TW202423949A - 一種靶向sstr2的化合物及其製備方法和應用 - Google Patents

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小元 陳
吳曉明
徐鵬飛
何田
楊清寶
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本發明為一種靶向SSTR2的化合物及其製備方法和應用，涉及核醫學與分子影像學領域。所述的靶向SSTR2的化合物結構如下式 （ I ）所示，所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物結構如下式 （ II ）所示。本發明還提供了由如式（ II ）所示的化合物標記了放射性核素得到的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物。本發明還提供了製備式 （ I ）和式 （ II ）所示化合物的方法以及它們在製備診斷和/或治療以SSTR2過度表達為特徵的疾病的藥物中的應用。

Description

一種靶向SSTR2的化合物及其製備方法和應用
本發明涉及核醫學與分子影像學領域，具體地涉及一種靶向SSTR2的化合物及其製備方法和應用。
生長抑素受體（somatostatin receptor, SSTR）是一種糖蛋白，屬於G蛋白偶聯型受體，有SSTR1-SSTR5共5種亞型。SSTR通過調節腺苷酸環化酶（Adenylate Cyclase，AC）的活性影響胞內cAMP濃度，進而將外源信號傳遞至胞內。SSTR參與多種激素的分泌調節，且與腫瘤的生長和增殖等過程相關。研究人員已在多種腫瘤組織中發現SSTR高表達，其中以生長抑素受體2（SSTR2）表達為最多。SSTR2可參與生物體內的眾多細胞信號傳導通路，如GPCR下游信號和腺苷酸環化酶抑制途徑，通過改變其結構來啟動下游的信號分子，進而調控生命體的眾多生理和病理反應過程。SSTR2在多種腫瘤細胞中頻繁高表達，尤其是神經內分泌瘤。鑒於其在腫瘤中的廣泛表達及重要作用，SSTR2已成為腫瘤顯像和治療的重要靶點。
近年來，肽受體放射性核素治療（Peptide Receptor Radionuclide Therapy, PRRT）引起了廣泛的關注。放射性核素標記的肽配體與腫瘤細胞高表達的受體特異性結合，將螯合的放射性核素運輸到細胞內部或吸附在細胞表面，通過核素衰變釋放出的α射線或β射線對腫瘤細胞造成損傷。Lutathera（ 177Lu-DOTA-TATE）是2018年首款獲得FDA批准的靶向生長抑素受體2的PRRT，已在美國和歐洲多個國家用於治療不能手術切除或轉移性神經內分泌腫瘤。然而，由於其在血液中的快速清除（主要是通過腎清除），使得其進入到腫瘤組織的劑量大大減少，同時也增加了腎臟的毒性。
既往研究公開了一種長效生長抑素類似物 177Lu-EB-TATE，其是在Lutathera的側鏈引入與白蛋白具有高親和性的偶氮染料（截短的EB），可以在體內與白蛋白可逆結合，以延長血液中的半衰期至9.47小時，比Lutathera提高約4倍。 177Lu-EB-TATE以馬來醯亞胺-硫醇形成硫代琥珀醯亞胺鍵作為偶聯手段，該偶聯具有高選擇性、快速反應動力學和溫和的反應條件等優點。但是，硫代琥珀醯亞胺鍵在生理條件下或存在游離硫醇的情況下容易通過逆邁克爾反應或硫醇交換反應而消除，導致體內穩定性較差。本領域公知，由於琥珀醯亞胺鍵斷裂，靶向部分與核素螯合部分分離，無法實現核素的靶向遞送能力。特別是對於長迴圈PRRT藥物，由於較長的血液迴圈時間，需要更高的體內穩定性，以保證與腫瘤部位的高表達的受體充分結合。因此有必要改善EB-TATE的偶聯鍵，提升體內穩定性、提高腫瘤攝取劑量，滿足核素治療和顯像需求。
鑒於上述背景，為了解決肽受體放射性核素治療藥物體內穩定性差的問題，本發明的首要目的在於：開發一種新的放射性核素標記的SSTR2靶向化合物，通過醯胺鍵偶聯EB部分與TATE部分，提升體內穩定性、提高腫瘤攝取劑量。
本發明的另一個目的在於：提供製備所述的新化合物的方法，以簡單高效的合成路線完成製備。
本發明的再一個目的在於：提供所述化合物在診斷或治療以SSTR2過度表達為特徵的疾病中的應用。
本發明的上述目的通過以下技術方案實現：
第一方面，本發明提供了一種結構如式 （ I ）所示的可靶向SSTR2的化合物，其結構中同時包含SSTR2結合配體和截短型伊文思藍（即截短的EB），且所述的SSTR2結合配體與所述的截短型伊文思藍之間通過含醯胺鍵的柔性連接臂連接： （I）。
第二方面，本發明提供了一種可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其結構中同時包含SSTR2結合配體、截短型伊文思藍、柔性連接臂及核素螯合結構，所述的化合物結構如下式 （ II ）所示： （II）。
第三方面，本發明提供了一種放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，它是由本發明第二方面所述的結構如式 （ II ）的化合物標記了放射性核素得到的。
本發明所述的方案中，所述的放射性核素可以選自發射α射線的同位素、發射β射線的同位素、發射γ射線的同位素、發射俄歇電子的同位素或發射X射線的同位素等，例如 51Cr、 67Ga、 68Ga、 111In、 99mTc、 186Re、 188Re、 139La、 140La、 175Yb、 153Sm、 166Ho、 86Y、 90Y、 149Pm、 165Dy、 169Er、 177Lu、 47Sc、 142Pr、 159Gd、 212Bi、 213Bi、 72As、 72Se、 97Ru、 109Pd、 105Rh、 101mRh、 119Sb、 128Ba、 123I、 124I、 131I、 197Hg、 211At、 151Eu、 153Eu、 169Eu、 201Tl、 203Pb、 212Pb、 64Cu、 67Cu、 198Au、 225Ac、 227Th、 89Zr或 199Ag中的任意一種；更優選的放射性核素為 177Lu、 225Ac、 68Ga、 64Cu、 89Zr、 90Y、 99mTc、 188Re或 111In。
第四方面，本發明提供了一種製備第三方面所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物的方法，本發明提供的製備方法包括： ①以10.05g的2-CTC樹脂為起始原料，溶脹後加入10.78g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸和11.17g的N,N-二異丙基乙胺，反應後，先用二氯甲烷淋洗，再用二氯甲烷、甲醇和N,N-二異丙基乙胺反應封端，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶的N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***(HOBT)、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、7.17g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.45g的Nε-(叔丁氧羰基)-Nα-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-賴氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.12g的1-羥基苯並***、9.48g的1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-D-色氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.28g的Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.14g的1-羥基苯並***、6.97g的Fmoc-D-苯丙氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，加入200mL的N,N-二甲基甲醯胺，再加入8.44g碘、10mL甲醇和10mL的N,N-二甲基甲醯胺的混合液，脫-Trt保護並環化，用100mL的20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液脫Fmoc保護後，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺、3.42g的2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1.16g的N,N-二異丙基乙胺、7.43g的(S)-5-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-二苯基]-4-基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,11-二氧-2,14,17三氧代-4,10-二氮雜二十-20-酸，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺溶液和8.44g的2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯，反應完後抽濾，再用200mL的20%的六氟異丙醇的二氯甲烷溶液切割樹脂，旋乾後加入乙腈、水和2M的HCl溶液4.5mL，加25mL的N,N-二甲基甲醯胺溶解，降溫，加入0.75g亞硝酸鈉的水溶液，低溫下加入3.38g的1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸單鈉鹽和11.34g碳酸氫鈉水溶液中，反應完畢旋乾，製備分離純化得到中間體，後將所得中間體加入95%的三氟乙酸水溶液脫保護，製備液相分離純化得到目標產物，即本發明第二方面式（II）所示結構的化合物； ②將①所得的可被放射性核素標記的化合物與含放射性核素的化合物按照濕法標記方法或凍乾法標記法反應，即可製備得到本發明第三方面所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物。
第五方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含本發明第二方面所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物或本發明第三方面所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，或它們在藥學上可接受的水合物、溶劑化物或鹽。
第六方面，本發明還提供了本發明第二方面所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物、本發明第三方面所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物或第五方面所述的藥物組合物在製備用於診斷或治療動物或人類個體的以SSTR2過度表達為特徵的疾病的藥物中的應用。
本發明所述的應用中，所述的以SSTR2過度表達為特徵的疾病包括但不限於：神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、肺癌、肝細胞癌、鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、頭頸癌、卵巢癌、食道癌、下嚥癌、喉癌、骨髓瘤細胞、膀胱癌、膽管細胞癌、透明細胞腎癌、致癌性骨軟化症、肉瘤、CUP(原發性未知癌)、胸腺癌、膠質瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、子宮頸癌或***癌。
與現有技術相比，本發明提供的所述靶向SSTR2的化合物具有更高的體內穩定性，結合其較長的血液迴圈時間，可表現出優異的代謝動力學、高腫瘤攝取和腫瘤滯留時間，有望應用於診斷或治療以SSTR2過度表達為特徵的疾病。
此外，本發明提供的製備所述靶向SSTR2的化合物的方法，採用固相合成和液相合成相結合的方法，反應路線簡潔，操作簡單，合成週期短，收率高，適合工業化放大生產。
以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。
本實施例涉及的主要化合物代碼和結構如下：
TATE-EB-01
DOTA-TATE
EB-TATE
實施例1 化合物II的製備 按Fmoc固相合成策略合成中間體21：以10.05g的2-CTC樹脂為起始原料，溶脹後加入10.78g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸（Fmoc-Thr(tBu)-OH）和11.17g的N,N-二異丙基乙胺，反應後得到中間體1，用二氯甲烷淋洗，再用二氯甲烷、甲醇和N,N-二異丙基乙胺反應封端，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶的N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體2，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***(HOBT)、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體3，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體4，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、7.17g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體5，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體6，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.45g的Nε-(叔丁氧羰基)-Nα-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-賴氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體7，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體8，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.12g的1-羥基苯並***、9.48g的1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-D-色氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體9，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體10，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.28g的Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體11，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體12，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體13，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體14，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.14g的1-羥基苯並***、6.97g的Fmoc-D-苯丙氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾得到中間體15，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，加入200mL的N,N-二甲基甲醯胺，再加入8.44g碘、10mL甲醇和10mL的N,N-二甲基甲醯胺的混合液，脫-Trt保護並環化得到中間體16，用100mL的20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液脫Fmoc保護後得到中間體17，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺、3.42g的2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1.16g的N,N-二異丙基乙胺、7.43g的(S)-5-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-二苯基]-4-基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,11-二氧-2,14,17三氧代-4,10-二氮雜二十-20-酸，反應完後抽濾得到中間體18，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團得到中間體19，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺溶液、8.44g的2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯，反應完後抽濾得到中間體20，再用200mL的20%的六氟異丙醇的二氯甲烷溶液切割樹脂得到中間體20'（即從樹脂切下的中間體20），旋乾後加入乙腈、水和2M的HCl溶液4.5mL，加25mL的N,N-二甲基甲醯胺溶解，降溫，加入0.75g亞硝酸鈉的水溶液，低溫下加入3.38g的1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸單鈉鹽和11.34g碳酸氫鈉水溶液中，反應完畢旋乾，製備分離純化得到中間體21，後將所得中間體21加入200mL的95%的三氟乙酸水溶液脫保護，製備液相分離純化得到目標產物TATE-EB-01（即本發明所述的式II化合物）。圖1為本實施例中TATE-EB-01的液相圖。圖2為本實施例中TATE-EB-01的質譜圖。理論分子量[M+K-3H] 2-/2=1155.89235，實測分子量[M+K-3H] 2-/2=1155.88451。
上述步驟合成路線如下：
實施例2 放射性Ga-68標記的TATE-EB-01配合物（ 68Ga-TATE-EB-01）的製備 濕法：將約18.5~1850兆貝可（MBq） 68GaCl 3鹽酸溶液（淋洗自鍺鎵發生器）加入到含0.5mL實施例1製備的化合物TATE-EB-01的醋酸-醋酸鹽溶液(1.0g/L)的離心管中，置於95℃下反應20min。取一C 18分離小柱，先用10mL無水乙醇緩慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水將標記液稀釋後，上樣到分離柱上，先用10mL水除去未標記的 68Ga離子，再用0.3mL 10mM的HCl的乙醇溶液淋洗得到 68Ga標記的配合物。該淋洗液經生理鹽水稀釋，並經無菌過濾後即得 68Ga標記的TATE-EB-01配合物的注射液（記為 68Ga-TATE-EB-01）。 凍乾法：將約18.5~1850兆貝可（MBq） 68GaCl 3鹽酸溶液（淋洗自鍺鎵發生器）加入到含有化合物TATE-EB-01的凍乾藥盒中，混勻後95℃下反應20min。取一C18分離小柱，先用10mL無水乙醇緩慢淋洗，再用10mL水淋洗。用10mL水將標記液稀釋後，上樣到分離柱上，先用10mL水除去未標記的 68Ga離子，再用0.3mL 10mM的HCl的乙醇溶液淋洗得到配合物淋洗液。該淋洗液經生理鹽水稀釋，並經無菌過濾後即得 68Ga標記的TATE-EB-01配合物的注射液（記為 68Ga-TATE-EB-01）。
實施例3 放射性Lu-177標記TATE-EB-01配合物（ 177Lu-TATE-EB-01）的製備 配置pH=5.5的緩衝溶液：稱取57.6毫克醋酸、189毫克龍膽酸和525毫克三水合醋酸鈉，用48毫升純水溶解，用氫氧化鈉溶液調節pH=5.5。用200µL緩衝液(pH=5.5)充分溶解200 µg實施例1製備的化合物TATE-EB-01，然後加入5毫升緩衝液(pH=5.5)以及150mCi左右 177LuCl 3的鹽酸溶液。混合物搖勻後80℃加熱反應20min。反應結束後冷卻至室溫。該反應液經生理鹽水稀釋，並經無菌過濾後即得10 mCi/mL的 177Lu標記的TATE-EB-01配合物的注射液（記為 177Lu-TATE-EB-01）。
實驗例1 細胞攝取實驗 對於細胞攝取實驗，將2×10 5AR42J腫瘤細胞接種在24孔板中過夜至貼壁，然後，將細胞與37 kBq的實施例3製備的 177Lu-TATE-EB-01在0.5 mL培養基中於37 °C孵育0.16、0.5、2、4和24小時。對於阻斷實驗，加入未標記的TATE-EB-01（50μg/mL）作為抑制劑以驗證其靶向特異性。對於競爭結合實驗，將AR42J腫瘤細胞與不同濃度（10 -5-10 -12M）未標記的TATE-EB-01（即本發明提供的式II化合物）或DOTA-TATE與 177Lu-DOTA-TATE（即 177Lu標記的DOTA-TATE）孵育1小時。之後除去上清液，用冰冷的PBS洗滌AR42J腫瘤細胞兩次，然後用1M的NaOH溶液裂解。收集細胞裂解物並使用γ計數器測定其放射性。隨著時間的推移， 177Lu-TATE-EB-01的細胞攝取逐漸增加，在24小時點的細胞攝取值最高，達到36.96±1.60%。當加入未標記的TATE-EB-01作為抑制劑時，細胞攝取減少到3.37±0.17%，這表明它們與SSTR2具有較高的結合特異性（參見圖3中的A）。此外，TATE-EB-01的IC 50值為20.39 nM，DOTA-TATE的IC 50值為11.48 nM，表明TATE-EB-01和DOTA-TATE二者與SSTR2受體具有相似的親和力（參見圖3中的B），這意味著修飾策略對SSTR2受體結合親和力的影響很小。
實驗例2 68Ga標記的TATE-EB-01配合物在荷瘤小鼠體內的MicroPET顯像 按實施例2的方法製備 68Ga-TATE-EB-01，在AR42J荷瘤小鼠中，針對隨機分組的小鼠，分別經尾靜脈注射7.4 MBq的 68Ga-TATE-EB-01、 68Ga-EB-TATE（即 68Ga標記的EB-TATE）和 68Ga-DOTA-TATE（即 68Ga標記的DOTA-TATE），然後分別於給藥後0~240 min將腫瘤小鼠麻醉並置於PET/CT掃描器上對小鼠進行MicroPET顯像。阻斷實驗是通過同時將未標記的TATE-EB-01與 68Ga-DOTA-TATE注射入AR42J腫瘤鼠並進行PET掃描。結果見圖4、圖5、圖6和圖7。圖4-圖6中的A部分分別是 68Ga-TATE-EB-01、 68Ga-EB-TATE和 68Ga-DOTA-TATE注射入AR42J腫瘤鼠後0.5、2和4小時時間點的PET顯像圖。圖4-圖6的B部分分別為小鼠靜脈注射 68Ga-TATE-EB-01、 68Ga-EB-TATE和 68Ga-DOTA-TATE後主要臟器組織攝取值的定量分析柱狀圖（每組3只小鼠進行定量分析）。由圖4-圖6的A部分可見，在採集成像的時間點，腫瘤清晰可見。由圖4-圖6的B部分可見， 68Ga-TATE-EB-01的腫瘤攝取值在注射後2小時達到16.08±1.26%ID/g，在注射後4小時達到22.42±1.28%ID/g，顯著高於正常組織（圖4所示）。相比之下， 68Ga-EB-TATE在腫瘤中的信號明顯低於 68Ga-TATE-EB-01，在注射後2和4小時的腫瘤攝取值分別為8.67±1.46%ID/g和12.25±1.52%ID/g（圖5所示）。對於 68Ga-DOTA-TATE，在注射後2和4小時，腫瘤攝取量分別為7.33±1.91%ID/g和6.67±1.94%ID/g（圖6所示）。為了評估靶向特異性，將實施例1製備的未標記的TATE-EB-01與 68Ga-DOTA-TATE同時注射進入AR42J腫瘤鼠進行抑制實驗，結果表明未標記的TATE-EB-01可以顯著抑制腫瘤攝取（參見圖7中的A、B部分）。相應藥物腫瘤攝取的定量結果如圖7中的C、D部分所示，與未進行抑制的上述PET顯像相比，TATE-EB-01抑制組PET成像的腫瘤攝取值顯著更低。
實驗例3 177Lu標記的TATE-EB-01配合物在荷瘤小鼠體內的SPECT顯像 按實施例3的方法製備 177Lu-TATE-EB-01，在AR42J荷瘤小鼠中，針對隨機分組的小鼠，分別經尾靜脈注射37 MBq的 177Lu-TATE-EB-01和 177Lu-EB-TATE（即 177Lu標記的EB-TATE），然後在異氟烷麻醉下，分別於給藥後1~96h進行SPECT顯像，結果見圖8和9。圖8和圖9的a）部分分別為 177Lu-TATE-EB-01和 177Lu-EB-TATE後不同時間的AR42J荷瘤小鼠的SPECT成像最大密度投影圖像，可見看到，在採集成像的各時間點，兩組腫瘤清晰可見，相比而言注射 177Lu-TATE-EB-01的小鼠各時間點的SPECT顯像效果更佳。圖8和圖9的b）部分分別體現了小鼠靜脈注射 177Lu-TATE-EB-01和 177Lu-EB-TATE後各器官或組織（血、肝、腎、腫瘤和肌肉）在不同時間點的攝取，每組中三個攝取量從左至右分別對應注射後1h、4h、12、24h、48h、72h和96h，可以看到兩種藥物於相同時間點在血液、肝臟、腎臟和肌肉的分佈比較相似，但是在腫瘤中的攝取， 177Lu-TATE-EB-01在所有時間點都明顯高於 177Lu-EB-TATE。另外，圖8和圖9的c）部分分別體現了小鼠靜脈注射 177Lu-TATE-EB-01和 177Lu-EB-TATE後不同時間點的靶/非靶比值，可以看出， 177Lu-TATE-EB-01組的在各時間點的腫瘤與正常器官的比值也明顯高於 177Lu-EB-TATE。例如在96h測試時間點， 177Lu-TATE-EB-01的腫瘤肌肉比值已超過120而 177Lu-EB-TATE組的腫瘤肌肉比值低於50。因此，無論是腫瘤絕對攝取還是靶/非靶比值， 177Lu-TATE-EB-01明顯優於 177Lu-EB-TATE。綜上所述，本發明所述靶向SSTR2的化合物及其放射性核素標記物，表現出優異的代謝動力學、高腫瘤攝取和腫瘤滯留時間，有望應用於診斷或治療以述SSTR2過度表達為特徵的疾病。
實驗例4 生物分佈 在生物分佈研究中，給AR42J荷瘤小鼠分別靜脈注射1.48 MBq的實施例3製備的 177Lu-TATE-EB-01、 177Lu-EB-TATE或 177Lu-DOTA-TATE（即 177Lu標記的DOTA-TATE），並在不同時間點解剖，收集感興趣的器官和腫瘤組織並稱重。使用γ計數器檢測放射性，生物分佈結果以每克組織注射劑量的百分比（%ID/g）計算。結果如圖10所示，對於實施例3製備的 177Lu-TATE-EB-01，腫瘤攝取隨著時間延長逐漸增加，並在注射後72小時達到峰值，攝取值為158.32±20.04%ID/g，在注射後96小時仍保持腫瘤高攝取值，為112.44±20.57%ID/g，且腫瘤攝取值遠遠超過其他器官，包括腎臟攝取值（15.15±6.20%ID/g）。相比之下，如圖11所示，觀察到現有的 177LuEB-TATE的腫瘤攝取值（96小時為37.28±9.50%ID/g）遠低於 177Lu-TATE-EB-01。如圖12所示， 177Lu-DOTA-TATE的腫瘤攝取最低，注射後48小時腫瘤攝取僅為9.19±2.16%ID/g，並且從注射後4小時開始不斷下降。這些結果表明，本發明的 177Lu-TATE-EB-01相比於其他兩個標記物腫瘤攝取最高且體內分佈最佳。
實驗例5 穩定性實驗 為了探索放射性標記的TATE-EB-01和EB-TATE在動物體內分佈差異的原因，我們將 68Ga-TATE-EB-01和 68Ga-EB-TATE分別在生理鹽水和谷胱甘肽溶液中體外培養2小時，並使用放射性高效液相色譜分析。此外，將 68Ga-TATE-EB-01和 68Ga-EB-TATE分別注射到BALB/c裸鼠體內，2 h後採集尿樣進行放射性高效液相色譜分析。結果如圖13所示， 68Ga-TATE-EB-01在谷胱甘肽溶液中和尿液中2 h後幾乎保持完整的原藥形式，放化純仍然大於99%。然而， 68Ga-EB-TATE在谷胱甘肽溶液和尿液中2h的穩定性較差，生成了多個副產物峰，主峰的放射化學純度明顯降低，表明了 68Ga-EB-TATE在谷胱甘肽所在的體外還原性環境中穩定性不佳，且在動物體內穩定性也較差，僅在注射後2h就有副產物生成，也是間接導致該探針在體內藥代動力學較差的原因。
雖然，上文中已經用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
圖1為本發明實施例1中TATE-EB-01的液相圖。 圖2為本發明實施例1中TATE-EB-01的質譜圖。 圖3體現了本發明 177Lu標記的TATE-EB-01配合物的細胞攝取結果，其中A體現了 177Lu-TATE-EB-01在AR42J腫瘤細胞中的細胞攝取實驗結果，以及用TATE-EB-01進行阻斷後細胞攝取的結果；B體現了TATE-EB-01和DOTA-TATE在AR42J腫瘤細胞中的競爭結合實驗結果。 圖4為本發明中 68Ga標記的TATE-EB-01配合物注射後不同時間MicroPET成像結果及腫瘤與重要器官的攝取結果統計圖。 圖5為 68Ga標記的EB-TATE注射後不同時間MicroPET成像結果及腫瘤和重要器官的攝取結果統計圖。 圖6為 68Ga-DOTA-TATE注射後不同時間MicroPET成像結果及腫瘤及重要器官的攝取結果統計圖。 圖7體現了未標記的TATE-EB-01與 68Ga-DOTA-TATE同時注射進入AR42J腫瘤鼠的抑制實驗MicroPET成像結果。 圖8為 177Lu標記的TATE-EB-01配合物注射後不同時間SPECT顯像結果及腫瘤與重要器官的攝取結果統計圖。 圖9為 177Lu-EB-TATE注射後不同時間SPECT顯像結果及腫瘤與重要器官的攝取結果統計圖。 圖10體現了AR42J荷瘤小鼠在注射本發明 177Lu-TATE-EB-01後1、4、24、48、72和96小時的主要臟器和腫瘤組織的生物分佈。 圖11體現了AR42J荷瘤小鼠在注射 177Lu-EB-TATE後1、4、24、48和96小時的主要臟器和腫瘤組織的生物分佈。 圖12體現了AR42J荷瘤小鼠在注射 177Lu-DOTA-TATE後1、4、24和48小時的主要臟器和腫瘤組織的生物分佈。 圖13體現了本發明 68Ga標記的TATE-EB-01配合物的體內外穩定性，其中(A)通過HPLC分析體現了 68Ga-TATE-EB-01分別在生理鹽水、谷胱甘肽溶液中孵育2小時，以及在小鼠體內尿液代謝的2小時的穩定性；(B)通過HPLC分析體現了 68Ga-EB-TATE分別在生理鹽水、谷胱甘肽溶液中孵育2小時，以及在小鼠體內尿液代謝的2小時的穩定性。

Claims (15)

  1. 一種靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，其結構中同時包含SSTR2結合配體和截短型伊文思藍，且所述的SSTR2結合配體與所述的截短型伊文思藍之間通過含醯胺鍵的柔性連接臂連接；其結構如式 （ I ）所示： （ I ）。
  2. 一種可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，其結構中同時包含SSTR2結合配體、截短型伊文思藍、柔性連接臂及核素螯合結構，所述的化合物結構如下式 （ II ）所示： （ II ）。
  3. 一種製備如請求項2所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物的方法，利用Fmoc固相合成策略合成重氮化反應前體，最後通過一步重氮化反應得到目標產物，其特徵在於，具體包括以下步驟： 以10.05g的2-CTC樹脂為起始原料，溶脹後加入10.78g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸和11.17g的N,N-二異丙基乙胺，反應後，先用二氯甲烷淋洗，再用二氯甲烷、甲醇和N,N-二異丙基乙胺反應封端，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶的N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、7.17g的Fmoc-O-叔丁基-L-蘇氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.45g的Nε-(叔丁氧羰基)-Nα-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-賴氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.12g的1-羥基苯並***、9.48g的1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-D-色氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.18g的1-羥基苯並***、8.28g的Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.23g的1-羥基苯並***、10.55g的Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加6.84g的苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、0.14g的1-羥基苯並***、6.97g的Fmoc-D-苯丙氨酸和2.37g的N,N-二異丙基乙胺，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，加入200mL的N,N-二甲基甲醯胺，再加入8.44g碘、10mL甲醇和10mL的N,N-二甲基甲醯胺的混合液，脫-Trt保護並環化，用100mL的20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液脫Fmoc保護後，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺、3.42g的2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1.16g的N,N-二異丙基乙胺、7.43g的(S)-5-((4'-氨基-3,3'-二甲基-[1,1'-二苯基]-4-基)羰基)-1-(9H-芴-9-基)-3,11-二氧-2,14,17三氧代-4,10-二氮雜二十-20-酸，反應完後抽濾，依次用二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲醯胺洗滌，再加入20%呱啶N,N-二甲基甲醯胺溶液100mL脫Fmoc基團，洗滌後加60mL的N,N-二甲基甲醯胺溶液和8.44g的2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯，反應完後抽濾，再用200mL的20%的六氟異丙醇的二氯甲烷溶液切割樹脂，旋乾後加入乙腈、水和2M的HCl溶液4.5mL，加25mL的N,N-二甲基甲醯胺溶解，降溫，加入0.75g亞硝酸鈉的水溶液，低溫下加入3.38g的1-氨基-8-萘酚-2,4-二磺酸單鈉鹽和11.34g碳酸氫鈉水溶液中，反應完畢旋乾，製備分離純化得到中間體，後將所得中間體加入95%的三氟乙酸水溶液脫保護，製備液相分離純化得到目標產物。
  4. 一種放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，它是由請求項2所述的結構如式 （ II ）所示的化合物標記了放射性核素得到的。
  5. 如請求項4所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，所述的放射性核素選自發射α射線的同位素、發射β射線的同位素、發射γ射線的同位素、發射俄歇電子的同位素或發射X射線的同位素。
  6. 如請求項4所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，所述的放射性核素選自 51Cr、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 89Zr、 111In、 99mTc、 186Re、 188Re、 139La、 140La、 175Yb、 153Sm、 166Ho、 86Y、 90Y、 149Pm、 165Dy、 169Er、 177Lu、 47Sc、 142Pr、 159Gd、 212Bi、 213Bi、 72As、 72Se、 97Ru、 109Pd、 105Rh、 101mRh、 119Sb、 128Ba、 123I、 124I、 131I、 197Hg、 211At、 151Eu、 153Eu、 169Eu、 201Tl、 203Pb、 212Pb、 198Au、 225Ac、 227Th或 199Ag中的任意一種。
  7. 如請求項4所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物，其特徵在於，所述的放射性核素選自 177Lu、 225Ac、 68Ga、 64Cu、 89Zr、 90Y、 99mTc、 188Re或 111In。
  8. 一種製備如請求項4至7中任一項所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物的方法，其特徵在於，包括：將如請求項2所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物與含放射性核素的化合物按照濕法標記方法或凍乾法標記法反應，即可製備得到所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物。
  9. 一種藥物組合物，其特徵在於：包含如請求項1所述的靶向SSTR2的化合物、如請求項2所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物、如請求項4至7中任一項所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物、或它們在藥學上可接受的水合物、溶劑化物或鹽。
  10. 一種藥物的應用，所述應用包含：如請求項1所述的靶向SSTR2的化合物、如請求項2所述的可用放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物、如請求項4所述的放射性核素標記的靶向SSTR2的化合物、或它們在藥學上可接受的水合物、溶劑化物或鹽、或如請求項9所述的藥物組合物，在製備用於診斷或治療動物或人類個體的以SSTR2過度表達為特徵的疾病的藥物中的應用；所述的以SSTR2過度表達為特徵的疾病選自：神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、肺癌、肝細胞癌、頭頸癌、卵巢癌、骨髓瘤、膀胱癌、透明細胞腎癌、致癌性骨軟化症或肉瘤。
  11. 如請求項10所述的應用，其特徵在於：所述的神經內分泌腫瘤為膠質瘤。
  12. 如請求項11所述的應用，其特徵在於：所述的膠質瘤為神經膠質瘤。
  13. 如請求項12所述的應用，其特徵在於：所述的神經膠質瘤為星形細胞瘤。
  14. 如請求項10所述的應用，其特徵在於：所述的胃腸道腫瘤選自胰腺癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌或膽管細胞癌。
  15. 如請求項10所述的應用，其特徵在於：所述的頭頸癌選自鼻咽癌、食道癌、下嚥癌或喉癌。
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