TWI381163B

TWI381163B - 正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法

Info

Publication number: TWI381163B
Application number: TW098130484A
Authority: TW
Inventors: Andrew M Wo; yu cheng Pan; Ken Chao Chen; Chen Lin Chen
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2013-01-01
Also published as: US20110059500A1; TW201109659A; US8535541B2

Description

正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法

本發明係關於一種細胞分離之設計，特別是關於一種正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法。

癌細胞或者存在於體液的稀有細胞的檢測及定量是作為臨床診斷、徵侯和生物醫學研究的潛在指標。例如，在轉移性癌症患者的血液有稀少的循環的腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，CTC)，可藉由檢測觀察其數量的消長來輔助治療。為了檢測及定量存在流體內的這些稀有細胞，需將這些稀有細胞分離出來，細胞分離技術因此而出現。

目前的細胞分離技術有很多種，主要包括有流式細胞分離(Fluorescence Activated Cell Separation，FACS)技術、介電泳動(Dielectrophoresis，DEP)細胞分離技術，微米篩(Microfabricated Sieving)之分離技術，磁珠細胞分離(Magnetically Activated Cell Separation，MACS)技術，以及一些應用光學和聲學的技術在內。在這些細胞分離技術中，尤其以流式細胞分離技術和磁珠細胞分離技術最常被使用。

雖然流式細胞分離技術常被使用，但是此項技術需要有相當高的花費、難以消毒、並且需要大量取樣。與流式細胞分離技術不同，利用磁珠細胞分離技術能在較短時間內獲得大多數的目標細胞，並且減少分析時的取樣需求，但如果想要在顯微鏡裡觀察這些細胞，則必需將細胞移轉(Transfer)到載片或觀察平台上，然而在移轉的過程中往往會導致極高的細胞損失(Cell Loss)。

美國專利第5,565,105號專利案，其係揭櫫一種磁場離心方法。其將帶電分子承置於一旋轉片中，並在旋轉片上施加一垂直於旋轉片之磁場，當旋轉片旋轉時，帶動旋轉片中之帶電分子於磁場中運動，使帶電分子受到勞倫茲力(Lorentz Force)的影響，與不帶電的分子分離。

美國專利第6,723,510號專利案，其係揭櫫一種具有較少損失的微粒分離方法。其利用一種含有基質微珠(Matrix Bead)的除質樣本液(Detergent)，與含有標的微粒的樣本進行結合，以在分離過程中減少標的微粒的損失。

習知的分離技術在分離的效果上有其限制，以及在分離時需花較長的時間，並在分離檢測上之靈敏度有所限制，分離效果不佳，以及在分離後無法直接觀察，導致在移轉到載片或觀察平台的過程造成極高的細胞損失。

緣此，本發明之目的即是提供一種正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，用以從一流體樣本中，將標的微粒分離出來。

本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係在一載板上形成有至少一組流道結構，每一組流道結構包括一內貯置槽、一外貯置槽及至少一條連通於內貯置槽及外貯置槽之間之微流道。然後將流體樣本中之標的微粒以免疫磁珠標定後，將流體樣本注入內貯置槽，並施加一磁性吸附力及施加一驅動力以一預定之驅動強度調變模式驅動流體樣本流動，將未標定有免疫磁珠之非標的微粒隨流體樣本經由微流道導流，分離至外貯置槽，而磁性吸附力則將標定有免疫磁珠之標的微粒吸附留置於內貯置槽中。

在本發明之較佳實施例中，磁性吸附力除了涵蓋內貯置槽，更涵蓋微流道，以將標定有免疫磁珠之標的微粒吸附留置於內貯置槽及微流道中。驅動強度調變模式包括先以一具有第一驅動強度之驅動力驅動流體樣本流動，再以至少一具有強於第一驅動強度之第二驅動強度之驅動力驅動流體樣本流動。亦可改以第一驅動強度之驅動力驅動流體樣本流動，將流體樣本中未標定有免疫磁珠之非標的微粒與標定有免疫磁珠之標的微粒初步分離，再以第二驅動強度之驅動力驅動流體樣本流動，將未標定有免疫磁珠之非標的微粒隨該流體樣本經由微流道導流，分離至外貯置槽。其中，驅動力係為離心力、壓力及界面力之一。

在分離標的微粒與非標的微粒後，更包括觀察標定有免疫磁珠之標的微粒，以及將內貯置槽之至少一部分區域連同標定有免疫磁珠之標的微粒從載板切離。

經由本發明所採用之技術手段，可以使得從含有標的微粒及非標的微粒之流體樣本中，將標的微粒分離出來。配合本發明之方法所使用之平台結構，其製造方法簡單、材料單純易取得，具有低成本製造的優勢。

再者，本發明的正篩選方式，不需考慮流體樣本的複雜性，不論流體樣本中含有多少種類的微粒，係直接以特定之免疫磁珠將標的微粒予以標定，分離時非標的微粒及流體樣本皆會分離至外貯置槽，而直接得到標的微粒。故在執行上更為直覺，且分離效果更好，不僅適用於少數種類的微粒分離，更適用於實際應用時，從含有多種微粒的複雜流體樣本中篩選出標的微粒。

再者，本發明在分離配合驅動強度調變設計，可達更好之分離效果。另外在觀察時可直接於載板上觀察標的微粒，不需另外移轉到載片或觀察平台上，有較低的細胞損失。後續處理時只需對載板進行裁切，便能快速且方便地回收標的微粒，利於後續細胞培養、實驗所需。

本發明所採用的具體實施例，將藉由以下之實施例及附呈圖式作進一步之說明。

參閱第1圖所示，其係顯示本發明分離微粒所使用之分離平台100，係於一載板1上形成有至少一組流道結構2，載板1之上方配置有一磁吸單元3，底部則連接有一旋轉驅動裝置4，用以驅動載板1旋轉。

參閱第2圖所示，其係顯示載板之立體分解圖。載板1具有一幾何中心11及一外環緣12，且在其幾何中心11開設有一中心開口13，此中心開口13對應結合於旋轉驅動裝置4之轉軸41。載板1在本實施例中係為三層式的結構，由下而上依序包括有一基板14、一流道結構層15及一罩覆層16。

流道結構2形成於載板1之流道結構層15，基板14及流道結構層15係採用壓克力樹脂(PMMA)材料所製成，而罩覆層16採用為透明薄膜材料。利用CO₂ 雷射於流道結構層15雕刻形成流道結構2後，將流道結構層15結合於基板14之上，再施加以罩覆層16於流道結構層15上，將流道結構2予以密封。此種方式在製造上簡單，且材料便宜，具有低成本製造的優勢。

當然，流道結構層15亦同樣可為多層結構，利用多層板疊合加工而成。載板1整體亦可為單層結構，其可使用各種適合加工的材料，不限於壓克力樹脂，流道結構2也可利用其它種雷射雕刻方式，或是以CNC加工、微製程、射出成型等方式製成。

參閱第3圖，其係顯示載板之局部上視圖。載板1上形成有四組流道結構2，每一組流道結構2包括有一內貯置槽21、複數條微流道22、一外貯置槽23，係沿載板1之幾何中心11向外環緣12一一配置。

內貯置槽21具有一內緣211及一外緣212，其內緣211鄰近於載板1之幾何中心11，其外緣212與複數條微流道22相連通，且在內貯置槽21之內緣211朝載板1之幾何中心11開設有一流體入口213。

外貯置槽23亦具有一內緣231及一外緣232，其內緣231與複數條微流道22相連通，其外緣232鄰近於載板1之外環緣12。

參閱第4圖所示，其係顯示本發明第一實施例之流程圖，並同時配合前述第1圖至第3圖，以及第5圖至第9圖對本發明第一實施例作一說明如下。

首先，於一含有標的微粒M及非標的微粒J之流體樣本5中，以一具有一選定鍵結分子P之免疫磁珠C將標的微粒M予以標定(步驟101)。在本實施例中，流體樣本5中含有二種微粒，非標的微粒J是Jurkat細胞，為一種人類淋巴癌細胞；標的微粒M是MCF7細胞，為一種人類乳腺癌細胞。其中MCF7細胞可與PE分子相鍵結，故選定PE分子作為鍵結分子P將標的微粒M標定免疫磁珠C。

如第5圖所示，在對標的微粒M標定免疫磁珠C後，將流體樣本5自流體入口213注入內貯置槽21(步驟102)。接著，如第6圖所示，將磁吸單元3設置在載板1上鄰近於內貯置槽21之位置，以施加一涵蓋內貯置槽21且具有預定強度分布之磁性吸附力Fb(步驟103)。

磁吸單元3可採用單一或多個磁鐵排列組成，本實施例中採用複數個同心設置之磁鐵環，來產生一具有高梯度分布之磁場(High Magnetic Gradient)之磁力Fb。一般而言，由於磁鐵在邊緣區域所提供的磁力較強，中央區域的磁力則較弱，故藉由多個磁鐵的設計可產生較多的邊緣區域，以具有高梯度分布之磁場之磁力，提供較佳的磁力吸附效果。

之後，施加一驅動力以一預定之驅動強度調變模式驅動流體樣本5流動(步驟104)。在本實施例中，驅動力為旋轉驅動裝置4驅動載板1旋轉所產生的離心力，藉離心力使流體樣本5流動。實際應用時，亦可採用壓力或界面力，例如以壓力幫浦施加壓力使流體樣本5流動，或是利用毛細作用的界面力使流體樣本5流動。

參閱第7圖及第8圖所示，驅動強度調變模式包括先以一具有較弱的第一驅動強度之驅動力Fc1驅動流體樣本5流動(步驟104a)，再以至少一具有強於第一驅動強度之第二驅動強度之驅動力Fc2驅動流體樣本5流動(步驟104b)。即是利用從低轉速至高轉速驅動載板1旋轉產生驅動力(離心力)Fc1、Fc2，使流體樣本5流動。

藉由所施加之驅動力Fc1、Fc2，將未標定有免疫磁珠C之微粒J隨流體樣本5經由微流道22導流，分離至外貯置槽23(步驟105)。並且，藉由磁吸單元3所施加之磁性吸附力Fb，將標定有免疫磁珠C之標的微粒M吸附留置於內貯置槽21中(步驟106)，將標的微粒M從流體樣本5中篩選出來。

參閱第9圖，在篩選出標的微粒M後，即得以藉由觀察儀器6(例如：顯微鏡)觀察內貯置槽21中標定有免疫磁珠C之標的微粒M(步驟107)，以及進行其它後續處理。在本實施例中，觀察內貯置槽21中標定有免疫磁珠C之標的微粒M時，係倒置載板1，將磁吸單元3移開，自載板1之頂面透過罩覆層16觀察。若不倒置載板1，當磁吸單元3移開後，標定有免疫磁珠C之標的微粒M會落下到載板1底部，造成難以觀察。另外若需要回收標的微粒M，可在對應內貯置槽21之位置於罩覆層16上預留切裁線24，以將載板1之至少一部分區域連同標定有免疫磁珠C之標的微粒M從載板1切離(步驟108)，藉此快速地回收內貯置槽21中之標的微粒M，利於後續細胞培養、實驗......等各種需求之用。

參閱第10圖所示，其係顯示本發明第二實施例之流程圖，此一實施例之操作流程與前述第一實施例相似，故相同之步驟乃標示以相同之編號。其差異在於施加驅動力時，係以具有第一驅動強度之驅動力Fc1驅動流體樣本5流動，將流體樣本5中未標定有免疫磁珠C之非標的微粒J與標定有免疫磁珠C之標的微粒M初步分離(步驟104c)。初步分離即是以較低的第一旋轉速度驅動載板1，因載板1旋轉所產生之離心力Fc1較低，可避免標的微粒M直接流至外貯置槽23，同時防止標的微粒M被破壞。

之後再以具有第二驅動強度之驅動力Fc2驅動流體樣本5流動，將未標定有免疫磁珠C之非標的微粒J隨流體樣本5經由微流道22導流，分離至外貯置槽23(步驟105a)。因第二驅動強度之驅動力Fc2的強度較強(較大離心力)，故藉以將殘餘在內貯置槽21中之流體樣本5及未標定有免疫磁珠C之非標的微粒J排至外貯置槽23。

參閱第11圖所示，本發明分離微粒所使用的另一載板1a，在載板1a上形成有至少一組流道結構2a。每一組流道結構2a包括有一內貯置槽21a、一條微流道22a、一外貯置槽23a。微流道22a連通於內貯置槽21a及外貯置槽23a之間，為連續彎道結構，其優點在於能在有限的空間中，擁有較長的流道長度。

參閱第12圖及第13圖所示，微流道22a中形成有複數個凸結構221a及凹結構221b，用以加強流體擾動，流體樣本5在微流道22a中流動時，易沉在下層的微粒更容易往上方移轉，便於以磁性吸附力補捉。微流道22a上方配置有一磁吸單元3a，其產生之磁性吸附力Fb’含蓋內貯置槽21a及微流道22a。

參閱第14圖所示，其係顯示本發明第三實施例之流程圖，並同時配合前述第11圖至第13圖作一說明如下。此一實施例之操作流程與前述第一實施例相似，故相同之步驟乃標示以相同之編號。其差異在於，施加磁性吸附力時，係施加一涵蓋內貯置槽21a及微流道22a且具有預定強度分布之磁性吸附力Fb’(步驟103a)，配合微流道22a的凸結構221a及凹結構221b設計，達到良好的補捉效果。在本實施例中，所施加的驅動力Fp為壓力，用壓力使流體樣本流向外貯置槽23a。當然，也可以使用離心力或界面力作為驅動力，驅動流體樣本流動，再由磁性吸附力Fb’將標定有免疫磁珠C之標的微粒M吸附留置於內貯置槽21a及微流道22a中(步驟106a)。

由以上之實施例可知，本發明所提供之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法確具產業上之利用價值，故本發明業已符合於專利之要件。惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之發明精神及以下所界定之專利範圍中。

100．．．分離平台

1、1a．．．載板

11．．．幾何中心

12．．．外環緣

13．．．中心開口

14．．．基板

15．．．流道結構層

16．．．罩覆層

2、2a．．．流道結構

21、21a．．．內貯置槽

211．．．內緣

212．．．外緣

213．．．流體入口

22、22a．．．微流道

221a．．．凸結構

221b．．．凹結構

23、23a．．．外貯置槽

231．．．內緣

232．．．外緣

24．．．切裁線

3、3a．．．磁吸單元

4．．．旋轉驅動裝置

41．．．轉軸

5．．．流體樣本

6．．．觀察儀器

C．．．免疫磁珠

Fb、Fb’．．．磁性吸附力

Fc1、Fc2．．．驅動力

Fp．．．驅動力

J．．．非標的微粒

M．．．標的微粒

P．．．鍵結分子

第1圖係顯示本發明分離微粒所使用之分離平台之立體圖；

第2圖係顯示載板之立體分解圖；

第3圖係顯示載板之局部上視圖；

第4圖係顯示本發明第一實施例之流程圖；

第5圖係顯示流體樣本注入內貯置槽之示意圖；

第6圖係顯示施加磁性吸附力之示意圖；

第7圖係顯示施加第一驅動強度驅動力之示意圖；

第8圖係顯示施加第二驅動強度驅動力之示意圖；

第9圖係顯示觀察標的微粒之示意圖；

第10圖係顯示本發明第二實施例之流程圖；

第11圖係顯示另一載板之局部上視圖；

第12圖係顯示另一微流道之立體圖；

第13圖係顯示另一微流道之剖視圖；

第14圖係顯示本發明第三實施例之流程圖。

Claims

一種正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，在一載板上形成有至少一組流道結構，該每一組流道結構包括具有至少一流體入口之內貯置槽、一鄰近配置於該內貯置槽之一外貯置槽及至少一條連通於該內貯置槽及該外貯置槽之間之微流道，該方法包括下列步驟：(a)於一含有標的微粒及非標的微粒之流體樣本中，以一具有一選定鍵結分子之免疫磁珠將該標的微粒予以標定；(b)將該流體樣本自該流體入口注入該內貯置槽；(c)施加一涵蓋該內貯置槽且具有預定強度分布之磁性吸附力；(d)以一具有第一驅動強度之驅動力驅動該流體樣本流動，將該流體樣本中未標定有免疫磁珠之非標的微粒與標定有免疫磁珠之標的微粒初步分離，藉由該磁性吸附力將該標定有免疫磁珠之標的微粒吸附留置於該內貯置槽中；(e)以至少一具有第二驅動強度之驅動力驅動該流體樣本流動，將該未標定有免疫磁珠之非標的微粒隨該流體樣本經由該微流道導流，分離至該外貯置槽。
如申請專利範圍第1項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(c)中，該磁性吸附力更涵蓋該微流道，步驟(d)中，該標定有免疫磁珠之標的微粒更被吸附留置於該微流道中。
如申請專利範圍第1項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(d)及步驟(e)中，該驅動力係為離心力、壓力及界面力之一。
如申請專利範圍第1項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(e)之後，更包括觀察該標定有免疫磁珠之標的微粒之步驟。
如申請專利範圍第1項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(e)之後，更包括將該載板之至少一部分區域連同該標定有免疫磁珠之標的微粒從該載板切離。
一種正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，在一載板上形成有至少一組流道結構，該每一組流道結構包括具有至少一流體入口之內貯置槽、一鄰近配置於該內貯置槽之一外貯置槽及至少一條連通於該內貯置槽及該外貯置槽之間之微流道，該方法包括下列步驟：(a)於一含有標的微粒及非標的微粒之流體樣本中，以一具有一選定鍵結分子之免疫磁珠將該標的微粒予以標定；(b)將該流體樣本自該流體入口注入該內貯置槽；(c)施加一涵蓋該內貯置槽且具有預定強度分布之磁性吸附力；(d)以一具有第一驅動強度之驅動力驅動該流體樣本流動，將該流體樣本中未標定有免疫磁珠之非標的微粒與標定有免疫磁珠之標的微粒初步分離；(e)以至少一具有第二驅動強度之驅動力驅動該流體樣本流動，將該未標定有免疫磁珠之非標的微粒隨該流體樣本經由該微流道導流，分離至該外貯置槽；(f)將該載板倒置，自該載板之頂面觀察該標定有免疫磁珠之標的微粒。
如申請專利範圍第6項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(c)中，該磁性吸附力更涵蓋該微流道，步驟(f)中，該標定有免疫磁珠之標的微粒更被吸附留置於該微流道中。
如申請專利範圍第6項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(d)及步驟(e)中，該驅動力係為離心力、壓力及界面力之一。
如申請專利範圍第6項所述之正篩選免疫磁珠標定微粒之分離方法，其中步驟(f)之後，更包括將該載板之至少一部分區域連同該標定有免疫磁珠之標的微粒從該載板切離。