TW202415765A

TW202415765A - 用於製備包含間葉幹細胞、間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物的方法、由此方法製得的組成物及其用於治療關節炎的用途

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Publication number: TW202415765A
Application number: TW112137021A
Authority: TW
Inventors: 李家昕; 林珀丞; 高詠晟; 莊明熙; 陳俊宏; 張朝亮; 張愷玲
Original assignee: 國璽幹細胞應用技術股份有限公司
Priority date: 2022-10-11
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2024-04-16
Also published as: CN117860784A

Abstract

本發明提供一種用於製備包含間葉幹細胞、間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物的方法、由此方法製得的組成物及其用於治療關節炎的用途。本發明組成物藉由多種功效實驗，達到治療關節炎之效果。

Description

用於製備包含間葉幹細胞、間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物的方法、由此方法製得的組成物及其用於治療關節炎的用途

本發明是有關於一種用於製備包含間葉幹細胞、間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物的方法、由此方法製得的組成物及其用於治療關節炎的用途。

關節炎是全世界最常見的慢性疾病之一，主要是關節的軟骨退化或者結締組織發炎，導致關節疼痛從而干擾關節的正常運動就叫關節炎，常見的關節炎包含骨關節炎(osteoarthritis, OA)、類風濕性、風濕性、化膿性關節炎、外傷性骨性關節炎、自身免疫性關節炎，僵直性關節炎等。關節炎的症狀及徵兆主要發生在受侵犯的關節，多以承載體重的關節或手指指間關節，可以發生在膝蓋、髖關節、足踝、手、肩關節背、頸。

其中，骨關節炎也稱為退化性關節炎(degenerative arthritis)，是一種可動關節(diarthrosis)衰竭的症狀表現，主要病徵為關節軟骨退化，骨骼間相互磨擦，而造成關節疼痛、觸痛(tenderness)、僵硬(stiffness)、鎖緊(locking)、關節積液(effusion)、關節活動度降低、關節空間喪失、骨贅生成、囊腫形成、關節變形，嚴重時可能導致殘疾(disability)。

世界衛生組織(World Health Organization, WHO)將每年10月12日定為「世界關節炎日World Arthritis Day」。全球骨關節炎患病率從1990年2.4751億增加到2019年5.2781億，增長了113.25%。根據Precision Reports指出全球幹細胞用於治療骨關節炎市場規模預計將從2021年2,200萬美元增加至2028年1.073億美元，2022-2028年複合成長率為25.1%。在臺灣依據110年臺灣衛生福利部統計處所發布110年度全民健康保險醫療統計年報所示，全臺膝部骨關節炎門、住診為3,893,506人次，其醫療費用統計約為58.8億新台幣，可見骨關節炎市場潛力相當可觀。目前治療骨關節炎的方式包含：足弓墊矯正、功能性護膝、復健科電療、葡萄糖胺(glucosamine)、軟骨素(chondroitin)、非類固醇抗發炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)、關節內注射類固醇(corticosteroids)、關節內注射玻尿酸(hyaluronic acid, HA)、注射血小板生長因子(platelet rich plasma, PRP)、自體同源軟骨細胞移植法(autologous chondrocyte implantation, ACI)、局部人工關節置換手術(partial knee replacement)及全人工膝節置換術(total knee replacement, TKR)等。

骨關節炎的病患年齡層下降，原本以50歲以上居多，但近年卻開始出現30、40歲的病患，已不是老年人特有的疾病，在美國是僅次於心臟病讓人無法工作的「兇手」，在台灣也是導致成年人殘疾的主要原因。由於退化性關節炎患者常常因為身體病痛，關節酸痛，或產生其他全身性的不適感，不僅難以入眠，容易疲倦，也造成體重減輕，再加上嚴重的關節損傷及變形，行動力大受影響，外出機會變少，有的患者甚至只能久臥病床，根本無法出門，嚴重影響健康相關生活品質(health-related quality of life, HRQOL)。

間葉幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因為具有再生性(regenerative)、免疫調節性(immunomodulatory)和旁分泌特性(paracrine properties)被視為一種治療藥物，為骨關節炎病患提供新的治療模式。目前已有17種不同來源的間葉幹細胞，包含脂肪組織(adipose tissue)、臍帶血(umbilical cord blood)、羊膜(amniotic membrane)、羊水(amniotic fluid)、華通氏膠質(Wharton's Jelly)、胎盤(placenta)、滑膜(synovium)、牙髓(dental pulp)、骨髓(bone marrow)及週邊血(peripheral blood)等。已有研究指出自體(autologous)幹細胞能治療骨關節炎，然而，自體幹細胞療法需要從病患身上取組織後，再進行幹細胞培養，才能進行治療，花費時間較長，另外，自體幹細胞治療對於無法提供自己組織的病患們，像年長者、體弱者、具傳染性疾病者或因病程無法等待者，有侷限。而異體幹細胞治療克服了這個限制，異體幹細胞治療骨關節炎可以直接患部關節腔注射幹細胞，完成治療後，即可離開醫院、不需等待細胞培養放大時間、無需住院、無需開刀和節省治療步驟，提高病友使用的意願，進而增加產品之普及性及方便性。Vega等學者證實異體骨髓來源幹細胞(allogeneic bone marrow MSCs, BMMSCs)用於治療骨關節炎，可以降低骨關節炎所引起的不適感，但對於生活品質改善並無顯著效果，另一篇文獻與Vega等學者研究有類似結果，其採用異體脂肪間葉幹細胞(allogeneic adipose-derived MSCs, ADSCs)治療骨關節炎，亦可以降低骨關節炎所引起的不適感，但生活品質量表結果反而是降低的，目前異體幹細胞治療骨關節炎相關研究指出在接受治療後1週僅能降低10%左右的關節炎不適感，需要到12週達到降低56%關節炎不適感，總上，骨關節炎治療市場上需要能快速及有效改善品質生活之產品。

目前臨床上關節炎藥物治療效果有限且具有嚴重副作用，許多患者無法持續治療。更重要的是，藥物僅緩解症狀，但未能根本解決問題，所以如何開發出一種可以有效治療關節炎的新藥物是本發明在此欲解決的重要課題。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎的用於治療骨關節炎的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於製備包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物之方法，包含以下步驟：(a)提供一間葉幹細胞；(b)將該間葉幹細胞培養在補充有N-乙醯基-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine)及L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)的角質形成細胞(keratinocyte)無血清培養基(serum free medium, SFM)中，藉此擴增該間葉幹細胞；以及(c)將該間葉幹細胞靜置一段預定時間，得到該包含間葉幹細胞、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物。

在本發明的一實施例中，該N-乙醯基-L-半胱胺酸具有一為1-100 mM的濃度，及該L-抗壞血酸2-磷酸具有一為0.05-50 mM的濃度。

在本發明的一實施例中，方法進一步包含將該間葉幹細胞於含氧官能基團比例在20~35%之材質的培養皿進行細胞擴增。

在本發明的一實施例中，該預定時間為18~24小時。

在本發明的一實施例中，該生長因子是Uteroglobin。

在本發明的一實施例中，該生長因子是選自於下列所組成的群組：白血球生長激素(Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF)、十號介白素(Interleukin-10, IL-10)、血小板衍生生長因子-AA (Platelet-derived growth factor-AA, PDGF-AA)、轉化生長因子-α (transforming growth factor-α, TGFα)、血管內皮生長因子-A (Vascular endothelial growth factor, VEGF-A) 、軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein, COMP)、Uteroglobin、十八號介白素結合蛋白-α (IL-18binding protein-α, IL-18BPα)、類血管生成蛋白-3 (angiopoietin-like 3, ANGPTL-3)、基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)，及其組合。

在本發明的一實施例中，該生長因子是十號介白素或轉化生長因子-α的表現是下調表現。

本發明之另一目的為提供一種包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物，其是藉由一包含如前所述的方法而被製備。

本發明之另一目的為提供一種如前所述的包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物用於製備一治療關節炎的醫藥品的用途。

在本發明的一實施例中，該間葉幹細胞為人類脂肪間葉幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)。

在本發明的一實施例中，該關節炎為退化性關節炎(degenerative arthritis)。

在本發明的一實施例中，該間葉幹細胞的有效濃度為單次關節內注射6×10 ⁶~5×10 ⁷個間葉幹細胞。

在本發明的一實施例中，該組成物增加軟骨厚度。

在本發明的一實施例中，該組成物改善關節炎的疼痛、僵硬及身體功能。

在本發明的一實施例中，該ADSC是藉由使用一包含1~100 mM之N-乙醯基-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine)及0.05~50 mM之L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)的角質形成細胞(keratinocyte)-無血清培養基(serum free medium, SFM)而被擴增。

在本發明的一實施例中，該ADSC是進一步於含氧官能基團比例在20~35%之材質的培養皿進行擴增。

在本發明的一實施例中，該關節炎是在該醫藥品被投藥後一週產生治療效果。

在本發明的一實施例中，該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。

綜上所述，本發明包含間葉幹細胞、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物的功效在於：可增加軟骨厚度、改善關節炎的疼痛、僵硬及身體功能，經由特定培養幹細胞的方式，提高細胞產量，同時提前於治療1週即有治療效果40%以上，同時改善骨關節炎病友的生活品質。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在 20%的範圍內，較佳為在 10%的範圍內，最佳為在 5%的範圍內。

除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。

依據本發明，用語“脂肪間葉幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)”是從脂肪中分離出的一種間葉幹細胞，屬於多潛能幹細胞(multipotent stem cell)，具有高可塑性(plasticity)，經過誘導後可以分化成很多不同組織的細胞。

依據本發明，細胞外囊泡包含外泌體(exosome)和微囊泡(microvesicles)。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、***錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。

茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。 實施例 1~4

依據本發明，下面實施例所使用之細胞為人類脂肪間葉幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)。

依據本發明，藉由在腹部外科手術期間從健康的捐贈者進行脂肪抽吸，從腹壁之皮下脂肪採集2~5g的脂肪組織，取脂手術時間大約1小時以內，傷口小於1公分。所有捐贈者均提供書面同意書。將人脂肪組織置於無Ca ²⁺/Mg ²⁺之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且立即轉移至實驗室。

依據本發明，將人類脂肪組織從運送培養基移出並放置於培養皿中，使用不含Ca ²⁺/Mg ²⁺的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 將脂肪組織洗滌3至4次，並切成小塊(體積約為1-3 mm ³)。36.5-38.5°C的溫度環境中用0.1~0.3%的膠原蛋白酶將組織解離60分鐘。在膠原蛋白酶消化之後，在溫度20~25°C、500g下離心5~15分鐘，將細胞和未消化的組織碎片從基質血管細胞(stromal vascular fraction, SVF)的顆粒中分離出來，收集解離的細胞並在36.5~38.5°C下在提供5% CO ₂的培養箱中培養。培養1~2天後，從培養物中除去上清液和碎片，獲得初代脂肪間葉幹細胞。

接著，將初代脂肪間葉幹細胞以不同培養基進行擴增培養，各實施例所使用的培養基如下：

實施例1：將0.5×10 ⁵個脂肪間葉幹細胞置於6孔細胞培養盤(Corning)以包含有1~100 mM之N-乙醯基-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05~50 mM之L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的角質形成細胞(keratinocyte)-無血清培養基(serum free medium, SFM) (Gibco)進行細胞培養1、4、7天，培養環境為溫度控制在36.5-38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

實施例2：將0.5×10 ⁵個脂肪間葉幹細胞置於6孔細胞培養盤(Corning)以包含有1~10mg/ml之人類血清白蛋白(Human Serum Albumin) (Bio-Pure)、0.05~50 mM之L-抗壞血酸2-磷酸、1~40mM碳酸氫鈉(Sodium bicarbonate) (Sigma)的DMEM/F12培養基(Gibco)進行細胞培養1、4、7天，培養環境為溫度控制在 36.5-38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

實施例3：將0.5×10 ⁵個脂肪間葉幹細胞置於6孔細胞培養盤(Corning)以包含有1~10 mg/ml之人類血清白蛋白(Bio-Pure)、0.05~50 mM之L-抗壞血酸2-磷酸、1~40 mM之碳酸氫鈉(Sigma)、5~15 mM HEPES (Sigma)的DMEM/F12培養基(Gibco)進行細胞培養1、4、7天，培養環境為溫度控制在36.5~38.5℃，且含有 5%二氧化碳之細胞培養箱中。

實施例4：將0.5×10 ⁵個脂肪間葉幹細胞置於6孔細胞培養盤(Corning)以包含有5~20wt%之胎牛血清(fetal bovine serum, Hyclone)的DMEM/F12培養基(Gibco)進行細胞培養1、4、7天，培養環境為溫度控制在36.5~38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

細胞數量以ADAM-MC™ Automatic Cell計數器(Digital Bio，NanoEnTek Inc.)進行評估。在培養天數為1、4、7天時，分別分析各實施例的細胞數量，並將所得結果記錄於表1中。表1

		實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
細胞數量(個數)	第1天	0.457×10 ⁵	0.369×10 ⁵	0.432×10 ⁵	0.336×10 ⁵
第4天	5.534×10 ⁵	3.460×10 ⁵	4.174×10 ⁵	1.548×10 ⁵
第7天	8.765×10 ⁵	6.808×10 ⁵	7.904×10 ⁵	1.860×10 ⁵

如表1中的結果顯示了不論是第4天還是第7天，實施例1的細胞數量皆為最多，接著依序是實施例3、實施例2、實施例4，其中實施例4的細胞數量明顯少於其他三組。

另外，分化簇或分化群(Cluster of Differentiation, CD)指的是不同譜系的細胞在正常分化成熟的不同階段和活化過程中，表現或消失的細胞表面標誌(markers)。CD標誌為細胞膜上的蛋白質複合體(protein complex)或醣蛋白(glycoprotein)。CD標誌有許多用途，常用於細胞的重要受體(receptors)或配體(ligand)，同時，可作為表面標誌用於細胞的鑑定和分離，並廣泛參與細胞各種不同階段，包含細胞生長、細胞分化、細胞遷移等；其中，CD29 (整合素β1 (integrin β1))是一種多功能蛋白質(multi-functional protein)，參與細胞基質黏附(cell-matrix adhesion)、細胞信號傳導(cell signaling)、細胞防禦(cellular defense)、細胞黏附(cell adhesion)、蛋白質結合、蛋白質異源二聚作用(protein heterodimerisatio)、受體介導活性(receptor-mediated activity)及傷口修復等，此外，CD29對於維持軟骨細胞表型、防止軟骨細胞凋亡並調節軟骨細胞特異性基因表達具有重要的角色。CD44是透明質酸(hyaluronic acid)的主要受體，透明質酸為軟骨主要的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)成分之一。CD44在維持軟骨穩定(cartilage homeostasis)發揮關鍵作用，CD44經由調節軟骨相關基因之表現，進而促進軟骨細胞主要標誌(important markers of chondrocytes)第二型膠原蛋白(type II collagen)和聚集蛋白聚醣(aggrecan)。CD73(5'外核苷酸酶 (5′ecto-nucleotidase))為免疫功能之調節物。CD90 (Thy-1)通過活化AKT和細胞週期蛋白D1 (Cyclin D1)在脂肪間葉幹細胞增殖和代謝扮演關鍵作用。CD105(內皮糖蛋白(endoglin))或TGF-β受體III (TGF-β receptor III)可為脂肪間葉幹細胞相對特定標誌；研究指出表現CD105之脂肪間葉幹細胞(CD105 ⁺ADSCs)具有較高之生長速度和分化能力。間質幹細胞上的CD105參與TGF-β/Smad2信號傳遞路徑和軟骨形成分化(chondrogenic differentiation)的調節。因此，在培養天數第7天時，分別分析實施例1~3所得之脂肪間葉幹細胞的表面抗原表達程度。將1×10 ⁶個/mL的脂肪間葉幹細胞取100 μL至微量離心管中，以1:100比例加入帶有螢光標記之CD73、CD90、CD105、 CD14、CD19、CD34、CD45、HLA- DR (Becton Dickinson)抗體混合均勻，避光靜置，然後使用BD AccuriC6流式細胞儀(Becton Dickinson)分析細胞標誌，分析完成後將所得結果記錄於表2中。表2

	實施例1	實施例2	實施例3
表面抗原表達程度(%)	CD 73	99.96	99.81	99.66
CD 90	100	99.98	99.94
CD 105	99.19	99.69	98.17
CD 14	0.06	0.07	0.15
CD 19	0.06	0.17	0.13
CD 34	0.07	0.29	0.23
CD 45	0.10	0.16	0.18
HLA-DR	0.04	0.07	0.12

又，確認各實施例的表面抗原，實施例1至3所培養出的ADSCs高水平表達特異性間質幹細胞標誌物CD73、CD90和CD105，而造血細胞標誌物CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR 分子表達量非常低，符合脂肪間葉幹細胞的特徵。同時，與軟骨形成分化有關的標誌CD105具高水平表達。

另外，比較實施例1至4中之培養至第七天後細胞的倍增時間(doubling-time)，所得結果如表3所示。表3

	實施例1	實施例2	實施例3	實施例4
倍增時間(小時)	20.01	22.30	22.00	32.67
倍增時間 (以實施例4為100%)	縮短38.8%	縮短31.7%	縮短32.7%	--

實施例1的倍增時間為20.01小時，而實施例2至4的倍增時間分別為22.30小時、22.00小時和32.67小時。

經由上述結果可知，實施例1所採用的培養基相對於其他實施例所採用的培養基能夠更有效的提升脂肪間葉幹細胞的擴增數量，並且不會影響細胞活性以及表面抗原特徵，且軟骨形成分化有關的標誌CD105具高水平表達。 實施例 5 、 6

在本實施例中採用與前述實施例1至4相同取得方式的初代脂肪間葉幹細胞於含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿及含氧官能基團比例在5-20%之材質的培養皿進行細胞擴增，其含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿外部材質為聚苯乙烯(polystyrene)，由於聚苯乙烯表面合併含氧官能基團(oxygen-containing functional groups)，使得培養表面具有帶淨負電荷(net negative surface charge)，提升培養皿表面更親水(hydrophilic)及濕潤，有助於細胞附著(cell attachment)和生長。各實施例的培養方式如下：

實施例5：將1×10 ⁶個脂肪間葉幹細胞以與實施例1相同之培養基構成分於含氧官能基團比例為29%之材質的培養皿(HYPERFlask, Corning)中進行細胞培養10~14天，細胞數約7×10 ⁷~3.146×10 ⁸，培養環境為溫度控制在36.5~38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

實施例6：將1×10 ⁶個脂肪間葉幹細胞以與實施例1相同之培養基構成分於含氧官能基團比例為17.2%之材質的培養皿(175T Flask, Corning)中進行細胞培養10~14天，培養環境為溫度控制在36.5~38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

在培養10~14天時，分別分析實施例5及6的細胞數量和細胞存活率、以及表面抗原表達程度，並將所得結果記錄於表4中。表4

	實施例5	實施例6
每cm ²所得細胞數量(個數)	49,612	31,761
細胞存活率	95%	96%
表面抗原表達程度(%)	CD 29	99.99	99.95
CD44	99.96	99.96
CD 90	100	99.98
CD 105	97.82	97.13
CD 14	0.00	0.02
CD 34	0.03	0.01
CD 45	0.02	0.03
HLA-DR	0.13	0.15

由上述表4的結果可知，實施例5的細胞數量從1×10 ⁶個細胞增加至2.56×10 ⁸個細胞(49,612個細胞/cm ²)；而實施例6的細胞數量從1×10 ⁶個細胞至1.64×10 ⁸個細胞(31,761個細胞/cm ²)。由此可知，在相同培養基構成分的情況下，將脂肪間葉幹細胞培養在含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿，其擴增速度會明顯優於培養在含氧官能基團比例在5-20%之材質的培養皿。

又，確認各實施例的表面抗原，實施例5和6所培養出的ADSCs高水平表達特異性間質幹細胞標誌CD90和CD105，而造血細胞標誌物CD14、CD34、CD45和HLA- DR分子表達量非常低，符合脂肪間葉幹細胞的特徵。

經由上述結果可知，實施例5所採用的培養皿相對於實施例6所採用的培養皿能夠更有效的提升脂肪間葉幹細胞的擴增數量，並且不會影響細胞活性以及表面抗原特徵。同時，與軟骨形成分化有關的標誌物CD29、CD44及CD105具高水平表達。 實施例 7 及比較例 1

在本實施例中採用與前述實施例1及3相同取得方式的初代脂肪間葉幹細胞進行細胞擴增，培養方式如下：

實施例7：將約1×10 ⁷個脂肪間葉幹細胞以與實施例1相同之培養基構成分於含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在 36.5~38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

比較例1：將1×10 ⁷個脂肪間葉幹細胞以與實施例3相同之培養基構成分於含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿，進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在36.5~38.5℃，且含有5%二氧化碳之細胞培養箱中。

在培養至第7天時，分別分析各實施例的細胞數量，結果發現實施例7的細胞數量從1×10 ⁷個細胞增加至7.88×10 ⁷個細胞，而比較例1的細胞數量從1×10 ⁷個細胞下降至1.96×10 ⁶個細胞。由此結果可知，並非所有培養基與含氧官能基團比例在20%以上之材質的培養皿搭配使用就能夠使脂肪間葉幹細胞的數量擴增，採用實施例1的培養基與含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿搭配使用(實施例7)才能夠最有效率的擴增脂肪間葉幹細胞的數量。 安定性試驗

將實施例7擴增所得的脂肪間葉幹細胞放入細胞凍存液[5%~15%二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)或含DMSO凍存液]中進行分裝，然後將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存，依照表5不同凍存天數取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，打開冷凍管，將細胞懸浮液轉移到離心管中，並以300×g離心5分鐘。

接著，去除上清液並將輕輕地將細胞顆粒放置於在10 mL鹽水中，然後在20~25°C下離心5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，以ADAM-MC™ Automatic Cell計數器(Digital Bio，NanoEnTek Inc.)進行評估細胞存活率，並將所得結果記錄於表5中。表5

凍存天數(day)	細胞存活率
125	90%
188	93%
215	93%
243	94%
250	91%
397	92%
404	94%
425	92%
586	92%
607	94%
614	94%
803	92%
817	92%
831	91%
838	91%
887	93%
915	93%
922	91%
957	91%
985	91%
1,084	93%

如表5所示，經由實施例1培養基構成分於含氧官能基團比例在20-35%之材質的培養皿所培養之細胞(實施例7)凍存1,084天後，其細胞存活率維持在90%以上。總上實驗所得本發明為最有效率的擴增脂肪間葉幹細胞的數量，不會影響細胞活性以及表面抗原特徵，同時能長期維持90%以上細胞存活率及軟骨形成分化有關的標誌具高水平表達，對於產品未來的應用及發展提供廣大的效益。

將實施例7擴增所得的脂肪間葉幹細胞凍管進行解凍後，取4~5x10 ⁷個細胞與3mL磷酸鹽緩衝生理鹽水(DPBS)或生理食鹽水(saline)混合，在2~10℃的環境中靜置0~48小時，過後以300×g 離心5分鐘，收取上清液體及同時收集上清液體中的細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)，其中將含有EVs的上清液體與Exo-Quick-TC (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)於4℃一起作用至少12小時後，進行EVs沉澱，完成EVs沉澱後，以蛋白質裂解液(lysis buffer)進行處理，取得EVs蛋白，其EVs蛋白濃度於靜置18~24小時後為478 g/mL和靜置48小時後為404.5 g/mL。上清液體跟EVs蛋白以MILLIPLEX ^®MAP MULIPLEX DETECTION (Merck Milliplex, 儀器型號：Luminex Magpix分析儀)分析白血球生長激素(Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF)、二號介白素(Interleukin-2, IL-2)、十號介白素(Interleukin-10, IL-10)、血小板衍生生長因子-AA (Platelet-derived growth factor-AA, PDGF-AA)、轉化生長因子-α (transforming growth factor-α, TGFα)、血管內皮生長因子-A (Vascular endothelial growth factor, VEGF-A) 、軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein, COMP)、Uteroglobin、十八號介白素結合蛋白-α (IL-18binding protein-α, IL-18BPα)、甲型胎兒蛋白 (a-Fetoprotein, AFP)、類血管生成蛋白-3 (angiopoietin-like 3, ANGPTL-3)、ANGPTL6/AGF、脂肪酸結合蛋白-1 (Fatty acid-binding protein-1, FABP1)、纖維母細胞生長因子-19 (Fibroblast growth factor-19, FGF-19)、FGF-21、FGF-23及基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的含量，相關數值記錄於表6中。表6

因子(pg/ml)	實施例7
0 hr	24 hrs	48 hrs
上清液	EVs	上清液	EVs	上清液	EVs
G-CSF	2.54±0.53	3.34±0.81	150.48±0.00	123.84±1.10	116.31±3.10	67.38±4.79
IL-2	0.41±0.03	0.38±0.03	0.28±0.00	0.39±0.00	0.32±0.00	0.45±0.03
IL-10	1.83±0.13	1.77±0.09	1.57±0.00	1.57±0.00	1.08±0.00	1.24±0.00
PDGF-AA	7.19±0.20	8.89±1.53	16.19±0.74	10.52±0.23	10.53±0.67	24.47±0.00
TGFα	0.93±0.07	1.04±0.11	0.64±0.00	0.95±0.21	0.64±0.00	0.71±0.00
VEGF-A	1.60±0.08	1.50±0.08	34.59±1.85	270.05±2.40	27.91±1.55	118.52±2.11
COMP	3.64±0.00	4.00±0.32	4.51±0.00	3.64±0.00	4.51±0.00	5.19±0.33
Uteroglobin	2.42±0.00	2.56±0.06	2.77±0.00	2.60±0.25	2.69±0.12	3.13±0.00
IL-18BPα	1.42±0.00	0.99±0.38	2.06±0.00	1.42±0.00	1.74±1.45	1.74±1.45
AFP	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00
ANGPTL3	0.34±0.01	0.34±0.01	0.26±0.01	0.38±0.01	0.30±0.01	0.38±0.01
ANGPTL6/AGF	0.48±0.01	0.54±0.05	0.48±0.02	0.48±0.02	0.43±0.02	0.50±0.01
FABP1	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00	0.02±0.00
FGF-19	0.05±0.00	0.07±0.02	0.06±0.00	0.06±0.00	0.06±0.00	0.09±0.00
FGF-21	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00
FGF-23	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00	0.01±0.00
MMP-2	83.56±0.00	98.75±13.59	732.88±0.00	512.95±62.11	669.83±89.17	310.66±0.00

本發明之組成物

將實施例7擴增所得脂肪間葉幹細胞與3.3±0.2 mL磷酸鹽緩衝生理鹽水(DPBS)或生理食鹽水(saline)混合，在2~10℃的環境中靜置18~24小時，在靜置過程中實施例7擴增所得脂肪間葉幹細胞會釋放出細胞外囊泡及生長因子；如前所述，脂肪間葉幹細胞及在特定靜置時間所產生的細胞外囊泡及生長因子所組成的製劑即為本發明之組合物，能夠用於治療退化性關節炎。

此外，也可以將脂肪間葉幹細胞靜置於其他注射用水中待其產生細胞外囊泡及生長因子，例如可以選自注射用蒸餾水、0.45%~3%氯化鈉注射液、2.5%~50%葡萄糖注射液、乳酸林格氏乙注射液(Lactated Ringer’s B)、或林格兒液(Ringer’s Solution)，在此不加限制。 應用例 . 本發明之組成物治療退化性關節炎

在本應用例中，將上述所得到本發明之組成物用於退化性關節炎患者的臨床治療。本應用例是根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的倫理原則以及當地法律法規進行。本應用例遵循現行的藥品優良臨床試驗件業指引。

本應用例幹細胞相關品質檢測由第三方認證實驗室執行[臺灣認證基金會(Taiwan Accreditation Foundation(TAF)，認證標準：ISO/IEC 17025，認證號：2800)]。無菌試驗採用中華藥典無菌試驗法及USP43, Sterility Tests為依據，以直接接種法進行評估；革蘭氏染色(Gram stain)為另一種快速微生物檢測測試，使用染色的方式分辨是否為革蘭氏陽/陰性菌。黴漿菌(Mycoplasmas)採用中華藥典黴漿菌試驗法為依據，以核酸擴增技術的方式進行評估。內毒素(Endotoxin)檢測採用中華藥典細菌內毒素檢驗法及USP43, Bacterial Endotoxins Tests為依據，以動力呈色法進行評估。CD34、CD45、CD90和CD105 (Becton Dickinson)細胞表面標記物使用BD AccuriC6流式細胞儀(Becton Dickinson)進行分析。細胞存活率以ADAM-MC™ Automatic Cell計數器(Digital Bio，NanoEnTek Inc.)進行評估。

脂肪間葉幹細胞擴增後相關標準如表7所示：表7

適應症	骨關節炎
幹細胞來源*	脂肪
細胞數	6-7×10 ⁶個脂肪間葉幹細胞 4-5×10 ⁷個脂肪間葉幹細胞
細胞活性(%)	＞70
細胞表面抗原表達(%)	CD34	＜10
CD45	＜10
CD90	＞90
CD105	＞90
安全性
微生物檢驗	未檢出
內毒素檢測(EU/mL)	＜0.25
黴漿菌檢測	不反應性
賦型劑	3.3±0.2 mL生理食鹽水(saline)
保存、靜置條件	2-10℃、0-24小時

* 脂肪組織捐贈者之特定需求為年齡為20~70歲，同時不具有相關傳染性病原或疾病(relevant communicable disease agents or diseases, RCSADs)的風險，亦沒有因異體移植傳播疾病的風險；人類免疫缺乏病毒第一與第二型(HIV type 1 & 2)、B 型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、人類傳染性海綿樣腦症(human transmissible spongiform encephalopathy, TSE)等相關傳染性病原或疾病測試結果，均為陰性或不反應性(non-reactive)。

受試者的選擇條件如下：

納入條件：

1.提供簽名並載明日期的受試者同意書。

2.受試者年齡為年滿40至80歲(包含80歲)。

3.受試者膝關節退化分級(Kellgren-Lawrence Grading Scale)為二到四級，採用美國風濕病學會訂定之膝關節炎標準評估。

4.即使在接受非類固醇消炎止痛藥(NSAID)的治療，受試者的目標膝關節的WOMAC退化性關節炎量表(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index, WOMAC)的疼痛指數仍介於7-17(包含17)。

5.無法接受長期使用非類固醇消炎止痛藥(NSAID)治療者(例如曾因使用非類固醇消炎止痛藥而發生嚴重的胃腸道副作用或因為本身的潛在疾病導致使用非類固醇消炎止痛藥後增加腸胃道系統，心血管系統或腎臟的風險)，及不能接受或希望延遲進行膝關節置換術者。

排除標準：

1.目標膝關節曾接受因骨折、韌帶重建、半月軟骨重建的手術和膝關節置換手術。

2.在篩選前12週曾對目標膝關節進行關節內介入治療(例如類固醇、麻醉劑、玻尿酸、關節鏡手術)。

3.篩選前1週內，除了乙醯胺酚(acetaminophen)和非類固醇消炎藥(NSAID)外，受試者接受或需要接受全身性或局部在目標膝關節免疫抑制劑、抗發炎藥、類固醇、鎮痛藥、鴉片類止痛藥或duloxetine (抗憂鬱藥)的治療。

4. 患有膝骨關節炎之外的其他關節疾病，試驗主持人判定不具試驗參加資格。

5. 無法接受核磁共振造影(MRI)檢查，包括對試驗中使用的核磁共振造影(MRI)顯影劑過敏、已知有幽閉恐懼症、體內有存在任何金屬性眼內異物或活動性/無活動性植入式醫療裝置(如心臟節律器、耳蝸(人工電子耳)、顱內血管夾或神經刺激器)。

6.目標膝關節受到感染或疑似感染。

7.有人類免疫缺乏病毒(HIV)感染病史。

8.篩選前2年內患有惡性腫瘤病史。

9.身體質量指數(BMI)≧35 kg /m ²(公斤/身高公尺的平方)。

10.已知對本試驗產品或活性對照的任何成分過敏。

11.在篩選前4週內，曾參與其他試驗性試驗。

12.持續或在過去2年內發生嚴重的醫療病情(例如同時並存的疾病)：心血管疾病(如紐約心臟協會第III或IV級)、肝臟疾病(如肝硬化評估指數C級，Child-Pugh Class C)、精神疾病(如酗酒、藥物濫用)、醫療病史、身體理學檢查或是實驗室檢查異常，經試驗主持人判定可能會干擾試驗結果或對受試者的安全產生不利影響。

13.具有生育能力的女性，在篩選時正在哺乳或血清/尿液懷孕檢測結果為陽性。

14.具有生育能力的受試者拒絕從簽署受試者同意書至最終/提前終止訪視期間使用高效的避孕措施。必須採用至少二種避孕法，其中一種必須為屏障法。可接受的方式包含：

(1)固定持續使用口服、注射或植入式荷爾蒙避孕法。

(2)放置子宮內避孕器(IUD)或子宮內投藥系統(IUS)。

(3)屏障式避孕法：保險套或阻塞帽(子宮隔膜或子宮頸/頂部帽)。

每個受試者依照上述納入排除條件篩選受試者，符合條件的受試者在第一天在目標膝蓋處接受單次關節內注射包含6~7×10 ⁶或4~5×10 ⁷個脂肪間葉幹細胞、脂肪間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡以及生長因子的組成物，分別為低劑量及高劑量，然後在第 1、4、8、12、24、36和48週進行預定訪視，安排受試者進行在注射後的西安大略及麥可麥司特大學關節炎量表(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index, WOMAC)、疼痛視覺類比量尺(Visual Analog Scales, VAS)、生活品質量表SF-12健康調查問卷、追蹤常規血液、生命徵象及目標膝部核磁共振造影(MRI)評估的變化。觀察如表8所示。表8

受試者的基礎資料，包含年紀、體重、身高、BMI、性別、種族、患病時間和Kellgren-Lawrence分級法(KL Grade)結果記錄於表9中。所有受試者未發生任何與試驗藥物相關嚴重不良事件(SAE)。表9. 受試者的基礎資料

特徵 \ 治療	低劑量組	高劑量組
年紀 [Y/O]
最低~最高	57.0 ~ 73.0	52.0 ~ 72.0
體重 [kg]
最低~最高	53.6 ~ 84.0	57.6 ~ 87.0
身高 [cm]
最低~最高	152.8 ~ 166.2	147.3 ~ 172.9
BMI 基線值 [kg/m ²]
最低~最高	20.1 ~ 30.4	21.7 ~ 32.9
性別
男	0%	40.0%
女	100.0%	60.0%
目標膝蓋
左膝	40.0%	80.0%
右膝	60.0%	20.0%
種族
亞洲	100.0%	100.0%
疾病持續時間 [ 年 ]
最低~最高	1.69 ~ 9.85	0.07 ~ 10.25
對目標膝蓋的 Kellgren-Lawrence 分級法 (KL Grade)
Grade 0	0%	0%
Grade 1	0%	0%
Grade 2	40.0%	46.7%
Grade 3	40.0%	53.3%
Grade 4	20.0%	0%
WOMAC基線值
最低~最高	30~47	38~56
WOMAC疼痛基線值
最低~最高	9~10	9~12
WOMAC僵硬基線值
最低~最高	1~4	3~6
WOMAC生理功能基線值
最低~最高	20~34	29~42
VAS基線值
最低~最高	19~74	52~83
SF-12 PCS基線值
最低~最高	34.34~43.81	21.62~40.69
SF-12 MCS基線值
最低~最高	39.87~48.05	36.13~50.79
SF-12 SF6D_R2基線值
最低~最高	0.48~0.8	0.52~0.818
軟骨厚度(mm)
最低~最高	1.10~1.87	1.13~2.23

WOMAC為Bellamy等學者於1981年提出用以評估髖關節(hip)和膝關節(knee)健康狀況之問卷，分為疼痛、僵硬、關節功能三個部分來評估髖關節和膝關節的結構和功能，總共有24個項目，每個項目從最輕微(0分)到最嚴重(4分)，疼痛的部分有5個項目，僵硬的部分有2個項目，關節功能的部分有17個項目，總分最高96分，WOMAC疼痛為0~20分、WOMAC僵硬為0~8分及WOMAC生理功能為0~68分。研究顯示此量表對於退化性膝關節炎的評估具有客觀的可靠性、有效性和敏感性，是一個廣泛應用於退化性關節炎患者的評估量表。VAS本研究使用視覺類比量尺評估病人疼痛程度，此方法廣泛應用於臨床上追蹤患者骨骼肌肉系統疼痛情形。測試的方法為準備一張空白紙張，在上面有一條長100公分的直線，左側端點標示0，右側端點標示100。測試時會告訴患者：0表示完全不痛，100表示最痛無法忍受的痛，請患者拿筆在直線上劃下自己疼痛的程度，疼痛指數即可用標有刻度的直尺量出長度來表示(以mm為單位)。如表10~13所示，病患在治療1週後，不論是低劑量組或高劑量組均顯著減緩疼痛至少35%以上，而在高劑量的部份，其減緩疼痛可以持續至少24週以上達80%以上。在骨關節炎引起的僵硬，在治療1週後，不論是低劑量組或高劑量組均顯著改善至少25%以上，並持續至少24週以上達55%以上。在骨關節炎引起的身體功能異常的部份，在治療1週後，不論是低劑量組或高劑量組均顯著改善至少43%以上，並持續至少24週以上達52%以上。總上可以得知本發明能在治療後1週即有效改善骨關節炎的疼痛、僵硬及身體功能，並持續至少24週。表10. 低劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其WOMAC及VAS結果

淨變化	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD
WOMAC	0.00	0.00	-17.67	2.08	-4.33	4.73	-16.33	5.51	-17.33	8.50	-18.00	18.38
WOMAC疼痛	0.00	0.00	-4.67	0.58	-2.33	1.53	-4.33	1.15	-5.00	1.73	-5.50	3.54
WOMAC僵硬	0.00	0.00	-0.67	0.58	-0.33	0.58	-1.00	1.00	-0.67	0.58	-1.50	0.71
WOMAC生理功能	0.00	0.00	-12.00	2.00	-2.33	4.51	-10.67	3.79	-11.67	6.66	-14.00	18.38
VAS	0.00	0.00	-28.00	17.06	-21.00	11.53	-22.33	4.51	-13.67	8.08	-14.00	4.24

表11. 低劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其WOMAC及VAS改善百分比

改善%	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
WOMAC	0%	45%	11%	42%	44%	46%
WOMAC疼痛	0%	50%	25%	46%	54%	59%
WOMAC僵硬	0%	25%	13%	38%	25%	56%
WOMAC生理功能	0%	44%	9%	40%	43%	52%
VAS	0%	54%	40%	43%	26%	27%

表12.高劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其WOMAC及VAS結果

淨變化	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD
WOMAC	0.00	0.00	-19.83	8.75	-28.33	8.26	-30.33	6.06	-33.00	8.49	-36.80	8.32
WOMAC疼痛	0.00	0.00	-4.13	1.46	-5.50	0.93	-6.13	1.55	-6.38	1.69	-7.57	1.62
WOMAC僵硬	0.00	0.00	-1.89	1.17	-2.00	0.87	-2.44	0.88	-2.44	0.73	-2.38	0.92
WOMAC生理功能	0.00	0.00	-15.25	4.40	-19.25	6.14	-20.38	4.47	-20.25	7.78	-23.75	6.63
VAS	0.00	0.00	-22.67	14.20	-32.67	15.26	-35.78	13.48	-39.33	15.03	-53.25	9.57

表13. 高劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其WOMAC及VAS改善百分比

改善%	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
WOMAC	0%	44%	63%	67%	73%	81%
WOMAC疼痛	0%	42%	56%	63%	65%	78%
WOMAC僵硬	0%	44%	46%	56%	56%	55%
WOMAC生理功能	0%	43%	55%	58%	58%	68%
VAS	0%	35%	51%	56%	61%	83%

SF-12是由Ware等人於1994年所發展，在一年內被超過一百萬個研究使用，亦被國家品質保證委員會(the National Committee 32 for Quality Assurance NCQA)選為年度成員醫療照護調查(Annual Member Health Care Survey)。慢性疼痛的患者因長期的疼痛，可能造成生活品質降低、個人身心靈健康狀態改變，為了解受試者在進行治療後，是否有因疼痛程度改變，進而影響生活品質之變化，而世界各地在進行生活品質評估研究時，經常使用各式生活品質量表作為評估工具。

SF-12問卷主要測量受者自覺健康狀態，包括身心健康狀態的兩大因素，包含了八項評估概念：總體健康(General Health, GH)、生理功能(Physical Function, PF)、身體功能問題導致角色受限(Role Physical, RP)、身體疼痛(Bodily Pain, BP)、活力(Vitality, VT)、社交功能(Social Function, SF)、情緒導致角色受限(Role Emotional, RE)與心理健康(Mental Health, MH)，另可將12個問題區分為兩大面向：生理面向(Physical Component Summary, PCS)和心理面向(Mental Component Summary, MCS)，並各自給分，此問卷為用來了解受試者在過去一個月的生理和心理健康狀態，分數越高表示受測者的心理或生理健康狀態越佳，而此問卷之計分需參照問卷搭配之常模進行轉化計算，方可得到正確之分數。SF-12的衍生產品是SF-6D，它是由6個維度(身體功能、角色限制、社會功能、疼痛、能量、心理健康)組成的多屬性效用度量，每個維度都有四到六級之間。SF-6D健康狀態的效用值1.0代表完全健康，0代表死亡。如表14~17所示，病患在治療1週後，不論是低劑量組或高劑量組均改善生活品質至少7%以上，而在高劑量的部份，其改善生活品質可以持續至少24週以上達22%以上。總上可以得知本發明能在治療後1週即有效改善生活品質，並持續至少24週。表14. 低劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其SF-12結果

淨變化	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD
PCS	0.00	0.00	2.99	4.62	3.35	4.40	2.89	2.88	7.12	3.11	10.32	9.05
MCS	0.00	0.00	6.24	6.00	1.07	5.85	4.85	1.32	5.54	2.04	-2.59	4.17
SF6D_R2	0.00	0.00	0.06	0.12	0.00	0.17	0.06	0.13	0.09	0.25	0.24	0.05

表15. 低劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其SF-12改善百分比

改善%	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
PCS	0%	7%	8%	7%	18%	25%
MCS	0%	14%	2%	11%	13%	-6%
SF6D_R2	0%	9%	0%	10%	14%	37%

表16. 高劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其SF-12結果

淨變化	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD	平均	SD
PCS	0.00	0.00	6.16	3.78	8.65	5.22	9.58	5.06	8.62	3.98	11.34	5.55
MCS	0.00	0.00	6.18	7.54	11.94	4.09	6.20	4.49	11.76	5.69	15.51	6.12
SF6D_R2	0.00	0.00	0.05	0.07	0.02	0.23	0.07	0.04	0.08	0.08	0.14	0.08

表17. 高劑量組治療後0、1、4、8、12、24週，其SF-12改善百分比

改善%	0wk	1wk	4wk	8wk	12wk	24wk
PCS	0%	18%	26%	29%	26%	34%
MCS	0%	15%	28%	15%	28%	37%
SF6D_R2	0%	8%	4%	11%	13%	22%

以核磁共振造影(MRI)評估本發明在治療前後，軟骨厚度的變化，如圖1所示，病患在治療24週後，低劑量組增加0.06 mm軟骨厚度，自基期加4%；高劑量組增加0.33 mm軟骨厚度，自基期加22%；病患在治療48週後，低劑量組增加0.01 mm軟骨厚度，自基期加1%；高劑量組增加0.18 mm軟骨厚度，自基期加12%。由此可知本發明具有增加軟骨厚度的潛力。

綜上所述，本發明包含間葉幹細胞、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物確實可增加軟骨厚度、改善關節炎的疼痛、僵硬及身體功能，經由特定培養幹細胞的方式，提高細胞產量，同時提前於治療1週即有治療效果40%以上，同時改善骨關節炎病友的生活品質。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

無

圖1顯示以核磁共振造影(MRI)評估本發明在治療前後，軟骨厚度的變化。

Claims

一種用於製備包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物之方法，包含以下步驟： (a) 提供一間葉幹細胞； (b) 將該間葉幹細胞培養在補充有N-乙醯基-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine)及L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)的角質形成細胞(keratinocyte)無血清培養基(serum free medium, SFM)中，藉此擴增該間葉幹細胞；以及 (c) 將該間葉幹細胞靜置一段預定時間，得到該包含間葉幹細胞、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡及生長因子的組成物。
如請求項1所述的方法，其中該間葉幹細胞為人類脂肪間葉幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)。
如請求項1所述的方法，其中該N-乙醯基-L-半胱胺酸具有一為1-100 mM的濃度，及該L-抗壞血酸2-磷酸具有一為0.05-50 mM的濃度。
如請求項1所述的方法，其進一步包含將該間葉幹細胞於含氧官能基團比例在20%~35%之材質的培養皿進行細胞擴增。
如請求項1所述的方法，其中該預定時間為18~24小時。
如請求項1所述的方法，其中該生長因子是Uteroglobin。
如請求項1所述的方法，其中該生長因子是選自於下列所組成的群組：白血球生長激素(Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF)、十號介白素(Interleukin-10, IL-10)、血小板衍生生長因子-AA(Platelet-derived growth factor-AA, PDGF-AA)、轉化生長因子-α(transforming growth factor-α, TGFα)、血管內皮生長因子-A (Vascular endothelial growth factor, VEGF-A) 、軟骨寡聚基質蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein, COMP)、十八號介白素結合蛋白-α (IL-18 binding protein-α, IL-18BPα)、類血管生成蛋白-3 (angiopoietin-like 3, ANGPTL-3)、基質金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)，及其組合。
如請求項7所述的方法，其中該生長因子是十號介白素或轉化生長因子-α的表現是下調表現。
一種包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物，其是藉由一包含如請求項1至5中任一項所述的方法而被製備。
一種如請求項9所述的包含間葉幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)、該間葉幹細胞所產生的細胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)及生長因子的組成物用於製備一治療關節炎的醫藥品的用途。
如請求項10所述的用途，其中該間葉幹細胞為人類脂肪間葉幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)。
如請求項10所述的用途，其中該關節炎為退化性關節炎(degenerative arthritis)。
如請求項10所述的用途，其中該間葉幹細胞的有效濃度為單次關節內注射6×10 ⁶~5×10 ⁷個間葉幹細胞。
如請求項10所述的用途，其中該組成物增加軟骨厚度。
如請求項10所述的用途，其中該組成物改善關節炎的疼痛、僵硬及身體功能。
如請求項11所述的用途，其中該ADSC是藉由使用一包含1~100 mM之N-乙醯基-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine)及0.05~50 mM之L-抗壞血酸2-磷酸(L-ascorbic acid 2-phosphate)的角質形成細胞(keratinocyte)-無血清培養基(serum free medium, SFM)而被擴增。
如請求項16所述的用途，其中該ADSC是進一步於含氧官能基團比例在20%~35%之材質的培養皿進行擴增。
如請求項10所述的用途，其中該關節炎是在該醫藥品被投藥後一週產生治療效果。
如請求項10所述的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。