TWI363060B - Purification of pegylated polypeptides - Google Patents
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Description
1363060 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 •本發明係屬於可用於分離多肽、尤其聚乙二醇化紅血球 生成素之層析分離方法領域。 【先前技術】 蛋白質在當今醫學業務中具有重要作用。對於人類應 用,各種醫藥蛋白質必須符合不同標準。為保證用於人類 之生物藥劑之安全性,在生產過程期間積累之副產物尤其 必須去除。為滿足質量管理規格標準,在製造過程後必須 實施一或多個純化步驟。在適宜純化方法之確定中,純 度、產量及產率尤其具有重要作用。 不同方法已得到良好發展且廣泛用於蛋白質純化,例如 使用微生物蛋白質之親和層析法(例如蛋白質A或蛋白質G 親和層析法)、離子交換層析法(例如陽離子交換(磺丙基羧 基甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式離子 交換)、嗜硫菌吸附(例如使用冷-巯基乙醇及其他犯配 體)、疏水作用層析或芳香族吸附層析(例如使用苯基瓊脂 糖、氮雜-親芳烴(arenophilic)樹脂、或間-胺基苯基硼 酸)、金屬螯合親和層析法(例如使用Ni(II)·及Cu(II)-親和 性物質)、尺寸排除層析法、及電泳方法(例如凝膠電泳、 毛細管電泳)(Vijayalakshmi,M.A. Appl. Biochem.
Biotech· 75 (1998) 93-102) » 據報導以下物質之間發生接合:例如聚乙二醇(PEG)與 介白素-6之間(歐洲專利第〇 442 724號)、PEG與紅血球生 132511.doc 1363060 成素之間(WO 01/02017)、包含内皮他丁(Endostatin)之嵌 合分子與免疫球蛋白之間(美國專利第2005/008649號)、基 於融合蛋白之分泌抗體之間(美國專利第2002/1473 1 1號)' 包含白蛋白之融合多肽之間(美國專利第2005/0100991號; 人血清白蛋白,美國專利第5,876,969號)、聚乙二醇化多 肽之間(美國專利第2005/01 14037號)、及干擾素融合蛋白 之間。
Necina,R.等人(Biotechnol· Bioeng. 60 (1998) 689-698) 報導藉由表現高電荷密度之離子交換介質直接自細胞培養 物上清液捕獲人單株抗體。在WO 89/05157中報導藉由對 細胞培養基直接實施陽離子交換處理來純化產物免疫球蛋 白之方法。來自小鼠腹水之單株IgG抗體之一步式純化由 Danielsson,A.等人闡述於 J_ Immun. Meth. 1 15 (1988),79-88中。藉由離子交換層析純化多肽之方法報導於WO 2004/024866中,其中使用梯度洗滌來分離目標多肽與一 或多種污染物。在歐洲專利第〇 530 447號中報導藉由三個 層析步驟之組合來純化IgG單株抗體之方法。單-聚乙二醇 化介白素-1受體拮抗劑之便捷純化由Yu,G.等人報導於 Process Biotechnol.42 (2007) 971-977 中。Wang 等人(Wang, Η.等人,Peptides 26 (2005) 1213-1218)報導藉由二步式陽 離子交換層析純化大腸桿菌(E.coli)中所表現之hTFF3。 Yun 等人(Yun,Q.等人,J. Biotechnol. 1 18 (2005) 67-74)報 導藉由兩個連續離子交換層析步驟純化聚乙二醇化rhG-CSF。WO 2007/039436及 WO 01/087329報導共價連接聚 132511.doc 1363060 (乙二醇)基團之紅血球生成素及 液體醫藥組合物。 【發明内容】 本發明包含純化單-聚乙二醇化紅血球生成素之方法, 該方法包含以下步驟:提供包含單…多、及非聚乙二醇 化紅血球生成素之溶液’實施兩個連續陽離子交換層析步 雜’及在第三陽離子交換層析步财时經純化單·聚乙
二醇化红血球生成素’纟中在兩個陽離子交換層析步驟令 使用相同類型之陽離子交換材料。 在方法之-實施例中,兩個連續陽離子交換層析步驟係 使用不同洗脫方法來實施。在另_實施财,兩個連續陽 離子交換層析步驟包含以下步驟:
包含紅血球生成素蛋白之 a) 在適用於使該單·聚乙二醇化紅血球生成素與第—陽 離子交換層析管柱中所含陽離子交換材料結合之條件 下,將包含單-、多_、及非·聚乙二醇化紅血球生成素 之混合物之緩衝水溶液施加至該第一管柱中, b) 藉由步驟洗脫法經由逐步增加流經緩衝液之離子強度 自第一陽離子交換層析管柱回收單·聚乙二醇化紅2 球生成素,其中與步驟a)中所施加之混合物相比該 單-聚乙二醇化紅血球生成素之百分比增加, c) 在適用於使所回收單-聚乙二醇化紅血球生成素與第 二陽離子交換層析管柱中所含陽離子交換材料結合之 條件下,將該單-聚乙二醇化紅血球生成素施加至該 第二管柱中,其中該第二管柱中所含陽離手交換材料 132511.doc 1363060 與第一管柱中之陽離子交換材料係同一類型, d)藉由連續洗脫法經由連續增加流經緩衝液之離子強度 自該第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之 乂純化單_聚乙二醇化紅血球生成素。 在方法之一實施例中,陽離子交換材料係強陽離子交換 材^。在較佳實施例中,強陽離子交換材料料丙基陽離 子又換材料。尤佳者係T〇y〇pearl⑧sp 65〇 Μ。在另一實施 例中,單-聚乙二醇化紅血球生成素係在步驟⑸中以純度高 於95面積_/〇之基本均勻形式回收。在方法之另一實施例 中,方法之步驟b)中離子強度之逐步增加係二步式離子強 度增加。單-聚乙二醇化紅血球生成素較佳係在步驟洗脫 法之第二步驟中回收,即在離子強度第二次增加後回收。 本發明之另一態樣係製造單_聚乙二醇化紅血球生成素 之方法’其包含以下步驟: a) 藉由使用聚乙二醇化試劑來聚乙二醇化紅血球生成 素, b) 用兩個連續陽離子交換層析步驟來純化聚乙二醇化紅 血球生成素,其中第一及第二陽離子交換層析採用相 同類型之陽離子交換材料, c) 自第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之 單-聚乙二醇化紅血球生成素。 【實施方式】 本發明包含純化單-聚乙二醇化紅血球生成素之方法, 該方法包含兩個陽離子交換層析步驟,其中在兩個陽離子 132511,doc 1363060 交換層析步驟中使用相同類型之陽離子交換材料。 本申請案_所用術語"離子交換材料"表示在離子交換層 析中用作固定相之載有共價鍵結荷電取代基之固定高分子 量基質。為達成總電荷中性,非共價鍵結異荷離子與其結 合。"離子交換材料”能使其非共價鍵結異荷離子與周圍溶 液中帶相同電荷之離子交換。端視其可交換異荷離子之電 荷,可將"離子交換樹脂"稱作陽離子交換樹脂或陰離子交 換樹脂。端視荷電基團(取代基)之性質,(例如)在陽離子 交換樹脂情況下可將”離子交換樹脂"稱作磺酸樹脂(s)、或 磺丙基樹脂(SP)、或羧曱基樹脂(CM)。端視荷電基團/取 代基之化學性質,"離子交換樹脂”可另外歸類為強或弱離 子交換樹脂,此取決於共價鍵結荷電取代基之強度。舉例 而言,強陽離子交換樹脂具有磺酸基(磺丙基較佳)作為荷 電取代基,弱陽離子交換樹脂具有羧基(羧曱基較佳)作為 荷電取代基,且弱陰離子交換樹脂具有二乙胺基乙基作為 荷電取代基。 不同類型之離子交換材料,即固定相,可以不同名稱自 多個公司獲得,例如陽離子交換材料Bio-Rex®(例如類型 70)、Chelex®(例如類型 100)、Macro-Prep®(例如類型 CM、High S、25 S)、AG®(例如類型 50W、MP)皆可自 BioRad實驗室獲得、WCX 2可自Ciphergen獲得、Dowex® MAC-3 可自 Dow chemical 公司獲得、Mustang C及 Mustang S可自Pall公司獲得、Cellulose CM(例如類型23、52)、超-D、partisphere可自 Whatman pic.獲得、Amberlite® IRC(例 1325II.doc 10 1363060 如類型 76 、747 、748) 、Amberlite® GT 73 、
Toyopearl®(例如類型 SP、CM、650M)皆可自 Tosoh Bioscience GmbH 獲得、CM 1500 及 CM 3000 可自 BioChrom 實驗室獲得、SP-SepharoseTM、CM-SepharoseTM 可自 GE Healthcare獲得、Poros樹脂可自 PerSeptive Biosystems獲 得、Asahipak ES(例如類型 502C)、CXpak P、IEC CM(例 如類型 825、2825、5025、LG)、IEC SP(例如類型 420N、 825)、IEC QA(例如類型 LG、825)可自 Shoko America公司 獲得、50W陽離子交換樹脂可自Eichrom Technologies公司 獲得。陽離子交換材料較佳係強陽離子交換材料,例如 Macro-Prep® High S 或 25S、或 MacroCap SP、或 Toyopearl® SP 650M、或 Source S、或 SP Sepharose、或 POLYCAT A。實例性陰離子交換材料係可自Dow chemical 公司獲得之Dowex® 1、皆可自BioRad實驗室獲得之 AG®(例如類型 1、2、4)、Bio-Rex® 5、DEAE Bio_Gel 1、 Macro-Prep® DEAE、可自 Eichrom Technologies公司獲得 之陰離子交換樹脂類型1、皆可自GE Healthcare獲得之 Source Q、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose(例如類型 CL-6B、FF) ' Q Sepharose、Capto Q、Capto S、可自 PerkinElmer獲得之 AX-300、皆可自 Shoko America公司獲 得之 Asahipak ES-502C、AXpak WA(例如類型 624、G)、 IEC DEAE、皆可自 Tosoh Bioscience GmbH 獲得之 Amberlite® IRA-96、Toyopearl® DEAE、TSK 凝膠 DEAE、可自Pall公司獲得之Mustang Q。在一實施例中, 132511.doc U63060 陽離子交換材料係續丙基陽離子交換材料。 相同類型之陽離子交換材料"表示所實施 採用相_子交換材料。此意= 二=驟之實施係在第-陽離子交換層析步 中使用%離子交換材料之第一部分 換層析步驟中使用相同陽離子交換材料之第二:交 兩:陽離子交換層析步驟中使用相同陽離子交換封料二
:=中,第二陽離子交換材料與第-陽離子交換射料 係相同類型之陽離子交換材料但陽離子交換材料 比不同。 刀 術語"步驟洗脫"及"步驟洗脫法,,在此申tf案中可互換使 用’其表示其中(例如)可導致洗脫(即自材料溶解出經社人 化合物)之物質濃度立刻升高或降低(即自—數值/濃度隸 變為下一數值/濃度)之方法。在此"步驟洗脫"中,一或多 種條件(例如pH、離子強度、鹽濃度、及/或層析流量)皆自 第一(例如起始)數值立刻變為第二(例如最終)數值,即條 件發生與線性改變相反之遞增式改變(即逐步改變)。在"步 :洗脫法,,中於每次離子強度增加後收集新流份。此流份 S有伴隨相應離子強度增強自離子交換材料回收之化合 物。在每次增強後皆使條件維持至洗脫法中之下一步驟。 在步驟洗脫"中一或多種條件皆自第一(例如起始)數值立 刻變為第二(例如最終)數值。在一實施例中改變係導致洗 脫之物質濃度之1 〇〇/。或更高。在此實施例中,亦即在第一 步驟中導致洗脫之物質濃度為1 〇〇%,在第二步驟中為 132511.doc 12 "Ό^〇6〇 110%或更咼,且在第三步驟中為12〇%或更高。在另一實 施例中改變為導致洗脫之物質濃度之50%或更高。在另一 實施例中改變為導致洗脫之物質濃度之丨20%或更高◊"步 驟洗脫"表示條件發生與線性改變相反之遞增式改變(即逐 步改變)。 術語,’連續洗脫"及”連續洗脫法"在此申請案中可互換使 用’其表示其中(例如)可導致洗脫(即自層析材料溶解出經 結合/吸附化合物)之㈣濃度以連續方式升高或降低(即濃 度係藉由一系列小步驟來改變,每個小步驟之改變不大於 導致洗脫之物質濃度之2%,較佳1%)之方法。在此"連續 洗脫中一或多種條件(例如ΡΗ、離子強度、鹽濃度、及/ 或層析流量)可以線性方式或指數方式或漸近方式來改 變。改變較佳係線性。 用於此中請案t之術語"施加至"及其語法上等效之表
表示純化方法之部分步驟,其令使含有欲純化目標物質 溶液與固以目接觸。此表示a)將溶液添加至固定相戶;Η 於之層析裝置中,或b)將固定相添加至溶液中…丨 ,下,含有欲純化目標物f之溶液流經固以目,使得固; 相與溶液中物質之間可發 率、鹽濃度、溫度、及/二Γ!。4視諸如pH, ^. 及/或"丨l速荨條件,溶液中之某些半 二、固由此自溶液中移除。其他物質保㈣ :二出物中發現保留於溶液中之物質。"流出物 表不〜經層析裝置後所獲得之溶 之所施加溶液,或用於沖洗…道,、了為3有目標物貿 H先讀或導致與固定相結合之一 13251 l.doc •13- 1363060 或多種物質洗脫之緩衝液。在—實施例中,層析裝置係管 柱或切。在純化步驟後可藉由熟習.此項技術者熟知之方 法自溶液回收目標物質,例如沈殿、鹽析、超渡、滲遽、
/東乾、親和㈣、或減少溶劑體積以獲得呈基本均句形式 之目標物質。在b)情況下,期將固定相(例如,呈固體形 式)添加至含有欲純化目標物質之溶液中,此使得固定相 與溶液中之物質之間可發生交互作用。在交互作用後移除 ,定相(例如,藉由過遽0,且目標物質係與固定相結合並 藉此自溶液㈣,或係、未與固^相結合並保留於溶液中。 用於此申請案中之術語"在適宜結合條件下"及其語法上 等效之表述表示目標物質(例如聚乙二醇化紅血球生成素) 在與固定相(例如離子交換材料)接觸時與固定相結合。此 不必表示目標物質之與固m结合,但目標物質之 基本上1 00/❶與固疋相結合,即目標物質之至少與固定 相結合,目標物質之至少75%與固定相結合,目標物質之 至少85%與固定相結合,或目標物質之95%以上與固定相 結合。 此申請案中所用術語”經緩衝’,表示其中因添加或釋放酸 性或鹼性物質所引起之PH變化可由緩衝物質夷平之溶液。 可使用導致此-效應之任_緩衝物質。較佳使用醫藥上可 接受之緩衝物質,例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸 或其鹽、嗎琳、2-(N-嗎琳基)乙燒績酸或其鹽、組胺酸或 其鹽、甘胺酸或其鹽、或三(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)或其 鹽。在一實施例中,可使用磷酸或其鹽、或乙酸或其鹽、 132511.doc -14- 1363060 或檸檬酸或其鹽、或組胺酸或其鹽作為緩衝物質。經緩衝 溶液視需要可包含其他鹽,例如氣化鈉、硫酸鈉、氯化 鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉、或檸檬酸鉀。
一般層析方法及其應用係為熟習此項技術者已知。參見 (例如)Chromatography,第 5版,部分 A ·· Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(編輯),Elsevier Science Publishing公司,New York,(1992) ; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl,Z.(編 輯),Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands, (1998) ; Chromatography Today,Poole,C. F.、及 Poole,S· K·,Elsevier Science Publishing公司,New York,(1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982) ; Sambrook,J.等人(編輯),Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,1989 ;或 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F. M.等 人(編輯),John Wiley & Sons公司,New York。 紅血球生成素之聚乙二醇化通常產生不同化合物之混合 物,例如多-聚乙二醇化紅血球生成素、單-聚乙二醇化紅 血球生成素、非-聚乙二醇化紅血球生成素、活化PEG酯之 水解產物(例如游離聚乙二醇化酸)、以及红血球生成素自 身之水解產物。為獲得呈基本均勻形式之單·聚乙二醇化 紅血球生成素,必須分離該等物質且必須純化目標化合 物。 132511.doc 1363060 因此,本發明一態樣係提供獲得呈基本上均勻形式之 單-聚乙二醇化紅血球生成素之方法,該方法包含以下牛 驟: a) 使用分子量為20 kDa至40 kDa之活化聚乙二醇化試劑 來聚乙二醇化紅企球生成素, b) 用兩個連續陽離子交換層析步驟來純化在步驟幻中獲 得之聚乙二醇化紅企球生成素,其中第一及第二陽離 子乂換層析步驟採用相同類型之陽離子交換材料, c) 自第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之 單-聚乙二醇化紅血球生成素。 此方法尤其可用於純化經聚乙二醇化之糖基化重組多 肽,即其係由哺乳動物細胞產生,較佳係由CH〇細胞、 HEK293細胞、BHK細胞、Per C6⑧細胞、或細胞產 生’且之後在化學上經聚乙二醇化。 在方法之第一步驟中使紅血球生成素聚乙二醇化。用於 聚乙二醇化反應中之聚(乙二醇)(pEG)聚合物分子之分子 量為約20 kDa至40 kDa(用於本文中之”分子量”應理解為 PEG之平均分子里,因為所獲得呈聚合化合物形式之叩G 不具有確定分子量而事實上具有分子量分佈;術語"約"意 指在該等PEG製劑中,某些分子之分子量可大於或㈣於 所述刀子ϊ,即術語"約"係指其中%% pEG分子之分子量 在所述分子2:之+/- 10%範圍内之分子量分佈。舉例而 言,3〇kDa之分子量表示自27kDa至33_。
術》D紅血球生成素”係指具有序列SEQ ID N〇:丨或SEQ 132511.doc • 16· 1363060 ID NO:2之蛋白質,或其實質上同源之蛋白質或多肽,其 生物學特性與刺激紅血球產生及刺激骨髓中定型紅系祖細 胞之***與分化相關。重組紅血球生成素可藉由重組DNA 技術或藉由内源基因活化經由在真核細胞(例如CHO細 胞、或BHK細胞、或HeLa細胞)中表現來製備。舉例而 言’紅血球生成素糖蛋白係藉由内源基因活化來表現,如 美國專利第5,733,761號、美國專利第5,641,670號、美國專 利第 5,733,746 號、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/1 1354、WO 91/06667、及 WO 91/09955 所報導。在一實施例中,本發明紅血球生成素係基於人 EPO之序列。在另一實施例中’人紅血球生成素具有SEq ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所列之胺基酸序列,人紅血球 生成素較佳具有SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列。術語 "紅血球生成素”亦表示SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2蛋白 質之變體,其中一或多個胺基酸殘基經改變、刪除、或插 入’且其具有與未經修飾蛋白質相同之生物學活性,例如 歐洲專利第1 064 951號或美國專利第6,583,272號所報導。 良體可具有人紅血球生成素之胺基酸序列,其具有1至6個 額外糖基化位點。聚乙二醇化紅血球生成素之具體活性可 藉由業内已知之各種分析方法來測定。本發明經純化聚乙 二醇化紅血球生成素之生物學活性使得藉由注射將該蛋白 質投與人類患者可導致與個體之未經注射或對照組相比, 骨髓細胞中網織紅血球及紅血球之產量增加。根據本發明 獲得並純化之聚乙二醇化紅血球生成素之生物學活性可藉 132511.doc 17 1363060 由 Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)中之方法來測試。 本發明之"PEG"或"PEG基團”意指含有聚(乙二醇)作為主 要部分之殘基。此一 PEG可另外含有結合(即接合)反應必 須之化學基團,其係得自分子之化學合成,或其為分子各 部分間達成最佳距離之間隔體。該等其他化學基團並不用 於計算PEG聚合物分子之分子量。此外,此一PEG可由連 接至一起之一或多個PEG側鍵組成。具有一個以上PEG鍵 之PEG稱為多臂或具分支PEG。具分支PEG可藉由(例如)將 聚氧化乙烯添加至各種多元醇(包括甘油、異戊四醇、及 山梨醇)中來製備。具分支PEG闡述於(例如)歐洲專利第0 473 084號、美國專利第5,932,462號中。在一實施例中, 使用線性PEG分子作為分子量為20-35 kDa之PEG,且使用 具分支PEG作為分子量超過35 kDa(尤其為40 kDa)之PEG聚 合物。在一實施例中,使用二臂PEG作為PEG 40 kDa。 術語”聚乙二醇化”意指聚(乙二醇)殘基共價鍵結於多肽 之N末端及/或内部離胺酸殘基上。蛋白質之聚乙二醇化在 業内廣泛為人所知,且由(例如)Veronese, F.M.综述於 Biomaterials 22 (2001) 405-417中。可使用不同官能團及 具有不同分子量之聚乙二醇、線性及具支鏈PEG以及不同 連接基團來連接PEG(亦參見Francis,G.E.等人’ Int· J. Hematol. 68 (1998) 1-18 ; Delgado,C.等人,(^1;.116¥· Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304)。如(例 如)WO 00/44785中所述,红血球生成素之聚乙二醇化可在 132511.doc -18- 1363060 水性溶液中用聚乙二醇化試劑來實施,在一實施例中係藉 由使用分子量介於5 kDa與40 kDa之間之經NHS活化之線 性或具支鏈PEG分子來實施。根據Lu, γ.等人,Reactive Polymers 22 (1994) 221-229,聚乙二醇化亦可在固相中實 施。無獨有偶,N末端聚乙二醇化多肽亦可根據w〇 94/01451來製造。
該等方法產生在離胺酸殘基之一或多個g—胺基處及/或在 N末端胺基處聚乙二醇化之红血球生成素。在n末端胺基 酸處之選擇性聚乙二醇化可根據Felix,A.M·等人,ACS
Symp. Ser.680 (Poly(ethylene glycol)) (1997) 218-238來實 施。選擇性N末端聚乙二醇化可在固相合成期間藉由偶合 N -聚乙二醇化胺基酸衍生物與肽鏈之n-ι末端胺基酸來達 成。側鏈聚乙二醇化可在固相合成期間藉由偶合N -聚乙 二醇化離胺酸衍生物與生長鏈來實施。組合N末端及側鏈 聚乙二醇化可如上文所述在固相合成期間實施,或藉由固 相合成經由將活化PEG試劑施加至胺基去保護之肽來實 施。 適宜PEG衍生物係平均分子量為約5至約40 kDa之活化 PEG分子’在一實施例中分子量為約2〇至約40 kDa,較佳 為約30 kDa至約35 kDa。在一實施例中,peg衍生物係線 性或具支鏈PEG。適用於製備peg-蛋白質及PEG-肽偶合物 之衆多種 PEG衍生物可自 Shearwater Polymers (Huntsville, AL,U.S.A. ; www.nektar.com)獲得。 活化PEG衍生物係為業内所知且闡述於(例如)關於PEG_ 132511.doc •19· 1363060 乙烯基颯之M〇rpurgo,Μ.等人,j· Bi〇c〇njug chem 7 (1996) 3 63-368中。線性鏈及具支鏈鏈PEG物質適用於製備 聚乙二醇化片段。反應性PEG試劑之實例係碘·乙醯基·甲 氧基-PEG、或曱氧基PEG-乙烯基砜⑻較佳為約45〇至約 900之整數且R係具有一至六個碳原子之線性或具支鏈Ci_ 至C0-烷基’例如甲基、乙基、異丙基等,其中在一實施 例中R=曱基):
該等碘-活化物質之應用係為業内已知且由(例如) Hermanson, G· T.闡述於 Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996),第 147-148 頁中。
在一實施例中,PEG物質係活化PEG酯,例如N-羥基琥 珀醯亞胺基丙酸酯、或N-羥基琥珀醯亞胺基丁酸酯、或諸 如PEG-NHS等N-羥基琥珀醯亞胺(Monfardini,C.等人’ Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一實施例中’活化 N-羥基琥珀醯亞胺酯係
132511.doc • 20· 1363060 其中使用烷氧基-PEG-N-羥基琥珀醯亞胺,例如曱氧基 PEG-N-羥基琥珀醯亞胺(MW 30000; Shearwater Polymers
公司)’其中R及m係如上文所定義。在一實施例中,PEG 物質係甲氧基聚(乙二醇)·丁酸之N-羥基琥珀醯亞胺基酯。 術語"烷氧基"係指烷基醚基團,其中術語,烧基I意指最多 含有四個碳原子之直鏈或具支鏈烧基,例如曱氧基、乙氧 基、正丙氧基及諸如此類,曱氧基較佳。
此申請案中所用術語"基本均勻形式”表示所獲得、所含 有 '或所用聚乙二醇化紅血球生成素係彼等具有界定數量 所連接PEG基團者。在一實施例中,聚乙二醇化紅血球生 成素係單-聚乙二醇化紅血球生成素。製劑可含有未反應 (即缺少PEG基團)之紅血球生成素、多_聚乙二醇化紅血球 生成素、以及在聚乙二醇化反應期間所生成多肽之片段。 在一實施例中,術語”基本均勻形式,,表示單_聚乙二醇化红 血球生成素之製劑含有至少5〇% (w/w)之單-聚乙二醇化紅
血球生成素、至少75°/。之單-聚乙二醇化紅血球生成素、至 / 90 /。之單-聚乙二醇化紅血球生成素、或%%以上之單_ 聚乙二醇化紅血球生成素。百分比值係基於獲得單聚乙 二醇化紅血球生成素之陽離子交換層析純化之相應層析圖 的面積-%。 本發明報告純化單_聚乙二醇化紅血球生成素以獲得單_ 聚乙二醇化紅血球生成素之基本均勻形式之方法。人們驚 訝地發現,皆使用相同類型陽離子交換材料之兩個連續陽 離子交換層析步驟之組合可提供單·聚乙二醇化紅血球生 132511.doc 1363060 成素之基本均勾形式。因此本發明提供純 化紅血球生成辛之方法, 平不c —每 夕 方法其包含以下步驟:提供包含單· :-、及非·聚乙二醇化紅血^成素之溶液,實施 :績陽離子交換層析步驟、及在第二陽離子交換層析步驟 :回收經純化單-聚乙二醇化紅血球生成素,❹在兩個 私離子交換層析步驟中使用相同類型之陽離子交換材料。 在-實施财,第-陽離子交換層析步驟中之回收係藉由 與第二陽離子交換層析步驟中之回收不同之洗脫方法來實 施。在另-實施例中,在第一陽離子交換層析步驟後及在 第二陽離子交㈣析步驟後使陽離子交換層析管枝再生。 在第二陽離子交換層析步驟中經純化單·聚乙二醇化紅 血球生成素之回收係藉由自第二陽離子交換層析材料洗脫 單-聚乙二醇化紅血球生成素來達成。在本發明方法之一 實施例+,所用洗脫方法中之兩個陽離子交換層析步驟各 不相同。在此實施例中,第__陽離子交換層析步驟係根據 步驟洗脫法來實施,即所用緩衝液之離子強度係自一離子 強度值逐步(即立刻)增加至下一離子強度值,較佳改變 10%或更高。在一實施例中,步驟洗脫法係根據三步洗脫 法來實施。在第一步驟_,主要自陽離子交換層析管柱洗 脫出多-聚乙二醇化紅血球生成素。離子強度之第二次增 強主要洗脫出單·聚乙二醇化紅血球生成素,以對應尺寸 排除層析圖之面積計(面積_%),其純度大於60%。離子強 度之第三次增強主要自管柱洗脫出殘留非_聚乙二醇化紅 血球生成素。 -22- 132511.doc 1363060 在-實施例中,第:陽離子交換層析步驟係根據連續洗 脫法來實施,即緩衝液之離子強度係以連續方式來增強, 改變較佳小於5%°合併含有單-聚乙二醇化紅血球生成素 之經洗脫流份以獲得呈基本均勾形式之單·聚乙二醇化紅 血球生成素’在-實施例中以對應層析圖之面積計,立含 有小於οκ低分子㈣式e緩衝液較佳以1〇祕至25〇 mM之濃度存在’在—實施例中為5Q讀至⑼賴,在另
-實施例中為約H)〇 mMe因此在本發明方法中,兩個連 續%離子父換層析步驟係指以下步驟: a)在適用於使該單-聚乙二醇化紅血球生成素與第一陽 離子交換層析管柱巾所含陽離子交換材料結合之條 件下’將包含單-、多·、及非_聚乙二醇化紅血球生 成素與低分子量形式之混合物之緩衝水溶液施加至 該第一管柱中, W藉由步料職㈣逐步增加流料㈣之離子強
度自第-陽離子交換層析管柱回收單·聚乙二醇化紅 血球生成素,其中與步驟a)中所施加之混合物相 比,所回收溶液中單-聚乙二醇化紅血球生成素之相 對含量增加, 0在適用於使所回收單_聚乙二醇化紅血球生成素與第 二陽離子交換層析管柱巾所含陽離子交換材料結合 之條件:’將來自步驟b)之該紅血球生成素施加至 έ第管柱巾其中該.第二管柱中所含陽離子交換 材料與第一管柱中之陽離子交換材料係同一類型,、 132511.doc • 23 - d)藉由連續洗脫方法經由彳查培4¾ i α AM 由連續增加流經緩衝液之離子 強度自該第二陽離子交換層析管柱回收呈基本Μ 形式之經純化單-聚乙二醇化紅血球生成素。
多肽之聚乙二醇化通常不提供呈均勾形式之聚乙二醇化 產物。此外可以單-聚乙二醇化、多-聚乙二醇化及非-聚乙 二醇化產物之混合物形式獲得目標產物。因此方法之步驟 a)中所施加聚乙二醇化紅血球生成素之溶液係存於水性緩 衝:中之單·、多·、及非·聚乙二醇化紅▲球生成素與低分 子!形式或片段之混合物。不同物質之相對含量係藉由尺 寸排除層析(SE-HPLC)來測定。實例性層析圖展示於圖i 中。圖1中相關峰之面積總和(即峰下面積)係尺寸排除層析 圖之總面積。單個峰之百分比表示為面積·%,即表示為層 析圖總面積之相對面積百分比。 一般層析法、其應用及相關術語已為熟習此項技術者所 熟知。參見(例如)Chromatography,第5版,部分A :
Fundamentals and Techniques,Heftmann,E_(編輯), Elsevier Science Publishing公司,New York,(1992)及其它 相關文獻。在層析期間,緩衝液流經陽離子交換層析管 柱。根據層析方法步驟之需要來調整此"流經緩衝液"。其 將目標物質輸送至(施加)層析材料及自層析材料輸送出(洗 脫)目標物質。 在第一陽離子交換層析步驟中,以0.7-1.5 mg/ml、較佳 約1 mg/ml之蛋白質濃度將單_聚乙二醇化、多-聚乙二醇 化 '及非_聚乙二醇化紅血球生成素之混合物施加至存於 132511.doc •24· 1363060
水性緩衝溶液中之第一陽離子交換層析管柱中。在一實施 例中’水性緩衝溶液具有約100 mM麟酸鉀且pH為約3.0。 此申請案中所用術語•,約"表示給定數值左右10〇/〇之範圍, 即± 10%。在一實施例中’在施加之前或之後用相同緩衝 溶液洗滌第一管柱。在步驟洗脫法之第一步驟中,使緩衝 液變為具有約100 mM磷酸鉀、約90 mM氯化鈉且pH為約 3 ·〇之緩衝液。用此緩衝液自陽離子交換層析管柱洗脫出 經水解活化PEG試劑(即對應聚乙二醇化碳酸)、未反應偶 合劑、及多-聚乙二醇化紅血球生成素。在三步洗脫法之 第·一步驟中’使緩衝液變為具有約1〇〇 mM填酸卸、約25 0 mM氯化鈉且pH為約3,〇之緩衝液。在此步驟中,自第一陽 離子交換層析管柱回收單-聚乙二醇化紅血球生成素。用 淨化水將此洗脫步驟中所收集流經緩衝液稀釋為約i :5 (v/v)至1:8 (v/v),〗:5 (v/v)較佳。實例性第一陽離子交換 層析展示於圖2中。在三步洗脫法之第三步驟中,使緩衝 液變為具有約10〇 mM磷酸鉀、約75〇 mM氣化鈉為約 3.0之緩衝液。在此步驟中,自第一陽離子交換層析管柱 回收非-聚乙二醇化紅血球生成素。 第陽離子交換層析之第二步驟令所收集之流經緩衝液 含有增高相對含量之單-聚乙二醇化紅血球生成素,即與 實施第一陽離子交換層析步驟之前相比,以重量或以面 積-%汁之單-聚乙二醇化紅血球生成t之百&比(在第二步 驟所收集流經緩衝液之尺寸排除層析之層析圖中)升高。 在-實施例中’單·聚乙二醇化紅血球生成素之相對含量 132511.doc •25- 63060 f至少6G面積·%。在另—實施财,單聚乙二醇化红血 球生成素之相對含量為至少80面積。 為進行單·聚乙二醇化紅血球生成素之進一步純化,實 施第二陽離子交換層析步驟。在第二陽離子交換層析中, 將第二洗脱步驟令所收集且經稀釋之流經緩衝液㈣至鱗 酸鉀濃度為约議福且阳為約pH 3〇,且將其施加至與 陽離子交換層析管柱含有相同類型陽離子交換材料之 第二陽離子交換層析管柱中。在一實施例中,第二陽離子 父換管柱及其中所含陽離子交換材料與第一陽離子交換層 析步驟中相同。藉由施加線性梯度自第二陽離子交換層析 管柱回收單-聚乙二醇化紅血球生成素,該梯度起始^農 度為約HK) mM並具有約5G福氯化鈉且pH為約3q之碟酸 钟緩衝液’且終止於濃度為約1〇〇應並具有約5〇〇 _氣 化鈉且pH為約3.0之磷酸鉀緩衝液。在十個管柱體積内, 氯化鈉濃度呈線性變化。對流經緩衝液實施分級分離且將 每一流份用1 _酸氫二钟稀釋以使pH值提高至約pH 6至 8 °實例性層析圖展示於圖3中。 在第二陽離子交換層析步驟後獲得呈基本均勻形式之 早-聚乙二醇化紅血球生成素,在一實施例中其純度為至 少95面積_〇/〇。 熟習此項技術者熟知離子交換層析技術。在與陽離子交 換材料結合之多肽之回收步驟中,增強流經離子交換管柱 之緩衝液/溶液之離子強度(即電導率)。此可藉由提高緩衝 液鹽濃度或藉由將其他鹽類(所謂洗脫鹽)添加至緩衝溶液 132511.doc * 26 - 1363060 中來達成。端視洗脱方法,可藉由逐份添加濃縮緩衝液或 洗脫Λ溶液來立刻(步驟洗脫法)或以連續方式(連續洗脫 法)it 1¾緩衝液/鹽遭庳 ^ -展度。較佳洗脫鹽係檸檬酸鈉、氯化 納、硫酸鈉、碳酸鈉、氯化钾、硫酸鉀、破酸鉀、或檸檬 ^•或Θ酸之其他鹽、或該等組份之任―混合物。在一實施 例中,洗脫鹽係擇檬酸鈉、氣化鈉、氯化卸、或其混合 物。
在田刖方法之-實施例中,陽離子交換材料係強陽離子 父換材料,较佳例如Toyopearl⑧SP 650 M。在一實施例中 導致洗脫之鹽之濃度為5 至500 mM,較佳為5 mM至 400 mM ’且更佳為5 mM至25()囊。在本發明另_實施例 中,導致洗脫之鹽同時用作緩衝物質,例如檸檬酸或其鹽 或磷酸或其鹽。 單-聚乙二醇化紅血球生成素可用於醫藥組合物中,該 組合物適用於以醫藥上可接受之載劑或媒劑藉由業内已知 方法來注射。舉例而言,適宜組合物已闡述於w〇 97/09996、WO 97/40850、WO 98/58660、及 WO 99/07401 中。調配本發明產物之醫藥上可接受之較佳載劑係人血清 白蛋白、人血漿蛋白等。可將本發明化合物調配於pH為7 且含有滲透性調節劑(例如132 mM氯化鈉)之10 mM磷酸鈉/ 卸緩衝液中。醫藥組合物視需要可含有防腐劑。醫藥組合 物可含有不同量之單-聚乙二醇化紅血球生成素,例如1〇_ 1000 pg/ml、例如 50 μβ或 400 pg。 本發明紅血球生成素糖蛋白產物之投與導致人類中紅血 132511.doc -27- 1363060 球形成。因此,投與單·聚乙二醇化紅血球生成素糖蛋白 產物可補充此對於紅血球產生具有重要㈣之紅血球生成 素蛋白。可以有效濃度調配含有單_聚乙二醇化紅血球生 成素糖蛋白產物之㈣組合物以供藉由各種方式投與經歷 血液病症之人類患者,料血㈣症之特徵為紅血球產量 低或紅也球生絲陷,其係單獨存在或料部分病況或疾 病而存在。可藉由注射投與醫藥組合物,例如皮下或靜脈 内庄射H乙二醇化紅血球生成素糖蛋白產物之平均 量可變。偶合物之確切量主要取決於以下因素:所治療病 況之確切類型、所治療患者之情況、以及組合物中之其他 成份。舉例而言,可(例如)每周一次以〇 〇11〇叫/“體 重、較佳0.1-1 Pg/kg體重來投與。 提供以下實例、所列序列及圖以幫助理解本發明,本發 明之真實範圍展示於隨附專利申請範圍中。應瞭解,可在 不偏離本發明精神之情況下對所列程序實施多種修改。 材料及方法
SE-HPLC SE-HPLC根據蛋白質之表觀分子量來將其分離。因此, 此方法能檢測單-聚乙二醇化紅血球生成素、低分子量形 式及片¥又、多-聚乙二醇化形式及紅血球生成素較大聚集 體之存在。HPLC配備有220-nm檢測器及Superose 6 HR管 柱(尺寸為 10 X 300 mm,Pharmacia Biotech,Cat-Nr. 17-0537-01)或 Superose 6 10/300 GL管柱(Pharmacia Biotech,
Cat_Nr: 17-5172-01)。管柱係在等強度條件及室溫下使用 132511.doc •28· 1363060 約0_4 ml/min之流速作業。流動相緩衝液係具有300 mM氣 化鈉且pH為6.8之50 mM磷酸鈉緩衝液。端視所用HPLC-系 統,可以1 00 μί或500 pL之樣品施加體積來實施方法。用 流動相緩衝液將樣品稀釋至蛋白質濃度為約〇.5 mg/mL(100 μί裝載)或 0·1 mg/mL(500 pL裝載)。蛋白質濃 度低於0.1 mg/mL之樣品可不加稀釋即使用。在220 nm之 檢測器波長下檢測經洗脫蛋白質。 實例1 紅血球生成素之發酵及純化 紅血球生成素可根據(例如)WO 01/87329來製造,且根 據WO 96/135718中所述來純化。 實例2 用雙官能團試劑對紅血球生成素實施聚6二醇化 a) 紅血球生成素之活化 將指定量之含有封閉硫氫基、SATA(破珀醯亞胺基乙酿 基硫代乙酸酯)或SATP(琥珀醯亞胺基乙醯基硫代丙酸 醋)(溶於DMSO中,添加至10 mg/ml)之試劑添加至經苄基 保護之紅血球生成素溶液中,在此處添加至5 mg/ml蛋白 質存於補加有50 mM氯化納且pH為7.3之10 mM峨酸卸緩衝 液中之1 ml溶液中。將反應混合物攪拌約30分鐘(在25 °C 下)且藉由將1 Μ離胺酸溶液添加至10 mM之終濃度來終止 反應。藉由對包含50〇11^氯化鈉及2 1!11^£0丁人且?11為6.2 之10 mM磷酸鉀緩衝液透析來去除多餘量之SATA及 SATP。用羥胺去除保護乙醯基。 132511.doc -29- 1363060 b) 活化紅血球生成素之聚乙二醇化 使380 mg 甲氧基PEG-馬來醯亞胺(MW 30.000 ; Shearwater Polymers公司,Huntsville (Alabama, USA))溶 解於含有95 mg活化紅血球生成素(4.5 mg/ml,存於具有50 1111^氯化鈉及2 1111^丑0丁人且?11為6.2之1〇1111^磷酸鉀緩衝液 中)之溶液中。在溶液中所得活化紅血球生成素與甲氧基 PEG-馬來醯亞胺之莫耳比為1:2至1:4。藉由將1 Μ羥胺水 溶液(添加至30 mM之終濃度)(ρΗ 6.2)添加至上述溶液中, 使活化紅血球生成素上共價鍵結之封閉硫氫基解封閉。在 反應混合物溶液中所得活化紅血球生成素含有游離硫氫基 (-SH)。在硫氫基解封閉後立即使現在含有游離硫氫基(-SH)之活化紅血球生成素與曱氧基PEG-馬來醯亞胺偶合反 應90分鐘(在25°C下,同時攪拌)。藉由將0.2 Μ半胱胺酸水 溶液以2 mM之終濃度添加至反應混合物中來終止偶合反 應。30分鐘後,藉由以5 mM之終濃度添加存於DMS0中之 0.5 Μ N-甲基馬來醯亞胺溶液來封閉未與曱氧基PEG-馬來 醯亞胺反應之活化紅血球生成素之多餘游離硫氫基。30分 鐘後,可對現在含有聚乙二醇化紅血球生成素之所得反應 混合物實施純化。 實例3 單-聚乙二醇化紅血球生成素之純化 a) 在SP Toyopearl 650 Μ上之第一層析 產物之第一層析係在填充有SP Toyopearl 650Μ之續丙基 (SP)管柱上實施。管柱係在RT下作業。第一管柱之最大裝 132511.doc -30- 1363060 載容量限定為1.5 g蛋白質/升管柱體積(CV)。用pH為2.9至 3.1之100 mM磷酸鉀緩衝液(Sp_A缓衝液)來平衡管柱。裝 载步驟後’用一系列含有漸增含量NaCl之磷酸鉀緩衝液洗 條並洗脫管柱。去除流出物中之經水解PEG試劑及多-聚乙 二醇化形式’且隨後分別用SP_A緩衝液及pH為2.9至3.1且 含有90 mM氣化鈉之1〇〇 磷酸鉀緩衝液(SP-B緩衝液)實 施洗滌步驟。 藉由施加pH為2.9至3.1且含有250 mM氣化鈉之100 mM 磷酸鉀緩衝液(SP-C缓衝液)來洗脫單-聚乙二醇化紅血球生 成素’將其收集於容器中且用淨化水直接以1:5稀釋。所 收集該洗脫液稱為"SP洗脫液混合物I"。 隨後用pH為2_9至3.1且含有750 mM氯化鈉之100 mM磷 酸鉀緩衝液(SP-D緩衝液)洗滌管柱以去除未反應紅血球生 成素且使管柱再生。 b) 在SP Toyopearl 650 Μ上之第二層析 第二管柱係在RT下作業。在用SP-Α緩衝液平衡後,將 SP洗脫液混合物I施加至管柱且之後用sp-A緩衝液洗滌管 柱。在經pH為2.9至3.1之1〇〇 mM磷酸鉀緩衝液緩衝之十個 管柱體積内,藉由施加斜率為50至50〇 mM氣化鈉之線性 梯度來洗脫單-聚乙二醇化紅血球生成素。在最多8個單獨 流份中分級分離產物峰且用1 Μ磷酸氫二鉀直接稀釋每個 流份以使pH提高至6至8。 在單-聚乙二醇化红血球生成素之洗脫完成後,可增加 梯度之斜率,此使得需要立即用pH為2.9至3.1且含有500 132511.doc -31 - 1363060 mM氣化納之1 00 mM填酸卸洗蘇管柱。 c) SP Toyopearl 650 Μ管柱之再生 在一系列七個步驟中使兩個管柱之樹脂再生。用淨化水 沖洗管柱,之後用0.5 Μ氫氧化鈉溶液沖洗。用淨化水置 換鹼性溶液,之後實施酸洗滌(0.5 Μ磷酸二氫鈉、1 Μ磷 酸)。在另一淨化水步驟後,在2 4小時内用0.5 Μ氫氧化鈉 對管柱實施去熱原化。在苛性再生後,再次用淨化水洗滌 管柱。管柱參數之概述參見表1及表2。 表1:第一層析管柱參數 步驟 緩衝溶液 管柱 體積 流速 [L/min] 平衡 100 mmol/L磷酸鉀,pH 2.9-3.1(SP-A緩 衝液) >6 1.6-2.1 管柱裝載 反應混合物,經SP-A稀釋(1:5) n. a. 1.6-2.1 SP-A洗滌 100 mmol/L磷酸鉀,pH 2.9-3.1(SP-A緩 衝液) 2 1.6-2.1 SP-B洗滌 100 mmol/L構酸奸,pH 2.9-3.1,90 mmol/L NaCl(SP-B緩衝液) 2-3 1.6-2.1 SP-C洗脫 100 mmol/L碗酸鉀,pH 2.9-3.1,250 mmol/L NaCl(SP-C緩衝液) 2-3 1.6-2.1 SP-D洗滌 100 mmol/L磷酸鉀,pH 2.9-3.1,750 mmol/L NaCl(SP-D緩衝液) 2-3 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 苛性管柱 再生I 0.5 mol/L NaOH >2 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 酸管柱再 生 1 mol/L填酸0.5 mol/L填酸二氫納 >3 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 苛性管柱 再生II 0.5 mol/L NaOH >3 n. a. 清洗 PW III >2 1.6-2.1 n. a. ·'不適用 132511.doc -32- 1363060
表2 :第二層析管柱參數 步规 緩衝溶液 管柱 體積 流速 [L/min] 平衡 100mmol/L 磷酸鉀’ pH 2.9-3.1 (SP-A 缓衝液) >6 1.6-2.1 管柱裝載 SP洗脫液混合物I ’經PWIII稀釋(1:5) n. a. 1.6-2.1 SP-A洗務 100 mmol/L磷酸鉀,pH 2.9-3.1,(SP-A緩 衝液) 2-3 1.6-2.1 梯度及洗脫 經10 CV,在緩衝液SP-A與100 mmol/L填 酸斜之間,斜率為50-500 mmol/L NaCl之 梯度,500 mmol/L NaCl pH 2.9-3.1 (SP-E 緩衝液) 10 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 苛性管柱再 生I 0.5 mol/L NaOH >2 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 酸管柱再生 1 mol/L磷酸,0.5 mol/L磷酸二氫鈉 >3 1.6-2.1 清洗 PW III >2 1.6-2.1 苛性管柱再 生II 0.5 mol/L NaOH >3 n. a. 清洗 PW III >2 1.6-2.1 n. a.:不適用 【圖式簡單說明】 圊1 不同聚乙二醇化紅血球生成素之混合物之SE-HPLC,其包括峰與物質間之關聯。 圓2 步驟洗脫法之實例性層析圖。 囷3 連續洗脫法之實例性層析圖。 132511.doc •33· 1363060 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120> 聚乙二醇化多肽之純化
<130> 24380 FT <140> 097126983 <141> 2008-07-16 <150> EP 07013959.7 <151> 2007-07-17 <160> 2 <170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> 智人 <400> 1
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 15 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45
iyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 132511·序列表.doc 1363060
Pro Leu Arg Thr 130 lie Thr Ala Asp Thr 135
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> 智人 <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg 1 5 10
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr 20 25
Tyr Leu 15
Thr Gly Cys Ala Glu His 30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45
Tyx Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala Val Glu Val Trp 50 55 60
Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90 95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110
Gly Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser Pro 115 120
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 125
Pro Leu Arg Thr 130 lie
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 135 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 2- 132511-序列表.doc 1363060
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
132511-序列表.doc
Claims (1)
1363060 第097126983號專利申請案 中文利此IMI替換本(100年A月卞-- 十、申請專利範圍: |v。年r尸’日¥(费·} T -------- ·-*···». >,, 1· 一種純化單-聚乙二醇化紅血球生成素之方法,其包含以 下步驟.提供包含單·、多·、及非_聚乙二醇化紅血球生 成素之溶液,實施兩個連續陽離子交換層析步驟,及在 邊第二陽離子交換層析步驟中回收該經純化單-聚乙二醇 化紅血球生成素,其特徵在於在兩個陽離子交換層析步 驟中使用相同類型之陽離子交換材料,且該兩個連續陽 離子交換層析步驟係使用不同洗脫方法來實施,該兩個 連續陽離子交換層析步驟包含以下步驟: a)在適用於使該單·聚乙:醇化紅血球生成素與第一陽離 子交換層析管柱中所含陽離子交換材料結合之條件 下,將包含單-、多_、非-聚乙二醇化紅血球生成素與 低分子量形式之混合物之緩衝水溶液施加至該第一管 柱中, b)藉由步㈣脫法經由逐步增加㈣經緩衝液之離子強 度自該第-陽離子交換層析管柱回收單”聚乙二醇化紅 血球生成素’其中與該所施加之混合物相比,該回收 溶液中該單-聚乙二醇化紅血球生成素之百分比有所增 加, c)在適用於使該單-聚,, t 一醇化紅血球生成素與第二陽離 子交換層析管柱中所+ > π 3 a陽離子父換材料結合之條 下’將步驟b)令所回收單聚 _ “兮…, 一醇化紅血球生成素施 加至該第二官柱中,其中 T °亥第一官柱中所含陽離子交 換材料與該第一管;cjj > @ Μ 柱甲之%離子交換材料係同一類 13251M000817.doc 1363060 型,' • t 9 W藉由連續洗脫方法經由連續增加該流經缓衝液之離子 強度自該第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形 式之該經純化單-聚乙二醇化紅血球生成素。 月长項1之方法,其特徵在於該陽離子交換材料係磺 丙基陽離子交換材料。 如β求項1之方法,其特徵在於在該方法之步驟b)中該離 子強度之該逐步增加係三步式離子強度增加。 4. 如請求項3之方法,其特徵在於b)中所回收單聚乙二醇 化紅血球生成素係在該步驟洗脫法之該第二步驟中回 收。 5. 如請求項4之方法,其特徵在於在該步驟b)中,多-聚乙 一醇化紅血球生成素係在該流經緩衝液之第一次離子強 度增加後回收,單-聚乙二醇化紅血球生成素係在該流經 緩衝液之第一次離子強度增加後回枚,且非-聚乙二醇化 紅血球生成素係在該流經緩衝液之第三次離子強度增加 後回收。 6. 如請求項1至5中任—項之方法,其特徵在於在步驟咐 ㈣洗脫法令導致洗脫之鹽濃度差異在該步驟洗脫法之 每一該等步驟中為ΠΟΟ/ο或更高。 7. 如請求項1至5_任一項之方法,其特徵在於該緩衝水溶 液含㈣酸或其鹽、或檸檬酸或其鹽、或組胺酸或其鹽 作為緩衝物質。 8. 如請求項1至5中任-項之方法’其特徵在於在該步驟 132511-1000817.doc 1363060 中,該單-聚乙二醇化紅血球生成素係藉由施加線性梯度 自該第二陽離子交換層析管柱回收,該線性梯度起始於 濃度為約100 mM並具有約50 mM氣化鈉且pH為約3.0之 磷酸鉀緩衝液且終止於濃度為約1 〇〇 mM並具有約500 mM氯化鈉且pH為約3.0之磷酸鉀緩衝液,其中在十個管 柱體積内該氯化鈉濃度之改變為線性變化。 9. 一種製造單-聚乙二醇化紅血球生成素之方法,其包含以 下步驟: a) 聚乙二醇化紅企球生成素, b) 用兩個連續陽離子交換層析步驟來純化單-聚乙二醇化 紅企球生成素,其中該第一及第二陽離子交換層析步 驟採用相同類型之陽離子交換材料, c) 自該第二陽離子交換層#管柱目收呈基本均句形式之 該單-聚乙二醇化紅血球生成素, 且在該方法中該兩個連續陽離子交換層析㈣係使用不 同洗脫方法來實施。 .如請求項1至5及9中任一項之方法,其特徵在於該第二 陽離子交換材料與該第-陽離子交換材料仙同類型之 陽離子交換材料但該陽離子交換材料所佔百分比不同。 11. 如請求項1至5及9中任一項之方 ^ . . g ώ 方去,其特徵在於該PEGf殘 留物在呈線性PEG時具有2〇 * KUa之分子量且在呈具支 鏈PEG形式時具有4〇kDa之分子量。 12. 如請求項1至5及9_任一 該n 、 法,其特徵在於所獲得 聚乙化紅血球生成素係呈基本均勾形式,藉由 132511-100Q8i7.doc 1363〇6〇 尺寸排除HPLC來測定,其含有95面積%以上之單·聚乙 一醇化紅血球生成素。 13·如請求項1至5及9中任一項之方法,其特徵在於該單聚 乙二醇化紅血球生成素係在該第一陽離子交換層析步驟 中回收,藉由尺寸排除HPLC來測定,其純度大於6〇面 積0/〇 〇 Μ.如請求項丨至5及9中任一項之方法,其特徵在於該緩後 水溶液含有約l00mM磷酸鉀緩衝液且具有約3 〇之?只。 •如明求項1至5及9中任-項之方法,其特徵在於在該等 層析步隸中溶液之pH值係約3. 〇。 16·如請求項1至5及9中任一項之古、土 计处 項之方法,其特徵在於造成該 聚乙二醇化紅血球生成素自該等陽離子交換層析管柱洗 脫之鹽係檸檬酸鈉、或氯化鈉、或氯化鉀。 1 7·如請求項1至5及9中任一項 貝之方法,其特徵在於該紅血 球生成素具有SEQIDN0:1或2之胺基酸序列。 132511-1000817.doc
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US5118796A (en) * | 1987-12-09 | 1992-06-02 | Centocor, Incorporated | Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives |
FR2646438B1 (fr) | 1989-03-20 | 2007-11-02 | Pasteur Institut | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
KR100233781B1 (ko) | 1989-11-06 | 1999-12-01 | 스테펜 에이. 쉐어윈 | 동종 재조합을 이용하는 단백질 제조방법 |
DE69034135T3 (de) | 1989-12-22 | 2012-08-23 | Laboratoires Serono S.A. | DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen |
FR2656531B1 (fr) | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
JP2826362B2 (ja) | 1990-02-13 | 1998-11-18 | 三井化学株式会社 | オレフィン重合用固体触媒の製造方法、オレフィン重合用固体触媒およびオレフィンの重合方法 |
JPH04218000A (ja) | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
JP3051145B2 (ja) | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
CH686212A5 (de) | 1992-03-07 | 1996-02-15 | Buehler Ag Geb | Verfahren und Vorrichtung zur Manipulation und Portionieren von langen Teigwaren. |
DE4118912C1 (zh) | 1991-06-08 | 1992-07-02 | Biotest Pharma Gmbh, 6072 Dreieich, De | |
EP0536447A1 (en) | 1991-10-11 | 1993-04-14 | Koninklijke Emballage Industrie Van Leer B.V. | Exposure meter for use with induction heat sealing of containers |
US5968502A (en) | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
PT101031B (pt) | 1991-11-05 | 2002-07-31 | Transkaryotic Therapies Inc | Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
ATE225801T1 (de) * | 1992-07-13 | 2002-10-15 | Bionebraska Inc | Verfahren zur modifizierung rekombinanter polypeptide |
US5264555A (en) | 1992-07-14 | 1993-11-23 | Enzon, Inc. | Process for hemoglobin extraction and purification |
TW402639B (en) | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
US5437989A (en) * | 1992-12-30 | 1995-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Alcohol/aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans DSM 4025 FERM BP-3812 |
US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
IL118201A (en) * | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
DE19535571A1 (de) | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten |
TWI240627B (en) * | 1996-04-26 | 2005-10-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Erythropoietin solution preparation |
EP0885613A1 (de) | 1997-06-21 | 1998-12-23 | Roche Diagnostics GmbH | Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin |
WO1998058661A1 (en) | 1997-06-23 | 1998-12-30 | Novo Nordisk A/S | Use of fviia for the treatment of bleedings in patients with a normal blood clotting cascade and normal platelet function |
US7101838B2 (en) * | 1997-08-05 | 2006-09-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts |
DE19734293A1 (de) * | 1997-08-08 | 1999-02-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen |
BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
AU2092700A (en) | 1999-01-26 | 2000-08-18 | Neurosearch A/S | Novel potassium channels and genes encoding these potassium channels |
EA200400067A1 (ru) | 1999-01-29 | 2004-04-29 | Эмджен Инк. | Конъюгаты гксф |
ATE230778T1 (de) | 1999-05-10 | 2003-01-15 | Ciba Sc Holding Ag | Azofarbstoffe, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zum färben oder bedrucken von natürlichen oder synthetischen materialien |
DE19930177B4 (de) | 1999-06-30 | 2007-02-08 | Nikolai Vladimirovich Bovin | Intermolekular assoziierende Verbindungen und deren Verwendung |
JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
DE60122286T2 (de) * | 2000-02-11 | 2007-08-02 | Merck Patent Gmbh | Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
BRPI0110914B8 (pt) * | 2000-05-15 | 2021-05-25 | Hoffmann La Roche | 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica' |
CN100528235C (zh) * | 2000-12-20 | 2009-08-19 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 红细胞生成素共轭物 |
US6930086B2 (en) | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
US6797299B2 (en) | 2002-02-05 | 2004-09-28 | Great Wall Enterprise Co., Ltd. | Desalting method for nutritional supplements with animal protein |
SE526227C2 (sv) | 2002-05-15 | 2005-08-02 | North China Pharmaceutical Group | Metod för rening av rekombinant humant serumalbumin |
WO2004009627A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Cangene Corporation | Pegylated erythropoietic compounds |
AU2003258518B2 (en) * | 2002-07-24 | 2007-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polyalkylene glycol acid additives |
EP2332996B1 (en) | 2002-09-11 | 2014-10-15 | Genentech, Inc. | Purification of anti-Her2 antibodies |
US7610156B2 (en) * | 2003-03-31 | 2009-10-27 | Xencor, Inc. | Methods for rational pegylation of proteins |
US20050008649A1 (en) | 2003-06-02 | 2005-01-13 | University Of Miami | Chimeric molecules and methods of use |
SE0401951D0 (sv) | 2004-07-29 | 2004-07-29 | Amersham Biosciences Ab | Chromatography method |
MX2007007580A (es) * | 2004-12-22 | 2007-12-11 | Ambrx Inc | Hormona del crecimiento humana modificada. |
CA2608393A1 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Regeneration of a chromatography matrix |
TWI320788B (en) * | 2005-05-25 | 2010-02-21 | Hoffmann La Roche | Method for the purification of antibodies |
GB2428018B (en) | 2005-07-06 | 2010-07-28 | Acco Uk Ltd | Stapling device |
US20070072795A1 (en) | 2005-09-28 | 2007-03-29 | Anton Haselbeck | Treatment of neurodegenerative disorders |
PL1931704T3 (pl) | 2005-10-04 | 2011-06-30 | Zymogenetics L L C | Wytwarzanie i oczyszczanie IL-29 |
WO2008010061A2 (en) | 2006-07-17 | 2008-01-24 | Glenmark Pharmaceuticals S.A. | 3-azabicyclo [3.1.0] hexane vanilloid receptor ligands, pharmaceutical compositions containing them, and processes for their preparation |
CL2008002053A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-05-22 | Hoffmann La Roche | Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion. |
AR067536A1 (es) * | 2007-07-17 | 2009-10-14 | Hoffmann La Roche | Metodo para obtener una eritropoyetina mono-pegilada en una forma sustancialmente homogenea |
-
2008
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