TWI309238B - Protein and nucleic acid for glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (gfd), alcohol dehydrogenase and s-nitrosoglutathione reductase from antrodia camphorata, manufacturing method and uses therefor - Google Patents

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1309238 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為： (二) 本代表圖之元件符賴單說明： 示發明特*的化學式 八本案若S^，請揭示最能頻 九、發明說明： ⑽以顯 【發明所屬之技術領域】 胺基酸及其核親。核 宿主細胞及製造方法， 本發明係關於一種樟芝GFD之蛋白質、 苷酸及可供製造該蛋白質之表現載體、 與含有該蛋白質之醫藥組成物。 【先前技術】 棒芝（Antrodiac鄉Aorata)又名牛樟足、牛棒兹報導指出 對肝腫瘤及子宮頸腫瘤的治療非常有效（1，弘+曰 J囚能在台灣 牛樟樹生長，故民間視樟芝為珍寳。因樟芝是菇類唯—能代謝牛 樟樹中大量抑菌性黃樟素而能生長的㈣，因有於他種兹類 的生理機能。樟芝在民間傳統療法上最主要應用於食品中毒，腹 瀉、下腹部疼痛、皮膚癢及肝癌等症狀《在眾多具有生理活性的 成分中，抗氧化物特別受到重視Π)，因此針對其抗氧化成分， 其抗氧化成分的分析，在深層培養中被詳細的研究，指出在樟芝 菌絲體的萃取液中，三帖類對於脂質的過氧化作用具有抑制的的 功能’三帖類與多酚化合物對於清除氧自由基扮演極重要的角 色。由於樟芝中含有大量且成分複雜的抗氧化成分，因此一系列 藉由提升抗氧化效果而達到保護正常細胞或毒殺癌化細胞的機 轉’也陸續做了研究（2-6)。以樟芝菌絲體甲醇粹取物在低劑量 下，對肝腫瘤細胞株Hep G2有很強的細胞毒殺作用，其次為水 1309238

萃取部分，但發酵濾液則幾乎不具毒殺性。以C57BL/6* bALB/c 兩種小鼠進行試驗，結過顯示鼠血中TNF-α、IFN-t"和IL-2皆 明顯增加，而IL-4和IL-10則與控制組無明顯差異。此外，樟 芝菌絲體發酵過渡液藉由抗氧化物與清馀自由基的能力，有保護 其肝功能正常的效果。透過樟芝菌絲體萃取液的處理，可避免人 類正常的紅jk球細胞中的GSH與ATP的消耗，並對白血病 leukimia HL-60細胞產生細胞毒性，顯示樟芝菌絲.體可能具有 抗氧化物與抑制腫瘤的效應。樟芝對於肝功能的疾病療效十分良 好，其多醣體對於β型肝炎病毒有明顯的抑制效果。在已發表的 菇類多醣體中，樟芝為第一個被證實其多醣體對於Β型肝炎病毒 有直接抑制效果的物種。但樟芝子實體之研究少有報告，其療效 應高於菌絲體，故以新鮮樟芝子實體為材料。

Glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GFD) ’ 是屬於 alcohol dehydrogenase3(ADH3)，主要是分解甲 輕（formaldehyde)、酒儉及還原被硝基化之物 (S-nitrososylated proteins)，對生物體解毒維持健康扮演重 要角色（7-15)。 GFD可防止甲搭和蛋白質及核酸等反應而傷害到生物体在 植物亦能由GFD而代謝甲醛⑻，有很多生理功能其中一種 是信息傳遞，其能傳遞信息是靠蛋白質進行硝基化 (S-nitrosoylation)與否而達到調控代謝性酵素、結構性蛋白或轉 譯因子。近年的研究報告發現咖，亦具有還原硝基化物 (s-nitr0S0Sylati0n)，特別是 s—nitr〇s〇giutath〇ne(GsN〇)， 1309238 因此可協助守護生物免受nitrosative stress (11)，在真菌 (fungus)中尚未有報告，特別是台灣的樟芝。GDF亦能代謝較高 濃度的酒精（7)，故來自台灣的樟芝GFD，兼具三種去毒功能（去 除曱醛、酒精及還原被硝基化之物），是第一次發現。 GFD相關基因常因來源不同使其蛋白質的穩定性和活性不 同，但樟芝子實體GFD基因產物所知甚少，即使其它生物，亦是 近幾年的報告，因此值得將樟芝子實體GFD基因作有系統的研 究。 以採自鹿谷之新鮮樟芝子實體為材料，抽取RNA，合成cDNA。 藉由EST序列資訊設計引子，用樟芝子實體cDNA為模板，以PCR 增生GFD MA並進行篩選，篩得樟芝子實體GFD之片段DNA，再 進行YRACE和TRACE，最後得到全長GFD之cDNA，繼之與表現 型載体連接，植入酵母菌進行大量生產並純化。GFD基因產物為 蛋白質，分子量40 kDa，而如何植入真核細胞是另一大考驗， 因此在N端分別接上幾個胺酸（Tat)，則Tat-GFD產物將容易植 入真核細胞以發揮其功能。值得應用於健康食品，或添加在燙 傷藥膏中以分解NO造成之傷害。 【發明内容】 本發明係提供一種樟芝GFD之蛋白質與核苷酸，及製造該蛋 白質之載體、宿主細胞及方法，與含該蛋白質之組成物。 本發明係由新鮮樟芝子實體之選殖並選擇表現GFD。該蛋 白可去除甲醛、酒精及還原被硝基化之物並藉此值得應用於健 康食品，或添加在烫傷藥膏中。 1309238 本發明提供一種分離核苷酸分子，包含編碼具SEQ ID N0:1 所示樟芝GFD胺基酸序列之核苷酸序列。本文所使用之語詞"核苦 酸分子"意指包括DNA分子（如cDNA或基因組DNA)、RNA分子（如 mRNA)、使用核苷酸同類物所產生的DNA或RNA同類物及其衍生 物、片段及同源物。核苷酸分子可為單股或雙股’但以雙股DNA 較佳。本文所使用之語詞"分離核苷酸"分子意為分離自存於天然 來源之其他核苷酸者。 根據本發明，核苷酸可僅包含編碼樟芝GFD生物活性之部分片 段。本文所使用之語詞”片段"意指編碼仍具生物活性之樟芝GFD 片段之核苷酸序列部分。 根據本發明之一具體實施例中，本發明分離核苷酸分子具有 SEQ ID N0:1之核苷酸序列或其簡併序列（擺動假說，Wobble hypothesis)。在另一具體實施例，本發明分離核苷酸分子包括 如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列，其全長為1373，轉譯區有1134 bp，可以轉譯出378個胺基酸。本發明核苷酸分子與其他來源的 序列比較，有高的相似性。本發明核酸所編碼之樟芝GFD可分解 曱醛、酒精及還原被硝基化之物，提供了生物體抵抗毒性（甲 醛、酒精及N0)所帶來的破壞與傷害。如熟習該項技術者所認同 者，基於基因密碼的簡併性，可製得許多編碼本發明樟芝GFD蛋 白質之核苷酸。因此，針對一已被鑑定之特定胺基酸序列，熟習 該項技術者可在不改變樟芝GFD蛋白質之胺基酸序列之情況下， 藉簡單修飾一或多個密碼而製出各種不同核苷酸。 根據本發明，編碼樟芝GFD蛋白質之核苷酸可使用標準雜交及 選殖技術來分離。特別的，本發明核苷酸可使用標準選殖及篩選 技術’自新鮮樟芝子實體之cDNA庫分離出來。本發明核苷酸之放 1309238 大可根據PCR放大技術，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板及 適當的寡核苷酸引子而得。經放大之核苷酸可選殖至適當載體並 藉DNA序列分析來鑑定。 表現載體及宿主系統 本發明亦提供一表現載體，包含本發明之核苷酸。本發明表 現載體包含一編碼如SEQ ID N0:1所示之蛋白質核苷酸序列。 本文所使用之語詞"表現載體"係可直接表現連接至其上之基 因梭苷酸分子。載體為可自行複製及表現連接於其上之核苷酸 者。一般言之，可用於重組DNA技術之表現載體通常為"載體”形 式，一般為環狀雙股之MA，在其為載體形式時並未融合至染色 體。 本發明編碼G F D蛋白質或其功能相似物之核苷酸序列可*** 適當之表現載體中以表現具生物活性之GFD蛋白質。該表現載體 需含有***編碼序列之轉錄及轉譯等必要元件。根據本發明，熟 習技藝人士可利用熟知之方法構築含有編碼GFD蛋白質及適當轉 錄及轉譯控制元件之表現載體。此等方法包括體外重組MA技 術5合成技術及體内基因重組技術等。 本發明另一目的係提供包含表現載體之宿主細胞，該載體包 含編碼GFD蛋白質之核苷酸序列。本文所使用之語詞”宿主細胞" 為可經載體（如質體）感染之宿主細胞。根據本發明，許多宿主系 統可用於包含且表現編碼GFD蛋白質之序列。此等宿主系統包括 但不限於微生物（如以重組質體或表現載體轉形之細菌）、酵母菌 (如以酵母菌表現載體轉形之酵母菌）、或動物細胞系統。本發明 之宿主細胞為大腸桿菌及酵母菌。本發明將GFD蛋白質之cDNA在 大腸桿菌或酵母菌系統表現，確實能表現出具有活性的重組蛋白 1309238 質，經親和性管柱進行快速純化後，獲得純的gfd蛋白質。 根據本發明之一具體實施例：本發明樟芝GFD係以pYEX-Sl 為表現型載體之構築；設計N端含限制酶及N9RI片段（5，GGAATTCG ATG TCC ACA GTA GGA AAA CC 3’）與C端引子含6 His-tag and ibo RI (5, GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG AGA CAT GTC GAC GAC ACA GC 3，），以GFD蛋白質之cDNA為模板與引子進行PCR得到 之DNA。將該DNA送入大腸桿菌中進行篩選，抽取之質體DNA係使 用限制酶及τσ RI處理，所得片段與相同限制酶處理過之pYEX-S 1 接合，送入酵母菌yeast ’並以介質YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)在30°C 下培養5 D (170 rpm)，打破菌 體’以10, OOOxg離心5 min，收集上清液後’經親和性管柱進行 快速純化後。電泳後作蛋白質染色，經10% SDS-PAGE，於40 kDa 處可看到明顯色帶，此即為GFD蛋白質。為方便GFD蛋白質穿過細 胞膜’可在前端接上含有九個胺基酸之Tat，並將接上Tat之GFD 蛋白質DNA送入酵母菌中進行表現。 組成物 本發明亦包括一種醫藥組成物，包含本發明之GFD。除本發明 蛋白質外，該醫藥組成物可含有適當之醫藥上可接受之載劑。 本發明之醫藥組成物可以本技藝已知之方式（例如藉常用方 法）製造，該常用方法包括混合、溶解、製粒、製錠、磨細、乳 化、包膠、包陷及/或冷凍乾燥等步驟。 本發明之醫藥組成物可藉任何途徑投藥，此等途徑包括（但不 限於）口服、靜脈内、肌内、動脈内、穿皮、皮下、腹膜腔内、 鼻内或腸道投與。 皇J性 1309238 本發明樟之來源之樟芝GFD蛋白f，其活性皆比其來源之㈣ 蛋白質為t。因此本發明樟芝來源之樟^gfd蛋白質在醫學、食 品、學術研究等方面更具利用價值及貢獻。 t發明KiFD蛋白質可分解甲链、酒精及還原被石肖基化之 物，提供生物體抵抗（甲輕、酒精及N〇)所帶來的破壞與傷害。本 發明GFD蛋白質應用於健康食品，添加於烫傷藥膏可加速傷口 癒合，在整形外科之皮膚移植及人造皮移植應用中，可藉由gfd ^白質防止移植皮膚之組織壞死’進而加速移植皮膚之缝合。 【實施方式】 下列實例進一步說明本發明，但非欲限制本發明之範圍， 任何熟悉該項技術者所知之替代和改變，均仍涵蓋於本發明 之範圍中’而不偏離本發明之精神和目的。 搜乏子實體總RNA之拙肽 取4 g樟芝子實體以液態氪急速冷凍，於研妹中磨成粉末後取 出’馬上與20 mL的溶解緩衝液lysis buffer(Novalgen’s Straight’s mRNA Isolation System)於30 mL 離心管中混合， 置於4°C下5 min後以9, OOOxg在4°C離心15 min，離心後取上面水 溶液層，大約有20 mL。將水溶液吸至50 mL falcon中加入3 mg magnetight particles 混勻，置於4 °C下以磁座需住 magnetight particles，以 1.5 mL wash buffer 洗蘇三次，在 60°〇以0.5‘水洗離即為抓人（10叩），加入0.1¥〇1.3 113〇(11111〇 acetatp 和 0.8 vol.isopropanol 置於-75°C 20 min，隨後以 12, 000 rpm在4°C下離心15 min ’以70% ethanol共清洗三次’乾 11 '1309238 燥後儲存於-70°C備用。 樟芝 5’-RACE-Ready cDNA與 3’-RACE-Ready cMA之合成： Based on BD Biosciences Clontech5s SMART RACE cDNA Amplification Kit. 5’-RACE-Ready cDNA : 將下列所有反應溶液加入於1. 5 mL的微量試管中並在冰上完 成：

mRNA (ug/uL) (1 ug) 1 uL

5’-CDS primer 1 uL

Smart II A Oligo 1 uL.

H20 2 uL

總計 5 uL

3 5-RACE-Ready cDNA: mRNA (ug/uL) (1 ug) 1 uL

3 ’ - CD S primerA 1 uL

H2 〇 3 uL

總計 5 uL 均勻混合反應溶液，並稍微離心後置於72°C恆溫水浴槽中2 min。作用後將離心管置於冰上2 min。加入2uL 5X first-strand buffer > 1 uL 20 mM DTT * 1 uL 10 mM dNTP mix > 1 uL powerscript reverse transcriptase 於42°C 恆溫水浴槽中 1. 5 h。後加入200 uL tricine-EDTA buffer於72°C恆溫水浴槽中7 min後儲存於 12 *1309238 -70°C備用。 樟芝GFD基因的選殖 彖 藉由樟芝EST序列資訊設計引子，用樟芝5’-RACE-ReadycDNA 與3’-RACE-Ready cDNA為模板，以PCR增生GFD相關基因DNA並進 行篩選，得樟芝GFD基因之片段DNA，再進行YRACE與3’-RACE，最 後得到全長GFD之cDNA。 GFD cDNA之表現 經由PCR、膠體之製備及電泳、次選殖、在酵母菌表現型載體 (pYEX-Sl)之構築、及蛋白質的誘發與樣品的電泳分析等程式達 成。 PCR程式 將下列反應試料加至0. 5mL微量試管中，依序加入下列試劑：

模板 ΜΑ 0. 2 ug 5’ -正義引子 10. pno 1 3'-反義引子 10 p m o 1 OX Taq DNA聚合酶緩衝液 5 uL 15 mM MgCh 6uL Taq DNA 聚合酶 2.5 units 10 mM dNTP 1.5 uL 加入無菌水至總計 50 uL 加入50~100 uL礦物油，進行25 cycles of PCR(94 °Cfor 30 13 *1309238 min, 50°Cfor 3 min, 72°Cfor 1.5 min) PCR反應結束後，可得 DM產物，經回收後可用來進行下一步的實驗，例如進行DNA重 組，分析其序列θ 膠體之製備及電泳 所用之膠體為1. 0%瓊脂醣膠，倒入IX TAE缓衝液以能完 全覆蓋住膠。取15 uL PCR產物，加上其1/10體積的追蹤染劑， 注入孔中，另外也注入6 uL之1 kb DNA標記用來瞭解DM樣品的 大小，接著以100伏特的電壓進行電泳，待DNA染料移動至膠之 2/3處，即可中止電泳。將完成泳之膠以溴乙唆（EtBr)染色15 min 後，放入水中退染，之後即可置於紫外光源箱下觀察。 次選殖 1. PCR產物輿載體接合輿宿主細胞韓形 取1 uL PCR產物，加入1 uL鹽溶液，1 uL的無菌水與0.5 uL的 pCR4之後，於室溫下反應5 min以進行連接。取前述已接合好妁 重組DNA，加入18 uL TOPO 10活性細胞中，置於冰上30 min，後 置於42°0的水浴中3〇56(：進行熱休克後立即置於冰上2 111丨11，加入 150 uL SOC培養基，在37°C下振盪培養60 min，將其均勻塗布 在含有50ug/mL抗生素ampicillin的LB瓊脂聽的培養皿，在37 °C培養12-16 h之後，挑選50-80個單一菌株於新的ampicillin 之LB瓊脂醣上，待進一步實驗。 2. 菌體之轉印與放射性探針之製備 1309238 將轉印紙覆於培養皿表面，並以針頭紮洞作定位之後，取出 轉印紙，此時培養m上的菌落轉印到轉印紙上，轉印工作完成。 準備一淺盤，上覆3 mm濾紙，倒入變性溶液（0. 5 M NaoH，1. 5 Μ NaCl)，倒入量以能充分濕潤3 mm濾紙，將轉印紙以吸附菌面朝 上，放在濕潤之濾紙之上7 min，接著取另一淺盤以中和溶液（1 MTris-HCl, 1 M NaCl，pH7. 5)充分濕潤濾、紙之上7 min。重覆中 和液步驟之後，將轉印紙置於烘箱中，以60-70°C烘乾。之後， 將轉印紙放於紫外交聯儀機器中，進行網狀連結15 sec，待進一 步以放射性探針來篩選。 放射性探針之製備

寡核苦酸（3 pmole/uL) 0· 5 uL 10X T4聚核普酸酶缓衝液 3. 0 uL 聚核普酸酶 （12 unit) 1. 5 uL [r-32p] ATP 3. 5 uL H2O 21. 5 uL 總計 30. 0 uL 混合均勻，置於37°C下反應30 min後。即完成放射性探針之 製備，將放射性探針加入雜交溶液中，用來篩選所要的目標基因。 3.目標基因DNA之選殖 取出前述之轉印紙，加入以1.5X SSC及0.1% SDS配製成的洗 劑，在44°C下震搖30 mi η，倒掉洗劑，加入不含放射性探針的雜 15 1309238 交溶液（5X SSC，5X Denhardt，0.5% SDS，100 ug/mL sperm DNA)，此一過程稱之為預雜交。倒出雜交溶液，加入含有放射性 探針之雜交溶液，置於44°C水浴震搖16 h以上，倒出含有放射性 探針之雜交溶液’用前述洗劑，在44°C震搖15 min，重覆此一步 驟2-4次。壓乾轉印紙，進行自動放射顯影，沖片後，挑出正反 應株。 4.細菌晳體之純化與檢視 挑出正反應株養於含ampicillin(50 ug/mL)之LB，於37°C下 培養6-8 h。以10, 〇〇〇xg離心3min，取得菌體沈澱物，加入200 uL 再懸浮溶液（50 mM Tris，pH 7. 5, 10 mM EDTA)振盪，使菌體懸 浮狀態。加入200 uL溶裂液（0. 2 M NaOH, 1% SDS)，輕輕的混勻’ 使菌體能被完全溶掉，質體能溶離出來。加入200 uL中和液（1.32 Μ醋酸卸），而後以12, OOOxg離心10 min，取上清液，注於0.5 mL 離心管（含DNA吸附膜），以12, 000xg離心lmin，使DNA能吸附於 膜上，之後加入mL的洗滌溶液，以12, 000xg離心2 min後。 再以12, 000xg離心2 min以去除殘留的酒精，最後加入50 uL的熱 水（60°C )靜置30 sec後，以12, 000xg離心2 min，收集離心下來 的質體DNA作質體之限制反應與電泳分析。即取MA以及適量的 限制酶，加上10 X reactin缓衡液，最後加無菌水使體積為 uL，在適當的溫度下反應2 h，以1%瓊脂醣膠電泳分析，以確定 嵌^入DNA的大小。 16 1309238 5.序列之判譫 利用ABI PRISM 377-96 DNA定序儀進行自動定序。 在酵母菌表現裀盤體之構築：

表現載體為pYEX-Sl，GFD係以pYEX-Sl為表現型載體之構築； 設計N端含限制酶及^ RI片段（5，GGAATTCG ATG TCC ACA GTA GGA AAA CC)與C端引子含6 His-tag and 价σ RI (5’ GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG AGA CAT GTC GAC GAC ACA GC 3，），以GFD 蛋白質之cDNA為模板與引子進行PCR得到之DNA。將該DNA送入大 腸桿菌中進行篩選，抽取之質體DNA係使用限制酶及RI處理， 所得片段與相同限制酶處理過之pYEX-Sl接合，送入yeast，並以 YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)在

30°C下培養5 D (170 rpm)，打破菌體’以i〇,〇〇〇xg離心5 min ’ 收集上清液後，經親和性管柱進行快速純化後。電泳後作蛋白質 染色，經10%SDS-PAGE，於40 kDa處可看到明顯色帶，此即為GFD 蛋白質。更佳的，為方便GFD蛋白質穿過細胞膜，可在前端接上 含有九個胺基酸之Tat，並將接上Tat之GFD蛋白質DNA送入酵母 菌中進行表現。 將其轉殖入酵母菌[trp一ada…ura—]作為表現宿主。pYEX-Sl (皆先以及RI處理連接），取前述已接合好的重組洲人，加入酵 母菌活性細胞中’篩選挑出正反應株以進行蛋白質表現。 在酵母菌棘形 17 1309238 1.製備轉形細， ⑴方法1 :選取單-菌落並完全的在YPD培養皿上劃線，在 28-32。〇培養8〜96h，從細菌培養基表層刮取菌，加入Yeastern 商品scos混合液至no a使試管中細菌濃度達5 χΐ〇7個/試 管。 ⑵方法2 :選取單-新鮮菌落加入w〇此γρ])培養液中於 28〜32 t：搖晃培養20, he將培養液加人ι〇 ι〇〇虹則培 養液中靜置8〜24h ’以2000 x g離心1〇山，去掉上清夜，以 無菌水清洗兩次去除殘餘的YPD培養液，將沈澱物混合擾摔入 110-115 μι SCOS混合液直至細菌濃度達5 χ1〇7個/試管。 2.製備SCOS混釦饬 在1. 5 mL試管中力认100 A SC0S緩衝夜，加入5 A i Μ術 (保存於-2G，加人5 ss DNA (保存於—抓），加入質 體DNA (不超過5μΙ〇。 3. 製備乾式遠擇性斑基m 完全乾燥的培養皿在Yeastern，s沉卯轉形系統中可提供良好 的轉形反應，因此建議在將培養皿叠置前先將無蓋培養I至於無 菌操作臺内lh左右，待其完全乾燥。 4. SCOS轉里 (1)將scos混合液與酵母菌懸浮細胞混合攪拌製成sc〇s轉形混 合液。 18 1309238 (2) 將試管加蓋，置於45. 5°C 10〜60 min。 (3) 將轉形混合液直接塗敷於乾燥培養皿[YNBD (1_ 7 g yeast nitrogen base, 5 g ammonium sulfate, 20 g glucose, 15 g agarose in 1 L water) containing 20 ug Trp/mL]，此程式 20 sec内完成，將培養皿置於28-32 °C2~4天。 蛋白質表現 取單_;*菌落（1〜2 111111)於10瓜]^¥1^人.1'11)(1.7 8 76381；1111：1'〇忌611 base, 5 g asparagine, 20 g glucose in one L) containing 20 ug Trp/mL培養液，此容器使用125 mL燒瓶，並於30 °C培養箱中 以250 rpm震盪培養過夜，次日再加入5 mL培養液使ODeoo達到〇丄 時並繼續以30 °C、250 rpm震盪培養72 h後，再加入10 mL γΡΐ) 並繼續以30°C、250 rpm震盥培養48 h。 將所有菌液以5000xg、4°C離心10 min，收取菌加入〇 5 〇· •呂坡 璃球及2 niL PBS(pH8. 0)，打破菌體，以10, 〇〇〇xg離心5 min , "故 集上清液後，再加入2 mL緩衝液，重覆此一萃取步驟，最後用2虹 緩衝液再萃取一次，一共收集6 mL上清液，此為粗蛋白質樣品 待進一步的電泳，電泳之膠體大小為1〇 cmx8cmx〇. 75匪。 1.電泳勝體的匍借 將鋁板與玻板拭淨後，和隔條組合好，放入製膠模型. '’再 依下表所列之用量配製膠體溶液：分離凝膠，混勻並注入模型 中，再加入適當的水壓平，約經過1 h，膠體形成後，再注入堆 19 1309238 積凝膠，並插上槽梳，待成膠即可。

取適量樣品與樣品載入缓衝液混勻後注入膠體孔洞中，以100 伏特電壓進行電泳，native-PAGE約需65 min，SDS-PAGE約需130 min後中止電泳，取下膠體，進行Coomassie blue染色：將膠體 浸於染劑中，均勻搖動30 min，移去染劑，用水清洗一次後，加 入退染劑，退染12 h即可。 UFD之純化 因 C 端帶有 6 個 His，以 Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharose superflow來進行親和性管柱純化如下：3 mL的樹脂 管柱，用5 vol.的PBS平衡，之後將6 mL的粗蛋白質樣品注入並 收集流下來的液體約6 mL。再以3 vol. PBS含20 mM imidazole 洗管柱，繼之以1.5 mL PBS含100 mM imidazole沖提，共收集6 個部分，其中有2値部分共3 mL有收集到蛋白貧，因為含有 imidazole，所以需經過透析除去。 透析液：將樣品約3 mL裝入透析膜中，以透析夾夾好，放入 含200 mL 1/3 PBScontaining 1 mM DTT and 5%glycerol透析液 的燒杯中，於4°C下透析4h以上，重覆此透析步驟即可分裝待進 一步分析。 5.GFD之蛋白質含晉 先製作蛋白質標準曲線（BSA standard curve):即分別取蛋 20 1309238 白質標準品（BSA，0_ 5 mg/mL)卜2、3、4、5、6 uL於其所對應之 滅菌水中，使最後體積達800 uL，之後分別加入呈色劑200 uL 室溫下反應5 min，測ODmnm並依吸光值求出蛋白質標準曲線。將 採收之樣品依相同方法測得吸光值即可由標準曲線求得蛋白質 含量。 6.活性測定 GFD活染：（1)首先將完成電泳之膠體，浸泡於70 mM potassium phosphate buffer (pH8.0), 0.5 M potassium chloride, 4.8 mM formaldehyde and ImM reduced GSH的水溶 液中，25°C搖動5 min後，分別加入不同量NAD、nitroblue tetrazolium、phenazine methosulfate 使最終濃度為 1.2 mM, 0. 4 mg/mL、0· 03 mg/mL，膠體於37°C搖動1 h後，以去離子水清 洗膠體後，呈現紫色帶之區域為具有GFD活性之處。 GSN0R活染：（2)將完成電泳之膠體，浸泡於0. 1 Μ potassium phosphate buffer (pH 8.0),2 mM NADH 水溶液中， 置於冰上15 min後，去除excess buffer，膠體覆上含有3 mMGSNO 的滤紙15 min後，除去爐紙，膠體在ultraviolet light上可觀 看NADH fluorescence消失的情形。 GFD 活性測定：（3)依據 Uotila and Koivusalo (13)作部分 修改，在 100 uL 反應液中：〇. 25〜1 pg GFD，100 mM potassium phosphate buffer (pH 8. 0), 1 mM HMGSH [GSH and formaldehyde 21 1309238 (1:1)在 25°C 混合 5 min 使產生 HMGSH]，2 mM NAD·在 340 nm 測NAD被還原的量以換算GFD之活性（12-13)。 7. GFD性質 熱穩定性 分別取適量GFD於1.5 mL試管中，各5管，分別於50 °C加 熱 0、2、4、8、16 min 後，置於冰上，進行 10% native-gel 電 泳，分別作蛋白質染色（2 ug)及活性測試（2 ug)。結果顯示此 甚為安定，在50 °C加熱其活性減少一半所需時間為5 min。 pH的影響 分別取適量液，於1. 5 mL試管中，共6管，加入不同pH值缓 衝液：0. 2 Μ檸檬酸鈉緩衝液（pH 2. 3、or 5. 4)，0. 2 M Tris-Hcl 緩衝液（pH 7. 8、or 9.0)，0.2 M甘胺酸NaOH 緩衝液（pH 10. 4 or 11.2)，在37 °C下反應lh後，置於冰上，分別進行10% nat i ve-ge 1電泳後作蛋白質染色（2 ug)及活性測試（2 ug)。結果 顯示此甚為安定，顯示以酸鹼處理很安定，尤其至pH7. 8〜pHll 處理lh對活性並沒有影響。 SDS的影響 分別取適量液，於1.5 mL試管中，共5管，分別加入不同量 的20 % SDS，使SDS最終濃度為0、1、2、3、4%，在37 °C下反應 lh後，分別進行10% native-gel電泳後作蛋白質染色（2 ug)及活 性測試（2 ug)。結果顯示SDS的處理不安定。 22 1309238 咪唑的影響 分別取適量GFD’於1>5 mL試管中，共5管，分別加入不同量 的咪唑，使咪唑最終濃度為0、0.2、0_4、〇_8、K6 M，在37。〇 下反應lh後，分別進行10% native-gel電泳後作蛋白質染色（2 ug) 及活性測試（2 ug)。結果顯示以咪唑的處理亦很安定，必須高至 0.8 Μ時對活性才有抑制（30%)。 香白酸的影響 分別取適量GFD ’於1.5 mL試管中，共4管，分別加入相當 GFD量1/20的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶於Tri-HC1緩衝液（pH 8 · 5 含 2 0 niM CaC I2)分別在 37 C 下反應 i〇、20、40 min，分 別進行10% native-gel電泳後作蛋白質染色（2 ug)及活性測試 (2 ug)。結果顯示以胰蛋白酶的處理40 min候，活性不變。 動力學 GFD 之動力學結果：The Lineweaver-Burke plot of the velocity (1/V。)對 1/HMGSH 為 1^=^.0.615 mM 和 Vmax= 128 μΜ/min，the. velocity (1/V。）對 1/NAD+為 Km= 1.105 mM 和 \^眶=131 μΜ/min。

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Claims (1)

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、申請專 ;ί '〜種選白 ，. ---一J ^選自棒芝同時具有去甲醛、酒精及還原硝基化之 、（glutathi〇ne_dependent formaldehyde 炫 e h V* _ r〇genase’ GFD)，其胺基酸序列係如SEQ IDN0:2所示。 ' 之同時具有去甲醛、酒精及還原硝基化之 苷質（GFD)之核苷酸，其包含一核苷酸序列，該核 序歹J係如SEQ Π) N〇:1所示，可用以編碼如申請專 麵固第i項所述 、抱姓 J疋之樟芝GFD之胺基酸序列。 據申請專利範圍 社 固第2項所述之樟芝GFD之分離核 核酸係在酵母菌中進行表現及量 甘酸，其中該分離 化 4 :::現载體，其包含如申請專利範圍第3項之嫩序列。 、1製造：其包含如申請專利範圍第4項之載體。 之蛋白質表狀條件MU、胞，柯細由雜紐分和 b)自該宿主細胞培養液中回收該蛋白質。