TW202413422A - 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途 - Google Patents
抗體、其抗原結合片段及其藥物用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202413422A TW202413422A TW112125861A TW112125861A TW202413422A TW 202413422 A TW202413422 A TW 202413422A TW 112125861 A TW112125861 A TW 112125861A TW 112125861 A TW112125861 A TW 112125861A TW 202413422 A TW202413422 A TW 202413422A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- seq
- chain variable
- variable region
- antibody
- light chain
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 89
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 claims description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 102000049583 human ROR1 Human genes 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000007924 marginal zone B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000021937 marginal zone lymphoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100039614 Nuclear receptor ROR-alpha Human genes 0.000 claims 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 102000005435 Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptors Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010006700 Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptors Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 18
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 9
- 101001103033 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR2 Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102220247477 rs1024182354 Human genes 0.000 description 7
- 102200118204 rs35890380 Human genes 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100039616 Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR2 Human genes 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 101100038118 Mus musculus Ror1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108700028760 rat Ror1 Proteins 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000049622 human ROR2 Human genes 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102220492414 Ribulose-phosphate 3-epimerase_H35A_mutation Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
本揭露關於受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1抗體或抗原結合片段及其藥物用途。特別是，根據本揭露的單株抗體抑制腫瘤，因此可用作癌症治療劑和靶向癌症治療，包括藉由特異性結合檢測各種癌症，以及向特定癌症遞送藥物等。
Description
本發明關於抗體，特別是關於對受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)表現出特異性的抗體，以及其用途，例如在癌症治療中的用途。
ROR(受體酪胺酸激酶樣孤兒受體)是RTK(受體酪胺酸激酶)家族的跨膜蛋白，有ROR1和ROR2，它們是I型跨膜受體酪胺酸激酶。ROR1和ROR2的胞外區含有免疫球蛋白(Ig)結構域、富含半胱胺酸的結構域(CRD)(也稱為捲曲(Frizzled，Fz)結構域)和環餅(Kringle，Kr)結構域。所有三個結構域均參與蛋白質-蛋白質相互作用。在細胞內，ROR1和ROR2具備酪胺酸激酶(TK)結構域和富含脯胺酸的結構域(PRD)，由兩個富含絲胺酸/蘇胺酸的結構域橫跨(Borcherding等人，2014,Protein Cell,5：496；Rebagay等人，2012,Prontiers in oncology,2：1)。
ROR1在胚胎和胎兒發育過程中表達，並且控制細胞極性、細胞遷移和神經突生長等。表達根據發育進展逐漸減少，它在成人中幾乎不表達，在B細胞發育過程中暫時表達，在脂肪細胞中僅報導了極少的表達(Hudecek等人，2010,Blood 116：4532；Matsuda等人，2001,Mech.Dev.105：153)。
然而，由於在各種癌細胞中觀察到ROR1的過度表達，因此將其歸類為癌胎(oncofetal)基因。特別是，ROR1作為抗癌抗體靶標受到關注，因為發現ROR1在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中過度表達。據報導，除了慢性淋巴細胞白血病(CLL)以外，它不僅在血液系統惡性腫瘤中過度表達，如B細胞白血病、淋巴瘤、急性髓系白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)等，還在實體癌中過度表達，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、結直腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌等。
ROR1的這種癌細胞特異性表達顯示ROR1可以是有效的癌症靶標，因此需要開發特異性識別它的抗體。該癌胎蛋白是癌症療法的有吸引力的靶標。ROR1抗體已描述於文獻W02014031174(UC961)、WO2017127664(XBR1-402)等中。並且一種人源化鼠抗ROR1抗體UC961已進入復發或難治性慢性淋巴細胞白血病的臨床試驗。
考慮到ROR1的癌症特異性表達及其在各種癌症中的表達，可以根據每種抗體的特性或用途將針對同一ROR1抗原的抗體開發成不同的抗癌抗體，因此有必要開發可以替代或補充現存抗體的各種抗體。由於可用的ROR1特異性單株抗體數量很少，因此本領域需要更好的抗ROR1抗體，其具有已知抗體不具備的有效內化或其他功能特性。還需要額外的診斷工具來檢測ROR1相關疾病病症中的ROR1表達。本發明旨在解決這些和其他需要。
抗體-藥物綴合物的抗癌功效被認為依賴於表達表面抗原的癌細胞攝入它們，因此靶向ROR1的單株抗體的內化不足也是待解決的緊急問題。
本發明要解決的技術問題是克服靶向ROR1的抗體與ROR1結合能力弱、與ROR2的交叉反應性和在人細胞中內化不足的缺陷。
具體地，本發明涵蓋以下方面：
本揭露提供了一種抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下序列的一個或多個CDR區序列：一種抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3區的抗體重鏈可變區以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3區的抗體輕鏈可變區，其中：a)HCDR1如SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05或SEQ ID NO：06中所示；b)HCDR2如SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中所示；c)HCDR3如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中所示；d)LCDR1如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26中所示；e)LCDR2如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中所示；f)LCDR3如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39中所示。
在一些實施方案中，重鏈可變區序列包含：分別如SEQ ID NO：01中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：07中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：14中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：02中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：08中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：15中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：03中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：09中所示的HCDR2和如SEQ ID
NO：16中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：04中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：10中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：17中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：05中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：11中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：18中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：05中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：12中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：19中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：06中所示的HCDR1、如SEQ ID NO：13中所示的HCDR2和如SEQ ID NO：20中所示的HCDR3。
在一些實施方案中，輕鏈可變區序列包含：分別如SEQ ID NO：21中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：27中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：33中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：22中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：28中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：34中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：23中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：29中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：35中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：24中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：30中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：36中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：24中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：31中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：37中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：25中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：32中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：38中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：26中所示的LCDR1、如SEQ ID NO：32中所示的LCDR2和如SEQ ID NO：39中所示的LCDR3。
在較佳的實施方案中，抗ROR1抗體或抗原結合片段包含：a)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：07和SEQ ID NO：14中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如
SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：33中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或b)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：08和SEQ ID NO：15中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或c)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：16中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：35中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或d)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：36中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或e)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：18中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：37中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或f)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：19中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或g)重鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：20中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區序列，其包含分別如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：39中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在較佳的實施方案中，抗體或其抗原結合片段選自鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：40、42、44、46、48、50、52的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：41、43、45、47、49、51和53的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。
在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含：a)重鏈可變區，如SEQ ID NO：40所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：41所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或b)重鏈可變區，如SEQ ID NO：42所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：43所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或c)重鏈可變區，如SEQ ID NO：44所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：45所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或d)重鏈可變區，如SEQ ID NO：46所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：47所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或e)重鏈可變區，如SEQ ID NO：48所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：49所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或f)重鏈可變區，如SEQ ID NO：50所示或與其具有至少80%、85%、
90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：51所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或g)重鏈可變區，如SEQ ID NO：52所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，如SEQ ID NO：53所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。
在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含：a)如SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：41所示的輕鏈可變區；b)如SEQ ID NO：42所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區；c)如SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：45所示的輕鏈可變區；d)如SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：47所示的輕鏈可變區；e)如SEQ ID NO：48所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變區；f)如SEQ ID NO：50所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變區；g)如SEQ ID NO：52所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含：a)如SEQ ID NO：40所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：41所示的輕鏈可變區；b)如SEQ ID NO：42所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區；c)如SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：45所示的輕鏈可變區；d)如SEQ ID NO：46所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：47所示的輕鏈可變區；e)如SEQ ID NO：48所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：49所示的輕鏈可變區；f)如SEQ ID NO：50所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：51所示的輕鏈可變區；g)如SEQ ID NO：52所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：53所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，抗體是全長抗體，其進一步包含人抗體恆定區；較佳地，該人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體，並且該人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體的κ鏈和λ鏈恆定區及其常規變體；更佳地，所述全長抗體包含SEQ ID NO：68的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO：69的人輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，以上抗原結合片段選自：Fab、Fab'、F(ab')2、可變片段(Fv)、單鏈可變片段(scFv)、二聚結構域V(雙體抗體(diabody))、二硫穩定化Fv(dsFv)和含有CDR的肽。
在一些實施方案中，本揭露提供了一種分離的核酸分子，其編碼任何抗體或抗原結合片段。
在一方面，本揭露還提供了一種重組載體，其包含上述分離的核酸分子。
在另一方面，本揭露還提供了一種用上述重組載體轉化的宿主細胞，其中該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳真核細胞，更佳哺乳動物細胞。
在一方面，本揭露還提供了一種用於在培養基中產生上述抗體或抗原結合片段的方法，以產生並積累該抗體或其抗原結合片段，並從培養物中收穫該抗體或其抗原結合片段。
在一方面，本揭露還提供了一種用於免疫檢測或測量ROR1的方法，其中該方法包括藉由與上述抗體或抗原結合片段接觸來檢測ROR1。
在一方面，本揭露還提供了一種用於診斷與人ROR1陽性細胞相關的疾病的方法，其中該方法包括藉由與上述抗體或抗原結合片段接觸來檢測或測量ROR1或ROR1陽性細胞。
在一些實施方案中，本揭露提供了一種醫藥組成物，其包含治療有效量的上述抗體或抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施方案中，本揭露還提供了一種治療或預防與ROR1過度表達相關的疾病的方法，其包括將治療有效量的上述抗體或其抗原結合片段或上述醫藥組成物施用於需要治療或預防該疾病的受試者的步驟。
在一些實施方案中，與ROR1過度表達相關的疾病是癌症；較佳地，該癌症是慢性淋巴細胞白血病(CLL)；套細胞淋巴瘤(MCL)；B細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)；邊緣區淋巴瘤(MZL)；神經母細胞瘤；腎癌；肺癌；或乳腺癌。
抗體或其抗原結合片段可以(1)特異性識別或結合表達於源自人的細胞表面上的ROR1，或(2)特異性識別或結合細胞表面不存在的ROR1胞外結構域，或(3)在人細胞中具有足夠的內化。
圖1.使用流式細胞術分析對ROR1融合瘤株與HT29(A)、HCC1187(B)和T47D(C)細胞系進行體外結合表徵。MFI：中位數螢光強度。純化的抗人ROR1抗體用作陽性對照(BioLegend，Cat#357802)。純化的小鼠IgG1抗體用作同種型對照(Biolegend，Cat#400102)。
圖2.藉由流式細胞術分析確定抗ROR1重組抗體與ROR1+Jeko-1細胞(A)和ROR1-T47D細胞(B)的體外結合表徵。
圖3. ROR1+Jeko1細胞中抗ROR1重組抗體的內化動力學。
本發明基於開發一種可以特異性結合ROR1的抗體。本節中使用的標題僅為方便說明，並不限制本發明。
除非本文另有定義，否則本文所用的科學術語和技術術語具有與所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。此外，除非上下文特別要求，否則單數形式包括複數形式，複數形式包括單數形式。
定義
在下面詳述本發明之前，將理解的是，本發明不限於本文中描述的特定方法、方案和試劑，因為它們可以不同。還將理解的是，本文所用的術語僅用於描述特定實施方案的目的，而不旨在限制本發明的範圍，本發明的範圍將僅由所附申請專利範圍限制。除非另有定義，否則本文所用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的相同含義。
對於說明書的解釋，將應用以下定義，並且在任何適當的情況下，單數形式使用的術語也可以包括複數形式，反之亦然。將理解的是，本文所用的術語僅用於描述具體實施方案的目的，而不旨在限制。
術語“抗體”是指包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區
組成。VH區和VL區可以進一步細分為稱為互補決定區(CDR)的超變區，穿插著稱為框架區(FR)的更保守的區域。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白結合宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如效應子細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)。
如本文所用，抗體的術語“抗原結合片段”是指抗體的一個或多個片段，其保留與抗原(例如ROR1)特異性結合的能力。已表明可以藉由全長抗體的片段來實現抗體的抗原結合功能。抗體的術語“抗原結合片段”內涵蓋的結合片段的示例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含在鉸鏈區由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由VH和CHI結構域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單個臂的VL和VH結構域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；(vi)分離的互補決定區(CDR)；和(vii)兩個或更多個分離的CDR的組合，該CDR可以視需要地由合成接頭連接。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可以使用重組方法藉由合成接頭連接它們，使得能夠將其製成單個蛋白質鏈，其中VL和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體也旨在涵蓋於抗體的術語“抗原結合部分”中。
如本文所用，術語“人抗體”旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球
蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變而引入的突變)。然而，如本文所用，術語“人抗體”不旨在包括其中源自另一種哺乳動物物種(如小鼠)種系的CDR序列已被移植至人框架序列上的抗體。
如本文所用，術語“重組人抗體”包括藉由重組手段製備、表達、產生或分離的所有人抗體，如(a)從人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤分離的抗體(進一步描述於以下第一節中)，(b)從經轉化以表達抗體的宿主細胞分離的抗體，例如從轉染瘤分離，(c)從重組組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)藉由涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式製備、表達、產生或分離的抗體。此類重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某些實施方案中，可以對此類重組人抗體進行體外誘變(或者，當使用人Ig序列轉基因的動物時，進行體內體細胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是這樣的序列，其雖然源自人種系VH和VL序列並與之相關，但可以不自然存在於體內人抗體種系貯庫(repertoire)中。
術語“CDR”是指抗體可變結構域內的六個高變區之一，其主要有助於抗原結合。六個CDR最常用的定義之一由Kabat E.A.等人(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242提供。如本文所用，CDR的Kabat定義僅適用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3或H1、H2、H3)。
用於鑑定HCVR和LCVR胺基酸序列內的CDR的方法和技術是本領域公知的，並且可以用於鑑定本文揭露的指定HCVR和/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可以用於鑑定CDR邊界的示例性慣例包括，例如，基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲結構的Chothia(Chothia等人(1989)Nature 342：877-883)、基於抗體序列變異性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，US Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))、AbM(University of Bath)、Contact(University College London)、國際ImMunoGeneTics數據庫(IMGT)(萬維網上imgt.cines.fr/)和基於使用大量晶體結構的親和傳播聚類的North CDR定義。所屬技術領域中具有通常知識者可以容易地鑑定由每種編號系統定義的CDR。
CDR編號的有用比較如下：
如本文所用，術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但較佳為雙鏈DNA。當核酸被置於與另一個核酸序列的功能關係中時，它是“有效連接”的。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子與編碼序列有效連接。
核酸的製備方法是本領域的常規製備方法。較佳地，其包括以下步驟：藉由基因選殖技術獲得編碼上述蛋白質的核酸分子，或藉由人工全長序列合成的方法獲得編碼上述蛋白質的核酸分子。
所屬技術領域中具有通常知識者知曉，編碼蛋白質胺基酸序列的鹼基序列可以被適當地取代、缺失、改變、***或添加，以提供多核苷酸同系物。可以藉由在維持抗體活性的範圍內取代、缺失或添加編碼蛋白質序列的基因的一個或多個鹼基來製備本發明的多核苷酸的同系物。
術語“載體”是指能夠轉運已與其連接的另一核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可以將另外的DNA片段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接至病毒基因組中。本文揭露的載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自我複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)，或者可以在引入宿主細胞時摻入宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製(例如非附加體哺乳動物載體)。
重組表達載體可以藉由本領域的常規方法獲得，即藉由將本發明的核酸分子連接至各種表達載體，從而被構建。該表達載體是本領域多種常規載體中的一種，只要其可以攜帶上述核酸分子即可。載體較佳包括：各種質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體等。
如本文所用，術語“轉染瘤”包括表達抗體的重組真核宿主細胞，如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、植物細胞或真菌(包括酵母細胞)。
可以藉由常規技術(例如，如PCR擴增或基因組文庫篩選的方法)獲得根據本發明的抗體或其片段的DNA分子的序列。此外，編碼輕鏈和重鏈的序列可以融合在一起，以形成單鏈抗體。
一旦獲得相關序列，就可以使用重組方法批量獲得該相關序列。這通常藉由以下進行：藉由常規方法，將序列選殖至載體中，用載體轉化細胞，然後將相關序列與增殖的宿主細胞分離。
此外，可以人工合成相關序列，尤其是當片段長度短時。通常，首先合成數個小片段，然後將其連接在一起以獲得長序列的片段。
目前，可以完全藉由化學合成獲得編碼本發明的抗體(或其片段或其衍生物)的DNA序列。然後可以將DNA序列引入本領域已知的各種現存DNA分子(或例如載體)和細胞中。此外，還可以藉由化學合成將突變引入本發明的蛋白質序列中。
一般地，在適合表達根據本發明的抗體的條件下培養獲得的宿主細胞。然後，藉由使用常規的免疫球蛋白純化步驟純化本發明的抗體，例如所屬技術領域中具有通常知識者公知的常規分離純化手段，如蛋白A-瓊脂糖、羥基
磷灰石色譜、凝膠電泳、透析、離子交換色譜、疏水色譜、分子篩色譜或親和色譜。
可以藉由常規手段鑑定獲得的單株抗體。例如，可以藉由免疫沉澱或體外結合測定(如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來確定單株抗體的結合特異性。可以藉由例如Scatchard分析來確定單株抗體的結合親和力(Munson等人，Anal.Biochem.,107：220(1980))。
根據本發明的抗體可以在細胞中或細胞膜上表達，或者胞外分泌。如有必要，可以根據重組蛋白的物理、化學和其他特性，藉由各種分離方法來分離並純化重組蛋白。這些方法是所屬技術領域中具有通常知識者公知的。這些方法的示例包括但不限於：常規複性處理、藉由蛋白質沉澱劑處理(如鹽沉澱)、離心、藉由滲透進行細胞裂解、超聲處理、超離心、分子篩色譜(凝膠色譜)、吸附色譜、離子交換色譜、高效液相色譜(HPLC)和任何其他液相色譜，及其組合。
多肽的術語“變體”，例如抗原結合片段、蛋白質或抗體的變體，是與另一多肽序列相比，其中一個或多個胺基酸殘基被***、缺失、添加和/或取代的多肽，並且包括融合多肽。此外，蛋白質變體包括這樣的蛋白質變體，其藉由蛋白質酶切割、磷酸化或其他翻譯後修飾進行修飾，但保持本文揭露的抗體的生物活性，例如與ROR1結合和特異性。變體可以與本文揭露的抗體或其抗原結合片段的序列約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%相同。可以參照以下描述計算同一性或同源性百分比(%)。
在一個實施方案中，同源性或同一性百分比可以計算為100×[(相同位置)/min(TGA,TGB)]，並且在該式中，TGA、TGB是比較的序列A和B的殘基數與內部間隙位置之和(Russell等人，J.Mol Biol.,244：332-350(1994))。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守變體，這意味著與本發明的抗體的胺基酸序列相比，有多至10個，較佳多至8個，更佳多至5個，最佳多至3個胺基酸被具有相似或相似特性的胺基酸取代以形成多肽。這些保守變體多肽較佳藉由根據表A的胺基酸取代產生。
表A
如本文所用，術語“KD”(M)旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。“KD”是指解離常數，其由Kd與Ka的比值(即Kd/Ka)獲得，並表示為莫耳濃度(M)。鑑於本揭露，可以使用本領域的方法確定抗體的KD值。例如，抗體的KD可以藉由使用表面電漿共振來確定，如藉由使用生物傳感器系統(例如系統)或使用生物層干涉技術(如Octet RED96系統)來確定。
術語“親和力”是抗體或其抗原結合片段與抗原之間相互作用的強度，它由抗原的特性(如抗原的大小、形狀和/或電荷)和抗體或抗原結合片段的CDR序列決定。本領域已知用於確定親和力的方法，可以參考以下內容。
當解離常數(KD)<106M時，抗體或其抗原結合片段被稱為與其靶標(如抗原)“特異性結合”。當KD<109M時，抗體與其靶標以“高親和力”特異性結合。
如本文所用，術語“醫藥組成物”旨在指含有本文所述的一種或多種化合物或其生理/藥學上可接受的鹽或其前藥與其他化學成分(如生理/藥學上可接受的載體和賦形劑)的混合物。醫藥組成物的目的是促進對生物體的施用，這有利於活性成分的吸收並發揮生物活性。
當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物液體時，“施用”和“處理”是指使該動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物液體與外源性藥物試劑、治療試劑、診斷試劑或組成物接觸。“施用”和“處理”可以例如指治療方法、藥物代謝動力學方法、診斷方法、研究方法和實驗方法。細胞的處理涵蓋使細胞與試劑接觸，以及使液體與試劑接觸，其中該液體與細胞接觸。“施用”和“處理”也指體外處理和離體處理，例如藉由試劑、診斷試劑、結合組成物或藉由另一細胞對細胞進行體外處理和離體處理。當應用於人、獸醫或研究受試者時，“處理”是指治療性處理、預防性或預防措施、研究和診斷應用。
此外，本揭露包括用於治療與ROR1相關的疾病的藥物，其包含本揭露的抗體或其抗原結合片段作為活性成分。
對與ROR1相關的疾病沒有限制，只要它是與ROR1相關聯的疾病即可，例如，可以藉由結合人ROR1來減少由本揭露中揭露的分子誘導的治療反應。因此，當在適合於治療應用的製劑和配方中時，本揭露的分子對於那些患有腫瘤、癌症或感染性疾病的人非常有用。
此外，本揭露涉及用於免疫檢測或測量ROR1的方法，用於免疫檢測或測量ROR1的試劑，用於免疫檢測或測量表達ROR1的細胞的方法，以及用於診斷與ROR1陽性細胞相關的疾病的診斷試劑，其包含本揭露的特異性識別人ROR1的抗體或抗原結合片段作為活性成分。
在本揭露中，用於檢測或確定ROR1的量的方法可以是任何已知的方法。例如，它包括免疫檢測或測定。
免疫檢測或測定是一種藉由使用標記的抗原或抗體來檢測或確定抗體或抗原的量的方法。免疫檢測或測定的示例包括放射性物質標記的免疫
抗體方法(RIA)、酶免疫測定(EIA或ELISA)、螢光免疫測定(FIA)、發光免疫測定、蛋白質印跡方法、物理化學方法等。
可以藉由使用本發明的抗體或其抗體片段檢測或測量表達ROR1的細胞來診斷上述與ROR1陽性細胞相關的疾病。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測，並且較佳可以使用免疫沉澱、螢光細胞染色或免疫組織化學染色等。此外，可以使用螢光抗體染色方法等，其使用FMAT8100HTS系統(Applied Bio system)。
實施例
本發明藉由以下具體實施例進一步說明。將理解的是，這些實施例僅用於說明目的，並不旨在限制本發明的範圍。以下實施例中沒有詳細條件的實驗方法一般按照常規條件中描述的條件，如Sambrook.J等人《分子選殖實驗指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002)，或按照製造商推薦的條件(如產品說明書)。除非另有說明，否則百分比和份數均以重量計。除非另有說明，否則以下實施例中使用的實驗材料和試劑均為市售。
實施例中描述的室溫是本領域的常規室溫，並且通常為10-30℃。
實施例1：免疫和抗體篩選
實施例1-1：免疫原的製備
重組蛋白抗原huROR1-Fc(R&D systems，目錄號9490-RO)工程改造的huROR1-HEK293細胞和HT-29細胞(ATCC，目錄號HTB38)的組合用於免疫小鼠。對於工程改造的huROR1-HEK293細胞系，用慢病毒轉導HEK293細胞，該慢病毒含有編碼人ROR1胞外結構域的基因序列和嘌呤黴素抗性基因。從轉導的HEK293細胞中選擇具有最高huROR1表達的單個株。
實施例1-2：免疫
免疫方案：
藉由用重組蛋白抗原huROR1-Fc(R&D systems，目錄號9490-RO)、工程改造的huROR1-HEK293細胞和HT-29細胞(ATCC，目錄號HTB38)的組合免疫編碼人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈可變區的遺傳修飾的小鼠來獲得抗ROR1抗體。藉由ROR1特異性免疫測定來監測抗體免疫反應。當達到所需的免疫反應時，從每隻小鼠收穫脾細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保持其活力並形成融合瘤細胞，並篩選ROR1特異性。
實施例1-3：脾細胞融合
藉由電融合或PEG融合使脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCC® CRL-158)融合以獲得融合瘤細胞。按照製造商的說明，使用ClonacellTM HY技術(STEMCELL technologies)進行PEG融合。用於電融合的原代細胞：小鼠骨髓瘤細胞系比值為1：1，用於PEG融合的為10：1。
實施例1-4：藉由ELISA篩選與人ROR1蛋白特異性結合的融合瘤株
使用DuoSet ELISA輔助試劑盒(R&D System，DY008)進行ELISA。用1μg/ml人ROR1-Fc(9490-R0-050)、人ROR2-Fe(8609-RO-050)或BSA包被ELISA板過夜。藉由用洗滌緩衝液洗滌板三次來洗去過量未結合蛋白質，然後在室溫封閉1小時。將50μl ROR1融合瘤上清液加入雙複孔中並孵育1小時。洗去過量未結合抗體，並將50μl 1：30000稀釋的二抗山羊抗小鼠IgG Fc-HRP(ab5870)加入每個孔中1小時。根據製造商的方案，洗滌板，然後加入50μL化學發光劑(顏色A和顏色B)。使用25μL 2N硫酸停止反應。藉由酶標儀(PerkinElmer)測量樣
品在450nm處的光密度。所有測試的株均選擇性地與人ROR1結合，但不與人ROR2或BSA結合，證明了ROR1特異性。
表1. 藉由ELISA測定(OD450)對融合瘤株與人ROR1和人ROR2進行結合表徵
實施例1-5：藉由流式細胞術篩選與表達ROR1的癌細胞特異性結合的融合瘤株
使用流式細胞術分析對融合瘤上清液進行在ROR1+細胞系HT29(ATCC，HTB-38)、HCC1187(ATCC，CRL-2322)和ROR1-ROR2+細胞系T47D(ATCC，HTB-133)上的結合測試。簡要地，將細胞染色緩衝液中的50μL細胞(2×106個細胞/mL)與50μL未稀釋的融合瘤上清液混合。混合物在冰上孵育20min，然後用冰冷的染色緩衝液洗滌兩次。隨後用50μL PE標記的二抗(1：400稀釋，BioLegend，Cat#405307)對細胞進行染色20min。用染色緩衝液洗滌並用4%PFA
固定後，藉由流式細胞術分析細胞。純化的抗人ROR1抗體用作陽性對照(BioLegend，Cat#357802)。純化的小鼠IgG1抗體用作同種型對照(Biolegend，Cat#400102)。圖1顯示了藉由流式細胞術測量的所選擇的細胞結合信號的示例。與T47D細胞相比，鑑定株1E9、8B10、15G4、29D4、31G8、37F9、38H10與HT29細胞和HCC1187細胞的結合譜增強。
實施例2：陽性融合瘤株的測序
從陽性融合瘤株序列的過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，提取RNA，進行逆轉錄，然後進行VDJ區域擴增。對從每個株擴增的cDNA文庫進行下一代測序。獲得抗體1E9、8B10、15G4、29D4、31G8、37F9和38H10對應的重鏈和輕鏈可變區DNA序列的胺基酸序列。經可製造性評價，在FR區中進行數個突變，每種抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列及CDR序列如下表所示。VH/VL中CDR的胺基酸殘基根據Kabat和Wu編號系統進行編號和註釋。
表2. ROR1融合瘤株的重鏈可變結構域的CDR序列
表3. ROR1融合瘤株的輕鏈可變結構域的CDR序列
表4. ROR1融合瘤株的重鏈和輕鏈可變結構域的序列
實施例3：抗ROR1重組抗體的構建和表達
實施例3-1：重組抗體的分子株
直接合成編碼所選擇株的VH和VL區的cDNA序列，作為具有5'末端框內(in-frame)前導序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)的DNA片段。使用NEBuilder DNA組裝選殖試劑盒(New England Biolabs)將這些DNA片段選殖至所選擇的載體中。將VH區選殖至pFUSE-CHIg_hG1載體(InvivoGen#pfuse-hchg1)中，該VH區與載體中的hIgG1重鏈恆定區在框內。將VL區選殖至pFUSE2-CLIg_hk載體(InvivoGen，#pfuse2-hclk)中，該VL區與載體中的hIgκ輕鏈恆定區在框內。
按1E9、8B10、15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和38H10(N81K、T83S)的順序，將抗體的IgG形式公開為以下重鏈和輕鏈全長，分別為：SEQ ID NO：54(重鏈)和55(輕鏈)；SEQ ID NO：56(重鏈)和57(輕鏈)；SEQ ID NO：58(重鏈)和59(輕鏈)；SEQ ID NO：60(重鏈)和61(輕鏈)；SEQ ID NO：62(重鏈)和63(輕鏈)；SEQ ID NO：64(重鏈)和65(輕鏈)；SEQ ID NO：66(重鏈)和67(輕鏈)。
表5. 重組抗體IgG恆定區的序列
表6. 抗ROR1重組抗體的重鏈和輕鏈全長序列
實施例3-2：重組抗體的表達和純化
重鏈表達質粒和輕鏈質粒使用ExpiFectamine 293轉染試劑盒(ThermoFisher，A14524)共轉染至Expi293F細胞(ThermoFisher，#A14527)中，或使用ExpiFectamine CHO轉染試劑盒(ThermoFisher，A29129)共轉染至ExpiCHO-S細胞(ThermoFisher，#A29127)中。基於製造商的說明，質粒DNA濃度達到每ml懸浮細胞1.0μg，LC：HC載體比例為1：1。在37℃，8% CO2的軌道振盪器上培養轉染的細胞5至7天。收集條件培養基，並在AKTA Pure 25機器(Cytiva)上使用HiTrap MabSelect SuRe色譜管柱(Cytiva，#17549112)純化抗體。沖提的抗體用Tris緩衝液(pH 9.0)中和並進行PBS緩衝液置換。藉由UV吸收測量產物濃度，並藉由SDS-PAGE和HPLC測定質量。
實施例4：藉由流式細胞術對抗ROR1重組抗體與ROR1+和ROR1-細胞系進行結合表徵
使用不同的ROR1或ROR2表達陽性的癌細胞系，包括Jeko-1和T-47D細胞，藉由FACS分析確定hIgG1 mAb與細胞表面ROR1的結合。
Jeko-1細胞(ROR1陽性)維持於補充有20% FBS和1%青黴素和鏈黴素的RPMI-1640培養基中。T-47D細胞(ROR2陽性)維持於補充有10% FBS和1%青黴素和鏈黴素的RPMI-1640培養基中。在37℃，5% CO2的加濕氣氛中培養兩種細胞系。
為了確定hIgG1 mAb與細胞表面ROR1受體的結合，首先收穫細胞並以2×106個細胞/mL重新懸浮於細胞染色緩衝液(BioLegend)中。然後，用人Fc受體阻斷試劑(BioLegend)在冰上處理細胞10min。將所得細胞懸液等分成50μL等分試樣。將50μL不同濃度的hIgG1 mAb與細胞等分試樣混合，混合物中hIgG1 mAb的終濃度範圍為1.1pM至200nM。細胞在冰上孵育1小時，然後用細胞染色緩衝液洗滌兩次。向每個樣品中加入50μL二抗(PE綴合的山羊抗人Fc，eBioscienceTM，1：200稀釋)以重新懸浮細胞。在冰上再孵育細胞30min。隨後用細胞染色緩衝液洗滌細胞兩次，並重新懸浮於4% PFA中以固定細胞。使用iQue3分析樣品以使用相應的通道測量中位數螢光強度。結果揭露於圖2和表7中。作為結果，證實本發明的抗ROR1抗體以濃度依賴性模式與原來在細胞中表達的人ROR1特異性結合。此外，已證實它不與家族成員蛋白人ROR2結合。
表7. 抗ROR1重組抗體與ROR1+Jeko-1細胞結合的KD值
實施例5：抗ROR1重組抗體在表達ROR1的細胞中的細胞內化的表徵
為了探索用本發明的ROR1抗體開發ADC策略的可能性，發明人評估了由ROR1抗體結合誘導的抗體的內吞作用。在測定中，收集Jeko-1細胞並以2×106個細胞/mL懸浮於冰冷的染色緩衝液(具有0.5% FBS的PBS)中，然後用人Fc受體阻斷試劑(BioLegend，422302)處理。然後將細胞與Alexa Fluor 488標記的抗體在冰上預孵育1小時。孵育後，將細胞轉移至37℃培養箱中。在預定時間點(0min、15min、30min、45min、1小時、2小時、4小時、6小時)，將50μL細胞懸液等分並轉移至冰上孵育直至孵育結束以進行內化。然後，所有等分樣品用冰冷的染色緩衝液洗滌兩次。藉由抗Alexa Fluor抗體(Invitrogen，A-11094)淬滅細胞表面結合的Alexa Fluor 488信號。然後藉由流式細胞術分析由內化導致的細胞內剩餘信號。在0min時收集細胞的另外50μL等分試樣，保存於冰上，並不進行淬滅而藉由流式細胞術分析。該樣品作為100%細胞表面結合信號的對照。計算內化抗體的量並歸一化為每種抗體的100%細胞表面結合信號，如由下式所計算的：
歸一化內化(%)=(MFI t -MFI t0)/(MFI 總-MFI t0)×100%
內化結果基於中位數螢光強度(MFI)。MFI t 是在時間t收集的樣品的MFI；MFI t0是在時間0分鐘收集的樣品的MFI。MFI 總是收集並用作100%細胞表面結合信號的對照的另外樣品的MFI。
表8. ROR1+Jeko1細胞中抗ROR1重組抗體的內化動力學。
如圖3和表8所示，在Jeko-1細胞中觀察到抗ROR1抗體1E9、15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和38H10(N81K、T83S)的足夠內化信號。
實施例6：抗ROR1重組抗體的表位表徵
實施例6-1：與人ROR1亞結構域蛋白的ELISA結合
使用DuoSet ELISA輔助試劑盒(R&D System，DY008)進行ELISA。用1μg/ml人ROR1蛋白(RO1-H522y)或人ROR1亞結構域-Ig樣(RO1-H5221)、捲曲(RO1-H5222)和環餅(RO1-H5223)包被ELISA板過夜。藉由用洗滌緩衝液洗滌板
三次來洗掉過量未結合蛋白質，然後在室溫封閉1小時。將50μl 100μg/mL ROR1重組抗體加入雙複孔中並孵育1小時。洗去過量未結合抗體，並將50μl 1：2000稀釋的二抗山羊抗人IgG Fc-HRP(ab6858)加入每個孔中1小時。根據製造商的方案，洗滌板，然後加入50μL化學發光劑(顏色A和顏色B)。使用25μL 2N硫酸停止反應。藉由酶標儀(PerkinElmer)測量樣品在450nm處的光密度。所有測試的重組抗體均與全長人ROR1蛋白結合。1E9、8B10、15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和UC-961與人ROR1 Ig樣亞結構域蛋白結合，而38H10(N81K/T83S)與人ROR1環餅亞結構域蛋白結合。
表9. 藉由ELISA(OD450)對ROR1重組抗體與人ROR1全長或亞結構域蛋白進行結合表徵
實施例6-2：Octet分箱(binning)
共對五個株(15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和38H10(N81K/T83S))進行表位分箱，並與抗ROR1抗體UC961進行比較。使用來自Pall Life Sciences(Menlo Park,CA)的配備有抗物種和Ni-NTA傳感器的Octet Red384系統進行抗體表位分箱。實驗作為串聯分箱測定進行。測定由五步結合循環組成：1)建立緩衝基線30秒，2)使用由10×動力學緩衝液儲備液(ForteBio)稀釋的標準1×測定緩衝液(PBS+0.02%吐溫20，0.1% BSA，0.05%疊氮化鈉)，將50nM ROR1抗原(RO1-H522y)偶聯至Ni-NTA octet傳感器5分鐘，3)加載250nM每種抗體(飽和mAb)以使固定化抗原飽和10分鐘，4)使250nM每種抗體(競爭mAb)結合5分鐘，5)使捕獲傳感器再生30秒。如表9和表10所示，五種抗ROR1重組抗體可以分為2個不同的表位箱(bin)。15G4(N65S)、29D4、31G8和37F9位於同一箱1中，而38H10(N81K/T83S)位於不同的箱2中。此外，UC-961結合不與五種抗ROR1重組抗體(15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和38H10(N81K/T83S))中的任一種競爭，表明UC-961結合表位位於分開的表位箱3中。
表10. 使用Octet Red384系統藉由BLI確定與人ROR1蛋白結合的重組抗體的表位分箱。
表11.人ROR1的抗ROR1重組抗體的表位箱
實施例7：抗ROR1重組抗體與鼠ROR1蛋白的交叉反應性
使用DuoSet ELISA輔助試劑盒(R&D System，DY008)進行ELISA。用1μg/ml小鼠ROR1蛋白(RO1-M5221)、大鼠ROR1蛋白(RO1-R5221)或對照BSA包被ELISA板過夜。藉由用洗滌緩衝液洗滌板三次來洗掉過量未結合蛋白質，然後在室溫封閉1小時。將50μl 25μg/mL ROR1重組抗體加入雙複孔中並孵育1小時。洗去過量未結合抗體，並將50μl 1：2000稀釋的二抗山羊抗人IgG Fc-HRP(ab6858)加入每個孔中另外1小時。根據製造商的方案，洗滌板，然後加入50μL化學發光劑(顏色A和顏色B)。使用25μL 2N硫酸停止反應。藉由酶標儀(PerkinElmer)測量樣品在450nm處的光密度。重組抗體15G4(N65S)、29D4、31G8、37F9和38H10(N81K/T83S)能夠與小鼠ROR1蛋白和大鼠ROR1蛋白兩者結合。相比之下，UC961沒有顯示出對小鼠或大鼠ROR1蛋白的交叉反應性。
表12. 藉由ELISA(OD450)對ROR1重組抗體株與小鼠ROR1或大鼠ROR1蛋白進行結合表徵
TW202413422A_112125861_SEQL.xml
Claims (21)
- 一種抗ROR1抗體或其抗原結台片段，其包含：包含HCDR1、HCDR2和HCDR3區的抗體重鏈可變區以及包含LCDR1、LCDR2和LCDR3區的抗體輕鏈可變區，其中，a)HCDR1如SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05或SEQ ID NO：06中所示；b)HCDR2如SEQ ID NO：07、SEQ ID NO：08、SEQ ID NO：09、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13中所示；c)HCDR3如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中所示；d)LCDR1如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26中所示；e)LCDR2如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：32中所示；f)LCDR3如SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39中所示。
- 如請求項2所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區序列包含：分別如SEQ ID NO：01中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：07中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：14中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：02中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：08中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：15中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：03中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：09中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：16中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：04中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：10中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：17中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：05中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：11中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：18中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：05中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：12中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：19中所示的HCDR3；或分別如SEQ ID NO：06中所示的HCDR1，如SEQ ID NO：13中所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：20中所示的HCDR3。
- 如請求項1所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區序列包含：分別如SEQ ID NO：21中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：27中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：33中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：22中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：28中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：34中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：23中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：29中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：35中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：24中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：30中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：36中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：24中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：31中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：37中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：25中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：32中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：38中所示的LCDR3；或分別如SEQ ID NO：26中所示的LCDR1，如SEQ ID NO：32中所示的LCDR2，和如SEQ ID NO：39中所示的LCDR3。
- 如請求項1所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中，a)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：17中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：36中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或b)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：08和SEQ ID NO：15中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或c)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：09和SEQ ID NO：16中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別 如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：35中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或d)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：07和SEQ ID NO：14中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：33中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或e)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：18中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：37中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或D重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：05、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：19中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或g)重鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：06、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：20中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；並且輕鏈可變區序列包含分別如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：39中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選自鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項5所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：46、40、42、44、48、50、52的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：47、41、43、45、49、51和53的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。
- 如請求項6所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：46中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：47中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或b)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：42中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：43中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或c)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：44中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：45中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或d)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：40中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：41中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或e)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：48中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：49中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或f)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：50中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：51中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；或g)重鏈可變區，其如SEQ ID NO：52中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性；和/或輕鏈可變區，其如SEQ ID NO：53中所示或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%的序列同一性。
- 如請求項7所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a)如SEQ ID NO：46中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：47中所示的輕鏈可變區；b)如SEQ ID NO：42中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：43中所示的輕鏈可變區；c)如SEQ ID NO：44中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：45中所示的輕鏈可變區；d)如SEQ ID NO：40中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：41中所示的輕鏈可變區；e)如SEQ ID NO：48中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：49中所示的輕鏈可變區；f)如SEQ ID NO：50中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：51中所示的輕鏈可變區；g)如SEQ ID NO：52中所示的重鏈可變區；和/或如SEQ ID NO：53中所示的輕鏈可變區。
- 如請求項8所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a)如SEQ ID NO：46中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：47中所示的輕鏈可變區；b)如SEQ ID NO：42中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：43中所示的輕鏈可變區；c)如SEQ ID NO：44中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：45中所示的輕鏈可變區；d)如SEQ ID NO：40中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：41中所示的輕鏈可變區；e)如SEQ ID NO：48中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：49中所示的輕鏈可變區；f)如SEQ ID NO：50中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：51中所示的輕鏈可變區；g)如SEQ ID NO：52中所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：53中所示的輕鏈可變區。
- 如請求項1至9中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為全長抗體，其進一步包含人抗體恆定區；較佳地，該人抗體恆定區的重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體，並且該人抗體恆定區的輕鏈恆定區選自人抗體的κ鏈和λ鏈恆定區及其常規變體；更佳該全長抗體包含SEQ ID NO：68的人抗體重鏈恆定區和SEQ ID NO：69的人輕鏈恆定區。
- 如請求項1至10所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a)如SEQ ID NO：60中所示的重鏈和如SEQ ID NO：61中所示的輕鏈；b)如SEQ ID NO：56中所示的重鏈和如SEQ ID NO：57中所示的輕鏈；c)如SEQ ID NO：58中所示的重鏈和如SEQ ID NO：59中所示的輕鏈；d)如SEQ ID NO：54中所示的重鏈和如SEQ ID NO：55中所示的輕鏈；e)如SEQ ID NO：62中所示的重鏈和如SEQ ID NO：63中所示的輕鏈；f)如SEQ ID NO：64中所示的重鏈和如SEQ ID NO：65中所示的輕鏈；g)如SEQ ID NO：66中所示的重鏈和如SEQ ID NO：67中所示的輕鏈。
- 如請求項1至9所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自：Fab、Fab'、F(ab')2、可變片段(Fv)、單鏈可變片段(scFv)、二聚結構域V(雙體抗體)、二硫穩定化Fv(dsFv)和含有CDR的肽。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至12中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段。
- 一種重組載體，其包含如請求項13所述的分離的核酸分子。
- 一種用如請求項14所述的重組載體轉化的宿主細胞，其中該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳真核細胞，更佳哺乳動物細胞。
- 一種用於製備如請求項1至12中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段的方法，其中該方法包括：在培養基中培養如請求項15所述的宿主細胞，以產生並積累如請求項1至12中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，並從培養物中收穫所述抗體或其抗原結合片段。
- 一種用於免疫學檢測或測量ROR1的方法，其中該方法包括藉由與如請求項1至12中任一項的抗ROR1抗體或其抗原結合片段接觸來檢測該ROR1。
- 一種用於診斷與人ROR1陽性細胞相關的疾病的方法，其中該方法包括藉由與如請求項1至12中任一項的抗ROR1抗體或其抗原結合片段接觸來檢測或測量該ROR1或ROR1陽性細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含治療有效量的如請求項1至12中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
- 一種治療或預防與ROR1過度表達相關的疾病的方法，其包括將治療有效量的如請求項1至12中任一項所述的抗ROR1抗體或其抗原結合片段、或如請求項19所述的醫藥組成物施用於需要治療或預防所述疾病的受試者的步驟。
- 如請求項20所述的治療或預防與ROR1過度表達相關的疾病的方法，其中該與ROR1過度表達相關的疾病是癌症；較佳地，該癌症是慢性淋巴細胞白血病(CLL)；套細胞淋巴瘤(MCL)；B細胞急性淋巴母細胞白血病(B-ALL)；邊緣區淋巴瘤(MZL)；神經母細胞瘤；腎癌；肺癌；或乳腺癌。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/368,121 | 2022-07-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202413422A true TW202413422A (zh) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI673287B (zh) | 抗b7-h3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| CN105555804B (zh) | 对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点 | |
| JP7257971B6 (ja) | 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用 | |
| MX2010011955A (es) | Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas. | |
| TW202126692A (zh) | 抗人Claudin18.2抗體及其應用 | |
| WO2019141268A1 (zh) | 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| WO2020151762A1 (zh) | 新型双特异性抗体分子以及同时结合pd-l1和lag-3的双特异性抗体 | |
| WO2019062877A1 (zh) | 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白 | |
| JP2021530207A (ja) | 二重特異性抗体及びその使用 | |
| JP2015508763A (ja) | ペプチドグリカン認識タンパク質１に結合する抗体 | |
| JP2023540526A (ja) | ネクチン－４抗体およびそれの使用 | |
| TWI714895B (zh) | 抗csf-1r抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| WO2021190441A1 (zh) | Cd47/人源化cd47抗体或其抗原结合片段、免疫活性片段及应用 | |
| WO2021098822A1 (zh) | 一种双特异性抗体 | |
| KR20220128332A (ko) | Lilrb2에 대항하는 단일-도메인 항체 | |
| WO2023125888A1 (zh) | 一种gprc5d抗体及其应用 | |
| WO2021110095A1 (zh) | 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| WO2020156439A1 (zh) | 抗cd79b抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN104861068B (zh) | 一种全人源抗her3抗体及其治疗相关疾病的用途 | |
| CN110606892B (zh) | 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用 | |
| JP2024514855A (ja) | Ｄｌｌ３に対する結合分子及びその使用 | |
| WO2024012434A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| KR20220167331A (ko) | 항-flt3 항체 및 조성물 | |
| TW202413422A (zh) | 抗體、其抗原結合片段及其藥物用途 | |
| KR20220054600A (ko) | Il-38-특이적 항체 |