TWI355490B

TWI355490B - Method for analyzing oligomeric proanthocyanidin (

Info

Publication number: TWI355490B
Application number: TW094125641A
Authority: TW
Inventors: Yuko Fukui; Koichi Nakahara
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2012-01-01
Also published as: TW200617386A; JP2006038763A; EP1774319A1; JP4659407B2; WO2006011640A8; SG145718A1; WO2006011640A1; CN1989407A; CA2575135A1; US8383413B2; EP1774319B1; CN102818865A; KR101166393B1; CA2575135C; US20080311662A1; KR20070039585A

Description

1355490 (1) 九、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明有關用以測定待分析之分析物或樣本中所含之低聚原花青素（黃烷-3-醇之η聚合物的混合物通稱：n22) '的方法，此等分析物或樣本係諸如天然物質、食物與飲 • 料、藥物及/或化妝品。胃| 【先前技術】由於原花青素（OPC)亦包含在葡萄酒中，其被認爲是法國吊詭現象（French Paradox)的有效成份之一（1995， Clin· Chim. Acta· 23 5，207-2 1 9)。已知抗氧化作用、改善周邊循環作用、改善血流效果、改善肝功能效果（2004， Japan Food Science，403，January Issue, 40-45)及抑制血小板凝集效果（Officially Published Platent Gazette 2003-527418)係原花青素的醫學益處。因此需要發展方便地定 % 質與定量評估此種活性成份OPC的方法。用以分析原花青素的習知方法包括以高效液相層析 ^ 術-質譜分析（LC-MS)進行之逆相 HPLC(2003, Biosci. ------

Biotechnol. Biochem., 67，（5)，1 1 40- 1 1 42) > 與以 LC-MS 進行之包括避免梯度的正常相HPLC(2003，J. Agrie. Food Chem·，51，75 1 3-752 1 )。不過，此二方法均需要MS偵測 I 一 _ — 器」i沒有一者被認爲是便利方法。此外，由於原花青素組份之黃烷-3-醇的立體異構現象，原花青素係以極多的立體異構物存在。對於可得到作爲標準物質的化合物有些 (2)1355490 限制析。的單逆相物的法。

。因此’除了某些已知化合物外，不可能進行定量分此外’自然界存在的原花青素所呈形式自黃烷-3-醇體至二聚物、三聚物’甚至到更高聚合度之/· η聚物> HP LC分析顯示黃烷-3-醇（單體）、該二聚物與該三聚尖峰重疊。如上述’目前沒有供定質定量評估OPC之便利方

【發定天豐富單體析包之新們由 3·醇產生 OPC 色譜烷-3 分離明內容】在此等狀況下’本發明人的注意力集中在發展可以測然物質、食物與飲料以及藥學產品中所含之n聚物的比率及含量的新穎分析方法需求上，且不會受到來自黃烷-3-醇的干擾。因此’本發明目的係提出用以分含在諸如天然物質、食物與飮料等分析物中的OPC 穎方法。本發明人進行各種硏究試圖解決前述問題。結果，他實驗與分子量方面明暸，（a)不論OPC中所含之黃院_ 的聚合度η數値爲何，由低聚原花青素（0PC)水解所的花青素數一定爲η/2。此發現使本發明人發展出分析的便利方法。本發明人另外發現（b)使用正常相柱之高效液相層析術可以輕易達成不同聚合度n之黃 -醇聚合物的分離作用，此係迄今以層析術仍然難以的物質。本發明方法使用上述事實（a)及/或事實（b)分析天然物 (3) 1355490 • * 質、食物與飲料、藥物及/或化妝品中的低聚原花青素 (OPC)數量，亦以便利方式分析OPC中之η聚合物的比例及/或含量。根據本發明方法，可以分析低聚原花青素（〇pc)fi γ * 會受到低聚原花青素中常包含之黃烷-3-醇單體的干擾。 w 此外，本發明方法可分析分析物中低聚原花青素的個別聚合物之黃烷-3 -醇聚合物，且不需要質譜儀。因此， ^ 本方法非常適於分析天然物質、食物與飮料、藥物及/或化妝品中之低聚原花青素。【實施方式】本發明方法之標的分析物係任意樣本，預期該等樣本包含黃烷-3-醇的η聚合物（n22)之混合物（下文稱爲低聚原花青素或OPC)，諸如天然物質（葡萄籽、羅望子、蘋果、樹皮、松樹皮衍生之多酚、茶葉、可可或其類似物及 % /或其處理產物（萃取液或其類似物））、食物與飮料、藥物及/或化妝品。低聚青素通常包括至少—種以下列通 •式表示之化合物： (4) 1355490 [化學式1 ]

CNIC

HO蜜=0£ 一"-親翻N8IW0 =¾ 截翻NOOIWI =c 截翻NsliHo =c δι

本發明目標特別在於上述低聚原花青素，其係包括結構式1中之原矢車菊素Bl、B2、B3與B4(其中n = 〇)、結構式2之原矢車菊素B5、B6、B7與B8(其中ηι = ι且 n2 = 2)，以及結構式1之原矢車菊素ci、C2與C4(其中 η=υ中至少一·者。上述Bl ' B2…C1、C2..·係個別化合物 (5) 1355490 之立體異構物。主要原矢車菊素' 〇pc與兒茶酸之結構如下圖式。 [化學式la]

PB1 (epi-4p，8-cate) PB2 (epi-4p,8-epi) (6) 1355490

U)測定OPC總數量根據本發明’不需要考慮分析物中低聚原花青素 (OPC)所含之黃烷-3-醇聚合物的種類與聚合度，且當分析 OPC水解時所產生之花青素時，可由其數値測定0pC總數量。本發明方法可以下列順序進行：

OPC之水解低聚原花青素的水解可在酸性條件下以熱解作用進行。較佳條件包括例如，使用酸/低碳醇混合物作爲酸性條件’該酸較佳係氫氯酸、硫酸或硝酸，該低碳醇較佳係丙醇、丁醇、戊醇及/或異戊醇。可以50至100°C，較佳係80至l〇〇t，更佳係85至95°C之溫度進行該熱解作 < 用’且反應時間爲3 0分鐘或以上，較佳係丨小時或以上。該酸之濃度可在0.1N至2N範圍做選擇，較佳係 0.4 N 至 1 N。進行水解時，若該分析物係包含低濃度低聚原花青素 -9- 1355490

之液態樣本’則可以適當方法’例如冷凍乾燥或乾燥或在減壓下固化至乾燥等方式濃縮該樣本。將該分析物（包括該濃縮物）溶解在上述酸/低碳醇混合物中’其濃度係〇 · 〇 1至1 %，較佳係〇. 〇 5至〇. 2 % (0.5至 2 mg/ml)，如此其可被水解。 * 該水解的具體實例如下：將包含原花青素的樣本（0.5 mg)溶解於玻璃試管中之1 ml 0·6Ν HC1/丁醇中，並使該 φ 溶液在90°C水浴中靜置2小時。完成反應之後，以UV-265(Shimadzu Corp.)測量 700 至 400 nm 的吸收光譜。551 nm處之吸光度確定該水解反應是否已完全進行以產生花青素。測量花青素數量可以任何眾所周知之方法測量因水解而產生之花青素數量，例如，以高效液相層析術或該吸光度方法輕易地進 ^ 行。該吸光度方法可以使用未經改變之水解產物進行，較佳係測量5 50至5 52 nm處之吸光度，於該波長下花青素 .顯示在可見光吸收光譜中之最大吸光度。在該波長下，可以忽視低聚原花青素水解而產生之花青素以外組份（例如，兒茶酸：最大吸光度270 nm)的干擾。該HPLC方法的實例具體說明如下：使用下列條件分析花青素 HPLC 色譜柱 YMC-ODS-A3 1 2 (6 mm X 150 mm, YMC)，1 ml/min之醋酸：甲醇：水=15:17.5:67.5的混合物，且色譜柱溫度爲40°C，且偵測A520 nm處之面積 -10- (8) 1355490 値。可使用氯化矢車菊素、氯化花翠素與氯化天竺葵色素 (均由Funakoshi銷售）作爲標準物質。此等標準物質的駐留時間各異，可選用其混合物或其中任一者作爲標準物質。至於該HP LC色譜柱，只要其係逆相樹脂，不只上述 C18爲底質樹脂，該C8-、C30-或聚合物爲底質C18樹脂均可使得分析爲類似的。

計算0PC的總數量爲了測定以上述分析之花青素數量爲基準之低聚原花青素的數量，進行下列程序：a)不論OPC所含之黃烷-3-醇聚合物的聚合度η數値爲何，水解一種η聚合物所產生之花青素數量係η/2。基於此一事實.，將水解所產生之花青素數量、乘以因數2.，因而可求得預^數量之分析物中的〇 P C總(數量，例如以m g計。或者，b)不論Ο P C所含之黃烷-3-醇聚合物的聚合度η數値爲何，OPC水解所產生之花青素的數量與OPC總數量成比例。以此事實爲基礎，將水解所產生之花青素數量與已知數量之〇PC標準物質水解所產生的花青素數量加以比較’並可藉由校正曲線或下列等式測得該分析物中之0 P C總數量（例如以m g計）及/或該分析物中之〇PC比例（a% ): 0PC總數量（mg)=(樣本之測得値/標準物質之測得値） X標準物質之數量（mg)(等式1) 分析物中之0PC比例（a%) = (0PC之總數量（mg)/分析物之數量）X 1〇〇 (等式2) -11 - 1355490 Ο) 若情況適當，所使用之標準物質可選自原矢車菊素 B1與原矢車菊素B2(二者均購自Funakoshi) (2)分析構成OPC的η聚合物各者本發明之特佳具體實施例中，除了或是分別測定上述

(1)中預定重量分析物中之OPC總數量，以高效液相層析術（HPLC)使OPC中之各種黃烷-3·醇聚合物比例變明確。藉由此舉，亦提供一種OPC分析之新穎方法，其測定預定數量之分析物中所含之不同聚合度η之個別聚合物的重量。該高效液相層析術中所使用之色譜柱較佳係正常相色譜柱，特佳係塡充矽膠爲底質之樹脂的正常相色譜柱。本發明人之硏究顯示，具有不同聚合度的原花青素（此實例中，亦包括η=1)可以層析術在正常相色譜柱上相當令人 % 滿意地分離成各成份。由黃烷-3-醇具有高極性之事實來判斷，目前尙未認爲可以正常相色譜柱分離彼等。此外， .本發明方法得以藉由使用紫外線偵測器進行測量，且不需要質譜偵測器。可以視需要決定高效液相層析術的條件。若具體說明此等條件，例如使用 Inertsil SIL (4.6 ηιηιφ X 150 mm， GL Sciences Inc.)作爲該色譜柱，洗提液係例如己烷、甲醇、四氫呋喃與甲酸之混合物。較佳情況係，以己烷：MeOH:THF:HCOOH = 45:40:14:1 進行等位洗提（約 1 -12- 1355490 do) ml/min)。即使使用己烷：Me〇H:THF:HCOOH = 40-60:3 0· 50:10-20:0.1-5，流速在0_3至1.5 ml/min之下仍可進行分析。該色譜柱溫度係10至60 °C，較佳係40 °C，且該偵測器較佳係光電二極體陣列偵測器，其係用於收集240至 400 nm之光譜數據。此係因爲OPC在2 80 nm處具有最大 • 吸光度，但是在以混合形式合倂有其他多酚的樣本情況中，位在2 80 nm以外之波長的不同尖峰構成該最大吸光 φ 度，因此使得可以區別該等其他多酚與OPC，並排除此等其他多酚。然而，在僅能使用單一波長偵測器的環境下，僅能做於A2 80 nm之吸光度的分析。以層析術分離之所有聚合物（所有聚合物包括二聚物或更高聚合度的聚合物）之尖峰總面積係在280 nm下具有最大吸光度之A280 nm尖峰的面積値總和。該色譜柱可爲 Shimpack PREP-SIL(Η) (4 · 6 mmφ x 3 00 mm，Shimadzu

C o r p.)或 S u p e r s h e r S i 6 0 (4 · 5 m m φ x 1 0 0 m m，M e r c k & C o.) 以及 Inertsil SIL (4.6 mm<(» x 150 mm，GL Science Inc.)。可由下列等式，以高效液相層析術獲得之尖峰面積爲基礎，計算構成OPC之各種η聚合物的比例（b%): b% = {尖峰面積（各種η聚合物）}/{總尖峰面積（所有聚合物）} X 1〇〇…（等式3) 以如此求得之各種聚合物比例與上述（1)求得之OPC 重量爲基礎，可以下列等式測得預定重量分析物中所含之 -13- (11) 1355490 各種n聚合物的重量，例如以mg計： η聚合物比 η聚合物之數量（mg) = OPC總數量（mg) x 例（b%)/l 〇〇 …（等式4) 。不過，本其次，本發明茲將以實施例更加詳細說明發明不受限於此等實施例。

實施例1 酸水解條件之硏究隨著時間觀察 flavangenol (松樹皮萃] 解。將 fIavangenoI(l mg)溶解在 1 ml 的 0.6 Ϊ 中，並在90t之熱水浴中加熱。經過20分鐘 14 0分鐘後，以每間隔2 0分鐘進行取樣。該醇稀釋成1:10，並測量於400至700 nm之可譜。所有樣本的最大吸光度係存在551 ηιη處 %結果係示於表1。 R物）的分 ί HCl/BuOH 之後，直到樣本係以丁見光吸收光。該測量的 -14- (12)1355490 表1 經酸分解之flavang.enol隨著時間的改變時間吸光度（551 nm) 20分鐘 0.732 40分鐘 0.796 60分鐘 0.819 80分鐘 0.830 1〇〇分鐘 0.867 120分鐘— 0.877 140分鐘 0.823

結果係，在酸分解期間該吸光度隨著時間過去而緩慢提高，在120分鐘內達到尖峰。基於此結果，後續實驗中將水解期間設在120分鐘（2小時）。

實施例2 於酸水解時製造及分析花青素將包含原花青素的樣本（0.5 mg)溶解在玻璃試管中之 1 ml 0.6N HC1/丁醇中，並使該溶液在90°C水浴中靜置2 小時。完成反應之後，以UV-265(Shimadzu Corp.)測量 700至400 nm的吸收光譜，且測得在551 nm處之吸光度。在下列條件下，對於完成該反應的溶液進行HPLC以分析花青素：色譜柱·· YMC-ODS-A3I2，6 mm(J> X 150 mm 移動相：CH3C00H:Me0H:H20 = 15:17.5:67.5 偵測：A520 nm(以PDA於400至600 nm處測量） -15- (13) 1355490 , · 自Funakoshi購買花翠素、矢車菊素與天竺葵色素作爲標準物質。洗提標準物質花翠素4.2分鐘，其λπΐ3χ爲 535 nm，洗提矢車菊素5·5分鐘，其Xmax爲525 nm，洗提天竺葵色素8_0分鐘’爲515 nm。對應於此等條件’將由該樣本獲得之酸水解產物之組份分析爲花翠 ‘ 素、矢車菊素與天竺葵色素。所分析的樣本係flavangenol、葡萄好多酣、茶多 ^ 酚、蘋果多酚與羅望子，並使用原矢車菊素Bl(Funakoshi) 作爲OPC之標準物質。結果示於表2與3。

表2以吸光度方法求得之OPC含量 A 5 5 0 nm OPC含量原矢車菊素B1 1.6905 10 0.0% flavangenol 0.8897 5 2.6 % 蘋果 0.3804 2 2.5 % 葡萄籽 0.7523 44.5% 羅望子 0.7641 4 5.2 % -16- (14)1355490 * 表3以HPLC方法求得之OPC含量樣本矢車菊素 OPC含量 ue/ml 原矢車菊素B1 _ 66.19 10 0.0% fl avangenol _ 29.45 4 4.5% 蘋果 28.64 4 3.3% 葡萄籽 13.48 2 0.4% 羅望子 27.8 1 4 2.0% 綠茶 1.84+ 1 .98 * 5.8% 矢車菊素 1.84 pg/ml +花翠素 1.98 μg/m1

實施例3以正常相HPLC分析兒茶酸、二聚物與三聚物在下列條件下，以正常相HPLC分析標準物質之兒茶酸與原花青素：

( + )-兒茶酸（Nacalai Tesque)、（-)-表兒茶酸（Wako Pure Chemical Industries)及原矢車菊素樣本（各爲0.1 mg) 各溶解於1 ml之移動相中，並經'由0.45 μιη之過濾器過濾該溶液，然後在下文所示之條件下進行HPLC。以下文提供之實施例5所述方法合成該三聚物。色譜柱：Inertsil SIL，4·6 πιηιφ X 150 mm 移動相：己院：MeOH:THF:HCO〇H = 45:40:14:1 偵測：A280 nm(以PDA於240至400 nm處測得）在此等條件下，洗提該單體（（ + )兒茶酸與（-)-表兒茶 -17- (15) 1355490 酸）2.9分鐘，洗提該二聚物3.6分鐘，洗提該三聚物4.3 分鐘。其層析譜如圖1所示。實施例4 以正常相HPLC進行分析在下示條件之下分析包含呈混合形式之兒茶酸與原花青素的樣本。

將包含原花青素的樣本（〗至2 mg)溶解於1 ml的移動相中，並經由0.45 μιη之過濾器過濾該溶液，然後在下列條件下進行Η P L C。使用之樣本係蘋果多酚、葡萄籽多酚、flavangenol 與羅望子。色譜柱：Inertsil SIL，4.6 ιηπιφ X 150 mm 移動相：己烷：MeOH:THF:HCOOH = 45:40:14:1 偵測：A28 0 nm(以PDA於240至400 nm處測得）作爲分析圖案的層析譜如圖2所示。此等圖案中，符號X表示在280 nm處不具最大吸光度且與〇PC不同之多酚。以等式c% = a% X b%測定各樣本中之二聚物與三聚物濃度。結果示於表4。 -18- (16) 1355490 . · 表4二聚物與三聚物之含量 OPC純度 A280nm比率含量比率 a% b% C% flavangenol 44.5% 二聚物 55.4% 24.7% 44.5% 三聚物 32.0% 14.2% 蘋果多酚 20.4% 二聚物 31.6% 6.4% 20.4% 三聚物 23.5% 4.8% 葡萄籽多酚 42.0% 二聚物 12.5% 5.3% 42.0% 三聚物 5.8% 2.4% 羅望子 43.3% 二聚物 22.8% 9.9% 43.3% 三聚物 23.2% 10.0%

實施例5 OPC之合成根據論文（1981，J.C.S. Perkin I. 1235-1 245)以下列方式進行OPC之合成。將（ + )-花旗松素（Taxif〇lin)(5 00 mg)溶解於之乙醇中，並添力口 200 mg之NaBH4。然後，添力口 lg之（+ ) 一兒茶酸並溶解之。接著添加HC1，並攪拌該混合物1 + 時。藉由逆相HPLC純化該反應產物，製得三聚物° 【圖式簡單說明】 3 -醇圖1係顯示以正常相HPLC分析兒茶酸與黃踩^ 之二聚物與三聚物的結果之圖。圖2係顯示以正常相HPLC分析其中混有兒茶酸_ — 花青素之分析物的結果之圖。 -19-

Claims

1355490 月2/曰修jL本j ϋ3 第094 1 25 64 1號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國100年9月29日修正十、申請專利範圍 1·—種用以測定預定重量之分析物中所含之黃烷- 3-醇的η聚合物（η22)的混合物總重之方法（下文將該混合物稱爲低聚原花青素或OPC)，

C V '該方法包括測量該分析物中由OPC水解所產生之花青素的重量，及將所測得之花青素重量乘以因數2，求得該分析物中之〇 P C總重，此係以不論OPC中所含且聚合度η數値不同之η聚合物的重量比率爲何，由—種η聚合物水解所產生之花青素數量係η/2之事實爲基礎。 2· 一種用以測定預定重量分析物中所含之低聚原花青素（OPC)的總重之方法，

該方法包括測量該分析物中由OPC水解所產生之花青素的重量，獨立測量由已知重量之OPC標準物質水解所產生之花青素重量，& 藉由校正曲線或下列等式，測定該分析物中之OPC 總重及/或該分析物中.之OPC重量比率（a%) 此係以不論OPC中所含且聚合度η數値不同之η聚合物的重量比率爲何，由一種η聚合物水解所產生之花青素的數量係η/2之事實爲基礎： 1355490 OPC總重=(樣本的測量値/標準物質的測量數値）χ標準物質之重量（等式1) 分析物中之0PC重量比率（a%) = (0PC總重/分析物總重）xl〇〇 (等式2)。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該標準物質係原矢車菊素B1。 4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其 Q 中該水解作用係於酸性條件下藉由熱分解進行。 5 如申請專利範圍第4項之方法，其中該酸性條件係酸與低級醇之—混合物。- -_ ----------------------- 6.如申請專利範圍第4項之方法，其中該酸係氫氯酸、硫酸或硝酸。 -7·—..如FH請惠_刮.節IWI策5 夕_卞# , S dn 1¾ fff硏醉仔丙醇、丁醇、戊醇及/或異戊醇》 8. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該熱分解係〇在80至100°C之溫度下進行，反應時間爲30分鐘或30 分鐘以上。 9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該熱分解係在8 5至9 5 °C之溫度下進行，反應時間爲1小時或1小時以上。 10. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該花青素重量的測量係藉由高效液相層析術及/或吸光度方法進行。 11. 如申請專利範圍第10項之方法’其中該吸光度 -2 - 135.5490 方法係藉由測量在5 50至5 52 nm之吸光度進行，該波長係花青素在可見光吸收光譜中顯示最大吸光度之波長。 12. —種用以分析一分析物中所含之低聚原花青素 (OPC)中黃烷-3-醇之不同聚合度n之n聚合物的方法，其包括下列步驟： a) 以如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法測定該預定重量之分析物中所含之OPC的總重：

b) 與步驟a)獨立，以高效液相層析術（HPLC)分析該分析物，分離出OPC中所含之不同聚合度η的個別n聚合物，並測定所有η聚合物之個別η聚合物重量的定量比例；以及 c )由a)與b)的結果測定該分析物中每種η聚合物之重量。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該高效液相層析術中所使用之色譜柱係正常相色譜柱。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該正常相色譜柱中所塡充之樹脂係矽膠爲底質樹脂。 15. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該高效液相層析術中，洗提液係己烷、甲醇、四氫呋喃與甲酸之混合物，該混合物之混合比係己烷/甲醇/四氫呋喃/甲酸=40-60:3 0-50:10-20:0.1 -5，較佳情況係，在等位洗提中之混合比爲45:40:1 4:1 ’色譜柱溫度係10至60 °C，並測量於 280 nm之吸光度。 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中該高效液 -3- 1355490 : • \ 相層析術中，洗提液係己烷、甲醇、四氫呋喃與甲酸之混合物’該混合物之混合比係己烷/甲醇/四氫呋喃7甲酸= 45:40:14:1，色譜柱溫度係10至60°C，並測量於280 nm 之吸光度。 17.如申請專利範圍第12至16項中任一項之方法’ 其中由下列以高效液相層析術所獲得之尖峰面積爲基礎之等式計算每種η聚合物的定量比例（b%): 〇〇

b% = {尖峰面積（每種η聚合物）}/{總尖峰面積（所有聚合物）} X 1 00(等式3)。 1 8 如申請-專利範圍第1-2項之方法，其中步驟-( c )中-每種η聚合物的重量係基於以（a)測得之OPC重量與以（b) 所測得之各種η聚合物之比例，依照下列等式測定： -η_聚-合—物.之-數-量（m.g-)_Ξ__OJB..C總_重_( m g_).xjj_聚-合—物比例一 (b%)/100(等式 4)。 19.如申請專利範圍第1、2或12項之方法，其中該待分析之低聚原花青素包含至少一種以下列通式表示之化合物： -4- 1355490 . ·· C

[化學式1 ] C τ— ZISS

20.如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該低聚原花青素係包含結構式1中η = 0之原矢車菊素B1、B2、 B3與B4、結構式2中nl = 1且n2 = 0之原矢車菊素 B5、B6、B7與B8，及結構式1中n = 1之原矢車菊素 Cl、C2與C4中至少一者之原花青素。 -5- 1355490 21.如申請專利範圍第1、2或12項之方法，其中該分析物係含有OPC之天然物質及/或其處理產物 '食物或飲料' 藥物及/或化妝品》 22·如申請專利範圍第21項之方法，其中該天然物質係選自葡萄籽、羅望子、蘋果、樹皮、松樹皮衍生之多酚、茶葉及可可。 23.如申請專利範圍第21項之方法，其中該處理產 Q 物爲萃取物》 24·如申請專利範圍第1、2或12項之方法，若該分析物係液體，其另外包括冷凍乾燥該分拆物或在減壓下將該分析物固化至乾燥狀態，然後粉末化之步驟。 25.如申請專利範圍第24項之方法，其中該液體係 _選自軟性^料或提神飮料、茶飮料及酒精飮料。_ 〇 135549.0 第094125641號專利申請案圖式修正本民國100年9月29日修正 758245 告本 IQQ舷擗掛氷113

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