TW589380B - A method for enriching rare cells by using density gradient and negative selection - Google Patents

A method for enriching rare cells by using density gradient and negative selection Download PDF

Info

Publication number
TW589380B
TW589380B TW086104288A TW86104288A TW589380B TW 589380 B TW589380 B TW 589380B TW 086104288 A TW086104288 A TW 086104288A TW 86104288 A TW86104288 A TW 86104288A TW 589380 B TW589380 B TW 589380B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
fluid
cancer cells
density
patent application
Prior art date
Application number
TW086104288A
Other languages
English (en)
Inventor
O Paul O P Ts
Zheng-Pin Wang
Stephen A Lesko
William G Nelson
Alan W Partin
Original Assignee
Univ Johns Hopkins
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Johns Hopkins filed Critical Univ Johns Hopkins
Application granted granted Critical
Publication of TW589380B publication Critical patent/TW589380B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

589380 A7 B7 五、發明説明（/ ) 增濃稀少细胞的方法 此申請案請求於1996年4月5日申請之U.S·臨時專利申 請案序號60/014,929的利益，其整個併於此供作參考。 發明技術領域 本發明係關於增濃在含有稀少细胞及非稀少细胞之混 合物中之稀少细胞的方法，特別是關於自體液如血液增濃 稀少之非血球细胞如癌细胞的方法。 / 發明背景 過去數年對增濃稀少细胞（如作為後績之簞離及描述特 徼用）有益增之興趣。此部份歸因於認知稀少细胞如癌细胞 可提供有用於各種醫療狀況之診斷及/或治療的資訊。 期望增濃癌细胞部份係奠基於知曉大多數癌死亡係因 腫瘤轉移而發生。因此，周圍血液中癌细胞之存在為癌細 胞擴散之指標，而增濃如此癌细胞便具有大的診斷利益。 此需要於***癌特別迫切，其中如此癌類之約三分之二 在診斷時為臨床上局部化的，但僅此等之約一半經證實在 手術時局限於***。因此，當癌首次被確認時將近三分 之一至二分之一已擴散超過***，若有準確、高度靈敏 之增濃方法，則癌可在較早期測得。 許多關於***癌之早期偵測集中於血清***專一 性抗原（PSA)之有效性。然而，PS A為器官專一性而非癌專 一性，且由正常、良性及惡性***上皮產生。结果作為 ***癌篩檢之PSA的陽性預測值通常少於503!。 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 請 先‘ 閱 讀 背. Sr 之 注 意 事 項 再，
頁 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（i ) 此外，周圍血液中癌细胞之最大含量估計為107白血 球中有 2個。Filder， Cancer Res., 50, 6130 (1990)。因 此，雖然研究建議***癌细胞於患有惡化疾病之人的血 液中循環，但卻難Μ偵測此等少數循環之癌细胞。 分離及偵測癌细胞之方法包括如使用免疫磁珠及聚合 酶鏈反應（如 Hardingham等人，Cancer Res·, 53，3455 (1993))，使用密度梯度凝膠（如美國專利案4,255,256)或 使用密度梯度離心，接著進行免疫分離Μ結合癌细胞（如 Griwatz等人，J. Immuno. Methods·, 183， 251-265(1995)) 〇 通常此等方法因缺乏在血液樣本中分離少數癌细胞之 有效性及靈敏度而無法令人滿意。此外，此等方法可提供 低細胞回收，因為高度脆弱之癌细胞在分離過程中可被損 害及/或較黏之癌细胞在分離過程中可變為不適當地被结合 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 例如，習知方法利用”正向選擇”，其中稀少细胞與结 合劑如抗體結合，结合之稀少细胞自非稀少细胞中分離出 。之後，稀少细胞藉由熱或其他適當手段自抗體分離出， 其可損害或破壞稀少细胞，使其難W偵測及/或培養。此外 ，或另一替代方案，某些方法涉及藉由離心濃縮癌细胞。 然而，因為某些癌细胞為脆弱及/或傾向於黏附於其接觸之 表面，所Μ此等方法亦可損害或破壞稀少綑胞，其如上所 述為不被期望的。再者，某些方法使分離過程中细胞”固定 - 4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（ 化”，因此使彼等不適用於培養或PCR分析。 鑑於上述，需要有效率、高度靈敏且高再現性之方法 K自细胞群體中增濃稀少细胞。亦需要可減少對脆弱且/或 黏性之彼等稀少细胞的損傷至最小程度之方法。 本發明可至少改善先前技藝中之一些缺點。本發明 之此等與其他儍點顯見於下述說明。 發明概述 本發明提供增濃在包含稀少细胞（較佳為非血球细胞） 與非稀少细胞之流體中之稀少细胞之方法。方法之具體例 包含（a)使包含稀少细胞與非稀少綑胞之流體進行密度梯度 分離而產生包含濃度增加之稀少细胞的流體；（b)使含濃度 增加之稀少细胞的流體接觸結合非稀少细胞之劑•，及（c)自 流體去除结合之非稀少细胞Μ於流體中增濃稀少细胞。 方法之另一具體例包含（a)使流體進行密度梯度分離而
訂 加至 MM 度流 濃二 含第 包該 及與 體體 流流 1 -第第 的該 胞使 细 2 少·， 稀體 之流 加二 增第 度的 濃胞 含细 包少 生稀 產之 流二 第 或 / 及1 第 自 \—/ C /(\ 及 劑 之 胞 细 少 稀 非 合 结 觸 接1 之 少
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 胞 细 少 稀 濃 增 中 體启 浐除 Λ、、 Ρ 胞 细 少 稀 bh rns 之及 合 一 结第 除自 去在 豊 ，鬅 ， 體 流 二 第 或 後 胞 细 少 稀 τπν 之 常 通 併 合 如 例 ο 胞 细 少 稀 理 處 步 ο 1 體進 流供 二 提 第亦 與例 一 體 第具 之之 胞 明 细發 少本 稀 含 胞 细 癌 養 培 或 包性 於一 ， 專 用之 明上 說或 作/ 彳及 ο 中 胞 细 癌 及 測 認偵5-確可_ 被 ， 可中 丨例 體 具 D些 ($某 胞之 细認 少確 稀含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（斗） 抗原。此外，或另一替代方案，可偵測專一性核酸之表現 且視需要可偵測染色體改變（如非整倍體的）。於一具體例 中*確認草案包括組合染色（包含免疫細胞化學染色）及螢 光原位雜交（FISH)。發明之具體例亦提供病患之癌診斷、 發生及監控之改良方法。 本發明又提供適用作癌细胞，特別是***癌细胞之 探針的特定核酸序列。本發明又提供包含由各種方法單離 之稀少细胞的組成物。 圖式簡單說明 圖1槪要地說明流體樣本（如血液）離心前（左側）及後（右側 )之密度梯度管柱。離心後形成四區：血漿I、介面I、梯度 I及粒I。合併介面I與梯度IM提供包括濃度增加之稀少细 胞的第一流體，Μ下稱為收集I流體。可合併血漿I與粒I及 離心形成含有四區之另一管柱。 圖2 Α及2 Β概要地說明在單一密度梯度管柱（圖2Α)或雙 密度梯度管柱（圖2B)上離心合併之血漿I與粒I。彼等略圖 說明離心前（左側）及後（右側）之管柱。離心後形成四區·•血 漿II、介面II、梯度II及粒II。合併介面II與梯度II K提 供包括濃度增加之稀少细胞的第二流體，Μ下稱為收集Π 流體。 圖3槪要地描逑本發明另一具體例，其中可利用雙密度 梯度管柱Μ在離心後形成六區。圖3左側說明雙密度梯度管 柱及離心前之流體樣本（如血液），而右側說明離心後之管 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再_寫本頁) 、1Τ
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 I 3 9 8 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（< ) 柱。離心後形成六區：血漿、介面I、梯度I、介面II、梯度 II及粒。合併介面I與梯度IK形成收集I流體，並合併介面 II與梯度II形成收集II流體。收集I及II流體各含有濃度增 加之稀少细胞。 圖4概要地描述本發明負向選擇法之具體例。收集II流 體與一或多個非稀少细胞之第一抗體如對白血球及/或紅血 球抗原專一之抗體一起培育。含有第一抗體之收集II流體再 與結合至載體如磁珠之第二抗體一同培育。第一抗體结合 至非稀少细胞，而第二抗體（結合至珠）結合至第一抗體。 據此，自流體去除珠提供富含稀少细胞之流體，Μ下稱為 收集III流體。 圖5概要地描逑可合併收集I及III流體，其各包含稀少 细胞。視需要，可使用稀少细胞於细胞培養及/或玻片製 備。 較佳具體例之詳细說明 本發明提供增濃包含稀少與非稀少细胞之流體中的稀 少细胞之靈敏、經濟且可再琨之方法。根據本發明，在產 生至少一包含濃度增加之稀少细胞的流體前使包含稀少與 非稀少细胞之流體進行密度梯度分離。包含濃度增加之稀 少细胞的流體進行”負向選擇法”，其包含使流體與结合非 稀少细胞之劑接觸。隨後结合之非稀少细胞自流體中分離 出，提供富含稀少细胞之流體。稀少细胞可進一步處理以 如確認、特徵化及/或培養细胞。例如，稀少细胞可被確認 w» 7 秦
訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2l〇x297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（b ) 及特徵化Μ偵測一或多種癌類型。本發明之具體例可用於 在治療期間或之後監控癌惡化或退化，而特別有效用於監 控人類之***癌。 在一具體例中，在產生包含濃度增加之稀少细胞的第 一流體及包含濃度增加之稀少细胞的第二流體前使包含稀 少與非稀少细胞之流體進行密度梯度分離。使此第一流體 及/或第二流體進行負向選擇法，其包含使流體與結合非稀 少细胞之劑接觸。隨後自流體分離出結合之非稀少细胞， 提供富含稀少细胞之流體。 此外，因可進行如本發明方法之具體例且減低對彼等 脆弱及/或黏性稀少细胞之應力至最小程度，可回收基本上 未受損之稀少細胞。當回收之活稀少细胞具有各種用途，
訂 望 期 被 別 特 此 時 究 研 之 養 培 胞 细 或 / 及 胞 细 整 完 於 用 如 再 與 輕使 如 t (Jfct 本因 樣 ， 同式 相形 之同 理不 處 呈 同可 不胞 受细 接少 將稀 使的 例ΙΦ 體丨 具 之 法 方 , 重 者， 胞 细 少 稀 部 全 上 質 實 bh Ήτν 若 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 稀 HP 包 ΤΓΤΝ ^5 低 细 降少 時稀 同 非 , 及 收胞 回。細 被在少 可存稀 胞的含 细中包 少體濃 I»流增 丨之供 胞提 细例 少體 稀具 含之 富 明 於發 份胞本 部细 大少 J2 ^ ^ ^ ㈣*肖 I度濃 f 83纟 £行使 (aJiic) 含本 .， 包樣體 , 體流 法流的 方使胞 胞 ·，少 细本稀 少樣之 稀之加 的胞增 中细度 本少濃 樣稀含 體非生 流及產 之胞而 體佳 流較 自 ο d)體 ;(流 劑之 合胞 结细 之少 胞稀 细含 少富 稀供 非提 合K 結胞 觸细 接少 體稀 流非 的之 胞 合 细結 少除 稀去
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（Ί ，稀少细胞為 细胞，亦即白 在本發明 稀少細胞之流 细胞對非稀少 得包含稀少非 樣本進行密度 胞的第一流體 體（II) ; (C)使 觸結合非稀少 癌细胞。某些具體例中，非稀少细胞包含血 血球（白细胞）及/或紅血球（紅細胞）。 之一具體例中，增濃包含稀少非血细胞及非 體樣本中稀少非細胞之方法，其中稀少非血 細胞之比例為至少約1 : 10 0，0 0 0，包含（a)取 血细胞與非稀少细胞之流體樣本；（b)使流體 梯度分離而產生包含濃度增加之稀少非血细 (I)及包含濃度增加之稀少非血细胞的第二流 該第一流體（I)及該第二流體（II)至少之一接 細胞之结合劑；（d )自第一流體（I)及/或第二
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 胞。 取體细非提 之 胞 细a)血a)流血合 Μ 胞一细 血II稀非^(使.非结胞 细 ώ 癌 非 — 非少 3 b 少觸细 癌吏度 少^及稀包/稀接少中¥密 稀 4 胞中 ο 本之胞稀 本 含 I 细其00樣加细非 樣 L 第 富 Μ 血 ，0,體增血之 液i之 供 W 非法10流度非合 血一俠加 提ffll少方1:之濃少结 濃 ^ 增 稀之約胞含稀除 增 度 胞 Μ 含胞少细包之去 供1濃 细 W 包细至少生加體。提ffl含9-少 Μ 濃非為稀產增·流體例Is包 ~ 稀 Μ 增少例非而度自流體^生 非 U , 稀比與離濃d)之具S產 之¾¾中中之胞分含;(胞 一 # 而 合 5 例本胞细度包劑细另 Μ 離 結及體樣细血梯使合血之 }分 除a)具體少非度(c)結非明 U 度 去(I一流稀少密;(之少發含梯 I)體另之非稀行體胞稀本包度 (I流在胞對含進流细含如，密 體一 细胞包本的少富 法行 流第 少细得樣胞稀供 方進
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（/ ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的第一流體及包含濃度增加之第二密度癌细胞的第二流 體，其中第二密度大於第一密度；（C)使該第一流體接觸结 合白血球及/或紅血球之结合劑；（d)自第二流體去除结合之 白及/或紅血球Μ提供富含較大密度癌细胞之第二流體。一 些具體例中，使濃度增加之第二密度癌细胞的第二流體接 觭结合白血球及紅血球之结合劑，而自流體去除结合之 血细胞，亦即白及紅血球。於一較佳具體例中，含不同密 度之癌细胞為***癌细胞。 任一含稀少及非稀少细胞之流體可根據本發明處理。 本發明之具體例適用於增濃流體中稀少细胞，其中流體中 稀少细胞與非稀少细胞之比例至少為約1 : 1 0，ϋ ϋ 0，及特別 適用於增濃流體中之稀少细胞，其中流體中稀少妞胞與非 稀少细胞之比例為至少約1 : 1 G 0 , Q 0 Q。根據本發明，相較於 原樣本中稀少细胞與非稀少细胞之比例，稀少細胞之濃度 可增加至少約1 0倍，較佳增加至少約1 0 0倍，及在一些具體 例中，增加至少約5 0 0倍。 本發明，特別是對於欲增濃之稀少细胞為癌細胞之彼 等特定具體例，能自流體提供較高含量之癌细胞回收。例 如，回收高至70%或更高，Μ血液樣本中之癌細胞數目為基 準。此外，一些具體例提供足夠之高靈敏度以偵測出至少 1.5癌细胞/毫升血液（如自20毫升血液樣本）。 本發明之方法為驚人且意外的，因其可利用”負向選擇 ”，亦即結合非稀少细胞而提供上述優點，該程序正好與習 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請· 先 閱 讀 背 面 之 注 i
訂 8( 3 9 8 5 A7 B7 五、發明説明（1 ) 知方法相反*其利用”正向選擇”，亦即結合稀少细胞。 可根據本發明處理之流體例包括體液，如血液、尿液 、唾液、淋巴液、脊髓液、***、羊水、腔液及組織萃取 物。 可根據本發明增濃之稀少細胞包括各種欲治療或診斷 之细胞，包括但不限於癌细胞。於該等欲處理之流體包含 體液之具體例中，稀少细胞為身體中所存在或產生且通常 不存在於體液中之细胞。例如，流體中之稀少细胞可為癌 细胞，而非稀少细胞可為非癌细胞。在一具體例中，稀少 细胞為稀少非血细胞，如***癌细胞。 當然，癌细胞可包含來自多種不同癌之任一的细胞， 包括但不限於彼等上皮源者。癌一詞應進一步理解為涵蓋 局部化之癌（如局限於腫瘤）W及非局部化之癌。特別地， 包括膀胱癌、腦癌、乳癌、结腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、 卵巢癌、胰癌、***癌、直腸癌及胃癌，只要為肉瘤形 式之腫瘤（如纖維肉瘤或横紋肌肉瘤）、淋巴或骨髄糸之造 血腫瘤或另一腫瘤，包括但不限於黑瘤、崎胎癌、神經母 细胞瘤或神經膠瘤。 根據本發明，在進行負向選擇前使包含稀少與非稀少 细胞之流體進行密度梯度分離。此為有利的，特別是對於 彼等稀少细胞為癌細胞之具體例，因為通常（使用體液如血 液）大部份之癌细胞的密度小於其他循環血细胞如有核之白 血球，因如此之癌细胞較大，因而每單位質量較輕於其 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再魂寫本頁)
、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（β) 他血细胞。然而，據聞某些癌细胞本質上為非均質，而特 定種類之癌细胞密度可類似有核之白血球者。據此，如下 述之更詳细說明所述，本發明之特定具體例包括進行密度 梯度分離至少二次及/或使用一或多重密度梯度管柱（亦即 具二或多個密度梯度之管柱）M進一步改善增濃方法之效率 0 密度梯度分離 通常，密度梯度分離法包含製備一或多個梯度介質層 ，其中梯度介質之一或多個密度應高於待分離之稀少细胞 之密度。典型地，包含稀少细胞與非稀少细胞之流體置於 梯度介質上層（或最上層梯度介質），將介質與流體離心直 至流體成份根據彼等各別成份密度彼此分離。 例如*使用圖1作為參考及使用體液如血液作為包含稀 少细胞與非稀少细胞之說明性流體，離心管之内容物在離 心後可呈琨如下：血漿層（血漿I)、介面層（介面I)、密度梯 度層（梯度I)與存在於管底部之细胞粒（粒I)。介面層兩側 有血漿層於一側及密度梯度層於另一側。 K較輕與較重形式二者存在之稀少细胞（如某些癌细胞 如***癌细胞）將存在於介面層、相鄰密度梯度層及细胞 粒中。典型地，較輕癌细胞位於介面層及梯度層，而相對 較重癌細胞與白及紅血球一起位於綑胞粒中。 根據本發明之具體例，可製得包含濃度增加之”較輕” 稀少细胞的第一流體懸浮液及包含濃度增加之”較重”稀少 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (説先閲讀背面之注意事項 丨 舄本頁
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（丨\ ) 细胞的第二流體懸浮液。此為有利的，因具不同特性之稀 少綑胞可根據本發明作不同的處理Μ改善稀少细胞回收及 減少非稀少细胞之存在，同時降低對較脆弱之稀少细胞的 應力至最小程度。作為說明用，包含濃度增加之較重稀少 细胞的懸浮液可暴露於结合非稀少细胞之劑*而结合之非 稀少细胞可被去除。然而，包含濃度增加之較輕稀少细胞 (其可能較大、較脆弱及/或較黏）不需暴露至結合劑。 例如，再次使用圖1作為參考，包含濃度增加之較輕稀 少细胞的第一流體懸浮液可藉由去除介面層（介面I)與較佳 ，鄰接介面層之密度梯度層（梯度I)的部份，及將介面層與 梯度層置於另一管中而製得。在去除梯度層時應小心而不 干擾細胞粒（粒I)。典型地，去除約2/3之鄰接梯度層。 之後，新管中之细胞Κ適當稀釋劑如磷酸鹽緩衝之鹽 水（PBS)溫和地清洗，再輕輕地離心（如在約200 X g之力量 離心）。由此處理取得之细胞粒再懸浮於溶液中Μ形成包含 濃度增加之稀少细胞的第一流體，Μ圖1與5中之”收集I”流 體說明。用於形成收集I流體之適當溶液包括例如，白蛋白 溶液如1重量％牛血清白蛋白溶液。較輕癌细胞佔多數之所 得细胞懸浮液（收集I流體），可用於各種目的，如细胞確認 及/或培養，於此將作更詳细的討論。視需要，可使此流體 進行負向選擇法Κ结合流體所含之非稀少细胞，而結合之 细胞可被去除Κ產生富含稀少细胞之流體。 若稀少细胞如癌细胞，其較重或其包含較輕及重之细 -1 3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 請 先’ 閲 讀 背 面 之 注
訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 __B7 五、發明説明（α) 胞時，包含濃度增加之稀少细胞（亦即較重癌细胞）的第二 流體懸浮液可被製備。例如，使用圖1、2 A與2 B作為參考， 未在增濃較輕细胞時使用之血漿層（圖1中之血漿I)及细胞 粒（圖1中之粒I)被去除及併於新管中，如圖2A與2B左側所 圖解。血漿與细胞粒之此合併物包括較重癌细胞Μ及紅與 白血球。接著，使此合併物進行密度梯度分離法。於某些 具體例中，在使此合併物進行密度梯度分離法前，合併物 之密度調至對應約原流體樣本者。例如，於彼等原樣本包 含血液之具體例中*合併物之密度可藉由添加血漿調整。 分離法使離心管之内容物可如前圼現四層。例如，圖 2 Α與2 Β之右側圖解血漿層（血漿II);含有癌细胞Μ及一些白 血球與紅血球之介面層（II)，密度梯度層（梯度II)及底部 之细胞粒（粒II)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 介面層（介面II)及較佳鄰接介面層之密度梯度層（梯度 II)的部份被去除及置於新管中。之後，新管中之细胞Μ適 當稀釋劑如磷酸鹽媛衝之鹽水（PBS)溫和地请洗，典型地， 再輕輕地離心。得自此處理之细胞粒再懸浮於溶液中Μ形 成包含濃度增加之稀少细晦（W及一些白血球及紅血球）的 第二流體，Μ圖2Α、2Β右側與圖4左側之”收集II”流體說 明。用於形成收集II流體之適當溶液包括白蛋白溶液如1重 量牛血清白蛋白溶液。通常使所得细胞懸浮液（收集II流 體進行負向選擇法，於下文”負向選擇法”一節作更詳细之 說明。 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0、〆297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（Λ ) 於另一具體例中，例如圖3所圖解，可利用多重密度梯 度管柱Μ提供多個介面與梯度層，而適當層可被合併及處 理Μ提供一或多個含有濃度增加之稀少细胞的流體。
例如，可利用圖3所圖解之梯度管柱具體例提供收集 I流體及收集II流體*其中各流體含濃度增加之稀少细胞 。作為說明用，體液如血液可置於梯度管柱之上層*其中 梯度密度上層（梯度I)之密度小於下層（梯度II)者。離心後 ，管之内容物可呈現如下：血漿層（血漿）、第一介面層（介 面I)、第一密度梯度層（梯度I)、第二介面層（梯度II)、第 二密度梯度層（梯度II)及存在於管底部之细胞粒（粒）。 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 典型地，一些較輕稀少細胞會位於介面I及梯度I層， 而一些較重稀少细胞會位於介面II及梯度II層。在一具體 例中（再次使用圖3作為參考），合併介面I及梯度I層Μ提供 收集I流體，而合併介面II及梯度II層以提供收集II流體。 視需要*可使用稀釋劑及/或懸浮液可如上所述形成。可使 收集I流體及/或收集II流體進行負向選擇法Μ结合流體所 含之非稀少细胞及可去除結合之细胞Μ產生富含稀少细胞 之流體。 各種用於進行密度梯度分離之密度梯度介質及草案適用 於進行本發明。因此，可便用單一及/或多重密度管柱，及 可使用介質密度之任一適當組合。當然，根據本發明之密度 梯度分離亦可使用連鑛及/或非連鑛梯度進行。可使用不同 介質及草案，視待處理之之流體及所欲细胞而定。可進行密 一15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ〗297公釐） 589380 A7 B7
五、發明説明（A 度梯度分離任一次數Μ提供一或多個含濃度增加之稀少细 胞的流體。一或多個梯度介質亦可包括一或多個添加劑Μ例 如提供所要密度或黏度。另一替代方案或此外，添加劑可在 密度分離期間使例如非稀少细胞凝集成塊或聚集。
於一些具體例中，例如用於分離較緻密之稀少细胞如 緻密***癌细胞，FICOLL 400 為較佳之介質。通常介質 與溶液中較高密度與較低黏度之化合物如谷硫磷納（sodiuifl id e t r i ζ 〇 a t e)與泛影酸納（s 〇 d i u in d i a t r i ζ 〇 a t e)併用。 訂
實例及一些流體包含血液之具體例中，可使用含细胞聚 集或凝集成塊劑如甲基纖維素、IS0PAQUE 、1,6-聚葡萄 糖及 FIC0LL 。Bhat, N · Μ · J · I mniiino . Me t h ·, 158,277-280(1993)。ISOPAQUE 為 N-甲基-3,5-二乙醯胺基 -2，4 , 6 -三碘苯甲酸納。F I C 0 L L (Accurate Chemical and S c i e n t i f i c C o r p o r a t i ο n，W e s t b u r y N e w Y o r k)為蔗糖與環 氧氯丙烷共聚合製得之合成高分子。此等劑造成紅血球凝集 成塊*因而可被用Μ自紅血球分離出白血球。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PERC0LL (可得自Pharmacia)密度梯度亦可適用於本發 明之目的。PERC0LL 為經膠體聚乙烯吡咯啶酮塗佈之矽石 ，pH在2 0G C下為8· 9土 0. 3，密度1 . 13土 0 · 0 0 5克/毫升及黏 度在20G C下為10土 5cps。 下段揭述使用PERC0LL.取得任一適當密度之密度梯 度介質。應了解其他介質及製備草案亦可適用，且可為業界 一般技藝人士輕易決定。PERC0LL 之儲液（stock -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589380 A7 _B7_ 五、發明説明（/ )
solution)藉由合併下列成份而製得：90毫升PERC0LL ，9毫 升10 X Hank’s平衡鹽溶液（HBSS不含鈣、鎂及酚紅），1毫 升HEPES媛衝液（PH7.3)及0.4毫升1M HC1。所得溶液之pH為 7.4。具有各種說明用密度之介質可如下取得。密度1.07 0克 /毫升之介質可藉由混合24體積PERC0LL 儲料溶液及20體積 1 X HBSS而取得。密度1. 07 9克/毫升之介質可藉由混合27體 積PERC0LL 儲料溶液及15. 9體積1 X HBSS而取得。密度 1 . 0 88克/毫升之介質可藉由混合23體積卩£1{(；〇1^ 儲料溶液 及10體積1 X HBSS而取得。 訂 在將包含稀少细胞與非稀少细胞之流體置於密度梯度管 柱前K適當稀釋劑稀釋較有利，特別是彼等流體包含血液之 具體例。可使用任一業界一般技藝人士已知之適當稀釋劑 。如此稀釋劑例包括緩衝液如生理媛衝液如T r i s媛衝液、磷 酸鹽媛衝液、擰檬酸鹽媛衝液及磷酸鹽緩衝之食鹽水（PBS) 及鹽溶液如市售平衡之食鹽溶液如Hanks平衡食鹽溶液（HBS S)、Earl ’s平衡食鹽溶液、Gey’s平衡食鹽溶液等。PBS為稀 釋血液較佳之稀釋劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 流體可W上述稀釋劑_釋至任一所要比例。然而，通常 於彼等流體為血液樣本之具體例中，以體積比約〇 · 1至約 10 (血液：稀釋劑），較佳Μ體積比約〇_ 5至約5(血液：體積 比）及較佳Μ約1至約2 (血液：體積比）稀釋。 流體樣本置於管柱上後，將管柱與樣本離心。離心一 般於任一適當離心機中及在適當力量下進行一適當時間長 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0 Χ297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（、b ) 度，Μ使較輕之稀少细胞自較重之非稀少细胞與其他物質 中分離出。一些具體例中，離心力通常在約3 0 0 X g至約 6 0 0 X g，較佳約3 5 0 x g至約4 5 0 x g之力量範圍内。當然， 在其他具體例中，離心機可在高於或低於上述之力量下操 作。 離心可^行任一時間長度。一些具體例中，離心進行 約1分鐘至約60分鐘*較優約10分鐘至約50分鐘，及較佳約 20分鐘至約40分鐘。血液為欲處理之流體的情況下，離心 較佳在約4 0 0 x g之力量下進行約30分鐘。 雖然彼等熟諸此藝者能在增濃血液中***癌细胞之 特定情形下決定適當密度，梯度介質（凝膠）應具密度不少 於約1. 0 6克/毫升，更佳不少於約1.0 6 8克/毫升。在涉及前 列腺癌细胞及利用雙密度梯度之一具體例中，雙梯度應包 括密度範圍約1 · 06克/毫升至約1 · 10克/毫升之各層，K約 1.0 77克/毫升至約1.0 8 3克/毫升較佳。 本發明方法之具體例包含可於流體如血液中循環之許 多類型癌细胞之增濃。例如，如下逑，培養來自傳統肝细 胞瘤G2细胞株之细胞並Μ已知數目置入正常人類血液中。 此等樣本於各種密度梯度中離心。已發現密度1.0 68克/¾ 升之密度梯度為梯度層，自其回收80 %所加之肝细胞瘤细胞 。肝细胞瘤细胞亦發現為非常黏稠與脆弱。咸信此等肝细 胞瘤细胞具有類似***癌细胞LN Cap细胞株之密度。 負向選擇法 - 1 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 _B7_ 五、發明説明（Λ ) 如上逑，負向選擇法包括使包含稀少细胞與非稀少细 胞之流體接觸結合非稀少细胞之劑，而自流體去除结合之 非稀少细胞。去除所结合之非稀少细胞提供富含稀少细胞 之流體。 例如*如上述任一具體例所述之收集II流體可包含較 重之稀少细胞以及一些可具有類似密度之非稀少细胞（如一 些白血球及紅血球）。據此，可使收集11流體與结合此等非 稀少细胞之劑接觸。去除所結合之非稀少细胞提供富含稀 少細胞之流體，K圖5中”收集III”流體表示。 根據本發明之具體例，結合非稀少细胞之劑典型包含 一或多個抗體，較佳為專一性结合至非稀少細胞之單株抗 體。各種抗體適用於進行本發明，且彼等可衍生自任一適 當來源。例如*於一些具體例中，如其中含稀少细胞與非 稀少细胞之流體包括血细胞者，適當之結合劑包括專一 性结合至一或多個白血球表面抗原及/或紅血球表面抗原之 抗體。另一替代方案或另外，結合劑可包含例如抗人類抗 體，如其專一性结合至人類正常白血球及/或人類紅血球者 0 負向選擇法涵蓋”直接“與”非直接”草案二者。例如， 直接負向選擇法之一例包括使用结合至撐體之抗體，其中 抗體結合至非稀少细胞。非直接負向選擇法之例包括使用 ”第一 ”抗體结合至非稀少细胞及”第二”抗體（其结合至撐體 )結合至”第一 ”抗體。較佳，第一與第二抗體來自不同種動 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 _B7_ 五、發明説明（d ) 物。許多第一與第二抗體均適用且可自市面取得。
使用撐體（例如粒子如珠，更佳為微珠）較佳，因其使 抗體-非稀少细胞结合或第二抗體-第一抗體-非稀少细胞结 合更易自流體去除。業界熟知之微珠可製自任一適當材料 ，包括塑膠及磁性材料，Μ磁性微株較佳，超順磁微珠更 佳。多種適當撐體，特別是粒子如微珠（含或不含所結合之 抗體）可自市面上取得。任一能夠自流體去除撐體（如粒子 )為業界一般技藝人士所知之分離方法與糸統可被利用。 訂 於直接負向選擇法之具體例中，包含濃度增加之稀少 细胞包含濃度增加之稀少細胞的流體（如收集II流體）與结 合至撐體粒子之抗人類抗體混合物接觸。所產生之流體再 於適當溫度下培育適當時間Μ達到抗體實質上完全结合至 非稀少细胞。培育溫度與時間會改變，但培育較佳在低於 周溫之溫度，更佳在約4Q C下進行約5分鐘至60分鐘，較佳 約10分鐘至約50分鐘。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 培育時，抗體/撐體粒子與細胞較佳如藉由使用適當 混合或搖晃裝置溫和地混合。已有非稀少细胞結合至抗體 之撐體粒子/抗體如業界已知者自流體分離出。作為說明用 ，撐體粒子為順磁性微珠之一些具體例中*分離可使用磁 性粒子濃縮器進行。適當濃縮器可自市面上取得，如 Dynal,Inc.(Lake Success, N.Y.)〇 於非直接負向選擇法之一具體例中，包含濃度增加之 稀少细胞的流體（如收集I流體）與第一抗體之混合物如抗人 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（/\ ) 類抗體接觸。此等第一抗體不結合至撐體。所得混合物可 再如上述直接法中所述者培育。之後，流體與結合至撐體 粒子之第二抗體接觸。選擇此等第二抗體Μ使對第一抗體 專一。已具第一抗體/非稀少细胞結合於上之撐體粒子 /第二抗體可自如上逑有關直接負向選擇法中所述者，如藉 由使用磁性粒子濃縮器自流體分離出。 如上所述，於一些具體例中，使用超順磁粒子較佳。 典型之超順磁微珠具有磁性磁化率約10 - 9 cgs單位至約 10 - 7 cgs單位，較佳約8 X 10 - 9 cgs單位至約10 - 7 cgs單位。涉及使用磁性粒子濃縮器自流體分離出順磁（或 超順磁）粒子之一具體例可說明如下。當流體置於由磁性粒 子濃縮器產生之磁場內時，順磁粒子被吸引至固定近於磁 性粒子濃縮器之磁鐵附近的管壁* Μ使非稀少细胞（结合至 順磁粒子）自稀少细胞（未结合）分離出。根據此具體例所富 含之轉少细胞實質上不含非稀少细胞所產生之污染。例如 ，自血液分離癌细胞之情形下，發現癌细胞幾乎可完全自 有核白血球分離。此為有利的，因有核白血球，若存在* 會干擾细胞確認*特別是對於使用聚合酶鏈反應（PCR)方法 之一些具體例。 對於包含稀少细胞與非稀少细胞之流體為血液時之一 些具體例，希冀使用结合至白血球（白细胞）及/或紅血球 (紅细胞）之抗體。適當白血球抗體之範例包括人類與抗人 類白血球 CD抗體，如 CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD7、 CD8、 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 __B7___ 五、發明説明（7° ) 、CDlla、CDllb、CD1 lc、CD14、CD15、 CD16、CD19、 CD20、 CD28、 CD36、 CD42a、 CD43、 CD44、 CD45、 CD45R、 CD45RA、CD 4 5 R B、C D 4 5 R 0、C D 5 7 及 C D 6 1 抗體等。目標為 人類CD45、CD 3、CD19、CD14與CD36之抗體較佳。例如， 使用CD4 5專一性抗體時，其辨認CD45白血球共通抗原 (LCA)族，其包含至少四個存在於白血球譜糸细胞上膜糖 蛋白（220，205，190 ，180 kD)之等形。當然，亦可包括 人類與抗人類紅血球抗體。 藉由直接負向分離具體例之實例，含稀少細胞之流體 與可抗人類〔045、抗人類（；19、抗人類6014及抗人類〔0 3抗 體之混合物（如鼠抗人類CD45IgG、鼠抗人類CD19 IgG、鼠 抗人類CD14 IgG與鼠抗人類CD3 IgG抗體之混合物）接觸。 視情況，適當抗人類紅血球抗體（如血形糖蛋白A)亦可包 含於抗體混合物中。於一具體例中，抗體在混合物暴露至 含稀少細胞之流體前結合磁性粒子，而粒子使用如上市述 之磁性粒子濃縮器自流體去除。 非直接負向分離具體例之實例中，若鼠抗人類CD 4 5 IgG抗體用作第一抗體時，第二抗體為抗鼠IgG抗體。第二 抗體可在使用前固結至粒子，而如上述自含稀少细胞之流 體去除。 根據本發明之具體例，提供增濃血液中癌细胞之套組 *其至少包含第一與第二梯度密度介質，其中第一梯度蜜 度介質之密度至少約1·067克/毫升*及第二梯度密度介質 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）
訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（d ) 之密度至少約1.077克/毫升，其中套組又包含撐體粒子及 至少一抗體，其能夠结合至較癌细胞更緻密之细胞的细胞 表面抗原。更佳具體例中，第一梯度密度介質之密度約 1.0 68克/毫升至約1 . 0 7 7克/毫升，第二介質之密度約 1 · 07 7克/毫升至約1.0 8 5克/毫升。 根據本發明之套組的其他具體例中，套組可包括一或 多個核酸探針（說明於下段”增濃之稀少细胞的進一步處理 ”）及/或一或多個抗體。視需要，如此之套組亦可包括一或 多個梯度密度介質。 增澹之稀少细胞的進一步處理 如上所逑，包含稀少细胞與非稀少细胞之流體可被處 理Μ提供多個流體，各含濃度增加之稀少细胞。可使一或 多個含濃度增加之稀少细胞的流體接觸結合劑Μ結合非稀 少细胞而提供一或多個富含稀少细胞之流體。視需要，可 合併流體。例如，可合併二個富含稀少細胞之流體或富含 稀少细胞之流體可與含濃度增加之稀少细胞的流體合併， 但不接觸結合劑。 本發明之具體例提供一或多個適用於各種目的之富含 稀少血细胞的流體。 根據本發明之方法的具體例亦提供用Κ處理或使用所 富含之稀少细胞Μ如確認、特徵化及/或培養稀少细胞。此 外*方法提供用W診斷癌，特別是男性***癌，亦使癌 之惡化或退化得Μ監控，特別是在治療期間或治療之後。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明（，） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明又提供確認病患血液中癌细胞之方法，其包含 藉由任一上述方法自病患血液增濃癌细胞及使用任一適當 草案與糸統確認细胞。 本發明之具體例亦提供用Μ製備治療產品，包括但不 限於疫苗。 细胞可藉由任一適當程序製備（如用作確認、特徵化及 /或培養）。典型地，確認及/或特徵化稀少细胞之方法的具 體例包括製備含增濃細胞之懸浮疲，移轉细胞懸浮液至顯 微鏡玻片（如製得一塗抹）及使用光顯微鏡檢視該塗抹。於 直接塗抹程序中，較佳避免經由離心力將癌细胞下壓或藉 由機槭手段再分配此等經壓緊之细胞。 另一方面，若細胞溫和地沉下或離心下且懸浮液小心 地去除後，鬆散沉下之细胞可藉由小量液體（約1-10微升 )再懸浮，及再直接移轉至玻片上（如作為確認用）或至生長 培養基（如作為培養用）上。移轉细胞至玻片上之一草案包 括使沉下之细胞再懸浮於BSA溶液中，及例如藉由使用市售
Megafunnel 大容積樣本室（Shandon)使细胞離心至玻片上 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0 視需要，沉下之细胞可藉由添加固定劑（如乙醇）固地 定，因而使细胞更耐損害。此可為有利的，因被固地定之 細胞可輕易地移轉至玻片。然而，因细胞被固定，彼等無 法被培養或用作PCR研究。 視需要，製備確認用之细胞的機械收集程序可避免使 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（约） 细胞暴露至離心應力。例如，溶液中少數癌细胞可有利地 自懸浮液收集且在溫和抽氣下沉積於膜上。液體通過膜孔 *而细胞收集於膜上。隨後此等细胞藉由將膜之含细胞表 面置於玻片上而移轉至玻片。 許多技術適用於確認及/或特徵化稀少细胞。此外，本 發明之具體例可包括確認及/或特徵化單一樣本中多類型之 稀少細胞，如不同癌细胞類型。適當技術包括如使用單株 抗體進行免疫细胞化學染色》核酸雜交（包括原位雜交 )及聚合酶鏈反應（PCR)研究。技術可包括利用抗體及/或探 針之”雞尾酒”。 作為說明用，於一些稀少细胞為上皮源细胞如*** 癌细胞之具體例中，彼等可藉由使用專一性结合至如 PSA (***專一性抗原）、PSMA(***專一性膜抗原）、 PSAP (***專一性酸磷酸酶）、細胞角蛋白或白蛋白之單 株抗體使其進行免疫细胞化學方式之染色而確認。雖然 P S A廣泛用於確認***細胞活性，但存有特定分泌少量或 不分泌PS A之***细胞。因此，於一些具體例中，希冀於另 一替代方案或另外使用專一性结合至PSMA之抗體。 當然*稀少细胞亦可使用核酸雜交草案而被確認及/特 徵化。例如，於一些稀少细胞為肝癌细胞之具體例中，適 當核酸探針例如包括專一性结合至血清白蛋白ibRNA與α -胎 兒蛋白10RNA之寡聚合探針。另一替代方案，於一些稀少细 胞為***癌细胞之具體例中，適當探針包括彼等對如 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（>4 ) PSA、PSMA、染色體7、染色體8及/或染色體18專一者。如 上述，存有分泌少量或不分泌PSA之特定***细胞。因 此，探測PSA較探測PSMA不靈敏。 對編碼PSA之inRNA、編碼PSMA之mRNA及染色體7、8及 /或18之著絲區具專一性之說明性探針於下文作更詳细的說 明。此等探針特別適用於原位雜交。 對PSMA(***專一性膜抗原）mRHA具專一性之代表性 探針包括： 序列編號 1 : T G G C T G T G C C C T G G G G C G C T G G T G C T G G C G GGTGGCTTCT TTCTCCTCGG CTTCCTCTTC GGGTGGTTTA TA， 序列編號 2:AGTGTCTATG AAACATATGA GTTGGTGGAA AAGTTTTATG ATCCAATGTT ，及 序列編號 6:GTGTTTGAGC TAGCCAATTC CATAGTGCTC CCTTTTGATT GTCGAGATTA 〇 對PS A (***專一性抗原）inRH A具專一性之代表性 探針包括： 序列編號 3:GGTCCTCACA GCTGCCCACT GCATCAGGAA CAAAAGCGTG ATCTTGCTGG GTCGGCACAG ， 序列編號 4:CGCTGGACAG GGGGCAAAAG CACCTGCTCG GGTGATTCTG GGGGCCCACT T6TCTGTAAT »
序列編號 7:TCTTCCTCAC CCTGTCCGTG ACGTGGATTG GTGCTGCACC CCTCATCCTG TCTCGGATTG» R 序列編號 8:CAGGCTGGGG CAGCATTGAA CCAGAGGAGT -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明（/ ) TCTTGACCCC AAAGAAACTT CAGTGTGTGG〇 對染色體7、8及18之著絲區中重複性序列具專一性之 代表性探針包括： 序列編號 5:GCTGTGGCAT TTTCAGGTGG AGATTTCAAG CGATTTGAGG ACAATTGCAG 〇
訂 著絲點之探針可用Μ測定细胞中染色體之數目，如測 定非整倍體。例如染色體7之著絲點的探針可用Μ計算细胞 内染色體7之數目。正常细胞應為雙倍體，因此顯現二個經 染色之探針”點”。偏離雙倍體狀態（亦即1、3、4或更大數 目之染色體7)表示非整倍體或染色體異常數目*其為癌/癌 狀態非常強之指示。 染色體18著絲點之適當探針可自市面取得，例如自 Vysis, Inc.(Doeners Grove, IL) °
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 染色體18著絲點之適當探針為序列編號9:GTACTCACAC TAAGAGAATT GAACCACCGT。Meyne等人，於 Methods in Molecular Biology, 33: In Situ Hybridization Protocols , Choo，H.K. (ed. ) , 6 3 - 7 4 ( 1 9 9 4 )。此序列可轉 化為更長之序列。例如，可轉化為序列編號10: AT GTGTGT AC TCACACTAAG AGAATTGAAC C'ACCGTTTTG AA。雖然可使用序列 長度約2Q至約60個核苷酸，較佳長度為42。 當然，稀少细胞亦可藉由聚合酶鏈反應（PCR)技術確認 。任一業界一般技藝人士已知之PCR技術及適當探針可被使 用0 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 本發明進一步提供確認病患血液中癌细胞之方法，其 包含藉由任一上逑方法自病患血液增濃癌细胞及使细胞原 位雜交（包括螢光原位雜交（FISH))。適當探針包括彼等敘 逑於上者。另外，例示之原位雜交草案及其中所用之探 針可發現於例如上逑Meyne等人之Methods in Molecular Biology, vol.33中0 作為說明用，FISH等探針可Κ去氧核糖核苷酸單元或 2甲基核糖基核苷酸基單元或由甲基磷酸酶 (methylphosphonate)主幹或硫代磷酸酯核苷酸基主幹組成 之非離子類似物合成。適當探針包括寡去氧核糖核苷酸探 針，及較佳彼等K螢光殘基標記者。可使用任一適當螢光 殘基。因此，螢光染料如螢光素（綠）、cy3(紅）、cy5(遠 紅）、cy7 (紅外線）與德州紅（Texas red)可為標記。二重與 三重原位雑交亦可藉由在上述條件下使用inRN A與著絲點探 針（差式標記）之組合而進行。高嚴格性清洗後，细胞核可 Μ螢光DNA染色如DAPI (二醯胺基苯基吲跺）或PI (碘化丙錠 )複染。經染色之细胞可使用任一適當螢光顯微鏡分析專一 性mRN Α與非整倍體。包括使用螢光顯微鏡之適當系統與草 案包括彼等揭述於如Callahan,等人，Cytometry 1 3 , 4 5 3 - 4 6 1 ( 1 9 9 2 )與 Lesko等人，Exp. Cell Res. 219， 4 9 9 - 5 6 6 ( 1 9 9 5 )中。 測定癌細胞核中非整倍體之另一替代程序為首先進行 專一性免疫细胞化學染色（如藉由將PSA、PSMA、PSAP或白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 i、發明説明（) 蛋白染色）及交聯抗體與抗原*接著Μ螢光標記之著絲點探 針進行原位雑交。 偵測類上皮癌细胞之程序包括專一性免疫细胞化學染 色（如藉由專一性结合至细胞表現之细胞角蛋白的细胞角質 素蛋白質抗體）。再進行固定化及/或交聯抗體與抗原，接 著進行原位雜交Κ偵測專一性“ΝΑ與染色體非整倍體。 為進行FISH，玻片在细胞置於上前應藉由在室溫下浸 漬於稀氫氯酸溶液如0 . 1 N H C 1中約2 Q分鐘K使任一 D N A與 RNA殘渣變性而清潔。HC1溶液應含0 · lHriton X 100界面 活性劑。玻片隨後K PBS洗灌。 稀少細胞如癌细胞可藉由任一前述適當程序負載於玻 片上。玻片隨後依序浸於75%乙醇、85J；乙醇與95%乙醇中 各約2分鐘而脫水。 一例示FISH雞尾酒包括各含2D0毫微克PSMA與PSA探針 Μ及250毫微克染色體7著絲點探針，將微升原位雜交緩 衝液（25%甲酶胺與4 X SSC用於寡聚物探針及50%甲醯胺與1 X SSC用於市售探針）加至玻片。隨後细胞以蓋玻Μ覆蓋’ 而玻片邊緣由橡膠接合劑圍繞及密封。玻片應保持Μ $胃 (如8 0〇 C下約5分鐘）中Μ變性，且隨後培育，如在42Q 約3小時。隨後细胞經清洗，如Μ 1 x SSC在65。C下約 10分鐘。细胞隨後K適當染料染色，如二醯胺基苯基031 跺（DAPI)，再於適當顯微鏡下檢視。 本發明之具體例又包括培養稀少细胞°例如’稀少® -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 Χ297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之
事 I Η 本^ 頁 I 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 _B7_ 五、發明説明（^ ) 胞如癌细胞可如上述增濃*隨後與適當生長培養基接觸。 典型地，為進行细胞培養，细胞負載至無菌膜滤器上。 業界一般技藝人士已知之任一適當膜濾器可被使用。 適當之膜範例包括微孔膜。膜可具任一適當孔徑，較佳孔 徑自約0.2微米至約15微米，更佳15微米。適當之微孔膜包 括尼龍6、尼龍46、尼龍66及硝基纖維素膜。適當膜可自市 面取得。 细胞在負載至膜前並未”固定”。具细胞負載於上之膜 一般置於經膠原塗覆之培養皿中，其含生長培養基及與經 膠原塗覆之表面接觸之细胞。業界一般技藝人士已知之任 一適當生長培養基可被使用。生長培養基之一例為補充 1%血清與額外因子之 PFMR-4A(Peehl, J· of Tissue Culture Methods, 9，53- 6 0 ( 1 9 8 5 ))。其他適當生長培養 基之例包括 RPMI 1640、 Coon’s F12、Dulbecco’s改質依 果（Eagle)培養基、McCoy’s培養基等。 细胞生長可藉由業界一般技藝人士已知之任一適當方 法監控。例如，***癌细胞生長可使用酵素聯结免疫吸 附法（ELISA)分析PS A分泌至培養基中而監控，而肝细胞生 長可使用ELIS A分析白蛋白或α-胎兒蛋白之分泌而監控。 所培養之细胞有各種額外用途。例如，细胞可用Μ提 供治療產品，包括但不限於疫苗。 本發明又包括診斷癌，特別是男性***癌之方法， 該方法包含如上述增濃與確認來自病患血液之癌细胞。 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（>1) 本發明又提供顯示人類癌，特別是顯示男性***癌 之改良方法。例如，於一些具體例中，有罹癌疑慮之病患 的血液如上處理W增濃***癌细胞（若存在）。利用寡核 苷酸引子之強化反轉錄酶（RT)聚合酶鐽反應（PCR)方法隨後 進行。因本發明方法能高效率地增濃细胞且具體例能夠在 6百萬細胞中偵測出1癌细胞，本發明之方法顯著較文獻中 記載之方法更靈敏，文獻中報導之方法能在1〇〇, 〇〇〇淋巴球 中偵測出1產生PS A之细胞（Katz等人，Urology, 43， 7 6 5 - 7 7 5 ( 1 9 9 4 ))及在1百萬细胞中偵測出1(18^611等人， Cancer Research，54, 6306-6310(1994))。此外，本發明 確認合成PSA之癌细胞Μ及非合成PSA之癌细胞如合成 PSMA之细胞。 本發明又提供在治療期間或之後監控癌之惡化或退化 之方法，而發現關於男性***癌之特別用途。方法包含 隨時採取重覆之血液樣本並如上述增濃、單離及確認有罹 癌疑慮之病患血液的癌细胞（若存在）。鑑於其增強之靈敏 度，本發明之具體例藉由單離與偵測病患血液中癌细胞而 有效用於監控各種癌治療之功效。 下逑實例進一步說明本發明，但當然不應Μ任何方式 建構Μ限制其範圍。於所有下逑實例中，所增濃之细胞使 用配備有冷卻之電荷耦合裝置（CCD)照相機與滤器襴 (filter cub)(使螢光素cy3、cy5及cy7螢光訊號之額外差 式偵測可行）之自動Zeiss Axiovert 35表螢光 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 Α7 Β7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明説明（ (epifluorescent)顯微鏡確認。照相機具有由電腦控制之 快門。電腦亦控制顯微鏡玻片台之移動。 顯微鏡設在自動模式並採多重波長曝光。影像經由A至 D轉化器下載至電腦。電腦Μ數位形式處理與記錄影像。 實例1
此實例說明***癌细胞與肝细胞瘤细胞之密度測定 Κ如改善選擇適用於實施本發明之適當密度梯度介質的效 率。癌细胞之密度藉由測定位於培養基與梯度介質之介面 的癌细胞回收百分比而於密度梯度管柱中測定。
PERCOLL (Sigma Chemical Co.，St· Louis, Μ0)儲料 溶液藉由添加9份PERCOLL 至1份（體積/體積）1 .5M NaCl溶 液而製得。PERCOLL 溶液之莫耳滲透壓濃度Μ生理食鹽 水調節。至所要莫耳滲透壓濃度之最後調節可藉由添加蒸 餾水或鹽達到。儲料PERCOLL 溶液之密度可由下式計算： (Po - PI) VoPo+VxPIO
Vx = Vo ----------- Pl=----------- (PI - P10) Vx + Vo 式中
Vx = 稀釋介質之體積（毫升）
Vo = PERCOLL (毫升）之體積（毫升）
Po = PERCOLL 之密度（1 · 130 土 0 · 0 0 5克 /毫升） P10 = 1.5 M NaCl之密度= 1 . 058克 /毫升 2.5 Μ蔗糖之密度=1.316克/毫升 -32-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（Μ ) PI = 所製得儲料溶液之密度（克/毫升） 因此，對於食鹽水中之儲料PERCOLL P1 = 1.123克 /毫升，而對於蔗糖中之儲料PERCOLL P1 = 1.149克/毫升 Ο 儲料PERCOLL 之溶液可使用细胞單離用之0. 15 Μ食鹽 水（密度=1.DQ8克/毫升）稀釋而稀釋至較低密度。下式可 用Κ計算所需體積Μ取得所要密度之溶液。 (Ρ1 - Ρ)
Vy = Vi --------- (Ρ - Py) 式中
Vy =稀釋介質之體積（毫升）
Vi =儲料PERCOLL 之體積（毫升） P1 ==儲料溶液之密度（克/毫升）
Py =稀釋介質之密度（克/毫升） P =所製得稀溶液之密度（克/毫升） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
表1·用於測定癌细胞密度之數個PERCOLL 溶液密度之製備 儲料溶液 0 · 1 5M NaCl 溶液密度 (Pl = l. 123(克 /毫升） (毫升） (克/毫升） 70 28 1.090 60 40 1.077 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（从） 50 47 1.067 40 56 1.056 30 69 1.043 20 80 1.031 癌細胞之密度測定如下： 所用癌细胞株自市面供應商（如美國標準菌種保存中心 )取得。LNCaP、TSU及肝细胞瘤G2细胞株在含10XFBS與 55iC02之RPMI 1640中於37Q C下培養。5毫升培養基中之细 胞在已知密度之5毫升單一 PERC0LL 溶液上分層並在室溫 及4 0 0 X g下離心20分鐘。收集介面與PERC0LL 溶液上方 任一可見小粒。計算此懸浮液中之细胞數目並用於回收之 計算。數據示於表2。 表2.癌细胞之密度測定
訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PERC0LL 密度 回收U) (克/毫升） LNCaP TSU 肝细胞瘤G2 1.031 10.0 10.0 10.0 1.043 20.5 15.0 17.0 1.056 25 · 0 20.5 24.0 1.067 76.0 84 . 5 85.0 -34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Λ ) .077 76.5 98 . 5 98 . 0 .090 76.0 98 . 5 98 . 0 如表2所示，96%至85%癌细胞使用密度1 . 0 6 7克/毫升之 梯度回收。使用肝细胞瘤G2與TSU细胞，額外之135；至1U细 胞回收可使用密度1.07 7克/毫升之梯度取得。使用較高密 度之LNCaP细胞，並未發現額外之細胞回收。 實例2 此實例說明使用單一密度梯度管柱分離***癌细胞 之方法。 採新血2 0毫升於二管中。血使用磷酸鹽緩衝食鹽水 (PBS)M 1 : 2稀釋。30毫升含有2 · 3 X 1(P LMCaP细胞（前列 腺癌细胞）之稀血液塗於15毫升PERC0LL 梯度上，密度 1.06 8克/毫升（圖1中之梯度I)。梯度管柱在室溫及400 X g下離心20分鐘。 位於血漿與PERCOLL 介質間之介面的细胞小心地移至 新管。將40毫升PBS加入新管並混合。經PBS稀釋之细胞在 2 5 0 X g下離心5分鐘。所得细胞粒懸浮於50微升0.1 %牛血 清白蛋白（BSA)溶液。 所製得之細胞懸浮液呈點狀塗抹於玻Η上，各使用 10微升懸浮液。使玻片風乾2小時。细胞Μ 95%乙醇固定 15分鐘，再以改質Carnoy’s固定劑固定10分鐘。使用前於 40 C下儲存於75%乙醇中。 -35- t紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格(210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（A ) 再重覆上逑實驗九次，每次使用新血樣本。10次實驗 中***癌細胞之平均回收為76-86%。 實例3 此實例說明使用較高單一密度梯度管柱分離***癌 细胞之方法（參見圖1與圖2A)。 取自實例2中1.06 8克/毫升密度梯度（圖1中之梯度I)的 细胞粒再懸浮於實例2之血漿部份並塗於含10毫升F ICO LL 介質，密度1.08 3克/毫升之較高密度梯度管柱（圖2 A中梯度 II)。室溫下密度梯度管柱在4 0 0 X g下離心20分鐘。 位於血漿與密度1.0 83克/毫升之介質間之介面的细胞 小心地从细胞轉移吸量管去除並置於新管。將40毫升PBS加 入介面細胞並混合。經PBS稀釋之細胞在25D X g下離心。 所得细胞粒懸浮於50微升0 · 1重量％BSA溶液中。白血球Μ光 顯微鏡計算。 分別將30微升鼠抗人類CD45、CD19、CD3、CD14單株抗 體（Sigma Chemical Co·)與10微升血型糖蛋白Α單株抗體 (Dako, Inc.)加入细胞懸浮液中，管在冰上培育30分鐘。 细胞懸浮液經離心，再吸出懸浮液。细胞粒與8 X 1 0 7 個塗覆有抗鼠IgG抗體（DynU, Inc·)之磁珠懸浮於2毫升P BS-BSA。細胞與珠在4° C下培育30分鐘，同時M l〇rpm/分 鐘旋轉該管。细胞-單株抗體-鼠IgG-磁珠複合物Μ磁性粒 子濃縮器去除。剩餘细胞收集於玻片上。玻片經離心而细 胞如實例2所述固定。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 實例4 此實例說明實例2所述自血液單離***癌细胞之程序 的效率。 使血液樣本進行實例1之程序，但離心20分鐘而非30分 鐘。 測定细胞總數、介面之细胞數、梯度底部之细胞數。 數據列示於表3。 表3.使用單一密度梯度單離***癌细胞之效率 前列 腺癌 細胞株 LNCaP P100 TSU wt 细胞數 2 . 3 X 105 1.00 X 107 介面之细胞數 1.75 ) (105 8.45 X 106 (回收υ (76%) (84.5¾) 底部之细胞數 少數細胞 1 · 50 X 105 (較高密度细胞X) (-1.0¾) (15%) 流失之细胞數* 5 . 5 X 104 5.00 xlO4 (流失X) (23%) (0.5¾) *包括黏著於管壁之细胞及在分離與清洗時破裂之细胞 實例5 此實例說明實例3所述自血液單離***癌细胞之程序 的效率。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明（Λ ) 使血液樣本進行實例2之程序，但離心2 0分鐘。 (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) 測定细胞總數、介面之细胞數、梯度底部之细胞數’ 並決定流失之细胞數。數據列不於表4。 表4.使用第二密度（1·〇 83克/毫升）梯度單離***癌细胞 之效率 ***癌 细胞株 LUCaP P100 TSU wt 细胞總數1 2 2·3 X 1〇3 1.50 X 1〇4 介面之细胞數 1.87 X 10^ 1.45 X 1〇4 (回收％) (81.3¾) (96.6%) 底部之细胞數 未測得 未測得 (較高密度细胞％) (〜0%) (〜0%) 流失之细胞數1 1 4.5 X 102 5.00 xlO2 (流失S：) (〜18 · 7¾) (〜3 · U) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 细胞懸浮液自單一梯度（1 .068克/毫升）分離之管底部收集 2 包括黏著於管壁之细胞及在分離與清洗時破裂之细胞 實例6 此實例說明培養癌细胞之方法。計算LNCaP细胞並加入 正常成人血液中。說明於實例2與3中之方法用Μ單離人工 血液中之LHCaP細胞。單離自人工血液之LNCaP细胞培養於 -38- 1本紙張尺度適用中國國家標準（CNsTa4規格（210X297公釐1 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（A ) 補充10¾血清與額外因子之生長培養基RPMI 1640。每三天 更換培養基。培養之细胞顯示陽性免疫染色PS A與PSAP，而 各燒瓶中之细胞數隨培養時間增加。 實例7 此實例說明藉由與PSA-ioRNA、PSMA-kRNA與染色體著絲 點探針進行螢光原位雜交（FISH)自病患血液確認LNCaP细胞 或***癌細胞。對PSA-mRNA、PSMA-mRNA與染色體7與18 之著絲點具專一性之寡核苷酸探針經合成及與螢光染料如 螢光素、cy3與cy5拼合。染色體著綠點8之探針來自市面（ V y s i s ) 〇 藉由實例1與2所述方法單離、固定與儲存之癌细胞於 室溫下、0.1 M HC1 - 0.1¾ Triton X-100之溶液中預處理 3 0分鐘，於75¾、8 55Ϊ與9 5%之系列等級中各等級脫水2分鐘 。樣本風乾。 FISH”雞尾酒”包含主要含25¾:甲醯胺與4 X SSC(對於寡 聚物探針）或50%甲醯胺與1 X SSC(對於市售探針）、20微克 /毫升PSA-mRNA探針與PSMA-fflRNA探針與25微克/毫升染色體 7、8與18著絲點探針之FISH媛衝液。將10微升FI SIT雞尾酒 ，，加至蓋玻片下之各玻片上。樣本在80ϋ C下變性10分鐘及 在4 20 C下培育2小時。玻片在70。C下Μ 1 X SSC清洗10分 鐘。Μ 1〇微升含有微克/毫升二醯胺基苯基吲跺 (D API)之抗褪色裝載介質複染。複染後，樣本在螢光顯微 鏡下檢視。染色體7著絲點（其為多倍體）顯現綠色，而核Μ _ 3 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7 __ 五、發明説明（以） DAPI染成藍色，3 染色體8著絲點（其為四倍體）顯現黃色，而核M DAP I 染成藍色。 計算染色體著絲點及數據列示於表5。 表5.來自培養與單離自癌病患血液之癌细胞的LNCaP细胞核 中染色體7與8之非整倍體 细胞編號 染色體著絲點7 染色體著絲點8 LNCaP 病患癌细胞 LNCaP 病患癌细胞 1 14 8 14 8 2 4 8 4 8 3 7 4 7 4 4 4 4 4 4 5 4 4 3 3 6 4 8 4 8 7 4 8 4 8 8 5 4 3 3 9 8 3 7 4 10 2 4 3 4 實例8 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 — B7 五、發明説明（β ) 此實例說明藉由免疫细胞化學法染色及藉由染色體著 絲點7與8偵測確認病患血液中LNCaP细胞或***癌细胞。 依實例2與3所述增濃、單離、固定與儲存之癌细胞使用對 抗PS A與PAP之第一抗體及拼合螢光染料之第二抗體藉由免 疫细胞化學染色。免疫细胞化學法染色後，樣本在室溫下 1XM三聚甲醛處理10分鐘。三聚甲醛處理使得在進行螢光 原位雜交前使癌ffl胞後固定（post-fixation) Μ及交聯抗 體與抗原並使複合物在FISH程縯中更安定。玻片在室溫下 M0.1 M HC1 0 · 1¾ Triton X-100之溶液預處理 20分鐘， 再Μ 75%、8 5¾與95%乙醇於各等級中脫水2分鐘。玻片風 乾。 為染色體著絲點7與8染色製備FISH雞尾酒流體。”雞尾 酒”包括含505K甲醯胺與2 X SSC與拼合有螢光染料之染色體 著絲點7與8 DN A探針之FISH媛衝液。將蓋有10微升FISH”雞 尾酒”與蓋玻片下之细胞在80° C下變性5分鐘及在42° C下 培育2至3小時。玻片在60。C下K 1 X SSC清洗10分鐘。以 10微升含有0.2微克/毫升二醯胺基苯基吲跺（DAPI)之抗褪 色裝載介質複染。樣本在螢光顯微鏡下檢視。 W免疫螢光法對***專一性抗原（PSA)染色之 LNCaP细胞顯現綠色，其代表细胞質中PS A抗體之免疫反應 0 LNCaP细胞顯現细胞核之免疫螢光染色，如藍色染色 (DAPI)所顯示。 -41- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7___ 五、發明説明（/ ) K***專一性酸性磷酸酶（PSAP)抗體進行免疫细胞 化學法染色之LNCaP细胞顯現Μ DAPI染色之核。 來自***癌病患之***细胞藉由使用PS Α抗體進行 免疫化學法將细胞質染色（綠色），再使用染色體著絲點 7 (藍色）與染色體著絲點8 (紅色）探針進行FISH而將核染色 Ο 實例9 此實例說明藉由實例2與3所述方法增濃與單離癌细胞 之效率。 血液樣本K各種白血球（WBC)對LNCaP细胞之比例與 LNCaP细胞重組。列示於表6與7中之细胞回收數據確認癌 細胞可Μ高回收百分比回收。 表6.自重組之血液中回收LHCaP细胞 WBC : LNCaP WBC LNCaP LNCaP之回收 细胞數 ％ 5 0 0 :1 2 · 76xl07 6.5xl04 5·5xl04 84 . 6 1 0 0 0 :1 2 · 76xl07 3.2xl04 2·7xl04 84 . 6 10000:1 2 · 76xl07 3.2x10^ 2 · 8xl03 86 . 2 0 : 2 0 0 0 0 (對照組） 0 2.3x10s 1 · 8xl05 78 . 3 -42 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明U\) 表7.重組血液中***癌细胞（LNCaP)之回收 樣本編號 血液量 WBC數目 LNCaP 细胞數 回收 51-9B3329 9. 0毫升 1.57x106 100 85 85¾ 51-5B3320 9.0毫升 1 · 47x108 100 80 80¾ 51-0B3340 9.0毫升 1 · 78χ1〇δ 100 97 97% 51-0B3337 9.0毫升 1.70x108 100 95 95% 51-0B3314 9.0毫升 6 · 64χ107 100 82 82% 51-7B3333 9.0毫升 1 . 26χ1〇δ 100 94 94% 51-0B3323 9 . 0毫升 1 . 09χ1〇δ 100 90 90% 51-6B3339 9.0毫升 7 · 84χ107 100 96 96X 51-2B3330 9 . 0毫升 2 . 3 2 χ 1 0 δ 100 75 75% 5卜8B3310 9.0毫升 1 · 59x108 100 90 90% N = 10 9.0毫升 1 · 42x108 100 88 . 4 88.4¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 單離自重組血液之LNCaP细胞具有低於1%之原WBC濃度 。污染之成份圼下列順序：單核白血球〉淋巴球〉嗜曙紅白血 球。發現單離自重組血液之LNCaP细胞在RPMI 164G培養基 中生長。WBC污染可藉由在三天後更換培養基而降低。 實例10 此實例說明藉由併用以細胞角蛋白單株抗體進行免疫 细胞化學法染色、Μ染色體著絲點7與18探針進行fish及p -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明u SMA niRNA探針而確認病患血液中之LNCaP细胞或***癌 细胞。 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 樣本在室溫下Μ 100X丙酮固定2至3小時。玻片經風乾 及在室溫下儲存於玻片盒中。玻片在室溫下於0.1Μ Tris清 洗緩衝液中培育10分鐘，而將液體自玻片表面去除。將 2 5微升經FIT C拼合之抗细胞角蛋白（CAM 5.2)單株抗體 (Becton-Dickinson, San Jose, CA;Cat.3 4 7 6 5 3 )(l:2稀釋 )加至玻片上。玻片與蓋玻片一起在3 70 C下於濕氣盒中培 育1小時。玻片未蓋而在室溫下於0 . 1Μ T r i s清洗媛衝液中 清洗10分鐘。再使玻片於暗處風乾。 製備含0.1M MgCl2之1%三聚甲醛並在冰上預冷卻。將 1.0毫升該1¾三聚甲醛滴在樣本區上。樣本在室溫下固定 2-5分鐘。自玻片表面去除固定劑，使玻片在室溫下風 F I S Η混合物（每一樣本）根據下述製備： FISH媛衝液（Oncor) 9.0微升
Cy3-染色體著絲點探針18 28毫微克 0.5微升 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Cy3拼合之PSMA-inRNA探針 25毫微克 0.5微升
Cy5-PSA-mRNA探針 25毫微克 0.5微升
Cy5-染色體著綠點探針7 2 8毫微克 0.5微升
Cy5-染色體著絲點探針8 2 8毫微克 0.5微升 將F I SH混合物加至樣本區。加上蓋玻片並以橡膠黏固 粉密封。樣本在85Q C下變性7分鐘，而玻片在42〇 C下培育 -4 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ^89380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ______B7_ 五、發明説明（) 2小時。玻片在60〇 C下於1 X SSC中清洗5分鐘，樣本在室 溫下風乾。樣本M DAP I複染，玻片在螢光顯微鏡下檢視。 摘逑結果於表8。 .表8· Μ细胞角蛋白免疫细胞化學染色與***專一性膜抗 原（？3>(纟）1〇1{^及染色體著絲點8與18探針之螢光原位雜交 (FISH) Μ及DAPI核染色偵測五種***癌细胞株（陽性染色 之百分比） 癌细胞株 免疫细胞化學 PSMA-mRNA 染色體8&18 DAPI LNCaP 100% 100% 非整倍體（95-10050 100% TSU-PRI 100% 100% 非整倍體（95-100%) 100% DUMS 100% 100% 非整倍體（95-100%) 100% PC-3 100% 100% 非整倍體（95-100¾) 100% PPC-1 ㈠ ㈠ 非整倍體（95-1003O 100¾ ***癌细胞Μ细胞質內Cy3拼合之***專一性膜抗 原（PSM A)ιηΟ A探針染色。细胞顯示核中四個綠色染色體著 絲點7訊號，其藉由拼合蟹光素之人類染色體7著絲點探針 染色。核K藍色DAPI染色。 另一***癌细胞於细胞質中有綠色细胞角蛋白染 色及在MDAPI染色之核中有染色體8同源多倍體訊號（四個 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明（d) 紅點）。白血球顯現具有兩個染色體8訊號（正常染色體數目 )之藍色核。 實例11 此實例說明藉由使用實例2之程序成功地自惡化之前列 腺癌病患單離與確認***癌细胞。 病患數、採集之血液量及單離之***癌细胞數列示 於表9。 表9 .自惡化之癌病患的血液採集***癌细胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 病患數 (N=13) 血液量（毫升） ***癌细胞 (细胞數） PC253 10 200 PC254 20 140 PC255 27 260 PC256 9 6 PC257 27 90 PC258 15 40 PC259 27 未測得 PC260 22 未能離心 PC261* 15 未測得 PC262^ 15 未測得 PC263 7 . 5 未測得 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（β PC264 PC265 16 9 未測得 20 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *得自正常成人血之對照組樣本 實例12 此實例說明自惡化之***癌病患之血液成功地單離 與確認***癌细胞（參見實例1 0之程序）。 實驗1(對等研究）中，相同樣本取兩等份且Μ相同程序 處理。病患數、採集之血液樣本量及單離之***癌细胞 數列示於表1 〇。對等研究之結論為單離程序係可再現的。 實驗11(儲存研究）中，相同樣本取兩等份且Μ相同程序 處理。Α組之樣本在24小時内處理，而Β組之樣本在4Q C下 儲存7 2小時後處理。病患數、採集之血液樣本量及單離之 ***癌細胞數列示於表1 1。儲存研究之结論為通常癌细 胞在7 2小時儲存後未能保藏。若细胞在7 2小時儲存後被保 藏時，癌细胞尺寸較小（約單核白血球之尺寸），但在細胞 質内具有非常典型且非常強之细胞角蛋白系統染色。 表1 (K偵測惡化之癌病患血液中之***癌細胞 實驗I: 請 先 閱 讀 背 面 之 注
I 訂 糸列編號 年龄 PSA量 (U/L) 血 液 (毫升） 總數 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 #1 58 19.9 20 3 4 7 #2 58 81.1 18 2 3 5 #3 72 76.0 18 5 4 9 #4 66 44.9 15 2 2 4 枯5 69 <0.1 20 1 2 3 #6 ? 18.6 18 2 2 4 #7 63 388.2 2 0 2 3 5 #8 78 212.6 20 6 4 10 #9 74 3 7 9 .1 20 1 5 16 1團 2團 #10 67 61.7 20 2 1 3 #11 7 1 182.6 20 1 1 2 #12 4 2 4 . 4 20 0 0 0 #13 53 85.7 20 8 7 15 #14 59 37.7 20 0 0 0 #15 59 6 . 1 2 0 0 0 0 #16 58 3 3 7.3 15 5 5 10 #17 67 14.69 2 0 0 1 1 #18 8 1 17.5 20 11 12 23 #19 72 9 . 7 20 0 0 0 #20 81 6 1 20 1 2 3 #2 1 54 43 20 3 4 7 #22 61 <0.1 18 0 0 0 一 4 8 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（θ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 #23 69 1.15 20 0 0 0 #24 61 44.3 18 0 0 0 #25 61 25.1 16 1 1 2 *相同樣本採二等份且Μ相同程序處理 表11 .偵測惡化之癌病患血液中之***癌细胞 實驗11 : 系列編號 年龄 PSA量 血 液 癌细 胞 總數 (U/L) (毫升） Α組 B組 #18 81 100 16 12 12 2 4本本 #26 58 44 20 0 0 0 #27 72 9 15 0 0 0 #1 58 52.6 20 2 0 2 #2 68 . 3 72 20 3 0 3 #7 63 38 1. 5 20 2 0 2 #13 53 26.2 20 4 0 4 "6 58 23.2 20 0 0 0 #25 61 24.1 20 2 0 2 #27 58 14.6 20 1 0 1 -49- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) **癌細胞尺寸較小（約單核白血球之尺寸）但细胞質中具有 非常典型且非常強之染色细胞角蛋白系統 實例1 3 此實例說明使用單一密度梯度管柱分離***癌细胞 之方法。 使血液進行實例2所述之程序，但密度1. 0 6 8克/毫升之 梯度管柱的離心在室溫及4 0 0 X g下進行3 Q分鐘，而非2 0分 鐘。玻片依實例2所逑製備。 再重覆實驗9次，各次使用新血樣本。10次實驗中前列 腺癌细胞之平均回收為7 0 - 8 0 %。 實例1 4 此實例說明使用雙重密度梯度管柱分離***癌细胞 之方法。 得自實例13之密度梯度的小粒再懸浮於得自實例13之 血漿份中並塗於含有10毫升密度1 . 0 8 3克/毫升之FI C0LL 介質與5毫升密度1.07 7克/毫升之FI COLL 介質的雙重密 度梯度管柱。將懸浮液塗於管柱上K使其與較低密度之介 質接觸，其接著與較高密度介質接觸。因此，使用圖2 B左 側作為參考，梯度III密度克/毫升，而梯度II密度 1.0 8 3克/毫升。密度梯度管柱在室溫及400 X g下離心30分 鐘0 使用圖2B右側作為參考，介面之细胞（血漿與梯度II及 111間之介面11) Μ细胞轉移吸量管小心取出並置於新管中 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
589380 A7 B7 五、發明説明（^ ) 。亦將40毫升PBS加入新管並混合。經PBS稀釋之细胞再於 2 5 0 X g下離心。所得小粒懸浮於2毫升0 · 1重量XBSA溶液中 。使用光顯微鏡計算白血球。 將CD4 5-Dynalbeads加人上述细胞懸浮液中（每一 WBC約 使用3個珠）。细胞懸浮液與Dynalbeads在4G C下一起培育 3 0分鐘，伴隨溫和搖晃。將含有细胞與珠之管置於磁性粒 子濃縮器（Dynal Corp.)及將懸浮液中之細胞吸移至新管， 留下由磁性粒子濃縮器固定於管中之珠與黏著之血细胞。 细胞懸浮液於2 5 0 X g下離心。所得小粒再懸浮於30微 升1重量％BS A溶液中。所製得之细胞懸浮液呈點狀塗抹於玻 片上，各使用10微升懸浮液。使玻片風乾2小時。细胞K 95¾乙醇固定10-15分鐘，再K改質Carnoy’s固定劑固定。 實例1 5 此實例說明實例1 3所述程序單離血液中***癌细胞 之效率。 使血液進行實例1 4所述之程序，但進行雙重密度梯度 管柱20分鐘，而非30分鐘。 測定細胞總數、介面之細胞數、底部之細胞數及流失 之细胞數。數據列示於表1 2。 表12.使用雙密度梯度單離***癌細胞 ***癌细胞株 LNCaP P100 TSU wt -51- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 589380 A7 B7 五、發明説明（9 ) 介面之细胞S： * 〜1% 14.5¾ 底部之細胞％ * 0 〜1 % 流失之细胞％ 0 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *此管柱含有自1.068克/毫升梯度管柱”漏出”之癌细胞 實例16 此實例說明使用雙密度梯度管柱增濃***癌细胞 0 採2 0毫升新血於二管中。M PBS依1:2稀釋血液。將 3 0毫升稀血塗於雙密度梯度管柱上層，其具有如圖3左側 所說明 10毫升 1 · 0 68克 /毫升 Histopaque (Sigma Chemical Co.)之上層及10毫升1.083克/毫升Histopaque 之下層。 管柱在室溫及400 X g下離心30分鐘形成如圖3右側所示之 6層。 離心後，小心地去除介面I與梯度I並置於另一管中， 亦小心去除介面11與梯度11並置於另一管中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將40毫升PBS加入含有介面I與梯度I之管中並混合。經 PBS稀釋之细胞在2 5 0 X g下離心5分鐘。所得小粒懸浮於 5 0微升1XBS A溶液中形成呈點狀塗於玻片上之细胞懸浮液。 使玻片風乾至少2小時。细胞Μ 953ί乙醇固定15分鐘’再Μ改 質Carnoy，s固定劑固定10分鐘。玻片在40 C下於75%乙醇中 儲存直至使用。 如上所述，亦小心地將介面11與梯度11移至新管。將 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7____五、發明説明（< ) 40毫升PBS加入新管中並混合。經PBS稀釋之細胞在250 X g 下離心5分鐘。所得小粒懸浮於2毫升IS： BS A溶液中。將 CD45-Dynalbeads加入细胞懸浮液中（每一白细胞（白血球） 使用約3-10個珠），懸浮液與Dynalbeads—起在4C C下培育 3 0分鐘，伴K溫和旋轉。 將含有细胞與珠之管置於Dynal磁性濃縮器中。操作濃 縮器K吸引珠與所黏附之血细胞至管壁。 將含有癌细胞之懸浮液吸移至另一管中。玻片如上製 備。 實例17 此實例說明實例16所述自血液單離***癌细胞之程 序的效率。再重覆實例16所逑程序9次，各次使用含有 LNCaP细胞之新血液。得自介面I與梯度I之***癌细胞的 平均回收為約70-8QX。得自介面II與梯度II之***癌细 胞的平均回收為約5-10X；。 所有列示於本申請案之核酸序列均為5’-3’組態。 所有在此引述包括專利與文獻之參考資料均整個併於 此作為參考。 當發明在此所述與揭示關乎特定較佳具體例與程序時 ，不意圖限制本發明至彼等特定具體例。反之意欲涵蓋所 有落於本發明精髓與範圍内之其他具體例與改變。 序列表 (1) 一般資料·· -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（2l〇x297公羡) (請先閱讀背面之注意事項
訂
589380 A7 B7 五、發明説明（吵） (i)申請人：Ts’o，Paul O.P.
Wang , Zheng-Pin Lesko , Stephen A .
Nelson, William G.
Partin, Alan W. (i i )發明名稱：增濃綑胞之方法 (i i i)序列數：1 D (iv)聯絡地址： (A) 地址：Leydig，Voit & Mayei*，Ltd·
(B) 街名： 7 0 0 Thirteenth St.，NW (C) 都市：Washington
(D) 州名：DC (E) 國名·•美國 (F) 郵遞區號：2 0 0 0 5 (v )電腦可讀取形式： (A) 介質型態：Floppy Disk (B) 電腦：IBM PC相容 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
(C) 操作糸統：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：Patentln Release #1.0, Version #1.30 (v i )目前之申請數據.· (A)申請號碼：W0 (B )申請日： (C)分類： -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（5、） (vii) 先前之申請數據： (A )申請號碼：U S 6 0 - 0 1 4 9 2 9 (B)申請日：05-APR- 1996 (C )分類： (viii) 律師/代理人資料： (A) 姓名：Jay, Jeremy M· (B) 註冊號碼：3 3 5 8 7 (C )參照/目錄號碼：7 3 3 7 8 (ix) 電信資料： (A) 電話：2 0 2 - 7 3 7 - 6 770 (B) 傳真：2 0 2 - 7 3 7- 6 7 7 6 (2) SEQ ID N0 · 1之資料： (i )序列特性： (A) 長度：72鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓蹼學··線型 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X i )序列描述：S E Q I D N 0 . 1 : TGGCTGTGCG CTGGGGCGCT GGTGCTGGCG GGTGGCTTCT TTCTCCTCGG CTTCCTCTTC GGGTGGTTTA TA (2) SEQ ID N0.2之資料： (i )序列特性： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 A7 B7 五、發明説明（A ) (A) 長度：50鹼基對 (B) 型式：核酸 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 (C) 股性：單股 (D )拓蹼學：線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X i )序列描述：S E Q I D N 0 · 2 :
AGTGTCTATG AAACATATGA GTTGGTGGAA AAGTTTTATG ATCCAATG.TT (2) SEQ ID NO · 3之資料： (i )序列特性： (A) 長度：60鹼基對 (B) 型式：核酸 (C )股性··單股 (D )拓蹼學：線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (xi)序列描述：SEQ ID N0.3: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GGTCCTCACA GCTGCCCACT GCATCAGGAA CAAAAGCGTG ATCTT GCTGG GTCGGCACAG (2 ) S E Q I D N 0 · 4 之資料： (i )序列特性： (A) 長度：60鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（< ) (D )拓蹼學：線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (xi)序列描述：SEQ ID N0.4: CGCTGGACAG GGGGCAAAAG CACCTGCTCG GGTGATTCTG GG6GCCCACT TGTCTGTAAT (2 ) S E Q I D N 0 · 5 之資料： (i )序列特性： (A) 長度：50鹼基對 (B) 型式：核酸 (C )股性·•單股 (D)拓蹼學·•線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (xi)序列描逑：SEQ ID N0.5: GCTGTGGCAT TTTCAGGTGG AGATTTCAAG CGATTTGAGG ACAATTGCAG (2 ) S E Q I D N 0 . 6 之資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：50鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性·•單股 (D )拓蹼學·•線型 (ii) 分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X i )序列描述：S E Q I D N 0 . 6 : -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項
-訂
589380 A7 _ B7 五、發明説明（4 )
GTSTTTGAGC TAGCCAATTC CATAGTGCTC CCTTTTGATT GTCGAGATTA (2 ) S E Q I D N 0 · 7 之資料： (i )序列特性： (A)長度：60鹼基對 (B )型式：核酸 (C )股性··單股 (D)拓蹼學：線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X i )序列描述：S E Q I D N 0 · 7 : TCTTCCTCAC CCTGTCCGTG ACGTGGATTG GTGCTGCACC CCTCATCCTG TCTCGGATTG (2) SEQ ID N0.8之資料： (i )序列特性： (A) 長度：6G鹸基對 (B) 型式：核酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C) 股性：單股 (D )拓蹼學：線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X i )序列描述：S E Q I D N 0 · 8 : CAGGCTGGGG CAGCATTGAA CCAGAGGAGT TCTTGACCCC AAAGAAACTT CAGTGTGTGG (2) SEQ ID N0.9之資料： -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明) (i) 序列特性： (A) 長度：30鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓蹼學··線型 (ii) 分子型式：其他核酸（合成之DNA) (X )公開資料： (A)作者：Meyne，Julianne Moyzis，Robert K. (B )標題：原位雜交草案 (C)期刊：Meth· in Mol. Biol. (D )卷數：3 3 (E)頁數：63-74 (G)日期：1994 (x i )序列描逑：S E Q I D N 0 · 9 : 6TACTCACAC TAAGAGAATT GAACCACCGT (2) SEQ ID Ν0·10 之資料： (i )序列特性： (A) 長度：42鹼基對 (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓蹼學·•線型 (ii)分子型式：其他核酸（合成之DNA) -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項
本1) .ϋ Τ • i 589380 A7 B7 五、發明説明（d ) (xi)序列描述：SEQ ID N0.10:
ATGTGTGTAC TCACACTAAG AGAATTGAAC CACCGTTTTG AA (請先閱讀背面之注意事項_
本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

  1. 589380 Θ 8 8 99 ABCD 申請專利範圍 來自富含較高密度癌細胞之第二流體之較高密度 癌細胞以製備富含第一密度及較大密度癌細胞之 流體’ 其中該方法包含使癌細胞之濃度較流體樣本 中癌細胞對非稀少細胞之濃度增加至少約 5 0 0倍 〇 t 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進 行期間該癌細胞為活的。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該癌細胞 為上皮細胞。 4. 如申請專利範圍第 胞為***癌細胞。 5. 如申請專利範圍第 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 ψ 本 頁 項之方法，其中該上皮細 [項之方法，又包含使用至 少一由***細胞表現之***專一性標記定性 ***細胞。 6 ·如申請專利範圍第5項之方法，包含偵測前列 腺專一性抗原與***專一性膜抗原兩者至少之 7·如申請專利範圍第4項之方法，又包含使用由 ***細胞表現之細胞角蛋白標記定性***細 胞。 8 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中***專 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐) 589380 β 8 8 <59 ABCD 七、申請專利範圍 一性抗原與***專一性膜抗原之至少之一係以 專一性結合至該抗原之mRNA之核酸探針偵測。 9 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中該探針係 選自下列所組成之族群中：SEQ. ID. No. 1 ， SEQ. ID. No. 2，及 SEQ. ID. No. 6。 1 0 ·，如申請專利範圍第8項之方法，其中該探針 係選自下列組成之族群中：SEQ. ID. No. 3 ， SEQ.ID.N〇.4，SEQ.ID.No.7 及 SEQ.ID.No.8。 1 1 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中*** 專一性抗原與***專一性.膜抗原兩者至少之一 係以專一性結合至該抗原之抗體偵測。 1 2 ·如申請專利範圍第3項之方法，又包含使用 至少一著絲點專一性標記定性上皮細胞之倍數體 狀態。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之方法 專一性標記包含專一性結合至著絲I 序列的核酸探針。 1 3項之方法 其中著絲點 DNA之互補 請 閲 讀 背 之 注 意 事 項
    本 頁 1 4.如申請專利範圍第 包含 SEQ. ID. No. 5。 1 5.如申請專利範圍第 包含 SEQ.ID.No.10。 1 6.如申請專利範圍第 其中該探針 1 3項之方法，其中該探針 項之方法，其中該結合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐) 589380 :5988 59 ABCD 六、申請專利範圍 劑包含抗體。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 1 7.如申請專利範圍第1 6項之方法，其中該結合 劑包含至少二個來自動物之初級抗體，其能結合 至不同之非稀少細胞抗原。 1 8 ·如申請專利範圍第1 6項之方法，其中該結合 劑包含來自動物之初級抗體，其結合至非稀少細 胞，及來自不同於第一抗體之另一物種的二級抗 -抗體，其中該二級抗-抗體結合至初級抗體。 1 9 ·如申請專利範圍第1 7項之方法，其中至少二 個初級抗體能結合至人類非稀少細胞抗原，而結 合劑又包含能結合至二個初級抗體之二級抗體， 其中初級抗體來自不同於二級抗體之物種。 2 0 _ —種在包含癌細胞及非稀少細胞之流體中傾 測癌細胞之方法，該方法包含藉由如申請專利範 圍第1項之方法提供富含癌細胞之流體並分析該 流體以彳貞測該癌細胞。 2 1 · —種偵測***癌細胞之方法，該方法包含 藉由如申請寻利範圍第4項之方法提供富含前列 腺癌細胞之流體並分析該流體以偵測***癌細 胞。 2 2 ·如申請專利範圍第3項之方法，又包含測定 癌細胞中染色體之數目。 __'_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 589380 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 3 ·如申請專利範圍第4項之方法，又包含測定 ***癌細胞中染色體之數目。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 2 4 ·如申請專利範圍第2 2項之方法，包括測定癌 細胞中非整倍體之數目。 2 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中癌細胞 為人類肝細胞、肝細胞瘤細胞或肝上皮細胞瘤細 胞。 2 6 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該流體 為血液。 2 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其包含將增 加濃度之第二密度癌細胞之第二流體接觸包含能 結合至白血球及紅血球的抗體之結合劑，且自第 二流體去除已結合之白血球及紅血球以提供富含 較大密度癌細胞之第二流體。 2 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中細胞在 進行該方法期間為活的。 2 9 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中非稀少 細胞包括血球細胞。 3 〇 ·如申請專利範圍第2 9項之方法，其中該血球 細胞包括白血球及紅血球細胞。 31 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中第一密 度梯度具有範圍有約1 · 0 6 8克/毫升至約1. 〇 7 7 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 589380 Θ8 8 99 ABCD 六、申請專利範圍 克/毫升之密度，且第二密度梯度具有範圍自約 1.077克/毫升至約1.085克/毫升之密度。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 3 2 ·如申請專利範圍第3項之方法，其中上皮性 癌細胞為乳癌細胞。 3 3 ·如申請專利範圍第3項之方法，其中上皮性 癌細胞為腎臟癌細胞。 3 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中將第二 流體接觸該結合劑，包括將白血球及/或紅血球 結奋至磁性小珠上。 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐)
TW086104288A 1996-04-05 1997-04-03 A method for enriching rare cells by using density gradient and negative selection TW589380B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1492996P 1996-04-05 1996-04-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW589380B true TW589380B (en) 2004-06-01

Family

ID=21768614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW086104288A TW589380B (en) 1996-04-05 1997-04-03 A method for enriching rare cells by using density gradient and negative selection

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5962237A (zh)
EP (1) EP0891550A1 (zh)
JP (1) JP2000508171A (zh)
CN (1) CN1153064C (zh)
AU (1) AU2438497A (zh)
CA (1) CA2251186A1 (zh)
TW (1) TW589380B (zh)
WO (1) WO1997038313A1 (zh)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2236268A1 (en) 1995-11-30 1997-06-05 Chromavision Medical Systems, Inc. Method and apparatus for automated image analysis of biological specimens
US6718053B1 (en) 1996-11-27 2004-04-06 Chromavision Medical Systems, Inc. Method and apparatus for automated image analysis of biological specimens
WO1997038313A1 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 The Johns Hopkins University A method of enriching rare cells
DE19736691A1 (de) * 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen
GB2361996B (en) * 1998-10-29 2004-05-12 Cell Works Inc Multiple marker characterization of single cells
JP4495349B2 (ja) * 1999-01-28 2010-07-07 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 癌の遺伝マーカーを生物学的サンプルにおいて検出するための核酸配列
DE19904267A1 (de) * 1999-02-03 2000-08-10 Michael W Dahm Verfahren zur Anreicherung von Tumorzellen aus einer Körperflüssigkeit und dazu geeigneter Kit
US6960449B2 (en) * 1999-02-10 2005-11-01 Cell Works Diagnostics, Inc. Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use
AU4056500A (en) * 1999-04-01 2000-10-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods for detecting cancer cells
US6897062B1 (en) * 1999-04-09 2005-05-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research DNA encoding the prostate-specific membrane antigen-like gene and uses thereof
US20040058401A1 (en) * 1999-04-13 2004-03-25 Blaise Bossy Method for detecting rare event
FR2792332B1 (fr) * 1999-04-14 2001-07-27 Labonord Procede de preparation d'une suspension cytologique
ES2548381T3 (es) * 2000-03-27 2015-10-16 Thomas Jefferson University Composiciones para el tratamiento e imágenes de células de cáncer estomacales y de esófago
US6379550B1 (en) * 2000-07-24 2002-04-30 Health Research, Inc. Method for detecting PSA and its molecular forms using thiophilic gel
US7108969B1 (en) * 2000-09-08 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Methods for detecting and diagnosing oral cancer
ES2249494T3 (es) * 2000-11-22 2006-04-01 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Metodo gradual destinado a recuperar o eliminar sustancias biologicas por flotacion a partir de un medio coloidal de baja densidad.
AU2002326318A1 (en) * 2001-06-26 2003-03-03 Trustees Of Tufts College Targeting tumor cell antigens: antibodies useful for the diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
WO2003023057A2 (de) 2001-09-06 2003-03-20 Adnagen Ag Verfahren und diagnose-kit zur selektionierung und/oder zum qualitativen und/oder quantitativen nachweis von zellen
US7316932B2 (en) * 2001-10-01 2008-01-08 Stemcell Technologies Inc. Method for separating cells
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
US7452712B2 (en) 2002-07-30 2008-11-18 Applied Biosystems Inc. Sample block apparatus and method of maintaining a microcard on a sample block
WO2004029221A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
FR2846426B1 (fr) * 2002-10-28 2004-12-10 Bio Merieux Procede de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie
WO2005084374A2 (en) * 2004-03-03 2005-09-15 The General Hospital Corporation Magnetic device for isolation of cells and biomolecules in a microfluidic environment
JP2008526255A (ja) * 2005-01-13 2008-07-24 マイクロニクス， インコーポレイテッド 微量流体希薄細胞検出デバイス
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
EP1871870B1 (en) * 2005-04-08 2010-12-01 Medical Discovery Partners LLC Method for enriching rare cell subpopulations from blood
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
JP5457673B2 (ja) 2005-09-20 2014-04-02 ベリデックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ユニーク配列のｄｎａプローブを作製するための方法および組成物、ｄｎａプローブの標識、ならびにこれらプローブの使用
US9134237B2 (en) 2005-09-20 2015-09-15 Janssen Diagnotics, LLC High sensitivity multiparameter method for rare event analysis in a biological sample
DK2027470T3 (da) * 2006-06-02 2013-02-04 Pfizer Prod Inc Analyse for cirkulerende tumorceller
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US20080070792A1 (en) 2006-06-14 2008-03-20 Roland Stoughton Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis
US8110393B2 (en) * 2007-03-23 2012-02-07 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for separating and harvesting cells from a whole blood sample
PL2187965T3 (pl) 2007-08-17 2020-05-18 Purdue Research Foundation Koniugaty wiążący psma ligand-łącznik i sposoby ich zastosowania
EP2220505B1 (en) * 2007-12-10 2015-10-28 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Methods of diagnosing cancer
CN102313813B (zh) * 2008-05-20 2014-01-15 北京莱尔生物医药科技有限公司 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法
CN101587043B (zh) * 2008-05-20 2013-10-02 北京莱尔生物医药科技有限公司 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法
GB0811567D0 (en) * 2008-06-24 2008-07-30 Cytosystems Ltd Assay
DK2562268T3 (en) 2008-09-20 2017-03-27 Univ Leland Stanford Junior Non-invasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
CN110470835A (zh) * 2009-03-24 2019-11-19 生物概念股份有限公司 细胞捕获和分析的装置和方法
US20120100538A1 (en) 2009-03-24 2012-04-26 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
US9951324B2 (en) 2010-02-25 2018-04-24 Purdue Research Foundation PSMA binding ligand-linker conjugates and methods for using
WO2012024691A1 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 President And Fellows Of Harvard College Multiphase systems for analysis of solid materials
WO2012177656A2 (en) 2011-06-19 2012-12-27 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
CN103091491B (zh) * 2011-11-01 2015-01-07 李彦萍 鉴别从人或动物生物体液中富集的非血源性有核细胞的方法
US20150056649A1 (en) * 2012-01-13 2015-02-26 Konica Minolta, Inc. Method for quantifying cell of interest in blood, and method for evaluating system for quantifying said cell
ITRM20120028A1 (it) * 2012-01-25 2013-07-26 Natalia Malara Metodo per isolare cellule tumorali circolanti.
KR20150035537A (ko) * 2012-05-15 2015-04-06 디아테크 온콜로지, 엘엘씨 종양 세포 분리/정제 프로세스 및 이의 사용 방법들
JP6892218B2 (ja) 2012-11-15 2021-06-23 エンドサイト・インコーポレイテッドＥｎｄｏｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． 薬物送達結合体およびｐｓｍａ発現細胞によって引き起こされる疾患の治療方法
US9513291B2 (en) 2012-11-30 2016-12-06 Rarecyte, Inc. Apparatus, system, and method for collecting a target material
US9217697B2 (en) 2012-11-30 2015-12-22 Rarecyte, Inc. Apparatus, system, and method for collecting a target material
US20140272963A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Abbott Molecular Inc. Cell preparations and cell supports and their use in theranosis
US20150064153A1 (en) 2013-03-15 2015-03-05 The Trustees Of Princeton University High efficiency microfluidic purification of stem cells to improve transplants
CN105247042B (zh) 2013-03-15 2021-06-11 普林斯顿大学理事会 用于高通量纯化的方法和设备
WO2014145152A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Gpb Scientific, Llc On-chip microfluidic processing of particles
EP3495355A1 (en) 2013-10-18 2019-06-12 Deutsches Krebsforschungszentrum Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
US10948494B2 (en) 2013-11-07 2021-03-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for enumeration of rare cells
US10188759B2 (en) 2015-01-07 2019-01-29 Endocyte, Inc. Conjugates for imaging
EP3256849A4 (en) 2015-02-09 2018-12-05 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection related applications, analysis and diagnosis
US10976232B2 (en) 2015-08-24 2021-04-13 Gpb Scientific, Inc. Methods and devices for multi-step cell purification and concentration
KR20180114209A (ko) * 2016-03-03 2018-10-17 야스이키 우메즈 세포 증식법을 이용한 순환종양세포의 검출·분리취득방법
IT201700024609A1 (it) * 2017-03-06 2018-09-06 Mollace Vincenzo Metodo e kit per la diagnosi e/o prognosi di tumori non ematologici
KR101844188B1 (ko) * 2017-04-06 2018-03-30 재단법인대구경북과학기술원 미세 유동 장치
US10844353B2 (en) 2017-09-01 2020-11-24 Gpb Scientific, Inc. Methods for preparing therapeutically active cells using microfluidics
JP2020074694A (ja) * 2018-11-06 2020-05-21 東ソー株式会社 血液試料からの目的細胞濃縮方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4255256A (en) * 1978-12-13 1981-03-10 Antonio Ferrante Medium for the separation of human blood leucocytes
US4751001A (en) * 1984-09-24 1988-06-14 Becton Dickinson And Company Blood partitioning apparatus
US4888278A (en) * 1985-10-22 1989-12-19 University Of Massachusetts Medical Center In-situ hybridization to detect nucleic acid sequences in morphologically intact cells
US4927750A (en) * 1986-04-09 1990-05-22 Jeanette Simpson Cell separation process
EP0500727B1 (en) * 1989-11-13 1998-01-21 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal dna
US5153117A (en) * 1990-03-27 1992-10-06 Genetype A.G. Fetal cell recovery method
US5541072A (en) * 1994-04-18 1996-07-30 Immunivest Corporation Method for magnetic separation featuring magnetic particles in a multi-phase system
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
US5273883A (en) * 1991-05-07 1993-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for γ-globin typing
US5629147A (en) * 1992-07-17 1997-05-13 Aprogenex, Inc. Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
CA2140278C (en) * 1992-07-17 2009-03-17 Morteza Asgari Enriching and identyfing fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
DE4228389C2 (de) * 1992-08-26 1994-07-21 Kuebler Gmbh Dr Gewinnung und Kultivierung transformierter Zellen
US5275933A (en) * 1992-09-25 1994-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Triple gradient process for recovering nucleated fetal cells from maternal blood
WO1994009363A1 (en) * 1992-10-14 1994-04-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer diagnosis and therapy
JP4204642B2 (ja) * 1992-11-05 2009-01-07 スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ 前立腺に特異的な膜抗原
WO1994026104A1 (en) * 1993-05-14 1994-11-24 Aprogenex, Inc. Target cell isolation method
WO1995003431A1 (en) * 1993-07-19 1995-02-02 Aprogenex, Inc. Enriching and identifying fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
US5714325A (en) * 1993-09-24 1998-02-03 New England Medical Center Hospitals Prenatal diagnosis by isolation of fetal granulocytes from maternal blood
US5432054A (en) * 1994-01-31 1995-07-11 Applied Imaging Method for separating rare cells from a population of cells
US5648223A (en) * 1994-08-31 1997-07-15 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching breast tumor cells
WO1997038313A1 (en) * 1996-04-05 1997-10-16 The Johns Hopkins University A method of enriching rare cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000508171A (ja) 2000-07-04
WO1997038313A1 (en) 1997-10-16
AU2438497A (en) 1997-10-29
CN1221492A (zh) 1999-06-30
CA2251186A1 (en) 1997-10-16
US5962237A (en) 1999-10-05
EP0891550A1 (en) 1999-01-20
CN1153064C (zh) 2004-06-09
US20030119077A1 (en) 2003-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW589380B (en) A method for enriching rare cells by using density gradient and negative selection
US6682940B2 (en) Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells
US11098274B2 (en) Method and device for detecting circulating tumor cell
US20090081689A1 (en) Reagents and methods to enrich rare cells from body fluids
KR100523381B1 (ko) 태아 세포를 동정하는데 사용되는 항배아 헤모글로빈 항체
Geens et al. The efficiency of magnetic-activated cell sorting and fluorescence-activated cell sorting in the decontamination of testicular cell suspensions in cancer patients
JP4071824B2 (ja) 混合細胞母集団の細胞浮遊液内の特定標的細胞を分離して検出する方法
CA2140278C (en) Enriching and identyfing fetal cells in maternal blood for in situ hybridization
US5648222A (en) Method for preserving cells, and uses of said method
US20110195413A1 (en) Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample
US20090081632A1 (en) Method for Enriching Rare Cell Subpopulations From Blood
JPH05506144A (ja) 胎児細胞回収法
KR20040030984A (ko) 순환성 종양 세포, 단편 및 잔해의 분석
Koss et al. Koss's cytology of the urinary tract with histopathologic correlations
Adams et al. Precision microfilters as an all in one system for multiplex analysis of circulating tumor cells
US7351589B2 (en) Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells
JPH09510875A (ja) 母親の末梢血からの胎児細胞の培養および単離
Dore-Duffy et al. The microvascular pericyte: approaches to isolation, characterization, and cultivation
Heger et al. Guidelines for DC preparation and flow cytometric analysis of human lymphohematopoietic tissues
JP4590109B2 (ja) 細胞の単一パラメータ及び複数パラメーター表現型解析のための生成物と方法
US20220235420A1 (en) Compositions and methods for isolating, detecting, and analyzing fetal cells
JP2020512813A (ja) がんのスクリーニング、診断、治療、及び再発における巨細胞の核酸の特徴付けの使用方法
KR20180114209A (ko) 세포 증식법을 이용한 순환종양세포의 검출·분리취득방법
US20060234374A1 (en) Malignant Cells and Method for Selecting the Same
Fischer et al. Method for procuring specific populations of viable human prostate cells for research

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees