TW586930B - Pure 3R-3'R stereoisomer of zeaxanthin for treating macular degeneration in humans - Google Patents

Description

586930 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明之背景 本發明係屬生化學領域，且關於一種名爲玉米黃質（簡稱 爲zx)之黃色素的特定異構物。此色素若作爲藥品或維生 素投藥與人類，則可治療或預防所稱斑點變性之疾病，其 損壞視網膜且可能造成失明。 視網膜係排列於眼球背部之組織，其構造複雜且含有十 二層明顯層。其經描述及説明於許多醫學敎科書中，例如 吉丁格（Gittinger) 1988，瓦根（Vaughn)與艾布瑞（Asbury) 1992 (完整之引述列示於下文）。 名爲斑點之特殊ί幕狀區域（於人類中其直徑約爲1至1 5毫 米）係位於視網膜中間。斑點具有兩項能與視網膜其他部位 辨別之特徵。第一，斑點含有相對上少的視網膜桿；其大 多數之光接受器爲圓錐形（於非常接近斑點中心之小窩中， 無視網膜桿）。第二，斑點具有明顯之黃色，其係由兩種名 爲葉黃素與玉米黃質之色素所造成。此二者屬於一類稱爲 π類胡蘿蔔素”之分子。此等類胡蘿蔔素色素之化學係經討 論於下文，接續於斑點變性之概述後。 斑點變性 ”斑點變性”意指任何包含對視網膜中心内，黃色斑點區 域中之視網膜細胞或光接受器錐體，造成漸進損害之病 況。其經描述及説明於文章與敎科書中，例如，泰勒 (Taylor) 1993，吉丁格（Gittinger) 1988及瓦根（Vaughan)與 艾布瑞（Asbury) 1992。 有數種類型之斑點變性存在。最普遍之類型稱爲，，與年齡 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐 (請先閲讀背面之注意事項 本頁) 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ——__— B7 — 五、發明説明（2 ) 相關之斑點變性”，通常簡稱爲AMD(或於有些文章中稱 ARMD)。AMD可能以輕微喪失至完全失明之程度損害視 力。 有兩形AMD，通常指”濕”與”乾”形。濕形涉及微血管及 其他血管逐漸生長進入視網膜，以致瓦解並破壞視網膜層 之正當結構。雖然此形A M D可藉由雷射治療封閉新形成之 血管，但是雷射治療可能僅暫時延遲血管生長，且其通常 典法防止取後幾乎所有視力之喪失；濕形Α μ D大多數最終 苇導致完全或幾乎完全失明。濕形僅發生於罹患Α μ D病患 之5至1 0 %中。 另一形AMD稱爲，’乾，，形AMD。因爲其發生於所有案例 之至少90%中，故其常簡單地指爲AMD。雖然此形之 AMD—般不造成完全失明，但可能對病患之視力造成嚴重 損傷，而使病患有無法閲讀或確認，諸如朋友或親戚臉孔 等已熟知之物體。如此，常導致官能性失明，使人們無法 在公共場所安全地駕駛或行走，且無法進行正常活動。 亦有各種涉及以斑點變性爲病徵之疾病，包括史塔加病 (stargardt’s disease)，貝斯特病（Best，s disease)，貝登氏病 (Batten’s disease)，史約藍-拉森徵候群 syndrome)，視網膜錐_桿行爲異常，及羊蠟樣色素脂褐病 。描述各種此類疾病之文章，係引述於杜瑞（D〇rey)等人 1993中。此外，其他涉及溶小體儲存問題（如戴薩克司二氏 病）或漸進性神經細胞變性（如阿耳滋海默氏病）之疾病，亦 與斑點變性有關。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項馬本頁) 丨裝· 本 訂 586930 A7 B7 五 發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 终多此類疾病具有遺傳成因，經證明爲遺傳性；有些引 起此等疾病之基因已被分離出，且基因篩選測試能指示一 個人是否具有缺陷基因。任何經基因測試或家族歷史證實 ’攜帶或類似攜帶此類基因之人，具有高度罹患斑點變性 之危險。 藉由慢慢奪取人們之視力，AMD使其罹患者承受極大之 痛苦。每年在喪失生產力，及在加諸家庭成員，保險公司 ’社會局’及其他必須爲承受失明或嚴重視力損害人們， 提供或給予醫療費用或其他援助者之沉重負擔方面，皆耗 費上百萬美元。 以由AMD所造成之問題而言，科學家與醫師爲找尋治療 或預防，由斑點變性造成之失明及其他視力喪失的方法， 已達數十年。然而儘管該等努力已進行超過半個世紀之久 ，現今仍無可用之有效治療方法。 爹斷：隱結與脂褐質 斑點變性通常係以視網膜之特殊照片進行診斷。在一類 型衫斷方法中，醫師將螢光藥劑注射入患者體中，給與藥 劑循環通過患者全身之時間，然後對視網膜進行磁化攝影 ，稱作血管照片。然後醫師再分析照片以決定一或二類型 細胞碎屑之存在與濃度。 其中一類型細胞碎屑稱爲隱結（drusen)，其爲已知且已 被研究數十年。其形成兩種明顯形式。少量之硬隱結（直徑 小於6 3微米之小顆粒）通常出現於任何超過四十歲人之眼 晴中。除非以不正常濃度存在，否則硬隱結不表示視網膜 請 先、 閱 讀 背 面· 之 注 項

"Pi 本衣 頁I 訂 m

586930 A7 B7 4 五、發明説明（ 損害。 相反地，具有意義量之較大軟隱結沉積（亦稱作濕隱結） 指不’實質上之視網膜損害已發生或開始，因爲軟隱結之 大斑點會破壞與瓦解視網膜層之組織，而可能阻止視網膜 細胞接受正常來自血液之營養。其視網膜含有意義量軟隱 結之患者’一般經認爲已罹患斑點變性。 另一類型通常出現於罹患斑點變性患者之視網膜碎屑稱 爲褐脂質。褐脂質與A M D之關係僅在最近變得清楚（例如 ，瓦特（Weiter)等人1988，及杜瑞等人1993 )。 類胡蘿蔔素化聲 類胡蘿蔔素”包括一大類分子；自然界中有超過6〇〇種類 胡蘿蔔素已經確定。此等分子共有數種特性，包括： 1 ·類胡蘿蔔素係藉由將異丙烯之分子（一種5 _碳分子）偶 合而產生。因爲建立單位含有5個碳原子，所以大多數之 類胡蘿蔔素含有5之倍數個碳原子。 2 ·類胡蘿蔔素具有多數個不飽和鍵結。此使彼等能吸收 位於，藍色與近紫外光光譜範園内之高能量光波。 3 ·因爲類胡蘿蔔素吸收位於，藍色與近紫外光光譜範圍 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 内<波長，而不吸收位於光譜其他區域之較長波長，故類 胡蘿蔔素通常具有黃色，橙色，#色，或紅色。該名稱”類 胡蘿蔔素”衍生自類胡蘿蔔；第一個已知之類胡蘿蔔素經鑑 足爲使胡蘿蔔呈橙色之色素。由類胡蘿蔔素在溶液中所造 成之顏色，將視各種因素而定，包括其他化學品之濃度與 存在與否。 586930 五、發明説明（5 ) >4 ·類胡蘿蔔素具有，，經共軛之"雙鍵。此表示雙鍵與單鍵 ^ ^而使鏈中之各碳原子以雙鍵與另一碳原子連結，但 ”、、灭”另一奴皆以雙鍵連結。此排列可藉參酌圖1而了解 ，其列不胡蘿蔔素，ζχ，與葉黃素之結構。 不同類胡蘿範素具有不同程度之共軛，且一般，經較高 度/、軛之刀子，將提供較佳對抗由高能量光照引起之”光毒 害損傷·^保護作用。例如，於圖i所列示之三種類胡蘿蔔 素中，各分子之整個直鏈部分係以交替之雙鍵與單鍵共拖 。於胡蘿蔔素及ZX中，共軛延伸至兩末端環之第一個 鍵。相反地，葉黃素具有較低共軛程度，因爲其中一末端 環之雙鍵，不具有造成完全共軛知適當位置。2又與葉黃素 之差異僅在於其中一末端環（但非兩端）中雙鍵之位置。 匕因類胡蘿蔔素經設計與選擇（經由演化）以吸收藍光及近 紫外光之潛在有害能量，故其於自然界中被使用作爲保護 色素。其廣泛地發現於植物中，因爲植物的主要目的之一 在於，儘可能吸收最多陽光，而同時使由藍光，紫外光及 近紫外光照射造成之細胞損害減至最低。對植物之紫外光 照射損害是主要問題，而類胡蘿蔔素幫助使其減至最低。 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 由於類胡蘿蔔素十分適合保護對抗光毒性損害，故動物 亦獲得（經由演化）利用類胡蘿蔔素作爲光保護色素之方式 。因動物無法於其體内合成類胡蘿蔔素，其必須自植物來 源攝取類胡蘿蔔素（或類胡蘿蔔素）。点-胡蘿蔔素即爲一例 ;哺乳動物必須自植物，或自肉類獲得它。一旦進入哺乳 動物體中，卢·胡蘿蔔素即被轉化成其他分子形式，包括維 -8- 586930

生素A(視黃醇），其係藉由將胡蘿蔔素裂解成兩半 成。 類胡蘿蔔素經區分爲兩主要類，即胡蘿蔔素與葉黃素。 胡蘿蔔素不含有任何氧；其爲確實之烴類，僅由碳與氫組 成。相反地，葉黃素（如Ζχ&葉黃素）亦含有氧。 圖1列示Ζ X之左與右末端環中碳原子之序號。依慣例， 於左末端環中之碳原子自丨至6編號，而於右末端環中之破 原子以加撇符號數字編號，例如3,碳（發音爲，，三。 因爲Z X爲左與右末端完全對稱，故所稱”左，，與”右”僅爲簡 化討論<習慣用法。然而應注意，葉黃素並非對稱：位於” 左”環中之雙鍵位置與”右，，環中之雙鍵位置不同。 、 因爲ZX係藉由將兩個羥基，加至々·胡蘿蔔素兩末端之 #3碳原子上而形成，故其化學名爲3,3，_二羥基-卢·0 胡 蘿蔔素；有些化學家稱其爲胡蘿蔔素_二醇。此分子由於係 首先經鑑定爲，使玉米呈黃色之色素且玉米之學名爲玉蜀 黍（々a ，故所給予之名稱爲”玉米黃質”。 如上所指’然界中有超過6〇〇種類胡蘿蔔素已經確定。其 中許多在生化及商業上具重要性。zx與葉黃素在本發明中 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 訂 線 特別重要，因其存在於哺乳動物及其他大多數動物之視網 膜中。 葉黃素在商業上具重要性，因其廣泛地（以植物抽出物之 形式’主要得自盞菊屬植物）餵食予雞隻，以使其皮膚與即 黃更具黃色，而此係顧客及消費者所希望的。 ZX能具有相同之作用，且較葉黃素更有效，但是ζχ來 -9 Μ氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 源用於家禽飼料上已太昴貴。美國專利5,308,759及 5,427,783案（發明人爲Gierhart，讓渡予應用食品生物科技 股份有限公司（Applied Food Biotechnology，Inc ·)，爲本發 明之同一讓渡人與申請人）欲解決ZX太昂貴用於動物飼料 之問題。此等專利係關於，使用細菌來生產商業上使用量 之ZX，而使其可餵予家禽及魚類。 、 除了植物以外，有些類胡蘿蔔素係由慝應細菌合成。此 等細菌經進化於受陽光直接曝曬區域，且其類胡蘿蔔素與 於植物中相同扮演光保護角色。描述得自細菌之類胡蘿蔔 素之文獻包括麥德摩特（McDermott)等人1972，美國專利 5,429,939案（Misawa等人1995)及其他於該等文獻中所引述 之文章。 美國專利5,429,939案（Misawa等人1995)列示許多編碼涉 及各種類胡蘿蔔素（包括ZX)生物合成之酵素之基因的 DNA序列。各於製造ZX之主要基因（包括crtE，crtB，crtl ，crtY，及crtZ)之角色亦已描述。含有包含此等基因之質 體之細胞寄存於美國菌種保護中心（American Type Culture Collection)(例如 ATCC 19321 及 ATCC 39368)與日本之發酵研究中心 (Fermentation Research Institute in Japan) (^iJ 雀口大腸桿菌 FERM BP 2377)。 玉米黃質立體化學及異構物 類胡蘿蔔素化學之一項重要層面涉及’’立體化學”與’’立體 異構物”。此標題於任何有關有機化學之大學敎科書中皆有 _____-10- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X 297公釐] (請先閲讀背面之注意事項再本頁) —裝_ 本 訂 -線- 586930 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 解釋 當一有機分子具有一個，攜帶四個相異與其鍵結之原子 或分子基團之碳原子時，該碳原子即稱爲，，不對稱”碳原子 0 當不對稱碳原子出現於一有機分子中時，與該不對稱碳 原子鍵結之四個相異基團，可能已兩種排列方式之一排列 。此兩種不同排列方式稱爲立體異構物。其中一立體異構 物將使極化之光以右手”之方式偏轉，而另一立體異構物 將使極化之光以左手”之方式偏轉。造成右手式偏轉之異 構物稱爲R立體異構物（亦稱爲D立體異構物）。造成左手式 偏轉之異構物稱爲S立體異構物（亦稱爲l立體異構物）。 由於ZX中之#3與#3,碳原子皆爲不對稱，故其具有四種 可能的互體異構物。於3R-3，R異構物中，該#3與#3,碳原 子皆具有R組態。於3S-3’S異構物中，該#3與#3,碳原子 皆具有L組態。爲方便起見，於本文中此兩種立體異構物 稱作R-R異構物，及S_S異構物。 第三與第四種異構物爲兩種，，混合，，或内消旋”（一 r與一 s ) 異構物·· 3R-3’S，異構物及3S_3，R異構物。因爲ZX於其 約終點位置完全對稱，此兩種異構物於任何一相同；若將 3R_33，異構物畫於紙上，則將紙旋轉即將其變爲3S_ 3 異構物。事實上，單一之”内消旋”異構物係由S-R與 R - S異構物形成。 若使用標準化學合成技術來製造Z X，該四種可能異構物 將各以約全部之25%存在。然而，由於S-R與R_S異構物 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項本頁)

586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ------------ ---B7 五、發明説明7^1 " ~ - 實際上相同，故其”内消旋"異構物將形成全部之5〇%，而 R-R及S-S異構物將各以約25%存在。含所有此三種立體 異構物之混合物稱爲，，外消旋，，混合物。 但是，在視網膜組織中，類胡蘿蔔素之細胞與酵素專一 性相當精確，而且不同之異構物或立體異構物不可互相交 換。葉黃素與ZX被視網膜細胞視爲完全不同且顯著之分子 來處理，即使彼等在習知化學術語學中認爲係彼此之異構 物（因其具有相同之碳，氫，與氧原子數）。 由於生物學之因素，於本文中有關之異構物僅爲立體異 構物。本文中任何對玉米黃質”異構物”之引述係指2\之 特別互體異構物，而非包括葉黃素。葉黃素與zx經認爲係 完全相異之類胡蘿蔔素。 事實上’於類胡蘿蔔素中可能存在之細小，微妙及不明 顯的立體異構物差異，當其進入視網膜組織中時，即爲相 當重要。顯然’唯一適於被人類視網膜細胞吸收且利用之 ZXjl體異構物爲R-R異構物（3R-3，r立體異構物）〇 業已報導於視網膜組織中發現痕量Ζχ之内消旋（r_s)異 構物。然而’此等痕量大概係由於在有些情況下，可能自 然發生之某種分子轉變，而導致從葉黃素先驅物形成内消 旋玉米黃質（波恩（Bone )等人1993及1994) 0 於實驗室中，ZX之立體異構物可使用諸如不對稱管柱層 析術（波恩等人1993)或循環二色性分析（布利頓（Britton) 1994)之方法而彼此區別。 斑點中之玉米黃質與葉黃素 _________________-12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公襲） (請先閲讀背面之注意事項本頁)

訂 586930 A7 B7 經濟部中央檬準局員工消費合作社印製 五、發明説明（10 ) 於1970年以前，即已十分知曉類胡蘿蔔素在保護植物， 不哽光毒性損害方面所扮演之角色。亦已知類胡蘿蔔素存 在動物組織中’且所有存在動物中之類胡蘿蔔素最初係衍 生自植物，因爲動物並無法合成類胡蘿蔔素。基於此項資 訊’有各類文章指出動物與植物類胡蘿蔔素之間的相似性 ，並結論類胡蘿蔔素保護動物對抗光毒性損害。 經確認類胡蘿蔔素於動物中之光保護角色後，研究人員 開始研究類胡蘿蔔素於視網膜中之化學及角色。有一系列 實驗包含其中實驗動物餵予不含任何類胡蘿蔔素之飲食（由 不含類胡蘿蔔素之穀粒或種子，如高粱類種子製成）之試驗 。結果指示，任何黃色斑點區域，以及此等视網膜皆含有 異常高濃度之軟隱結，表示視網膜之損傷（馬利諾 (_1丨11〇你）等人1980，奇耳舒費德（幻讓脑1(1) 1982,哈姆 (Ham)等人1984，及史諾得力（sn〇dderly)等人1984)。鑑 於此等發現，研究人員建議類胡蘿蔔素似乎是健康視網膜 所必需。研究人員正進行搜集有關，胡蘿蔔素與綠葉蔬菜 有益於眼睛之古老格言之分子層面支持。但是，科學家至 今仍不明瞭斑點中之黃色色素是否必須以最終之形式分解 ’或其是否可能藉由使用其他先驅物，如胡蘿蔔素或番 茄紅素於動物中合成。 葉黃素於1949年經鑑定爲存在斑點中之黃色素之一（瓦德 (Wald) 1949)。ZX於許多年後始被確定爲另一種斑點色素 (波恩等人1985)。概述於1980年代中期或後期以前有關對 斑點色素之認知之文章包括韓德曼（Handelman)與德拉茲 (請先閱讀背面之注 意事項本頁 裝· 訂 線- -m i^i _ _ 讎13麵

586930 A7 B7 五、發明説明（11 ) (Dratz) 1986，威尼爾（Werner)等人 1987，庇斯等人（Pease) 1987，海格斯壯（Haegerstrom)-波特諾（p0rtn0y ) 1988，及 韓德曼等人1988。尤其，此等文章證實，ζχ(其爲完全共 軛，且因此較葉黃素具有更佳對抗由光能造成之損害的保 護作用）爲小窩（位於斑點非常中央之小區域）中佔多數之色 素。Z X之量逐漸減少，而葉黃素誠如一者同心地自小窩中 脱離移向斑點較外層區域而量漸漸增加，以致於斑點較外 圍區域中’葉黃素係優勢之黃色素。更進著眼於视網膜老 化與損傷之各層面，及特別針對類胡蘿蔔素作爲視網膜保 護劑之文章’包括史沛度托（Sperduto)等人1990，吉爾斯 特（Gerster) 1991，夏赫（Schalch ) 1992，及西頓（Seddon) 等人1994。 概言之，吾人知道葉黃素與ZX係斑點中兩種色素已達十 年以上，而經過十數年，科學家已思慮此等色素可保護斑 點對抗光毒性損傷。 然而，儘管此等發現與建議已超過十年，尚未發展出任 何類型藥劑，任何營養或飲食補給品，或其他已知有效顯 著地預防或延遲（更不用説逆轉）斑點變性逐漸生成之治療 形式。 先前之文句需要稍做限制，因爲卢_胡蘿蔔素，維生素A ，與維生素E，皆已知在幫助保護視網膜組織方面，具有 某程度之有益功效。·（參見，例如，美國專利5,3 10,764案 ，巴蘭諾茲等人，以及於下文引述之兩篇由眼疾案例控制 研究小組所著之文章）。此等專利與文章已宣稱或建議，0 14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 586930 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（12 -胡蘿蔔素，維生素A，與維稱素E在預防或減低與斑點變 性相關損害上，可能具有可偵測之功效。 由於類胡蘿蔔素，維生素A，與維生素E之普遍抗氧化劑 角色，此等宣稱可能爲眞。但是，亦不幸地事實是由A -胡 蘿蔔素，維生素A，與維生素E對視網膜所提供之助益非常 有限’且不足以達有效治療之程度。爲了所有實際目的， 變性斑點被認係無法預防，無法阻止，且不可逆的。任何 廣谱抗氧化劑（如卢·胡蘿蔔素，維生素A，與維生素E )僅 僅具減緩效果。因爲可使用者皆非眞正有效，該等維生素 已試圖用以減緩，由斑點變性造成之無情損傷（效果很有限 且不令人滿意）。 按照先前技藝，亦應注意，許多健康食品店販售標示作 爲對眼睛與視力有幫助之類胡蘿蔔素製劑。該項對於類胡 蘿葡素混合物之標示聲明可能有理，因爲（如上所示）々-胡 蘿蔔素與維生素A已知可用做爲普遍之抗氧化劑。然而， 並無市售可得之類胡蘿蔔素混合物含有多於相當少”痕，，量 (ZX。存在健康食品店中所售類胡蘿蔔素混合物之主要類 胡蘿蔔素，爲非-玉米黃質類胡蘿蔔素（主要是卢-胡蘿蔔素 與維生素A)。 一些重要政府機關與研究協會之立場及研究標的亦値得 «、切注意。在美國，國家健康學會（通過國家眼睛協會 (NEI)與國家眼睛諮尋評議會運作）最近發表兩篇報告，標 題爲”視力研究：國家計劃1994-1998 ”，NIH發表編號No, 1994 ;尤其參見55_65頁），及”與年齡相關之眼 (請先聞讀背面之注意事項再本頁)

-訂

A7 ____B7 五、發明説明（13 ) 睛疾病研究”，NIH發表編號No. ^^—(1993 )。此二篇 報告，及其所敘述之研究，皆針對以0 _胡蘿蔔素（而非ζχ) 作爲最有可能用於治療AMD之化合物。此外，ΝΙΗ及其他 税資機構分配上百萬美元於進行以々·胡蘿蔔素（而非ζχ) 作爲最有可能用於治療或預防AMD之藥劑的研究上。 其他値得受到注意之卓越研究人員係屬於，，眼疾案例控制 研死小組”。此小組最近發表兩篇文章，標題爲”抗氧化劑 地位與新血管與年齡相關之斑點變性”，Arch Ophthalmol 11: 104-109 (1993)，與”新血管與年齡相關之斑點變性之 危險因子”，Arch. Ophthalmol. 1〇 : 1701-1708 (1992)。猶 如在官方之NIH報告中，此等文章並未敎示或建議以玉米 I負作爲治療A M D之藥劑，且此學會亦已拒絕或刪除任何 用以研究以ΖΧ作爲可能用於治療或預防aMd之藥劑的研 究經費。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 亦應注意，對於類胡蘿蔔素用以治療或預防癌症（由皮托 (Peto)等人1981開始），及用以預防膽固醇形成與減低動脈 内斑堆積（佳爾拉（jialal)等人1991)方面，有很大興趣。有 許多文獻涉及類胡蘿蔔素之各種活性，且有興趣於化學合 成類胡蘿蔔素’包括葉黃素與ZX之方法。但是，儘管於過 去數十年致力於類胡蘿蔔素之研究及合成，仍未有報導任 何治療或預防斑點變性之有效方法。综觀由斑點變性加諸 罹患者與社會之龐大花費之痛苦，係一項很嚴重的問題， 且必須加以解決。 因此，本發明致力於一項可能地重要突破，提供（丨）一種 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） '' ' ~~ 586930 A7 B7 五、發明説明（ 14 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 用以治療業經診斷爲罹患斑點變性之患者之安全且有效藥 劑’及（2 ) —種可與維生素丸相比，可由任何想在到達或經 過中年後，減低可能罹患斑點變性危險者採用之營養補給 品。 蓋^素與玉米黃質之合成：先前技藝 各種先前技藝款項係敘述製造ZX之方法。此等款項可分 成兩個類組：發酵方法，其中微生物扮演製造方法中之關 鍵角色；及非發酵合成方法，其中使用純化學反應。大多 數先前技藝款項建議，ZX應用於已知目的上，例如作爲家 禽或魚類之飼料添加劑，用以增暗肉色並使其更吸引人。 顯然，該等努力並未使ZX以商業上量製造或販售。 於1995年10月，購買ZX(經純化形式或其中ζχ包含多於 約5 %以重量計之半濃縮形式）的唯一方式，係需要購買毫 克量之ZX’其產自專業化學公司如At〇mergic化學品公司 (Farmingdale，紐約）或光譜化學品製造公司（Gardena，加 州）。由此等專業製造商出品，經純化ZX(以含有不希望s_ S與S-R異構物之合成消旋混合物形式）之1995年價格爲每 毫克約90至約125美元。此價格換算成約（美金）1〇〇〇⑼元 ’每克以消旋混合物形式之ZX。顯然，此等製劑因爲其價 格及因爲其含有大量不希望且可能危險之s_s與内消旋異 構物’而無用作爲藥劑或營養補給品之現實潛力。於本發 明以如，播法公開得到以任何形式之經純化或僅半純化之 R-R玉米黃質。 敘述使用微生物發酵生產ZX之先前技藝款項包括·· (請先閲讀背面之注意事項 舄· 本頁) 裝· 、1Τ * I - - .................. -17- 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 ____B7 _五、發明説明（15 ) (1) 可力敦（Courington)與古得溫（Goodwin) 1995，最早 敘述以黃桿菌（F/avMacier)屬細菌製造ZX之參考文獻。 (2) 美國專利3,891，504(史考契（Schocher)與威斯（Wiss)， 1975，讓與 Hoffman LaRoche)亦敘述以黃样菌（F/avMacier) 屬細菌製造ZX。 (3) 美國專利3,841，967(達赛克（Dasek)等人，1974)與美 國專利3,951，743 (薛費爾（Shepherd)等人，1976)。皆讓與 雀巢公司（Nestle)。此等敘述可用以增加由細菌所製造Z X 產量的方法與營養物。 (4) 兩篇較近之美國專利（5,308,759與5,427,783，皆由吉 爾哈特發明），讓與應用食品生物科技股份有限公司，即本 發明之同一讓渡人與申請人。此等專利敘述一種分離自密 蘇里運河之菌株（F/avohcier/i/m 。此等細菌經 發現只製造，而不產生實質量之其他類胡蘿蔔素。此在使 肉類及卵黃具較深顏色之家禽與魚飼料方面很重要，因爲 類胡蘿蔔素在被動物攝食後，彼此競爭吸收進入血漿中。 因此，由吉爾哈所鐘定之F· 菌株產生無其他之 類胡蘿蔔素，可使更多ZX用作爲動物組織之色素，並因而 增加其功效與性能。 該美國專利5,308,759案申請一種使用AFB之尺 細菌，製造用於家禽或魚飼料之ZX的方法專利 。美國專利5,427,783案，分割案，申請飼料混合物之專利 。該二專利皆限定ZX用於家禽或魚飼料，且皆未建議任何 有關Z X治療人類之用途。 |_-18-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 本頁) -裝· -訂 586930 A7 B7______ 五、發明説明（21 ) 未眞正罹患A M D之患者而製備之單位劑量，可含有較少之 量’例如每劑量約〇· 1毫克至約2毫克。 任何此等劑量可以商業上合理之花費，使用本發明之揭 不提供。含有25毫克（或更少量）存在油性液體載體之膠囊 ’可以經濟的方法，使用微生物發酵配合溶劑萃取步驟而 製得。若使用較筇貴之純化，如實施例4所述之方法，則 亦可製得含有甚至較高量（例如每劑量100毫克或更多）之粉 末化調和物。 爲維生素或營卷補給品 於本發明第三層面中，z X可以維生素或營養補給品或食 品添加劑之形式製造與包裝，以應未眞正罹患斑點變性， 但欲減低其於生命晚期罹患斑點變性危險之人們消費。當 以此目的攝取時，適當量必須實質上高於存在現今健康食 TO店所售粉末中的極微量，但其將實質上低於當z X用作爲 業I 4斷罹患a M D患者之治療藥劑時所用之量。預期此等 劑量同樣地係介於約0.05毫克至約5毫克之範圍，以每曰攝 取<劑量爲基準。例如，當R_R玉米黃質爲存在综合維生 素膠囊中眾多試劑之一時，以0 05至1〇毫克之劑量爲適宜 ，而對於希望得較高劑量人們於藥店自行購得商品而言， 可使用1至5毫克之劑量。 不論其係用作爲治療藥劑或營養補給品，欲用於人類之 ZX製劑應含有R-R異構物爲唯一或，，佔極大多數，，之2\立 體異構物。本文中所稱，”佔極大多數之立體異構物”係描 述其中所希望ZX之R-R異構物，構成混合物中全部玉米黃 (請先閱讀背面之注意事項v •裝-- #馬本買) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

586930 A7 B7____ 五、發明説明（25 ) 包括極性有機溶劑。目前經確定最佳之溶劑爲四氫吃喃 (THF)，其逐漸地攻擊細胞並使分離膜之破壞步驟不再需 要。雖然於實驗室規模操作中使用THF時不需要攪拌，但 於溶劑混合步驟時攪拌，可能係商業上製造所必需。 亦已對其他溶劑進行測試，並將持績測試與評估，但至 今經測試者無與THF功能一樣良好的。對於此類用途，極 性有機溶劑似乎係最隹之溶劑。目前經測試之非環有機溶 劑（如丙酮及***），具稍低之溶解度，而諸如甲醇，乙醇 ，與己烷之溶劑，具有甚至較Z X低之溶解度。 一般，溶劑萃取作用包含，將溶劑與細胞糊或經乾燥生 物量，於使溶劑能儘可能溶解最多ZX之條件下混合。接著 於此步騍後，將溶劑可溶之液體部份，使用諸如離心或過 濾之機械方式與固體分離。可將固體丟棄，或作爲其他方 法步驟（若希望，包括重複溶劑萃取循環）之餵料。然後將 液體部份處理以去除溶劑，通常係籍由蒸發。此殘留下含 有R-R玉米黃質之黏稠狀油，以及其他被溶劑自細胞糊抽 出之溶劑可溶組成。當於對含有1至3% Ζχ(以重量計）之 細胞所進行之單相萃取方法中，使用THF作爲溶劑時，及 當後續將THF以蒸發移除時，所形成之液體含有約5%至 約2 0 % Z X (以重量計）。 另一類呈現良好預備結果之溶劑萃取法，包含使用超臨 界液體（即，於大氣壓力下爲氣體，但於昇高壓力下轉變成 作爲溶劑之液體的化合物）。二氧化碳爲最普遍用於超臨 萃取法之溶劑，且可利用商業上規模之c〇2萃取***。於 __ -28· ^氏張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210x^7公釐）一^----_ (請先閱讀背面之注意事項 I I I I 本頁) ,ιτ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 586930 A7 B7 五 、發明説明（26 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此類系統中，將經液化之二氧化碳於高壓反應容器中，與 細胞糊或經乾燥之生物量混合。然後將液體通過一系列， 以逐步方式減低壓力之小室。ZX於相當高之壓力下自溶液 沉緞出，而大多數其他細胞固體仍保持溶解於超臨界液體 中。ZX沉澱可於較早之去壓力步驟時收集，然而大多數雜 質仍溶於二氧化碳中，且將在移至下一再度減壓之反應室 時，於溶劑中被帶走。超臨界溶劑萃取法之效果，可進一 步藉使用攜帶劑（如乙醇，丙二醇，或乙酸乙酯）而增加·。 預先已對數種此類攜帶劑進行測試，且已顯示實質上增加 ZX於超臨界二氧化碳中之溶解度。 雖然二氧化碳爲最普遍使用之超臨界劑，然而爲相同目 的’亦可於商業上規模之系統中，使用各種其他化合物（包 括各種氮或氣氟碳化合物）。任何當壓力之作用而具有氣態 與液態相之化合物，皆可經測試其用於上述細菌發酵方法 後，以超臨界萃取法之ZX純化作用的適合度。 若希望，可將含有ζχ之油性液體（藉由溶劑或超臨界萃 取而產生），與親脂性載體物質（如植物油）混合，然後包封 於爲人類攝取而設計之膠囊中，毋需任何進一步ZX之純化 。此將提供製造可用於人類，呈一種對罹患斑點變性之人 們之藥劑’或呈一種對想減低可能於生命後期罹患斑點變 性危險之人們之維生素或營養補給品，之半純可消化形式 之R-R玉米黃質的適宜且經濟之方法。 又’可將半純形式之R_r玉米黃質進一步純化，以增加 ZX濃度及去除任何雜質。此可藉由諸如使用兩種經選 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X291?公釐） (請先閲讀背面之注 意事項本頁 •裝.

、1T • 111 I................... II 1--- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 586930 A7 ------- B7 五、發明説明（27 ) 擇溶劑之組合的二溶劑系統；（2)結晶作用或吸附於物質（ 如織物濾床）上促使ZX結晶之作用；或（3)逆流層析術之方 式完成。由申請人用以純化ZX之R_R異構物達約98%的層 析術方法，係敘述於實施例4中。 其他用於另外類胡蘿蔔素之純化技術，經揭示於美國專 利 5,3 82,714(卡吉克（Khachik) 1995)與 4,851，339 案（希爾斯 (Hills) 1989)中。任何此等爲其他類胡蘿蔔素所設計之純 化技術，同樣於純化ZX上給予良好結果，因爲如圖i所示 ，卢-胡蘿蔔素，葉黃素，與ZX之間具有化學相似性。 施用之形式 使用諸如每日或每週膠囊之攝食形式，或使用經ζχ補充 (食品或食品添加劑（如下所述）之口服攝食，爲將ζχ施用 於人類的較佳形式。此類攝取毋需於固定間隔期（如每日或 每週）規律的攝取，但是傾向使兩次劑量之間經過合理時期 (如一或多天，較佳地少於一星期）之偶然或間歇攝取，因 而使ΖΧ適當且逐漸以少量堆積於斑點組織中。作爲維生素 補給品，以單一劑量可能有幫助，然而經過數年之期間， 單一劑量必不如間歇攝取適當少劑量般有幫助。對於類胡 蘿蔔素於人類與測試動物中之吸收的研究暗示，由於血液 濃度所顯示之”裝載”因素，每日攝取較每週或其他間歇攝 取爲佳。 因爲類胡蘿蔔素之營養攝取易於相對地低，可能對於特 定患者（如罹患嚴重斑點變性之患者）在醫藥上希望使用其 他投藥形式，例如肌肉内注射，或植入緩慢釋放裝置。若 ________ - 30 - ^紙張尺度適用中國國家標準（規格(210X297^#^ 一 一 ---- (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) _裝· 、?! 586930 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

選擇此類途徑，適宜之載體調和物可包括水，緩衝劑，及 具有多數#基之化合物’例如丙二醇，糊精，或環糊精化 合物。 可使用各種用於人類口服攝取之包裝形式，只要任何此 形式能保護ZX不受氧化，且適度考慮到含有2又液體之油 性，厭水之本質。 適於人類攝取之組合物實例包括： (a )可消化之防水膠囊與其中所含之液體，其中該膠囊與 液體係經尺寸化，及經設計用於人類口服攝食，且爲醫藥 可接受者，而其中該液體含有ZX之R_R異構物，以及作爲 稀釋劑之載體液體’如植物油。若希望，存在此類膠囊中 之ZX，可包封於膠團中，或呈微封膠之形式（以如實施例9 或1 0所述之方法製得），以助於保護ZX於胃中不被消化。 若希望此類膠囊可由相對上堅固，較硬之物質製成；另外 ’其當習知用於含有維生素之膠囊中時，可由柔軟之物質 製成。若包封膠囊係由可忍受胃部酸性，且於進入小腸後 可被酵素消化之物質製成時，則z x可受保護不會在胃内被 酸改變或分解，且可增加膠囊中ZX之生物可利用性。然而 ’已知至少有一部分zx以經咀嚼之蔬菜物質成分進入胃中 ’而可未受損害地通過胃部；因此，並不一定需要保護ZX 對抗胃部酸性。因爲使用本發明所述之微生物，可生產有 效無限量之R-R玉米黃質，故選擇較佳膠囊物質將比科學 上之命令更具經濟取向。 (b)爲人類口服攝食所設計之片劑，其中該片劑含有ZX

(請先閲讀背面之注意事項\^寫本頁)

P 裝·

、1T 線

• ί I HI 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ----------B7 五、發明説日Κ29) ' ~~~—- 之R_R異構物，以及可與玉米黃質相容，且使玉米黃質盥 該黏合劑物質之混合物在適當壓力下壓縮後，保持其形狀 之可壓縮黏合劑物質，且其中該片劑爲醫藥上可接受者， 並經預先尺寸化以用於人類之口服攝取。若希望，該片劑 可具有使片劑於通過胃部進入小腸後仍保持完整之腸包衣 ，以助於保護zx於胃中不被消化。 (c) 欲用於人類口服攝取之組合物，含有爲人類消費之食 品物質，其爲營養上可接受且較佳地口感良好，其適合作 爲玉米黃質之載體，且其含有R-R玉米黃質爲營養添加劑 。ZX爲一種橘黃色色素，具有一般與植物油，香酥油，及 難油月曰相同之厭水特性；其亦與廣泛使用之類胡蘿萄素著 色劑，如/?_胡蘿蔔素相似。於是，其可作爲營養著色劑添 加至坪多各觀食品物質中，例如人造奶油，酪農產品，糖 漿，製餅生麵團，不再經劇烈燒煮之肉類製備物，及湯類 成分。其他適宜之食品物質可包含顆粒調和物，例如作爲 湯，沙拉，烘烤麵包等之添加劑，而含有鹽或香料之調味 混合物。於此類顆粒調和物中，若希望該ZX可具有保護性 包衣’以減少玉米黃質被胃酸分解。 (d) 包含用於人類口服消費之食品的組合物，該食品含有 可能爲完整，對人類無致病性，且含有玉米黃質R_R異構 物之微生物細胞。此類食品可選自乳路，酸奶絡，牛乳與 啤酒。若希望該等微生物細胞可爲活的，或已經過巴斯德 殺菌法殺死。 其他包裝形式亦合適，且可較佳用於各種用途上。有關 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 < 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁} •裝_ M693〇 五、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 發明説明（ (3) 雖然鵪鶉之視網膜較人類視網膜小許多，但由於存在 ZX與葉黃素，整個鵪鶉視網膜爲黃色。此有效地使整個鵪 4視網膜可作爲位於人類視網膜中央，小斑點區域之模式 ’且使得分析與觀察更加容易。 (4) 日本鶴鶉視網膜無血管，且具有與人類視網膜小窩區 域相似之結構。 (5 )曰本鵪鶉雌性之壽命大約爲1至丨5年，而雄性大約爲 3至4年。此可提供縱向研究老化過程，而其在其他較長壽 之種類中，將非常困難進行。 此等因素更詳細討論於懷特（Fite )等人1991與懷特等人 1993 中。 此等活體内試驗係敘述於實施例5至8中。至今所得之結 果良好，且明白地指出，由本發明所揭示F/a⑽ 細胞製造之R-R玉米黃質（1)於口服攝取後，適 當地沉積於斑點中，且（2)高度有效保護視網膜細胞不受光 毒害。 此外，如實施例8中所討論，初步結果指示，R_R玉米黃 質在保護視網膜細胞不受光毒害方面，遠比胡蘿蔔素有 力及有效。當胡蘿蔔素以高劑量餵予試驗動物時，由卢 -胡蘿蔔素所提供之小量保護助益，甚至無法達到實質上具 有w義之水準。相反地，當R - R玉米黃質以相同劑量銀予 動物時，其完全阻斷並防止視網膜細胞損傷指示物與經測 量之死亡指示物。 R - R玉米黃質之微生物來源 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X ：W公釐） (請先閲讀背面之注意事項v 裝-- |寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 586930 五、發明説明（ 分鐘，進行巴斯德殺菌法。此步驟殺死細菌，而不破壞其 已製造之z X。然後將培養物冷卻至室溫，並以交叉流動微 過濾系統之方式，將含有ZX之細胞及存在培養液中之其他 固體與液體相分離，其將細胞/固體濃度從約i 0至i 5 %之 最初値，增加至約60至80%之過濾後濃度，以體積計。此 方法產生一種細胞糊劑，其亦含有某些來自營養培養基之 殘餘固體。對於餵予用於試驗之日本鵪鶉的Z X製劑而言， 如實施例5 _ 7所述，將細胞糊劑冷凍至_ 7 〇 °C，然後於2 5 °C 下完全眞空中冷凍乾燥，以製得含有約【至丨〇% ZX(以重 量計）之乾生物質。於過去之試驗中，各批中Z X含量係個 別地測量’且將具有不同濃度之批份組合並共同混合，以 確保用於日本鵪鶉試驗之恆定濃度。 爲製造用於人類攝取之ZX，使用溶劑萃取法，以產生一 種具黏性之油性液體，如實施例3所述。 實施例3 :成爲油性液體之半純化作用 待於實施例2所述已製得細胞糊劑後，可將其以任何不同 之方式處理。如上所述，若希望，可藉由諸如超音波震盪（ 高頻率音波），高壓，或研磨（將細胞之溫度保持於3 〇。(：以 下，以防止氧化）之方式將細胞膜破壞以將細胞碎開，並使 更容易獲得Z X。然而，當於溶劑萃取步驟中使用四氫吱喃 (T H F )時，則不需要進行此步驟，因爲τ H F於破壞細胞膜 方面非常有效，而不借助於機械方式。於實驗室規模操作 中使用THF時不需要攪拌，但是，同樣地，於溶劑混合步 驟時攪拌，將可能有助於商業上製造操作。 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^寫本頁) •裝· 、v5 586930 A7 B7 五、發明説明（40 ) 於目前所完成之試驗中，THF萃取法包含將約8至20體 考貝經純化過濾之T H F與一體積含有6 0 · 8 0 %固體之細胞糊 W ’於低於2 5 °C之溫度下混合2至2 4小時。τ H F逐漸地侵 害細胞，產生一種具有柔毛狀固體懸浮液之液體。於至多 20,000重力下離心數分鐘後，可藉由乾燥將大部分thf去 除。剩餘之T H F可於眞空下蒸發，而剩下具黏性油。當含 有1至3 A Ζ X之細胞糊劑，於一次通過操作中以τ η ρ萃取 法處理時’所得之油通常含有約5至20% ΖΧ，以重量計。 燥粉末形式之高度純化玉米黃質，具有 物的製備 呈乾燥粉末形式之高度純化玉米黃質製劑，係藉由以液 m層析術之方式（如下述），處理實施例3所述經τ η ρ萃取 之油性液體而得。將含有ζ χ之油性液體溶於己烷中，然後 通過3有天然氧化銘粉末之層析管柱。使用兩倍管柱體積 (己烷清洗管柱，以去除類胡蘿蔔素雜質如胡蘿蔔素與 番蘇紅素，以及脂質與其他污染物。然後將以8〇 : 2〇之己 烷：丙酮混合物通過該管柱，以使Ζχ釋出。將移出之溶解 Ζ Χ於眞S中乾燥。層析術分析指出爲至少9 8 %純之Ζ X ; 僅能偵測到及少量其他不純物。 待於相對上不受保護之狀況（通常係於正常冷藏下，以適 當頻數移出取樣，且不含任何抗氧化劑，及不採取任何阻 止與大氣中氧接觸之預防措施）中儲存大約六個月後，將此 Z X製劑之樣本寄予於佛羅里達國際大學邁阿密分校之約翰 藍卓（John Landrum)博士，以進行立體異構物分析。其使 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公羡） (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) •裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^»6930 A7 、發明説明（41 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 有胺甲酸酯何生物之不對稱管柱層析術之分析 月長時間未受保護之製劑含有92奶。所出現 胡：ΐ:::先溶析出之酮基·類胡《素；酮基-類 丄個接附於類胡蘿《素某處之額外氧原子， 备=胡，素於未防止氧化之下儲存時’其增升爲共 、 '力藍卓博士之不對稱分析指出100%存在製劑中 =ΖΧ為ReR異構物。無可«量ΖΧ之不希望S.S或S-R立 月豆異構物存在。 據了解’雖然如上所述，色層分析純化完全可行且高度 效率’但不十分適合以商業上量製備高度純化之zx。一 種經發展出用以純化葉黃素之替代方法’敘述於美國專利 5,382,7U(卡吉克（Khachik) 1995 ;亦參見卡吉克等人1991) 中，提供一項用於評估商業上製造用途之良好選擇方法， 二係夫一-谷劑萃取系統中使用冰凍之乙醇-水混合物，接 著進行冷凍乾燥。 5 · .iJL黄質於日本鵪鶉之試驗，使用不同之飲令 兔 所有涉及日本鵪鶉之試驗，皆於哈瓦得醫藥學院（波士頓 ，麻薩諸塞州）之薛分斯（Schepens)眼睛研究學會，與應用 食品生物科技股份有限公司（本申請案之讓渡人）所簽訂之 契約下完成。所有處理及對照組，實質上皆含有有意義數 量之鳥類。大多數情形下，對照組與處理組之數量相同。 缺乏類胡蘿蔔素之鳥飼料係得自purina Mills (聖路易市， 途、蘇里州）。此等鳥飼料係僅爲實驗用途而售，且藉由使用 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇χ297公釐

i HI- —ϋ —ϋ ϋ -------*----裝-- (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) -訂 586930

B 44 五、發明説明（） 表 飲食 類胡蘿蔔素濃度(微克/克） ZX Lutein "Cryp β -Car Canthax Lycop 對照組 (C+) 0.59 1.55* 0.11 0.24 0.00 0.00 缺乏 (C-) 0.26 0.59* 0.00 0.00 0.00 0.00 玉米黃質 (ZX+50) 67.60 0.59* 1.90 3.00 0.00 2.90 玉米黃質 (ZX+5) 6.74 0.06* 0.20 0.28 0.00 0.27 (請先閲讀背面之注意事項\^寫本頁) 關鍵 zx = 3R_3’R-玉米黃質 β -Cryp = -隱黃素 /3 - C = -胡蘿蔔素 Canthax^ 難油黃素 Lycop = 番蘇紅素 氺=： 暫時之鑑定。此可能亦爲玉米黃質之 順式-異構物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 所有鳥類皆成長並保持於正常之繁殖用籠中。除了下文 所指示者以外，將其維持於正常白光光普照射下，範圍爲 每曰1 0至1 4小時。 實施例6 :以口服攝取之玉米黃質於視網膜之堆積 進行化學分析，以決定Z X (與其他類胡蘿蔔素）堆積於實 施例5所述各飲食組鳥類視網膜中之濃度。 爲完成此等分析，將已自缺乏類胡蘿蔔素蛋孵化，且已 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 586930

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以其各別之飲食餵養生長至少二 , < —丄、 y 個月 < 鳥類，經由斷頭法 设死。藉由將摘出之眼晴解立丨 ㈢鮮4而取出視網膜，並將得自單 一視網膜之組織。使用玻璃或具四1乙晞（TEFL〇NTm)杵 ，於250微升去離子蒸麻中研磨至幾近均質。取出㈣ 升均質物，並用於分析均質物之蛋白質，以將得自各不同 視網膜樣本之結果正常化。將25〇微升含有2% w/v五倍子 纷之甲醇與5G微升6G%w/v氫氧㈣加至剩餘之24〇微升 視網膜組織樣本中。將混合物於水浴中於7代下加熱一小 時’然後將500微升50% ν/ν乙醇加入，接著將2毫升己燒 加入。將混合物漏動以充分混合，然後令其靜置於代下 直到分層發生。將含有己烷與經萃取之類胡蘿蔔素，生育 酚，及視黃醇之表層（即，浮於其他液體頂端之較輕相）取 出。將另外2毫升己烷加至组織均質物中，並將混合物渦 動及令其再次分層。將此表層取出，並與第一次的組合。 方；弟一萃取循$衣中，將此程序再重複一次，以確保完全萃 取出類胡蘿蔔素，生育酚及視黃素。 然後將組合得之己烷萃取物以1毫升水萃洗，以去除殘餘 之氫氧化神。將另外1毫升己垸加至該己燒·水混合物中， 然後以滴管小心地將己烷層（表層）取出。將己烷於氮氣之 怪定蒸汽中蒸發。剩餘之殘餘物含有類胡蘿蔔素，生育酚 ’視黃醇與其他未經鑑定之己烷-可萃取化合物。然後將此 殘餘物溶解於溶劑（甲醇··三氣甲烷：三乙胺）中，並如上 所述以HPLC分析。 結果列示於下表2中，其亦顯示於高密度光曝照後之損害 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項^^寫本頁) 裝· 訂 586930

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 並且必須以足夠保護視網膜組織不受光毒性損害之量，由 鳥類眼睛中的視網膜細胞吸收。所有此等障礙，皆由本發 明所述經細菌發酵之R_R玉米黃質製劑解決。 藉由R-R玉米黃質之保 將各飲食組中有些鳥類，於2〇〇〇至3〇〇〇lux下，使用包 含1小時光照接著2小時幾近完全黑暗之循環，接受高密度 可見光28小時。接著光循環期後，於犧牲前， 幾近完全黑暗中14小時。於預先之試驗中，已== 類胡蘿蔔素缺乏組鳥類中十分嚴重損害，而於對照組（正常 飲食）鳥類中適度損害之高密度光曝照量。亦於預先之試驗 中已測定得，爲測量於未受保護（類胡蘿蔔素缺乏）鳥類中 脱噬錐體核之最大數量，光照後的14小時時期是需要的。 餵食對照飲食之鳥類證明，大約曝曬後24小時達到最大 脱嗤作用，而餵食補充以ZX之飲食的鳥類證明，於大於 24小時甚多以後始達到最大脱噬作用。所能測得於損害前 之時間延長，其本身爲ZX保護功效之強力指標。 將從此等鳥類得之視網膜以顯微解剖分離，固定於二甲 苯中並於包埋於paraplast (Oxford，56°C)前，先於乙醇中乾 燥。然後將paraplast中之視網膜組織切片，然後以高遼氏 (Galiyas )1990之方法，或以破化pr〇pidium染色以看得見緻 金核’其爲脱嗤從用之特徵。計數於4〇〇χ(線性）放大倍率 ，單一顯微鏡視野内所能見之緻密核數量。每一處理組計 數至少6至8個分別視野，並求得平均値。 於表2中，結果明白地證實，視網膜細胞之死亡與損害： -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項^^寫本頁} 裝_ -訂 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（49 ) 實施例9 :吸收增進劑之形成 直徑小於1微米，且僅含有所希望玉米黃質R · R異構物之 含玉米黃質”膠微粒”，可自生物質之溶劑萃取物或實施例 3所述油性液體，藉由使用特定類型膽鹽，如歐爾森（〇is〇n) 1994所述獲得。可將含有R_R玉米黃質之油性液體與適當 膽鹽’如由紐澤西州哈肯薩克之馬可發展公司（Marcor Development Company of Hackensack)，販售之甘胺-或牛 磺膽酸鹽之磷酸鹽混合，或使用含有膽鹽混合物之膽囊抽 出物，如艾荷華州戴文波特之莎茲曼公司（Salzman Corporation of Davenport)販售者。此膽汁物質可與溶劑萃 取物或油性物質，及與特定其他鹽類包括氣化鈉，氯化舞 或氣化鉀混合。然後將此混合物於含有混合裝置如旋轉槳 之機械均質機中，於例常實驗（藉由分析由各種槳大小與形 狀，轉速，及時間之組合所產生的膠微粒大小範圍）中，可 達最佳之旋轉速度與時間下處理。若需要，將所形成之膠 微粒乾燥去除溶劑，然後使用載體或稀釋液體如植物油稀 釋承任何所希望之濃度。然後可將此混合物封於膠囊或其 他助於呑食且保護所成之膠微粒對抗胃酸分解之裝置中。 亦可使用其他乳化劑與脂質，以形成具有小粒子尺寸之 乳欣。可使用諸如吐溫與史潘（Spans)之非離子界面活性劑 ，如歐爾森1994所述，以及諸如磷脂與神經鞘脂類之脂質 物質，其將形成具有小（小於丨微米）尺寸之脂質小囊胞。 實施例1 0 :經微封滕:夕互米黃質 此實施例描述呈經微封膠形式之玉米黃質。微膠囊爲範 —-----------· 52 - 本紙張尺度適财關家縣（CNS ) A4規格711^7公董） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁} -裝 586930 A7 B7 五 、發明説明（ 50 消 圍自10至1000微米，由經由包被物質或殼，可由不同化合 物如明膠，***膠，澱粉，玉米醇溶蛋白（一種得自玉: <蛋白質）等製備得，微封膠之核心物質（如R_R玉米黃質） 組成。於製備外殼材料時，亦可將其他化合物加入，以助 毛、、隹持所成製劑之形狀，組織，穩定性，或其他所希望之 性質。此等化合物可包括乳化劑，葡萄糖醇，抗氧化劑如 TBHQ或2-[1，1·二甲基]]，4-苯二醇，或膠化劑如角叉菜 將純或經部分純化之玉米黃質溶解於適當溶劑，如乙 ’丙酮或THF中。一旦將已溶解之玉米黃質加至水中， 溶液中即形成直徑小於10微米之微晶體。若於將存在溶別 中《玉米黃質添加至水時，以高頻率於乳化劑如吐溫8〇存 在下進行超音波震盪，則增進此方法之效果。 :旦微晶體形成後，將外殼材料加至該含水，玉米黃質 與落劑之混合物中。對於有些外殼材料，如 混合物維持於域高之溫度下至多二小時。一旦外：將 =全溶解後’將全部混合物置於超音波讓；5 1 〇刀鐘，以將晶體再乳化。 何含核心與外殼材料之混合物使用 巴完成，例如噴霧乾燥，或使用 克（Sparks)等人於美國專利？^〇 4 ο; μ 方法乾燥。噴霧乾燥器普遍用於食品與飼科工；：J 二由::編⑽T維持於特定溫度之盤(大概Ϊ )成《^°其^每分鐘至Π)，刪次旋轉 醇 於 劑

訂 材 至 任 史 盤

本紙張尺度適财® -53- 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 » B7 五、發明説明（51 ) (rpm)之各種速度範園下操作。當轉速於如4000 rpm下， 將含核心與外殼材料之混合物加至盤的中1央。當液體與經 加熱之旋轉盤接觸時，即形成微膠囊。將微膠囊藉由離心 力自盤的中央射出，並收集於已預先塗覆一層”收集”或" 捕集”劑如厭水性澱粉或3¾精之平坦表面上。然後將裱膠囊 ，藉由尺寸篩網，與捕集劑分離。將微膠囊置於容器中，以 防止受到光照與空氣，並於冷蕤狀況下儲存，直到測量成 爲用於口服攝取之膠囊。 。 因此，已列示與描述,一種新穎且有用以製造含有用於人 類攝食之玉米黃質的醫藥品之方法，以及含有.經微生物合 成之R-R玉米黃質，用於預防或治療斑點變性之調合物。 雖然本發明已爲説明與、敘述之目的，例舉引述某些特別 具體實施例，但對習於該項技藝人士而言，各種對所説 明實施例進行之可能修飾，改變，及相 > 物係顯而易知 的。任何直接由本發明敎授所衍生，且不脱離本發明精 神與範圍之改變，皆視爲涵蓋於本發明中。 參考文獻

Bauernfeind, J.C. (ed.), Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors: Technological and' hhitritional Applications (Academic Press, New York, 1981)

Bone, R.A., "The role of the macular pigment in the detection of polarized light,n Vision Research 20： 213-220 (1980)

Bone, R.A., et al, "Preliminary identification of the human _-54- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐了 (請先閱讀背面之注意事項^!|寫本頁) 裝·

、1T 586930 A7 B7 五、發明説明（52 ) .macular pigment, n Vision Res.. 25 ·· 1531 -1535 (1985)

Bone, R.A., et al, "Analysis of the macular pigment by HPLC： retinal distribution- and age study, n Invest. Opthalinol · . €ci. 29: 843-849 (1988) ' - / Bone R.A., et al,· nStereochemistry of the macular carotenoids , " Invest. Ophthalmgl. Vi^. Sci% 34 ： 2033-2040 (1993) 、 Bone, R.A. , et al, "DistrilDUtion of macular pigment stereomers in individual eyes, including those with age-related macular degeneration (AMD) , 11 ARVO Abstracts Invest. Ophthalmol. Vis . Sci. 35: 1502 (1994) di Mascio, P·, et al, HLycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher,n Archives of Biochemistry and Biophysics 274： 532-538 (1989) Dorey, C. K. , et al, "Lipofuscin in aged an(^ AMD eyes, M in Retinal Degeneration (Hollyfield et al, editors, Plenum Press, New York, 1993)

Eye Disease Case Control Study Group, "Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration, 11 Arch. Ophthalmol. 11: 104-109 (1993)

Eye Disease Case Control Study Group, "Risk factors for neovascular age-related macular degeneration,M Arch. Ophthalmol. 10: 1701-1708 (1992)

Foote, C.S., et al, "Chemistry of singlet oxygen. XI. Cis-Trans isomerization of carotenoids by singlet oxygen and a probable quenching mechanism,n J· Amer. Chem. S〇c· 92： 5218-5219 (1970)

Foote, C.S., et al, "Chemistry of singlet oxygen. X. Carotenoid quenching parallels biological protection, Amer· Chem. S〇c· 92·· 5216-5218 (1970)

請 先 閲 面 之 注 意 事 項 經 中 央 標 準 局 員 工

費 合 作 社 製

Galiyas, F., Acta Neuropathologica 79： 620 (1990) Gerster, Η·, "Review： antioxidant protection of the ageing macula," Age and Aging 20： 60-69 (19 9.1) Gittinger, J.W., Manual of Clinical and Problem Ophthalmology (Little-Brown, Boston, 1988) Haegerstrom-Portnoy, G., nShort-wavelength-sensitive-cone sensitivity loss with aging： a protective role for macular pigment?, n J · Opt. S〇c · Am. A5: *2140-2144 (1988) Ham, W.T., Jr., et al, "Basic mechanisms underlying the production of photochemical lesions in the mammalian retina," -55· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X 297公釐） 586930 ^ A7 B7 * ___ ________—-- ^ 五、發明舞明（）

Current Eye Research 3： 165-174 (1984) *

Handelman, G.J. and Dratz, E.A,, "The role of antioxidants in the retina and retinal pigment epithelium pind the nature of prooxidant-induced damage,n Adv. in Free Radical Biology & Medicine 2； 1-89 (1986)

Handelman, G.J., et al, M Carotenoids.*^ in the human macula and whole retina," JTnvesrt · QpAthalmcpl · Vis，· Sex'. 291 850-855 (4988)

Jialal, ·Ι·, et al, Ηβ-Carotene inhibits the oxidative modification of low-density lipoprotein," Biochimica et Biophysica Acta 1086: 134-^.38 (1991) ,.

Khachik, F·, et al, 11 Separation, . identification and quantification of carotenoids in fruits, vegetables and human plasma by high performance liquid chromatography/M Pure and Applied Chemistry 63: 71-80 (1991)

Kirschfeld, K., "Carotenoid pigments： their possible role in .protecting against photooxidation in eyes and photoreceptor cells,” Proc. R. Soc. Lond. B 216: 71-85 (1982)

Malinow, M.R., et al, "Diet-related macular^anomalies in monkeys," Invest. Ophthalmol. Vis· Sci. 19: * 857-863 (1980)

Pease, P:L., et al, "Optical density of human macular pigment, ,r Vision Res. 27： 705-710 (1987)

Peto, R., et al, "Can dietary beta-carotene materially reduce human cancer rates?11 Nature 290 x 201-208 (1981)

Schalch, W.,丨,Carotenoids in the retina--a review of their possible role in preventing or limiting damage caused by light and oxygen," EXS 62： 280-298 (1992)

Seddon, J.ML, et al, "Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration, H JAMA 272： 1413-1420 (1994) ·

I-1I一-1 ...................................... .................................. · (請先閲讀背面之注意事項 —裝-- 寫本頁) 訂 ........................1 ............................. n I · H— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（510x297公釐） 586930 A7 B7 54 五、發明説明（） (Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1992)

Wald, G., nThe photochemistry of yision, n Doc. Ophthalmol. 3： 94 (1949)

Weiter/ J.J., et al, "Central sparing in annular macular degeneration," Am. J. Ophthalmol. 106： 286-292 (1988) , 〆

Werner； J.S., et al, "Aging and human macular pigment density,u Vision Res. 27： 257-268 (1987) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -57- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210 X297公釐）

Claims (1)

1. 586930 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第85114674號專利申請案 B8 中文申請專利範圍修正本(W年6月）g88 六、申請專利範圍 1. 一種物質组合物，其包含可消化防水膠囊及其所含之液 體，其中該膠囊與液體係經尺寸化，及經設計用於人類 口服攝食，且爲醫藥可接受者，其中該液體含有一種玉 米黃質3R-3A立體異構物，其中該玉米黃質3R-3'R立 體異構物構成液體中全部玉米黃。質之至少約9 0 %，而不 希望之S-S與S-R異構物則構成液體中全部玉米黃質之 少於約1 0 %。 2. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該液體不含有 顯著量玉米黃質之不希望S_-S或R-S立體異構物，且其 中玉米黃質之3R-3'R立體異構物爲唯一可^貞測得之玉 米黃質立體異構物。 3. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該膠囊含有至 少約3毫克玉米黃質之3 R-3 A立異構物。 4. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該膠囊含有至 少約10毫克玉米黃質之3 R-3'R立體異構物。 5. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該玉米黃質 3 R- 3 'R立體異構物構成液體中全部類^月蘿蔔素之至少 約90%，且其中可能於攝取後與玉米黃質競爭營養吸收 或組織堆積之其他類胡蘿葡素構成藥劑調合物中全部類 胡蘿蔔素之少於約1 0 %。 6. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該玉米黃質之_ 3 R - 3 ' R立體異構物係藉由包含將衍生自 ma/hvori/m AFB44菌株（其FIRDI之寄存編號爲CCRC 9 1 1 0 0 6 8 )之細菌細胞，於促進玉米黃質生物合成之適 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   經濟部中央標準局員工消費合作社印装 586930 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 宜條件下培養之步驟的方法合成得。 7·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該玉米黃質之 3 R-3’R立體異構物係藉由將已經過基因工程，而含有 至少一種包含得自衍生自 八？644菌株（其？1尺〇1之寄存編號爲（：〇11€ 9 1 1 006 8)之 細胞之DN A序列的玉米黃質合成基因之細胞，於促進 玉米黃質生物合成之適宜條件下培養之步驟的方法合成 得。 8.根據申請專利範圍第1項之並合物，其中該玉米黃質之 3 R - 3 ’ R立體異構物係包封於藉由使用膽鹽•之方法製得 之膠微粒中。 9· 一種物質組合物，其包含經設計用於人類口服攝食之片 劑，其中該片劑含有： · t a.—種玉米黃質3R-3，R立體異構物，及 b · —種可與玉米黃質相容，且使玉米黃質與該黏合劑 物質之混合物在適當壓力下壓縮後，保持其形狀之可壓 縮黏合劑物質， 且其中該片劑爲醫藥上可接受者，並經預先尺寸化以 用於人類之口服攝取，而其中該玉米黃質3r_3,r立體 異構物構成片劑中全部玉米黃質之至少约9〇%，而不^ 望之S-S與S-R異構物則構成片劑中全部玉 於約10%。 ' 〜 K).根據申請專利範圍第9項之物質組合物，其中該片劑係 包封於有助於保護玉米黃質不被氧化之可消化^/ ΜΛ張元^適用中國國家標準（CNS ) A4%# ( 210 X 295^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

   586930 經濟部中央標準局貝工消費合作社印褽 A8 B8 C8 ____D8 ____ 六、申請專利範圍 11· 一種物質組合物，其含有欲用於人類口服攝取之調合 物，其中該調合物含有： a·—種爲營養上可接受且口感良好，用於人類消費之 食品物質，其適合作爲玉米黃質之載體，及 b · —種經添加於食品物質中作.爲營養添加劑之玉米黃 質3 R - 3 ’ R立體異構物，其量足以提供約} % (以重量計） 之玉米黃質，其中該玉米黃質3R_3，Ri體異構物構成 食品物質中全部玉米黃質之至少約9 〇 %，而不希望之s _ S與S - R異構物則構成食品物質中全部玉米黃質之少於 約 1 0 %。 12·根據申請專利範圍第1 1項之物質組合物，其中該食品 物質係選自人造奶油，酪農產品，糖漿，製餅生麵團， 肉類製備物，及湯類成分。 -< 13. 根據申請專利範圍第1 1項之物質組合物，其中該玉米 黃質經微膠封，及包封於減少玉米黃質被胃液分解之保 護塗層中。 14. 根據申請專利範圍第1 1項之物質組合物，其中該食品 物質包含一種顆粒調合物。 15·根據申請專利範圍第1 4項之物質組合物，其中該顆粒 調合物係選自含鹽調味混合物，含香料調味混合物，湯 類添加劑，烘焙速食品，及乳類調味添味劑。 16.根據申請專利範圍第1 1項之物質組合物，·其中該顆粒 调合物係包封於減少玉米黃質被胃液分解之保護塗層 中 〇 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   586930 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 17. —種物質組合物，其包含一種欲用於人類口服消費之食 品，其中該食品含有對人類非致病源，且其含有濃度當 作爲微生物細胞物質一部分時至少約2 %之玉米黃質 3 R - 3 f R立體異構物之完整微生物細胞，且其中該食品 不含有任何不希望之玉米黃質立·體異構物。 18. 根據申請專利範圍第1 7項之物質組合物，其中該食物 係選自乳酪，酸奶酪，牛乳與啤酒。 19. 根據申請專利範圍第1 7項之物質組合物，其中該微生 物細胞已經過巴斯德殺菌法殺死。 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐）