TWI274058B - Novel polypeptides involved in immune response - Google Patents

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TWI274058B
TWI274058B TW089101990A TW89101990A TWI274058B TW I274058 B TWI274058 B TW I274058B TW 089101990 A TW089101990 A TW 089101990A TW 89101990 A TW89101990 A TW 89101990A TW I274058 B TWI274058 B TW I274058B
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Description

A7 1274058 B7 五、發明說明（1 ) 發明領域 本發明係關涉及T-淋巴細胞活化的多肽。特定而言，本 發明係關T -淋巴細胞之輔助刺激性多肽，編碼該核酸的多 肽，生產該多肽的表現載體和宿主細胞，及用於治療與免 疫抑制和免疫活化相關疾病之組合物與方法。 發明背景 爲了產生適當的T -淋巴球（T -細胞）免疫反應，必需藉由 抗原存在細胞（APC)提供T 細胞兩種信號。首先，必需要 提供抗原給T -細胞受體（TCR)，其經由主要的組織相容性 複合物（MHC)來達成，此舉可決定專一性。其次，必須使 APC上的B7家族成員與T細胞上的CD28蛋白質啣接以傳遞 一種不依賴抗原的輔助刺激性信號。一種生產性的免疫反 應會導致增殖、分化、純種系擴大，以及效應或功能。在 缺乏第2種輔助刺激性信號的情況下，T -細胞會進入一種 持久的特定於抗原之不反應狀態，稱爲無反應性。 T _細胞會引發免疫反應，調控特定於抗原之效應物功 能，並藉著分泌組織介素調節其他白血球的活性。τ -細 胞受體（TCR)能區分τ -細胞與其他淋巴球且只有在其由 APC呈現而在MHC參與之範圍内與抗原結合。某一T-細胞 的功能性活性可與膜抗原如CD4和CD8的表現相關聯。例 如，CD4+ T-細胞一般是作用爲T助手細胞（TH)且受限於第 II類MHC，然而CD8+細胞一般而言作用爲其細胞毒性之 T -細胞（Tc)，且受限於第I類MHC。 先前鍟認之有效的T -細胞共同刺激性多肽包括稱爲B7.1 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) . --線_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 _ B7 五、發明說明（2 ) 的多肽（Freeman等人，《免疫學期刊 >>，第143期，2714-2722頁（1989年），Feeman等人，《實驗醫學雜隸》，第174 期’ 625-631頁（1991年）），以及稱爲Β7·2的多肽（Freeman等 人，《科學》，第 262期，909-911 頁（1993 年，和 Freeman等 人，<< 實驗醫學雜誌》，第178期，2185-2192頁（1993))， (或分別稱爲CD80和CD86)。這些多肽或可被謗發或必要組 成性地在各種APCs上表現，且別爲T-細胞上CD8和CTLA-4的膜結合配體。CD28(Aruffo和Seed，《美國科學院證 >>，第 84期，8573 頁-8577頁（1987年），和Gross等人，《免 疫學期刊》，第144期，3201-3210頁（1990年））是在休眠的 T -細胞上表現且調控正向之輔助刺激性信號。CTLA-4(Brunet等人，《自然》，第 328期，267-270 頁（1987年）0 和Dariavach等人，《歐洲免疫學雜誌>>，第18期，1901-1905頁（1988))的表現是在T_細胞活化時被謗發，且負向調 節CD28的信號，此係由於它對Β7.1和Β7.2之高度結合親和 力。沒有CTLA-4基因的老鼠戲劇性地顯示高量的Τ -細 胞，因爲關閉增殖信號的機制在沒有CTLA-4時會變弱。 此種表現型清楚地證明CTLA_4輔助刺激性蛋白質對Τ -細 胞增殖具有主要的抑制效應。缺少CD28或B7.1或B7.2的老 鼠具有較不嚴重的表現型，這指出T -細胞輔助刺激的替 代途徑可能存在。 吾人對於CD28/CTLA-4作爲調節T _細胞活化和增殖方法 的途徑相當有興趣。一種與人的Fc融合之含CTLA-4細胞 外部份的嵌合蛋白質具有很強的免疫抑制作用，且已在各 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - I------訂·— II---I I · 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274〇58
7臨床背景下被研究過。B7」*B7 2蛋白質的抗體也在免 畏抑制的範疇中被評估過類似指標。抗-CTLA-4抗體已顯 丁其促進T -細胞活化的用途。此外，Β71*Β7·2基因療法 已顯示在癌症免疫療法的範疇中有高度希望。 至今有CD28，CTLA-4，Β7.1和Β7.2涉及單一τ_細胞輔助 f激性途徑。若能藉由調控丁_細胞的輔助刺激作用來調 即免疫反應，則吾人希望能鑑認出同樣或分開的τ_細胞 輔助刺激途徑之其他成員，其可能具有調控宿主了_細胞 功能和免疫反應的有利特性。 因此，本發明的目標是要提供能刺激Τ-細胞活性和/或 增殖的新穎多1。本發明尚有—項目標是要利用該新類多 肽預防和治療T-細胞調節之免疫疾病。 發明搞要 有兩種Τ-細胞輔助刺激途徑中之新穎多肽已令人驚奇地 被發現。該多肽代表·種獨特輔助刺激途徑中的配體-受體 對，孩途徑顯然異於包括先前説明蛋白質CD28， B7.1和B7.2的途徑。該多肽稱與CD28相關的蛋白質_卜 稱CRP1 ;和與B7相關的蛋白質]，或稱B7Rpi。 一 本發明提供編碼CRP1和B7RP1多肽以及相關多肽的核酸 分子。本發明之經分離的核酸分子包括選自包括 的核酸分子： ^ a) 圖1 A中所列示的核嘗酸序列（序列辨識號碼：u · b) 編碼如圖1 A中所列示自殘基1_2〇〇或自殘基21_2〇〇之 多肽的核苷酸序列（序列辨識號碼：i ); c) 编碼至少有大約百分之七十與圖⑽列示的多肤完 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐
--------tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1274058
五、發明說明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 王相同之多肽的核甞酸序列（序列辨識號碼·· 1 ); d) —種自然發生之（a)，（b)或（c)任一者的對偶基因變異體 或替代的接合變異體； e )與（a)，（b)或（c)之任一者互補的核甞酸序列； f) 一種（b)，（c)或（d)的核甞酸序列，其編碼至少大約25， 5〇 ’ 75，100或大於1〇〇個胺基酸殘基之多肽的核甞酸序列； g) —段（a)，（b)或（c)的核甞酸序列，其包括至少大約1〇， 15 ’ 20 ’ 25 ’ 50 ’ 75 ’ 100或大於1〇〇個核甞酸的片段；以及 h) 在嚴苛條件下能與（a)_(g)之任一者雜交的核甞酸序列。 本發明亦提供一種選自以下組群中核苷酸序列之經分離的 核酸分子： a)圖2 A(序列辨識號碼：6)或圖3 A(序列辨識號碼：11} 或圖12A(序列辨識號碼：1 6 )中所列示的核甞酸序列； b )編碼如圖2 A (序列辨識號碼：6 )中所列示自殘基1-322 或自殘基47-322之多肽，或如圖3A(序列辨識號碼：^) 中所列示自殘基1-288或自殘基19-288、20_288、2卜288、 22-288、24-288或28-288 ;或如圖12Α中所列示自殘基 302或自殘基 19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28_ 302之多肽的核甞酸序列； c )編碼至少有大約百分之七十與圖2 Α (序列辨識號碼： 6 )或圖3 A (序列辨識號碼：1 1)或圖12A(序列辨識號碼： 1 6 )所列示的多肽完全相同之多肽的核苷酸序列； d) —種自然發生之（a)，（b)或（c)任一者的對偶基因變異體 或替代的接合變異體； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 擔 . 線· 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（5 ) e) 與（a)，（b)或（c)之任一者互補的核苷酸序列； f) 一段（b)，（c)或（d)的核甞酸序列，其編碼至少大約25， 5G’75’ 1〇〇或大於100個胺基酸殘基之多肽的核甞酸序列； g) —段（a)，（b)或（c)的核苷酸序列，其包括至少大約10， 15 ’ 20，25，50，75，100或大於100個核甞酸的片段；以及 h) 在嚴苛條件下能與之任一者雜交的核苷酸序列。 本發明的主要事物亦關於CRP1和B7RP1多肽及相關的多 肽。本發明提供包含選自以下組群之胺基酸序列之經分離 的多肽，該組群包括： a) 圖1A(序列辨識號碼：2)所列示的胺基酸序列； b) 圖1 A (序列辨識號碼：2 )所列示的成熟的胺基酸序 列’其包括位於殘基21上的成熟胺基端； c )圖1 A (序列辨識號碼：2)所列示之胺基酸序列的片 段’其包括至少大約25，50，75，100或大於1〇〇個胺基酸殘基。 d) —種（a)，（b)或（c)的同源多肽；以及 e) —種（a) ’（b)或（d)或對偶基因變異體或替代的接合變異體。 同時與本發明關聯的是一種包括選自以下組群之胺基酸 序列的經分離多肽，該組群包括： a) 圖2A(序列辨識號碼：7)或圖3a(序列辨識號碼：12) 或圖12A(序列辨識號碼：1 7 )所列示的胺基酸序列； b) 圖2 A(序列辨識號碼：7)所列示之成熟的胺基酸序 列，其包括於殘基47上的成熟胺基端；或圖3A(序列辨識 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - . 線_ A7 1274058 _______B7_ 五、發明說明（6 ) 號碼：1 2 )所列示之成熟的胺基酸序列，其包括位於殘基 19，20，21，22，24或28任一者上的成熟胺基端；或圖 12A(序列辨識號碼：1 7 )所列示之成熟的胺基酸序列，其 包括位於殘基19，20，21，22，24或28任一者上的成熟胺 基端； c )圖2 A (序列辨識號碼：7 )或圖3 A (序列辨識號碼：1 2 ) 或圖12A(序列辨識號碼：1 7)所列示的胺基酸序列的片 段，其包括至少大約25，50，75，100或大於1〇〇個胺基酸 殘基； d) —種（a)，（b)或（c)的同源多肽；以及 e) —種（a)，（b)，⑷或⑷的對偶基因變異體或替代的接 合變異體。 本發明亦涵蓋用於生產多肽的載體和宿主細胞，能與 CRP1和B7RP1多肽以及相關多肽結合的抗體，用於偵測 B7RP1和B7RP1相關的多肽與CRP1和CRP1相關多肽之結合 的檢驗。包含CRP1或CRP1相關多肽和B7RP1或B7RP1相關 多肽的藥物組合物亦涵蓋於本發明之中。本發明亦提供與 CRP1或B7RP1作用之化合物的鑑認方法，做爲測定此種化 合物是否爲CRP1和B7RP1活性之促進物或拮抗物的檢驗。 CRP1或B7RP1多肽涉及τ -細胞輔助刺激和增殖。crpi或 CRP1 ^肤’及其選擇性的結合劑，及其促進劑與插抗劑 可用於診斷，預防和治療與τ_細胞反應之控制有關的免 疫疾病。 CRP1或B7RP1多肽，其選擇性的結合劑，及其促進劑和 _ -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ;線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _B7 _五、發明說明（7 ) 拮抗劑可用於診斷、預防和治療免疫疾病，其或用於刺激 不充份的免疫反應’或減低或是抑制誇大或不適當的免疫 反應。該免疫疾病可能直能或間接地由T_細胞調節之。 本發明提供治療、預防或改善Τ_細胞調控之疾病的用 途，其包括對動物施用CRP1或B7RP1多肽。本發明亦提供 一種方法用於診斷Τ-細胞調節之疾病或動物體内可能由 Τ-細胞調節之疾病，其包括測定CRpi*B7Rpi多肽之存在 或表現量，依據該多肽的存在或表現量診斷斷由τ_細胞 調節的疾病或由Τ -細胞調節疾病的可能性。典型上，一 種Τ -細胞調節的疾病是一種可能直接或間接由τ _細胞調 節的免疫疾病。該動物較好是哺乳動物或更好是人類。本 發明亦提供一種鑑定與CRP1*B7RP1多肽結合之測試化合 物的方法，其包括將多肽與測試化合物接觸，並測定該多 肽與測試化合物的結合程度。該方法可用於鑑認CRP1*/ 或B7RP1多肽之促進劑和拮抗劑。 CRP1和/或B7RP1多肽拮抗物可用做爲許多病徵之免疫 抑制劑，包括自體免疫疾病（如類風濕性關節炎、牛皮 癬、多發性硬化、糖尿病、和全身性紅斑狼瘡）、毒性休 克徵候群、骨髓和器官移植、發炎性水腫瘤、由於輸血造 成的異位致敏，以及治療移植物抗宿主疾病。此外，拮抗 劑可用做抑制劑，用於與T _細胞相依之B細胞調節病徵包括氣喘和過敏，以及抗體調節的自體免疫。CRP1和/或 B7RP1多肤的促進劑或許有用但不限於腫瘤監視和移除之 T -細胞活化作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - -線· -10- i紙張尺度適財格（21Q x 297公董） 1274058 A7 B7 五、發明說明（8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的拮抗物包括抗體或其片段，其會對B7RP1或 B7RP1的細胞外部份具反應性或與之結合，其中該抗體會 降低或減少B7RP1與CRP1之結合。在一項具體實例中，該 抗體選擇性地與人的B7RP1或其細胞外之部份結合。該抗 體或其爲拮抗物之片段會部份或完全抑制B7RP1之免疫輔 助刺激活性。在一項較佳的，該抗體是一種單株抗體，且 或可爲老鼠、人、嵌合的或經人類化的抗體。 本發明尚包括一種調控B7RP1和CRP1作用的方法，其包 括對動物施用一種CRP1之選擇性結合劑，或B7RP1的選 擇性結合劑，或施用二者。在一項具體實例中，該選擇性 結合劑是一種與B7RP1結合的抗體，且其降低或減少 B7RP1與CRP1的結合。本發明亦提供一種調節由B7RP1所 調控之免疫輔助刺激作用的方法，其包括對動物施用 B7RP1之選擇性結合劑。該選擇性結合劑較好是一種抗 體，其能與B7RP1結合，且部份或完全抑制由B7RP1所調 控之免疫輔助刺激作用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明亦提供控制動物體内T _細胞活化或增殖的方法， 其包括對動物施用一種編碼CRP1或B7RP1多肽的核酸分 子。例如，可將編碼B7RP1多肽的核酸分子用於基因療法 以促進T -細胞對各種腫瘤回應之活化作用。 一種經基因轉移的非人哺乳動物亦包含於本發明之範疇 中，其含有編碼CRP1或B7RP1多肽之核酸分子。吾人將 CRP1或B7RP1核酸以一種能夠表現且增加CRP1或B7RP1多 肽之循環濃度的方式導入哺乳動物體内。該經基因轉移之 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（9 ) 非人哺乳動物較好是一種嘴齒動物，且更好是老鼠或家 鼠。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 附圖説明 圖1·Α)鼠的CRPl(mCRPl)之DNA和胺基酸序列，預測之 CRP1信號序列在胺基端有劃底線，而實驗測定之肽原切 割部位以星號指示。預測之貫穿膜的序列則在靠向羧基端 處畫有底線。B)老鼠CRP1蛋白質序列（mCRPl)與老鼠 CD28(mCD28)之胺基酸排比。 圖2.A)鼠的B7RPl(mB7RPl)之DNA和胺基酸序列。預 測之B7RP1信號序列在胺基端劃有底線，而實驗測定之肽 原切割部位則由星號指示。預測之穿透膜的序列在靠羧基 端處畫有底線。B)B7RP1蛋白質序列（mB7RPl )和老鼠的 CD80(mCD80)之胺基酸排比。 圖3 · A)推定之人類B7RP1 (hB7RPl )的蛋白質編碼區結 構和序列。hB7RPl之預測信號序列在胺基端劃有底線。 預測之信號肽切割部位則以星號標示。預測之穿透膜的序 列在靠向羧基端畫有底線。B ).推定之鼠的hB7RP 1蛋白質 和成熟之鼠的B7RP1 (mB7RPl )蛋白質的胺基酸排比。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖4· A)從以pcDNA3/CRPl-Fc轉移感染之293T細胞表現 可溶之CRPl_Fc融合蛋白質。體積經正規化的細胞溶解物 或經調整的培養基指示裝載並在10% PAGE膠體上分離。 用Western分析法分析細胞溶解物和細胞生長基上清液以 得知與細胞相聯（細胞溶解物）和經分泌（生長基）的F c融合 蛋白質之表現情形。主要的抗體是羊抗人的F c抗體（Pierce. 12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 化學公司出品，位於伊利諾州的Rockford市）。B).從以 pcDNA3/B7RPl-Fc轉移感染的293T細胞表現可溶之B7RP1 -Fc融合蛋白質。將2 0微升經正規化的細胞溶解物或培養 基上清液裝載到10% PAGE膠體上並予分離。用Western法 如A)中的方式進行分析。 圖5.CRP1-FC與B7RP1-FC之融合蛋白質和COS-7細胞中 表現之膜結合蛋白質間的交互作用。將C0S-7細胞短促地 單獨用 pcDNA3/CRPl，pcDNA3/B7RPl，或pcDNA3 載體予 以轉移感染。用psDRa/hCD28轉移感染CHO D-細胞並穩 定的表現人的CD28(hCD28)。能表現與膜結合之CRP1， B7RP1或hCD28的細胞成排表示如該圖板左側所標示者。 將F c融合蛋白質與管柱中的濾板結合細胞共同培育，如 該圖板之頂端所指示。培育之後沖洗細胞。用一種抗人的 F c抗體和ACAS分析法（附著細胞分析與分類法：ACAS Ultima，Meridian儀器公司出品，位於密西根州〇kemos市） 偵測結合之F c融合蛋白質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖6 .FACS(螢光活化細胞分類機）分析B7RP1 (推定的， CRP1)之受體在活化的CD4+和CD8+ T -細胞上的表現情 形。將老鼠的脾細胞用PMA和離子黴素（ionomycin)活化十 二小時。將B7RP1-FC融合蛋白質，對照用的Fc蛋白質 (Mock-Fc)或PBS(未染色）與細胞一起培育，沖洗，並緊接 著與羊抗人Fc-FITC結合抗體（GaHuFc-FITC)共同培育，如 每一圖板底部所標示者。添加細胞標記物抗體（對於T -細 胞標記物CD4和CD8)與P E結合者，或同型的對照組抗體 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（11 ) (家鼠的同型物）與PE結合者，或PBS(未染色），如每一個 別圖板左側所標示者。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖7 · FACS(螢光活化細胞分類機）分析B7RP1在B -細胞上 之表現。用螢光細胞計數法分析老鼠的脾細胞上CRP1 (假 設，B7RP1)之配體的表現。將CRPl-Fc融合蛋白質，對照 之Fc蛋白質（Mock-Fc)，或PBS(不含染劑）與細胞共同培 育，沖洗，且緊接著與羊抗人Fc-FITC結合抗體（GaHuFc-FITC)共同培育，如每一圖板底部所標示者。添加與pE結 合之抗CD45R的細胞標記物抗體（CD45R是一種B -細胞標 記物），或同型之對照抗體（家鼠之同型物），或PBS(不含 染劑），如每一個別圖板之左側所指示者。 圖8 .FACS分析腹膜巨噬細胞上mCRPl配體的表現。依 據腹膜細胞之光散射性質首先將其區分爲次細胞組（圖板 A )。巨噬細胞在第五區（R5)被鑑認出來，因爲其強烈使 光線向前散射（FSC)和向旁側散射（SSC)的能力，且由於其 被F4/80抗原，一種巨噬細胞的標記物染色呈正結果（圖板 B )。在第六區（R6)的巨噬細胞被單離出來，此係根據其 F4/80抗原染色結果較弱，且發現其會被CRPl-Fc融合蛋白 質染色（假設此係因其能表現B7RP1)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖9·用一種B7RP1 -Fc融合蛋白質抑制T -細胞增殖。藉 由增加Con A的濃度活化得自老鼠脾細胞之τ -細胞，如該 圖底部所示。在Con A存在或缺少（未添加）的條件下添加 mCRPl-Fc，mB7RPl和mB7.2_Fc融合蛋白質以使τ _細胞增 濃。在一個9 6孔的盤中用200,000個細胞進行τ -細胞增殖 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（12 ) 驗。將細胞與培養基（無添加物）或F c融合蛋白質共同培 百，如圖説所示。4 2小時之後，將細胞用η -胸嘧啶脈衝 處理6小時，然後收獲並測定其併入之放射性。平均cpM 和標準偏差係從三個重複樣品得到並做爲代表。 圖10· A)得自對照組老鼠#1〇的正常腸系膜淋巴結顯示該 淋巴結之皮質、副皮質和髓質。蘇木素伊紅（H&E)染色， 放大4 0倍。B )從WX11老鼠#40得到的腸系膜淋巴結顯著 增大，其具有顯著的囊泡增生（FH)，副皮質擴大和髓索增 生（MH)。H&E，放大40倍。C)得自對照組老鼠#1〇之腸系 膜淋巴結之髓索（MC)和髖竇（MS)之細部觀察。注意該小的 索係由與帶有肥胖巨嗟細胞之髓竇鄰接的大多數小淋巴 球所組成。H&E，400倍。D)得自WX11老鼠#40之腸系膜 淋巴結之髓索（MC)和髓竇（MS)的細部觀察。注意顯著加厚 之髓索係由漿細胞與偶見之羅素體細胞（箭頭處）所組成。 H&E，放大400倍。E)得自對照組老鼠#10的正常脾顯示 動脈周圍淋巴鞘（PALS)之紅色髓區和白色髓區。放大1〇〇 倍。***：以小淋巴球、巨噬細胞和偶見之漿細胞環繞白 色髓區之邊緣區域的細部觀察，放大4〇〇倍。ρ )得自WX11 老鼠#6之具有增大白色髓區之脾臟，該區包括pals和囊 泡（箭頭處），100倍。***：帶有許多漿細胞和偶見羅素 體之邊緣區域的細部觀察，400倍。G)得自對照組老鼠 # 2 5之具有集合淋巴結的迴腸，其囊泡間區域（箭頭處）兩 側是兩個後期囊泡，放大4 〇倍。Η )得自WX11老鼠#32之 具有集合淋巴結的迴腸，其有顯著增大的囊泡和偶見之生 -15· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) β Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13 ) 發中心與囊泡間組織（箭頭處），放大4〇倍。 圖11 · A)得自對照組老鼠# 5與之正常腸系膜淋巴結顯示 該結之皮質、副皮質與髓質。蘇木素-伊紅（Η & E )染色， 40倍放大。B)有顯著囊注增生之得自wxu老鼠#33的顯 著增大腸系膜淋巴結（上方：外皮質中成排的後期囊泡）， 其尚有副皮質擴大（中間）和髓索過度增生（下方）。H&e， 放大4 0倍。C )用抗-B220抗體（b細胞標記物）對得自對照 組老鼠#10的腸系膜淋巴結做免疫組織化學染色。注意深 度（褐色）染色的皮質區和淺的髓索。免疫染色是利用抗生 物素蛋白-生物素複合物（ABC)免疫過氧化酶進行的（DAB 色原蘇木素反染色），40倍。D)用抗-B220抗體對得自 WX11老鼠#33的腸系膜淋巴結做免疫組織化學染色。注意 深度染色的皮質囊泡和髓索（雖然該髓索中成熟的漿細胞 對B220呈負反應），放大40倍。E)用抗_CD3抗體（T-細胞標 記物）對得自對照組老鼠#10的淋巴結做免疫組織化學染 色。注意該淋巴結副皮質區的染色結果，放大4 0倍。F) 用抗-CD3抗體對得自WX11老鼠#33的淋巴結做免疫組織化 學染色。注意該淋巴結副皮質區之加大且深度的染色結 果，放大40倍。 圖12. A)人的B7RP1 (hB7RPl)蛋白質編碼區之結構和序 列。預測之hB7RPl信號序列在胺基端劃有底線。預測之 信號肽切割部位則以星號標記。預測之穿透膜的序列則在 靠向羧基端處劃有底線。B)推定之成熟hB7RPl蛋白質與 成熟的老鼠B7RPl(mB7RPl)蛋白質的胺基酸排比。 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 言 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1274058 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明說明（14 ) 圖13· A)人的CRP1(hCRPl)之蛋白質編碼區的結構和序 列。預測的hCRPl信號序列在胺基端劃有底線。預測的信 號肽切割邵位是以星號標記的。預測的穿透膜序列則在靠 向複基端劃有底線。B) hCRPl蛋白質與老鼠的CRpi (mB7RPl)蛋白質之胺基酸排比。 圖14· CRP-1位在休眠之記憶T_細胞上。得自6至7個月 大老鼠的靜止脾細胞經雙重染色，其利用FITC_結合抗人 的Fc抗體標記之B7RP-l-Fc和一種PE結合的抗體，後者係 抗 CD44(圖 14A)，CD45RB(圖 14B)，或CD69(圖 14C)者。 圖1 5 ·藉由B7RP-1-FC融合蛋白質之T -細胞輔助刺激作 用。A)藉由不同量之mrim-Fc(實心方塊），b7.2-Fc(實心 圓），或OPG-Fc融合蛋白質對照組（空心方塊）與抗〇1)3抗 體連結所謗發之T -細胞增殖。利用不同濃度的融合蛋白 免覆加在96孔平盤上，該平盤已預先以抗人以FAb2(125 微克/亳升）和抗-CD3抗體（0.9微克/毫升）包覆過。以依劑 量而走的方式進行B7RP-1-FC和B7.2-FC輔助刺激T-細胞反 應’劑量達0.3微克/毫升，在此濃度可達到最大效應。B) 以B7RP-1-FC(實心方塊），B7.2_Fc(實心圓），非融合Fc(空 心方塊）或不加Fc(空心圓）與抗_CD3抗體（〇·85微克/毫升） 結合且在各種濃度的免抗ByRP-^Fc多株抗體存在下謗發 T-細胞增殖。FC融合蛋白質的使用濃度爲〇·3微克/毫升且 結合至上的平盤中。以純化的Β7κρ_1-Ι7(：培育抗B7RIM_Fc 抗體，藉由皮下注射乳化於佐劑中的抗原，然後以親和性 純化之。將抗體與F c融合蛋白質共同培養3 〇分鐘，然後 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - |線· 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（15 ) 添加細胞。該抗B7RIM-Fc抗體會特定地抑制由B7rim_Fc 以視劑量而定的方式所謗發的τ _細胞增殖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖16· CRP小Fc和B7RIM-Fc蛋白質對於老鼠體内膠原蛋 白誘發關節炎之病發數（A)和嚴重程度（B)之影響。懷疑患 有膠原蛋白謗發關節炎的Β10·ΚΙΙΙ老鼠以1〇微克豬的膠原 蛋白第二型溶於CFA在尾部底端進行免疫注射。老鼠每週 接受兩次100微克的融合蛋白質。Fc融合蛋白質和對照組 的PBS治療在圖説中有標示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖17· B7RP_1-Fc基因轉移老鼠體内的近側結腸。（A)得自 對照組老鼠#53F(雌性）之正常近侧結腸顯示腸壁有黏膜、 下層黏膜、肌肉和漿膜。蘇木素·伊紅染色，放大4〇倍。 (B)得自B7RP-1-FC基因轉移老鼠#111F之擴散增厚的側結 腸，具有隆凸的腺肥大，潰瘍裂與穿透黏膜的發炎。 H&E，40倍。（C)較低倍之側結腸視圖（如圖格…，得自 B7RP-1-FC基因轉移老鼠#111F，其具有多發性裂潰瘍和穿 透黏膜的發炎。H&E，20倍。（D)得自B7RP-l_Fc基因轉移 老鼠# 111F之裂潰瘍與肥大性結腸腺的仔細觀察（顯示於以 上圖格B和C)。注意有黏液濃性滲出的迴腸，h&e，1〇〇 倍。（E) B7RP-1-FC基因轉移老鼠#112F黏膜下層之肉芽腫 性發炎的細邵觀察，其具有被巨噬細胞、淋巴球和較少的 嗜中性細胞所包園之多核巨細胞。H&E，400倍。F) B7RP_1-Fc基因轉移老鼠#112F的黏膜肉芽腫性發炎的細部 觀察’其具有與淋巴球、漿細胞和較少位於黏膜腺體下鄰 的嗜中性細胞混合的類上皮巨嗤細胞，H&E，400倍。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（16 ) 圖18·在腿1>]如基因轉移老鼠中的遠側結腸。得 自對照組老鼠#53F(雌性)的正常遠側結腸，顯示腸壁的各 層有㈣、下層黏膜，肌層和漿膜。蘇木素-伊紅（酬)染 色，放大40倍。（B)得自隱仏以基因轉移的老鼠（雌性） 之擴散增厚的遠側結腸，其具有隆凸的腺肥大，和增生過 盛與散射的隱窩膿腫。H&E，4〇倍。（c)得自嫌^❿基 因轉移老鼠#55M(雄性），其具有隆凸的腺肥大和增生過 盛。H&E,4〇倍。（D)得自B7RIM_Fc基因轉移老鼠#u2F(雌 性）之擴散增厚的遠側迴腸，具有肥大的迴腸腺，聚集的 淋巴樣叢集和許多隱窩濃腫。H&E，4〇倍。（E)用抗-CD3抗 體（T -細胞標記物）對得自基因轉移老鼠#1丨邛的 遠侧結腸做免疫組織化學染色。注意表面黏膜及結腸淋巴 樣斑塊之免疫染色。H&E，40倍。（F)B7RP-1-Fc基因轉移 老鼠（結腸黏膜的細部觀察，其具有隱窩膿腫（箭頭處）和 由B220+ B細胞組成的淋巴樣叢集（***圖），h&e，1〇〇倍。 圖19. B7RP-1_Fc基因轉移老鼠之小腸。（A)得自對照組老 鼠#53F(雌性）之正常十二指腸，顯示腸腔、纖毛和黏膜隱 窩’以及下層的黏膜。肌層和漿膜。蘇木素-伊紅（H&E)染 色’ 40倍放大。（B)得自B7RP-1-FC基因轉移老鼠#51F(雌 性）< 擴散增厚的十二指腸，其具有隆凸的隱窩肥大和增 生過盛’以及輕微的淋巴漿細胞浸潤位於固有膜中。 H&E ’ 40倍。（C)得自對照組老鼠#53F(雌性）之正常的空 腸’顯不長度正常之纖毛與空腸黏膜中的隱窩。H&E，40 倍放大。（D)得自B7RP-1-FC基因轉移老鼠#51F(雌性）之顯 -19- 不、，，氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 言 Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
1274058 五、發明說明（π) 著増厚的空腸黏膜’其具有局部廣泛之隱窩肥大和增生過 盛H&E，40倍。（E)知自對照組老鼠#53F(雄性）之正常迴 腸’其顯示正常長度的纖毛和隱窩在迴腸黏膜中。臟， 4〇倍放大。（F)得自B7RIM _Fc基因轉移老鼠#23 m(雄性）之迴 腸黏膜輕微萎縮，具有錢損害與纖毛純頭。刪，4〇倍。 圖20. B7RP-1-FC融合蛋白質會抑制老鼠體内的腫瘤生 長，。將Meth Α肉瘤細胞植入Balb/C老鼠的腹部皮内。在植 入後的7, 10, 14和17天用賦性藥（黑鑽）或老鼠的……小 Fc(灰色三角形，實施例7)對老鼠進行治療。在植入後指 定日如實施例20所説明的方法測量腫瘤的體積。該腫瘤 生長炀形經偵測達第2 8天。每一組有8隻老鼠。 圖21·藉由人的B7RP-1-Fc轉助刺激τ-細胞。用抗CD3和 人的B7RP-1-FC包覆96孔的平盤，並且如實施例21説明的 方式培養和收穫1X105個T-細胞/每孔（>98% CD3+)。A)僅 由抗-CD3謗發的輔助刺激作用（實心圖），〇·5微克/毫升 B7RP-l_Fc(實心三角形），〇·5微克/毫升〇pG_Fc(空心圓， 和5微克/毫升抗-CD28(空心三角形），在不同濃度的抗_CD3 主要刺激作用條件下。數據顯示BWP-hFc輔助刺激經抗 -CD3供給訊息的T -細胞至相似於用抗_CD28抗體輔助刺激 的程度。數據顯示得自數個實驗中之一個代表性實驗之三 個重覆孔槽中[3H]TdR併入平均値+/- SD，該實驗係以分離 自二個正常供應著之T -細胞所產生者。B)因劑量而定之 CRP-1-Fc對B7RP-1-FC輔助刺激作用的抑制。將τ_細胞培 養在用抗-CD3，0.3微克/毫升和B7RP-1-Fc，0.5微克/每毫 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公31) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 丨線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（18 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 升二者覆蓋之孔槽之中。在添加τ _細胞之前，將一系列 稀釋濃度的CRP-1-Fc(實心圓）或〇PG-Fc(空心圓）與B7RP-1-Fc預先培育3〇分鐘。數據顯示〇尺1>_1_1^會以依劑量而定 的方式抑制B7RP-1謗發的輔助刺激作用。以抑制百分率對 BTRP-I-Fc^qpg-fc蛋白質濃度作圖。數據顯示在三個重 複孔槽中進行的三個實驗的[3H]TdR併入平均値+/_ ，該 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 實驗係兩個正常供應者所產生之代表性實驗。c)藉由Ch〇 人的B7RP-1細胞之輔助刺激作用。從周圍血液中純化τ_ 細胞’並且以各種濃度的抗-CD3培養之，在只有抗_CD3 單獨存在下（實心圓，1 X 1〇4 CHO載體對照組細胞（空心圓） 或1 X 104 CHO B7RP-1細胞（實心三角形），如實施例22中 所説明者，數據顯示與膜結合之B7RP_丨輔助刺激τ _細胞 生長至利用B7RP-1-Fc融合蛋白質所發現到的程度。數據 顯示的是三個重覆培養物的平均値+/_ SD，且爲兩個正常 供應者所產生的代表性結果。D)組織介素之生產。如圖 21A中説明的方法培養τ-細胞，並在第48小時（黑線條）和 72小時（灰線條）收集上清液。數據顯示由b7RP-1-Fc輔助 刺激細胞（上圖）所生產之IL-2的量相似於由抗-CD3和對照 組F c刺激細胞所生產的量，但是顯著少於由抗_CD28輔助 刺激細胞所生產的量。數據亦顯示B7RP-l_Fc輔助刺激作 用會促進IL-10(中間圖）和IFN-加瑪（下圖）之生產。 本發明之詳細説明 本發明提供本説明書中稱爲CRP1和B7RP1的新穎多肽， 其包括一種涉及T _細胞活化之受體-配體對。編碼該多肽 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7
五、發明說明（19 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的cDNAs係從老鼠腸皮内細胞所製備之基因庫中鑑認出來 的，並且根據其與CD28和CTLA-4多肽（對CRP1而言）或 B7.1和B7.2多肽（對B7RP1而言）之同質性做篩選。 與CD28相關的蛋白質_ 1或crpi，經預測爲第一型穿透 膜的蛋白質，其具有位於胺基端的信號序列和細胞外部 份，一個穿透膜的部份，和一個羧基端之細胞内部份（圖 1 )。該CRP1蛋白質以其成熟形式之全長爲ι8〇個胺基酸。 預測的導引序列跨在大約胺基酸殘基之1 _ 2 〇 (相對於起始 的甲硫胺酸）’而該成熟蛋白質的細胞外部份則涵蓋大約 殘基之21-145(實施例1)。該預測之穿透膜的部份跨在大 約殘基146-163，且該細胞内部份涵蓋大約殘基146_2〇〇。 該胺基端的細胞外部份相似於一個I g環區，其具有保留性 之推定分子内與分子間鍵結的半胱胺酸。並且有一種 ηΜΥΡΡΡΥπ圖式是先前已知對B7.1和B7.2結合至CD28和 CTLA-4很重要的，此圖式亦有部份其保留性。 CD28和CTLA-4具微弱同質性，例如老鼠的CD28和CTLA-4之間有26%的胺基酸完全相同。CRP1有19%的胺基酸與 老鼠的CD28完全相同，而有14%的胺基酸與老鼠的CTLA-4完全相同。然而重要的半胱胺酸殘基在殘基42，63，83， 109和137(相對於CRP1蛋白質中之起始甲硫胺酸，見圖ία) 的位置上，於老鼠的CD28，CTLA-4和CRP之間具保留性。 大約的成熟蛋白質長度與該穿透膜的區域相對於羧基端的 位置在CRPI，CD28和CTLA-4之中亦相似。 人的CRP1是一個穿透膜的蛋白質，其具有如圖13Α中所 -22- 1本紙張尺度顧巾0 0家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # --線 A7 1274058 B7 ___ 五、發明說明（2〇 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 示的核甞酸和胺基酸序列。預測的序列跨在大約殘基1-19 或大約殘基1 - 2 0的位置，預測的成熟胺基端在殘基2 0或 2 1。較好是該成熟胺基端是在位置2 1上。該細胞外部份 跨在任何預測之成熟胺基端至大約胺基酸殘基140，該穿 透膜的部份跨在大約殘基141-161，而該細胞内部份則跨在 大約殘基162-199。人的CRP1蛋白質有69%與老鼠的蛋白 質完全相同，並且對應的核苷酸序列有77%完全相同。人 的CRP1序列報導於Hutloff等人，<< 自然〉〉，第397期， 263-266頁（1999年）的論文中。 與B 7相關的蛋白質_ 1或B7RP1經預測及第一型穿透膜的 蛋白質，其在胺基端有一信號序列和細胞外部份，並有一 穿透膜的部份，而在羧基端有一細胞内部份（圖2A)。該 B7RP1蛋白質之成熟形式全長爲276個胺基酸。預測的導 引序列跨在大約胺基酸殘基1 - 4 6 (相對於起始的甲硫胺 酸），而該成熟蛋白質的細胞外部份則涵蓋殘基47-279(實 施例3 )。預測的穿透膜部份跨在殘基280-298，而該細胞 内部份則涵蓋殘基299-322。相似於B7.1和B7.2的是該 B7RP1的細胞外部份包括了兩個I g環區。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 B7.1和B7.2其微弱的同質性，例如老鼠的B7.1和B7.2之間 有24%的胺基酸完全相同。B7RP1有20%的胺基酸與老鼠 B7.1完全相同，而有19%的胺基酸與老鼠的B72完全相 同。然而重要的半胱胺酸殘基在老鼠的B7.1和B7.2與 B7RP1之間具保留性，其位於殘基62，138，185和242(相對 於B7RP1蛋白質中的起始甲硫胺酸酸，圖2 A)。該成熟蛋 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1274058 B7__ 五、發明說明（21 ) 白質的大約長度與該穿透膜區相對於羧基端的位置在 mB7RPl，Β7·1 和B7.2之間相似。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 人的B7RP1亦爲穿透膜的蛋白質，其具有保留的半胱胺 酸殘基位在細胞外部份，對於I g環結構是必要的。預測的 引導序列涵蓋大約殘基1-18，1-19，1-20，1-21，1-23或1-27，如圖3 A所示。預測的成熟胺基端可位於殘基19，20， 21，22，24或28之任一者。較好是該胺基端位於1 9的位 置。該細胞外部份跨在任一成熟胺基端和大約殘基259之 胺基酸之間。預測的穿透膜部份跨在大約殘基259-274。細 胞内部份則涵蓋殘基275-302。人的完整B7RP1核：y：酸和胺 基酸序列顯示於圖12A之中。人的B7RP1有大約43%與老 鼠的蛋白質完全相同。 CRP1和B7RP1互相結合，但CRP1卻無法被偵測到與 B7RP1有關的蛋白質B7.2結合，且B7RP1未顯示與CRP1 -相關的CD28或CTLA-4有可偵測到的結合（實施例8)。 B7RP1顯示其能調控T -細胞的增殖，推測是經由B7RP1與 CRP1受體交互作用的途徑（實施例1 1 )。因此，CRP1和 B7RP1代表調控T -細胞增殖和活化的新穎途徑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7RP1與CRP1的交互作用可用某種方式調節，使得免疫 輔助刺激作用與T _細胞的增殖和活化得以增加或減少。 藉實例來説明，抗-B7RP1單株和多株抗體培育用以抗老 鼠之B7RP1者，會阻滯B7RP1/CRP1的交互作用，且亦阻 滯由B7RP1 - F c融合蛋白質謗發的T -細胞增殖（參考實施例 1 7)。人的CRP-1-Fc融合蛋白質會阻滞由人的B7RP-1-Fc謗 24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公蓳Γ 1274058
五、發明說明（22 ) 發之人的T -細胞增殖（實施例2丨）。此外，以老鼠的類風 濕性關節炎爲模式的關節炎症狀也會因添加CRP-1_Fc融合 蛋白質而延遲其開始（實施例1 8 )。B7RP-1 /CRP- 1之輔助 刺激作用亦可藉由添加BWP—LFc融合蛋白質或其他此途 &的活化因子而有所增進（實施例2 〇 )。 分子 π經分離的核酸分子”一詞係指一種核酸分子，其不含至 少一種天然與之結合之污染核酸分子，且較好是基本上不 含任何其他污染之哺乳動物的核酸分子。 對偶基因變異體’’ 一詞係指一種基因之數種天然生成的 替代形式之一，其據有生物體之染色體之某一部位。 接合變異體”一詞係指一種核酸分子，通常是RNA，其 藉由RNA轉錄序列中***序列之可能的加工而生成。 π高度嚴苛的條件”是指下列的條件：（1)在沖洗時用低離 子強度和高溫’例如：〇·1 X SSC(0.015 M NaCl/0.0015 Μ檸 檬酸鈉）’ 0.1% NaDodS04在50°C，或（2)在雜交反應時，採 用一種變性劑如甲醯胺，例如：5〇%(v/v)甲醯胺加〇1%牛 血清蛋白/0.1%。Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯酮/5〇 mM磷酸鈉緩 衝液，在 pH 6.5 和 5 X SSC(750 mM NaCl，75 mM 擰檬酸 鈉），在42°C。另一項高度嚴苛條件的實例爲5〇%甲醯胺， 5 X SSC，50 mM磷酸鈉（pH 6.8)，0.1%焦磷酸鈉，5 X丹哈 特氏溶液（Denhardt’s solution)，超音波振盪之鮭魚*** DNA，（50微克/毫升），0.1% SDS，和10%硫酸葡聚糖酯， 在42°C下於0·2 X SSC和0.1% SDS之中沖洗。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # 訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 1274058 A7 B7 五、發明說明（23 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ”中度嚴苛的條件”是指包括使用比上述方式較不嚴苛的 沖洗液和雜交條件（例如：溫度和離子強度）。一個中度嚴 格條件的實例是如在37°C下隔夜培育在下述溶液之中，包 括：20% 甲醯胺，5 X SSC，50 mM磷酸鈉（pH 7.6)，5 X丹 哈特氏溶液，10%硫酸葡聚糖酯，和20微升/毫升剪力處 理之變性鮭魚***DNA，接著將濾器以1 X SSC在大約37-50°C下沖洗。熟習此藝者會認知到如何調整適應因子如探 針長度等等所必需之溫度、離子強度和其他變項。 重組的DNA技術方法列述於Sambrook等人（《分子轉殖： 實驗室手册》冷泉港實驗室出版，冷泉港實驗室，位於紐 約（1989年））和/或Ausubel等人編著，（<<現代分子生物學 方法 >〉，格林出版公司與Wiley and Sons公司出版，紐約 (1994年）本説明書將之完整地併入參考文獻之中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明提供編碼CPR1或B7RP1多肽之經分離的核酸分 子。本發明亦提供的核酸分子爲片段、對偶基因變異體， 接合變異體，或序列上與編碼CRP1和B7RP1多肽的分子互 補者。本發明亦涵蓋至少有70%與編碼CRP1或B7RP1的分 子完全相同的核酸分子，或是能在中度或高度嚴苛的條件 下與編碼CRP1或B7RP1的分子雜交的核酸分子。該核酸 分子可爲cDNA，基因組DNA，RNA或部份或完全合成的 核酸分子。在較佳的具體實例中，本發明的核酸分子至少 有大約 75%，80%，85%，90%或95%與編碼 CRP1 或 B7RP1 的核酸分子完全相同。 編碼CRP1或B7RP1多肽或其片段的基因或cDNA可藉由 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1274058 _____B7 _ 五、發明說明（24 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如雜交篩選或PCR放大一個基因組成cDNA的基因庫而 獲得。有用於基因庫篩選的探針或引子則可根據其他已知 的基因或得自同一個或相關之基因家族的序列訊息而產 生’例如在CRP1或B7RP1相關的多肤中發現的保留性樣 式’如保留之半胱胺酸配置。此外，當編碼CRPi或 B7RP1多肽的基因已從一物種之中被鑑認出來，則該基因 的整個或部份可用作鑑認得自其他物種之同質基因的探 針。該探針或引子可用於從各種被認爲能表現CRP1或 B7RP1基因的組織來源之中篩選出cDNa基因庫。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 萬暴核嘗酸探針被用於篩選cDNA或基因組的基因庫時， 以下兩種高度嚴苛的溶液之一可被採用。第一種是6Χ SSC加〇·〇5°/◦焦磷酸鈉在35。0-62。0，該溫度視寡核巷酸探 針的長度而定。例如，1 4個鹼基對的探針是在35°C -40°C 沖洗’ 1 7個驗基對的探針在45-50。〇沖洗，2 0個驗基對的 探針在52_57°C沖洗，而23個鹼基對的探針在57_63。(：沖 洗。當非特定結合造成的背景顯示爲高時，可將溫度提高 2 - 3 C。第二種高度嚴苛溶液則用氣化四甲銨（Tmac)沖洗 暴核芬酸探針。有一種嚴苛的沖洗溶液是3M TMAC，50 mM Tris-HCl，pH 8.0和0.2% SDS。使用此溶液的沖洗溫度 是探針長度的函數。例如，一個含1 7個驗基對的探針是 在大約4 5 - 5 0 C下沖洗的。 另一項製備編碼CRP1或B7RP1多肽或其片段的方法是採 用化學合成法，利用熟習此藝者已詳知的方法如説明於
Engels 等人（Agnew· Chem. Inti. Ed·，第 28 期：716-734 頁 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) 1274058 A7 B7 五、發明說明（25 ) (1989))。這些方法包括尤其是三磷酸酯，亞磷酸醯胺、和 用於核酸合成的Η -磷酸酯方法。此種化學合成之一項較 佳方法爲利用標準亞磷酸醯胺化學之以聚合物支持（做爲 擔體）的合成方法。典型上，編碼CRpi或B7Rpi多肽的 DNA會有數百個核甞酸的長度。比大約1〇〇個核甞酸長的 核酸可利用這些方法合成爲數個片段。然後將這些片段連 接起來形成完整長旳CRP1或B7Rpi多肽。通常編碼多肽 胺基端的DNA片段會有一個ATG，其編碼一個甲硫胺酸殘 基。這個甲硫胺酸或出現或不出現在成熟形式的CRpi或 B7RP1多肽上，視寄主細胞中生產的多肽是否被設計成從 該細胞分泌出來。 CRP1或B7RP1核酸分子、片段，和/或衍生物本身並不 編碼具生物活性之多肽者，或可用於診斷檢驗之雜交探 針，足性或定量的測試哺乳動物組織或體液樣品中之 CRP1或B7RP1 DNA或對應的rna存在與否。 在某些佗形之中’較好是能製備天然crpi或B7RP1多肽 的核酸和/或胺基酸變異體。核酸變異體可利用定位突 變、PCR放大，或其他適當的方法來生產，其中該引子有 所需的定點突變（請參考Sambrook等人，同上，和Ausubel 等人，同上，有關突變技術之説明）。化學合成利用Engels 等人，同上所説明之方法者亦可用於製備此種變異體。其 他熟習此藝者已知的方法亦可使用。 較佳之核酸變異體包括那些含有業已改變之密碼子以使 CRP1或B7RP1多肽在特定寄主細胞中的表現達到最佳 -28· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - -------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7
五、發明說明（26 ) f。特殊的密碼子改變要視所選擇的蛋白質和寄主細胞而 ^此種舍碼子最佳化”在一項實例中可藉由挑選優先用 於特定寄主細胞之高表現基因的密碼子來實現。能併入密 碼子頻率表如”Ecohigh· cod，，以求高表現之細菌基因優先 密碼子的電腦規則系統即可使用，且由威斯康辛大學套裝 專人第9版提供，遺傳學電腦小組，威斯康辛州Madis〇n 市。其他有用的密碼子頻律表包括： "Celegans—high.cod”，"Celegans—low.cod”， "Drosophile(果繩)—high.cod”，"Human(人類)一high.cod，，，
Maize(玉米)—high.cod"，和"Yeast(酵母菌）—high.cod，， 其他較佳的變異體是那些編碼保留性胺基酸變化如以下説 明者（例如，其中天然的胺基酸側鏈電荷或極性未經不同 的胺基酸取代而有根本的變化），此係與野生種比較而 言’和/或那些經設計以產生新穎的醣化和/或磷酸化部位 者，或那經設計以刪除存在之醣化和/或磷酸化部位者。 編碼CRP1或B7RP1多肽的基因，cdNA或其片段可利用 標準的連接技術***適當的表現或放大載體之中。該載體 典型上是經選擇而能在採用之特殊寄主細胞中具有功能著 (亦即，該載體能與寄主細胞的内部構造相容，使得該基 因的放大作用和/或表現作用得以發生）。該基因，cDNA 或其片段編碼CRP1或B7RP1多肽者可以在原核、酵母 菌、昆蟲（腺病毒系統），和/或眞核寄主細胞之中放大/表 現。挑選寄主細胞部份要視CRP1或B7RP1多肽或其片段 是否要醣化和/或磷酸化而定。若是需要，則酵母菌、昆 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 Β7 五、發明說明（27 ) 蟲或哺乳動物寄主細胞爲較佳者。 典型上，所使用於任何寄主細胞的表現載體含有用於質 m維持和轉殖與表現***之核嘗酸序列的序列。此種序列 總稱爲”兩側序列"，包含了啓動子和其他調節元素如促進 序列，複製元素的起端，轉綠終止元素，完整的***序 列，其包含一個供應者和接受者接合部位，一段信號肽序 列，核醣體結合部位元素、聚腺甞酸化序列，用於***編 碼係表現多肽的核酸之聚連接體區位，以及可選擇的標記 物元素。這些元素之每一者會在以下討論。視需要該載體 可包含一段"標簽，，序列，亦即位於CRpi或B7Rpi多肽編 碼序列之5 ’或3 ’端的寡核铱酸序列；該寡核苷酸分子編碼 聚組織胺酸（如六組織胺酸），或其他，，標簽,，，如FLAG， HA(血球凝集素感冒病毒）或myc，其存在有可構得之抗體 者此釤簽典型上在表現多肽時是與該多肽融合的，並且 可做爲把CRP1或B7RP1多肽從寄主細胞内親和性純化的 工具。例如，親和性純化法可藉由管柱層析法完成，利用 抗該標簽的抗體做爲親和性基質。視需要，利用各種方法 可將該標簽緊接著從純化的CRP1或B7RP1多肽中移除， 如使用特定的蛋白酶。 ,、、、S此藝者可將人的免疫球蛋白關節和Fc區與cRp 1或 B7RP1多肽的N_端或c_端融合在一起。緊接著可利用蛋 白質A親和性管柱純化以融合蛋白質。免疫球蛋白的 區已知在體内存在長的藥物動力學半生期，並且與卩仁區 融ά的蛋白質已被發現在體内存在比未融合之對應蛋白質 -30- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂---------線 » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
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zl (X 格 規 4 Λ J/ η \ 3 V 干 I 【厘 / y 1274058 A7 B7 五、發明說明（28 ) 要長許多的半生期。並且，融合至Fe區能使對某些分子 的生物活性或許有用的分子得以二聚化或多員聚合。 該兩側序列可以是同源的（亦即來自相同物種和\或如同 宿主細胞的細胞株），異源的（亦即來自宿主細胞物種或細 胞株的物種），雜交體的（亦即合併得自一種來源以上之兩 側序列），合成的，或其可以是原始的CRp^B7Rpi核酸 兩側序列。同樣的，該兩侧序列的來源可以是任何單細胞 原核或眞核生物，任何脊椎動物或無脊椎生物，或任何植 物，假若該兩側序列在該宿主細胞構造中具有功能且可被 活化。 有用於本發明載體之兩側序列可得自於數種本技藝中已 知的方4典尘上’本發明有用之兩側序列除了 或 B7贈核酸兩侧序列之外應已先前就藉由拼接和/或内切 限制酶消化而鑑認出來，因此可用適當的内切限制酶從正 確的組織來源分離出來。在某些情形之中，該兩侧序列的 完整核荅酸序列爲已知者。在本説明書中，兩侧序列可利 用上述核酸合成或轉殖的方法予以合成。 當吾人已知兩侧序列的整體或只有部份時，可用pcR和/ 或以適當的寡核苷酸和/或兩側序列片段從同一或另一物 種之中篩選基因庫而獲得。 當孩兩側序列爲未看者，可從較大段的dna分離出含有 兩侧序列之DNA片段，該DNA可包含例如一段密碼序列或 甚至其他基因。分離工作用藉由内切限制酶來完成，利用 -種或更多小心選擇的酵素以分離出正確的dna片段。消 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058
五、發明說明（29) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 化4用（後，可藉由壤脂膠體純化法 η 他熟習此藝者已知的方法分離出所需片段。對於一般= 言，選擇適當的酵素以達成此目標可説是十分 顯然易知的。 複製元素的起始點典型上是購得之原核表現載體的—部 份，並且能協助載體在宿主細胞之中放大。在某些情況之 中’將載體放大至某個複本數目可能對於CRP1或B则 多肽的最佳表現是重要的。若是所選的載體不含複製區位 〈起始點’則吾人可根據已知的序列予以化學合成。並連 接至該載體。 轉錄終止元素典型上位於CRP1或B7RP1多肽密碼序列之 3’端，並作用於使CRpi或B7Rpi#肽之轉錄終止。通常 ，核細胞内的轉錄終止元素是一段富含G_c的片段，接著 是聚-T序列。雖然該元素很容易從基因庫中轉殖獲得或 甚至可以購得而是載體之部份，但其亦可容易地利用如以 上所説明的核酸合成法很容易地合成出來。 一種選擇性標記用基因元素係編碼宿主在選擇性培養基 中存活和生成所必需的蛋白質。典型的選擇性標基用基因 編碼下述蛋白質··（a)提供對於抗生素或其他毒素，例如抗 原核宿主細胞之氨苄青黴素、四環素、或康黴素之抗性 者，（b)補足細胞之營養缺陷者；或（c)補充未能自複合培 養基得到之重要營養素。較佳之可選擇標記物是抗康黴素 基因、抗氨芊基黴素基因，以及抗四環素基因。 核糖體結合元素一般稱作山恩-道格諾（shine_Dalgarn〇) -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣
I I I I I I I 訂-------I I » 1274058 A7 B7 五、發明說明（3〇 ) 序列（原核生物）和柯札科（Kozak)序列（眞核生物），其通常 對於mRNA之轉譯起始而言是必要的。該元素典型上位於 待合成之CRP1或B7RP1多肽啓動子之3，端和編碼序列的5， 端上。山恩-道格諾序列是有變化的，但典型上是聚嘌呤 (亦即具有高含量的A - G )。有許多山恩-道格諾序列已被 鑑識出來，並且其中有許多在經挑選宿主細胞中具功能者 可與CRP1或B7RP1基因或cDNA結合使用。有許多山恩道 格諾序列已被鑑識出來，其每一序列可以很容易地利用以 上陳述的方法合成並使用於原核的載體。 在欲使CRP1或B7RP1多肽從宿主細胞分泌的那些情形之 中，可以利用一段信號序列導引多肽從宿主細胞釋出。並 且將CRP1或B7RP1的穿透膜之區位以突變或刪除方式使 其失活，以防止連接至宿主細胞膜。無型上，該信號序列 被放在CRP1或B7RP1基因或cDNA的編碼區，或直接放在 CRP 1或B7RP1基因編碼區的5 *端。有許多序列已被鑑識 出來，且其中任何可在所挑選宿主細胞中有作用的序列均 可用於和CRP 1或B7RP1基因或cDNA結合。因此，該信號 序列可與CRP1或B7RP1基因或cDNA同源或異源，且可與 CRP1或B7RP1多肽基因或cDNA同源或異源。此夕卜，該信 號序列可利用以上陳述的方法予以化學合成。 在大多情況之中，藉由一段信號肽的存在自宿主細胞分 泌多肽會導致胺基端的甲硫胺酸從多肽上被刪除。 在許多情況之中，CRP1或B7RP1基因或cDNA的轉錄會 隨載體中的一個或更多***序列的存在而增加，這在 -33- 本紙張尺度_巾關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) »衣 訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（31) CRP1或B7RP1多肽在眞核宿主細胞，尤其是在哺乳動物 的宿主細胞中生產時尤然。所使用的***序列可能是 CRP1或B7RP1基因之中天然發生的，尤其是當所使用的 基因是完整長度的基因組序列或其片段。當該***序列並 非是該基因中天然發生者（比如對於大多cDNAs而言），該 ***序列可得自其他來源。該***序列相對於CRpl或 B7RP1基因之5 ’ -兩側序列的位置一般而言很重要，因爲 邊***序列必需經轉錄才能有效。如此，當***表現載體 CRP1或B7RP1基因是一個CDNA分子時，該***序列的較 佳位置是在轉錄起始部位的3，一側，且在聚腺甞酸轉錄終 止序列的5,一側。較好是該***序列位於⑺^入的一側或 另一側（亦即5,或3，），使其不要干擾到這個密碼序列。得 自任何來源的任何***序列，包括任何病毒的，原核和眞 核（植物或動物）的生物者可用於本發明之實行，只要其能 與所***之宿主細胞與該宿主細胞相容。本發明亦包括合 成的***序列。視需要而定，該載體中可使用一個以上的 ***序列。 當以上所列述之一種或更多元素未出現在所使用的載體 内時，其可個別獲時並連接至該載體之中。用以獲得每一 元素的方法對熟習此藝者而言爲詳知者。 用於實行本發明之較佳載體是那些能與細菌、昆蟲、和 哺乳動物宿主細胞相容者。此種載體包括尤其是1)(：1111和 pCR3和pcDNA3.1(加州聖地牙哥市的invitrogen&司出品）， pBSII(加州 La Jolla市的 Stratagene公司出品），pET15b(威斯 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·»衣 -------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（32) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 康辛州邁狄遜市的Novagen市出品），pGEX(紐澤西州 Piscataway 市的 Pharmacia Biotech 公司出品），pEGFP-N2 (加州 Palo Alto 市的 Clontech公司出品），pETL(BlueBacII; Invitrogen 公司出品）和 pFastBacDual(Gibco/BRL，公司出 品，紐約 Grand Island市）。 待載體已建構好並且編碼完整長度或經修整之CRP1或 B7RP1多肽的核酸分子已***該載體之正確部位之後，可 將已完成之載體***適當的宿主細胞中進行放大和/或多 肽之表現。 宿主細胞可以是原核宿主細胞（如大腸桿菌）或眞核宿主 細胞（如酵母菌細胞、昆蟲細胞，或脊椎動物細胞）。該宿 主細胞在適當條件下培養時，能合成CRP1或B7RP1多 肽，其可緊接著從培養基中收集（若該宿主細胞將多肽分 泌至培養基内）或直接從生產該多肽的宿主細胞收集（若該 多肽不被分泌出來）。收集以後，可利用如分子篩層析 法、親和性層析法及類似者純化CRP1或B7RP1多肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 選擇用於生產CRP1或B7RP1多肽的適當宿主細胞要視各 種因素而定，如所需的表現濃度、爲得到活性所需的多肽 修飾，如糖化作用或磷酸化作用，或摺疊成具生物活性分 子之難易而定。 適當的細胞或細胞株可以是哺乳動物細胞，如倉鼠的卵 細胞（CHO)，人的胚腎（HEK)293或293T細胞，或3T3細胞。 選擇適當的哺乳動物寄主細胞和轉型、培養、放大篩選及 產物生產和純化的方法已見知於本説明。其他適當的哺乳 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（33) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 動物細胞株有猴子的C0S-1和C0S-7細胞株，和CV-1細胞 株。更多作爲範例的哺乳動物寄主細胞包括靈長類細胞株 和鳴齒類細胞株，包括經轉型的細胞株。得自體外原發現 組織培養的正常細胞、細胞株，以及原始外植物亦適當。 候選細胞在基因型上可缺少選擇基因，或可包含一種優勢 作用的選擇性基因。其他適當的哺乳動物細胞株包括但不 限於老鼠的神經胚細胞瘤N2A細胞，HeLa，老鼠的L929細 胞’得自瑞士 Balb-c或NIH老鼠的3T3細胞株，BHK或HaK 食鼠細胞株。 相似之有用的宿主細胞株是細菌細胞。例如在生物技術 領域已詳知做爲宿主細胞的各種大腸桿菌株（例如， HB101，DH5a，DH10，及MC1061)。各種枯草桿菌、假單 胞菌、其他桿菌。鏈黴菌之菌株及類似者亦可被採用於本 方法。 有許多熟習本技藝者已知的酵母菌細胞株亦可獲得，用 作宿主細胞以表現本發明之多肽。 此外，若需要昆蟲細胞系統可被用於本發明之方法。此 種系統敘述於例如Kitts等人(<<生物技術》，第14期：810- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 817 頁（1993 頁）），Lucklow(<< 當代生技見解 >>(Curr. Opin. Biotechnol·，）第 4 期：564-572 頁（1993 年））和 Lucklow 等人（<< 病毒學期刊》，第67期，4566-4579頁（1993年））。較佳的昆 蟲細胞疋Sf-9和Hi5(加州Carlsbad市的Invitrogen公司出品）。 將一種表現載體”轉型"或"轉移感染”至所選擇的宿主細 胞可利用如氯化鈣、電穿孔法、微注射法、脂粒感染法或 -36 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 Α7 Β7 五、發明說明（34 ) DEAE-葡聚糖法來完成。所選擇的方法部分可能是所使用 之該i值主細胞功能。這些方和其他適當方法爲熟習此藝 者詳知者。且業經陳述過，例如在Sambr〇〇k等人之前述論 文中。 用表現載體轉型或轉移感染的宿主細胞可用熟習本技藝 者已詳知的標準培養基培養。該培養基通常含有細胞存活 和生長所必需的營養素。培養大腸桿菌的適當培養基爲， 例如Luna肉汁（LB)，和/或Terrific肉汁（TB)。培養眞核細 胞的適當培養基是RPMI 164〇，MEM，DMEM，所有培養基 均可依待培養之特殊細胞株所需補充血清和/或生長因 子。昆蟲培養之適當培養基爲Grace氏培養基，補充以所 需的酵母抽取物、乳清蛋白水解物和/或胎牛血清。 典型上，會將有用於轉型細胞之選擇性生長的抗生素或 其他化合物添加到培養基内做爲補充劑。所使用的化合物 由使宿主細胞轉型的質體上出現之可選擇標記元素所指 定。例如，當該選擇性標記元素是對康黴素具抗性者，則 該培養基内應添加的化合物即是康黴素。 宿主細胞中CRP1或B7RP1多肽的生產量可利用本技藝中 已知的標準方法來評估。此種方法包括但不限於西方墨點 分析法。SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳、非變性膠體電泳， HPLC分離法、免疫沈澱法和/或活性檢驗如DNA結合膠體 偏移檢驗。 若CRP1或B7RP1多肽業經設計而能從宿主細胞内分泌出 來，則大多數多肽可在細胞培養基内被發現。用此種方法 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（35) 製備的多肽典型上不具胺基端的甲硫胺酸，因爲其已在細 胞分泌出來的過程被刪除了。然而，若CRP1或B7RP1多 肽並供法自佰主細胞内分泌出來，則其存在於胞漿和/或 核内（對於眞核的宿主細胞而言）或在細胞質内（對於格蘭 氏陰性細菌宿主細胞而言），且具有胺基端的甲硫胺酸。 從落液中純化CRP1或B7RP1多肽可用許多技術來完成。 若孩多肽業經合成而在其羧基或胺基端含有一個標記如六 組織胺酸（CRP1 /B7RP1 /hexaHis)或其他小的肽如FLAG(康 州New Haven市的柯達公司出品）或myc(加州以小―市的 Invitrogen公司出品），則其基本上可用單步驟方法純化， 藉著將有標記之多肽通過一種親和性管柱，其中該管柱的 基質對該標記或直接對該多肽有高度親和性（亦即一種特 定辨識CRP1或B7RP1多肽之單株抗體）。例如，聚組織胺 酸以高親和力與特定性與鎳結則，則可使用含鎳的親和性 管枉（如Qiagen®鎳管柱）純化crpi /B7RP1 /聚組織胺酸（請 參考例如Ausubel等人編著的《現代分子生物學方法》， 第 10.11.8邵份，紐:約 John Wiley & Sons公司出版（1993 年））。 當CRP1或B7RP1多肽經製備而沒有標記附加在上面，且 無法獲得抗體，則可使用其他已詳知的純化方法。此類方 法包括但不限於離子交換層析法，分子篩層析法， HPLC ’原始膠體電泳法且與膠體沖提法併用、和製備用 之等電距焦法（"Isoprime"機器/技術，Hoefer Scientific公司 出品）。在某些情形之中，這些技術中之兩種或更多可併 用以達到增進的純度。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（36 ) 若吾人期望CRP1或B7RP1多肽主要是在細胞内被發現， 則可用熟習此藝者已知的任何標準技術從宿主細胞抽取細 胞内物質（包括格蘭氏陰性菌之包涵體）。例如，可將細胞 溶解以釋出外膜/細胞質，藉由法國擠壓法、均質化法和/ 或超音波振動，接著以離心法來達成。 若CRP1或B7RP1多肽已在細胞液中形成了包涵體，則該 包涵體經常會與内部和外部的細胞膜結合，因此在離心後 會發現其主要在小塊物質之中。然後可用極端之pH處理 該小塊物質，或用chaotropic試劑如洗濯劑、胍、胍衍生 物、尿素或尿素衍生物，在還原劑如二硫蘇糖醇存在下於 鹼性pH或酸性pH下之三羧乙基膦處理而使其釋出、破 裂、並使包涵體溶離出來。然後可用膠體電泳法、免疫沈 澱法或類似者分析多肽之當前溶解形式。若是需要分離出 CRP1或B7RP1多肽，則可用標準法如以下列示者和 Marston等人《酵素學方法》，第182期·· 264_275頁（199〇年》 的方法來達成分離。在某些情形之中，CRP1或B7RP1多 肽在分離時是不具生物活性的。許多方法被用於，，重新摺 疊"或將多肽轉變成其三維結構並產生二硫鏈連接者可用 於恢復生物活性。此種方法包括使溶離的多肽與pH通常 在7以上的溶液在特殊濃度的適當chaotrope存在下接觸。 在大多情形之中，重新摺疊/氧化溶液亦包含一種還原 劑，或該還原劑與其對應的氧化形式以特定比例存在，以 產生特殊的氧化還原電位使蛋白質的半胱胺酸架橋形成時 發生二硫鏈重新洗牌的結果。一些常使用的氧化還原對偶 丨 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -------訂--------- »· 1274058 A7 B7 五、發明說明（37) 包含半胱胺酸/半胱胺；穀胱甘肽（GSH)/二硫雙GSH，氯化 亞銅，二硫蘇糖醇（DTT)/二硫烷DTT，2_巯基乙醇（bME)/ 二硯基-b(ME)。在許多實例當中，必需要有輔助溶劑才能 增進重新摺疊的效率，並且爲此目的之較常用試劑包括甘 油、各種分子量的聚乙二醇，和精胺酸。 CRP1或B7RP1多肽、片段和/或其衍生物亦可藉由化學 合成法（如固相肽合成）利用熟習此藝者已知的技術如那些 由Merrifield等《美國化學會誌〉>，第85期：2149頁（1963))， Houghten等人(<<美國國家科學院進展”第82期·· 5132頁 (1985))及 Stewart 和 Y〇ung(<< 固相合成》，Pierce 化學公 司，位於伊利諾州R0Ckf0rd市（1984年））所陳述者製備之。 此種多肤之合成可在胺基端帶有或不帶有甲硫胺酸。化學 合成的CRP1或B7RP1多肽或片段可用這些參考文獻所宣 佈的方法予以氧化形成二硫化物架橋。CRP1或B7Rpi多 肽或片段被期望具有可與重組方式生產CRP1或b7RP1多 肽，或從天然來源純化者相比的生物活性，從而能與重組 的或天然CRP1或B7RP1多肽交換使用。 多肽 "CRP1或B7RP1多肽” 一詞係指具有圖1A(序列辨識號 碼：2 )，圖2 A (序列辨識號碼：7 )或圖3 A (序列辨識號 碼：1 2)之胺基酸序列的多肽和所有本説明書中説明之相 關多肽。相關的多肽包括：對偶基因變異體、接合變異 體、片段、衍生物、取代、刪除和***之變異體、融合蛋 白質和同源物。此種相關多肽可以是成熟多肽，亦即缺少 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（38) 信號肽的多肽。CRP1或B7RP1多肽或具有或不具有胺基 端的甲硫胺酸，這要視其製備的方式而定。 ” CRP1或B7RP1多肽片段’’ 一詞係指比CRP1或B7RP1多 肽之完整胺基酸序列短少的肽或多肽，完整序列列示於圖 1 A (序列辨識號碼：2)，圖2 A (序列辨識號碼：7)或圖 3 A (序列辨識號碼：12)。此種片段的形成可由切掉胺基 端、切掉羧基端，和/或從中間刪除該多肽序列。此種 CRP1或B7RP1多肽片段可在有或沒有胺基端之甲硫胺酸 的條件下製備。此外，CRP1或B7RP1多肽片段可以是天 然的接合變異體，其他接合變異體，和得自天然體内蛋白 酶活性的片段。較佳之CRP1或B7RP1多肽片段包括可溶 形式的CRP1或B7RP1，其缺少穿透膜的區位，且包含 CRP1或B7RP1之細胞外區位的全體或部份。 ’’CRP1或B7RP1多肽變異體”一詞係指CRP1或B7RP1多 肽之胺基酸序列中含有一個或更多胺基酸序列取代、刪 除、和/或添加者，此乃與列示於圖1 A (序列辨識號碼： 2)，圖2A(序列辨識號碼：7)或圖3A(序列辨識號碼： 之CRP1或B7RP1多肽胺基酸序列相較而言。此種crpi或 B7RP1多肽變異體可從對變的CRP1或B7RP1多肽核酸分子 變異體製得，該核酸分子係從CRP1或B7RP1多肽之DNA 序列變異而得。 如本説明書所使用的"CRP1或B7RP1多肽衍生物” 一詞， 係指CRP1多肽、變異體或其片段中經化學修飾者，例如 藉由添加一種或更多水溶性聚合物，與N -連接或與〇 _連 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 » 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（39 ) 接的_類、糖、磷酸鹽、和/或其他此種分子，而這些分 子並非天然與野生型的CRP1或B7RP1多肽接合者。衍生 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物尚包括刪除天然與CRP1或B7RP1多肽連接之一種或更 多化學基因。 如本説明書中所使用的”具生物活性之CRp 1或B7RP1多 月太"、”具生物活性之CRP1或B7RP1多肽片段"、"具生物 活性之CRP1或B7RP1多肽變異體"係指CRP1或B7RP1多肽 中具有至少一種CRP1或B7RP1之活性特徵者。有一種活 性是使CRP1或B7RP1結合。另一種活性是CRP1或B7RP1 刺激T -細胞增殖和/或活化。 M同源物”一詞係指與一種物種體内鑑認到之多肽相對應 的多肽。例如：老鼠和人的B7RP1多肽就被認爲是同源 物。 成熟的胺基酸序列”一詞係指缺少引導序列的多肽。 ，經分離之多肽"係指一種多肽，其不具有至少一種能在 其天然環境發現之多肽，且較好是基本上不含任何污染的 哺乳動物多肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ”同一性”一詞在本技藝中是指兩種或更多核酸分子或雨 種或更多多肽之間的關係，此係藉由比對序列來決定。在 本技藝中，同一性亦指多肽或核酸分子序列之間序列的相 關程度，該情況或許是以比較兩條核苷酸或胺基酸序列之 間是吻合來決定。”同一性”係測量兩個或更多序列之間完 全相同之吻合百分率，其乃由特殊電腦程式（亦即"規則系 統"）所表現之間隙排列來測定。 -42- 1本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（40) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) π相似性” 一詞係指一種相間概念，但與”同一性”是對比 的，其乃測量包括完全吻合和保留性取代之吻合這兩種相 似性。因爲保留性取代只適用於多肽而不適用於核酸分 子，因此相似性只與多肽序列的比較有關。若兩種多肽序 列具有例如10/20完全相同的胺基酸，且剩餘者均爲非保 留性取代，則”同一性”和”相似性”的百分率均爲50%。若 在同一實例中，有多出5個的位置上有保留性取代，則其 同一性的百分率仍爲50%，但是相似性的百分率將是75% (15/20)。因此在有保留性取代的情況下，兩種多肽序列之 間的相似程度會高於此二序列之間同一性的百分率。”保 留的”胺基酸取代作用在本説明書之以下會説明，請參考 表1。根據表1，保留性胺基酸取代是選自同一群的可交 替胺基酸，例如；驗性的、酸性的、無電荷之極性的，和 非極性的。例如，精胺酸之保留性胺基酸取代是離胺酸和 組織胺酸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 同一性和相似性可以很容易地用已知的方法計算出來， 其包括但不限於 < < 計算分子生物學〉>，Lesk，Α.Μ.編著， 牛津大學出版社，紐約，1988年；《生物計算：資訊學與 基因組計畫〉〉’ Smith，D.W.編著。Academic Press 出版， 紐約，1993年，《序列數據之計算機分析》，第1部， Griffin，Α·Μ·和Griffin，H.G·編著，Humana，Press出版，紐:澤 西州，1994年；《分子生物之序列分析》，von Heinje，G., Academic Press出版，1987年；和《序列分析引子》， Gribskov，M.和Devereux，J·，編著，M· Stockton Press 出版， -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（41) 紐約，1991 年；和 Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM應用數 學雜誌》，第48期：1073頁（1988年）。之中説明的方法。 較佳之測定同一性和/或相似性的方法係經設計以產生 待測序列之間之最大吻合。測定同一性和相似性的方法整 理在公開可獲得的計算機程式中。較佳之測定兩序列間同 一性與相似性的計算機程式方法包括但不限於：GCG套裝 程式，包括GAP(Devereux，J·，等人，《核酸研究》，第1 2 期，（1) : 387頁（1984年）；遺傳學計算機小組，威斯康辛大 學，威斯康辛州邁狄遜市），BLASTP，BLASTN，和 FASTA(Atschul，S.F.等人，《分子生物學雜龍》，第215 期：403-410頁（1990年）。BLAST X程式可公開得自國家生 物技術資訊中心（NCBI)和其他來源（BLAST手册，Altschul. S·，等人，NCB NLM，NIH馬來蘭州的 Bethesda市，20894 ; Altschul，S·，等人，《分子生物學雜諸》，第215期：403-410頁（1990年）。已詳知的Smith Waterman規則系統可用於 測定同一性。 藉由實例説明，利用計算機規則系統GAP(遺傳學計算機 小組，威斯康辛大學，威斯康辛州邁狄遜校區），將兩種 序列同一性百分率待測定之多肽排比以求其相對之胺基酸 的最佳吻合（即”吻合的區段"，如規則系統中所測得者）。 間隙開放懲罰値（其計算爲平均對數的3倍；”平均對數”是 指所採用之比較方陣的對數平均値；該"對數"是指與特殊 的比較方陣吻合之每一完整胺基酸的指定分數或數字）， 和間隙延伸性懲罰値（通常是間隙開放懲罰値是丨/iO倍）， • 44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1274058 A7 B7 五、發明說明（42) 以及比較方陣如PAM 250或BLOSUM 62乃與規則系統連結 使用。規則系統亦使用標準比較方陣（請參考Dayhoff等 人，《蛋白質序列與結構百科>>，第5卷，補編3 ( 1978年） 對於PAM250比較方陣之説明；請參考Henikoff等人，《美 國國家科學院進展》，第89期：10915-10919( 1992年），對 於BLOSUM 62比較方陣之説明）。 用於多肽序列比較之較佳參數包括以下： 規則系統：Needleman和Wunsch，<<分子生物學雜就、’ 第 48 期：443-453 頁（1970 年） 比較方陣：BLOSUM 62，得自 Henikoff和Henikoff，《美國 國家科學院進展》，第89期：10915-10919頁（1992年） 間隙懲罰値：12 間隙長度懲罰値：4 相似性閾値：0 具備以上參數的GAP程式是有用的。先前提過的參數在 利用GAP規則系統之多肽比較上是簡略參數（對於末端間 隙無懲罰値）。 較佳之用於核酸分子序列比較的參數包括以下： 規則系統：Needleman和Wunsch，<〈分子生物學雜諸〉〉’ 第 48 期：443-453 頁（1970 年） 比較方陣：吻合數：+10，不吻合數=〇 間隙懲罰値：5 0 間隙長度懲罰値：3 GAP程式就以上參數而言亦有用。先前提過的參數對核 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1274058 A7 B7 五、發明說明（43) 酸分子的比較是簡略參數。 其他做爲實例的規則系統、間隙開放懲罰値、間隙延伸 懲罰値、比較方陣、相似性閾値等等可被熟習此藝者所使 用，包括那些在 <<程式手册，威斯康辛套裝程式 >〉第9 版，1997年9月出版所列示者。特殊選擇則要視待完成的 特定比較而定，諸如：DNA對DNA，蛋白質對蛋白質，蛋 白質對DNA ;此外，無論比較是在成對序列之間（其中 GAP或BestFit—般而言是較佳者）或在一個序列一個大的序 列資料庫之間（其中FASTA或BLASTA爲較佳者）。 至少有大約70%同一性的多肽典型上含有一個或更多的 胺基酸被取代’刪除和/或添加，當其與野生型CRp 1或 B7RP1多肽比較時是如此。在較佳的實例中，多肽有大約 75%，80%，85%，90%或95%與 CRP1 或 B7RP1 多肽完全相 同。通常’原始殘基經取代者或爲丙胺酸或保留性的胺基 酸，以使多肽的全部淨電荷、極性、或厭水性受到最少影 響或不受影響。保留性取代列述於以下表1之中。 表1 保留的胺基酸取代 驗性的： 精胺酸 離胺酸 組織胺酸 酸性的： 麩胺酸 天冬胺酸 播電荷而具極性： 麩胺醯胺 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1274058 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（44 ) 天冬醯胺 絲胺酸 蘇胺酸 赂胺酸 非極性： ***酸 色胺酸 半胱胺酸 甘胺酸 丙胺酸 纈胺酸 甲硫胺酸 亮胺酸 正亮胺酸 異亮胺酸 本發明ί疋供CRP1或B7RP1多肽衍生物。在一 j頁具體實例 中，經化學修飾的CRP1或B7RP1多肽組合物中cRpl或 B7RP1多肽與聚合物連接著亦包括在本發明的範疇之中。 所選的聚合物典型上是水溶性的，使與其接合的蛋白質不 會在水溶液環境如生理環境上沈澱。所選擇的化合物通常 經修飾而有單-反應基，如用於酸化的活性醋或用於嫁基 化的醛，使得聚合反應的程度可由本發明所提供的方法控 制。該t合物可具任何分子量ϋ可以丨分枝或非分 的。在本發明的範疇中所包括的是聚合物的混合物。較好 是對於終產物之醫療用途的製備而言，該聚合物是藥物學 -47· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -1_1 ϋ 1·— ϋ ϋ an a ϋ ϋ 線 ·! 1274058 A7 ____ B7 五、發明說明（45) 上容許的。 水溶性聚合物或其混合物可選自包含以下成份的組群， 例如：聚乙二醇(PEG)，單甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纖 、、隹素，或其他以醣類爲基底的聚合物，聚_(N _乙晞基吡 咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚烷氧丙烷/環氧乙 烷、共聚物，聚氧乙基化多醇（例如··甘油）和聚乙晞醇。 對於醯化反應而$，所選的聚合物必需有一個單一的反 應性酯基。對於還原性烷基化反應而言，所選聚合物必須 具有單一的反應性醛基。一種較佳的反應性醛基是聚乙二 醇丙醛，其在水中具穩定性，或是它的單一 C丨丨〇烷氧基 或芳氧基衍生物（請參考美國專利案第5,252,714號）。 將CRP1或B7RP1多肽PEG化可藉由任何本技藝已知的 PEG化反應實施，如以下參考文獻中的實施例所説明者： «生長因子之焦點討論》，第3期，4-1〇頁（1992年）：Ep 〇 154 316 ; EP 0 401 384。較好是peg是經由如下方式以具反 應性的聚乙二醇分子（或任何類似的具反應性的水溶性聚 合物）進行醯化反應或烷基化反應來實行。 本發明所使用之較佳水溶性聚合物是聚乙二醇，縮寫爲 PEG。本説明書中所使用的聚乙二醇意圖涵蓋任何形式的 PEG已用於衍生其他蛋白質者，如單_(C1_C10)烷氧基或芳 氧基-聚乙二醇。 一般而言，化學轉化法可在任何用於使具生物活性物質 與活化的聚合物分子反應的適當條件來施行。用於製備 CRP1或B7RP1多肽的方法一般而言包括以下步驟：⑷在 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11 11---訂--------I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1274058 _____B7___ 五、發明說明（46 ) 使CRP1或B7RP1多肽與一個或更多PEG基團連接之條件下 將多肽與聚乙二醇反應，和（b)獲得反應產物。一般而 言，用於醯化反應之最佳反應條件可根據已知參數和所期 望的結果來決定。例如，PEG :蛋白質的比率愈高，聚· PEG化產物的百分率愈高。 一般而言，反應條件可藉由施用CRP1*B7RP1聚合物之 結合物來使之緩合或調節。然而，本發明所揭示的結合物 可具有其他活性，增進的或減低的生物活性，或其他特 徵，如增進的或減少的半衰期，此乃與未經轉化之分子比 較的結果。 CRP1或B7RP1多肽、片段、變異體和衍生物可單獨採 用、共用採用、或與其他藥物組合物合併採用。CRp丨或 B7RP1多肽、片段、變異體和衍生物可與細胞介素、生長 因子、抗體、抗發炎劑，和/或化學治療劑適用於所治療 之病徵者合併使用。 本發明提供其選擇性的CRP1或B7RP1結合劑。一種選擇 性的結合劑是指對CRP1或B7RP1具特定性的分子，其可 包括：蛋白質、肽、核酸、醣類、脂類或少分子量的化合 物。一種選擇性結合劑合與CRP1或B7RP1交互作用，從 而〃周控CRP1結合至B7RP1。在一項具體實例中，一種選 擇性的結合劑會部份或完全相滞CRP1結合至B7RP1，且 邵份或完全抑制至少一種CRP1或B7RP1的生物活性，如 免疫輔助刺激反應。在另一項具體實例中，該選擇性的結 合劑是抗體。該抗體可對CRP1或B7RP1具免疫反應性， -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A衣 訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（47) 且較好是對B7RP1具免疫反應性。在本發明的另一項具體 實例中，能與B7RP1反應的抗體結合至B7Rpi的抗原決定 基上，使彳于其與CRP1的結合部份或完全被阻滞，並且至 少有一種B7RP1的生物活性如免疫輔助刺激活性部份或完 全被抑制。部份被抑制一詞係指至少有可偵測到程度之抑 制作用發生。充全被抑制一詞則意指沒有更增進的抑制作 用發生。 CRP1或B7RP1多肽、片段、變異體和/或衍生物可以本 技藝中已知的方法用於製備抗體。因此能與cRpi或 B7RP1多肽反應的抗體，以及此種抗體的反應性片段亦可 被認爲是在本發明的範疇之中。該抗體可以是多株的、單 株的、重組的、嵌合的、單鏈的和/或具有雙特定性的。 典型上，該抗體或其片段或爲人類來源，或爲，，人類化" 的，亦即經製備以防止或減少施用於病人時所產生之抗體 免疫反應。該抗體片段可以是任何能與本發明之CRpi或 B7RP1多肽反應之片段，如Fab，Fab，等。本發明亦提供融 合瘤，其乃將任何CRpi或B7Rpi多肽或其片段做爲抗體 送入所選擇的哺乳動物中，接著將該哺乳動物的細胞（例 如：脾細胞）與某種癌細胞融合，藉由已知技術產生永存 不死的細胞株。被採用於產生此種細胞株和抗本發明之人 類CRP1或B7RP1多肽的抗體亦涵蓋於本發明之中。 本發明的單株抗體包括"嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕 鏈的邵份與得自特殊物種或屬於特殊抗體類或次類之抗體 的對應序列完全相同或同源，然而其餘的鏈則與得自另一 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線 ·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（48) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 物種或屬於另一抗體類或次類之抗體的對應序列完全相同 或同源，本發明的單株抗體亦包括此種抗體之片段，只要 這些片段其有所需的生物活性（美國專利案第4,816,567 號；Morrison等人，《美國國家科學院進展報告》，第81 期，6851-6855頁（1985年））。 在一項較佳的具體實例中，該嵌合性抗-CRP1或B7RP1 的抗體是”人類化”的抗體。使非人的抗體”人類化”的方法 在本技藝中已詳知。一般而言，"人類化”的抗體有一個或 更多非人類來源的胺基酸***其中。人類化可依以下技藝 中已知的方法來實行：（Johes等人，<< 自然〉〉，第321期， 522-525 頁（1986 年）；Riechmann 等人，《自然》，第 332 期， 323-327 頁（1988年）；Verhoeyen 等人，<〈科學〉>，第 239 期， 1534-1536頁（1988年）），藉著以嚙齒類的互補決定區（匸01^) 替代人類抗體的對應區。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 本發明亦涵蓋完整的人類抗- CRP1或B7RP1抗體。此種 抗體的生產可藉著對基因轉移動物（如老鼠）用CRP1或 B7RP1抗原進行免疫接種，該動物能在沒有内源免疫球蛋 白產生的條件下產生一系列人類抗體。請參考例如·· Jakobovits等人，《美國國家科學院進展報告》，第90 期，2551-2555 頁（1993 年）；Jakobovits 等人，<< 自然 >〉， 第362期，255-258頁（1993年）。人的抗體亦可在噬菌體表 現的基因庫之中生產（Hoogenboom等人，<<分子生物學期 刊》，第227期，381頁（1991年）；Marks等人，《分子生物 學期刊》，第222期，581頁（1991年）。 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1274058 _ B7__ 五、發明說明（49 ) 本發明之選擇性結合劑亦可用於調空CRp 1或B7Rp丨之結 合且調控至少一種由CRP1或B7RP1調節的生物活性如免 疫輔助刺激作用。此種選擇性結合劑的一項實例就是對 CRP1或B7RP1具有免疫反應性之抗體。該抗體可用於治 療，如抑制CRP1或B7RP1多肽與其結合配偶之結合。該 抗體尚可用於體内和體外之診斷目的，如以經標記的形式 用於债測CRP1或B7RP1多肽是否在體液或細胞樣品中存 在。 藥物組合物釦旒用 CRP1或B7RP1多肽的藥物組合物是在本發明的範轉之 中。此種組合物可包含治療有效量之多肽或片段、變異體 或衍生物與一種藥物上可接受的載劑混合。在一項較佳的 具體實例中，藥物組合物包括呈水溶性形式的CRP1或 B7RP1多肽，其包含部份或整個CRP14B7RP1細胞外的部 份：典型上，一種CRP1或B7RP1多肽之治療用化合物可 用組合物形式施用，該組合物包括純化的多肽、片段、變 異體或衍生物與一種或更多生理上可接受的載劑、賦形劑 或稀釋劑合併。該載劑物質可以是注射用的水，較好是以 其他施用於哺乳動物的溶液中常見之物質補充者。中性之 緩衝鹽溶液或與血清蛋白混合的鹽溶液是作爲範例之適當 載劑。較好是該產物經調配成冷凍乾燥物，其中利用適當 的賦形劑（例如：蔗糖）。其他標準的載劑、稀釋劑和賦形 4 了如所為包含在内。其他做爲範例的組合物包含p Η大 約爲7·〇-8·5的Tris緩衝液，或ρΗ大約爲4 〇_5·5的乙酸鹽緩 _ -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂------------線 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058
五、發明說明（) 衝液，其肖T包含山梨糖醇或適當的替代物。 CRP1或B7RP1藥物組合物可由腸胃外施用。或者，該組 口物可由血管内或皮下施用。當用於全S性施用時，用於 本發明的治療組合物可呈無熱原，容許非經腸的水溶液形 式。此種藥物學上容許之蛋白質溶液的製備，考慮其適當 的p Η ’等張性、穩定性等等，是在本技藝之技巧範圍内。 有用於實行本發明CRP1*B7Rpi#肽組合物之治療調配 物可由混合具有所需純度之經挑選成份，且視需要包含生 理上可接爻的載劑、賦形劑或穩定劑（<<雷明敦氏藥物科 學》，第 1 8 版，A· R. Gennaro編著，Mack Publishing c〇mpany 出版（1990年）製成冷凍乾燥的餅塊或水溶液以便貯存。可 接受的載劑、賦形劑或穩定劑對受藥者是無毒性的，且較 好在所採用的劑量和濃度下是不具反應性的，並且包括緩 衝劑如磷酸鹽、擰檬酸鹽、或其他有機酸；抗氧化劑如抗 壞血酸；低分子量的多肽；蛋白質，如血清蛋白、動物膠 或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙晞吡咯酮；胺基酸如 甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸、離胺酸；單醣、 雙醣、和其他醣類，包括；葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 劑如EDTA;糖醇類如甘露糖醇或山梨糖醇，形成鹽的抗 衡離子如鈉離子和/或非離子界面活性劑如Tween，複離子 劑（pluronics)或聚乙二醇（PEG)。 採用於醫療之CRP1或B7RP1多肽組合物的有效量要視例 如治療對象如CRP1或B7RP1多肽所使用於何種病徵、施 用途径’以及病患的狀況。因此，治療師必需滴定劑量， -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 衣
----I I I 訂--— II--I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 !274058 A7 B7 五、發明說明（51 ) 並且修飾施用途徑如獲取最佳療效之所需。典型的每曰劑 量範圍是在大約0·1微克/公斤至高達100毫克/公斤或更 夕要視上述的因素而定。典型上，一位臨床醫師會施用 琢組合物直到劑量達到所需效果。因此該組合物可單劑施 用，或以兩劑或更多劑連續施用（其可包含或不包含同量之 CRP1或B7RP1多肽），或經由灌輸裝置或導管連續灌輸。 隨更多研％之進行，與治療各種病患之各種病狀的適當劑 量有關訊息於焉產生，並且一般熟習此藝者，考慮治療的 過程，所治療的疾病型式，受藥者的年齡和一般健康情 形，即可確定適當的劑量。 用於體内施用的CRP14B7RP1多肽必需經過殺菌。這很容 易經由通過殺菌濾膜過濾來達成。當該組合物經冷凍乾 燥，可在冷凍乾燥和重組之前或之後進行。通常用於非經腸 施用的組合物可貯存在經冷凍乾燥的型式或在水溶液中。 治療性組合物一般置放於具有殺菌入出口的容器内，例 如一種血管内注射溶液袋或具有可由皮下注射針刺破的塞 子之小瓶。 施用該組合物的途徑是根據已知方法，例如：口服、注 射或藉由血管内、腹膜内、腦内（主質内）、腦室内、肌内、 眼内、動脈内或損害部位内途徑，或經由持續的釋放系 統，或藉由視需要涉及使用導管的植入裝置。若需要時可 藉由灌輸、大丸劑注射法或植入裝置連續施用該組合物。 可選擇的或除此而外，該組合可經由植入受影響的膜區 域、海轉或任何其他CRP1或B7RP1多肽已被其吸收的適 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 !274058 A7 B7 —----.^^ 五、發明說明（52) 當材質上做局部施用。 在使用植入裝置的狀況下，該裝置可植入任何適當的組 織或器官之中，並且CRP1或B7RP1多肽的輸送可直接經 由大丸劑裝置，或連續施用裝置，或經由利用連續灌輸的 導管。CRP1或B7RP1多肽可用持續釋放的調配物或製備 物來施用。持續釋放之製備物的適當實例包括呈有形狀物 體形式之半透性聚合物基質，例如：薄膜或微膠囊。持續 釋放之基質包括聚酯類、水凝膠、聚交酯類（美國專利第 3,773,919號，歐洲專利案第58,481號），左旋-麩胺酸和加 瑪左旋麩胺酸乙酯（Sidman等人，《生物聚合物》，第2 2 期，547-556頁（1983年））。聚-(2-羥乙基-甲基丙晞酸酯 (Langer等人，《生物醫學材料研究期刊》，第i 5期·· 167- 277 頁（1981年）]和 Langer。《化學技術》，第 12 期：98-105 頁（1982年））’乙晞乙酸乙烯醋（Langer等人，同上）或聚_ 右旋（-)-3-羥基丁酸（歐洲專利案第133,988號）。持續釋放 之組合物亦可包括微脂粒，其可經由數種本技藝已知的任 何方法予以製備（例如，Eppstein等人，《美國國家科學院 進展報告》，第82期：3688-3692頁（1985年）；歐洲專利案 第36,676號；歐洲專利案第88,046號；歐洲專利案第 143,949號）。 在某些情形之中，可能需要將CRP1或B7RP1多肽組合物 用於體外方式。在本發明中，吾人將細胞、組織或器官從 病患身上移出而將其暴露於CRP1或B7RP1多肽組合物， 而後將細胞、組織和/或器官緊接著植回病患體内。 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·111111 線®-· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 Α7 Β7 五、發明說明（53) 在其他的情形之中，CRP1或B7RP1多肽之遞送可藉著將 某種已經由遺傳修改的細胞植入病患體内，其中使用如本 説明書所説明的方法，以表現和分泌該多肽、片段、變異 體或衍生物。此種細胞可以是動物或人類細胞，並可得自 病患本身的組織或得自其他來源，人類抑或非人類的。視 需要可使該細胞永存不死。然而，爲了要減少免疫反應的 機會’較好是將細胞加上外套以防止周圍組織浸入。該包 圍的物質典型上是生物可相容的，可半透的聚合物外套或 膜’其容許蛋白質產物釋出，但卻防止細胞受到病患的免 疫系統破壞，或從周園組織來的其他有害因子破壞。 用於使細胞以膜包圍的方法是熟習此藝者已知的，而經 包圍之細胞的製備及其植入病患則可毋需過度實驗來完 成。請參考例如美國專利案第4,892,538號；第5,〇01，472號 和第5，1〇6,627號。一種用於包圍活細胞的方法説明於1>(：1 界091/1〇425號（八61^〇1^等人）。用於調配各種其他持續 或經控制之遞送工具之技術，如微脂粒載劑、生物可侵蝕 性顆粒或小珠子亦爲熟習此藝者已知的，且其説明於例如 美國專利案第5,653,975號。該細胞有或沒有經過外部包園 者可植入適當的病患體組織或器官内。 如以上所討論的，或許能以一種或更多CRP丨或B7RP1多 肤、變異體、衍生物、和/或片段處理細胞製備物較好。 這或可藉著例如將包含T -細胞的細胞，如骨髓細胞直接 暴露在多肽、變異物、衍生物或片段之中，而後者是呈可 以穿透細胞膜的形式。例如，可將包含τ ·細胞的細胞暴 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂---------線J 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（54 ) 露於B7RP1多肽以活化T -細胞功能，再將以此處理的細胞 植入病患體内。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 或者，可採用基因療法。一種可應用之基因療法爲利用 可操作方式連接到組成性或可謗發啓動子之CRP1或 B7RP1基因（基因組DNA，cDNA和/或合成DNA編CRP1 或B7RP1者，或其片段變異體或衍生物），以形成，，基因療 法DNA建構體”。該啓動子可與内源的CRP1或B7RP1基因 同源或異源，只要它在該建構體待***之細胞或組織形式 中具有活性。其他基因療法DNA建構體的成份可視需要包 括：若需要，有經設計用於特定位結合之DNA分子（例 如：有用於同源重組之内源兩侧序列），特定於組織的啓 動子，促進序列或安靜序列，能提供勝於母細胞之選擇性 優點的DNA分子，有用於做爲標記物以辨識轉型細胞之 DNA分子，負向選擇系統，特定於細胞的結合劑（例如， 對於細胞之針對目標而言），特定於細胞之進入因子，和 促進載體表現之轉綠因子，以及使載體得以製造之因子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 然後可將此種基因療法之DNA建構體加進病患的細胞中 (體外或體内）。一種將基因療法之DNA建構體加入的方法 是經由病毒的載體。適當的病毒載體典型上用於基因療法 以遞送基因療法之DNA建構體者包括但不限於：腺病毒， 與腺相關之病毒、疱疹病毒、豆狀病毒、乳頭淋瘤病毒、 和反轉錄病毒的載體。這些載體之中有某些如反轉錄病毒 載體，可將基因療法DNA建構體遞送到病患細胞的染色體 DNA中，而該基因療法DNA建構體可結合到染色體DNA之 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公Μ ) 1274058 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（55) 中；其他載體會作用爲游離體而基因療法DNA建構體則留 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在細胞質中。基因療法之載體用途説明於例如美國專利案 第 5,672,344號，第 5,399,346號。 將基因療法DNA建構體遞送到病患細胞而不使用病毒載 體的可選擇方法包括而不限於由微脂粒調控的轉移，直接 注射裸體DNA ’受體調控的轉移（配體_Dna複合物），電穿 洞法、磷酸鈣沈澱，和微粒子撞擊（例如，，基因槍"）。請參 考美國專利案第 4,970，154 號，W0 96/40958 號，5,679,559 號，5,676,954號和 5,593,875號。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 另一種經由基因療法而使内源CRP1或B7RP1多肽在細胞 内表現增進的方法是將一個或更多促進元素***CRP1或 B7RP1多肽啓動子之中，其中該促進元素可用於增進 CRP1或B7RP1多肽基因的轉錄活性。所使用之促進元素 的選擇是根據吾人所想要活化的基因所在之組織而定；已 知能使啓動子在該組織内活化的促進元素即會入選。例 如’若要使CRP1或B7RP1多肤在T -細胞中’’開啓，，，則可 使用lck啓動子促進元素。在此待添加之該轉綠元素的功 能性部份可利用標準的轉殖技術將之***一段含有CRpl 或B7RP1多肽啓動子的DNA片段之中（且視需要，可包含 載體，5’和/或V兩侧序列等等）。然後此項建構體，已知 爲”同源重組建構體••可由體外或體内方式送入所要的細胞 之中。 基因療法可用於降低CRP1或B7RP1多肽的表現，其中經 由修飾内源啓動子的核芬酸序列。此種修飾典型上是經由 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐了 1274058 A7 B7 五、發明說明（56) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 同源重組方法來完成。例如，可修飾含有選用於去活性之 CRP1或B7RP1基因啓動子之一部份或全部的DNA分子， 以除去和/或置換調控轉綠之啓動子的小段。在本發明 中，啓動子之轉錄活化子上的TATA盒子和/或結合部位可 利用標準的分子生物學技術予以刪除；此刪除可抑制啓動 子活性’從而壓抑對應之Crpi或B7RP1基因的轉錄。刪 除啓動子内之TATA盒子或轉啓活化子結合位置可藉由產 生一個包括CRP1或B7RP1多肽啓動子之全部或相關部份 <建構物來達成，（該啓動子得自與待調節之CRpi或 B7RP1基因相同或相關的物種），其中一個或更多tata盒 子和/或轉錄活化子結合部位的核甞酸經取代、刪除和/或 ***一個或更多核苷酸的方式突變，使得ΤΑΤΑ盒子和/或 活化子結合邵位活性降低或造成完全失活。這個建構體典 型上亦含有至少大約5〇〇個DNA鹼基，其對應於原來的（内 源）經修飾之啓動子片段的5，和3，兩侧區域，該建構體可 導入適當的細胞中（體外或體内進行），而以直接或經由上 述病毒載體的方式進行。典型上，將該建構體整合到細胞 的基因組DNA中可經由同源重組，其中啓動子建構物之中 的5 ’和3，兩側DNA序列可用於幫助經修飾的啓動子區域經 由雜交作用整合至内源的染色體DNA上。 其他的基因療法亦可採用，而以其適於抑制一種或更多 CRP1或B7RP1多肽爲佳。例如，反意義股dna或RNA分 子，具有一段序列與所選擇之CRP1或B7RP1多肽基因之 至少一部份互補者可被導入細胞之中。典型上，每一個此 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 1274058 ______B7_______ 五、發明說明（57 ) 種反意義股分子可與每一所選的CRP1或B7RP1基因的起 始位置（5 ’端）互補。當該反意義股分子與對應的CRP1或 B7RP1多肽mRNA雜交時，則此mRNA的轉譯就被阻擂了。 或者，可以採用基因療法造出一種或更多CRP1或B7RP1 多肽的優勢一負向抑制劑。在此情形之中，編碼每一經選 擇之CRP1或B7RP1多肽的突變全長或截短多肽之dna可 經製備並利用如以上説明的病毒或非病毒方法導入病患細 胞。每一此種突變物典型上設計用於在其生物角色上與内 源多肽競爭。 激動劑與拮抗劍 本發明亦提供CRP1或B7RP1的激動劑與拮抗劑，其能調 節兩種分子或其中之一的活性。激動劑和拮抗劑可從改變 B7RP1拮合至CRP1的試驗分子鑑認出來。 π試驗分子，，一詞是指待評估其與CRP1或B7RP1多肽結合 且從而改變B7RP1結合至CRP1之能力的分子。較好是該 試驗分子能以至少大約l〇6M的親和常數進行結合。 有許多種檢驗可用於測量CRP1或B7RP1的結合。這些檢 驗可用於師選試驗分子增進或減少B7RP1結合至CRP 1的 比例或程度。在一種檢驗型式之中，是將一種CRp 1多 肽，較好是一種CRP1的可溶形式如細胞外區位固定化， 其藉由黏接至微滴盤的槽底來固定。然後可將放射性標記 的B7RP1和試驗分子添加到該孔槽内，一次加一種任 一順序）或同時加入。培育之後，可將孔槽沖洗並利用閃 爍記數器計算放射性以測定B7RP1結合至CRpi蛋白質的 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
A7 1274058 ____B7______ 五、發明說明（58 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 程度。典型上，該分子可在一個濃度範圍内測試，並且可 利用一系統缺少一種或更多測試檢驗元素之對照組孔槽來 評估結果的正確性。此種方法的一項選擇涉及使蛋白質的 Π位置”逆轉，而即將B7RP1固定化在微滴盤孔槽，與試驗 分子和放射性標記的CRP1共同培育，並測定CRP1結合的 程度（請參考，例如《現代分子生物學方法 >〉第丨8章， Ausubel等人編著。j〇hn Wiley & Sons公司出版，位於紐約 市（1995年）]。 放射性標記外的另一選擇是將Crpi或B7RP1與生物素結 合’然後與生物素結合的蛋白質可利用連接至酵素，如辣 根過氧化酶[HRP]或鹼性磷酸酯[Ap]的鏈抗生物素蛋白來 偵測其存在，其可利用比色法或藉由螢光標記鏈抗生物素 蛋白來偵測。針對與生物素結合之CRP1或B7RP1的抗體 亦可使用，並可在與酵素連接的鏈抗生物素蛋白（連接至 A P或HRP)共同培育後，而偵測到。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CRP1或B7RP1亦可藉著連接到瓊脂珠粒、丙烯酸珠粒或 其他型式的此種鈍性基質而予固定化。該基質一蛋白質複 合物可被放入含有互補蛋白質和試驗化合物的溶液中；培 百之後，可用離心沈澱珠粒，而CRpi或B7Rpi之間的結 合可利用上述方法得知。或者，可將基質_蛋白質複合物 在ΐ柱中固疋化，並使試驗分子和互補蛋白質通過該管 柱。然後可以利用以上陳述的任何技術，亦即放射性標記 法、抗體結合或類似者求知CRpi或B7Rpi之間複合物的 形成。 -61 - 紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公璧） 1274058 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（59) 另一種形式之體外檢驗有用於鑑認測試分子增進或降低 CRP1/B7RP1複合物形成者是一種表面質粒基因組共振偵 測系統’如Biacore檢驗系統（紐澤西州，piscataway市的 Pharmacia公司出品）。Biacore系統可利用製造商的方法來 實行。此種檢驗基本上涉及CRP1或B7RP1與外覆葡聚糖 的感測器零件結合，而該零件位於偵測器中。然後試驗化 合物和其他互補蛋白質可同時或連續地注入含有該感測器 零件的槽中，而結合之互補蛋白質的量則可根據分子質量 的變化得知，該變化與感測器零件經葡聚糖外覆的一側相 關聯，而分子質量的變化可由偵測系統量測到。 在某些情形之中，或許會想要評估兩種或更多共同使用 於增進或降低CRP1/B7RP1複合物之形成的試驗分子。在 這些情形之中，先前所陳述的檢驗可以很容易地被修改， 藉著同時或連續地將此種添增的試驗化合物加到第一種試 驗化合物。該檢驗之其餘步驟如以上所列示。 體外檢驗如先前説明者可有利地用在迅速篩選大量化合 物，以知其對於CRP1或B7RP1複合物形成的效應。該檢 驗可予自動化以筛選噬菌體展子，合成肽與化學合成庫中 產生的化合物。 可增進或減低CRP1和B7RP1複合物形成之化合物亦可利 用表現其中一種多肽之細胞和細胞株的細胞培養物中篩選 得到。細胞和細胞株可從任何哺乳動物得到，但最好是從 人類或其他靈長類、犬牙類或嚙齒類來源獲得。…尺^與 將CRP1表現於表面之細胞的結合則在有或沒有試驗分子的 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（6〇 ) 條件:進行評估，結合的程度可藉由例如流動細胞計數器 來測定，其中利用到能與B7RP1結合的經生物素修飾之抗 體。細胞培養檢驗亦可有利地進而用於評估在上述蛋白質 檢驗中得分爲正的化合。 醫療用途 本發明的多肽及其激動劑與拮抗劑可用於調節τ _細胞的 功能。激動劑與拮抗劑包括那些能調節CRP1*/或B7RP1活 性’並且增進或降低至少一種CRP1 *B7RP1蛋白質活性， 諸如種與τ -細胞功能相關的活性，例如τ _細胞活化的分 子。激動劑與拮抗劑可爲輔助因子，諸如··蛋白質、肽、 醣類、脂類或少分子量的分子，其與CRP1或B7RP1作用， 從而調節其活性。具有潛力的多肽激動劑或抑制劑包括與 可溶性或膜結合形式之CRP1或B7RP1反應之抗體，該 CRP1或B7RP1包含該蛋白質之細胞外區位之部分或全體。 _節CRP1或B7RP1表現的分子典型上包括編碼CRpi或 B7RP1蛋白質之核酸，其可作用爲反意義之表現調節劑。 CRP1或B7RP1多肤’以及其激動劑和枯抗劑可用於治療 自體免疫疾病、移植存活、免抑細胞活化以抑制腫瘤細胞 生成，依賴T -細胞之B -細胞調控疾病，和癌症基因的免 疫療法。在一項具體實例中，CRP1和/或B7RP1功能之拮 抗劑或抑制劑有利於緩和慢性免疫細胞功能不良之疾病症 狀。自體免疫疾病，如全身紅斑性狼瘡，類風濕性關節 炎，免疫血栓細胞減少性紫瘢（ITP)，和牛皮癖，可用 CRP- 1 /B7RP-1拮抗劑或抑制劑治療。此外，慢性發炎疾 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1274058 A7 B7 五、發明說明（61 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 病’如發炎性腸病（Crohn氏症和潰瘍性結腸炎）。Grave氏 症、Hashimoto氏甲狀腺炎和糖尿症亦可用crp_i/b7RP-1 的抑制劑治療。如實施例1 8之中所説明的，crp- 1 _Fc會抑 制而B7RP-1-FC會增進嚙齒類之類風溼性關節炎疾病模式 之病發。在此模式中的相反效應支持b7rp-1_Fc蛋白質的 激動角色和CRP-l_Fc蛋白質的拮抗作用。此結果亦説明τ_ 細胞反應要如何藉由操縱此途徑來調節，以及此途徑在類 風濕性關節炎進展中的重要性。此外，如實施例1 9之中所 説明的，在體内表現B7RP-1-FC會刺激發炎性腸病（IBD)在 基因轉移老鼠體内的表現型。此項實例支持ByRpd/cRpj 在腸内發炎進行中所扮演的角色。因此，MRP-i/CRPd途 徑之拮抗劑可用於治療人的IBD。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CRP1或B7RP1的拮抗劑可用做爲骨髓和器官移植的免疫 抑制劑’並且可用於延長移植物的存活。此種拮抗物可在 既存在的治療當中提供顯著優異之處。骨髓和器官移植治 療必須與T ·細胞調節的宿主對外來細胞或組織排斥競 爭。目前用以抑制T-細胞調節之排斥的醫療攝生法涉及 用環孢素或FK506藥物治療。雖然藥物有效，但病患卻得 承受嚴重的副作用之苦，包括··肝毒性、腎毒性、和神經 毒性。環孢毒FK506類別的治療劑標的鈣神經鹼，一種泛 表現之磷酸酶。因爲CRP1表現受限於τ-細胞，所以CRpi 或B7RP1抑制劑或許缺少使用本發明之免疫治療劑所發現 的嚴重副作用。 CRP1或B7RP1拮抗劑可用做自體免疫疾病的免疫抑制 -64· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（62 ) 劑，此類疾病諸如類風濕性關節炎、牛皮癖、多發性硬 化、糖尿糖，和全身紅斑性狼瘡。 CRP1 /B7RP1調節之輔助刺激途徑的拮抗劑亦可用於緩 和毒性中風徵候群、發炎性腸疾、依賴T _細胞之B _細胞 調節的疾病，和治療移植物對抗宿主的疾病。 抗體、包含例如細胞外區位的蛋白質，和其他CRp丨或 B7RP1調節劑造成延長或增進之τ _細胞活化者可增進對於 腫瘤的免疫反應。實施例20顯示B7RP-1-FC可抑制老藏體 内的腫瘤細胞生長。相似地，人的B7RP-1-FC，或其他 B7RP-1/CRP- 1途徑的活化劑可用於增進對抗人體腫瘤的 免疫反應。抗腫瘤活化一般被認爲具有強的溶解細胞之 T -淋巴球成份。事實上，B7-Fc融合蛋白質的抗腫瘤效果 (Sturmhoefel等人，《癌症研究》，第 59 期：4964-4972 頁，1999年）是由細胞溶解性CD8+T-細胞所調節的。因爲 CRP-1亦在溶解細胞之CD8+ T -細胞上表現（實施例9 )，所 以或許實施例20所證明的抗腫瘤效果是由於B7RP-l-Fc在 CD8+細胞上的作用。B7RP-1/CRP-1途徑亦可經操縱以調 節許多其他臨床情況下的CTL反應，包括同種異體移植物 移植、移植物對抗宿主之疾病，和自體免疫疾病。 利用本發明之B7RP1基因之基因療法可用於癌症之免疫 療法。導入癌細胞之B7RP1基因可將其轉型成爲產生抗原 的細胞，其可在導回動物體内時被免疫系統的T -細胞辨 識出來。T -細胞辨識經轉移感染的腫瘤細胞會造成根除 腫瘤細胞表現或不表現B7RP1基因。此種免疫療法可用於 -65- C請先閱讀背面之>i音？事項再填寫本頁) 訂 線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（63) 各種血癌、肉瘤、黑色素瘤、腺癌、乳癌、***癌、肺 癌、結腸癌和其他腫瘤。此項發明涵蓋以相似方式使用 B7RP1基因以增進對應各種腫瘤之T -細胞活化作用。 如實施例1 4所説明的，表現B7RP1之基因轉移老藏之表 現型指示出B7RP1在控制抗體產生方面很重要。B7Rpi蛋 白質活性之激動劑和拮抗劑或許多有用於需要抑制或增進 抗體生產之醫療指示。 例如有許多疫苗的作用是藉由發出有效且特定的抗體反 應。某些疫苗’尤其是對抗腸微生物（例如A型肝炎病毒 和沙門氏菌屬菌）的疫苗會發出壽命短暫的抗體反應。吾 人希望能潛勢化和延長此種反應以增進該疫苗的效果。因 此，可溶性的B7RP1或抗CRP1之活化抗體可做爲疫苗的 佐劑。 抗病毒反應亦可藉由B7RP-1/CRP_1途徑之活化劑或激 動劑來增進。實施例2 0的數據指出細胞免疫性會受b7rp_ 1-Fc促進。B7RP-1-FC或其他B7RP-1/CRP-1途徑之活化劑 對細胞免疫功能的促進亦有利於減少病毒感染的細胞。 B7RP-1-FC會以一種互補方式對體液免疫功能產生作用， 該作用能增進抗體調節之反應，如實施例1 3所觀察到的 作用於幫助清除身體的自由病毒。 反之，有許多臨床症狀要藉由抑制抗體生產來緩和。過 敏是一種通常有利的免疫反應被誇大化或並不適當，而導 致發炎反應和組織受損。抗體調節的過敏反應尤其易受 B7RP1活性之抑制劑所拮抗。過敏、稻草熱、氣喘和急性 -66 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)
1274058 A7 B7 五、發明說明（64 ) 水腫會引起第一型過敏反應，而這些反應可被具有B7RH 活性的蛋白質、抗體或小分子抑制劑所壓制住。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 引起抗體調節之過敏反應的疾病，包括全身紅斑性狼 瘡、關節炎（風濕性關節炎、活性關節炎、牛皮癖關節 炎）吳又性病（腎小球腎變性病、膜的、mesangiocapillary 微血管的、限局分節的、限局壞死的、新月形的、增殖的 -細S病乂）’皮膚疾病（天疱瘡和類天疱瘡，結節性紅 斑）内刀’必病k (甲狀腺炎-Grave氏，Hashimoto氏-胰島素 相依型糖尿病，各種肺病變（尤其是外因性乾性齒槽），各 種血管病變，腹腔病，連帶異常生產“入，許多貧血和血 小板減少症、Guillain-Barre，徵候群，和重肌無力症，亦 可用B7RP1拮抗劑予以治療。 此外，淋巴增生性疾病，如多發性骨髓瘤，Waldenstr〇m 氏巨球蛋白血症，可由蛋白質，抗體或B7Rpi的小分子拮 抗劑予以抑制。 最後’移植物對抗宿主的疾病，是一種”人爲”的免疫疾 病可受益於B7RP1拮抗劑所抑制之抗體產生。 以下實施例乃提供更多完整的本發明之説明，但不宜言全 釋爲對本發明範疇之限制。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例1 CRP1的cDNA和胺基酸序列 將雌性C57/黑老鼠六隻犧牲，切出小腸，並將Peyer氏斑 塊移出。將小腸組織切片打開並除去黏膜和其他殘餘物。 將含有小腸上皮内細胞（iIELs)的上皮層加以補充i -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（65) DTT在RPMI-1640中溫和攪拌，於37°C下進行20分鐘。使 分離出的細胞通過一個100微米的濾器，用5 0毫升RpMi_ 1640沖洗，予以混合以進而打碎細胞結塊，然後通過一個 4 0微米限制器以獲取單細胞群。然後將這些細胞以5 0亳 升體積的RPMI-1640再沖洗以確保除去殘留的DTT。然後 攪拌組織並予沖洗如前以收集剩餘的ilELs。將ilELs與脂 肪細胞及大部份上皮細胞分開，利用三個步驗的Percol梯 度，而ilELs會在40%至80%的交界區形成寬帶。然後用 RPMI-1640沖洗細胞兩次，以除去微量的Percol，用 CD103(整合素阿爾法IEL)抗體進行免疫染色，並且以FACs Star細胞分類機將其分出來。然後使用這些分類出來的細 胞製備全部RNA，可直接使用Trizol(Gibco BRL，位於瑪里 蘭州的Gaithersburg市），或在與平盤結合的活化抗體上活 化至隔夜，該抗體與加瑪/戴爾它（delta)TCR，阿雷法/貝 它TCR，或CD3活化至隔夜。如以上方法製備RNA並將其 匯集用以建構EST cDNA庫。 一個cDNA純種系，稱爲smil2-00082-al，含有與CD28， 同源的核甞酸序列（圖1 B)。將序列轉譯和緊接著與已知 於公開資料庫的蛋白質比較，透露其與老鼠的CD28有19% 的胺基酸完全相同（圖1 B)。這種低的同源性很顯著，因 爲老鼠的CD28只與老鼠的CTLA-4共享26%的胺基酸完全 相同性。所有原本的半胱胺酸被認爲對於CD28/CTLA_4家 族之分子内和分子間半胱胺酸鍵結有重要性者經發現具有 保留性（胺基酸殘基83，109和137 ;相對於起始的甲硫胺 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 _____B7_五、發明說明（66 ) 酸）。此外，原來的開放讀碼區之全部長度和穿透膜區位 的相對位置相似於CD28和CTLA-4者。吾人稱該基因為 CRP1，意為CD28相關蛋白質-1。 實施例2 人類CRP1 cDNA的轉殖 編碼人類CRP1蛋白質的核酸序列經以下方法予以鑑認。 人類cDNA庫係從增濃之得自正常人類自願者之周圍人血 的淋巴球製備。該淋巴球經純化並將紅血球藉π淋巴球分 離基質"（ICN製藥公司，位於加州Costa Mesa市）予以去。 然後將細胞於含有1 0亳微克/毫升PMA，500毫微克/亳升 離子黴素，和平盤結合之抗CD3之活化抗體的培養基中活 化至隔夜。全部RNA係採Trizol(Gibco/BRL)法從活化的細 胞製備，而聚-A (腺甞）RNA則藉Dynal珠粒純化法予以分 離。cDNA是從經分離的聚-A RNA分離出來的，並予以大 小選擇以得到最大的cDNA片段。然後將大小經選擇的 cDNA連接至質體pSPORT(Gibco/BRL出品）。編碼人類 CRP1蛋白質的DNA係由重組噬菌體斑塊，或經轉型的細菌 純種系雜交方法（Sambrook等人，如同以上所述），筛選活 化的淋巴球cDNA庫獲得。噬菌體或質體cDNA庫係利用得 自如實施例1和圖1之老鼠CRP 1基因純種系之放射性標記 的探針篩選出來的。該探針用於篩選從平盤處理之基因庫 提出尼龍濾器。這些濾器在42 °C下於50%甲醯胺，5X SSPE，2X Denhardt氏溶液，0.5% SDS和100微克/毫升鮭魚 ***DNA之中預先雜交4小時，然後在42 °C下於50%甲醯 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ -69- 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（67) 胺，5X SSPE，2X Denhardt 氏溶液，〇·5% SDS，100微克 / (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亳升鮭魚***DNA，和5毫微克/毫升mBRP 1探針之中雜交 24小時。將墨點紙在常溫下2X SSC，0.1% SDS沖洗i 〇分 鐘，在50°C下IX SSC，0.1% SDS沖洗1〇分鐘，然後在5〇 c ’ 〇·2Χ SSC再沖洗1 0分鐘。得自任何人類CRP1純種系 的***序列以實施例1所説明的方法予以定序和分析。 實施例3 B7RP1 DNA和胺基酸序列 一種cDNA純種系，稱爲smill-〇〇〇03-g5，含有與B7 J (CD80)與B7.2(CD86)同源的核甞酸序列。將序列轉譯（圖 2A) ’緊接著與已知公開基因庫中的蛋白質比較，透露其 與老鼠的Β7·1(圖2B)有20〇/〇胺基酸完全相同。此種低同源 性很顯著’因爲老鼠的Β7· 1只與老鼠的Β7.2共亨24%的胺 基酸同一性。僅管此種低的同源性，不過重要的半胱胺酸 殘基在此一純種系的開放項碼區與老鼠的Β 7 · 1和β 7 · 2之間 具有保留性，其位於殘基62，138，185和242(相對於起始 的甲硫胺酸，圖2Β)。大約的成熟蛋白質長度和穿透膜區 域相對於羧基端的位置在與Β7·；1*Β7·2比較之下，亦相似 於本純種系的原來ORF。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例4
轉殖人類B7RP1 cDNA 利用老鼠B7RP1序列（參考圖2)的基因庫胚同質性研究 (GCG，威斯康辛大學）尋回一種包含具有〇RFii679個鹼 基之4358個鹼基序列的純種系（AB〇14553)。pcR轉殖引子 70· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（68) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 是根據此序列所設計的。一種含1313個鹼基對之DNA片段 根據製造商建議的程序利用人類淋巴結”馬拉松-立即’· (Marathon-ReadyTM)cDNA(加州，Palo Alto 的 Clontech 公司 出品由5 ·和3 ’ RACE)獲得。 用於完整長度人類B7RP1的引子爲： 2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA (序列辨識號碼：25) 2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG (序列辨識號碼：26) 2083-77 TCC GAT GTC ATT TCC TGT CTG GC (序列辨識號碼：27) 2083-78 GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC (序列辨識號碼：28) 2113-29 GTG GCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G (序列辨識號碼·· 29)
2113-30 CCC AAC GTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G (序列辨識號碼：30) 2113-31 GCG TGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G (序列辨識號碼：31) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 引子2083-75和2083-76係用於放大利用RACE方法之基因的 5’端。引子 2083-77，2083-78，2113-29，2113-30和2113-31 係用於放大利用RACE方法之基因的3，端。 所產生之核铱酸序列包含有288個胺基酸殘基的ORF，以 甲硫胺酸爲起始，然後將預測之成熟人類…尺^胺基酸序 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（69) 列與成熟老鼠的B7RP1胺基酸序列（圖3 B )比較，而發現有 48%的胺基酸完全相同。此種同質性很顯著，因爲種與種 之間CD80(B7.1)基因的同質性很低，事實上人和老鼠的 CD80只有41%的胺基酸完全相同。很重要的是，人的 B7RP1蛋白質保留了對I g環結構必需之重要半胱胺酸殘基 (胺基酸殘基係相對於成熟蛋白質之第16，92，138，194和 195殘基，圖3 B )。此外，該穿透膜的區位之總長和位置 與人的B7RP1同系物一致。 實施例5 B7RP1 RNA之表現 利用RNA探針將RNA原位雜交至B7RP1基因。將成熟老 鼠的組織以4〇/0對-甲醛，包埋在石蠟中，並且以5微米厚 度切片。在原位雜交之前，將組織用〇·2Μ HCL使其變得 可/參透’接著用蛋白質酶Κ消化，並且以三乙醇胺和乙酸 酐進行乙醯化。將切片於55。(：與969個鹼基之33Ρ_標記的核 糖探針雜交至隔夜，該探針對應於老鼠的B7RP1序列之1 至969核:y：酸。用RNase消化的方式除去過量的探針，接著 藉由連續在鹽濃度降低的緩衝液中沖洗，然後在〇.1X SSC 中於55 C下進行高度苛性的沖洗。將標本片沾浸在K〇dak NTB2乳化物中，在4 t下曝露2 _ 3週，予以沖洗，並且用 f木素和伊紅予以負染色。用深暗視野和穿透性光照明檢 驗切片，而能同時評估組織形態學與雜交信號。 以原位雜交分析B7RP1 RNA顯示B7Rpi RNA在淋巴樣細 胞成熟與淋巴球活化的範圍内高度表現。B7Rpi rna表現 _ -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------% 1274058
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（70) 於胸腺的淋巴樣組織，小腸的帕伊爾氏結，脾臟和淋巴 結。在這些淋巴樣組織中的表現顯示B7RP1 RNA —般而T 是在B -細胞和其他APC涉及的區域中表現的。這些區域包 括胸腺的髓質區，淋巴結的主要泡狀物，以及Peyer氏斑 塊的泡狀與圓頂區。B7RP1 RNA的表現高度特定於淋巴樣 組織中APC涉及的區域。 數種非淋巴樣組織的分析亦透露B7RP1是在APC涉及的 區域表現。在肺部，B7RP1之表現被發現是在次黏液區， 與抗原加工的功能一致。在小腸之中，B7RP1 RNA被發現 在固有層之中。値得注意的是吾人發現受損肝臟的切片顯 示與B7RP1 RNA之表現重疊的浸潤現象。此種B7RP1表現 與淋巴球堆積對於組織破壞的反應一致性顯示B7Rp 1涉及 淋巴球活化。 實施例6 CRP1 RNA的表現 利用RNA探針對CRPi基因進行rna原位雜交。老鼠的組 織如實施例5製備之。組織可滲透化，探針雜交，切片處 理，和組織染色如實施例5所説明者。在55。〇下，將切片 與603個鹼基之33p_標記的核糖探針雜交至隔夜，該探針對 應於老鼠CPR1序列的第1至6〇3號核芬酸。用深暗視野和 穿透式光照明設備檢驗切片，以容許同時評估組織形態 與雜交信號。 將仵自老鼠的淋巴結用啰唑酮處理過，予以切片並分 CRP1 RNA的表現。經致敏老鼠淋巴結顯示比正常老鼠淋 •73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一^|_ 111111 - 1274058
五、發明說明（71 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 巴結要高度的CRPl RNA表現。CRP1的表現是位於副皮 質，一個T -細胞的活性區。因此，CRP1 RNA的表現與T -淋 巴球的表現一致，並且在T -細胞活化之際會向上調節。 實施例7 CRPl-Fc或B7RP1-FC融合蛋白質的表現與純化 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了建構CRPl-Fc融合蛋白質的DNA表現載體，所以將 CRP1之第一胺基端的147個胺基酸編碼序列融合、加框至 人類Fc基因（同型IgGl)之羧基端的235個胺基酸編碼序 列，並且在pcDNA3之多元連接序列（pcDNA3/CRPl-Fc)範 圍内予以連接。爲了建構B7RP1-FC融合蛋白質的DNA表現 載體，所以將B7RP1之第一胺基端的269個胺基酸編碼序 列融合、加框至人類Fc基因（同型IgGl)之羧基端的235個 胺基酸編碼序列上，並且連接至pcDNA3之多元連接序列 (pcDNA3/B7RPl-Fc)範圍内。該編碼序列具有包含得自 CRP1和B7RP1每一蛋白質之N端序列，但不包含每一蛋白 質之推定穿透膜區間。利用FuGene 6轉移感染劑（印地安 納州 Indianapolis市的Roche Molecular Biochemicals公司出品） 將 293T 細胞以 pcDNA3/CRPl-Fc或pcDNA3/B7RPl-Fc進行轉 移感染。四天之後，將調整數的基質收集起來，並且利用 蛋白質A瓊脂糖（Pharmacia公司出品）以整批層析法純化F c 蛋白質。用三倍管柱體積之"免疫純粹溫和沖提緩衝液 ’’（Immunopure Gentle Elution Buffer·，Pierce公司出品）沖提 與管柱結合的Fc融合蛋白質，然後對抗150倍體積之20 mM HEPES，100 mM NaCl，pH 7.5進行透析。透析過的蛋 -74- 氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 1274058 A7 B7 五、發明說明（72) 白質用 Microsep 離心濃縮物，30 kD MWCO(Pall Filtron 出 品）予以濃縮，並且利用得自每一蛋白質胺基酸序列之消 光係數計算該蛋白質的濃度。CRP1 -Fc融合蛋白質的表現 顯示於圖4A之中，B 7CRP1 -Fc融合蛋白質的表現則顯示於 圖4B之中。 實施例8 鑑認CRP1或B7RP1是一個受體一配體對 爲了決定是否該新穎蛋白質是與包含CD28，CTLA-4， B7.1和B7.2相同之輔助刺激途徑的一部份，吾人利用一種 細胞表現展示檢驗。此種檢驗用到AC AS(附著細胞分析與 分類）分析法分析是否表現在細胞上的膜結合蛋白質會與 各種F c融合蛋白質作用。表現膜結合蛋白質的細胞在圖5 的左側指示者，與Fc融合蛋白質（指示於該圖上方）共同培 將培養在DMEM基質，含10%FBS之Cos-7細胞以500,000 細胞/每槽分盤在一個2 4孔平盤之中。利用FuGene 6試劑 (印地安納州 Indianapolis市的 Roche Molecular Biochemicals 公司出品）將該細胞轉移感染。對每一轉移感染而言，將3 微升Gene 6試劑添加劑4 7微升不含血清的DMEM基質中。 在室溫下培育1 0分鐘以後，將混合物滴加入0.25微克質體 中並且培育1 5分鐘。然後將以上混合物添加到有〇.5毫升 DMEM與10% FBS的細胞之中。在37°C，5% C02的氛圍下 培育該細胞。做爲對照組的一方則是以CHO D-細胞用含 有人類CD28之cDNA的表現載體穩定轉移感染，其亦以 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
1274058 A7 B7 五、發明說明（73 ) 500,000細胞/槽分盤於24孔的平盤上。 4 8小時以後，除去含有轉移感染試劑的基質，用RpMI 加5% FBS沖洗該細胞兩次。把丨〇到2〇毫微克溶於1毫升基 質之經純化F c融合蛋白質培育在冰上3 〇分鐘。用RP]V[I加 5% FBS沖洗該細胞三次，然後與2微升FITc結合之抗人類 F c抗體（1毫克/毫升）在冰上另外培育3 〇分鐘。用rPmi連 續沖洗三次之後，用不含酚紅的25〇微升Rp]V[I基質覆蓋以 備ACAS分析。 以ACAS法分析與各種f c融合蛋白質結合之細胞顯示 B7RP1蛋白負與CRP1結合’但不與該已知輔助刺激途徑 中之蛋白質CD28或CTLA-4結合。反之，CRP1會與B7RP1 作用’但不與B7.2這種已知途徑中的成份作用（參考圖 5)。這些結果強烈指示CRP1和B7RP1代表一種新穎的受 體-配體對，其相似於CD28和B7.2。然而，因爲CRP1和 B7RP1不與B7.2，CTLA-4或CD28作用，所以它們是分開並 且在已知的輔助刺激途徑中獨立作用的。 實施例9 鑑認能表現B7RP1受體之細胞 利用B7RP1 -Fc融合蛋白質以偵測能表現針對B7RP1之受 體的細胞，假設包括CRP1蛋白質（參考實施例6 )，此乃藉 由FACS分析來完成。將脾臟從6隻C57/黑色雌老鼠身上移 出，用100微米篩孔大小的濾器予以研磨以釋出淋巴球， 使其通過70微米濾器，然後在50毫升RPMI_1640之中沖 洗。在1500 rpm轉速下使之離心沈澱成小塊，再重新懸浮 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（74) 於新鮮的RPMI之中，混合以打散成塊的細胞，並使其通 過40微米的濾器。把待活化的細胞植放入裝有？尺以1_ 1640，5% FBS，1XPSG，ΡΜΑ，離子黴素的六孔平盤中， 在37 C和5% C〇2下培育至隔夜。十二小時後用目視確認方 法檢查T -細胞之活化情形。 將用於免疫染色之活化的脾細胞在PBS，0.5% BSA(Path-ocyte4商品，ICN藥廠出品），沖洗緩衝液沖洗，重新懸 浮，然後分成100微升體積的小部份，以適當方式添加i 5 微克/毫升CRP1 -Fc融合蛋白質或B7RP1 -Fc融合蛋白質 (1 · 5微克/母個樣品）’然後把混合物放在冰上培育$ 〇分 鐘，並且經常攪拌。將細胞用5毫升沖洗緩衝液沖洗兩 次。融合蛋白質的結合作用是利用2微克羊的抗人類 (GaHuFc-FITC)結合二級抗體溶於1〇〇微升體積中進行細胞 染色而觀看到的。細胞的標記抗體與p E結合有與GaHUFc-FITC —併添加，並且若有指出則一併添加附照用的同型_ P E結合抗體對照物（家鼠的同型物）。把樣品如先前在冰 上培育和沖洗。觀察是用FACScan掃描分析來完成的，其 具有閘片安在淋巴球細胞群上。用CD4+抗體和B7RP1-FC 融合蛋白質雙重染色指出該細胞會表現CD4標示物和針對 B7RP1之受體，假設爲CRP1 (圖6)。以類似的方式用CD8 + 抗體和B7RP1 - Fc融合蛋白質進行雙重染色則顯示該細胞 會表現CD8和B7RP1受體（圖6)。我們吾法在未經活化的脾 細胞製備物中可信賴地偵測到此種雙重染色細胞。因爲 CD4和CD8是T-淋巴球之標記物，所以吾人可推定CRP1會 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（75) 在經活化的CD4+和CD8+ T·細胞中被表現出來。這些數據 與CRP1 RNA在致敏化老鼠的淋巴結τ -細胞區域比一般正 常老鼠有增進的表現相互一致。（實施例6 ) 實施例1 0 鑑I忍能表現CRP1配體之細胞 利用CRPl-Fc融合蛋白質偵測能表現CRP1之配體的細 胞，假設包括B7RP1蛋白質（參考實施例8 )，此係藉由 FACS分析法完成（圖7)。脾細胞係如實施例8的方法製 備’除了把十二小時之T ·細胞活化步驟刪除，並且直接 分析細胞。用CD45R(B220)標記物抗體和CRP1_Fc融合蛋 白質對脾細胞做雙重染色。偵測那些能表現CD45R B -細 胞標記物和推定CRP1配體（假設包括B7RP1 )兩者的細胞 (實施例8)。因此，吾人可下結論：B7RP1會在B-細胞一種 存在抗原之細胞型式中表現。這些數據與B7RP1 rNA會在 各種淋巴樣組織的B -細胞區域表現相互一致（實施例5 )。 用FACS分析B7RP1在腹膜巨噬細胞上的表現（圖8)。以 局邵灌洗法從正常老鼠身上收集腹膜細胞並先予沖洗後， 再與CRP1 - F c融合蛋白質或做爲對照物的ρ 〇蛋白質，或 者是與F4/80單株抗體（其偵測特定於巨噬細胞的抗原）， 或一種無關的同型相吻合之對照用單株抗體共同培育。然 後將細胞再沖洗，並與羊的抗人Fc_FITC結合抗體一起培 育。經過再沖洗之後，把細胞送入facs分析儀中偵測其 光散射與螢光染色的性質。首先將腹膜細胞以其光散涉性 質爲根基區分成次群（圖8A)。巨噬細胞在第5區（R5)被鑑 -78· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· --------線_· 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（76) 遇出來’因爲它們能強烈地把光向前（FSC)和向兩側（ssc) 散涉，並且它們經F4/80抗原（一種巨噬細胞標記物）染色 的結果爲正（圖8 B )。第6區（R6)的巨噬細胞經單獨挑出， 此乃基於其對F4/80抗原的染色結果較不深，並且經發現 會被B7RP1 -Fc融合蛋白質染色（圖8C)。這些數據指出 CRP1的配體’或許包括b7rpi，會在巨嗤細胞這種專門 存在有抗原的細胞上表現。這項結果與CRp丨和B7RP1 τ -細胞活化上的功能相互一致。 實施例1 1 B7RP1-FC融合蛋白質在c〇nA-刺激之 T-淋巴球上的體外抑制活性 如實施例8的方法製備老鼠的脾細胞，並藉由負向選擇法 使T ·淋巴球變濃（R&D系統公司出品，位於明尼蘇達州，
Minneapolis市）。利用200,000個脾細胞在9 6孔的圓底平盤 中進行增殖檢驗。將細胞與基質（無添加物），CRpi _Fc， B7RP1 -Fc或B7.2_Fc等如圖9所指示的融合蛋白質一起培 '。如圖9底部指示的添加基質（無添加物），或各種濃度 的CnoA。然後把細胞放在37°c和5% c〇2下培育。42小時 以後’用3 Η -胸嘧啶對細胞進行6小時脈衝，將之收獲並 測定其放射性。平均的CPM和得自三個重覆樣品之標準差 則表現於圖9之中。
Fc融合蛋白質本身並未顯示出顯著的τ_細胞刺激或抑 制活性，然而當1微克/毫升和3微克/毫升C〇nA#在時， B7RP1-FC和已知的B7.2_Fc融合蛋白質均顯示出顯著的抑 -79 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） l· —----------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1274058 A7 B7 五、發明說明（77) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 制活性（圖9 )。在高濃度下，ConA刺激作用會造成細胞死 亡’假設是經由T-細胞過度活化。添加B7RP1-FC或B7.2-Fc則會顯著保護細胞免於高濃度c〇nA之破壞作用。在抑 制和保護功能兩方面，B7RP1-FC蛋白質對於CnoA刺激之 細胞而T要比B7.2-Fc蛋白質的效果來得大。這些數據指 出B7RP1蛋白質的功能在於調節τ _細胞的增殖。 實施例1 2 B7RP1-FC融合蛋白質在基因轉移老鼠 身上之全身傳遞 將實施例7中所説明的B7RP1 -Fc融合蛋白質次轉殖到 ApoE-肝臟特定之表現載體之中（sinionet等人，<<臨床研 究雜誌 >>，第94期·· 1310-1319頁（1994年）和PCT申請案 號第US 94/11675號）。用限制酶Spe I和Not I將編碼區從 pCEP4/B7RPl_Fc上切下，並將此片段次轉殖到先前提過之 ApoE-肝臟特定之表現載體的同一切位。將所得到的質體 HE-B7RP1-FC的整個蛋白質編碼區和該編碼區兩側的序列 予以定序，以確保其沒有突變發生。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用兩回CsCl密度梯階離心法將質體放大並純化。用限制 酶Cla I和ASe I消化已純化的質體DNA，並且用瓊脂膠體電 泳純化1.5 kb基因轉移***序列。把純化的片段稀釋成1微 克/愛升溶於5 mM Tris，pH 7.4，和0.2 mM EDTA的野存注 射液。將得自BDF1 X BDF1·配種老鼠的單細胞胚胎基本上 依説明的方法注射（Brinster等人，《美國國家科學院進展 報告》，第82期，4338頁（1985年）），只除了注射針在使 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 1274058 A7 ___B7 ___ _ 五、發明說明（78 ) 用前要成斜角並予碎油處理。將胚胎放在C〇2培養箱中培 養至隔夜，並1 5至2 0含兩個細胞的胚胎轉移到假受孕之 CD1雌鼠的輸卵管。 在一段受孕期後，從微注射胚胎上的移植獲得5 6個子 代。用PCR放大基因組DN A樣品中整合進入之轉移基因來 篩選子代。放大的目標區是一個含369 bp之人類Apo E*** 序列區，其包含在表現載體之中。用於PCR放大作用的寡 核甞酸序列是： 5，_GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3’（序列辨識號碼：32) 5’-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3’ （序列辨識號碼：33) PCR的條件為：94 "C，2分鐘，一個循環；94 °C經1分 鐘，63 °C經20秒，和72°C經30秒，共30個循環。在56個 原來的子代中，有7個經鐘認為PCR正結果之基因轉移創 始老鼠。 在十二週齡時，將9隻基因轉移創始老鼠（#1，2,4,6, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨線- 8，30，32，33，40)和 5 隻對照組老鼠（#5，9，10，25，28) 予以犧牲以進行屍體剖驗和病理學分析。將全部的細胞 RNA從創始動物和負面對照組之同胎動物肝臟中分離出 來，方法如說明（McDonald等人，《酵素學方法》，第152 期，219頁（ 1987年））。用北方墨點法分析這些樣品得知轉移 基因的表現程度。將得自每一動物之大約1 〇微克總RN A以瓊 脂電泳變性膠體進行解析（Ogden等人，《酵素學方法》，第 152期，61頁（1987年），然後轉移到HYBOND_N尼龍薄膜 (Amersham公司出品）上，用32P dCTP-標記之mB7RPl-Fc插 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058
五、發明說明（79 入列 DNA探測。在 63°C ExpressHyb 溶液（Cl0netech公司 出品）和2-4 X 1〇6 CPM經標記之探針/每亳升雜交溶液之 中雜X —小時。雜交之後，將墨點紙用2 χ SSC，〇 SDS在室溫下各沖洗5分鐘兩次，然後用〇 1χ ssc，〇 ι% SDS在饥各沖洗15_2〇分鐘兩次。接著用放射自顯術測定> 創始和對照組同胎動物中轉移基因的表現情形。 北_方墨點分析指出有7隻基因轉移創始老鼠表現出可偵 測濃度之轉移基因的RNA(老鼠#1，2，6，8，32，33和 4〇)。負對照組的老鼠和3隻創始老鼠（#4，3〇和31)則未表 現出可偵測到的RNA量。因爲B7RP1 _Fc融合蛋白質經測 足從培養之哺乳動物細胞内分泌出來（圖4 B和實施例乃， 因此轉移基因之mRNA的表現應指出了全身傳遞之基因產 物的濃度。 實施例1 3 B7RP1 -Fc融合蛋白質的生物活性 將七隻基因轉移老鼠（老鼠#1，2，6，8，32，33和4〇)和5 隻對照用的同胞老鼠（#5，9，10,25和28)犧牲以供屍體剖驗 和病理學分析，其利用以下方法：在安死術之前，所有動 物都要驗明身份編號，然後稱重，予以麻醉和抽血。保留 血液成血清和完全血液二種形式以供完整的血清化學和血 液學名單。放射顯影術只有在最終以致命的C〇2吸入麻醉 之後，和整體解剖。然後將組織取出並且用1〇%經緩衝的 Zn-揭馬林固定用以進行組織學檢驗。收集的組織包括肝 臟、脾臟、胰臟、胃、十二指腸、迴腸、帕尹爾氏結，結 -82 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁}
1274058 A7 ----------_B7__ 五、發明說明（80 ) 腸、腎、再生性器官、皮膚、乳腺、胃頭、腦、心臟、 肺、胸腺、氣管、食道、甲狀腺/副甲狀腺、空腸、盲 腸、直腸、腎上腺、白色和褐色脂肪，和骨骼肌。在固定 之前，測定整個器官的重量：肝、心臟、胃、腎、腎上 腺、脾和胸腺。固定之後，將組織加工到石蠟塊之中，得 到3微米的切片。 對於B -淋巴球標示物，B220，和T -淋巴球標記物， CD3 ’進行免疫組織化學研究。爲了偵測B22〇或CD3之表 現’將之以福馬林固定、石壤包埋、4微米切片經除去石 蟻並用去離子水予水合。以3 %過氧化氫終止切片反應， 用蛋白質阻制劑（Lipshaw公司出品，加州Carpinteria市）予 以阻制，並且在家鼠抗622〇單株抗體（pharmingen公司出 品，加州聖地牙哥市）或兔子的抗CD3多株抗體⑴ak〇公司 出品，加州Carpinteria市）之中培育。用生物素修飾的兔子 的抗家鼠或羊的抗兔子免疫球蛋白偵測該抗體，並使用與 過氧化酶結合的鏈抗生物素蛋白（Bi〇Genex公司出品，位 於加州San Ramon市）與DAB做爲發色劑（Bi〇tek公司出品， 加州Santa Barbara市）。將切片用hemaoxylin做對比染色。 在此項研究中，在研究的存活相期間報導的是正常臨床 跡象。該基因轉移老鼠的全身放射顯影圖可與對照組的老 鼠相比較。該基因轉移老鼠的全部血液學參數可與負對照 組相比較，雖然在個別老鼠中散發性的改變是存在^ : ^ 因轉移老鼠’ #8和#40有增進的血清球蛋白濃度（高球^ 白血症）而#32和#33則有高正常範園之球蛋白濃度，而伴 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058
奴有低正常範圍之白蛋白濃度，此爲慢性抗原刺激免疫系 統中常見的形式。其他基因轉移老鼠之器官重量與對照組 的並沒有顯著的不同。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以下組織病理學的變化發生在基因轉移老鼠體内：基因 轉移之B7RP1 - F c老鼠的腸繫膜淋巴結與對照組老鼠比較 時適度或顯著地增大（圖1〇A-1〇D ;圖ua_11e)。該皮層使 員著的囊/包增生過盛看起來像是放大的二級囊泡（圖1 11B)，且帶有大的生發中心，其中包含大多爲B22〇+ B細 胞（圖11D)和一些發散的CD3+ τ細胞（圖nF)。該副皮質 (CD3+ T細胞）區亦適度放大（圖11B_nF)，且髓竇略爲增 加了肥胖巨噬細胞的數目（竇組織細胞病）。在該結節處最 値柃 >王意的變化是發生在髓索，其溫和至顯著地因大量 B7RP1 - Fc基因老鼠體内分化完全的漿細胞而擴大（圖 10D)。在基因轉移老鼠#4〇之中，有少量發散的盧梭爾氏 體（亦即漿細胞中具有顯著、大而圓之細胞質内含免疫球 蛋白的小泡者）亦在髓索之中被發現（圖丨〇D)。有趣的是其 他内邵與周圍的淋巴結（例如：頸部和腹股溝的）具有相似 之活性淋巴樣過度增生的形態學特徵，暗示此爲全身反 應。這些發現與慢性的。正進行之具有促進體液免疫反應 免疫刺激作用一致，其使得B細胞增殖並且最終分化成 水、、、田胞。在與對照組老鼠比較時，B7RP1 - F c基因轉移老 鼠的脾臟有可變之增大的白色髓區，其具有適度活性的淋 巴樣過度增生，尤其與具有顯著生發中心和周圍動脈τ_ 細胞的Β _細胞二級囊泡有關。另外一値注意的發現 __________-84- 本紙張尺度咖巾關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐"7 I --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1274058
五、發明說明（82 ) ^B7RPl_Fe基因轉移老氣在其環繞白髓區的邊緣區位和 :鄰接的、、、工姆〈中有最小至溫和的聚細胞胞欽作用。基因 轉移老請具有少許發散的盧梭爾氏體（圖ι〇ρ，插圖）， I’工姆有t微至中度的髓外造血作用，可與對照組老氣體 内所見者互相比較（圖1 〇E)。 小腸的帕伊爾氏結中度至顯著地在B7RP1 -Fc基因轉移 老藏體内增大，其增大程度要大過對照組的老鼠（圖i〇g)， 並且其具有非常大之帶有顯著生發中心的囊泡，在基因轉 移老鼠#40和#32之中尤然（圖1〇H)。此外，在黏膜之加厚 的固有層中淋巴球和漿細胞的數目有極少（在#32)至輕微 的（在# 8和# 3 3)增加（與老鼠# 3 2迴腸中之溫和和嗜伊紅浸 潤物相混）卜，其發生於小腸，但在轉移基因老鼠的的結腸 内更爲顯著。在某些B7RP1-Fc基因轉移老鼠體内（尤其是 老鼠#8和#2)大腸淋巴樣集結（GALT)亦要比對照組略爲 更加顯著。 一般而言，其他受檢驗的組織，包括：胸腺、骨髓、 肝、肝、心、胰、腎、腎上腺、甲狀腺、副甲狀腺、氣 管、再生性器官、膀胱、乳腺、皮膚、骨髓肌、周圍神 經、腦、食道、胃、小腸和大腸、骨頭（股骨/脛骨），膝 關郎、白色和褐色脂肪’顯示出正常狀況，並且可與對照 老鼠所偵測到的背景變化相比較。 此項研究的數據顯示在基因轉移老鼠體内過度表現B7 相關的蛋白質F c嵌合體（B7RPl_Fc)會引發一種表現型， 其特徵爲顯著具活性的淋巴樣過度增生在脾、周圍和内部 -85- 氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) - 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（83 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 淋巴結，和與腸管連結之淋巴樣組織被偵測到，其呈囊泡 增生過盛，且在某些動物體内有τ ·細胞區擴大和値得注 意的漿細胞胞欽作用並伴隨高球蛋白血症。該漿細胞胞欽 作用伴隨較高之循環IgG濃度（平均土SD=597±298毫升於基 因轉移老鼠體内，對比於209±80亳克於對照組同胎老鼠， η=7，ρ<0·05，t試驗），尤其是IgG2a(217±100毫克/毫升對 比於75土29毫克/毫升，n=7，p<0.01，t試驗）。IgG2a之引 發通常與Thl細胞介素如IFN-g相關連，因此B7RP- 1會引 發B -細胞和T -細胞增殖並刺激B -細胞分化到漿細胞内和 生產免疫球蛋白。 這些變化與持續的全身免疫反應，並且高度刺激免疫系 統中的體液免疫而造成B細胞刺激、增殖和分化成通貫所 檢驗淋巴樣器官中生產抗體之漿細胞的結果相符合。 吾人從B7RP1 -Fc基因轉移老鼠所顯示的顯著淋巴樣增 生過盛做以下結論：B7RP1蛋白質在體内具有與免疫系統 刺激作用相關的顯著生物活性。 實施例1 4 人類B7RP1的轉殖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利用淋巴球分離基質（ICN藥廠出品）將正常人類循環周圍 淋巴球與紅色球分開。然後用1 〇微克/毫升與平盤結合的 抗-CD3抗體（Immunotech公司出品，緬因州Westbrook市）， 1 0毫微克/毫升PMA和500毫微克/亳升離子黴素處理至隔 夜（1 6小時，在37°C和5% C02條件下使其活化。然後用 TRIzol試劑（Gibco BRL公司出品）從細胞製備總RNA。用離 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（84 ) 心法使細胞集成小塊，並將細胞小塊物再懸浮於1毫升 TRIzol試劑中，使每5 X 106個細胞懸浮於1毫升試劑中，並 在室溫下培育5分鐘。然後在每1毫升原始TRIzol試劑中添 加0 · 2毫升氯仿。劇烈地用手搖晃試管1 5秒並且在室溫下 培育3分鐘，並且在4°C下以13,000 rpm、離心1 5分鐘。離 心之後，收集包含RNA的澄清上層水液相，並添加異丙醇 使樣品RNA沈澱。然後在室溫下培育該溶液！ 〇分鐘，使 RNA沈澱成小塊，用75%乙醇沖洗，然後在4F，15,000 rpm下離心5分鐘。將小塊物風乾，再懸浮於不含rnA水解 酶的水中，把它分成小部份，貯存在_8〇°C直到稍後使用。 cDNA庫的建構是利用應用於cdnA合成和質體轉殖的外 部錄寫質體系統（Gibco BRL公司出品）。簡言之，將平均 大小爲2 kb的cDNA***序列連接到pSport載體的Sall/Notl 轉殖切位之中。將連接完成的質體用電穿洞法送入 Electromax轉型競爭性大腸桿菌（Gibco BRL公司出品）之 中，予以滴定並且以每個LB盤含15,000個菌落的方式予以 分盤（含氨苄青黴素100微克/毫升。將300,000個菌落置放 到菌落/斑塊篩選雜交轉移薄膜（NEN Life Sciences公司出 品）之上，在0.5 N NaOH和1·5 M NaCl之中變性5分鐘，然 後連續於以下緩衝液中和每一者5分鐘：1 M Tris HC1，pH 8·0 ; 0·5 M Tris HC1 pH 8.0和 1.5 M NaCl及2X SSC。然後將 該濾紙以紫外線照射進行交叉連接反應，並在眞空烤箱中 於80°C烘烤30分鐘。將濾紙廣泛地在2X SSC中於42°C下預 沖洗以除去殘留物，然後在42°C下於50%甲醯胺，5X SSPE， -87- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 卜 — 丨丨丨丨丨 — —— i I — — I 丨- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（85 ) 5X Denhardt氏溶液，0.5% SDS，100微克/毫升鮭魚*** DNA之中預先雜交2小時。 人的淋巴球cDNA庫是用895 bp長的DNA片段篩選的，其 具有圖3A顯示的核嘗酸1-771 ’有167 bps緊接在圖3A中起 始甲硫胺酸密碼子5 ’端，並且有17 bp緊接在圖3 A之位置 711的3 ’端。此種含167個鹼基對之上游5，序列係得自 HuB7RPl cDNA 的 51 RACE(實施例 4)，並且從 TOPO TA載 體（加州Carlsbad市的Invitrogen公司出品）的Eco RI限制酶切 位釋出。將此***序列在0.8%瓊脂TAE膠體中純化兩次。 利用DNA膠體純化套組（Qiagen出品）從瓊脂中分離出DNA 的***序列。 依照Redi-Prime 2(Amersham公司出品）任意主要標記系統 的方法用32P dCTP(Amersham公司出品）標記125毫微克DNA 片段。然後將承載菌落的濾紙與探針在42°C下於下述緩衝 液中與探針雜交至隔夜：50%甲醯胺，5X SSPE，2X Denhardt氏溶液，0.5% SDS，100毫克/毫升ssDNA。該探針 的比活性爲2.38 X 109 cpm/微克DNA，在大約2毫微克標記 探針/每毫升雜交緩衝液的條件中。將探針除去並予保留 以便下一回篩選用。然後將濾紙在2X SSC，0.1% SDS RT 之中沖洗1 5分鐘，接著用IX SSC，0.1% SDS在55°C沖洗 1 5分鐘；並且用IX SSC，0.1% SDS於60°C沖洗1 0分鐘。 把濾紙包在塑膠之中，並在-80°C與二片促進用隔板曝露 於放射自顯術底片至隔夜。鑑認3個獨立之正結果的純種 系。將曝露樣品排列於細菌盤中，並將正結果的純種系刮 88 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） J---In — — — — — — ----丨 I -訂 — 丨 I----I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1274058 A7 B7 五、發明說明（86 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 下來，稀釋並重新分盤於含氨芊青黴素100微克/毫升的 L B盤中，使其如先前生長至隔夜，並將純種系挑出，製 備，和探測（如先前説明的方式）。把三個獨立的轉殖純種 系分離出來，將DNA分離出來，並對每一純種系的三個重 覆樣品進行DNA定序。 該人類B7RP1蛋白質的全長是302個胺基酸。該穿透膜區 位的多肽長度與相對位置與其他B 7家族的成員一致。人 類B7RP1基因有43%的胺基酸與老鼠的純種系完全相同。 這種程序的同質性很顯著，因爲老鼠與人的CD80蛋白質 只有41%完全相同。老鼠和人類基因之間値得注意的保留 部份是位於胺基酸位置37，113，158，215和216的半胱胺 酸殘基。 實施例1 5 人類CRP1的轉殖 利用老鼠B7RP1序列（參考圖2)之基因庫胚同質性搜尋 (GCG，威斯康辛大學）尋獲一種包括1〇4 bp序列之基因組 純種系（基因庫查詢編號AQ022676)，其顯示與老鼠的 CRP1基因有高同質性。PCR轉殖用引子經設計而與此種序 列相重疊。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5*-GCA TAT TTA TGA ATC CCA-3’（序列辨識號碼；34) 5’_ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3,（序列辨識號碼；35) 利用上述引子，並利用圖1和實施例1中説明之老鼠的 CRP1質體做爲模版可將老鼠的CRP1之151 bp DNA片段放 大。依照Redi-Prime 2(Amersham公司出品）任意主要標記 -89 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7__ 五、發明說明（87 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 系統的方法以32P dCTP(Amersham公司出品）將125毫微克 DNA予以標記。然後容許得自實施例1 5所説明之人的周 圍血液基因庫的純種系裝載濾紙與探針在以下雜交缓衝液 中雜交至隔夜（1 5小時），溫度爲4i°C : 50%甲醯胺，5X SSPE，2X Denhardt 氏溶液，〇.5% SDS，1〇〇 微克 / 毫升 ssDNA。該探針的比活性爲3·52 χ 1〇9 cpm/微克·Α，15 耄微克標兄探針/耄升雜交緩衝液。把探針取下並保留以 供下回之篩選。然後在2X SSC，0.1% SDS中於室溫下沖洗 濾紙，接著在IX SSC，0.1% SDS中於37°C下沖洗7分鐘， 於40°C下沖洗7分鐘，於44°C下沖洗7分鐘，然後在50°C下 沖洗7分鐘，連續地監測試紙釋放出標記探針的速度。把 試紙包在塑膠之中，並曝露於底片，於_8〇Ό外加兩片促 進隔板的條件下曝露至隔夜。此方法透露有9種可能之獨 JL正結果純種系。將曝露樣品排列於細菌平盤中，並將正 結果的純種系刮下來，貯存在2〇〇微升S〇c，2次連續的1 : 10稀釋後將得自第二次稀釋的7〇微升再分盤於含有1〇〇微 克/毫升氨苄青黴素的LB平盤上，如先前方培養至隔夜。 把純種系挑出，如先前方法製備並予探測。由此分離出8 個獨立的純種系，並以Qiagen微量製備法製備出Dna。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 吾人獲得含有199個胺基酸之開放讀碼區的cDNa純種系 (圖13A)。此種cDNA純種系包含與實施例1和圖！所説明之 老鼠CRP1純種系同質的核苷酸與胺基酸。對應此人類純 種系之開放讀碼區的核苷酸有77%與老鼠的CRP1基因完全 相同。將人類序列轉譯並緊接著與老鼠的^尺^蛋白質比 較透露其與老鼠的蛋白質有69%的胺基酸完全相同（圖 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1274058 _B7 五、發明說明（88 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 13B)。此外，胺基酸114至119之間的主題"FDPPPF”在老鼠 和人的CRP1基因之間具保留性。此種主題序列對應於老 鼠和人類之CD28中的"MYPPPY，，，CD28對於B7蛋白質的 交互作用是必需的。而且，位於胺基酸位置42，109和141 的半脱胺fe亦具保留性。這些半脱胺酸對應於CD28和 CTLA-4中的半胱胺酸者涉及I g環的形成和分子間雙硫化 物的二聚化。與老鼠CRP1接近的類似性，和與CD28同質 性族群的結構相似性指出這是人類的CRP1同系物。 實施例1 6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CRP 1表現於休眠之記憶τ -淋巴球 爲了研究CRP 1在記憶T -細胞上的表現，所以從6 - 7個月 的老鼠身上收集脾臟的T -細胞。將這些細胞用fitc結合 之抗人類Fc抗體標記之B7RP1 - Fc與抗CD44，CD45RB或 CD69之PE結合抗體做雙重染色。用B7RP-1-FC融合蛋白質 染色以偵測CRP_ 1蛋白質在這些τ _細胞上的表現。較年長 的老鼠顯示其有比年輕老鼠更多的CRP-1 +脾臟Τ -細胞。 有趣的是有相當數目的這些細胞是CD44高量（圖14a)和 CD45RB低量（圖14b)，該模式對記憶τ -細胞而言是典型 的。這些CRP-1 +記憶Τ -細胞正在休眠狀態，因爲它們並 未表現活化標記物CD69(圖14c)。CRP1在記憶Τ -細胞上的 表現指出CRP-1在記憶τ -細胞上具有輔助刺激的功能。 體外之T -細胞輔助刺激作用 受抑於抗B7RP_1之抗體 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（89 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了測定B7RP-1蛋白質對於τ_細胞是否具有功能相關 性，吾人將CD3+T-細胞與融合蛋白質與一種抗 _ CD3+杬體共同培育，以進行體外的增殖檢驗。然後用兔 子抗老鼠的B7RP1多株抗體或家鼠抗老鼠的B7Rp丨單株抗 體特定抑制B7RP1 - Fc在體外之輔助刺激性增殖。 盤_備B7RP· 1兔子的多株抗血浩 用老鼠的B7RP1蛋白質對三隻紐西蘭白兔（5_8磅，最初 重量）進行IM注射。每隻兔子均在第一天以15〇微克老鼠的 B7RP1蛋白質乳化於等體積之亨特氏丁丨如乂八乂完整佐劑 進行免疫注射。進一步的加強作用（第14天和第28天）是 以同樣程序進行的。用EIA法監測抗體滴定度。在第二次 追加後’抗血清透露適當的抗體滴定度。然後便從每一動 物身上獲取30毫升生產用血液。將此程序每週重覆施行 至6週。然後用蛋白質-a瓊脂層析法，接著用逆向選擇ρ c 蛋白質和層析法，並以B7RP-1-FC親和層析法進行正向選 擇以純化多株抗體。 製備家鼠抗老鼠的B7RP1單株抗體 家鼠抗老鼠的B7RP1單株抗體係如 << 實用免疫學>>，第 二版（1980 年；L· Hudson 和 F. C· Hay; Blackwell Scientific 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Publications公司出版，位於密蘇里州聖路易市）説明的方 法產生。簡言之，以每四週間隔對Lou家鼠（Harlan出品； 位於印地安納州的In(jianap〇ns市）以muB7RPl_FC融合蛋白 質乳化於佛洛伊德氏佐劑進行腹膜内注射。在融合之前三 天，用可溶的muB7RPl對家鼠進行血管内追加注射。在融 合當日，在二氧化碳下犧牲動物並以消毒方式取出脾臟。 • 92 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（9〇 ) 用組織消化機產生單細胞懸浮液。將脾細胞和y3_aG12.3 骨髓瘤細胞（美國型式培養收集中心，位於馬里蘭州 Rockville市）在不含血清的基質内沖洗，並藉由添加聚乙 二醇（PEG 1500 ; Boehringer Mannheim Biochemicals公司出 品；位於印地安納州的Indianap〇lis市）使其融合。將細胞 潤洗一次’再懸浮於含有血清的基質中，並且分盤到9 6 孔的組織培養盤中。十到十二天後，測試每一孔槽中的基 質是否含特定之抗B7RP1抗體，該測試係直接以酵素連接 之免疫吸著劑檢驗（EIA)來完成。將得自指示有可能結合 之孔槽中的細胞做1 〇毫升培養液之培養，並使其冷束於 液態氮中。得自每一培養物之基質而以流動細胞計數法測 試，並進行功能性T -細胞增殖檢驗。經這些方法測定有 價値者乃分盤成單細胞純種系，用EIA再次挑選，並維持 最終的細胞株用以生產抗體。從細胞基質中藉由蛋白質A 瓊脂層析法純化出抗體。 T -細胞製備與T -細胞增殖檢驗 把得自C57B1/6老鼠（8-1 2週大的雌鼠，查爾士之可實驗 室出品）的脾臟T -細胞用逆向挑選法經由老鼠τ -細胞濃化 管柱（R&D Systems公司出品）予以純化。然後該T -細胞可 直接使用或進一步以如下方式進行抗體與補體溶解作用之 純化。將細胞重新懸浮於含有抗體（均爲1 〇微克/每毫升， 且得自Pharmingen公司）的RPMI基質之中（2·5 X 1〇6個細胞/ 每毫升），該抗體係抗老鼠的CDllb(純種系Ml/70)，NK-1.1(純種系 ΡΚ136)，CD8a(純種系 53-6.7)，I-Ab(純種系 M5/114.15.2)，CD1 lc(純種系 HL3)和B220抗原（純種系 RA3- -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1274058 A7 B7 五、發明說明（91 ) (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 6B2)。然後將細胞培育在冰上3 〇分鐘，以12〇〇 Γρηι使其成 爲小塊物，重新懸浮在4 : ι(體積比的RPMI :兔子的補體 (Sigma公司出品，#s_7764)，並且在3：TC另外培養30分 鐘。再使細胞形成小塊沈澱，並重複處理該補體。在分盤 之前用含10% FCS的RPMI沖洗該細胞。將U型底的96孔平 盤用抗-CD3抗體（純種系145-2C11，Pharmingen公司出品） 以0-1.2微克/當升的濃度範圍，和抗人類12〇|7&|;)2(|§丨8111&公 司出品，12.5微克/毫升）在4°C下進包覆表面至隔夜，接著 在3 7 C培育6 - 9小時。在有或無各種f c融合蛋白質的條件 下培養T-細胞（1 X 1〇5/每孔）48小時，並且在最後1 8小時 用1微居里的3H-胸嘧啶脈衝處理。對照組f c蛋白質包括 OPG和Fc的融合蛋白質和一段非融合的Fc蛋白質片段。然 後收穫細胞並計算併入的放射性。B7RP-1-FC輔助刺激T-細胞以劑量倚賴性方式增殖（圖15a)，並且有一種抗_B7Rp_ l_Fc抗體會特定地抑制這種輔助刺激作用之劑量倚賴性。 (圖 15b) 實施例1 8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CRP-1/B7RP-1途徑之抑制劑會降低由 膠原蛋白引發之類風濕性關節炎發生 膠原蛋白引發的關節炎（CIA)是一種自體免疫的多發性關 節炎的動物模式，其發生於嚙齒動物和靈長類動物，且具 有許多與人類之類風濕性關節炎的相似性。用異源種類的 第II型膠蛋白（CII)進行免疫接種會引發對CII之自體免疫 反應，其導致CIA在可能發生的老鼠株内發展。具有H-2r 和H_2q的老鼠同類株高度易發生CIA、CIA是由CII反應性 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7
五、發明說明（92 ) T -細胞和抗體共同的增效作用所調節。將豬的 (Nabozny等人，《自體免疫》，第2〇期，51-58頁（1995年）） 溶於0.01N乙酸中使其濃度爲2毫克/毫升，然後用cfa (Difco公司出品）以1 : 1的比例予以乳化。將可能發生關 郎炎的 B10.RIII(H-2r)老氣（jackson Laboratories公司出品， 位於緬因州的Bar Harbor市）用1〇〇微升乳化物以皮内方式 免疫接種在尾巴的基部。每週監測老鼠2 _ 3次以得知關節 炎的發展情形。關節炎之嚴重程度是利用如下的評等系統 對每一腳掌進行測定：〇表示沒有關節炎；丨表示1 _ 3腳趾有 紅腫現象’ 2表示腳莩嚴重發腫；3:關節黏連。將每一肢的 評分相加產生對每隻動物而言自〇 _丨2的嚴重程度範圍。 將老鼠以100微克（溶於200微升）蛋白質每週腹膜内注射 兩次。該處理在以豬的CII免疫注射一天後開始，並且在 免疫注射52天之後停止。本實驗在包含1〇隻老鼠的組中 進行，而得分在1或在1以上的動物評分爲正値。結果顯 示於圖16和表1之中。 表1 CRP-1，B7RP-1，CTLA-4和B7.2 Fc 融合蛋白質對引發關節炎的影響 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - -H ϋ I -ϋ ϋ ϋ 一：0、 _ϋ ·ϋ ϋ I ϋ ϋ I · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 處理組別 平均値+/-SD引發天數 CTLA4-FC 60.0±0.0 CRPl-Fc 48.9±13.2 B7.2-FC 28.4 士 14.1 B7RP1-FC 33·9±16·6 PBS 37.7±17.1 -95· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 ___B7_____ 五、發明說明（93 ) 在以CRPl-Fc融合蛋白質處理的老鼠體内，關節炎症狀 的引發要比PBS處理的老鼠要延遲大約1 〇天。這證明了抑 制CRP-l /B7RP-1途徑可以減輕這種類風濕性關節炎之老 鼠模式的症狀。 用B7RP-1-FC或B7.2_Fc處理的老鼠顯示其與PBS處理的對 照組相比’會較早發生疾病（表1和圖16a)，並且增加關節 炎的嚴重性（圖16b)。這指出了 B7RP-l_Fc融合蛋白質會增 進T -細胞的免疫反應。此種活性有用於在體内產生抗腫瘤 的免疫性。 在此類風濕性關節炎的老鼠模式中，CRP-1-Fc和BTRP-l-pc所產生 的相反 效應指 出該途 徑可經 操縱而 促進或 抑制病 情發展。用可溶性B7RP- 1-Fc針對CRP-1蛋白質目標會促進 該病症，而使可溶性CRP-1-Fc和B7RP-l_Fc交互作用會抑 制該疾病的症狀。 實施例1 9 B7RP-l_Fc會在基因轉移老鼠體 内謗發發炎性腸疾表現型 持績在22-25週大的基因轉移老鼠體内（實施例ι2)過量表 現與B 7相關的蛋白質（B7RP 1-Fc)會謗發某些動物體内發 炎性腸病（IBD)之顯著表現型，而在小腸和大腸有顯著的 增厚與fe性發炎（小腸結腸炎）和體重減輕。就組織學而 言’最嚴重的發炎性變化在近端和遠端的結腸被發現，並 在小腸有輕微變化。該近端結腸顯著增厚並有裂缝潰瘍， 壁膜4透性發炎’以及慢性黏膜肥大’而遠端結腸則有擴 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .
1274058 五、發明說明（94 ) 散之黏膜肥大（或病灶性侵蝕與腺體萎縮），而沒有潰瘍。 近端小腸有輕微至顯著的黏膜肥大與較輕微的發炎變化， 而遠端小腸（迴腸）則在某些動物有輕微的黏膜肥大，且在 其他老鼠爲萎縮。小腸的變化最嚴重且在雌性基 因轉移老㈣内經f地被發現，但亦在本研究之數個雄性 基因轉移老鼠體内被發現。 很有趣的疋吾人 >王意到在近端結腸内發現的組織學特 徵，包括裂缝性潰瘍和穿透壁膜的慢性肉芽腫發炎，以及 多核性巨細胞，比潰瘍性結腸炎更爲密切相似於人類體内 發現的Crohn氏症。就形態學而言，此種結腸炎亦相似於 缺乏介白素-10的老鼠體内説明之IBD，其發展出消耗、 貧血、和影響整個腸遒的小腸結腸炎（Kuhn等人，1993 年；Sartor，1995年；Leach等人，1999年）。在^❹擊倒性 老鼠體内。B7RP-1-FC基因轉移老鼠的最初變化包括輕微 病灶性發炎細胞的浸潤物在固有層而沒有慢性上皮增殖 (實施例1 3 )。在較年長老鼠體内，受影響的慢性節段變 厚’此係由於腺體肥大/增生和慢性發炎所致。B7RP-1 _Fc 老鼠的近端和遠端結腸具中度至嚴重結腸炎，其具有發炎 性腸病（IBD)的組織學特徵。近端節腸之受影響節段（圖 17B-17D)擴散性的增厚，這是由於腺體之上皮肥大和增生 過盛’以及黏液腺體之伸長與舒張（圖17B)，其具有數目 增加的有絲***形體和少有的隱窩膿腫，但是保留具有黏 液素的杯狀細胞（圖17D)。在固有層之黏膜有擴散之慢性 發炎，在某些動物體内穿透黏膜的延伸而涉及腸壁的下 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（95 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 層’包括黏膜下層、肌層、漿膜，和鄰接的腸繫膜脂肪組 織（圖17B-17C)。發炎的浸潤物包含淋巴球（主要是cD3+， CD44+，T細胞），漿細胞，和上皮樣巨噬細胞（圖17F)與某 些嗜中性和常見的多核巨細胞混合（圖丨7E)，其爲慢性肉 芽腫發炎的特徵。淋巴樣集結物（大多是B220+細胞與少數 CD3 +細胞混合）亦出現在黏膜下層和更深層的較小血管附 近和黏膜之中，包括腸繫膜脂肪（圖17C)。空腸包含黏液 膿或黏液滲出物（圖17D)。在這些B7RP-1-FC基因轉移老鼠 體内發現嚴重的迴腸炎證據，有黏膜多病竈的裂隙潰瘍和 穿透黏膜的發炎（圖17B-17C)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7RP-1-FC基因轉移老鼠的遠端結腸亦有擴散性增厚和 增生過盛，伴隨迴腸腺體之伸長，嗜鹼和舒張(圖18B_18G)， 其中有些包含隱窩膿腫（圖18D和18F)和黏液。固有層有輕 微擴散之發炎性淋巴球浸潤物（主要是CD3+，CD44+細 胞’尤其是在表面黏膜；圖18E)，以及漿細胞和上皮樣巨 嗟細胞的病灶集結物與某些嗜中性細胞混合。淋巴樣集結 物（主要是B220+細胞的；圖18D和18F)亦在黏膜整體上發 散。B7RP-1-FC基因轉移老鼠的小腸有更多可變的變化， 包括輕微至病灶性顯著的黏膜和隱窩肥大和增生過盛（圖 19B和19D，具有隱窩：絨毛的比例範圍自1 : 4至1.5 : 1， 相較於對照老鼠之1 : 1〇)，伴隨固有層顯著的淋巴漿細胞 浸潤物。黏膜過度增生在近端小腸最爲顯著，包括十二指 腸（圖19B)和尤其是空腸（圖19D)。隱窩結構爲限局擾亂與 結構不良者發生在最嚴重受影響的老鼠體内（圖19D)。相 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 ----- B7 五、發明說明（96 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對的，某些老鼠的遠端小腸（迴腸）有輕微的，斑瑰狀的迴 腸黏膜絨毛萎縮（圖19F)，其具有鈍頭的、加厚的或限局 的織毛損失（其隱窩：絨毛比例爲1 : 1或更少，正常比例 則爲1 : 2 )，而其他老鼠則有輕微的迴腸黏膜肥大。 B7RP_l_Fc融合蛋白質作用於活化負責引發與人類之 Crohn氏症非常相似之表現型的細胞。這事實指示出可能 負責Crohn氏症之發炎現象的細胞是被37111>_1_1^融合蛋白 質所活化的。可溶性蛋白質、抗體或B7RP—1的小分子抑制 劑因而有用於抑制IBD。 實施例30 B7RP-1-FC蛋白質會抑制老鼠體内之腫瘤生長 爲了檢驗B7RP1和CRP1對於免疫原之老鼠Meth A肉瘤生 長的影響，吾人研究是否可溶性B7RP1-FC會影響已建立於 Balb/c老鼠的Meth A肉瘤之生長。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將以指數生長之Meth A肉瘤細胞移植，藉由第〇天以皮 内注射0.5百萬個細胞入Balb/c老鼠的腹腔。第七天，當腫 瘤達到〜100立方毫米時，用賦性劑（PBS)或B7RP-1-Fc(8毫 克/公斤）治療該老鼠，在第7，10，14和17天時皮下注射到 頸部。用螯狀鉗測量腫瘤的二維直徑，並利用以下公式估 測腫瘤的體積（以立方毫米爲單位）：腫瘤體積=[{(寬 度）2 X長度}/ 2 ]。該腫瘤的生長則監測達2 8天。每一組有 8隻老鼠。 對照組腫瘤之Meth A肉瘤生長模式是兩相的：一個緩慢 的起始相，接著是較快的指數相。在B7RP-1-FC處理過的 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（97 ) 老鼠中，腫瘤的生長在快速指數相中顯著地較緩。第2 8 天，對對照組和B7RP_1-Fc處理的老鼠之平均體積分別是 1410立方毫米和580立方毫米（圖20)。因此，B7RP-l_Fc治 療會顯著地抑制這項模式中的腫瘤生長。數據有力地提出 可溶性B7RP-1-FC蛋白質有利的治療用途，以及其他B7RP-1 /CRP_ 1途徑之活化劑在治療免疫原腫瘤上的用途。 免疫原的抗腫瘤活性與細胞溶解性T -淋巴球（CTL)的功 能密切關聯。一貫地，B7RP-1-FC蛋白質被表現在細胞溶 解性的CD8+ T _細胞上（實施例9，圖6 )。這些數據有力地 支持B7RP-1作用在細胞溶解性在CD8+ T -細胞上。B7RP-1-Fc或其他B7RP-1 /CRP-1途徑的刺激因而可用於促進一些 非癌症相關性病徵的細胞免疫功能和細胞溶解性T-細胞。 實施例2 1 體外抑制人的B7RP-1活性 爲了測定是否人類B7RP-1具有正向的輔助刺激性質，吾 人試驗表現人類B7RP-1的細胞，並在τ -細胞增殖檢驗中 試驗人類B7RP-1-FC融合蛋白質。人類的B7RP-1-FC融合蛋 白質是藉由融合對應於胺基酸1至247的基因序列和部份人 類的IgGl基因序列來建構的（實施例1 4)。人的B7RP-1-Fc 融合蛋白質是藉由融合對應於胺基酸1至146的基因序列和 郅份人類的IgG 1基因序列（實施例2 )來建造的。建構、表 現和純化這兩種融合蛋白質的方法是如同實施例7所説明 的方法進行的。B7RP-1-FC顯示其有依賴抗_CD3刺激之輔 助刺激活性（圖21a)。此外，這種活性可以特定地被cRpd- -100 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 ^97公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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五、發明說明（98 )
Fc蛋白質抑制（圖21b)。相似的輔助刺激效果可利用ch〇細 胞獲得，該細胞表現與膜結合的人類B7RP-i，其包含整 個編碼序列（圖21C)。 口正 用人類的T ·細胞在以上體外增殖條件下生產組織介素業 經測定。將得自受刺激4 8和7 2小時之τ _細胞培養上澄液 用於分析IL-2，IL-10和IFN-加瑪，分析方法係根據製造商 的説明書（BioSource Internati〇nal公司出品）用EUSA來完 成。IFN-加瑪和IL_10的濃度顯著增加；然而不同於以 CD28輔助刺激的情形，IL_2並未顯著被謗發（圖21旬。增加 的IFN-加瑪是一種ΤΜ組織介素，其濃度相關於B7rim增 進IgG2a的功能，如實施例1 3所説明。 體外T -細胞輔助刺激檢驗係以如下方式進行。藉由逆向 挑選新鮮或解凍的、黏著性耗盡之PBMc，利用mAb標記 的磁性珠子（Miltenyi Biotec公司出品）分離出高度純化的人 類T-細胞（>98% CD3+)。將T_細胞（ΐχ1〇5個細胞/每孔）培 養在96孔平盤的三個重複孔槽之中，平盤中有2〇〇微升/每 孔RPMI+10% FCS。爲了評估B7RP-1-FC之輔助刺激作用， 因此將各種濃度的抗-CD3(Phanningen公司出品）和1 〇微克 /毫升抗人類IgG Fc(Sigma公司出品）溶於100微升1χ ?別預 先覆蓋在U型底的平盤上，此乃藉由41下培育至隔夜來 完成。把未結合的抗-CD3和抗人類1§(} Fc除去，並將細胞 在有或沒有各種濃度之B7RP-1-Fc，〇PG-Fc對照組，咬抗_ CD28(Pharmingen公司出品）的條件下培養。對於CRp小Fc 抑制B7RP-1-FC之輔助刺激作用，將T_細胞培養在用〇·33 -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)
1274058 A7 B7 五、發明說明（99 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 微克/亳升抗-CD3和1 0微克/毫升抗人類IgG Fc預先包覆的 孔槽中，該孔槽會有0.5微克/毫升B7RP-1-FC，並且有連續 稀釋的CRP-1-Fc或OPG-Fc，以1 〇微克/毫升做爲起始。爲 了評估表現B7RP-1之CHO細胞的輔助刺激作用，將T_細胞 培養在含各種濃度之可溶性抗-CD3的平底盤中，並且在有 或沒有各種含量之經過絲裂黴素-C處理的CHO B7RP-1-細 胞或CHO載體細胞下進行。爲了試驗Τ -細胞增殖，在72小 時培養的最後1 8小時裡用1微居里/每孔[3]TdR對培養物施 以脈衝。以[3H]TdR併入情形測定T _細胞的增殖。一項得 自三個任意供給者之代表性實驗的結果以平均CPM併入値 +/- SD來表示。爲了分析組織介素的生產，將細胞培養4 8小 時和7 2小時，並收集上澄液以供ELISA。 這些實驗顯示如實施例1 4所説明的人類B7RP_ 1的細胞 外邵份在融合至人類F c片段時，能在體外輔助刺激τ _細 胞。這種輔助刺激作用會被CRP-i_Fe抑制，且因而證明人 類B7RP-1之可溶性抑制劑是如何作用的。在體外檢驗 中’如本説明書上説明利用人類ByRPd *CRp_i者，可用 於篩選杬體可落性蛋白質、肽體，或是MRH/CRP-i活性 之小分子抑制劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 * 氺氺 雖然本發明是以較佳具體實例的方式説明，但熟習此藝者 會瞭解到變化和修飾是可能發生的。因此，吾人意圖使所 附的申巧專利範圍涵盖所有此種相當的變化，而此種變化 則包含在如申請專利範園所提出之本發明範轉之中。 ____-102- 本紙張尺度適財關家標準（cns)A4規-- 1274058 A7 B7 五、發明說明（100) ， 序列-覽表 <110> AMGEN INC. <120> -涉及免疫反應之新穎多肽
<130> A-579A <140〉 09/264,527 <141> 1999-03-08 <160> 35 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 600 <212> DNA <213> 鼠 · <220> <991> <222> 互 〜補.((1) . . (600)) . <400> 1 Γ atg aag ccg tac ttc tgc cgt gtc ttt gtc ttc tgc ttc eta ate aga 48
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 1 5 10 15 . ett tta aca gga gaa ate aat ggc teg gee gat cat agg atg ttt tea 96
Leu Leu Thr Gly Glu 工le Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30 ttt cac aat gga ggt gta cag att tet tgt aaa tac cct gag act gtc 144
Phe His Asn Gly Gly Val Gin lie Ser Cys Lys Tyr* Pro Glu Thr Val 35 40 45 cag cag tta aaa atg ega ttg ttc aga gag aga gaa gtc etc tgc gaa 192
Gin Gin Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60 etc acc aag acc aag gga age gga aat geg gtg tee ate aag aat cca 240
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser lie Lys Asn Pro 65 70 75 80 atg etc tgt eta tat cat ctg tea aac aac age gtc tet ttt ttc eta 288
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 aac aac cca gac age tee cag gga age tat tac ttc tgc age ctg tee 336
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 att ttt gac cca cct cct ttt caa gaa agg aac ett agt gga gga tat 384 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125 ttg cat att tat gaa tee cag etc tgc tgc cag ctg aag etc tgg eta 432
Leu His lie Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140 ccc gta ggg tgt gca get ttc gt't gtg gta etc ett ttt gga tgc ata 480
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys lie 145 150 155 160 103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------11^--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇1 ) ctt ate ate tgg ttt tea aaa aag aaa tac gga tee agt gtg cat gac 528
Leu lie 工le Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ect aat agt gaa tac atg ttc atg geg gca gtc aac aca aac aaa aag 576
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190 tet aga ctt gca ggt gtg acc tea 600
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> 鼠 <400> 2 *
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu lie Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser .♦ 20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gin lie Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val 35 40 45
Gin Gin Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser lie Lys Asn Pro 65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125
Leu His 工le Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys lie 145 150 155 160
Leu lie 工le Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200 <210> 3 <211> 200 *
<212> PRT -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1〇2) <213> 鼠 <400> 3
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 15 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu lie Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gin lie Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val 35 40 45
Gin Gin Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser lie Lys Asn Pro 65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 90 95 *
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125
Leu His 工le Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys lie 145 150 155 160
Leu lie 工le Trp Phe Sdr Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 * 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200 <210> 4 <211> 218 <212> PRT 、 <213> 鼠 ' <400> 4
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gin 15 10 15
Val Thr Glu Asn Lys 工le Leu Val Lys Gin Ser Pro Leu Leu Val Val 20 25 30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu 35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val 50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gin Pro Gin Phe Arg 65 70 75 80 -105- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
I I I 訂-I —II--I 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇3)
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val 85 90 95
Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp lie Tyr Phe 100 105 110
Cys Lys lie Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg 115 120 125
Ser Asn Gly Thr lie lie His lie Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr 130 135 140
Gin Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val 145 150 155 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val lie Trp 165 170 175
Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gin Val Thr Thr Met Asn Met 180 185 190 *
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gin Pro Tyr Ala 195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro 210 215
<210> 5 <211> 234 <212> PRT <213>合成序列 <220> <223>合成序列之説明：：合成的寡核棼酸 <400> 5
Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 15 10 15
Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45
Val Xaa Xaa Ser Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60
Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Cys Xaa 65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Val Xaa Phe Xaa Leu 100 105 110
Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Phe Cys Xaa Xaa Xaa 115 120 125
Xaa Xaa Xaa Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly Xaa 130 135 140 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇4)
Xaa Xaa His lie Xaa Glu Xaa Xaa Leu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 156 155 160
Lys Leu Xaa Trp Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa - 165 170 175
Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa lie Trp Xaa Xaa Xaa 180 185 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 210 215 220
Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230
<210> 6 <211> 966 <212> DNA <213> 鼠 一 <220> <〇oi > rnc; <222> 互 補 ：（1) ..(966)) <400> 6 atg cag eta aag丨 tgt ccc tgt ttt gtg tcc ttg gga acc agg cag cct 48
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 15 10 15 gtt tgg aag aag etc cat:gtt tet age ggg ttc ttt tet ggt ett ggt 96
Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30 ctg ttc ttg ctg ctg ttg age age etc tgt get gcc tet gca gag act 144
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45 gaa gtc ggt gca atg gtg ggc age aat gtg gtg etc age tgc att gac 192
Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys lie Asp 50 55 60 ccc cac aga ege cat ttc aac ttg agt ggt ctg tat gtc tat tgg caa 240
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gin 65 7 0 75 80 ate gaa aac cca gaa gtt teg gtg act tac tac ctg cct tac aag tet 288 lie Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 85 90 95 cca ggg ate aat gtg gac agt tcc tac aag aac agg ggc cat ctg tcc 336
Pro Gly lie Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 100 105 110 ctg gac tcc atg aag cag ggt aac ttc tet ctg tac ctg aag aat gtc 384
Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Val 115 120 125 acc cct cag gat acc cag gag ttc aca tgc egg gta ttt atg aat aca 432
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met Asn Thr -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇5) 130 135 140 gcc aca gag tta gt;c aa§ ate ttg gaa gag gtg gtc agg ctg cgt gtg Ala Thr Glu Leu Val Lys lie Leu Glu Glu Val Val Arg Leu Arg Val 145 150 155 160 480 gca gca aac ttc agt aca cct gtc ate age acc tet gat age tee aac Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val lie Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 165 170 175 528 ccg ggc cag gaa cgt acc tac acc tgc atg tee aag aat ggc tac cca Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met· Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 180 185 190 576 gag ccc aac ctg tat tgg ate aac aca aeg gac aat age eta ata gac Glu Pro Asn Leu Tyr Trp lie Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu 工le Asp 195 200 205 624 aeg get ctg cag aat aac act gtc tac ttg aac aag ttg ggc ctg tat Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Val Tyr Leu Asn Lys Leu Gly Leu Tyr 210 215 220 672 gat gta ate age aca tta agg etc cct tgg aca tet cgt ggg gat gtt Asp Val Il,e Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 235 240 720 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ctg tgc tgc gta gag aat gtg get etc cac cag aac ate act age att Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gin Asn lie Thr Ser lie 245 250 255 · 768 age cag gca gaa agt ttc act gga aat aac aca aag aac cca cag gaa Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gin Glu 260 265 270 816 acc cac aat aat gag tta aaa gtc ett gtc ccc gtc ett get gta ctg Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala Val Leu 275 280 285 864 geg gca geg gca ttc gtt tee ttc ate ata tac aga ege aeg cgt ccc Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe lie 工le Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300 912 --------訂---------. cac ega age tat aca gga ccc aag act gta cag ett gaa ett aca gac His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320 cac gcc His Ala <210> 7 <211> 322 <212> PRT <213> 鼠 <400> Ί
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 15 10 15
Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 960 966 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇6)
Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys 工le Asp 50 55 60 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gin 65 · 70 75 80 工le Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 85 90 95
Pro Gly lie Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 100 105 110
Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Val 115 120 125
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met Asn Thr 130 135 140
Ala Thr Glu Leu Val Lys lie Leu Glu Glu Val Val Arg Leu Arg Val 145 150 155 160
Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val lie Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 165 170 175
Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 180 185 190
Glu Pro Asn Leu Tyr Trp lie Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu 工le Asp 195 200 205
Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Val Tyr Leu Asn Lys Leu Gly Leu Tyr 210 215 220
Asp Val lie Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 23.5 240
Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gin Asn lie Thr Ser lie 245 250 255
Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gin Glu 260 265 270
Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala Val Leu 275 280. 285 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe lie 工le Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300
His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala <210> 8 <211> 322 <212〉 PRT <213> 鼠 <400> 8 ，
Met Gin Leu Lys Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro -109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇7) 1 5 10 15
Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45
Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys lie Asp 50 55 60
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gin 65 70 75 80 lie Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser 85 90 95
Pro Gly lie Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 100 105 110
Leu Asp Ser Met LyS Qln Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Val 115 I 120 125
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met Asn Thr 130 135 140
Ala Thr Glu Leu Val Lys lie Leu Glu Glu Val Val Arg Leu Arg Val 145 150 155 160
Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val lie Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 165 170 175
Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 180 185 190
Glu Pro Asn Leu Tyr Trp lie Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu lie Asp 195 200 205
Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Val Tyr Leu Asn Lys Leu Gly Leu Tyr 210 215 220
Asp Val lie Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 235 240
Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gin Asn lie Thr Ser lie 245 250 255
Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gin Glu 260 265 270
Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala Val Leu 275 280 285
Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe lie lie Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300
His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala <210> 9 -110- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝i ------訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（1〇8)
<211> 306 <212> PRT <213> 鼠 <400> 9
Met Ala Cys Asn Cys Gin Leu Met Gin Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe 15 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu lie Leu Leu Phe Val Leu Leu lie Arg Leu Ser 20 25 30
Gin Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gin Leu· Ser Lys Ser Val Lys Asp 35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser 50 55 60
Glu Asp Arg lie Tyr Trp Gin Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val 65 70 75 80 lie Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu 85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu lie lie Leu Gly Leu Val Leu Ser .· 100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gin Lys Lys Glu Arg Gly Thr 115 120 125
Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser lie Lys Ala Asp 130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn lie Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr 145 150 155 160
Lys Arg 工le Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe 165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly lie Asn Thr Thr lie 180 185 190
Ser Gin Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr lie Ser Ser Gin Leu Asp 195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr lie Lys Cys Leu lie Lys Tyr Gly 210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp 225 230 235 240
Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly 245 250 255
Ala Val lie Thr Val Val Val lie Val Val lie lie Lys Cys Phe Cys 260 265 270
Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn 275 280 285
Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gin Thr Val 290 295 300
Phe Leu 305 -111 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^--------^-------- 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1〇9) <210〉 1〇 <211> 327 . <212> PRT <213>合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核甞酸 <400〉 10
Met Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 20 25 30
Leu Phe Xaa Leu Leu Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Cys Xaa 50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Trp 65 70 75 80
Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Asn Arg Xaa Xaa Xaa 100 105 110
Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa Xaa 130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa 145 150 155 160
Xaa Xaa Ala Xaa Phe Ser Thr Pro Xaa lie Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 165 170 175
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa 180 185 190
Pro Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 工le Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Val Xaa Val Xaa Xaa -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1274058 Δ7 A7 ___B7 五、發明說明（11〇) 275 280 285
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 ' 295 300
Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Thr Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320
Xaa Glu Xaa Thr Xaa Xaa Xaa 325 <210> 11 <211> 864 <212> DMA <213> 鼠 <220> <991> <222> 互 補 （（1)..(864)) <400> 11 atg egg ctg ggc* agt cct gga ctg etc ttc ctg etc ttc age age ett 48
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu " 1 5 10 15 ---.--------_裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ega get gat act cag gag aag gaa gtc aga geg atg gta Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val 20 25
c P as gA, c r ge as c yo gl 3 gG 6 9 gtg gag etc age tgc get tgc cct gaa gga age cgt ttt gat tta aat 144 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45 gat gtt tac gta tat tgg caa acc agt gag teg aaa acc gtg gtg acc 192 Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60 tac cac ate cca cag aac age tee ttg gaa aac gtg gac age ege tac 240 Tyr His lie Pro Gin Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80 — — — — — — — — — egg aac ega gee ctg atg tea ccg gee ggc atg ctg egg ggc gac ttc 288
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95 tee ctg ege ttg ttc aac gtc acc ccc cag gac gag cag aag ttt cac 336 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 100 105 110 tgc ctg gtg ttg age caa tee ctg gga ttc cag gag, gtt ttg age gtt 384
Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 115 120 125 432 gag gtt aca ctg cat gtg gca gca aac ttc age gtg ccc gtc gtc age Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140 gee ccc cac age ccc tee cag gat gag etc acc ttc aeg tgt aca tee 480
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 145 150 155 160 ata aac ggc tac ccc agg ccc aac gtg tac tgg ate aat aag aeg gac 528 lie Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp lie Asn Lys Thr Asp •113· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 Δ7 A7 __B7 五、發明說明（111) 165 170 175 aac age ctg ctg gac cag get ctg cag aat gac acc gtc ttc ttg aac
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190 atg egg ggc ttg tat gac gtg gtc age gtg ctg agg ate gca egg acc
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg lie Ala Arg Thr 195 200 205 ccc age gtg aac att ggc tgc tgc ata gag aac gtg ett ctg cag cag
Pro Ser Val Asn lie Gly Cys Cys 工le Glu’Asn Val Leu Leu Gin Gin 210 215 220 aac ctg act gtc ggc age cag aca gga aat gac ate gga gag aga gac
Asn.Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp lie Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240 aag ate aca gag aat cca gtc agt acc ggc gag aaa aac geg gcc aeg
Lys lie Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255 tgg age ate ctg get gtc ctg tgc ctg ett gtg gtc gtg geg gtg gcc
Trp Ser lie Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 ata ggc tgg gtg tgc agg gac ega tgc etc caa cac age tat gca ggt 工le Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285
<210> 12 <211> 288 <212> PRT <213> 鼠 * <400> 12
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 15 10 15
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 20 25 30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60
Tyr His lie Pro Gin Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 70 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140 -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 576 624 672 720 768 816 864 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
· 1-— —Bi I ϋ -^1 一一 I ϋ iai I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 B7 五、發明說明（112)
Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 145 150 155 160 工le Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp lie Asn Lys Thr Asp , 165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg lie Ala Arg Thr 195 200 205
Pro Ser Val Asn lie Gly Cys Cys lie Glu Asn Val Leu Leu Gin Gin 210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp lie Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240
Lys 工le Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255 ·
Trp Ser lie Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 工le Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285 <210> 13 <211> 267 <212> PRT <213> 人 <400> 13 *
Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys 15 10 15
Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr 20 25 30
Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His lie Pro Gin 35 40 45
Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu 50 55 60
Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe 65 70 75 80
Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser 85 90 95
Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His 100 105 110
Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro 115 120 125
Ser Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 工le Asn Gly Tyr Pro 130 135 140
Arg Pro Asn Val Tyr Trp 工le Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu Asp 145 150 155 160 -115- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-----I I I 訂---II---I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（113)
Gin Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly Leu Tyr 165 170 175
Asp Val Val Ser Val Leu Arg 工le Ala Arg Thr Pro Ser Val Asn lie ' 180 185 190
Gly Cys Cys lie Glu Asn Val Leu Leu Gin Gin Asn Leu Thr Val Gly 195 200 205
Ser Gin Thr Gly Asn Asp He Gly Glu Arg. Asp Lys He Thr Glu Asn 210 215 220
Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser lie Leu Ala 225 230 235 240 V孕1 Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala lie Gly Trp Val Cys 245 250 255
Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 260 265 <210> 14 <211> 276 <212> PRT j <213> 鼠 1 <400> 14
Glu Thr Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys 15 10 15 lie Asp Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr 20 25 30
Trp Gin 工le Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr* Tyr Tyr Leu Pro Tyr 35 40 45
Lys Ser Pro Gly lie Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His 50 55 60
Leu Ser Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys 65 70 75 80
Asn Val Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met 85 90 95
Asn Thr Ala Thr Glu Leu Val Lys lie Leu Glu Glu Val Val Arg Leu 100 105 110
Arg Val Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val lie Ser Thr Ser Asp Ser 115 120 125
Ser Asn Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly 130 135 140
Tyr Pro Glu Pro Asn Leu Tyr Trp lie Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu 145 150 155 160 工le Asp Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Val Tyr Leu Asn Lys Leu Gly 165 170 175
Leu Tyr Asp Val lie Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly 180 185 190 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)
1274058 A7 B7 五、發明說明（114)
Asp Val Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gin Asn lie Thr 195 ^ 200 205 Ser lie Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro 210 215 220 Gin Glu Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala 225 230 235 240 Val Leu Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe lie lie Tyr Arg Arg Thr 245 250· 255 Arg Pro His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu 260 265 270 Thr Asp His Ala 275 <210> 15 <211> 280 <212> PRT * <213>合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核甞酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <400> 15 Glu Xaa Glu Val Xaa Ala Met Gly Val Ser Xaa Val Xaa Leu Ser Cys 1 5 10 15 Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Val Tyr 20 25 30 Trp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Thr Tyr Xaa Xaa Pro Xaa 35 40 45 Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Ser Xaa Tyr Xaa Asn Arg Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Phe Ser Leu Xaa Leu Xaa 65 70 75 80 Asn Val Thr Pro Gin Asp Xaa Gin Xaa Phe Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu 100 105 110 Xaa Val Ala Ala Asn Phe Ser Xaa Pro Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Thr Cys Xaa Ser Xaa Asn Gly 130 135 140 Tyr Pro Xaa Pro Asn Xaa Tyr Trp lie Asn Xaa Thr Asp Asn Ser Leu 145 150 155 160 Xaa Asp Xaa Ala Leu Gin Asn Xaa Thr Val Xaa Leu Asn Xaa Xaa Gly 165 170 175 Leu Tyr Asp Val Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1111111 1274058A7B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（115) 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Cys.Cys Xaa Glu Asn Val Xaa Leu Xaa Gin Asn Xaa Thr 195 200 205 Xaa Xaa Ser Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 225 230 235 240 Ala Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa·Xaa Xaa 工le Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 <210> 16 <211> 1294 <212> DNA <213> 人
> > > 0 12 2 2 2 2 2 2 V V V 5 'UTR (1) .. (199) <220> <221> CDS <222> (200) .. (1105) <400> 16 * gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgcccacg 60 cgtccgcggg agcgcagtta gagccgatct cccgcgcccc gaggttgctc ctctccgagg 120 tctcccgcgg cccaagttct ccgcgccccg aggtctccgc gccccgaggt ctccgcggcc 180 cgaggtctcc gcccgcacc atg egg ctg ggc agt cct gga ctg etc ttc ctg 232 Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu 15 10 etc ttc age age ett ega get gat act cag gag aag gaa gtc aga geg 280 Leu Phe Ser Ser Leu Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Val Arg Ala 15 20 25 atg gta ggc age gac gtg gag etc age tgc get tgc cct gaa gga age 328 Met Val Gly Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser 30 35 40 cgt ttt gat tta aat gat gtt tac gta tat tgg caa acc agt gag teg 376 Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser 45 50 55 aaa acc gtg gtg acc tac cac ate cca cag aac age tee ttg gaa aac 424 Lys Thr Val Val Thr Tyr His lie Pro Gin Ash Ser Ser Leu Glu Asn 60 65 70 75 gtg gac age ege tac egg aac.ega gee ctg atg tea ccg gee ggc atg 472 Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met 80 85 90-118- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝---- 11111111 1274058 A7 B7 五、發明說明（彳16) ctg egg ggc gac ttc tee ctg ege ttg ttc aac gtc acc ccc cag gac 520
Leu Arg Gly Asp Phe Set Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp 95 100 105 gag cag aag ttt cac tgc ctg gtg ttg age caa tee ctg gga ttc cag 568
Glu Gin Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin 110 115 120 gag gtt ttg age gtt gag gtt aca ctg cat gtg gca gca aac ttc age 616
Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser 125 130 135 gtg ccc gtc gtc age gee ccc cac age ccc tee cag gat gag etc acc 664
Val Pro Val Val Ser Ala Pro His Ser Pro Ser Gin Asp Glu Leu Thr 140 145 150 155 ttc aeg tgt aca tee ata aac ggc tac ccc agg ccc aac gtg tac tgg 712
Phe Thr Cys Thr Ser 工le Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp 160 165 170 * ate aat aag aeg gac aac age ctg ctg gac cag get ctg cag aat gac 760 工le Asn Lys Thr Asp Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp ..175 180 185 - acc gtc ttc ttg aac atg egg ggc ttg tat gac gtg gtc age gtg ctg 808
Thr Val Phe Leu Asn Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu 190 195 200 agg ate gca egg acc ccc age gtg aac att ggc tgc tgc ata gag aac 856
Arg 工le Ala Arg Thr Pro Ser Val Asn lie Gly Cys Cys lie Glu Asn 205 210 215 gtg ett ctg cag cag aac ctg act gtc ggc age cag aca gga aat gac 904
Val Leu Leu Gin Gin Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp 220 225 230 235 ate gga gag aga gac aag ate aca gag aat cca gtc agt acc ggc gag 952 工le Gly Glu Arg Asp Lys 工le Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu 240 245 250 aaa aac geg gee aeg tgg age ate ctg get gtc ctg tgc ctg ett gtg 1000
Lys Asn Ala Ala Thr Trp Ser lie Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val 255 260 265 gtc gtg geg gtg gee ata ggc tgg gtg tgc agg gac ega tgc etc caa 1048
Val Val Ala Val Ala lie Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin 270 275 280 cac age tat gca ggt gee tgg get gtg agt ccg gag aca gag etc act 1096
His Ser Tyr Ala Gly Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr 285 290 295 ggc cac gtt tgaccggagc tcaccgccca gagcgtggac agggcttccg 1145
Gly His Val 300 tgagacgcca ccgtgagagg ccaggtggca gettgageat ggactcccag actgcagggg 1205 agcacttggg gcagccccca gaaggaccac tgctggatcc cagggagaac ctgctggcgt 1265 tggctgtgat cctggaatga ggcccbttc 1294 119- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- %, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Γ o •e 5 SI 〇 r p r e s s i H o r p a 5 14 A 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 A7 B7 五、發明說明（117) <210> 17 <211> 302 ， <212〉 PRT <213〉人 <400> '17
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 1 5 10 . 15
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 20 25 30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 35 40 45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 50 55 60
Tyr His lie Pro Gin Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 65 "f 70 !' 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 85 90 95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 100 105 110
Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 115 120 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 130 135 140
Gin Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 155 160 lie Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp lie Asn Lys Thr Asp 165 170 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 180 185 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg lie Ala Arg Thr 195 200 205
Pro Ser Val Asn lie Gly Cys Cys lie Glu Asn Val Leu Leu Gin Gin 210 215 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin Thr Gly Asn Asp lie Gly Glu Arg Asp 225 230 235 240
Lys 工le Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 245 250 255
Trp Ser lie Leu Ala Val Leu Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 260 265 270 工le Gly Trp Val Cys Arg Asp Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 275 280 285
Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu Thr Glu Leu Thr Gly His Val 290 295 300 -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
ϋ mmKm ϋ 1 ϋ ϋ a ϋ ϋ ϋ I 1274058 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（118) <210> 18 <211〉 302 .. <212> PRT <213> 人 <400> 18 Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly 1 5
Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu 10 15
Arg Ala Asp Thr Gin Glu Lys 20 Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys 35
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gin 50 55 Tyr His lie Pro Gin Asn Ser 65 70
Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp 25 30 Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn 40 45 Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr 60 Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr 75 80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser 85
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val 100
Cys Leu Val Leu Ser Gin Ser 115 Glu Val Thr Leu His Val Ala 130 135 Ala Pro His Ser Pro Ser Gin 145 150 lie Asn Gly Tyr Pro Arg Pro 165
Asn Ser Leu Leu Asp Gin Ala 180
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val 195
Pro Ser Val Asn lie Gly Cys 210 215 Asn Leu Thr Val Gly Ser Gin 225 230 Lys lie Thr Glu Asn Pro Val 245
Trp Ser lie Leu Ala Val Leu 260 lie Gly Trp Val Cys Arg Asp 275 Ala Trp Ala Val Ser Pro Glu 290 295
Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe 90 95 Thr Pro Gin Asp Glu Gin Lys Phe His 105 110
Leu Gly Phe Gin Glu Val Leu Ser Val 120 125 Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser 140 Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser 155 160
Asn Val Tyr Trp lie Asn Lys Thr Asp 170 175
Leu Gin Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn 185 190 Val Ser Val Leu Arg lie Ala Arg Thr 200 205
Cys lie Glu Asn Val Leu Leu Gin Gin 220
Thr Gly Asn Asp lie Gly Glu Arg Asp 235 240
Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr 250 255
Cys Leu Leu Val Val Val Ala Val Ala 265 270 Arg Cys Leu Gin His Ser Tyr Ala Gly 280 285 Thr Glu Leu Thr Gly His Val 300 121 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) !274〇58 A7 --- B7 i、發明說明（119) <210> 19 <211> 322 <212> PRT <213> 鼠 <400> 19
Met Gin Leu Lys -Cys Pro Cys Phe Val Ser Leu Gly Thr Arg Gin Pro 1 5 10 15
Val Trp Lys Lys Leu His Val Ser Ser Gly Phe Phe Ser Gly Leu Gly 20 25 30
Leu Phe Leu Leu Leu Leu Ser Ser Leu Cys Ala Ala Ser Ala Glu Thr 35 40 45
Glu Val Gly Ala Met Val Gly Ser Asn Val Val Leu Ser Cys lie Asp 50 55 60
Pro His Arg Arg His Phe Asn Leu Ser Gly Leu Tyr Val Tyr Trp Gin 65 .70 75 80 工le Glu Asn Pro Glu Val Ser Val Thr Tyr Tyr Leu Pro Tyr Lys Ser .· 85 90 95
Pro Gly lie Asn Val Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Arg Gly His Leu Ser 100 105 110
Leu Asp Ser Met Lys Gin Gly Asn Phe Ser Leu Tyr Leu Lys Asn Val 115 120 125
Thr Pro Gin Asp Thr Gin Glu Phe Thr Cys Arg Val Phe Met Asn Thr 130 135 140
Ala Thr Glu Leu Val Lys 工le Leu Glu Glu Val Val Arg Leu Arg Val 145 150 155 160
Ala Ala Asn Phe Ser Thr Pro Val lie Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asn 165 170 175
Pro Gly Gin Glu Arg Thr Tyr Thr Cys Met Ser Lys Asn Gly Tyr Pro 180 185 190
Glu Pro Asn Leu Tyr Trp lie Asn Thr Thr Asp Asn Ser Leu lie Asp 195 200 205
Thr Ala Leu Gin Asn Asn Thr Val Tyr Leu Asn Lys Leu Gly Leu Tyr 210 215 220
Asp Val lie Ser Thr Leu Arg Leu Pro Trp Thr Ser Arg Gly Asp Val 225 230 235 240
Leu Cys Cys Val Glu Asn Val Ala Leu His Gin Asn lie Thr Ser lie 245 250 255
Ser Gin Ala Glu Ser Phe Thr Gly Asn Asn Thr Lys Asn Pro Gin Glu 260 265 270
Thr His Asn Asn Glu Leu Lys Val Leu Val Pro Val Leu Ala Val Leu 275 280 285
Ala Ala Ala Ala Phe Val Ser Phe lie lie Tyr Arg Arg Thr Arg Pro 290 295 300 -122- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ ϋ emme 一 δ，· μ·· _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1274058 A7 B7 五、發明說明（12〇)
His Arg Ser Tyr Thr Gly Pro Lys Thr Val Gin Leu Glu Leu Thr Asp 305 310 315 320
His Ala *
<210> 20 <211> 329 <212> PRT <213>合成序列 <220> <223>合成序列之説明：备成的寡核甞酸 <400> 20
Met Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Leu Xaa 20 25 30
Leu Phe Xaa. Leu Leu Xaa Ser Ser Leu Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 35 40 45
Glu Val Xaa Ala Met Val Gly Ser Xaa Val Xaa Leu Ser Cys Xaa Xaa 50 55 60
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Val Tyr Trp Gin 65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Thr Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Ser 85 . 90 95
Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Ser Xaa Tyr Xaa Asn Arg Xaa Xaa Xaa Ser 100 105 110
Xaa Xaa Xaa Met Xaa Xaa Gly Xaa Phe Ser Leu Xaa Leu Xaa Asn Val 115 120 125
Thr Pro Gin Asp Xaa Gin Xaa Phe Xaa Cys Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Val 145 150 155 160
Ala Ala Asn Phe Ser Xaa Pro Val Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 165 170 175
Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Thr Xaa Thr Cys Xaa Ser Xaa Asn Gly Tyr Pro 180 185 190
Xaa Pro Asn Xaa Tyr Trp lie Asn Xaa Thr Asp Asn Ser Leu Xaa Asp 195 200 205
Xaa Ala Leu Gin Asn Xaa Thr Val Xaa Leu Asn Xaa Xaa Gly Leu Tyr 210 215 220
Asp Val Xaa Ser Xaa Leu Arg Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240
Xaa Cys Cys Xaa Glu Asn Val Xaa Leu Xaa Gin Asn Xaa Thr Xaa Xaa 245 250 255 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） :-------------裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11111111 %, 1274058 A7 B7 五、發明說明（121)
Ser Gin Xaa Xaa Xaa Xaai Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa 260 · 265 270
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala -275 280 285
Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300
Arg Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Val Xaa 305 310 ·315 320
Xaa Glu Xaa Xaa Leu Thr Xaa His Xaa 325 <210> 21 <211〉 1370 <212> DNA <213> 人 <220> <221> 5'UTR 一 <222> (1) .. (165) <220>
<221> CDS <222> (166)..(762) <400> 21 aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctctaa tacgactcac 60 tatagggaaa gctggtacgc ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg 120 tccgtgaaca ctgaacgcga ggactgttaa ctgtttctgg *caaac atg aag tea ggc 177
Met Lys Ser Gly 1 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)
c emmmf I 1_ϋ 1 maKmmw 一 δ、I ϋ 1· ϋ ϋ ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 etc tgg tat ttc ttt etc ttc tgc ttg ege att aaa gtt tta aca gga 225 Leu 5 Trp Tyr Phe Phe Leu 10 Phe Cys Leu Arg lie 15 Lys Val Leu Thr Gly 20 gaa ate aat ggt tet gcc aat tat gag atg ttt ata ttt cac aac gga 273 Glu lie Asn Gly Ser 25 Ala Asn Tyr Glu Met 30 Phe lie Phe His Asn 35 Gly ggt gta caa att tta tgc aaa tat cct gac att gtc cag caa ttt aaa 321 Gly Val Gin lie 40 Leu Cys Lys Tyr Pro 45 Asp lie Val Gin Gin 50 Phe Lys atg cag ttg ctg aaa ggg ggg caa ata etc tgc gat etc act aag aca 369 Met Gin Leu 55 Leu Lys Gly Gly Gin 60 lie Leu Cys Asp Leu 65 Thr Lys Thr aaa gga agt gga aac aca gtg tcc att aag agt ctg aaa ttc tgc cat 417 Lys Gly 70 Ser Gly Asn Thr Val 75 Ser lie Lys Ser Leu 80 Lys Phe Cys His tet cag tta tcc aac aac agt gtc tet ttt ttt eta tac aac ttg gac 465 Ser 85 Gin Leu Ser Asn Asn 90 Ser Val Ser Phe Phe 95 Leu Tyr Asn Leu Asp 100 cat tet cat gcc aac tat tac ttc tgc aac eta tea att ttt gat cct 513 124- 尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐) 1274058 Δ7 ι\ί Β7 五、發明說明（122 )
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser lie Phe Asp Pro 105 110 115 cct cct ttt aaa gta act ett aca gga gga tat ttg cat att tat gaa 561
Pro Pro Phe Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His lie Tyr Glu - 120 125 130 tea caa ett tgt tgc cag ctg aag ttc tgg tta ccc ata gga tgt gca 609
Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Phe Trp Leu Pro lie Gly Cys Ala 135 140 145 gcc ttt gtt gta gtc tgc att ttg gga tgc’ ata ett att tgt tgg ett 657
Ala Phe Val Val Val Cys lie Leu Gly Cys lie Leu lie Cys Trp Leu 150 155 160 aca aaa aag aag tat tea tcc agt gtg cac gac cct aac ggt gaa tac 705
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 165 170 175 180 atg ttc atg aga gca gtg aac aca gcc aaa aaa tet aga etc aca gat 753
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp 185 190 195 gtg acc eta taatatggaa ctctggcacc caggcatgaa gcacgttggc 802
Val Thr Leu cagttttcct caacttgaag tgcaagattc tcttatttcc gggaccacgg agagtctgac 862 ttaactacat acatcttctg ctggtgtttt gttcaatctg gaagaatgac tgtatcagtc 922 aatggggatt ttaacagact gccttggtac tgccgagtcc tctcaaaaca aacaccctct 982 tgcaaccagc tttggagaaa gcccagctcc tgtgtgctca ctgggagtgg aatccctgtc 1042 tccacatctg ctcctagcag tgcatcagcc agtaaaacaa acacatttac aagaaaaatg 1102 ttttaaagat gccaggggta ctgaatctgc aaagcaaatg agcagccaag gaccagcatc 1162 tgtccgcatt tcactatcat actacctctt ctttctgtag ggatgagaat tcctctttta 1222 atcagtcaag ggagatgctt caaagctgga gctattttat ttctgagatg ttgatgtgaa 1282 ctgtacatta gtacatactc agtactctcc ttcaattgct gaaccccagt tgaccatttt 1342 accaagactt tagatgcttt cttgtgcc 1370 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
—i ϋ 1_| ϋ 一：0、· a^i ·1 11 i·— I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 22 <211> 199 <212> PRT <213> 人 <400> 22 Met Lys Ser 1 Val Leu Thr
Phe His Asn 35
Gin Gin Phe 50
Gly Leu Trp 5 Gly Glu lie 20 Gly Gly Val Lys Met Gin
Tyr Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg lie Lys 10 15
Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe lie 25 30
Gin lie Leu Cys Lys Tyr Pro Asp lie Val 40 45
Leu Leu Lys Gly Gly Gin lie Leu Cys Asp 55 60-125- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1274058 A7 B7 五、發明說明（123 )
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser 65 7Θ Lys Phe Cys His Ser Gin Leu 85 Tyr Asn Leu Asp His Ser His 100 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe 115 His 工le Tyr Glu Ser Gin Leu 130 135 工le Gly Cys Ala Ala Phe Val 145 150 工le Cys Trp Leu Thr Lys Lys 165 Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met ..180 Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195
Gly Asn Thr Val Ser lie Lys Ser Leu 75 80 Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 105 110 Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu 120 125 Cys Cys Gin Leu Lys Phe Trp Leu Pro 140 Val Val Cys lie Leu Gly Cys lie Leu 155 160 Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro 170 175 Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser 185 190 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 23 <211> 199 <212> PRT <213> 人 <400> 23 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr 1 5 Val Leu Thr Gly Glu 工le Asn 20 Phe His Asn Gly Gly Val Gin 35 Gin Gin Phe Lys Met Gin Leu 50 55 Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser 65 * 70 Lys Phe Cys His Ser Gin Leu 85 Tyr Asn Leu Asp His Ser His 100 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe 115 His lie Tyr Glu Ser Gin Leu 130 135 工le Gly Cys Ala Ala Phe Val
Phe Phe Leu Phe Cys Leu Arg lie Lys 10 15 Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met Phe lie 25 30 lie Leu Cys Lys Tyr Pro Asp lie Val 40 45 Leu Lys Gly Gly Gin lie Leu Cys Asp 60 Gly Asn Thr Val Ser lie Lys Ser Leu 75 80 Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 90 95 Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn Leu Ser 105 110 Lys Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu 120 125 Cys Cys Gin Leu Lys Phe Trp Leu Pro 140 Val Val Cys lie Leu Gly Cys lie Leu -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂--------- %- 1274058 A7 B7 五、發明說明（124 ) 145 150 155 160 工le Cys Trp Leu Thr Ly咨 Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro * 165 170 175
Asn Gl-y Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser 180 185 190
Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 <210> 24 <211> 200 , <212> PRT <213> 鼠 <400> 24
Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu lie Arg 1 5 10 15
Leu Leu Thr Gly Glu lie Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser 20 25 30
Phe His Asn Gly Gly Val Gin lie Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val 35 40 45
Gin Gin Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu 50 55 60
Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser lie Lys Asn Pro 65 70 75 80
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu 85 : 90 95
Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gin Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser 100 105 110 lie Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gin Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr 115 120 125
Leu His lie Tyr Glu Ser Gin Leu Cys Cys Gin Leu Lys Leu Trp Leu 130 135 140
Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys lie 145 150 155 160
Leu lie lie Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp 165 170 175
Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200
<210> 25 <211> 24 <212> DNA <213>合成序列 <220> -127- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -^1 ϋ ϋ 1 一-0’ ·ϋ ϋ ϋ ϋ —Mi n . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1274058 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（125) <223>合成序列之説明··合成的寡核甞酸 <400>25 accatgcgggc tgggcagtcc tgga 24
<2 1 0>26 <2 1 1>23 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明··合成的寡核甞酸 <400>26 tggtgaccta ccactccca cag 23
<2 1 0>27 <2 1 1>23 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核苷酸 <400>27 tccgatgtca tttcctgtct ggc 23
<2 1 0>28 <21 1>24 <2 12>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核:y：酸 -128- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Ρ裝------- —訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1274058 Δ7 Α7 Β7 五、發明說明（126) <400>28 gctctgtctc cggactcaca gccc 24 <2 1 0>29 <2 1 1 >28 <2 1 2>DNA <2 1 3>合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核嘗酸 <400>29 gtggcagcaa acttcagcgt gcccgtcg 28
<2 1 0>3 Ο <2 1 1>28 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220〉 <223>合成序列之説明··合成的寡核甞酸 <400>30 cccaacgtgt actggatcaa taagacgg 28
<2 1 0>31 <2 1 1>28 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223 >合成序列之説明：合成的寡核嘗酸 <400>3 1 gcgtgctgag gatcgcacgg acccccag 28 -129- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΗΓ衣
-ϋ ^^1 i^i ^^1 一口、I 11 B·^— 1···· 1_1 i^i ·11 —ai· I 1274058 Δ7 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（127) <2 1 0>32 <2 1 1>21 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核甞酸 <400>32 gcctctagaa agagctggga c 21 <2 1 0>33 <2 1 1>21 <2 12>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核苷酸 <400>33 cgccgtgttc catttatgag c 21 <2 1 0>34 <211> 1 8 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223〉合成序列之説明：合成的寡核苷酸 <400>34 gcatatttat gaatccca 18 <2 1 0>3 5 -130- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 裝 訂---------· 1274058 A7 B7 五、發明說明（128) <21 1>18 <2 1 2>DNA < 2 1 3 >合成序列 <220> <223>合成序列之説明：合成的寡核苷酸 <400>3 5 actattaggg tcatgcac (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -131 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

  1. 1274(^9101990號專利申請案 益 中文申請專利範圍替換本(95年1〇月）益 申請專利範圍 95： 11. 〇 7 修 4 ^ 1 · -種經純化的核酸分子，其包括選自以下組群之核答酸 序列： a)序列辨識號碼··丨丨或序列辨識號碼：6或序列辨識 號碼：1 6所列示的核苷酸序列； b )編碼如序列辨識號碼：6所列示自殘基丨_322或自殘 基47-322之多肽，或如序列辨識號碼：丨丨所列示自殘 基 1-288或自殘基 19-288、20-288、21-288、22-288、24- 288或28-288或如序列辨識號碼·· 16所列示自殘基^02 或自殘基 19-302、20_302、21-302、22-302、24-302或28- 3〇2之多肽的核甞酸序列； e)與（a)或（b)完全互補的核省:酸序列； d) —段（b)的核甞酸序列，其編碼至少大約25，5〇, 75 ’ 1〇〇或大於100個胺基酸殘基之多肽的核甞酸序列； 以及 e) 在嚴苛條件下能與之任一者雜交的核菩酸序 列。 2 ·根據申請專利範圍第1項之核酸分子，其中該核甞酸序列 係可操作地連接至一段表現控制序列。 3 · —種包含根據申請專利範圍第1項之核酸分子的宿主細 胞。 4 ·根據申請專利範圍第3項之宿主細胞，其為真核細胞。 5 .根據申請專利範圍第3項之宿主細胞，其為原核細胞。 6· —種生產多肽的方法，其包括在適當的培養基中培養根 據申請專利範圍第3項之宿主細胞並從培養基中分離出多 62545-951031.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1274058 1 — D8 六、申請專利範園 肽。 7 · —種藉由根據申請專利範圍第6項的方法所生產的 B7RP]多肽。 8. 種經純化的多肽分子，其包括選自以下組群之胺基酸 序列： a)序列辨識號碼：7或序列辨識號碼：1 2或序列辨識 號碼：1 7所列示的胺基酸序列； b )序列辨識號碼：7所列示之成熟的胺基酸序列，其 包括位於殘基4 7上的成熟胺基端；或序列辨識號碼： 1 2所列示之成熟的胺基酸序列，其包括位於殘基丨9、 20、21、22、24或28任一者上的成熟胺基端；或序列辨 識號碼：1 7所列示之成熟的胺基酸序列，其包括位於 殘基19、20、21、22、24或28任一者上的成熟胺基端； 以及 e )序列辨識號碼：7或序列辨識號碼：1 2或序列辨識 號碼：1 7所列示的胺基酸序列的片段，其包括至少大 約25、50、75、100或大於1〇〇個胺基酸殘基。 9· 一種能特疋與根據申請專利範圍第8項之多肽結合的抗 體。 10·根據申請專利範圍第9項的抗體，其為單株抗體。 11·根據申請專利範圍第9項的抗體，其為人的抗體。 12·根據申印專利範圍第9項的抗體，其為經人類化或經 融合的抗體。 13·根據申印專利範圍第9項的抗體，其會與或π州 62545-951031.doc •2·
    申請專利範 Ϊ274058 的細胞外部分結合。 其會抑制B7RP1與 14·根據申請專利範圍第9項的抗體 cnpi結合。 種包3根據申請專利範圍第8項的多肽的化學修飾的多 根據申清專利範圍第1 5項的多肽，其經水溶性聚合物 以共價方式修飾之。 17·包含根據申請專利範圍第8項的多肽與異源胺基酸序列 融合的融合多肽。 18·根據申請專利範圍第17項的融合多肽，其中該異源胺基 酸序列是一個IgG固定部分或其片段。 19. 一種用於治療、預防或改善τ細胞調節之醫藥組合物， 其包括根據申請專利範圍第8項的多肽。 2〇· —種診斷動物體内由T細胞調節之疾病或疑為T細胞所 調節之疾病的方法，其包括： a) 在活體外測定根據申請專利範圍第8項的多肽是否 存在或其表現量；以及 b) 根據多肽是否存在或其表現量診斷由τ細胞調節之 疾病或疑為T細胞所調節之疾病。 21· —種鑑認與多肽結合之試驗分子的方法，其包括： a)使根據申請專利範圍第8項的多肽與一種試驗分子 接觸；並且 b )測定多肽與該試驗分子結合的程度。 22·根據申請專利範圍第2 1項的方法，其尚包栝測定多肽 -3- 62545-951031.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A8 1274058 S D8 六、申請專利範圍 與該化合物結合時的活性。 23. —種用於調節T細胞在動物體内活化或增殖的醫藥組合 物，其包括申請專利範圍第1或2項的核酸分子。 24. —種用於抑制動物體内免疫反應的醫藥組合物，其包括 CRP- 1或B7RP- 1的拮抗物。 25. 根據申請專利範圍第24項的醫藥組合物，其中該拮抗物 是一種與B7RP-1結合的抗體。 62545-951031.doc -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1274058 第089101990號專利申請案 中文圖式替換頁(95年10月）
    I I未添加 ， CRPI-Fc B加· Hi B7.2-FC 未添加 0.33 Con A (μ〇/πΊΐ) 1274058 ία 31倏I年月 第089101990號專利申請案 中文圖式替換頁(95年10月）
    第1，2組/對照 組(n=8) 第 3,4 组/B7RP-1-FC (n=8)-8毫克/公斤 2000.00 π 1800.00 - 1600.00 - 1400.00 1200.00 i 〇〇〇.〇〇」 800.00 600.00 - 400.00 - 200.00 -0.00 5 10 15 20 25 腫瘤植入後的天數 30
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