TWI308593B - Gene coding for scytalone dehydratase exhibiting resistance to agricultural fungicidal agent - Google Patents

Description

1308593 坎、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於將作爲發病 衆所週知之水稻稻熱病菌之3,^熱病原菌而被 酵素編碼之基因。 —焱基-1·四氫萘酮脫水 【先前技術】 由水稻稻熱病菌（Pyricularia grisea)引起之太妒办舶 y ae，Magnaporthe 承」= 病於裁培水稻之幾乎所有國家均被 不》心’尤其於以日本爲首古、田 舉爲農業上重大病宝之心多L的氣候之地區，被列 重大病口之一，故爲達成高產量之水稻農作， 水稻稻熱病之防治爲必要不 J人缺#。近年，取代右治漆 效果之藥劑，藉由使用有 ’、 令頂防效果之箱處理型藥劑，於水 稻稻熱病防治上有節省農家勞力之趨勢。作爲此種藥劑， 可列舉加普胺㈣卿amid ; ((1RS，3SR)_2,2•二氣，⑻_ (4氯一苯基)乙基)」_乙基_3_甲基環丙烷羧胺))所代表之 3.6.8- 三羥基·〗_四氫萘酮脫水酵素抑制劑（以下， SCDH)(Kurahashi et al.，； %，23, 22 28, m

Motoyama et al.，j. Pestic. Sci, 23, 58 61，i998)。scdh係 黑色素生合成路徑中，催化3,6,8_三羥基四氫萘酮至 1.3.8- 一羥奈（以下，ι，3,8_ ΤΗΝ)之脫水反應之酵素。 於水稻稻熱病菌破壞侵入水稻葉表面之角質層之際，使 感染特異性器官之附著器中甘油濃度上昇至8〇個氣壓，爲 了將此甘油關閉於附著器中，細胞壁之黑色素層成爲必要 不可欠缺者（鐮倉等，化學與生物，39，340-347，2001)。

83876-970923.DOC 1308593 黑色素之生合成一旦被抑制，附著器即不能形成，故 SCDH抑制劑並非爲有直接殺菌力之藥劑，係藉由抑制病 原性而實現防治活性之非殺菌性藥劑。 關於絲狀菌之SCDH基因，最初雖由Pyricularia oryzae解 明，但其基因序列並未被公開，只報導了 SCDH蛋白質之 三級結構（Landquist et al., Structure, 2, 937-944，1994)。 之後於瓜類炭疽病菌（Kubo et al.，Appl. Environment. Microbiol，62，4340-4344，1996;登錄號 D86079)被報導， 然後’於煙色麵菌（Tsai et al.，Mol. Microbaiol，26，175-183，1997，登錄號 U95042)，水稻稻熱病菌（Motoyama et al.，Biosci. Biotech. Biochem，62，564-566，1998 ;登錄號 AB004741)及荷蘭榆樹病菌（Wang et al.，登錄號 AF3 1 65 75)均被報導。另，關於加普胺所結合之scdH蛋白 質之二級結構亦有報導（Nakasako et al.，Biochemistry, 37, 9931-9939, 1998 ； Wawrzak et al., Proteins ： Struct. Func. Genet, 35, 425-439, 1999)= 【發明内容】 另’近年’發現有對加普胺等SCDh抑制劑感受性降低 之水稻稻熱病菌（以下稱爲「耐受性水稻稻熱病菌」。）。 如上所述，因加普胺等SCdh抑制劑係對水稻耕作非常重 要之藥劑’故研究闡明耐受性水稻稻熱病菌之感受性決定 要因’且’建立耐受性水稻稻熱菌之防治對策者於繼續穩 定之水稻耕作上極爲重要。 但对文性水稻稻熱病菌之感受性決定要因之解明及耐受

83876-970923.DOC 1308593 性水稻稻熱病菌之生息地域之特定等，與耐受性水稻稻熱 病菌相關之研究現今幾乎尚未進行。 爲達成上述目的，本發明者銳意研究之結果，成功地解 明了耐受性水稻稻熱病菌之感受性決定要因，完成了本發 明。 x 即’本發明包含以下者。 (1) 一種基因，係編碼以下（勾或（1?)之蛋白質。 ⑷一種蛋白f，係由序歹,】編號2所示之胺基酸序列所組 成。 (b) —種蛋白質，係由序列編號2所示之胺基酸序列中】個 以上之胺基酸經缺失、被取代或㈣加而成之胺基酸序列 成1於3,6,8~二經基四氫萘嗣脫水酵素抑制劑之 I下'具3,6,8·三羥基-1·四氫萘酮脫水酵素活性之蛋白 ⑺+如⑴記載之基因’其特徵在於上述3,6,8_三經基小 四氫萘酮脫水酵辛抑击丨 土 素抑制劑抑制黑色素生合成路徑中3 6 8. 二羥基-1-四氫絮：_ $ ,， τ ^,ο,ο 不-匕3,8-三羥萘之脫水反應。 (3) 如（1)記載之其田 土口，其特徵在於上述3,68 -hi 1 四氫萘酮脫水酵专楠生丨加 ，-二羟基-1- 畔f抑制劑係加普胺。 (4) 一種3,6,8-三夠其 一 &巷四氫萘酮脫水酵 載之基因編碼。 呼t ’係由（1)記 (5) (6) (7) 栽體而成。 水稻稻熱病菌 一種重組載體，係 一種轉形體，係由 一種感受性評估方 含有（1)記載之基因 轉形（5)記載之重組 法，其係用於評估

83876-970923.DOC 1308593 針對 3，6，8 -三钟 τ ^ it 制劑之感受性 —工基_1_四氫萘酮脫水酵素抑 者該方法係包含以下步驟： 係用於鑑定評估料金+ u , ^ 怙對象之水稻稻熱病菌中 四氫萘酮脫水酵辛$ + 开系之胺基酸序列中，相當 和之胺基酸序列中第75辦夕細μ 丁乐/：)现之纈胺酸之胺基 (a)—種步驟， 3,6,8-三羥基 於序列編號4所 酸。 (b) —種步驟，係用 對象之水稻稻熱病菌 素抑制劑之感受性。 於評估基於上述（a)步驟之結果，評估 對於3,6,8·二經基小四氫萘酮脫水酵 (8)如（7)記載之减受性 本4又性°平估方法，其特徵在於上述（b) 之Μ下於^⑷步驟中已較之上述胺基酸爲蛋胺酸 滑升V下’ δ平估爲與野生φί 7k好*e i*上 r玍生水％韜熱病菌相比，評估對象 之水稻稻熱病菌對於3 6 X - a 1 >- _ ΤΡ·3,6,8-二羥基_；!_四氫萘酮脫水酵素 制劑具低感受性。 W -種抑制劑筛選套組，係包含⑷記載之3，Μ_三經 基-1-四氫萘酮脫水酵素。 (10) -種3,6,8_三經基四氫萘_脫水酵素抑制劑抵抗 性水稻稻熱病菌評估套組，係具有將相當於序列編號4所 示之胺基酸序列第75號之纈胺酸之胺基酸編碼之鹼基序列 夹於中間之方式設計的一對引子。 (11) 一種3,6,8-三羥基四氫萘酮脫水酵素抑制劑抵抗 性水稻稻熱病菌評估套組，係具有含將相當於序列編號4 所示之胺基酸序列第75號之纈胺酸之胺基酸編碼之鹼基序 列之寡聚核苷酸。

83876-970923.DOC 1308593 以下，祥細說明本發明。 本發明所關聯之基因’係將於3,6,8三經基小四氨举嗣 脫^酵素抑制劑（以下稱為SCDH抑制劑）存在下，具3，M_ 二經基小四氫萘_脫水酵素活性之3,6,8_三羥基小四氫萘 明脫水酵素（以下稱爲「突變型SCDH酵素」）編碼者。再 者，以下之說明中，將於SCD_制劑存在下，Μ』·三經 基小四氫萘嗣脫水酵素活性降低之3,6,8_三㈣小四氣蔡 酮脫水酵素僅稱爲SCDH酵素或野生型WDH酵素。 作爲SCDH抑制劑，例如可列舉加普胺（c卿卿⑽^ ; 二氯養（1-(4_氯苯基）乙基）]乙基-3-甲基環丙烧缓 ，）’非話可薩尼錄（fen_il)(1_(2,4_:氣苯基）氧善（】_ :基1,2 -甲基）丙乙烷羧胺）’基可老吸麥特 ⑷山cymetXN-H- (2,4•二氯苯基）乙路]小氛基^二甲 胺）等。SCDH抑制劑，通常作爲水稻稻熱病菌對 之感染抑制劑被使用’抑制SCDH酵素之活性。 而言，SCDH抑制劑於圖旧示之黑色素生合成路徑中^ 化3，M_三羥基四氫萘酮至1，3,8-三羥萘(以下， την)之脫水反應，及 卜 5 蔡之脫水反應。 一基—氣蔡嗣至Μ-二經 二Η抑制劑’藉由抑制此s⑽酵素活性，抑制水稻稻 …丙之寸者器之形成，從而可抑制其對水稻之病原性。 即SCDH抑制劑藉由使水稻稻熱病菌之感染 止水稻稻熱病之發生。與此相對，突變型SCDH酵素，= 即使於SCDH抑制劑存在下，亦具上述酵素活性，故對水

83876-970923.DOC 1308593 =熱病菌付與對SCDH抑制劑之抵抗性。因此表現突變 坦SCDH酵紊夕u ,一 埶 、…水稻稻熱病菌（以下，稱爲「耐受性水稻稻 : 」或抵抗性株），即使於SCDH抑制劑存在下，望色 =生合成亦不被抑制，可形成附著器，二入:: 果录面之条暂_ '曰。P ’耐党性水稻稻熱菌即使於SCDH抑 劑存在下亦具高感染力。 :爲犬變型SCDH酵素，可列舉由序列編號2之胺基酸序 _ —成者又，犬變型SCDH酵素即使係由序列編號2所 胺基酉夂序列中!個以上之胺基酸缺失’被取代或被附 :而成之胺基酸序列所組成，且，於3，m•三經基_卜四氯 水酵素抑制劑存在下具3，m•三㈣小四氫蔡嗣脫 : 性者亦可。在此，1個以上意味著，例如i-30 固，適宜者係1-20個，更適宜者係1-10個。 野生型SCDH酵素或突變型SCD_素之酵素活性，可藉 由測定3,6,8·三經基+四氫萘嗣至之脫水反應，3 ，，由3,8·二經基+四氫萘_μ，8_二經萘之脫水反應而 =古即於含有野生型SCDH酵素或突變型％卵酵素與基 貝（3，M-三經基四氫萘_或认二經基小四里气蔡⑷之 反應溶液中進行酵素反應，藉由測定基質之減少量及/或 反應產物(1，3,8-THN或二經萘)之增加4，以評估野生 型SCDH酵素或突變型SCDH酵素之酵素活性。 具體言之，可分光測定3,6,8_三經基小四氣蔡綱至m ΤΗΝ之酵素反應。例如，測定3，M_三經基小四氣蔡闕之 減少量可依照 M〇toyama et al.，j. PesUc %，”， 83876-970923.DOC 11 1308593 1998進行。 另一方面’爲基質之3,6,8-三羥基-1-四氫萘酮及爲生成 物之1，3，8-THN之各自之UV吸收光譜（示於圖2)中，雖然於 200-3 00 11111處吸收被3,6,8_三羥基_丨四氫萘酮 之吸收覆蓋’但因於340-360 nm處3,6,8-三羥基-1-四氫萘 酮之吸收幾乎可忽視，故13,8-THN之增加量，可於340- 360 nm處之UV吸收光譜而測定。再者，於34〇_36〇 nm處 之UV吸收光谱之測定方法，由進行經由1 〇〇秒内測定酵素 反應之速度分析（rate assay)，可測定野生型scdh酵素或 突變型SCDH酵素對SCDH抑制劑之感受性。 藉由此方法’於依特定濃度添加了 SCDH抑制劑（如加普 胺）之反應溶液中進行酵素反應，藉由於34〇_36〇 nm處測 疋之uv吸收光譜，可測定反應産物i，3,8_Thn之合成量。 然後將測定之1，3,8-THN之合成量以無SCDH抑制劑存在下 之1’3,8-THN合成量除算，以作.SCDH抑制劑於該濃度下 之抑制率。然後，關於野生型SCDH酵素及突變型SCDH酵 素，改變SCDH抑制劑之濃度，測定其抑制率，以算出各 酵素之150值。由野生型SCDH酵素之15〇值與突變型scdh 酵素之150值，藉由算出其R/s比，可評估突變型“^^^酵 素對SCDH抑制劑之感受性。例如，算出之r/s比爲2以上 之It升y下可疋義爲突變型SCDH酵素與野生型SCDH抑制 劑相比，對SCDH抑制劑之感受性低。 再者X變型SCDH酵素之酵素活性，不僅限定於上述 n應用任何方法測^均可。#爲突變^ scdh之酵素

83876-970923.DOC -12· 1308593 活性方法，例如可列舉爲使用酵素反應生成物1，3,8-三羥 萘之HPLC分析定量等方法。 編碼突變型SCDH酵素之基因（以下稱爲「突變型SCDH基 因」），只要爲含編碼上述突變型SCDH酵素之鹼基序列 者，爲來自含内含子之基因組DNA者亦可，來自非含内含 子之cDNA者亦可。 突變型SCDH基因，例如使用由水稻稻熱病菌之SCDH酵 素之由cDNA序列設計之引子，與具SCDH抑制劑抵抗性之 水稻稻熱病菌（以下稱爲「耐受性水稻稻熱病菌」）之基因 組DNA，可經由PCR獲得。又，突變型SCDH基因，亦可 使用上述引子，及由耐受性水稻稻熱病菌抽出之mRNA， 經由RT-PCR獲得。再者，水稻稻熱病菌之SCDH酵素之 cDNA序列係衆所週知者，被揭示於Motoyama等之Biosci. Biotech. Biochem, 62，564-566，1988 (DNA資料庫，登錄號 AB004741) 〇 藉由此種方法獲得之突變型SCDH基因，例如含有序列 編號1所示之基因序列。比較編碼突變型SCDH基因及野生 型SCDH酵素基因（以下稱爲SCDH基因）之鹼基序列（cDNA) 之結果示於圖3。又，比較基因組DNA之突變型SCDH基因 及SCDH基因之鹼基序列之結果示於圖4。如圖3及圖4所 示，突變型SCDH基因中，於SCDH基因之第223號之G(鳥 嘌呤）同族突變型爲A(腺嘌呤）。此突變型，意味著野生型 SCDH酵素之第75號之纈胺酸（Val)突變爲蛋胺酸（Met)。 又，比較突變型SCDH基因及SCDH基因之鹼基序列之結 83876-970923.DOC -13 - 1308593 果，於突變型SCDH基因中，第450號之T(胸腺嘧啶）突變 爲C(胞嘧啶），但此突變不伴有胺基酸突變。

又，由圖3及圖4之比較，突變型SCDH基因，於突變型 SCDH酵素之胺基酸序列中第42號及第43號之間與第141號 及第142號之間，分別有8丨個鹼基與約89個鹼基的内含 子。再者，因後者之内含子（突變型SCDH酵素之胺基酸序 列之第141號及第142號之間）與多聚a鏈相連，於進行PCR 之際，因生成長度各異者而不能決定明確長度，故大約爲 89個驗基。 作爲突變型SCDH基因’不僅限定於序列編號1之鹼基序 列，只要爲將由序列編號2之胺基酸序列所組成之蛋白 質，或由序列編號2之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸缺 失，被取代或被附加而成之胺基酸序列所組成，且，於 3,6,8-三羥基-1-四氫萘酮脫水酵素抑制劑存在下具 3，6,8-二羥基-1-四氫萘酮脫水酵素活性之蛋白質編碼之鹼 基序列，任意者均可。作爲此種驗基序列，例如可列舉爲 序列編號1之鹼基序列非伴有胺基酸突變之鹼基取代而生 成之驗基序列。 河对興序列編號丨之鹼基序 又，作爲突變型SCDH基 ' ~ Aφ 列互補之鹼基序列，於嚴格條件下爲可雜交之鹼基序列， 且將於3，M-三減-卜四1萘嗣脫水酵素抑制劑之存名 下’具3,6’8-三羥基小四氫萘輞脫水酵素活性之蛋白質结 碼之鹼基序列所組成者亦可。此處’所謂嚴格條件，即使 如納濃度爲10 mM-300 mM，摘官本g、 、且者爲20-100 mM，溫度 83876-970923.DOC 14 1308593 爲25C-70。。，適宜者爲4rc_55t之條件。 突變型SCDH基目，例如以由即使於S(：dh抑㈣存在下 亦能對水稻感染之水稻稻熱病®獲得之基因組DNA爲模 板’使用有特定序列之一對引子，可經由取獲得。作爲 基因組DNA之調製〉去，無任何限定，例如使用以ctba(十 A炫基二甲基 >臭化銨）爲抽出液之方法，SDS/苯齡或苯盼/ 氣仿抽出之方法’《市場出售之套組，例如可列舉Qiagen 公司之DNeasy Piant System，Amersham Bi〇sciences公司之 Nucleon PhytoPure套組等。 更，突變型SCDH基因，由即使於scdh抑制劑存在下亦 對水稻感染之水稻稻熱病菌抽出全量mRNA，使用全量 mRNA及有特定序列之一對引子，經由RT_pcR亦可獲得。 作爲水稻稻熱病菌之全量mRNA抽出方法，無任何限定， 例如可列舉異硫氰酸胍法，SDS_苯酚法，苯酚/氯仿抽 出，或市場出售之例如可列舉爲Qiagen公司之RNeasy

Total RNA System，Amersham Biosciences 公司之 Quiek

Prep Micro mRNA Purification Kit, Quick Prep Total RNA Extraction Kit 等。 上述PCR及RT-PCR中使用之一對引子，例如可基於基因 庫中登錄之水稻稻熱病菌之基因組DNA之鹼基序列，以將 SCDH基因夾在中間之方式來設計。一對引子，可基於水 稻稻熱病產之基因組DNA之驗基序列，並且附加功能性序 列來設計。所謂功能性序列，可列舉爲了與載體相連之限 制酵素之識別序列，及爲了與開放譯讀架—致之***序列 83876-970923.DOC -15· 1308593 等。 例如，作爲一對引子，雖可列舉爲下者，但並非僅限於 此。 引子 1(序列編號 5) : 5I-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3， 引子 2(序列編號 6) : 5'-TTATTTGTCG^_CAAAGGTCTCC-3' 引子 3(序列編號 7) : 5'-AGTTCGAACTGGAATTCAACCG GCACGCATGATGCATGCATTTA-3' 引子 4(序歹ij 編號 8) : 5’-ATGGGTTCGCAAGTTCAAAAG-3’ 弓I 子 5(序列編號 9) : 5'-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3’ 引子 6(序列編號 10) : 5’-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3' 引子 7(序列編號 11) : 5'-ATCGTCGACGTGAATTC.GTCTT GTAAAAGCCGCCAAC-3' 再者，引子1，4,6及7係順義引子，引子2,3及5係反義引 子。因此作爲一對引子，一方由順義引子中選擇，另一方 由反義引子中選擇。 引子2因係基於衆所週知文獻（Motoyama et al.，Biosci. Biotech. Biochem，62, 564-566, 1988)所揭示之驗基序列而 合成者，故下劃線所示之鹼基爲「G」。然而，DNA資料庫 之登錄號AB004741所揭示之與其相當之鹼基係「C」。該 鹼基「C」雖爲正確者，但該鹼基即使爲「G」，亦對PCR 及RT-PCR之結果無影響。引子3及引子7中下劃線所示之 文字表示Eco RI識別序列。此Eco RI識別序列，可於*** 蛋白表現載體等之際利用。引子3及引子7中Eco RI識別序 列之5’端之鹼基序列，係爲了 Eco RI能識別Eco RI識別序 83876-970923.DOC -16· 1308593 列而使其留有餘地而附加之鹼基序列。引子7中，Ec〇 ri 識別序列之3’端之2個鹼基序列（即，引子7之第18號及第19號 之「GT」），係***蛋白質表現載體（ρ(}Εχ_2τ)之際，爲與 開放譯讀架一致而用之驗基序列。 例如，使用引子7及引子3，以全量RNA爲模板進行RT_ PCR，可調製出質體，其由將獲得之pcR生成物以以〇幻 處理後***預先進行Eco RI消化與驗性填酸酶之bap處 理之 pGEX-2T (Amersham Biosciences 公司製）而成。此質 體作爲突變型水稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體（ferm BP-7948)，由獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物 寄存中u (曰本國次城縣桌波市東1丁目1中央第6)於Mo〗 年3月8日基於布達佩斯條約被寄存於國際；再者，上述水 稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體亦已於2〇〇3年5月2〗曰寄 存於食品工業發展研究所（FIRDI)，且授予寄存號碼為 BCRC 940423。 此質體（突變型水稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體）可於 大腸桿菌等宿主内作爲與麩胱苷肽_s_轉移酵素（以下，稱 爲GST)之融合蛋白質來表現SCDH酵素。再者，爲了能應 用於無細胞系之蛋白質表現系統，構建有突變型％〇11基 因之質體亦可。 並且，突變型SCDH基因，可使用即使kSCDH抑制劑存 在下亦對水稻感染之來自水稻稻熱病菌之〇〇]^八文庫及特 疋之彳朱針而獲得。

並且，突變型SCDH基因，可對野生型SCDH基因誘發突 83876-970923.DOC 1308593 變而獲得。例如使用爲 馬了使編碼野生型SCDH基因第75號 之纈胺酸（Val)之密碼，突 穴變爲編碼蛋胺酸（Met)之密碼而 没计之引子，藉由戶斤禮却> „ °月〇卩位特異突變法，可獲得突變型 SCDH基因。爲了使用部

位特異大變法而獲得突變型SCDH 基因，可使用市場出售 售之套組。作爲市場出售之套組，例 如可列舉寶酒造公司 之 TaKaRa LA PCR in vitro

Mutagenesis kit 等。 不過，上述突變型SrnHi m DH基因，如後述之實施例所示， 於篩選使耐受性水稻稻埶

，、、、病滴之感染力降低之新的SCDH 抑制劑之際有效，特別县 吁乃〗疋使用於表現可能之狀態下***上 述已突變之SCDH基因之恭舻主，日& + <戰體’表現該突變型SCDH酵素， 於作爲新的SCDH抑制劑之极姑私所+ 1 4 d之候補物質存在之條件下，測定 已表現之突變型SCDH酵去夕缺|、工 鲜常之酵素活性。於該候補物質存 在之情形下，藉由判定突變开丨 又犬雙型SCDH酵素之酵素活性是否 降低可篩選新的SCDH抑制劑。 特別地，先前之測定方法中，於候補物質存在下，使用 水稻其本身之所謂植木缽實驗及藉由觀察附著器將貼於培 養皿ϊ复脂上之玻璃紙破壞之春給，I、，β 7丄 八紙屣之貝驗，以評估水稻稻熱病菌之 附著器所組成抑制’很難進行迅速的scdh抑制劑之筛 選。與之相對’藉由上述之方法’因經簡便方法可測定 SCDH酵素之酵素活性，故可隹 双』進订新的SCDH抑制劑之迅速 篩選。 又，由上述突變型SCDH基因之鹼基序列解析來看， SCDH酵素第75號之綠胺酸（Val)突變爲蛋胺酸⑽〇之突變

B3876-970923.DOC -18· 1308593 型SCDH酵素中，因於SCDH抑制劑存在 a 1 /、晖f活性，葬 由解析編碼SCDH酵素第75號之胺基酸之鹼 曰 〜_签斤列，可^ 查解析對象之SCDH基因對SCDH抑制劑是否有耐受性。D° 即’於研究於特定地區等採取之水稻又 N％熱病菌（解析對 象之水稻稻熱病菌）對SCDH抑制劑是否有感受性之際，藉 由鑑定該水稻稻熱病菌之SCDH基因（解析對象之 因）之SCDH酵素第75號胺錢，可評㈣水㈣熱病菌= SCDH抑制劑之感受性。 於決定編碼解析對象之SCDH酵素第75號胺基酸之驗基 序列之際，使用任何方法均可，無特別限定。於決定編碼 SCDH酵素之第75號胺基酸之驗基序列之際，例如使用以 將至少含編碼SCDH酵素第75號胺基酸之驗基序列之驗基 序列夾於中間之方式設計的-對引子，與模板DNA(eD^ 或基因組DNA)，根據模板DNA之特定區域以決定鹼基序 列。基於決定的鹼基序列，可鑑定解析對象之scdh^素 第75號胺基酸。 _ > 於決定編碼解㈣象之SCDH酵素第75號胺基酸之驗基 序列之際，特別地，將解析對象之水稻稻熱病g固體巧 之後’取絲狀菌絲冑，對該菌絲體經照射微波而獲得成爲 模板：基因組讓者適宜。照射微波，例如可使用微波爐 等。藉由此方法，獲得成爲模板之基因組dna之情形下， 與將解析對象之水稻稻熱病菌液體培養之後集菌，依據特 定法抽出基因組DNA之方法相比，可於非常短時間内獲得 基因組DNA。

83876-970923.DOC 19- 1308593 更m編碼解析對象iSCDH酵素第75號胺基酸之 驗基序列之際’特別地’按照—方引子於編碼第75號胺基 酸之鹼基序列的附近，例如於40個鹼基上游處雜交而設計 爲佳。藉此’可於非常短時間内決定將解”象之scdh 酵素第7 5號胺基酸編碼之鹼基序列。 並且，於決定編碼解析對象之SCDH酵素第乃號胺基酸 之驗基序列之際，可使用寡聚㈣酸，其含將相#於序列 編號4所示之胺基酸序㈣75號_酸之胺基酸編碼之驗 基序列。例如’於解析對象之SCDH料第75號胺基酸係 蛋胺酸之情形了，使此募聚核普酸能與編碼該SCDH酵素 之基因雜乂之方式來设計寡聚核普酸H，以此寡聚核 苦酸作爲探針，藉由菌落雜交及南方雜交等方&，可鑑定 解析對象之水稻稻熱病菌之SCDH酵素第75號胺基酸。藉 由此方法彳。乎估解析對象之水稻稻熱病菌對SCDH抑制劑 之感受性。 並且’於分析解析對象$ ^ m 了象之SCDH酵素第75號胺基酸之

際，亦可利用單鏈構象多能M 得豕夕態性（以下，稱爲SSCP)。即預先 檢出野生型SCDH基因與耐受性SCDH A m 士 ^ m j又r生buuH基因中，起因於單鏈 構象多態性之差異之電泳表型的區別，基於解析對象之 SCDH基因單鏈構象多態性，比較電泳表型。#此，解析 對象之SCDH基因，可雜〜& * 了銓疋編碼SCDH酵素第75號胺基酸之 驗基序列。於分析解析#务 τ象之SCDH酵素第75號胺基酸之 際，藉由利用SSCP，可於极α士扣〜 於極知·打間内判別解析對象之水

稻稻熱病菌對於SCDH抑制劑之感受性。 83876-970923.DOC •20- 1308593 並且’於分析解析對象之SCDH酵素第75號胺基酸之 際，亦可應用已改變之PCR_限制酵素片段多態性（RFLp) 解析法（以下，稱爲「改變PCR-RFLP法」）。即藉由PCR-RFLP解析法，亦可簡易地檢測出解析對象之水稻稻熱病 菌之SCDH酵素第75號之纈胺酸（Val)至蛋胺酸（Met)之突變 (以下’稱爲Val75Met突變型）。 於改k PCR-RFLP解析法之際，作爲pcR中使用之一方 引子，不含第223號鹼基（編碼SCDH酵素第乃號胺基酸之 密碼中所含鹼基），且，根據第223號鹼基的種類，如使3, 末端有限制酵素識別序列之方式來設計。此時，該—方引 子彡上述含限制酵素識別序列一般，即使含與成爲模板 之基因組DNA,1UDNA之驗基序列一部分錯配之驗基亦 可。作爲限制酵素識別序列，無特別限^，可使用 識別之序列。 於改變PCR-RFLP解析 〜叫糾工尸叮返設計 之對引子’與成爲模板之基因組DNA或cDNA進 :CR:於PCR之際，根據適宜設^溫度及時間等 2 1使使用含與模板錯配之驗基之引子，亦可增幅所期 望之核板之區域。經由PCR所 轳鹼其X η 所獲仟之産物，爲依據第223 號驗基不同’同時含有上述—方引子及限制 列，或，依據第223號驗基不同 酵$°θ ]序 者。 j个3丨民制酵素識別序列 其次，將由PCR所獲得之產物，用識別 含之限制酵素熾別庠別夕止丨 4 方弓丨子所 哔硪別序列之限制酵素處 处 轉由此限制酵|

83876-970923.DOC -21 . 1308593 處理，出現因第223號鹼基之差異而獲得之片段長度不同 者。其次，將由限制酵素處理所獲得之片段長度，例如藉 由電泳等方法檢出，可鑑定第223號鹼基，可分析解析對 象之SCDH酵素第75號胺基酸。 並且’於分析解析對象之SCDH酵素第75號胺基酸之 際，亦可應用一般的已知之單鹼基多型性測表型（typing) 方法’作爲單鹼基多型性測表型方法，例如可列舉 Applied Biosystems公司之 SNaPsh〇t Muitiplex Kit(單引子 伸長反應）’ Qiagen公司之Masscode System(質量分析系 統），Sequenom公司之MassARRAY系統，寳酒造公司之 UCAN法，使用切割酵素之侵略法（invader assay)，使用微 陣列方法等。 【實施方式】 [實施例] 以下，使用實施例進一步詳細說明本發明。但，本發明 之技術範圍並非限定於此實施例者。 實施例1 本例中，首先調製抽出SCDH酵素之際使用之絲狀菌絲 體，將標準（野生型）菌株之水稻稻熱病菌（pyricularia oryzae)及具加普胺耐受性之水稻稻熱病菌（抵抗性株（A及 B))之胞子溶液（i〇5/ml)分別接種於含酵母抽出物（5 g)，葡 萄糖（20 g)，KH2P〇4 (0·5 g)，Na2Hp〇4 (〇 5 g)及 (〇·5 mg)之200 ml YGPCa液體培養液（pH 6.5)，於”艺培 養4-5日0 83876-970923.DOC -22- 1308593 培養後，將块盖、、A仏 主 、 ° 、分離，收集絲狀菌絲後，用蒸餾 水μ洗，添加相♦^ & 相田於痛絲重量之5倍量之冷 機均質化。離心句用禾汁 屯m- _漿液（1 5,000 x g，20分），於4°C乾燥沈 /A 一酮粉末’將此丙_粉末保存於-85。(：。 使用獲得之丙獅伞、士 鲷叔末，調製含SCDH酵素之粗酵素液， 測定該SCDH酵夸夕胁主 主、 素之酵素活性。於調製含SCDH酵素之粗酵 素液之際’將两酮給圭 末^渴於20 ml 1/15 Μ填酸鉀緩衝液 ⑽6·8)，於冰鎮下，攪拌3〇分後，於15,_xg離心分離 1 5刀’以經由離心公 , 離所獲侍之上清液作爲粗酵素液。 然後’於使用粗酵素液測定SCDH酵素之酵素活性之

' ' 將3有1 mM EDTA之1 〇〇 mM磷酸緩衝液（pH μ1 20 mM 3,6,8-三羥基_1_四氫萘酮（乙醇溶 液）30 μ卜適當濃度之加普胺之乙醇溶液^ y及超純水 M40 W混合’於27°C預保溫培養2分。然、後，添加_ μ1 粗酵素，開始酵素反應。將經由酵素反應由3,6,8·三經基_ 1-四^萘酮生成之以口冊之量作爲於uv35g賺之吸光 度上昇，藉由監測1〇〇秒來測定起因於粗酵素液中所含之 !隨酵素之酵素活性。再者，基質之3,6,8·三經基-1-四 气T酮係於加音胺之存在下液體培養標準（野生型）菌，由 獲侍之囷絲體經常法（Kurahashi wt al，J Pes…W，23 22-28, 1998)調製者。 ，， :果顯示於圖5。使用此結果經變積分析算出5 〇 %抑制 劑漢度（15。值）。其結果，由標準（野生型）菌抽出之粗酵素 ' ㈢胺之150值爲7.45 nM ’與之相對，抵抗性菌株a

83876-970923.DOC -23- Ϊ308593 刀別舄1 63 nm及1 57 nm。由i士此枯 2i < L, ^ 由化些值可知，R/S比約爲 •。此雖然係抵抗性菌株A及b之 〃 β之加普胺耐受性之要因， 1一啓不係爲加普胺之靶點之3 ^ ^ ^ ，，8·二羥基_1-四氫萘酮脫水 畔素之感受性降低所致。 本例中，首先，爲了從水稻稻熱病菌抽出基因組dna及 瞻Μ，如下調製絲狀菌絲體。首先，於燕麥培養基上分 別培養標準（野生型）菌及具加普胺耐受性之水稻稻熱病菌 (抵抗性株（A及B))。培養後，將菌絲體部分接種於 鈴薯葡萄糖（PD)液體培養基，於2fC予培養3日。因經予 。養生長之絲狀菌絲成爲團子狀，用滅菌過之果汁機將其 均質化，再將其中每i ml分別接種於2〇 ml之PD液體培養 基中繼續培養3_5曰。將菌絲體經減壓濾過濾別後，以蒸 鶴水清洗。將這些菌絲體於液氮存在下用研蛛研磨，製成 微粉末，保存於_85〇c。藉此，可獲得標準（野生型）菌由來 之微粉末，抵抗性株A由來之微粉末及抵抗性株B由來之 微粉末。 於使用抵抗性株A由來之微粉末提取全量RN A之際，使 用Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen公司製），依據添付之項 目書而進行。於使用獲得之微粉末抽出基因組DNA之際， 使用Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen公司製），依據添付之 項目書而進行。RNA濃度經分光光度計於OD26Q測定吸光 度而定量。DN A濃度係依據於1 %瓊脂膠上之亮度情况， 或使用Hoe 33258 (Hoechst公司製）測定螢光光譜。 83876-970923.DOC • 24- 1308593 接著，使用獲得之全量RNA調製含抵抗性株之突變型SCDH基 因之cDNA。於調製含突變型SCDH基因之cDNA之際，首先 將獲得之 RNA (2 pg)與 2 μΐ 寡（dT)2〇 (10 pmol/μΐ)，各2 μΐ 之引子 1 (5'-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3' ’ 25 pmol/μΐ) 及弓丨子 2 (5'-TTATTTGTCGGCAAAGGTCTCC-3' ，25 pmol/μΐ)及 RT-PCR粒子（Amersham Biosciences 公司製）混 合，使最終容量爲50 μΐ調製反應溶液，反應依據以下條件 進行。作爲cDNA之合成，於42°C30分，接著於95°C30分 進行反應。然後，作爲以合成之cDNA爲模板之PCR反 應，以95°C 30秒，55°C 1分及72°C 1分所形成之步驟重複35 個循環，於最終循環結束後，於72°C 7分來結束反應。將 反應後之反應溶液藉由用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences公司製）純化而獲 得RT-PCR生成物。再者，含標準菌株之SCDH基因之 cDNA及含抵抗性株B之SCDH基因之cDNA亦可與上述方法 同樣得到。

另一方面，使用獲得之基因組DNA調製含抵抗性株A之 突變型SCDH基因之DNA。於調製含突變型SCDH基因之 DNA之際，首先將獲得之基因組DNA 4 μΐ，各1 μΐ之引子1 (5’-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3'，25 pmol/μΐ)及引子3(5'-AGTTCGAACTGGAATTCAACCGGCACGCATGATGCATGC ATTTA-3'，25 pmol/μΐ)及 PCR粒子（Amersham Biosciences公 司製）混合，調製反應溶液。反應依據以下之條件進行， 作爲以基因組DNA爲模板之PCR反應，以95°C 30秒，55°C 83876-970923.DOC -25- 1308593 1分及72 C 2分所形成之步驟重複4〇個循環，於最終循環結 束後，於72 C 7分來結束反應。將反應後之反應溶液藉由 ^ GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences公司製）純化而獲得PCR生成物。再者，含標準 菌株之SCDH基因之DNA及含抵抗性株b之SCDH基因之 DNA亦可與上述方法同樣得到。 接著’使用獲得之RT-PCR產物及PCR産物，決定含突變 型SCDH基因之cDNA及含突變型SCDH基因之DNA之鹼基 序列’於決疋驗基序列之際’使用Applied Biosystems公 司之 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction

Kit。 使用此套組之定序反應，係將模板之RT_pCR或pCR産 物，3.2 pmol之引子（引子1，引子3，引子5及引子6)及8 μ1 之終止子與混合物混合，於總量2〇 μ1之反應溶液中進行。 作爲反應條件，將由96°C 10秒，50°C 5秒及60°C 4分所形成 之步驟重複40個循環，於最終循環之後，於6(rc 7分結束 反應。反應結束後，將反應溶液中殘存之染色終止子（dye terminator)專成分用 Auto Seq G-50 (Amersham Bioscience 公司製）經膠體據過去除。其後，用Applied Biosystems公 司之ABI 3 10 Genetic Analyzer解析反應生成物，決定鹼基 序列。將RT-PCR產物作爲模板決定之突變型SCDH基因之 驗基序列顯示於序列編號1，由突變型SCDH基因編碼之突 變型SCDH酵素之胺基酸序列顯示於序列編號2。

以RT-PCR産物爲模板，對於突變型SCDH基因之cDNA

83876-970923.DOC •26- 1308593 之解析結果顯示於圖3。圖3係將基因庫登錄之水稻稻熱病 菌之SCDH基因之鹼基序列（登錄號ΑΒ〇〇4741，上段），與 使用由標準菌株獲得之PCR産物解析出的SCDH*因之鹼 基序列（中段），與使用由抵抗性株A獲得之RT_pcR產物解 析出之突變型SCDH基因之鹼基序列（下段）作一比較之 圖。

又，以PCR產物爲模板，對於基因組DNA中存在之突變 型SCDH基因之解析結果顯示於圖4。圖3係將基因庫登錄 之水稻稻熱病菌之SCDH基因之鹼基序列（登錄號 ΑΒ〇〇4741，上段）’與使用由標準菌株獲得之PCR產物解 析出的SCDH基因之鹼基序列（中段），與使用由抵抗性株A 獲得之PCR産物解析出之突變型Scdh基因之鹼基序列（下 段）作一比較之圖。 由此圖3及圖4 ’可判明抵抗性株a中，s c D Η基因之 cDNA驗基序列之第223號（}(鳥嘌呤）同族突變爲Α(腺嘌 吟）°此意味著標準菌株之SCDH酵素胺基酸序列第75號纈 胺酸（Val)突變爲蛋胺酸（Met)。又cDNA鹼基序列之第450 说驗基於登錄的驗基序列（登錄號AB004741，圖3之上段） 中雖爲T(胸腺嘧啶），但於標準菌株及抵抗性株中爲c(胞 喷。定）。但此cDNA鹼基序列之第450號鹼基之突變，被認 爲因係非伴有胺基酸突變，故對SCDH抑制劑之感受性無 任何影響。 又’由圖4確認了序列編號3所示之鹼基序列第42號與第 43號之間及第141號與第1 42號之間，分別有8 1個鹼基與約 83876-970923.DOC -27- 1308593 89個驗基之内含子，因後者之内含子與多聚a鏈相連，於 進行PCR之際，因生成長度各異者而不能決定明確長度， 故大約爲89個鹼基。 實施你Η 研究了水稻稻熱病菌之SCDH酵素中第75號纈胺酸（Val) 至蛋胺酸（Met)之突變（以下’稱爲Val75Met突變型）之簡 易測定法。 燕麥培養基（5%燕麥，2%右旋糖及1 ·5%瓊脂）上，28 °C 培育之水稻稻熱病菌之菌體用牙簽取出，移至1.5 μΐ之微 試管中。合蓋，於微波爐（600 W)照射微波5_7分。經此處 理’破壞菌體之細胞壁。 接著’向微試管内加入50 μΐ ΤΕ緩衝液（ΡΗ 8.0)，激烈 授拌’於14,000 rpm離心分離1〇分，將溶解有游離之基因 組DNA之上清液移至其餘微試管中，保存s_2(rc。將ι_5 μΐ之上清液與各 1 μ1之引子4 (5，-ATGGGTTCGCAAGTTCAAAAG -3’，25 pmol/μΐ)，引子 5 (5’-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3’’ 25 pmol/μΐ)及 PCR粒子（Amersham Biosciences公司製） 混合，使最終容量成爲25 μΐ調製反應溶液。作爲PCR反 應’將95°C30秒’ 55。(： 1分及72°C2分所形成之步驟重複40 個循環’於最終循環之後，72 t 7分結束反應。使用 Invisorb Spin PCRapid Kit (Invitek 公司製）純化反應溶 液’獲得PCR產物。反應溶液中所含之PCR産物使用

Applied Biosystems 公司之 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit進行定序反應。 83876-970923.DOC -28- 1308593 於進行定序反應之際，將模板之PCR産物，3.2 pmol之 引子6 (5，-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3')及8 μΐ之終止 子予混合物混合’調製總量20 μΐ之反應溶液。作爲定序反 應，將96°C 10秒，50t5秒及6(TC4分所形成之步驟重複40 個循環’於最後循環之後於60 °C 7分結束7分。反應結束 後，使用 Auto Seq G-50 (Amersham Biosciences公司製）經 膠體過濾去除反應溶液中殘存之染色終止子等。之後，用 同一公司之ABI 3 10 Genetic Analyzer定序解析反應生成 物。此時，經使用Amersham Biosciences公司製之47 cm X 50 μιη之短毛細血管柱（short capillary column)，每份樣品 可於約35分之短時間内判明第75號之胺基酸由纈胺酸突變 爲蛋胺酸。 實施例4 應用單鏈DNA構象多態性（SSCP)解析法，研究水稻稻熱 病菌之SCDH酵素之第75號之纈胺酸（Val)至蛋胺酸（Met)之 突變（以下，稱爲Val75Met突變型）之簡易檢定法。 與實施例3同樣，經微波照射水稻稻熱病菌絲狀菌絲 體，簡易地調製基因組DNA溶液。將此基因組DNA溶液5 μ卜各 1 μΐ之弓丨子 6 (5'-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3，， 25 pmol/μΐ)’ 弓丨子 5 (5'-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3' ’ 25 pmol/μΐ)及 pcr粒子（Amersham Biosciences公司製） 混合，使最終容量成爲25 μΐ調製反應溶液。作爲PCR反 應，將95°C 3 0秒，55°C丨分及72°C 2分所形成之步驟重複40 個循環’於最終循環之後，以72X： 7分結束反應。此反應 83876-970923.DOC •29- 1308593 之結果，獲得了 215 bp之PCR生成物。使用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences公司 製）去除反應溶液内殘存之taq DNA聚合酶及引子等。 之後，作爲SSCP用之上樣緩衝液，將0.5m EDTA (PH 8·0) 0·4 ml，溴酚藍1〇 mg及甲醯胺1〇 m丨混合而調製出。 將反應溶液與上樣緩衝液按丨：丨混合，於85 〇c加熱丨5分 後，迅速冰鎮。由此以反應溶液中所含之PCR産物作爲單 鍵 DNA。 然後’用反應溶液及上樣緩衝液之混合液，於

Amersham Biosciences公司之PhastSystem全自動電泳系統 中進行電泳。作爲膠體載體及緩衝液試劑，使用該公司之

PhastGel Homogeneous 12.5 與 PhastGel Native Buffer Strips ’ 於 400 V，10 mA，2·5 W，4t，100 Vh預電泳 後，於400 V，10 mA，2.5 W，代，200 Vh正式進行電

泳。其結果示於圖6A及B。再者，圖6A係使用上述GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit未經純化而進行上 述電泳之情形之結果。圖⑶係使用上述GFXpCRDNAand Gel Band Purification Kit純化後進行電泳之情形之結果。 圖6A及B各自之單鏈DNA之電泳表型相異，被認爲係 PCR溶液中緩衝液之組成不同所導致者。無論如何，因圖 6A及B於標準菌株與加普胺耐藥性菌株中電泳表型上發現 有差別’故識別其各自者成爲可能。 實施例5 構建***突變型SCDH基因之表現載體，研究對％1)^1抑 83876-970923.DOC -30- 1308593 制劑之抵抗性。 因蛋白質表現載體之pGEX-2 T (Amersham Biosciences公 司製）中，插有水稻稻熱病菌之3,6,8-三羥基-1-四氫萘酮脫 水酵素基因，故使用末端有Eco RI切斷部位之引子7(5匕 ATCGTCGACGTGAATTCGTCTTGTAAAAGCCGCCAAC-3，） 與引子 3 (5，-AGTTCGAACTGGAATTCAACCGGCACGC ATGATGCATGCATTTA-3’）進行 RT-PCR，此 RT-PCR係基於 實施例1中揭示之方法而進行者。引子7及3，分別位於各 自SCDH基因之開放譯讀架（ORF)之上游及下游，將編碼 SCDH酵素之區域全夾於中間。 於進行RT-PCR之際，首先，將標準（野生型）菌或加普胺 耐受性水稻稻熱病菌抽出之全量RNA(各2 pg)，與2 μΐ之 寡（dT)20(10 pmol/μΐ)，各2 μΐ之引子 4 (25 pmol/μΐ)及引子 3 (25 pmol/μΐ)，與 RT-PCR粒子（Amersham Biosciences 公司 製）混合，調製最終容量50 μΐ之反應溶液。反應依據以下 之條件進行。將反應溶液於42°C反應30分，接著於95°C反 應30分，合成cDNA鏈。之後繼續將95°C 30秒，55°C 1分及 72°C 1分所形成之步驟重複25個循環，進行PCR反應。反 應結束後，反應溶液使用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences 公司製）純化 RT-PCR生成物。之後，最終溶於50 μΐ滅菌水。 接著，將含RT-PCR生成物之溶液30 μΐ，與10 X Η緩衝 液（Takara公司製）4 μΐ，Eco RI 1 μΐ (12 u/μΐ，Takara公司 製）混合，使最終容量爲40 μ卜供於37°C限制酵素反應2小 83876-970923.DOC •31 - 1308593 時。限制酵素反應後，使用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences公司製）純化反應 溶液，溶於30 μ卜滅菌水。 另一方面，將GST融合蛋白質表現載體之PGEX-2T (Amersham Biosciences 公司製）1 pg，與 10 X Η緩衝液 (Takara公司製）1 μΐ及 Eco RI 1 μΐ (12 u/μ卜 Takara公司製） 混合，使最終容量爲10 μΐ，供於37 °C限制酵素反應1小 時。向此反應液中加入BAP緩衝液10 μΐ (TOYOBO公司 製），鹼性磷酸酶2.5 μΐ (0.4 u/μΐ，BAP-101，ΤΟΥΟΒΟ公 司製）及滅菌水77.5 μΐ，供於3 7。(：去磷酸化反應2小時。

然後，將2 μΐ之被Eco RI消化之RT-PCR生成物，1 μΐ被 Eco RI/BAP處理過之PGEX-2T，2 μΐ之滅菌水及5 μΐ之溶 合緩衝液I液（Ver, 2，Takara公司製）混合，調製反應液， 供於16 °C溶合反應12小時。反應結束後，依據大腸桿菌 (JM109株）之勝任細胞（Competent cell)(Takara公司製）附加 之項目書，使用反應液將大腸桿菌JM109株轉形。然後將 轉形過之大腸桿菌JM109株輔於含氨爷青黴素50ppm之LB 固體培養基上’於3 7 °C靜置培養12小時。培養後，收集取 付數點之單囷落（Single colony)，進行直接菌落（direct col〇ny)PCR。然後，由直接菌落PCR之結果，篩選出 SCDH基因按目的方向被***之pgeX-2T，進一步，藉由 決定鹼基序列來確認被***之SCDH基因之鹼基序列中有 無差異’以上方法概示於圖7。又，由以上方法獲得之質 體作爲突變型水稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體（FERM 83876-970923.DOC -32- 1308593 BP-7948)，被獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物 寄存中心（曰本國茨城縣築波市東丨丁目丨番地丨中央第幻基 於2002年3月8日之布達佩斯條約而被寄存於國際；再者， 上述水稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體亦已於2〇〇3年5月 21日寄存於食品工業發展研究所（FIRDI)，且授予寄存號碼 為 BCRC 940423。 然後，將SCDH基因準確***之pGEX_2T載體轉形之大 腸桿菌於27。(：於含50 ppm氨苄青黴素之LB液體培地2〇〇如 中培養至OD26。至0.6-1.0。之後，以最終濃度爲！福添加 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，繼續於27r激烈攪拌培養5 小時。培養後，經離心（10,000 5^，10分，4。〇收集大腸 才干菌。爲了清洗大腸菌，首先使其懸濁於冷卻的1/15 M磷 酸鉀緩衝液（PH 6.8)10⑹中，再度經離心（1〇,〇〇〇 xg，1〇 分，4 C )收集大腸桿菌。之後，再度懸濁於冷卻的丨/丨5 μ 磷酸鉀緩衝液（PH 6.8) 5 ml中，邊冰鎮邊於微端（micr〇Up) 超聲波處理後，於，^000 xg離心Μ分，以其上清液 作爲粗酵素溶液。 使用此粗酵素溶液，測定對加普胺之感受性。對加普胺 之感受性與上述實施例丨同樣進行了測定。其結果示於圖 8。再者圖8中，連結空心圓而成之圖及連結實心圓而成之 圖，係實施例1中測定之對加普胺之感受性之測定結果。 由圖8，於大腸桿菌中表現之GST融合SCDH酵素，與標 準菌及加普胺耐受性菌雙方相同，具與由水稻稻熱病菌抽 出之粗酵素液中所含之SCDH酵素相同之藥劑感受性。 83876-970923.DOC -33- 1308593 更，作爲SCDH抑制劑，對於非諾可薩尼錄及基可老吸 麥特亦同樣研究了感受性。結果示於圖9。 由圖9，判明GST融合SCDH酵素即使對此非諾可薩尼錄 及基可老吸麥特亦具有財受性。即，由此圖8及圖9顯示之 結果，已明確GST融合SCDH酵素於各種SCDH抑制劑之存 在下均具有高酵素活性。故，於研究•開發防治即使於 SCDH抑制劑存在下，亦對水稻具有高感染力之耐受性水 稻稻熱菌病菌之藥劑之際，可使用GST融合SCDH酵素而 進行候選物質之篩選。具體而言，於候選物質之存在下， 測定GST融合SCDH酵素之酵素活性，選擇使該酵素活性 有意義降低之候選物質。被選出之候選物質使突變型 SCDH酵素之酵素活性降低，使财受性水稻稻熱菌病菌之 感染力降低。藉此，可防止起因於耐受性水稻稻熱病菌之 水稻稻熱病之發生。 實施例6 水稻稻熱病菌之SCDH酵素中，對於Val75Met突變型之 簡易檢定法，應用PCR-RFLP進行了研究。與實施例3同 樣，微波照射水稻稻熱病菌絲狀菌絲，簡易地調製出基因 組DNA。將此基因組溶液5 μΐ，各1 μΐ之引子8(序列編號 12 ， 5'-TTCGTCGGCATGGTCTCGAGCATCTAG-3' ， 25 pmol/μΐ)，弓| 子 5 (5'-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3'，25 pmol/ μΐ)及PCR粒子混合，以最終容量爲25 μΐ調製 反應溶液。 引子8中有下劃線之鹼基「TCT」，係與模板之基因組 83876-970923.DOC -34- 1308593 DNA之鹼基序列錯配，臨近3,端之鹼基rAG」與後述之由 PCR被;^幅的表初的驗基相同，係爲了形成限制酵素I 切斷識別部位（「TCTAGA」）而設計之序列。即，由pcR 被增幅之最初的鹼基爲A之情形下，經引子8被增幅之片段 中’含有限制酵素Xba I之切斷識別部位。另一方面，經 PCR被增幅之最初的鹼基爲a以外之情形下，增幅片段中 不存在限制酵素Xba I之切斷識別部位。 作爲PCR反應，將95t：30秒，55°C 1分及72°C2分所形成 之步驟重複40個循環，於最終循環之後，於72<t 7分結束 反應。此反應結果，獲得了 183 bp之PCR生成物。使用 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bl〇SClenCes公司製），純化PCR生成物，之後溶於2〇 μ丨之 滅菌水。將其中之7.5 μ卜ΐ〇 χ Μ緩衝液（Takara公司製y μ卜 0.1% BSA溶液 1 μ卜 Xba 】ο」μ1 (12 u/ w，公 司製）混合，使最終容量爲1〇 μ卜供於3rc限制酵素反應i 小時，將反應液全量於3%瓊脂膠電泳之結果示於圖1〇。 再者圖1 0中，列2係使用由標準菌株抽出之基因組DNA 之反應液者。列4係使用標準菌株抽出之基因組]3]^入，未 進订限制酵素反應之反應液者。列5係使用抵抗性菌株抽 出之基因組DNA，未進行限制酵素反應之反應液者。 由圖ίο可明了抵抗性株由來之PCR生成物之xba I處理樣 品’變成了 25個驗基左右之短片@。由此結果，可明確標 準菌株（野生型株）與抵抗性株之區別應用法成 爲可能。

83876-970923.DOC 35- 1308593 産業上之利用可能性 如以上詳細說明，藉由本發明 ^ 霄明，可提供用於對SCDH抑 制劑耐受性水稻稻熱病菌之相關研究之基因。X，此美因 可用於新的SCDH抑制劑之篩選與解析對象之水稻㈣病 菌之對SCDH抑制劑之感受性之評估等。 序列表任意文字（free text) 序列編號5-12係合成引子。 【圖式簡單說明】 圖1係說明水稻稻熱病菌之黑色素生合成路徑之圖。 圖2係顯示3,6,8-三羥基-1-四氫萘酮與之 收光譜之特性圖。 圖3係顯示比較基因庫登錄之水稻稻熱病菌之scdh基因 驗基序列，標準菌株之SCDH基因之驗基序列（cDNA)及抵 抗性株之SCDH基因驗基序列（c A)之圖。 圖4係顯示比較基因庫登錄之水稻稻熱病菌之SCDH基因 鹼基序列’標準菌株之SCDH基因之鹼基序列（基因組 DNA)及抵抗性株之SCDH基因之驗基序列（基因組dna)之 圖。 圖5係顯示由標準菌株及抵抗性株（A及B)分別抽出之粗 酵素液中，加普胺濃度與SCDH酵素活性之抑制率之關係 之特性圖。圖中’〇表示標準菌株由來之粗酵素液，△表 示抵抗性株A由來之粗酵素液，□表示抵抗性株b由來之 粗酵素液。 圖6係顯示實施例4中所進行之單鏈DNA構象多態性 83876-970923.DOC -36- 1308593 (SSCP)解析法之結果之電泳寫真，A(左側）係使用GEX PCR DNA and Gel Band Purification Kit未經純化而進行電 泳之情形之結果。B(右側）係使用GEX PCR DNA and Gel Band Purification Kit純化後而進行電泳之情形之結果。 圖7係概略地顯示水稻稻熱病野生型SCDH cDNA質體及 突變型水稻稻熱病突變型SCDH cDNA質體之製作方法之 圖。 圖8係關於使標準菌株之cDNA於大腸桿菌中表現之GST 融合SCDH酵素，使抵抗性株之cDNA於大腸桿菌中表現之 GST融合SCDH酵素，標準菌株之粗酵素液及抵抗性株之 粗酵素液，顯示加普胺濃度與SCDH酵素活性之抑制性之 關係之特性圖。圖中，〇表示標準菌株由來之粗酵素液， △表示由標準菌株cDNA表現之GST融合SCDH酵素，#表 示抵抗性株由來之粗酵素液，▲表示由抵抗株cDNA表現 之GST融合SCDH酵素。 圖9係關於使標準菌株之cDNA於大腸桿菌中表現之GST 融合SCDH酵素及使抵抗性株之cDNA於大腸桿菌中表現之 GST融合SCDH酵素，顯示非諾可薩尼錄及基可老吸麥特 之濃度與抑制率之關係之特性圖。圖中，〇表示非諾可薩 尼錄所致對由標準菌株cDNA表現之GST融合SCDH酵素之 抑制，△表示非諾可薩尼錄所致對由抵抗性株cDNA表現 之GST融合SCDH酵素之抑制，#表示基可老吸麥特所致 對由標準菌株cDNA表現之GST融合SCDH酵素之抑制，▲ 表示基可老吸麥特所致對由抵抗性株cDNA表現之GST融 83876-970923.DOC -37- 1308593 合SCDH酵素之抑制。 圖1 0係顯示實施例6中進行之應用PCR-RFLP法，解析 SCDH酵素之Val75Met突變型之結果之電泳寫真（3%瓊脂 膠）。 83876-970923.DOC 38- 1308593 序列表 <110〉組合化學工業股份有限公司 <12〇>具農藥用殺蟲劑耐受性之SCDH基因

<130) PH-1735-PCT <140> 092105334 <141> 2003-03-12 <150> JP 2002-66955 <151〉 2002-03-14 <160> 12 <170> Patentln Ver. 2. 1 <210> 1 <211〉 516 <212> DNA <213〉稻熱病菌 <220〉 <221〉 CDS <222〉 （1)..(516) <400〉 1 atg ggt teg caa gtt caa aag age gat gag ata ace ttc tea gac tac Met Gly Ser Gin Val Gin Lys Ser Asp Glu lie Thr Phe Ser Asp Tyr 5 10 15 83876 48 1308593 ctg ggc etc atg aot tgc gtc tat gag tgg gca gac age tac gac tcc 96

Leu Gly Leu Met Thr Cys Val Tyr Glu Trp Ala Asp Ser Tyr Asp Ser 20 25 30 aag gac tgg gat agg ctg ega aag gtc att geg ect act ctg ege att 144

Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val lie Ala Pro Thr Leu Arg lie 35 40 45 gac tac ege tee ttc etc gac aag etc tgg gag gca atg ccg gee gag 192

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Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gin Met Leu Gly Asp Pro Thr 65 70 75 80 etc ege aeg cag cac ttc ate ggc ggc aeg ege tgg gag aag gtg tee 288

Leu Arg Thr Gin His Phe lie Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser 85 90 95 gag gac gag gtc ate ggc tac cac cag ctg ege gtc ccg cac cag agg 336

Glu Asp Glu Val lie Gly Tyr His Gin Leu Arg Val Pro His Gin Arg 100 105 110 tac aag gac acc acc atg aag gag gtc acc atg aag ggc cac gee cac 384

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His 115 120 125 -2- 83876 432 1308593 teg gca aac ett cac tgg tac aag aag ate gac ggc gtc tgg aag ttc Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys lie Asp Gly Val Trp Lys Phe 130 135 140 480 gee ggc etc aag ccc gat ate ege tgg ggc gag ttc gac ttt gac agg Ala Gly Leu Lys Pro Asp lie Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg 145 150 155 160 516 ate ttt gag gac gga egg gag acc ttt ggc gac aaa lie Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys 165 170 <210〉 2 <211〉 172 <212> PRT <213〉稻熱病菌 <400> 2

Met Gly Ser Gin Val Gin Lys Ser Asp Glu lie Thr Phe Ser Asp Tyr 15 10 15

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Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val lie Ala Pro Thr Leu Arg lie 35 40 45

Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Trp Glu Ala Met Pro Ala Glu 83876 1308593 50 55 60

Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gin Met Leu Gly Asp Pro Thr 65 70 75 80

Leu Arg Thr Gin His Phe lie Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser 85 90 95

Glu Asp Glu Val lie Gly Tyr His Gin Leu Arg Val Pro His Gin Arg 100 105 110

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His 115 120 125

Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys lie Asp Gly Val Trp Lys Phe 130 135 140

Ala Gly Leu Lys Pro Asp lie Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg 145 150 155 160 lie Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys 165 170 <210> 3 <2U> 516 <212〉 DNA <213〉稻熱病菌 4 - 83876 <220> - 1308593

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Claims (1)

1308593 公告本 拾、申請專利範圍： !·=分離或純化之基因’其係編碼一種蛋白質，兮 蛋白資為相當於序列編號4所示之胺基酸序列中第: 之纈胺酸之纈胺酸經突變為蛋胺醆而成、且於3“』 羥基-四氫萘酮脫水酵素抑制劑之存在下且，，8_二 羥基-1-四氫萘酮脫水酵素活性者。 /、，，8_二 2. 如申請專利範圍第！項之經分離或純化之 三：基小四氫萘嗣脫水酵素抑制劑係抑制ί 色素生合成路徑中、由3,6,8_三 W萘之脫水反應。 』小四氧萘，形成 3. 如申請專利範圍第1項之經分離或純化之基因，"上 述3,6,8-三經基四氫萘酮脫 因其中上 (―)。 尺酵素抑制劑係加普胺 4. 一種經分離或純化之3,6,8-三羥美] 辛，其俏由、由社宙, 土 ·1-四氫萘酮脫水酵 素其係由如申凊專利範圍第i項之 醇 因編碼者。 77離或純化之基 5. 一種重組載體，其係含有申請 或純化之基因。 11圍第1項之經分離 6. -種轉形體，其係將如申請專 進行轉形而成者。 弟5項之重組栽體 -種感受性評估方法’其係用於 者，戎方法係包含以下步驟： (a)鑑定評估對象之水稻 於3,6,8-三經基-1-四氫蔡酮脫水酵h稻稻熱病菌對 者，該方法係白4 ,、，nr 土 m . '卩制劑之感受性 u三羥基-1 83876-970923.DOC 1308593

感受性進行評估。 (列中、相當於序列編號4所I fe之纈胺酸之胺基酸； 果’對評估對象之水稻稻熱病 四氫萘鋼脫水酵素抑制劑之 如申請專利範圚笛7 τδ β Λ ..

素抑制劑具低感受性。 9. 一種抑制劑篩選套組， 其係包含如申請專利範圍第4項 之3，6,8 -二輕基-1-四氫萘_脫水酵素。 10. —種3,6,8-三羥基-1-四氫萘酮脫水酵素抑制劑抵抗性 水稻稻熱病菌評估套組，其係具有一引子對，該引子 對係以將編碼相當於序列編號4所示之胺基酸序列中第 7 5號之绳胺酸之胺基酸之驗基序列央於中間之方式設 計者。 11 · 一種3，6，8 -三經基-1 -四氫萘酮脫水酵素抑制劑抵抗性 水稻稻熱病菌評估套組，其係具備一寡聚核苷酸，該 募聚核苷酸包含編碼相當於序列編號4所示之胺基酸序 列中第75號之纈胺酸之胺基酸之鹼基序列。 83876-970923.DOC 1308593 第092105334號專利申請案 厂一——.….— ____________________ 中文圖式替換頁(97年9月） 年沿·％.哈修·(更)正替換 GDHPPKSD LVP/0GSIPGI 刀 LVK A A M 2GSQVQKSD ^J&.i^m'票 SCDH瑢桝簿 tg(bp) 聲^^-s-#^^it(GST) E/i1-— >日|,專5昨^0

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PGEX-2H cDN A 矢錄翁濟激KmRNA ECOsEs /U ECoRIaifrv 素— 3 3 51屮丨7 V 83876 1308593 柒、 指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無指定代表圖。 捌、 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 83876-970923.DOC