2~4個。GH-KLH共軛連結物顯示含有最大數目之Globo H,大部分係因KLH之尺寸較大以及含有較多Lys殘基所致。亦將使用對-硝基苯基連接子之相同偶合流程應用於竹嵌紋病毒,其在病毒外殼上含有超過100,000個離胺酸殘基。然而,該病毒在4℃下於磷酸鈉緩衝液(pH=7.2)中反應時的不安定性是進一步研發之主要考量。此外,GH-BaMV16
因其巨大之尺寸而限制其可經由MALDI-TOF分析進行偵測。最後,將凍乾之醣共軛連結物貯存在-30℃,並在使用前以無菌水進行重新配製。
使合成之Globo H及切截片段(圖1)以戊胺連接子連附於還原端,並共價固定於經NHS塗覆之玻璃玻片上。在十一種寡醣中,選擇九種壓印在微陣列上。針對一系列的寡醣濃度(1、5、10、20、40、50、80、100μM)進行試驗,以使結合親和力及螢光強度最適化。分別以50μM之九種Globo H類似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2),對各個微陣列玻片進行點漬(12重複)。在80%溼度大氣下反應後,將該等玻片在使用前貯存於室溫下之乾燥器中。
為驗證微陣列上之醣類,使用小鼠單株抗體(針對Globo H之VK9及Mbr1,以及抗SSEA-3)及對應之次級抗體(山羊抗小鼠IgG及IgM)以檢驗結合特異性,結果顯示於圖2A-2C。該數據暗示,VK9及Mbr1兩者皆可辨識Globo H以及外側之四醣BB4,但MBr1亦可輕微辨識BB3(Gilewski Tel al.
(2001)Proc Natl Acad Sci USA
98:3270-3275;Huang C-Y,et al.
(2006)Proc Natl Acad Sci USA
103:15-20)。此外,抗SSEA-3抗體可特異辨識SSEA-3抗原(Gb5)而無任何交叉反應性。該等結果指出,Globo H微陣列可用於描述取自經免疫小鼠之多株抗體的特異性及效價。
在此實驗中,以1μg之合成性Globo H(GH)共軛連結物,在有或無醣脂質佐劑α-GalCer(C1)之情形下,由皮下免疫一群小鼠。在每週間隔之三次免疫接種10天後,收集小鼠血清,並接著引入聚醣微陣列中,以評估抗體含量。發現GH-KLH、GH-DT、及GH-BV是誘發IgM之最有效免疫原,其次為GH-TT及GH-BSA,如圖3A所述,而α-GalCer則可刺激免疫反應以誘發高量之IgM抗體。亦在小鼠IgG抗體上觀察到類似之傾向(圖3B),而該相對IgG含量高於IgM含量。簡言之,儘管合成性醣共軛連結物具有較低之醣密度,但GH-DT具有與GH-KLH類似之免疫原性,而α-GalCer佐劑亦顯示可增強該免疫反應。
由於C1已經顯示為GH-DT之有效佐劑,因此針對具有高於C1之較佳佐劑活性的其他醣脂質進行檢驗,如圖4所示(Fujio M,et al
.(2006)J Am Chem Soc
128:9022-9023)。
以1.6μg之GH-DT及GH-BV,在有或無2μg醣脂質之情形下,每週兩次由肌內免疫小鼠群。在第三次疫苗接種兩週後取得血清,並將其引入聚醣微陣列分析。一般而言,小鼠抗Globo H IgG效價隨著免疫流程之進行而增加,但IgM含量則幾乎與免疫接種次數無關(圖5)。在GH-BV免疫接種組中,醣脂質-疫苗處理及單獨疫苗處理的IgM含量並無顯著差異。儘管此等結果暗示,GH-BV結合醣脂質並非一種有效之免疫方案,但該不良之免疫原性可能係由BaMV之不安定性所造成。然而,α-GalCer類似物,特別是7DW8-5,則可與GH-DT合作良好而誘發小鼠免疫反應。
有趣的是,由GH-DT及各種醣脂質佐劑所產生之小鼠多株IgG抗體不僅可中和Globo H,亦可與Gb5、SSEA-4、及Gb4交叉反應,而C34似乎為最有效者(圖6)。為尋找可誘發較IgM有高出許多之效價之IgG的新穎疫苗組合物,試驗Globo H-DT共軛連結物與醣脂質C1或C34或是市售可得之佐劑AlPO4
(磷酸鋁)或MF59。令人意外地,在第三次疫苗接種後,Globo H-DT與醣脂質C34可幾乎誘發IgG抗體(圖7)。簡言之,新穎之醣脂質佐劑7DW8-5結合GH-DT共軛連結物可增強抗Globo H IgG及IgM抗體兩者,而醣脂質佐劑C34結合GH-DT可誘發較IgM高出許多之IgG抗體效價。其對於Gb5及SSEA-4抗原亦具有不同之結合親和力,該兩種抗原皆特異表現於乳癌幹細胞之表面。
為進一步比較不同醣脂質佐劑對於Globo H疫苗之作用,茲以GH-KLH免疫七組小鼠。該等結果暗示,與醣脂質一同進行疫苗接種之小鼠可誘發較高含量之抗Globo H抗體(圖8)。儘管MF59係一種強效佐劑,但其無法與GH-KLH合作以誘發對抗Globo H之抗體。AlPO4
(磷酸鋁)亦顯示對於抗體誘發無明顯效應。另一方面,GH-KLH結合C34在第一及第二次免疫接種後顯示較佳之免疫原性,但在第三次免疫接種後則顯示與C1並無顯著差異。
DT-CRM197(一種無毒性之突變毒素)可誘發抗原特異性之T細胞增殖,並增加脾細胞之IL-2、IFN-γ、及IL-6生成,因此暗示其在由Th1驅動之途徑中所扮演某種角色(Miyaji ENet al
.(2001)Infect Immun
69:869-874;Godefroy S,et al
.(2005)Infect Immun
73:4803-4809;Stickings P,et al
.(2008)Infect Immun
76:1766-1773)。儘管細胞激素內容主要係Th1,但抗CRM197抗體之亞群為IgG1且無可偵測之IgG2a,暗示其係混合的Th1/Th2反應。此等結果促成針對Globo H疫苗之抗體同種型內容的評估,而本研究顯示,GH-DT或GH-KLH結合醣脂質佐劑可主要誘發IgG1抗體及微量之IgG2a(圖9)。
儘管醣脂質佐劑在經靜脈(i.v.)單獨投予時可增強Th1偏性細胞激素分泌,但並未觀察到抗體類型轉換(IgG2a)。整體言之,醣脂質在增強細胞及體液免疫反應兩方面皆扮演關鍵角色。
亦以相同策略合成與DT共軛連結之Gb5及SSEA-4。在第三次疫苗接種後,比較IgM及IgG之抗體效價,發現Gb5-DT及SSEA-4-DT亦可誘發較IgM高出許多之IgG效價(圖10)。
由於GH-DT及C34可誘發抗體辨識Globo H、Gb5(SSEA-3)、及SSEA-4,因此使用24種聚醣之陣列,在佐劑之存在下,針對SSEA-3-DT及SSEA-4-DT疫苗之特異性進行檢驗,將焦點放在IgG之研究(圖11)。
如圖12所示,以Globo H-DT及C34佐劑免疫之小鼠可誘發能夠高選擇性辨識Globo H、SSEA-3(Gb5)、及SSEA-4之抗體,而疫苗SSEA-3-DT與佐劑MF59則可誘發低選擇性之高免疫反應。另一方面,SSEA-3-DT結合佐劑C34僅可誘發對抗Globo H、SSEA-3、及SSEA-4之抗體。
有趣的是,在有或無佐劑之情形下,SSEA-4-DT均可誘發特異辨識SSEA-4及其切截結構(具有前端乳糖缺失之SSEA-4)的IgG及IgM抗體。然而並不清楚該選擇性之來源為何。
為直接評估合成性醣共軛連結物疫苗之功效,每週測量腫瘤尺寸3次,如圖13所示。一般而言,使腫瘤在注射4T1(一種帶有Globo H之乳癌細胞系)後,繼續生長2週。在第24天,所有結合醣脂質佐劑之疫苗接種組仍顯示較小的腫瘤進程(相較於單獨使用GH-DT組及PBS控制組)。該初步數據暗示,以GH-DT及醣脂質佐劑進行之疫苗接種可在活體內延遲部分程度之腫瘤進程。
如下製備Globo H半酯:
將Globo H胺1
(5mg,4.54μmol)溶於無水DMF溶液中。接著加入對-硝基苯基醚連接子(8.8mg,22.7μmol),並在室溫下攪拌1~3小時。以TLC(1% AcOH於甲醇中)及寧海準試驗(Ninhydrin test)監測反應。自由胺之消失及較大R f
產物之出現表示反應完成。在減壓條件下並不予加熱而蒸發該反應混合物以除去DMF,接著以CH2
Cl2
及含有1%醋酸之水萃取兩次。以反相(C18)管柱層析濃縮及純化該水溶液,並以含有1%醋酸之H2
O至MeOH:H2
O=4:6漸進溶析。接著將該溶液凍乾為淺黃色之固體產物12
(5.4mg,產率88%)1
H NMR(600MHz,D2
O)δ8.25(d,2H,J
=9.0Hz),7.28(d,2H,J
=9.0Hz),5.12(d,1H,J
=3.9Hz),4.79(d,1H,J
=3.7Hz),4.51(d,1H,J
=7.7Hz),4.44(d,1H,J
=7.7Hz),4.39(d,1H,J
=7.7Hz),4.31-4.28(t,2H,J
=7.7Hz),4.15-4.11(m,2H),3.99(d,1H,J
=2.0Hz),3.92(d,1H,J
=2.8Hz),3.89-3.44(m,33H),3.16(t,1H,J
=8.6Hz),3.10(t,2H,J
=6.7Hz),2.62(t,2H,J
=6.9Hz),2.20(t,2H,J
=6.6Hz),1.93(s,3H),1.62-1.49(m,4H)1.54-1.48(m,2H),1.45-1.40(m,2H),1.30-1.24(m,2H),1.11(d,3H,J
=6.5Hz)13
C NMR(150MHz,D2
O)δ178.0,176.1,176.0,156.9,147.1,127.3,124.5,105.7,105.0,103.7,103.6,102.2,101.0,80.5,80.0,78.9,78.0,77.8,77.1,76.7,76.4,76.3,76.2,75.2,74.6,73.8,73.5,72.5,72.1,71.8,71.2,70.9,70.8,70.1,69.7,69.5,68.5,62.6,62.6,62.0,62.0,61.7,53.3,40.8,37.1,35.0,30.0,29.7,26.4,25.0,24.1,23.9,17.0 HRMS:C55
H87
N3
O35
Na[M+Na]+
計算值:1372.5018;實驗值:1372.5016。
如下製備醣共軛連結物:
將BSA、DT-CRM197、及破傷風類毒素(Adimmune,Taiwan)溶於100mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.2)中(~5mg/ml),並在該溶液中加入30至40當量之Globo H半酯35
。在室溫下溫和攪拌該混合物24小時。接著以去離子水稀釋該混合物,並對去離子水進行5次更換之透析。接著將該溶液凍乾成為白色粉末。以MALDI-TOF分析定性取得之Globo H-蛋白共軛連結物,以測定醣納入率。產生13、14、
及15
。41(GH-BSA)
,MALDI-TOF發現76029、42(GH-DT-CRM197)
發現62138、43(GH-TT)
發現162902、44(GH-BaMV)
並未測定。
以ddH2
O重構醣共軛連結物41、42、43
及原始載體蛋白(~1μg/μL)。以乙腈及去離子水1:1新鮮製備基質芥子酸,以產生包括0.1% TFA之10mg/mL終基質濃度。溫和加樣並混合基質溶液及醣共軛連結物,接著風乾試驗盤。在測量前須使用牛血清白蛋白進行校正。在線性正離子模式下偵測各個醣共軛連結物及原始載體蛋白樣本。使用平均分子量可計算出載體蛋白上之平均醣納入數目。
以機器針(SMP3,TeleChem International Inc.,USA),將~0.7nL之溶於壓印緩衝液(含0.005% Tween-20之300mM磷酸緩衝液,pH 8.5)中的各種濃度之含胺聚醣,自96孔沈積至塗覆NHS之玻璃玻片上,以印製微陣列(BioDot,Cartesian Technologies,USA)。分別以50μM之九種Globo H類似物(SSEA-4、GH、Gb5、Gb4、Gb3、Gb2、BB4、BB3、及BB2),對各個微陣列玻片進行點漬(12重複)。使經印製之玻片在80%溼度之大氣中反應一小時,接著隔夜乾燥。將該等玻片在使用前貯存於室溫下之乾燥器中。
以3% BSA/PBS緩衝液(pH 7.4)中之0.05% Tween 20對小鼠血清進行1:60之稀釋以作為初步篩選。以50mM之乙醇胺對聚醣微陣列進行阻斷1小時,並在使用前以ddH2
O及PBS緩衝液清洗兩次。接著將該等血清稀釋物引入Globo H微陣列中,並在室溫下共置1小時。分別以PBST(PBS緩衝液中之0.05% Tween-20)及PBS緩衝液進一步清洗該等微陣列玻片三次。下一步,在該等微陣列玻片中加入Cy3-affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)、IgG1、IgG2a或抗小鼠IgM,並接著密封以在室溫下進行1小時之共置。最後,以PBST、PBS、及ddH2
O之順序清洗該等玻片三次。乾燥該等微陣列玻片,接著以微陣列螢光晶片視讀器(Genepix 4000B),在532nm進行掃描。以軟體GenePix Pro 6.0(Axon Instruments,Union City,CA,USA)分析數據。為取得精確之測量,將光電倍增管增益值(PMT Gain)調整至400避免螢光飽和。自各個聚醣點之信號中減去局部背景值。略去具有明顯缺點或無可偵測信號之點。最終之螢光強度定義為重複實驗點之「F532nm-B532nm之中數」的平均值。
在4℃下,將100μl碳酸氫鈉緩衝液(pH 10)中之0.2μgGlobo-H神經醯胺塗覆於96-孔盤(NUNC)中隔夜。以PBS清洗,並以3%胎牛血清白蛋白在室溫下進行阻斷30分鐘。在各孔中加入小鼠血清之系列稀釋物,並在室溫下共置1小時,接著以DPBST(Dulbecco磷酸緩衝鹽水,0.05% Tween20)清洗。加入山羊抗小鼠IgG-AP(1:200,Southern Biotech.,USA),並在室溫下共置45分鐘。以PBST清洗試驗盤五次,接著在37℃下與鹼性磷酸酶受質對-硝基苯磷酸(Sigma)進行共置8分鐘。在共置之後,加入3M NaOH溶液以中止反應,並在ELISA視讀器(SpectraMax,Molecular Devices)上,以405nm分析試驗盤。效價係定義為產生大於0.1之光學密度的最高稀釋度。
(1)針對三隻小鼠之組別(6週齡母C57BL/6小鼠,BioLASCO,台灣),在有或無醣脂質佐劑C1或7DW8-5之情形下,分別將GH-KLH(Optimer Inc.)、GH-BSA、GH-TT、GH-CRM197、及GH-BaMV,經由皮下投予至腹部區域,以每週之間隔投予三次。各次疫苗接種含有1μg之Globo H以及有或無2μg之醣脂質佐劑。控制組小鼠僅注射磷酸緩衝鹽水(PBS)。在第一次免疫(免疫前)及第三次免疫10天後對小鼠進行取血。(2)針對三隻小鼠之組別(8週齡母Balb/c小鼠,BioLASCO,台灣),在有或無C1、C23、或7DW8-5之情形下,分別將GH-BaMV或GH-CRM197,以兩週之間隔經由肌內免疫三次。各次疫苗接種含有1.6μg之Globo H以及有或無2μg之佐劑。控制組小鼠係注射磷酸緩衝鹽水(PBS)。在免疫前及各次免疫2週後對小鼠進行取血。(3)針對三隻小鼠之組別(8週齡母Balb/c小鼠,BioLASCO,台灣),在有或無佐劑C1、C17、7DW8-5、C30、AlPO4
、MF59(1:1混合物)之情形下,如(2)所述進行免疫。在4000g下離心10分鐘取得血清。以聚醣微陣列分析血清學反應或與習知之ELISA分析比較。
(1)對五群經免疫之母Balb/c小鼠(分別為PBS,單獨或結合C1、C23、及7DW8-5之GH-CRM197),在最終之免疫接種8週後,由皮下注射2 x 105
個轉移性小鼠乳腺腫瘤細胞系4T1(於無菌PBS中)。(2)對七群經免疫之母Balb/c小鼠(分別為單獨或結合C1、C17、8-5、C30、AlPO4
、及MF59之GH-KLH),在最終之免疫接種6週後,由皮下注射2 x 105
個轉移性小鼠乳腺腫瘤細胞系4T1(於無菌PBS中)。在腫瘤異種移植之前及之後監測小鼠抗Globo H血清。每週以Vernier卡尺測量小鼠腫瘤尺寸三次,並將其定義為(長度x高度x寬度)/2(mm3
)。
由已在三軍總醫院(台北,台灣)進行初次手術之病患取得人類乳癌樣本。將樣本完全編碼以保護病患之隱私權,並將其以中央研究院醫學研究倫理委員會(台北,台灣)所核准之操作流程使用。將腫瘤樣本切片為1mm2
之正方形片段,再使其於含有膠原酶(1,000U/ml)、玻尿酸酶(300U/ml)、及DNase I(100μg/ml)之RPMI1640培養基中,在37℃下共置2小時,而對其進行酶切消化。過濾通過100-μm細胞濾器(BD Biosciences)而收集原始乳癌細胞,並再懸浮於添加5% FBS之RPMI1640培養基中。
將原始乳癌細胞製成含有2% FBS及0.1% NaN3
之PBS中的1×105
個細胞。以抗CD24-PE、抗CD44-APC、及抗CD45-PerCP-Cy5.5之抗體混合物(各1μl)標記細胞。以共軛連結Alexa488之單株抗Globo H抗體(VK-9)染色以偵測Globo H之表現。在FACSCanto流式細胞計數器(Becton Dickinson)上進行分析。BCSCs係定義為CD45-
/CD24-
/CD44+
細胞,而非BCSCs則定義為該CD45-
細胞之其餘族群。在經區隔的進一步分析Globo H之表現。
將移植進入小鼠體內之由人類乳癌取得的細胞,以抗CD24-PE、抗CD44-APC、及抗H2Kd
-FITC之抗體混合物(BD Biosciences)染色。在FACSAria細胞分選器(Becton Dickinson)上進行經抗體標記細胞之螢光活化細胞分選。將H2Kd-
/CD24-
/CD44+
細胞分選為BCSCs;而其他之H2Kd-
族群則分選為非BCSCs。BCSCs及非BCSCs之典型純度分別為>85%及>90%。
針對SSEA-4在正常組織上之表現,使用含有20種不同器官之組織微陣列玻片(Biomax),其中各器官係衍生自五名個體。在56℃下隔夜乾燥玻片,再根據標準之組織病理學流程進行復水,接著再以AR-10溶液pH 9.0(BioGenex Laboratories)進行抗原修復。使用抗SSEA-4抗體(eBioscience)測定SSEA-4之表現。使用抗大鼠IgM作為次級抗體偵測SSEA-4之染色,並以DAB受質顯色。以蘇木精對玻片進行對比染色。將原始乳癌BC0145及來自NOD/SCID小鼠之腫瘤異種移植物固定在10%磷酸緩衝福馬林中,並包埋於石蠟中。以2μM之厚度切割石蠟切片,置於SuperFrost Plus顯微檢驗玻片上(Menzel-Glser),再在55℃下隔夜乾燥。在二甲苯中對該等切片進行脫蠟,再根據標準之組織病理學流程進行復水,接著以蘇木精及曙紅(H&E)染色。在進行免疫染色前,首先將該等玻片置於10mmol/L檸檬酸緩衝液(pH 6.0)中並微波15分鐘。接著使該等玻片與抗ER或抗PR抗體隔夜共置。以超敏聚合物-HRP IHC偵測系統(Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System)(BioGenex)進行免疫偵測。
本申請案中所引述之所有刊物及專利文件皆為所有目的而以其全文併入作為參考,其範圍如同各刊物或專利文件皆特定及個別標記併入作為參考。
儘管前文之發明已以說明及實例之方式,為明確明瞭之目的而以部分細節敘述,熟習技藝者將可輕易明瞭,根據本發明之教示,可對其進行變化及修飾而不偏離附呈申請專利範圍之精神或範圍。
為符合37 C.F.R. §1.72(b)之規定提供發明摘要,以使讀者可快速確認本發明技術揭示之性質及要旨。茲明瞭發明摘要之提呈並不會用於解釋或限制申請專利範圍之範圍或意義。
下列之圖式形成本說明書之一部份,且其係作為進一步說明本揭示內容之部分態樣,該等態樣所述之發明可在參照一或多張圖式並結合本文所呈現之特定具體實例的詳細說明時而更為明瞭。本專利或專利申請檔案含有至少一張以彩色製成之圖式。本專利或專利申請公開案(含彩色圖式)之影本將依請求及繳付必要費用後由智財局提供。
圖1顯示Globo H及切截衍生物之結構。
圖2A-2C分別顯示單株抗體VK9及Mbr1(針對Globo H)及抗SSEA-3之結合特異性。
圖3A-3B顯示經各種Globo H共軛連結物及α-GalCer進行疫苗接種之小鼠的血清反應。對三隻C57BL/6小鼠之組別,在有或無2μg醣脂質之情形下,以1μg之醣共軛連結物,由s.c.進行疫苗接種。將小鼠血清分別稀釋1:60及1:240以進行IgM(圖3A
)及IgG(圖3B
)抗體分析。在532nm,PMT 500下,使用Cy3-抗小鼠IgG或IgM次級抗體進行螢光偵測。數據係以三隻小鼠之平均螢光強度±SEM表示。
圖4顯示α-GalCer及類似物之結構。
圖5顯示經Globo H共軛連結物及α-GalCer衍生物進行疫苗接種之小鼠的IgM含量。收集小鼠血清,並在第二及第三次疫苗接種後進行分析,如其所示。在532nm,PMT 400下,使用Cy3次級抗小鼠IgM進行偵測。結果係以三隻小鼠之平均螢光強度±SEM表示。
圖6顯示疫苗接種後小鼠多株抗體(抗Globo H、抗Gb5、抗SSEA-4、及抗Gb4)之良好特異性。在有或無2μg醣佐劑之情形下,以1.6μg GH-DT,進行第三次疫苗接種兩週後取得小鼠血清(母鼠,Balb/c,i.m.)。以聚醣微陣列分析IgG效價,並將其定義為產生大於1000之MFI(背景值之10倍),PMT 400的最高稀釋度。各點代表個別小鼠效價。
圖7顯示Globo H-DT與不同佐劑所產生之IgM對IgG抗體效價。
圖8顯示針對佐劑對於GH-KLH疫苗之活性的評估。對母Balb/c小鼠,以1.6μg GH-KLH與2μg所示佐劑由i.m.進行疫苗接種,並在疫苗接種後每兩週取血一次。稀釋血清,並將其引入微陣列分析。
圖9顯示免疫後之抗體同種型內容剖析。如所述對小鼠進行疫苗接種。將血清(1:60稀釋物)引入微陣列以進行抗體亞群分析(532nm,PMT 300)。數據係以三隻小鼠之平均螢光±SEM表示。
圖10顯示由SSEA-3-DT或SSEA-4-DT與不同類型醣脂質佐劑所誘發之IgM對IgG抗體效價。
圖11顯示細胞表面24種聚醣之結構。
圖12A-12C顯示針對不同疫苗所誘發之IgG的交叉反應性研究。圖12A:由Globo H-DT與C1佐劑所誘發之抗Globo H IgG;圖12B:由Gb5-DT與C1佐劑所誘發之抗Gb5 IgG;圖12C:由SSEA-4-DT與C1佐劑所誘發之抗SSEA-4 IgG。
圖13顯示小鼠異種移植模式。在無菌PBS中製備2 x 105
個4T1小鼠轉移性乳腺種瘤細胞,並由皮下注射以對Balb/c小鼠進行疫苗接種。以Vernier卡尺測量小鼠腫瘤尺寸,並將其定義為(長度x高度x寬度)/2(mm3
)。
圖14顯示合成Globo H半酯及醣共軛連結物之流程。
圖15顯示對於原始乳癌幹細胞中SSEA-4表現之流式細胞計數分析。以四色免疫螢光染色及後續之流式細胞計數分析,對BCSCs及非BCSCs表面之SSEA-4表現。BCSCs係定義為CD45-
/CD24-
/CD44+
細胞,而非BCSCs則定義為該CD45-
細胞之其餘族群,如左欄所示。BCSCs及非BCSCs表面之目標抗原表現分別示於中及右欄。虛線代表同種型控制組,而數字代表陽性細胞之百分比。
圖16顯示正常組織中SSEA-4之侷限表現。使用正常組織陣列之免疫組織化學染色,檢驗***、小腸、及直腸中之SSEA-4表現。SSEA-4之陽性染色侷限在上皮細胞之頂表面。
Claims (34)
- 一種免疫原性組合物,其包含:(a)聚醣,其基本上由Globo H或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及(b)包含C34之佐劑,該C34具有下式之結構:
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其中該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其中該連接子係對-硝基苯基連接子。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其中該連接子係對-硝基苯基,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其中該免疫反應較佳係導向IgG同種型抗體之生成。
- 根據請求項5之免疫原性組合物,其中該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其包含至少一種可誘發體液及細胞免疫反應之佐劑。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其中由該免疫反應所產生之抗體可中和表現於癌細胞或癌幹細胞上之抗原。
- 根據請求項8之免疫原性組合物,其中由該免疫反應所產生之抗體可中和抗原Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種。
- 根據請求項9之免疫原性組合物,其中該可中和抗原Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種的抗體包含相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體。
- 根據請求項9之免疫原性組合物,其中該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項1之免疫原性組合物,其尚包含一種可在對象體內誘發抗癌免疫反應之癌症疫苗組合物。
- 根據請求項12之癌症疫苗,其中該癌症疫苗適用於治療選自由下列者所組成之群的癌症:乳癌、肺癌、肝癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤、***癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、及膀胱癌。
- 根據請求項13之癌症疫苗,其中該癌症之腫瘤細胞表面具有Globo H抗原。
- 根據請求項13之癌症疫苗,其中該癌症疫苗中之Globo H抗原係表現在乳癌腫瘤之上皮細胞上。
- 根據請求項12之癌症疫苗,其中由該免疫反應所產生之抗體可中和抗原Globo H、Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種。
- 根據請求項12之癌症疫苗,其中該等抗原Globo H、 Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種係表現在乳癌幹細胞上。
- 一種癌症疫苗,其包含:(a)免疫原性組合物,該組合物包含:聚醣,其基本上由Globo H或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及包含C34之佐劑,其中該免疫原性組合物可誘發一免疫反應,該反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體;以及(b)一醫藥可接受之賦形劑。
- 根據請求項18之癌症疫苗,其中在該免疫原性組合物中,該連接子係對-硝苯酚,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項19之癌症疫苗,其中該癌症係乳癌,且該癌症疫苗中之Globo H抗原係表現在乳癌腫瘤之上皮細胞上。
- 根據請求項19之癌症疫苗,其中由該免疫反應所產生之抗體可中和抗原Globo H、Gb4、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種。
- 根據請求項19之癌症疫苗,其中該癌症係乳癌,且其中該等抗原Globo H、階段特異性胚胎抗原-3(SSEA-3)、及階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)中之至少一種係表現在乳癌幹細胞上。
- 一種免疫原性組合物,其包含:(a)聚醣,其基本上由Globo H-相關性聚醣或其免疫原性片段組成,其中該聚醣係經由連接子而與載體蛋白共軛連結;及(b)包含C34之佐劑,其中該Globo H-相關性聚醣係選自由SSEA-3及SSEA-4所組成之群,且其中該免疫原性組合物可誘發 免疫反應,該免疫反應可誘發相較於IgM同種型抗體之較高相對含量的IgG同種型抗體。
- 根據請求項23之免疫原性組合物,其中該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 根據請求項23之免疫原性組合物,其中該連接子係對-硝基苯基連接子。
- 根據請求項23之免疫原性組合物,其中該連接子係對-硝基苯基,該載體蛋白係白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)。
- 一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之抗原,其中該抗原係由Globo H或其免疫原性片段組成;及包含C34之佐劑。
- 根據請求項27之治療劑,其中該治療劑投予至對象可誘發抗體生成,該等抗體可辨識表現在乳癌幹細胞(BCSC)上之抗原。
- 根據請求項27之治療劑,其中該抗原係選自由Globo H、SSEA-3、及SSEA-4所組成之群。
- 一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之SSEA-3;及包含C34之佐劑。
- 根據請求項30之治療劑,其中該治療劑投予至對象可誘發抗體生成,該等抗體可辨識表現在乳癌幹細胞(BCSC)上之抗原。
- 根據請求項31之治療劑,其中該抗原係選自由Globo H、SSEA-3、及SSEA-4所組成之群。
- 一種對抗乳癌幹細胞之治療劑,該治療劑包含:經由對-硝基苯基連接子而與白喉毒素交叉反應性材料197(DT-CRM197)載體蛋白共軛連結之SSEA-4;及包含C34之佐劑。
- 根據請求項33之治療劑,其中該治療劑投予至對象可誘發抗體生成,該等抗體可辨識表現在乳癌幹細胞(BCSC)上之抗原SSEA-4或其切截結構。
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