TW202412852A - 人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素結合物 - Google Patents

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葛瑞絲 趙
約司華 雷恩 可雷頓
喬丹 史考特 坎普敦
意青 丰
敦敏 梁
松青 那
克麗斯汀 佩吉 紐本
史考特 查爾斯 波特
巴拉蒂 拉姆齊
大衛 約翰 斯托克爾
賈桂林 瑪莉 伍爾斯特
建淮 蘇
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Abstract

本發明提供人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素受體促效劑結合物及使用該等結合物治療自體免疫疾病及發炎性疾病之方法。

Description

人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素結合物
本發明提供人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素受體促效劑結合物、使用該等結合物治療自體免疫疾病及發炎性疾病(諸如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬及僵直性脊椎炎)之方法、製備該等結合物之方法及包含該等人類TNFα抗體糖皮質激素結合物之醫藥組合物。
類風濕性關節炎(RA)係致衰弱的慢性自體免疫疾病，其攻擊關節，最常為手部、腕部及膝部中之關節，且通常一次性攻擊許多關節。在RA中，關節內膜變發炎，引起關節組織受損，其可導致僵硬、腫脹、不穩定(不平衡)、變形及慢性疼痛。當前治療採用例如非類固醇消炎藥(NSAIDS)、皮質類固醇、調節疾病之抗風濕藥物(DMARD)、抗體療法，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、托法替尼(tofacitinib)、依那西普(Etanercept)、阿達木單抗(adalimumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、戈利木單抗(golimumab)及賽妥珠單抗(certolizumab)。此類治療之缺點包括例如非標靶毒性及產生抗藥物抗體。
抗藥物抗體可為與TNFα同時結合至抗TNFα抗體治療劑的非中和抗體，或其可為降低抗TNFα治療抗體於血清中之有效濃度及/或與TNFα競爭抗原結合位點(互補位)，由此抑制抗TNFα治療抗體之工作機制的中和抗體。(van Schie KA等人, Annals of the Rheumatic Diseases, 2015, 74 :311-314)。舉例而言，研究顯示，超過百分之九十之抗TNFα藥物抗體為中和的且可與其他抗TNFα抗體治療劑交叉反應。(van Schie KA等人，2015)。因此，在一些情況下，據報導，對抗TNFα抗體產生抗藥物抗體之患者在投與藥物期間或在投與藥物之後的第一天內具有對此等治療劑減弱之臨床反應及/或不良事件，諸如輸注相關反應，其特徵在於諸如發熱、搔癢、支氣管痙攣或心血管性虛脫之症狀(Atiqi, S., Front Immunol., 2020, 26(11): 312)。因此，仍顯著需要提供發炎性及/或自體免疫疾病(諸如RA)之改良有效治療且將當前審批通過之治療所具有的缺點降至最低或消除的新穎藥劑。
WO2017/210471揭示某些糖皮質激素受體促效劑(GC)、抗體及其免疫結合物。WO2018/089373揭示新穎類固醇、其蛋白質結合物以及用於治療疾病、病症及病況之方法，該等方法包含投與該等類固醇及結合物。迄今為止，尚未批准用於治療疾病之人類TNFα抗體GC結合物。
本發明提供某些新穎的人類TNFα抗體GC結合物，其中該抗體結合至人類TNFα。本發明進一步提供包含新穎抗人類TNFα抗體GC結合物之組合物及使用此類抗人類TNFα抗體GC結合物及其組合物之方法。另外，本發明提供某些新穎抗人類TNFα抗體GC結合物，其適用於治療自體免疫疾病及發炎性疾病，諸如類風濕性關節炎。本發明進一步提供某些新穎抗人類TNFα抗體GC結合物，其適用於治療已產生針對其他抗TNFα治療劑(例如，阿達木單抗)之抗藥物抗體的患者之自體免疫疾病及發炎性疾病。本文揭示之某些抗人類TNFα抗體GC結合物呈現良好的可發展性概況，諸如良好物理化學特性(例如，低黏度或聚集、良好熱穩定性)以促進發展、製造及調配。因此，本文所提供之某些抗人類TNFα抗體GC結合物具有以下特性中之一或多者：1)以期望效力結合人類TNFα，2)結合人類膜TNFα且內化至細胞中，3)以期望效力結合恆河獼猴(rhesus macaque monkey)及/或犬TNFα，4)抑制可溶性及膜人類TNFα誘導之細胞凋亡，5)活體外調節TNFR及糖皮質激素受體介導之細胞介素表現(例如，抑制IL-13、IL-6、GM-CSF，誘導IL-10)，6)活體內抑制TNFR介導之細胞介素表現(例如，CXCL1)，7)誘導ADCC活性，8)展現活體內及活體外與針對其他抗TNFα治療劑(例如，阿達木單抗)之抗藥物抗體的低交叉反應至無交叉反應，9)活體內顯著抑制組織及/或多發性關節炎關節發炎，10)活體內顯著抑制阿達木單抗難治性小鼠之關節發炎或11)具有良好的可發展性概況，例如，可接受之黏度、溶解度及聚集、良好穩定性及/或可接受之藥物動力學概況以促進發展、製造及/或調配。
因此，在一個實施例中，本發明提供式I之結合物： 其中Ab為結合人類腫瘤壞死因子α之抗體(「抗人類TNFα抗體」)，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 或 ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式Ia之結合物： 式Ia 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 或 ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式Ib之結合物： 式Ib 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 或 ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式Ic之結合物： 式Ic 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 或 ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式Id之結合物： 式Id 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 或 ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式Ie之結合物： 式Ie 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 且n為1至5。
在又一實施例中，本發明提供式If之結合物： 式If 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 為： ， 且n為1至5。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab1，其中Ab1包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 1，該HCDR2包含SEQ ID NO: 2，該HCDR3包含SEQ ID NO: 3，該LCDR1包含SEQ ID NO: 4，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab1包含：包含SEQ ID NO: 7之VH及包含SEQ ID NO: 8之VL。在一些實施例中，Ab1包含：包含SEQ ID NO: 9之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab2，其中Ab2包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 1，該HCDR2包含SEQ ID NO: 2，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 14，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，Ab2包含：包含SEQ ID NO: 16之VH及包含SEQ ID NO: 17之VL。在一些實施例中，Ab2包含：包含SEQ ID NO: 18之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 19之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab3，其中Ab3包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 22，該HCDR2包含SEQ ID NO: 23，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 4，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab3包含：包含SEQ ID NO: 24之VH及包含SEQ ID NO: 8之VL。在一些實施例中，Ab3包含：包含SEQ ID NO: 25之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 10之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab4，其中Ab4包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 22，該HCDR2包含SEQ ID NO: 23，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 14，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5，且該LCDR3包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，Ab4包含：包含SEQ ID NO: 24之VH及包含SEQ ID NO: 17之VL。在一些實施例中，Ab4包含：包含SEQ ID NO: 25之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 19之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab5，其中Ab5包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 22，該HCDR2包含SEQ ID NO: 23，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 14，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，Ab5包含：包含SEQ ID NO: 24之VH及包含SEQ ID NO: 27之VL。在一些實施例中，Ab5包含：包含SEQ ID NO: 25之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 28之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)為Ab6，其中Ab6包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 1，該HCDR2包含SEQ ID NO: 2，該HCDR3包含SEQ ID NO: 30，該LCDR1包含SEQ ID NO: 31，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，Ab6包含：包含SEQ ID NO: 33之VH及包含SEQ ID NO: 34之VL。在一些實施例中，Ab6包含：包含SEQ ID NO: 35之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 36之輕鏈(LC)。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 22，該HCDR2包含SEQ ID NO: 23，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 14，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，SEQ ID NO: 44包含胺基酸殘基QQYDXaa 5LPLT，其中SEQ ID NO: 44之Xaa 5為天冬醯胺或離胺酸。
在一些實施例中，式I之結合物，其中結合人類TNFα之抗體(「Ab」)包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 22，該HCDR2包含SEQ ID NO: 23，該HCDR3包含SEQ ID NO: 13，該LCDR1包含SEQ ID NO: 43，該LCDR2包含SEQ ID NO: 5且該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，SEQ ID NO: 43包含胺基酸殘基QASQGIXaa 7NYLN，其中SEQ ID NO: 43之Xaa 7為絲胺酸或精胺酸。
在一些實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體為完全人類抗體。在其他實施例中，抗人類TNFα抗體具有人類IgG1同型。
在本發明之一些實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體具有經修飾之人類IgG1。在一些實施例中，修飾在重鏈可變區(VH)中。在一些實施例中，修飾在輕鏈可變區(VL)中。在一些實施例中，修飾在VH及VL中。在其他實施例中，經修飾之人類IgG1 VH及/或VL向本發明之抗人類TNFα抗體提供所需之黏度概況及/或免疫原性風險概況。
在其他實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體具有經修飾之人類IgG1恆定域，其包含用於產生抗體結合物(亦稱為生物共軛物)的經工程改造之半胱胺酸殘基(參見WO 2018/232088 Al)。更特定言之，在本發明之此類實施例中，抗人類TNFα抗體包含在IgG1重鏈中的經工程改造之半胱胺酸殘基。在此類實施例中，抗人類TNFα抗體包含在重鏈恆定域1 (CH1)中之胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸，或在重鏈恆定域2 (CH2)中之胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。在其他實施例中，抗人類TNFα抗體包含在CH1域中之胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸及在CH2域中之胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。
在一些實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體與針對其他抗TNFα治療劑(例如阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或依那西普)或其結合物之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。在特定實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。在此類實施例中，式I之某些結合物可用於治療對用如本文所定義之其他抗TNFα治療劑(例如，阿達木單抗)之先前治療產生抗藥物抗體的患者。在其他實施例中，式I之某些結合物可用於治療對用此類其他抗TNFα治療劑之先前治療的其他抗TNFα治療劑產生抗藥物抗體且因此對其他抗TNFα治療劑具有減弱之臨床反應或不良反應的患者。在此類實施例中，式I之結合物，其中抗人類TNFα抗體具有足夠不同的胺基酸及核酸序列，使得其與針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。在特定實施例中，式I之結合物，其中本發明之抗人類TNFα抗體具有足夠不同的CDR胺基酸序列，使得其與針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。在一些實施例中，其他抗TNFα治療劑為阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或依那西普或其結合物。
在一些實施例中，本發明提供編碼結合抗人類TNFα之新穎抗體之HC或LC，或VH或VL的核酸，或包含此類核酸之載體。
在一些實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO: 11、12、20、21、26、29、37或38之序列的核酸。
在一些實施例中，提供編碼結合抗人類TNFα之抗體之重鏈或輕鏈的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼SEQ ID NO: 9、10、18、19、25、28、35或36之序列的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼抗體重鏈之序列的核酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO: 9、18、25或35。舉例而言，核酸可包含SEQ ID NO: 11、20、26或37之序列。在一些實施例中，提供包含編碼抗體輕鏈之序列的核酸，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO: 10、19、28或36。舉例而言，核酸可包含SEQ ID NO: 12、21或29或38之序列。
在本發明之一些實施例中，提供編碼結合抗人類TNFα之抗體之VH或VL的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼SEQ ID NO: 7、8、16、17、24、27、33或34之序列的核酸。在一些實施例中，提供包含編碼抗體VH之序列的核酸，該抗體VH包含SEQ ID NO: 7、16、24或33。在一些實施例中，提供包含編碼抗體VL之序列的核酸，該抗體VL包含SEQ ID NO: 8、17、27或34。
本發明之一些實施例提供包含編碼抗體重鏈或輕鏈之核酸序列的載體。舉例而言，此類載體可包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之核酸序列。
本文亦提供包含編碼抗體VH或VL之核酸序列的載體。舉例而言，此類載體可包含編碼SEQ ID NO: 7、16、24或33之核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 8、17、27或34之核酸序列。
本文亦提供包含編碼抗體重鏈之第一核酸序列及編碼抗體輕鏈之第二核酸序列的載體。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 9之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 18之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 19之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 25第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 25之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 19之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 25之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 28之第二核酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO: 35之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 36之第二核酸序列。
本文亦提供組合物，其包含編碼抗體重鏈之核酸序列的第一載體及包含編碼抗體輕鏈之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含第一載體，其包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之第二核酸序列。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 9之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 10之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 18之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 19之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 25之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 10之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 25之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 19之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 25之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 28之核酸序列的第二載體。在一些實施例中，組合物包含：包含編碼SEQ ID NO: 35之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 36之核酸序列的第二載體。
本文亦提供包含載體之組合物，該載體包含編碼抗體重鏈之核酸序列及編碼抗體輕鏈之核酸序列。在一些實施例中，組合物包含載體，其包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之第二核酸序列。
在一實施例中，n為2至5。
在一實施例中，n為3至5。
在一實施例中，n為3至4。
在一實施例中，n為約4。
在一實施例中，n為約3。
在一實施例中，n為約2。
如本文中所使用，下式中之「GC」： 係指適合之糖皮質激素受體促效劑有效負載且包括下式IIa、IIb及IIc： ， ，及 。
如本文中所使用，下式中之「L」 係指將Ab連接至GC之適合連接子基團。一般熟習此項技術者已知之適合連接子包括例如可裂解連接子及不可裂解連接子。更特定言之，適合連接子「L」包括以下式IIIa至IIIf： ， ， ， ， ，及 。
在一實施例中，本發明提供式IV之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一實施例中，本發明提供式IVa之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一實施例中，本發明提供式IVb之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一實施例中，本發明提供式IVc之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一實施例中，本發明提供式IVd之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子： 。
在一實施例中，本發明提供一種式V化合物： 。
在又一實施例中，本發明提供一種式Va化合物： 。
在一實施例中，本發明亦提供一種治療有需要之個體之自體免疫疾病之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明亦提供一種治療有需要之個體之發炎性疾病之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其藥物或鹽。在某些實施例中，自體免疫疾病或發炎性疾病為例如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎(PsA)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬(PS)、僵直性脊椎炎(AS)、幼年特發性關節炎、化膿性汗腺炎、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***或風濕性多肌痛(PMR)。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之類風濕性關節炎之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物，或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之牛皮癬性關節炎之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之克羅恩氏病之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之潰瘍性結腸炎之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之斑塊型牛皮癬之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，本發明進一步提供一種治療有需要之個體之僵直性脊椎炎之方法，其包含向該個體投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的個體接受用其他抗TNFα治療劑之先前治療，且其中個體產生針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體。在此類實施例中，其他抗TNFα治療劑係選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少四者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少三者或更多者之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑之至少兩者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對阿達木單抗或其結合物之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。
在一實施例中，本發明進一步提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於療法中。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療自體免疫疾病。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療發炎性疾病。在某些實施例中，自體免疫疾病或發炎性疾病為例如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎(PsA)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬(PS)、僵直性脊椎炎(AS)、幼年特發性關節炎、化膿性汗腺炎、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***或風濕性多肌痛(PMR)。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療類風濕性關節炎。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療牛皮癬性關節炎。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療克羅恩氏病。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療潰瘍性結腸炎。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療斑塊型牛皮癬。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療僵直性脊椎炎。在一些實施例中，投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的個體接受用其他抗TNFα治療劑之先前治療，且其中個體產生針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體。在此類實施例中，其他抗TNFα治療劑係選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少四者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少三者或更多者之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑之至少兩者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對阿達木單抗或其結合物之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。
在一實施例中，本發明亦提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療自體免疫疾病之藥劑。在一實施例中，本發明亦提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療發炎性疾病之藥劑。在某些實施例中，自體免疫疾病或發炎性疾病為例如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬性關節炎(PsA)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬(PS)、僵直性脊椎炎(AS)、幼年特發性關節炎、化膿性汗腺炎、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***或風濕性多肌痛(PMR)。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療類風濕性關節炎之藥劑。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療牛皮癬性關節炎之藥劑。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療克羅恩氏病之藥劑。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療潰瘍性結腸炎之藥劑。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療斑塊型牛皮癬之藥劑。在一實施例中，本發明提供式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製造用於治療僵直性脊椎炎之藥劑。在一些實施例中，投與有效量之式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽的個體接受用其他抗TNFα治療劑之先前治療，且其中個體產生針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體。在此類實施例中，其他抗TNFα治療劑係選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少四者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑中之至少三者或更多者之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群：阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對其他抗TNFα治療劑之至少兩者或更多者的抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應，該其他抗TNFα治療劑選自由以下組成之群阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗、賽妥珠單抗或其結合物。在又其他實施例中，如本文所揭示之某些式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與針對阿達木單抗或其結合物之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。
本發明之核酸可在宿主細胞中表現，例如在核酸已可操作地連接至表現控制序列之後。能夠表現與其可操作地連接之核酸的表現控制序列為此項技術中熟知的。表現載體可包括編碼一或多個信號肽之序列，該一或多個信號肽促進多肽自宿主細胞分泌。含有所關注之核酸(例如，編碼抗體之重鏈或輕鏈之核酸)的表現載體可藉由熟知方法(例如，穩定或短暫之轉染、轉型、轉導或感染)轉移至宿主細胞中。另外，表現載體可含有一或多種選擇標記物(例如，四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以輔助偵測經所需核酸序列轉型之宿主細胞。
在另一態樣中，本文提供包含本文中所描述之核酸、載體或核酸組合物之細胞，例如宿主細胞。宿主細胞可為經表現本文所描述之抗體之全部或一部分的一或多種表現載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染的細胞。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本發明抗體之HC及LC多肽的表現載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染。在一些實施例中，宿主細胞可經表現本文所描述之抗體之HC多肽的第一載體及表現本文所描述之抗體之LC多肽的第二載體穩定或短暫地轉染、轉型、轉導或感染。此類宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞，可表現結合如本文所描述之抗人類TNFα之抗體。已知能夠表現抗體之哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞、HEK293細胞、COS細胞及NS0細胞。
在一些實施例中，細胞(例如，宿主細胞)包含載體，其包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之第一核酸序列及編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之第二核酸序列。
在一些實施例中，細胞(例如，宿主細胞)包含：包含編碼SEQ ID NO: 9、18、25或35之核酸序列的第一載體及包含編碼SEQ ID NO: 10、19、28或36之核酸序列的第二載體。
本發明進一步提供一種產生結合本文描述之抗人類TNFα之抗體的方法，其藉由在使得表現抗體之條件下培養上文所描述之宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞及自培養基回收經表現之抗體來進行。可藉由習知技術純化其中已分泌抗體之培養基。可採用蛋白質純化之不同方法，且此類方法為此項技術中已知的且描述於(例如) Deutscher，Method in Enzymology 182:83-89 (1990)及Scopes，Protein Purification:Principles and Practice，第3版，Springer，NY(1994)中。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使本發明之化合物與抗人類TNFα抗體接觸。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IV化合物與抗人類TNFα抗體接觸。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVa化合物與抗人類TNFα抗體接觸。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVb化合物與抗人類TNFα抗體接觸。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVc化合物與抗人類TNFα抗體接觸。本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含使式IVd化合物與抗人類TNFα抗體接觸。在一些實施例中，將產生之結合物為式I結合物。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含以下步驟： (a)用還原劑還原抗人類TNFα抗體，其中該抗人類TNFα抗體包含一或多種經工程改造之半胱胺酸殘基； (b)用氧化劑氧化該抗人類TNFα抗體；及 (c)使本發明之化合物與抗人類TNFα抗體接觸以產生結合物。
本發明提供一種產生結合物之方法，該方法包含以下步驟： (a)用還原劑還原抗人類TNFα抗體，其中該抗人類TNFα抗體包含一或多種經工程改造之半胱胺酸殘基； (b)用氧化劑氧化該抗人類TNFα抗體；及 (c)使下式之化合物 與抗人類TNFα抗體接觸以產生結合物。
在一些實施例中，還原劑為二硫蘇糖醇。在一些實施例中，氧化劑為去氫抗壞血酸。在一些實施例中，還原劑為二硫蘇糖醇且氧化劑為去氫抗壞血酸。
本發明進一步提供藉由任何本文中所描述之方法所產生之抗體或其抗原結合片段。
在一實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽，或本文所描述之抗體、核酸或載體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含式I結合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一實施例中，本發明進一步提供一種製備醫藥組合物之方法，其包含將式I結合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑摻合。在一實施例中，本發明亦涵蓋用於合成式I結合物之新穎中間物及方法。
本申請案主張2022年5月13日申請之美國臨時申請案第63/341,691號根據35 U.S.C. §119(e)之權益，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
除非另外說明，否則如本文中所使用之術語「TNFα」係指可溶性及/或膜TNFα，以及任何由處理細胞中之TNFα前驅蛋白而產生之天然成熟TNFα。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之TNFα，該等脊椎動物包括哺乳動物，諸如犬科動物、靈長類動物(例如，人類及食蟹獼猴或恆河猴)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語亦包括天然存在之TNFα變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。抗人類TNFα之實例的胺基酸序列為此項技術中已知的，例如NCBI寄存編號：NP_000585 (SEQ ID NO: 39)。食蟹獼猴TNFα之實例的胺基酸序列亦為此項技術中已知的，例如UniProt參考序列P79337 (SEQ ID NO: 42)。恆河獼猴TNFα之實例的胺基酸序列亦為此項技術中已知的，例如UniProt參考序列P48094 (SEQ ID NO: 40)。犬TNFα之實例的胺基酸序列亦為此項技術中已知的，例如GenBank寄存編號：CAA64403 (SEQ ID NO: 41)。術語人類「TNFα」在本文中用於共同地指代全部已知之抗人類TNFα同功型及多型性形式。本文中所使用之序列編號係基於無信號肽之成熟蛋白。
除非另外說明，否則如本文中所使用之術語「TNFR」或「TNF受體」係指任何天然成熟TNFR，例如TNFR1 (亦稱為p55或p60)或TNFR2 (亦稱為p75或p80)。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之TNFR，該等脊椎動物包括哺乳動物，諸如犬科動物、靈長類動物(例如，人類及食蟹獼猴或恆河猴)及嚙齒動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語亦包括天然存在之TNFR變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。人類TNFR1之實例的胺基酸序列為此項技術中已知的，例如GenBank寄存編號：AAA61201 (SEQ ID NO:45)。人類TNFR2之實例的胺基酸序列為此項技術中已知的，例如NCBI寄存編號：NP_001057 (SEQ ID NO:46)。術語「TNFR」在本文中用於共同地指代全部已知之人類TNFR同功型及多型性形式。
如本文中所使用之術語「抗藥物抗體」或「ADA」係指在哺乳動物中由向該哺乳動物投與之治療劑的免疫反應所形成之抗體。在本發明之一些實施例中，針對治療劑形成之抗藥物抗體可中和該治療劑之作用，因此改變治療劑之藥物動力學(PK)及/或藥效動力學(PD)特性，干擾治療劑之作用，及/或降低療效，及/或減弱對治療劑之臨床反應。針對治療劑之抗藥物抗體亦可在患者中引起不良免疫反應，從而使得患者可不為用該治療劑進行進一步治療之候選者。不良免疫反應之實例包括(但不限於)在投與藥物期間或在投與藥物之後第一天內的輸注相關反應，其特徵在於諸如發熱、搔癢、支氣管痙攣或心血管性虛脫之症狀(Atiqi, S., Front Immunol., 2020, 26(11): 312)。
如本文中所使用，術語與抗藥物抗體之「低結合至無結合」係指本發明之抗人類TNFα抗體糖皮質激素結合物或抗人類TNFα抗體與針對其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體的結合，其中此結合測定為下文用於量測結合之分析的截止點或在分析之預定變化範圍內。在此類方法中，截止點為預定之臨界值，其用於鑑別與抗藥物抗體之陽性結合。在一些實施例中，分析法之預定可變性係高於分析法截止點的不到約20%。在此類實施例中，本發明之抗人類TNFα Ab GC結合物或抗人類TNFα抗體與針對其他治療劑(例如，阿達木單抗)之抗藥物抗體的結合高於分析法截止點的不到約20%視為弱結合。在一些實施例中，本發明之抗人類TNFα Ab GC結合物或抗人類TNFα抗體與針對其他治療劑(例如，阿達木單抗)之抗藥物抗體的結合處於或低於分析法之截止點被認為無結合。
術語「其他抗TNFα治療劑」係指結合TNFα且抑制經TNF受體介導之反應的試劑，不包括本文中所描述之結合物或抗人類TNFα抗體。此類藥劑可包括但不限於抗體或其結合物、抗體片段或抗原結合片段，其包含保持與抗原相互作用之能力的抗體之至少一部分，該抗原諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫鍵鍵聯的Fvs (sdFv)、Fd片段或線性抗體，其可例如融合至Fc區或IgG重鏈恆定區。在一些實施例中，其他抗TNFα治療劑可例如為阿達木單抗、英夫利昔單抗、戈利木單抗及賽妥珠單抗及/或其結合物。
如本文中所使用之術語「抗體」係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實施例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性或多特異性抗體，或結合抗體。抗體可具有任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)，及任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。本發明之實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段，術語「抗體片段或抗原結合片段」包含保持與抗原相互作用之能力的抗體之至少一部分，該抗原諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、scFab、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、Fd片段或線性抗體，其可例如融合至Fc區或IgG重鏈恆定區。
例示性抗體為由四條多肽鏈構成之免疫球蛋白G (IgG)型抗體：經由鏈間二硫鍵交聯之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)。四條多肽鏈中之各者之胺基端部分包括具有約100至125個或更多個胺基酸之主要負責抗原識別的可變區。四條多肽鏈中之各者之羧基端部分含有主要負責效應功能之恆定區。各重鏈由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區係指抗體之包含抗體重鏈之Fc區及CH1域的區。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區組成。IgG同型可進一步分為子類別(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。恆定區中之胺基酸殘基之編號係基於如Kabat中之EU索引。Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Bethesda, MD: U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1991)。術語EU索引編號或EU編號在本文中可互換地使用。
VH及VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(complementarity determining region，CDR)，其間穿插有稱為構架區(framework region，FR)之更保守的區。CDR暴露於蛋白質之表面上且為對抗體之抗原結合特異性而言重要的區。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大部分殘基。胺基酸殘基分配至CDR可根據熟知方案進行，其包括描述於以下之彼等方案：Kabat (Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))，Chothia (Chothia等人, 「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)；Al-Lazikani等人, 「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))，North (North等人, 「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))，或IMGT (the international ImMunoGeneTics database available on at www.imgt.org; 參見Lefranc等人, Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212)。IMGT及North CDR定義之組合用於如本文所描述之例示性抗人類TNFα抗體。
如本文所用，術語「Fc區」係指抗體之包含抗體重鏈之CH2及CH3域的區。視情況地，Fc區可包括抗體重鏈之鉸鏈區的一部分或整個鉸鏈區。諸如效應功能之生物活性可歸因於Fc區，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：Fc受體結合，抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)，C1q結合，補體依賴性細胞毒性(CDC)，吞噬作用，細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
如本文中所使用之術語「抗原決定基」係指抗原之結合於抗體的胺基酸殘基。抗原決定基可為線性抗原決定基、構形抗原決定基或雜合抗原決定基。術語「抗原決定基」可參考結構抗原決定基使用。根據一些實施例，結構抗原決定基可用於描述由抗體覆蓋之抗原區(例如在結合至抗原時抗體之覆蓋面積)。在一些實施例中，結構抗原決定基可描述抗原之胺基酸殘基，其在抗體之胺基酸殘基之特定接近性內(例如，在特定數目之埃(Angstrom)內)。術語「抗原決定基」亦可參考功能抗原決定基使用。根據一些實施例，功能抗原決定基可用於描述抗原之胺基酸殘基，其以促成抗原與抗體之間的結合能之方式與抗體之胺基酸殘基相互作用。抗原決定基可根據不同實驗技術(亦稱為「抗原決定基定位技術」)確定。應理解，抗原決定基之確定可基於所使用之不同抗原決定基定位技術變化，且亦可隨所使用之不同實驗條件變化，例如歸因於由特定實驗條件誘導之抗原的構形變化或裂解。抗原決定基定位技術為此項技術中已知的(例如，Rockberg及Nilvebrant, Epitope Mapping Protocols: Methods in Molecular Biology, Humana Press, 第3版 2018；Holst等人, Molecular Pharmacology 1998, 53(1): 166-175)，包括(但不限於) X射線結晶法、核磁共振(NMR)光譜法、定點誘變、物種交換誘變、丙胺酸掃描誘變、位阻誘變、氫-氘交換(HDX)及交叉阻斷分析法。
除非另外指明，否則如本文所用之術語「結合(bind/binds)」欲意謂蛋白質或分子與另一蛋白質或分子形成化學鍵或吸引相互作用之能力，藉由此項技術中已知之常用方法所測定，其引起兩種蛋白質或分子接近。
如本文中所使用之術語「核酸」係指核苷酸之聚合物，包括含有單股及/或雙股核苷酸之分子，諸如併入有核苷酸之天然、經修飾及/或類似物的DNA、cDNA及RNA分子。本發明之聚核苷酸亦可包括例如藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入其中之受質。
本發明之實施例包括其中多肽(例如，抗人類TNFα抗體)結合至一或多種藥物部分，諸如2個藥物部分、3個藥物部分、4個藥物部分、5個藥物部分或更多個藥物部分的結合物。如本文所描述，藥物部分可在多肽中之一或多個位點處結合至多肽。在某些實施例中，結合物之平均藥物與抗體比率(DAR) (莫耳比)在2至5、或3至5或3至4之範圍內。在一些實施例中，結合物之平均DAR為約3。在某些實施例中，結合物之平均DAR為約4。平均值意謂算術平均值。
如本文中所使用，應理解式I結合物涵蓋式Ia、Ib、Ic、Id、Ie及If之結合物，且本文之對式I結合物之所有參考應理解為包括式Ia、Ib、Ic、Id、Ie及If之結合物。熟習此項技術者進一步瞭解，包括式Ia、Ib、Ic、Id、Ie及If之結合物的式I結合物亦可稱作抗人類TNFα抗體糖皮質激素結合物(「抗人類TNFα Ab GC結合物」)。
本發明之抗人類TNFα抗體GC結合物可調配為藉由任何途徑投與之醫藥組合物，該途徑使結合物生物可用，包括例如靜脈內或皮下投與。此類醫藥組合物可使用此項技術中已知之技術及方法(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Adejare, Editor, 第23版, 2020年出版, Elsevier Science)製備。
如本文中所使用，術語「治療(treating)」、「治療(treatment)」或「治療(to treat)」包括限制、減緩、停止、控制、延遲或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重程度，或減輕現有症狀或病症，但不必指示現有症狀或病症之完全消除。治療包括投與蛋白質或核酸或載體或組合物以用於治療患者，特定言之人類之症狀或病症。
如本文中所使用，術語「抑制(inhibits)」或「抑制(inhibiting)」係指例如生物反應或活性之減低、降低、減慢、減少、停止、中斷、消除、拮抗或阻斷，但未必指示生物反應之完全消除。
如本文所使用，術語「個體」係指哺乳動物，包括但不限於人類、黑猩猩、猿、猴、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、狗、貓、大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似動物。較佳地，個體為人類。
如本文中所使用，術語「有效量」係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽在向個體單次或多次劑量投與後提供在診斷或治療下個體之所需作用的量或劑量。如本文中所使用，術語「有效量」進一步係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽將誘發個體之所需生物或醫療反應，例如降低或抑制蛋白質活性或減輕症狀、緩解病況、減緩或延遲疾病惡化或防止疾病等的量或劑量。在一非限制性實施例中，術語「有效量」係指本發明之結合物或其醫藥學上可接受之鹽向個體投與時有效於至少部分地減緩、抑制、防止及/或減輕病況或病症或疾病以達成所需治療結果的必需量(在投與劑量及時段以及方式下)或劑量。有效量亦為本發明之結合物或本發明之其醫藥學上可接受之鹽的治療有益效果超過其任何毒性或有害效果的量。
有效量可由熟習此項技術者利用已知技術及根據類似情形下所得的觀測結果來確定。在確定用於患者之有效量中，主治診斷醫師考慮多個因素，包括(但不限於)：患者之種類；其身材、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；涉及程度或疾病或病症之嚴重程度；個別患者之響應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特性；所選擇之劑量方案；伴隨藥療之使用；及其他相關情況。
本發明之範疇內包括為式I結合物的醫藥學上可接受之鹽。本發明之結合物的醫藥學上可接受之鹽，諸如式I結合物可在此項技術中已知之標準條件下形成。參見例如Berge, S.M.等人, 「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。 表 1 ：縮寫及定義
術語 定義
ACN 乙腈
aq 水性
cP 厘泊
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二異丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
dppf 1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵
ES/MS 電噴霧質譜分析
EtOAc 乙酸乙酯
HATU 六氟磷酸氮雜苯并***四甲
HPLC 高效液相層析法
LDA 二異丙基胺基鋰
MeOH 甲醇
MS 質譜
MTBE 甲基三級丁基醚
m/z 質荷比
NMR 核磁共振
Pet ether 石油醚(petroleum ether)
rt 室溫
satd 飽和
THF 四氫呋喃
本發明之結合物或其鹽可藉由一般熟習此項技術者已知的多種程序容易地製備，其中一些在以下製備及實例中加以說明。一般熟習此項技術者認識到，所述各途徑中之特定合成步驟可以不同方式組合，或與不同流程之步驟結合以製備本發明之結合物或其鹽。各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、濕磨及結晶。除非另外指明，否則所有取代基如先前所定義。試劑及起始材料為一般技術者容易獲得的。以下製備、實例及分析進一步說明本發明，但不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。 製劑 16-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲醛
同時進行兩個反應。在-78℃下經30分鐘向4-溴-2-氟-1-甲氧基苯(250 g，1.2 mol)於THF (1500 mL)中之溶液中緩慢添加LDA (2 M，730 mL)。再過30分鐘後，在-78℃下經30分鐘緩慢添加DMF (140 mL，1.8 mol)。1小時後，合併兩個反應物，且將混合物用檸檬酸水溶液(2000 mL)稀釋且用EtOAc (1500 mL × 2)萃取。合併之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。將殘餘物在室溫下用石油醚(1000 mL)濕磨12小時，得到標題化合物(382 g，67%產率)。ES/MS m/z 233.9 (M+H)。 製劑 22-氟-3-甲氧基-6-甲基苯甲醛
同時進行三個反應。將6-溴-2-氟-3-甲氧基苯甲醛(120 g，5.3 mol)、甲基硼酸(47 g，7.9 mol)、Pd(dppf)Cl 2(12 g，0.02 mol)及Cs 2CO 3(340 g，1.1 mol)添加至1,4-二㗁烷(600 mL)及水(120 mL)之混合物中。將混合物在120℃下攪拌。12小時後，合併三個反應物，且將混合物用飽和NH 4Cl水溶液(1000 mL)稀釋且用MTBE (1500 mL × 2)萃取。合併之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物藉由矽膠層析進行純化，用40:1石油醚:EtOAc溶離，得到標題化合物(180 g，59%產率)。ES/MS m/z 169.3 (M+H)。 製劑 32-氟-3-羥基-6-甲基苯甲醛
將2-氟-3-甲氧基-6-甲基苯甲醛(175 g，1.0 mol)添加至DCM (1050 mL)中。在0℃下將BBr 3(200 mL，2.1 mol)緩慢添加至溶液中。將反應物在室溫下攪拌。1小時後，混合物用飽和NaHCO 3水溶液(1000 mL)稀釋直至pH=7至8，且隨後用MTBE (1500 mL × 2)萃取。合併之有機層用飽和NaCl水溶液(1000 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到標題化合物(110 g，68%)。ES/MS m/z 154.9 (M+H)。 製劑 4N-[3-[(2-氟-3-甲醯基-4-甲基-苯氧基)甲基]苯基]胺基甲酸三級丁酯
在室溫下將2-氟-3-羥基-6-甲基苯甲醛(130 g，0.84 mol)、(3-(溴甲基)苯基)胺基甲酸三級丁酯(200 g，0.70 mol)及碳酸鉀(350 g，2.5 mol)添加於乙腈(780 mL)中，且隨後加熱至50℃。5小時之後，反應物用水(600 mL)稀釋且用EtOAc (800mL×2)萃取。合併之有機層用飽和NaCl水溶液(800 mL)洗滌且在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物藉由矽膠層析進行純化，用50:1石油醚:EtOAc溶離，得到粗產物。將粗產物在室溫下用MTBE (500 mL)濕磨30分鐘，得到標題化合物(103 g，32%)。ES/MS m/z 382.1 (M+Na)。 製劑 5(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮
在-10℃下將過氯酸(70%於水中，4.8 mL)添加至(8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11,16,17-三羥基-17-(2-羥基乙醯基)-10,13-二甲基-7,8,9,11,12,14,15,16-八氫-6H-環戊[a]菲-3-酮(4.4 g，12 mmol，亦稱為「16α-羥基普賴蘇穠」)及N-[3-[(2-氟-3-甲醯基-4-甲基-苯氧基)甲基]苯基]胺基甲酸三級丁酯(4.0 g，11 mmol，製劑4)於乙腈(110 mL)中之懸浮液中且升溫至室溫。1小時後，在室溫下將DMF (10 mL)添加至懸浮液中。18小時後，反應物用飽和NaHCO 3水溶液淬滅且用9:1 DCM:異丙醇萃取。有機層經合併，經MgSO4乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到殘餘物。殘餘物藉由逆相層析法純化，用1:1 NH 4HCO 3水溶液(10 mM + 5% MeOH):ACN溶離，得到標題化合物，峰1 (1.72 g，25%)。ES/MS m/z 618.6 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, d 6-DMSO) δ 0.93-0.87 (m, 6H), 1.40 (s, 3H), 1.71-1.60 (m, 1H), 1.89-1.76 (m, 4H), 2.18-2.12 (m, 2H), 2.29 (s, 4H), 4.23-4.17 (m, 1H), 4.32-4.30 (m, 1H), 4.50-4.43 (m, 1H), 4.81 (d, J= 3.2 Hz, 1H), 4.98-4.95 (m, 3H), 5.16-5.10 (m, 3H), 5.61 (s, 1H), 5.95 (s, 1H), 6.18-6.15 (m, 1H), 6.53-6.48 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.90-6.86 (m, 1H), 6.99 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.12 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.33-7.30 (m, 1H)。 製劑 6(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(在本文中亦稱為GC1)
根據製劑5，殘餘物藉由逆相層析法純化，用1:1 NH 4HCO 3(10 mM + 5% MeOH):ACN水溶液溶離，得到標題化合物，峰2 (1.24 g，18%)。ES/MS m/z 618.6 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, d 6-DMSO) d 1H NMR (400.13 MHz, DMSO): 0.88 (s, 3H), 1.24-1.12 (m, 2H), 1.40 (s, 3H), 1.69-1.56 (m, 1H), 1.91-1.76 (m, 4H), 2.08-2.01 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.39-2.29 (m, 1H), 3.18 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 4.12-4.00 (m, 1H), 4.37-4.30 (m, 2H), 4.79 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 5.10-5.06 (m, 3H), 5.31 (d, J= 6.7 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 6.18 (dd, J= 1.8, 10.1 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 6.53-6.48 (m, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.87 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.99 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.09 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.33 (d, J= 10.1 Hz, 1H)。 製劑 7(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸
向3-順丁烯二醯亞胺丙酸N-丁二醯亞胺酯(5.0 g，19 mmol)及L-丙胺醯基-L-丙胺酸(3.4 g，21 mmol)於DCM (25 mL)中之溶液中添加DIPEA (3.1 mL，18 mmol)且將混合物在室溫下攪拌隔夜。將反應混合物在減壓下濃縮，得到殘餘物，其藉由矽膠層析純化，用2%乙酸/EtOAc溶離，得到標題化合物(4.0 g，69%)。ES/MS m/z 312.3 (M+H)。 製劑8  3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺(在本文中亦稱為「GC-L」)
向冷卻至0至5℃的(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(24 g，39 mmol，參見製劑6)及3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸(15 g，47 mmol，參見製劑7)於DCM (250 mL)中之溶液中添加2,6-二甲基吡啶(11 mL，97 mmol)，接著添加HATU (17 g，43mmol)。將混合物在0至5℃下攪拌5分鐘，隨後移除冷卻浴，且將混合物攪拌2小時。混合物用EtOAc稀釋。有機溶液用三份水、一份NaCl飽和水溶液洗滌，經Na 2SO 4乾燥(添加MeOH以幫助溶解)，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物藉由矽膠層析使用1至10% MeOH/DCM之梯度純化，得到標題化合物(24 g，68%)。ES/MS m/z 911.4 (M+H)。 1H NMR (400.13 MHz, DMSO): d 9.88 (s, 1H), 8.20 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.60-7.58 (m, 1H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.14-7.09 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.89 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 6.34 (s, 1H), 6.18 (dd, J= 1.8, 10.0 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.31 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 5.13-5.04 (m, 3H), 4.78 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 4.41-4.30 (m, 4H), 4.10-4.00 (m, 1H), 3.61 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.42-2.31 (m, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.11-2.01 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 5H), 1.40 (s, 3H), 1.31 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 1.19-1.11 (m, 5H), 0.88 (s, 3H)。 製劑9  3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙烯醯胺
以類似於製劑8中描述之程序的方式，製劑9之化合物由(6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10R,11aR,12aS,12bS)-10-(3-((3-胺基苯甲基)氧基)-2-氟-6-甲基苯基)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-1,2,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-4H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-4-酮(參見製劑5)及3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸(參見製劑7)來製備。ES/MS m/z 911.4 (M+H)。1H NMR (500.11 MHz, DMSO): d 9.88 (s, 1H), 8.23-8.20 (m, 1H), 8.11 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.59 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.33-7.28 (m, 2H), 7.15-7.08 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.91-6.89 (m, 1H), 6.17 (dd, J= 1.7, 10.1 Hz, 1H), 5.94 (s, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.16-5.12 (m, 3H), 4.98-4.96 (m, 1H), 4.81 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 4.49-4.36 (m, 6H), 3.61 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.41 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.30-2.29 (m, 4H), 2.17-2.15 (m, 2H), 1.88-1.77 (m, 4H), 1.69-1.61 (m, 1H), 1.40 (s, 3H), 1.31 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 1.18 (d, J= 7.2 Hz, 3H), 0.93-0.87 (m, 6H)。 實例 實例 1. 抗人類 TNFα 抗體糖皮質激素結合物 ( 抗人類 TNFα Ab GC 結合物 ) 之產生 實例 1a ：抗人類 TNFα 抗體之產生及工程改造。
抗體產生 ：為了產生對人類TNFα具有特異性之抗體，用重組人類TNFα免疫接種具有人類免疫球蛋白可變區之基因轉殖小鼠。用人類TNFα進行篩檢且測試與其他TNFα物種之交叉反應性。對人類及食蟹獼猴TNFα具有交叉反應性之抗體進行選殖、表現且藉由標準程序純化，且在經TNFα誘導之細胞毒性分析法中測試中和。抗體在其CDR、可變域構架區及IgG同型中經選擇及工程改造以改良結合親和力及可發展性特性，諸如穩定性、溶解度、黏度、疏水性及聚集。
人類TNFα之胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 39，食蟹獼猴TNFα之胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 42。
抗人類TNFα抗體可藉由熟知方法合成及純化。適合之宿主細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovarian；CHO)可使用預定HC:LC載體比率(若使用兩種載體)經用於分泌抗體之表現系統，或編碼重鏈及輕鏈兩者之單一載體系統短暫或穩定地轉染。已分泌出抗體之澄清培養基可使用常用技術來純化。
改良黏度之抗體工程改造 ：發現親本TNFα抗體譜系在濃縮時具有高黏度。黏度為用於評估經由例如自動注射器遞送治療抗體之可行性的關鍵可發展性標準。抗體之突變誘發分析需要改良生物物理學特性且保持所需親和力及效能而不增加免疫原性風險之平衡。親本抗體之電腦模擬建模用於鑑別包含六個互補決定區(CDR)之表面中之電荷不平衡區。篩檢由突變誘發產生之抗體以用於TNFα結合，且選擇與親本mAb (藉由ELISA所測定)相比保持或改良標靶結合以及具有所需黏度及其他可發展性特性的此等抗體以用於進一步開發。
降低免疫原性風險之抗體工程改造 ：在MHC相關肽蛋白質體學(MAPPS)分析法中測試抗人類TNFα抗體以確定免疫原性風險。簡言之，鑑別具有特異性CDR序列之抗體的主要組織相容複合體(MHC)結合肽。構築具有鑑定為潛在地降低免疫原性之突變的CDR庫且進行篩檢以用於TNFα結合。篩檢及選擇抗體以最佳化低免疫原性風險，同時平衡維持對TNFα之所需結合親和力及其他所需可發展性特性。
表2a、2b及3展示例示性抗人類TNFα抗體序列，其低黏度、可接受之免疫原性風險及其他所需可發展性特性最佳化，同時保持對人類TNFα之所需結合親和力。 表 2a ： 例示性抗人類 TNF α Ab 之 CDR 胺基酸序列
TNFα 抗體 CDR 序列
HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
Ab1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
Ab2 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 15
Ab3 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
Ab4 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 15
Ab5 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
Ab6 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 32
表 2b ： 例示性抗人類 TNF α Ab 之 CDR 胺基酸共通序列
區 共通序列
LCDR1 SEQ ID NO: 43 QASQGIXaa 7NYLN 其中Xaa 7為絲胺酸或精胺酸
LCDR3 SEQ ID NO: 44 QQYDXaa 5LPLT 其中Xaa5為天冬醯胺或離胺酸
表 3 ：例示性抗人類 TNFα Ab 之胺基酸序列
TNFα 抗體 VH VL HC LC
Ab1 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
Ab2 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19
Ab3 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 10
Ab4 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 19
Ab5 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 28
Ab6 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
實例 1b. 其中 n 為 4 之 抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之產生 其中n為4；且 Ab為Ab1。
例示性抗人類TNFα抗體Ab1 (參見表2a、2b及3)首先在存在40倍莫耳過量之二硫蘇糖醇(DTT)之情況下在37℃下還原2小時或在約21℃下還原＞16小時。此初始還原步驟用於移除各種加帽基團，包括在表現期間結合至重鏈之124及378位置處的經工程改造之半胱胺酸的半胱胺酸及麩胱甘肽。在還原步驟後，樣本經由去鹽管柱純化以移除未結合之端帽以及還原劑。在室溫(約21℃)下在存在10倍莫耳過量之去氫抗壞血酸(DHAA)之情況下進行後續2小時氧化步驟以重新形成輕鏈與重鏈之間的天然鏈間二硫鍵以及一對鉸鏈二硫鍵。2小時氧化步驟之後，使用10 mM溶解於DMSO中之儲備溶液添加4至8莫耳當量之糖皮質激素受體促效劑有效負載-連接子(「GC-L」)、製劑8中製備的3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS, 8bS,10S,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺。樣品隨後在室溫下培育30至60分鐘以允許GC-L與經工程改造之半胱胺酸的高效結合。隨後使用後續拋光步驟，諸如尺寸排阻層析法(SEC)或切向流過濾(TFF)以將樣品緩衝交換至適當的調配緩衝液中且移除DMSO及任何過量的連接子-有效負載。
藥物與抗體比率 (DAR) 評估 ：為評估最終結合物上存在之連接子-有效負載之平均數目，使用兩種分析方法：1)逆相(RP) HPLC及2)飛行時間(TOF)質譜分析。兩種方法均需要初始樣品還原步驟，其包括添加二硫蘇糖醇(DTT)達至約10mM之最終濃度，接著在42℃下培育5分鐘。
逆相 HPLC 方法 ：將10至30 µg之經還原抗人類TNFα抗體Ab1 GC結合物樣品注射於苯基5PW，4.6 mm × 7.5 cm，10 µm管柱(Tosh Part# 0008043)上。A緩衝液由含0.1%三氟乙酸(TFA)之水製成，而B緩衝液由含0.1%三氟乙酸(TFA)之乙腈(ACN)構成。在樣品注射之前將管柱在20% B緩衝液中進行平衡，接著在約8.5管柱體積上之梯度為28% B至40% B。平均DAR藉由計算各個別DAR物種之分率百分比之貢獻乘以各貢獻物種之DAR數目來測定。由於此值係基於部分還原之樣品且僅表示分子之一半，因此隨後將數目乘以2以解釋完整抗體GC結合物。實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物之DAR計算值提供於表4中。 表 4 ：使用部分還原之樣品中各 DAR 物種之分率百分比定量抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之平均 DAR
DAR 峰 % DAR 貢獻
0 23.97 0.00
1 3.573 0.13
總 LC % 27.543   
   LC 平均 DAR 0.13 (LC之DAR貢獻)
        
0 0 0.00
1 16.059 0.22
2 42.631 1.18
3 12.525 0.52
4 1.242 0.07
總 HC % 72.457   
   HC 平均 DAR 1.99 (HC之DAR貢獻)
(HC+LC)2 最終平均 DAR 4.23
飛行時間質譜分析方法 ：將8 µg之部分還原之樣品注射於Poroshell 300sb-C3 2.1×2.5 mm，5 µM管柱(Agilent Part# 821075-924)上。緩衝液A由含0.1%三氟乙酸(TFA)之水製成，而緩衝液B由含0.1%三氟乙酸(TFA)之乙腈(ACN)構成。在樣品注射之前將管柱在0% B緩衝液中進行平衡，接著在約28管柱體積上之梯度為10% B至80% B。平均DAR藉由計算各個別DAR物種之分率百分比之貢獻乘以各貢獻物種之DAR數目來測定。由於此值係基於部分還原之樣品且僅表示分子之一半，因此隨後將數目乘以2以解釋完整抗體GC結合物。實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物之DAR計算值提供於表5中。 表 5 ： 基於飛行時間質譜分析之總離子計數定量抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之平均 DAR
DAR 離子計數 DAR 貢獻
0 70408.48 0.00
1 748.98 0.01
總 LC % 71157.46   
   LC 平均 DAR 0.01 (LC之DAR貢獻)
        
0 0 0.00
1 11453.18 0.14
2 59493.17 1.46
3 9902.22 0.37
4 424.72 0.02
總 HC % 81273.29   
   HC 平均 DAR 1.99 (HC之DAR貢獻)
(HC+LC)2 總平均 DAR 4.00
實例 1c. 其中 n 為 3 之 抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之產生 其中n為3；且 Ab為Ab1。
實例1c之結合物以類似於實例1b中描述之程序的方式在結合步驟期間使用較低莫耳比之GC-L 3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((3-((2-氟-3-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,10S,11aR, 12aS,12bS)-7-羥基-8b-(2-羥基乙醯基)-6a,8a-二甲基-4-側氧基-2,4,6a,6b,7,8,8a,8b,11a,12,12a,12b-十二氫-1H-萘并[2',1':4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊烯-10-基)-4-甲基苯氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丙醯胺與Ab1來製備。舉例而言，使用3.2:1莫耳比之相應GC-L:Ab1產生大約3之最終DAR。 實例 1d. 其中 n 為 4 之 抗人類 TNFα Ab2 GC 結合物之產生 其中n為4；且 Ab為Ab2。
實例1d之結合物基本上以類似於實例1b中描述之程序的方式使用Ab2代替Ab1來製備。 實例 1e. 其中 n 為 3 之 抗人類 TNFα Ab2 GC 結合物之產生 其中n為3；且 Ab為Ab2。
實例1e之結合物基本上以類似於實例1c中描述之程序的方式使用Ab2代替Ab1來製備。
實例 1f. 硫代琥珀醯亞胺水解 ：其中n為4的式Ie結合物之硫代琥珀醯亞胺環可在如下文方案2中所示的此項技術中眾所周知之條件下水解(參見例如WO 2017/210471，段落001226)，得到式If之開環產物。 方案 2
另外，式Ie結合物之以上硫代琥珀醯亞胺環可在活體內及在標準或眾所周知之調配條件下經歷至少部分地水解，得到式If之開環產物。 實例 2. 抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物及抗人類 TNFα 抗體 之結合效力
實例 2a.Elisa 結合 ：在抗原下降ELISA格式中測試實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體與人類、恆河猴及/或犬TNFα蛋白質之結合效力。簡言之，384孔高結合盤(Greiner Bio-one #781061)塗佈有20微升/孔的於碳酸鹽緩衝液pH 9.3 (0.015 M Na 2CO 3及0.035 M NaHCO 3)中稀釋的1 µg/mL之人類TNFα (Syngene)、2 µg/mL之恆河猴TNFα (R&D Systems，目錄號1070-RM)或2 µg/mL之犬TNFα (R&D Systems，目錄號1507-CT/CF)且儲存於4℃下隔夜。次日，將盤在室溫下用80 µL酪蛋白(Thermo Fisher Pierce，目錄號37528)阻斷1小時，移除阻斷緩衝液，且將20 µL於CHO細胞中表現之滴定抗人類TNFα抗體及抗人類TNFα Ab1 GC結合物(起始濃度為20 µg/mL，稀釋於酪蛋白中且滴定3倍，8點下降)添加至盤中。在37℃下培育盤90分鐘，隨後在PBS/0.1% Tween中洗滌三次。將以1:1500稀釋之20 μL二級抗體試劑山羊-抗人類κ-AP (Southern Biotech，目錄號2060-04)添加至盤中且在37℃下培育45分鐘。將盤如上洗滌3次，且向每個孔中添加20 μL在分子級水中稀釋至1:35之鹼性磷酸酶受質溶液。一旦顯色(大約15至30分鐘)，在Molecular Device Spectramax盤讀取器上以560 nM OD讀出盤，且使用Softmax Pro 4.7軟體獲取資料。在GraphPad Prism中進行資料分析。
表6a中之結果顯示，實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物以所需效力結合人類TNFα，其與未結合之抗人類TNFα Ab1相當。
表6b中之代表性結果顯示，抗人類TNFα抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5及Ab6與人類、恆河獼猴及犬TNFα交叉反應。 表 6a. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物與人類 TNFα 之結合 EC 50
人類TNFα EC 50(µg/mL)
Ab1 0.280
Ab1 GC 結合物 0.325
表 6b. 例示性抗人類 TNF α 抗體 與 人類、恆河獼猴及犬 TNF α 之結合 EC 50
人類TNFα EC 50(µg/mL) 恆河獼猴TNFα EC 50(µg/mL) 犬TNFα EC 50(µg/mL)
Ab1 0.223 0.156 0.220
Ab2 0.222 0.162 0.24
Ab3 0.216 0.141 0.240
Ab4 0.213 0.144 0.231
Ab5 0.220 0.161 0.176
Ab6 0.131 0.115 0.162
實例 2b. 細胞表面結合 ：為評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物與活膜TNFα表現細胞之結合，使用先前經證實允許細胞表面(Mueller等人，1999)上之生物活性TNFα在不存在TNFα裂解的情況下表現的突變集使TNFα之已知裂解位點不活化。不可裂解TNFα構築體穩定地轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。此等細胞表現膜結合TNFα，如藉由流式細胞測量術所展示。
將TNFα轉染之CHO細胞在4℃下用濃度範圍在600 nM至0.0304 nM (在三倍稀釋下)內之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物在FACS緩衝液(具有2% FBS之PBS)中培育30分鐘。根據製造商協定藉由用經AlexaFluor-647 (Thermo #A20186)標記之山羊抗人類IgG F(ab')2進行二次偵測來證實細胞結合。用例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物培育之經轉染CHO細胞用FACS緩衝液洗滌，且隨後在4℃下在FACS緩衝液中用2 µg/mL之經AlexaFluor-647標記之山羊抗人類IgG F(ab') 2染色30分鐘。將經染色細胞洗滌，再懸浮於FACS緩衝液中，且在BD LSRFortessa細胞分析儀上分析。一式兩份地進行染色。人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照物。抗人類TNFα Ab1用作陽性對照物。
使用FlowJo (v10.8.0)分析流式細胞測量術資料以獲得各測試樣品之AlexaFluor-647之平均螢光強度(MFI)。藉由使用GraphPad Prism 9將非線性回歸(4PL曲線)擬合至所標繪之MFI資料來獲得EC 50值。
表7中之結果顯示，GC與抗人類TNFα Ab1之結合不顯著影響抗人類TNFα Ab1 GC結合物與表現TNFα之膜的結合。 表 7. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物與膜人類 TNFα 之結合
與膜人類TNFα 之結合 EC 50(nM)
hIgG1 同型對照 n/a
Ab1 4.258
Ab1 GC 結合物 5.292
實例 3 ： 抗人類 TNFα Ab GC 結合物之活體外功能表徵
實例 3a. 內化 ：評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體結合膜結合TNFα及內化至衍生自不同健康人類供體之樹突狀細胞(DC)之人類CD14+單核球中的能力。將CD14+單核球自周邊血液單核細胞(PBMC)分離，培養且分化成未成熟樹突狀細胞(用IL-4及GM-CSF)，所有均使用標準方法。為獲得成熟DC，用1 µg/mL LPS (脂多糖)處理細胞4小時。
例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體在完全RPMI培養基中以8 μg/mL稀釋，且在完全RPMI培養基中以相同體積與稀釋至5.33 μg/mL之偵測探針Fab-TAMRA-QSY7混合，隨後在4℃下在黑暗中培育30分鐘以形成複合物，隨後添加至未成熟及成熟DC培養物中且在37℃下在CO 2培育箱中培育24小時。用2% FBS PBS洗滌細胞且再懸浮於100 µL具有Cytox綠色活/死染料之2% FBS PBS中。在BD LSR Fortessa X-20上收集資料且在FlowJo中分析。活的單細胞被閘控，且TAMRA螢光陽性細胞之百分比記錄為讀數。為允許將分子與產生自不同供體之資料進行比較，使用標準化內化指數。使用以下計算使內化信號相對於IgG1同型(經標準化之內化指數=0)及內部陽性對照物PC (經標準化之內化指數=100)標準化： 其中X TAMRA、IgG1同型 TAMRA及PCT AMRA分別為測試分子X、IgG1同型及PC之TAMRA陽性群體的百分比。
表8a中之結果顯示，抗人類TNFα Ab1 GC結合物在結合至表現於成熟樹突狀細胞上之TNFα後會以與未結合之抗人類TNFα Ab1之內化指數相當的內化指數活體外內化至樹突狀細胞中。此指示糖皮質激素與抗人類TNFα Ab1之結合不影響抗人類TNFα Ab1之內化功能。
來自表8b中之不同供體的代表性結果顯示，抗人類TNFα抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5及Ab6在結合至細胞表面上之TNFα後會內化至未成熟及成熟的樹突狀細胞中。 表 8a ： 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物內化至樹突狀細胞
成熟樹突狀細胞內化指數
對照hIgG1 0
Ab1 44.5
Ab1 GC 結合物 39.5
表 8b ： 例示性抗人類 TNFα 抗體 內化至樹突狀細胞
未成熟樹突狀細胞內化指數 成熟樹突狀細胞內化指數
Ab1 19.4 26.7
Ab2 21.9 38.3
Ab3 20.0 35.2
Ab4 33.6 43.1
Ab5 54.6 52.7
實例 3b. 可溶性及膜 TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 ：在基於活體外細胞之分析中評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體對可溶性及膜TNFα誘導之細胞凋亡的抑制。
可溶性 TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 ：活體外評估例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體抑制可溶性TNFα誘導之L929細胞凋亡分析的能力。L929小鼠纖維肉瘤細胞天然地表現TNF受體。當與放線菌素D組合時，TNFα在此等細胞中誘導典型之細胞凋亡，由於形成過量之可藉由TNFα中和補救之反應性氧中間物而引起細胞快速死亡。簡言之，在分析培養基(1× DMEM培養基、10% FBS、1% Pen-Strep、1% MEM必需胺基酸、1% L-麩醯胺酸、1%丙酮酸鈉)中培養L929。在分析當天，細胞用1×PBS (無Ca ++或Mg ++)沖洗且自具有0.25%胰蛋白酶+ EDTA之培養燒瓶中剝離。胰蛋白酶用分析培養基滅活。L929細胞在室溫下以1500 rpm離心5分鐘。將細胞集結粒再懸浮於分析培養基中，且將1 × 10 4個L929細胞(於100 µL中)添加至96孔盤中且置放於組織培養恆溫箱(37℃，95%相對濕度，5% CO 2)中隔夜。隨後將結合物/TNFα/放線菌素-D混合物(TNFα Ab1 GC結合物及抗體以15 µg/mL添加，在三倍稀釋下達至0.0005 µg/mL)與L929貼附型細胞轉移至96孔盤中且培育(37℃，95%相對濕度，5% CO 2) 18小時。
為測定活細胞之數目，移除分析培養基，且將MTS-四唑鎓受質混合物添加至各孔(100 µL)中(其中代謝活性細胞中之線粒體脫氫酶將MTS-四唑鎓還原成有色甲臘產物)。將盤置放於培養箱(37℃，95%相對濕度，5% CO 2)中2小時。藉由在微盤讀取器(Biotek Cytation 5成像多模式讀取器)上在490 nm下讀取盤來測定細胞死亡。結果以濃度表示，其中50%之經TNFα誘導之細胞毒性(IC 50)係藉由例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物或抗體抑制，使用資料之4參數S形擬合(GraphPad Prism 9)計算。
膜 TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 ：為評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體抑制膜TNFα誘導之細胞凋亡的能力，將不可裂解TNFα構築體穩定轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中以產生表現CHO細胞之細胞表面(膜) TNFα。產生在TNFα之裂解位點處具有已知突變之不可裂解TNFα構築體，其允許在不存在TNFα裂解之情況下在細胞表面上表現生物活性TNFα (Mueller等人1999)。L929細胞與表現人類不可裂解TNFα之CHO細胞之培育引起L929細胞快速死亡。為測定例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα抗體是否可中和所觀測之細胞凋亡，評估介於15 µg/mL至0.0005 µg/mL (在三倍稀釋下)範圍內之劑量。將各濃度之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物或抗人類TNFα抗體以100微升/孔重複添加至含有每孔500個CHO TNFα轉染物細胞+6.25 µg/mL放線菌素D之盤中兩次。將混合物在室溫下培育30分鐘，且隨後添加至L929細胞盤中。人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照物。基本上如關於經可溶性TNFα誘導之細胞凋亡分析法所描述來測定L929細胞死亡。
表9a中之結果顯示，實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物以劑量依賴型方式活體外抑制可溶性人類TNFα (約0.104 µg/mL之IC 50)及膜人類TNFα (約0.306 µg/mL之IC 50)誘導之L929細胞之細胞凋亡，與抗人類TNFα Ab1相當。此指示GC與抗體之結合不影響抗體之生物活性。如所預期，陰性對照物hIgG1同型不抑制TNFα誘導之細胞凋亡。
表9b中之代表性結果顯示，例示性抗人類TNFα抗體Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5及Ab6以劑量依賴型方式活體外抑制可溶性及膜人類TNFα誘導之L929細胞之細胞凋亡兩者。 表 9a. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物抑制 L929 細胞之可溶性及膜人類 TNFα 誘導之細胞凋亡
可溶性人類TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 IC 50(µg/mL) 膜人類TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 IC 50(µg/mL)
hIgG1 同型 n/a n/a
Ab1 0.089 0.302
Ab1 GC 結合物 0.104 0.306
表 9b. 例示性抗人類 TNF α 抗體抑制膜及可溶性人類 TNF α 誘導之 L929 細胞的細胞凋亡
可溶性人類TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 IC 50(µg/mL) 膜人類TNFα 誘導之細胞凋亡的抑制 IC 50(µg/mL)
hIgG1 同型 n/a n/a
Ab1 0.16 0.13
Ab2 0.13 0.13
Ab3 0.19 0.15
Ab4 0.19 0.13
Ab5 0.22 0.20
實例 3c. 活體外人類 T 細胞 細胞介素表現分析 ：為評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及實例1d之抗人類TNFα Ab2 GC結合物對疾病相關細胞之功能活性，將人類初級T細胞在活體外用結合物刺激及共處理。亦評估來自US2020338208之例示性抗人類TNFα Ab GC結合物之活性。根據製造商之協定(人類T細胞分離套組，Stemcell Technologies #17951)，人類初級CD 3+T細胞藉由免疫磁性陰性選擇自新純化之人類PBMC分離。使用流式細胞測量術染色在BD LSRFortessa細胞分析儀上評估細胞純度。T細胞經證實有CD3 +(抗人類CD3-APC，Fisher Scientific #17-0036-42)及CD4 (抗人類CD4-eFluor-450，Fisher Scientific #48-0047-42)及CD8 (抗人類CD8a-FITC，BioLegend #301006)T細胞子集之額外表型分型。將2 × 10 5個CD 3+T細胞/孔接種於分析培養基(1× RPMI-1640培養基，10% FBS，1%非必需胺基酸，1%丙酮酸鈉，1% 格魯塔瑪，1% Pen-Strep及0.1% β-巰基乙烯醇)中之96孔平底盤中。細胞用1 × 10 5個人類T-活化物抗-CD3/CD28戴諾珠粒(Thermo Fisher #11132D)刺激且用例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物、抗人類TNFα Ab2 GC結合物或來自US2020338208之例示性抗人類TNFα Ab GC結合物中之各者以200 nM至0.0914 nM (在3倍稀釋下)處理，每個供體兩個重複盤。人類IgG1同型對照抗體用作陰性對照物。對照包括未結合之抗人類TNFα Ab1及游離GC。隨後將分析盤在37℃與5% CO 2下培育72小時。在72小時收集細胞培養上清液且將其冷凍在-80℃下。使用定製U-PLEX人類生物標記多重分析(Mesoscale Discovery #K15067L)藉由對人類IL-6、IL-10、IL-13及GM-CSF具有特異性之偵測抗體自解凍之細胞培養上清液量測細胞介素含量。活性量測為細胞介素IL-6、IL-13、GM-CSF之抑制及IL-10之誘導。對於各個別供體，將細胞介素之偵測含量(pg/mL)轉化成正規化之『抑制%』或『誘導%』值。IL-6、IL-13及GM-CSF組之正規化參數0%抑制等於經刺激-未處理之對照孔中細胞介素之平均濃度，其中100%抑制等於未經刺激之對照孔中細胞介素之平均濃度。IL-10組之正規化參數0%誘導等於經刺激-未處理對照孔中細胞介素之平均濃度，其中100%誘導等於200 nM游離GC處理組中細胞介素之平均濃度。藉由將非線性回歸(4PL曲線)擬合至正規化資料上而獲得正規化IC 50值。使用GraphPad Prism 9進行統計分析。
表10中之結果顯示，實例1b及實例1d之抗人類TNFα Ab GC結合物顯著抑制細胞介素IL-13、IL-6及GM-CSF，且顯著誘導細胞介素IL-10。另外，在此活體外分析中，相比於抗人類TNFα Ab1或US2020338208中揭示之例示性抗TNFα Ab GC結合物，實例1b及實例1d之抗人類TNFα Ab GC結合物以更大百分比抑制細胞介素IL-13、IL-6及GM-CSF，且誘導細胞介素IL-10。特定言之，結果顯示實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物及實例1d之抗人類TNFα Ab2 GC結合物經由TNFα抗體及糖皮質激素兩者調節細胞介素表現。 表 10. 實例 1b 之抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物及實例 1d 之 抗人類 TNFα Ab2 GC 結合物對 T 細胞 細胞介素釋放的作用
IL-6 IL-13 GM-CSF IL-10
200 nM 下之抑制%(SEM) 200 nM 下之抑制%(SEM) 200 nM 下之抑制%(SEM) 200 nM 下之 誘導%(SEM)
hIgG1 同型 6.53 (4.70) 7.32 (4.02) 8.61 (4.88) 16.52 (4.75)
Ab1 (n=14) 32.24 (3.82)* 28.07 (3.33)* 25.59 (4.13)* 42.47 (7.87)
Ab1 GC 結合物(n=12) 56.76 (5.17)*^ 58.48 (2.85)* ^ † 53.94 (3.04)* ^ † 114.41 (12.37)*^
Ab2 GC 結合物(n=12) 48.52 (3.11)* 60.16 (2.58)* ^ † 52.94 (2.47)*^ 102.27 (8.60)*^
來自 US2020338208 之 例示性抗人類TNFα Ab 結合物(n=14) 41.18 (4.20)* 42.25 (2.94)*^ 38.79 (2.96)* 87.06 (12.19)*^
資料統計 ： 杜凱氏多重比較測試 ； * = 相比於 同型， p＜0.05 ； ^ = 相比於 Ab1， p＜0.05 ；† = 相比於來自 US2020338208 之 例示性抗人類 TNFα Ab 結合物 ， p＜0.05 。 實例 4. 例示抗人類 TNFα Ab GC 結合物之效應功能活性
實例 4a. 人類 Fc γ 受體 結合 . 實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物與人類Fcγ受體之結合親和力藉由表面電漿子共振(SPR)分析評估。使用製造商之EDC/NHS胺偶合方法(Cytiva P/N BR100050)製備一系列S CM5晶片(Cytiva P/N BR100530)。簡言之，所有4個流動細胞(FC)之表面藉由以10微升/分鐘注射EDC/NHS之1:1混合物7分鐘而活化。將蛋白A(Calbiochem P/N 539202)在10 mM乙酸鹽、pH 4.5緩衝液中稀釋至100 μg/mL，且藉由以10微升/分鐘之流動速率注射7分鐘持續約4000 RU將其固定至所有4個FC上。未反應之位點用以10微升/分鐘注射乙醇胺7分鐘阻塞。注射2×10 μL甘胺酸、pH值1.5以移除任何非共價相關蛋白質。操作緩衝液為1× HBS-EP+ (TEKNOVA，P/N H8022)。FcγR細胞外域(ECD)-FcγRI(CD64)、FcγRIIA_131R及FcγRIIA_131H(CD32a)、FcγRIIIA_158V、FcγRIIIA_158F(CD16a)及FcγRIIb (CD32b)自穩定CHO細胞表現產生，且使用IgG瓊脂糖及尺寸排阻層析法純化。對於FcγRI結合，測試分子(其包括實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物及人類IgG1同型對照抗體)在操作緩衝液中稀釋至2.5 µg/mL，且在FC 2至4中捕獲大約150 RU之各抗體(RU捕獲)。FC1為參考FC，因此未在FC1中捕獲抗體。在操作緩衝劑中將FcγRI ECD稀釋至200 nM，且隨後在操作緩衝劑中將其兩倍連續稀釋至0.78 nM。以40微升/分鐘在所有FC上進行各濃度之重複注射持續120秒，隨後進行1200秒之解離相位。藉由在所有FC上以30微升/分鐘注射15 μL之10 mM甘胺酸(pH 1.5)以進行再生。將扣除參考之資料收集為FC2 FC1、FC3-FC1及FC4-FC1，且在25℃下獲得該等量測值。使用藉由Scrubber 2 Biacore評估軟體以進行穩態平衡分析或BIA評估中之「1:1(朗繆爾)結合」模型來計算親和力(K D)。對於FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa結合，在操作緩衝劑中將抗體稀釋至5 μg/mL，且在FC 2至4中捕獲約500 RU之各抗體。FC1為參考FC。在操作緩衝劑中將Fcγ受體ECD稀釋至10 nM，且隨後在操作緩衝劑中將其2倍續稀釋至39 nM。以40微升/分鐘在所有FC上注射各濃度之重複注射持續60秒，隨後進行120秒解離相位。藉由在所有FC上以30微升/分鐘注射15 μL之10 mM甘胺酸(pH 1.5)以進行再生。將扣除參考之資料收集為FC2-FC1、FC3-FC1及FC4-FC1，且在25℃下獲得該等量測值。使用Scrubber 2 Biacore評估軟體進行穩態平衡分析來計算親和力(K D)。分析各受體至少兩次。
表11中之結果顯示，實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物與人類、FcγRIIa、FcγRIIb及FcγRIIIa受體ECD之結合親和力(K D)與人類IgG1同型對照抗體相當。 表 11. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物與人類 Fcγ 受體 之結合親和力
Fcγ 受體 人類IgG1 同型對照抗體 抗人類TNFα Ab1 GC 結合物
平均K D 標準偏差 平均K D 標準偏差
FcγRI 47.9 pM 13.1 48.6 pM 12.1
FcγRIIA_131H 0.57 µM 0.04 0.35 µM 0.02
FcγRIIA_131R 0.57 µM 0.02 0.31 µM 0.01
FcγRIIb 2.81 µM 0.14 1.30 µM 0.05
FcγRIIIA_158V 0.15 µM 0.00 0.12 µM 0.01
FcγRIIIA_158F 0.82 µM 0.01 0.52 µM 0.01
實例 4b. 抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) ：實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之活體外ADCC分析藉由基於報導基因之ADCC分析法評估。
對於基於報導基因之ADCC分析法，共表現膜結合TNFα及CD20之CHO細胞株(Eli Lilly and Co.)用作目標細胞株且表現功能性FcγRIIIa (V158)-NFAT-Luc之Jurkat細胞(Eli Lilly and Company)用作效應細胞株。將所有測試抗體及細胞在含有RPMI-1640 (無酚紅)及0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、500 U/mL之青黴素-鏈黴素及0.1% w/v BSA之分析培養基中稀釋。測試抗體首先稀釋至20 nM之3×濃度，且隨後以1:4比率連續稀釋7次。50微升/孔之各抗體在白色不透明底部96孔盤(Costar，#3917)中等分三份。將CD20抗體用作陽性對照。隨後以5×10 4個細胞/孔，以50 µL等分試樣將Daudi靶細胞添加至盤中，且在37℃下培育1小時。隨後，以1.5 × 10 5個細胞/孔，以50 µL等分試樣將Jurkat V158細胞添加至各孔中且在37℃下培育4小時，隨後添加100微升/孔之One-Glo Luciferase受質(Promega, #E8130)。使用盤振盪器以低速混合盤之內含物，在室溫下培育5分鐘，且使用0.2 cps整合在BioTek微量盤讀取器(BioTek Instruments)上讀取發光信號。使用GraphPad Prism 9分析資料且以抗體濃度相對於相對發光單位(RLU)之離散格式標繪各抗體濃度之RLU。結果代表兩個獨立實驗。
圖1中之結果顯示，實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物相較於陽性對照具有中等ADCC活性。
實例 4c. 補體依賴性細胞之細胞毒性 (CDC) ： 實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之活體外CDC分析使用共表現膜結合TNFα及CD20之CHO細胞株(Eli Lilly and Co.)實施。在由RPMI-1640 (無酚紅)及0.1 mM非必需胺基酸(NEAA)、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-麩醯胺酸、500 U/mL青黴素-鏈黴素及0.1% w/v BSA構成之分析培養基中稀釋所有測試抗體、補體及細胞。測試抗體首先稀釋至3×濃度之200 nM，且隨後以1:4比率連續稀釋7次。將50微升/孔之各抗體(包括CD20陽性對照抗體)在白色不透明底部96孔盤(Costar，#3917)中等分成三份。Daudi靶細胞以5 ×10 4個細胞/孔添加50微升/孔且在37℃下培育1小時。隨後，在37℃水浴中快速解凍之人類血清補體(Quidel，#A113)在分析培養基中以1:6稀釋，且以50 µL/孔添加至分析盤。在37℃下培育盤2小時，隨後添加100微升/孔之CellTiter Glo受質(Promega，#G7571)。使用盤振盪器以低速混合盤之內含物，在室溫下培育5分鐘，且使用0.2 cps整合在BioTek微量盤讀取器(BioTek Instruments)上讀取發光信號。使用GraphPad Prism 9分析資料且以抗體濃度相對於相對發光單位(RLU)之離散格式標繪各抗體濃度之RLU。
兩個代表性獨立實驗之結果(其中之一者展示於圖2中)顯示，例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物相較於陽性對照時具有CDC活性之邊際誘導。 實例 5 ： 例示性抗人類 TNF α 抗體與針對阿達木單抗之抗藥物抗體結合之表徵
實例 5a. 與針對阿達木單抗之食蟹獼猴抗藥物抗體之結合 ：評估例示性抗人類TNFα抗體與針對阿達木單抗之抗藥物抗體(抗阿達木單抗抗體)之結合，該等抗藥物抗體由來自經阿達木單抗高免疫之食蟹獼猴的親和力純化高免疫猴血清(AP-HIMS)獲得。使用阿達木單抗-AffiGel10純化來自經阿達木單抗高免疫之食蟹獼猴的抗阿達木單抗抗體。在ACE-橋分析法中使用AP-HIMS之滴定來偵測抗阿達木單抗抗體。分析法遵循FDA免疫原性測試指導來開發。簡言之，用1×TBST (Boston BioProducts，IBB-181X)洗滌經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之96孔盤(Pierce，15500)，且在室溫下使用於TBST/0.1%牛血清白蛋白(BSA；Sigma, A7888)中之100微升/孔的30 nM經生物素標記之阿達木單抗塗佈1小時。用TBST洗滌盤三次，且用TBS (Fisher, BP2471-1) 1:10稀釋親和力純化之抗阿達木單抗抗體，且以100微升/孔添加至經塗佈之盤中且在4℃下培育隔夜。第二天，用TBST洗滌盤三次，且在室溫下使用65微升/孔之300 mM乙酸(Fisher Scientific, A38-500)來酸溶離所捕獲之抗阿達木單抗抗體5分鐘。接著，在中和緩衝液(0.375 M Tris，300 mM NaCl，pH 9)中，使聚丙烯96孔盤(Corning, 3359)負載有50 μL之1 μg/mL經生物素標記之阿達木單抗及經釕標記之阿達木單抗中之各者。隨後，將50 μL經酸溶離之樣品添加至在中和緩衝液及ADA中含有混合物之聚丙烯盤中，且使其在室溫下橋接至經標記之抗體1小時。洗滌MSD Gold 96孔鏈黴抗生物素蛋白盤(Mesoscale, L15SA-1)，且在室溫下用TBS+1% BSA阻斷1小時，隨後洗滌，且將80 μL之經橋接樣品添加至盤中1小時。用TBST洗滌盤三次，且將150微升/孔之2×MSD緩衝液(Mesoscale, R92TC-2)添加至盤中。在MSD SQ120讀取器上讀取盤以提供表示為電化學發光單位(ECLU)之第1層信號。
亦在ACE-橋分析法中測試相同AP-HIMS以偵測針對例示性抗人類TNFα抗體Ab6之抗體，基本上遵循上文關於阿達木單抗所概述之相同方法，但使用經生物素及釕標記之Ab6。接著，繪製隨所測試之AP-HIMS濃度變化之所得ECLU信號。
圖3中之結果顯示，相較於阿達木單抗與其自身抗藥物抗體(最大ECLU信號40000)之結合時，例示性抗人類TNFα抗體Ab6與針對阿達木單抗之抗藥物抗體(最大ECLU信號4000)具有弱結合至無結合，該等抗藥物抗體由來自用阿達木單抗高免疫之食蟹獼猴之血清純化。特定言之，結果顯示例示性抗人類TNFα抗體Ab6僅識別約10%之由食蟹獼猴產生之針對阿達木單抗的抗藥物抗體，表明此結合可能係歸因於位置遠離CDR區(諸如抗體恆定區)之共有序列。
實例 5b. 與針對阿達木單抗之人類患者抗藥物抗體之結合 ：評估在由參與研究RA-BEAM之經阿達木單抗治療之患者獲得的21名患者血清樣品中例示性抗人類TNFα抗體與針對阿達木單抗之抗藥物抗體(抗阿達木單抗抗體)之結合。藉由使用基本上如關於食蟹獼猴ADA評估所描述之方法，在基線後收集21個血清樣品且確認針對阿達木單抗具有高ADA滴度。接著，使用基本上如關於食蟹獼猴ADA評估所描述之方法來評估21個血清樣品與例示性抗人類TNFα抗體Ab6之結合。
圖4中之結果顯示，在所測試之21個患者樣品中之16個中，例示性抗人類TNFα抗體Ab6與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有弱結合至無結合(ECLU信號低於分析法之截止點(102 ECLU))。在確定免疫原性中，截止點為用於鑑別「推定陽性」或含有抗藥物抗體之樣品的臨界值。如圖4中所示，21個樣品中有五個具有高於截止點之ECLU信號，但均高於截止點不到20%，且因此判定為在分析法可變性之內。在用阿達木單抗治療之人類患者中，抗人類TNFα抗體Ab6與針對阿達木單抗之抗藥物抗體的顯著弱結合或無結合指示Ab6及阿達木單抗抗體序列足夠不同，從而使得由所測試之人類個體針對阿達木單抗產生之對阿達木單抗中存在之抗原決定基具有特異性的ADA未由Ab6共用，且因此未由Ab6顯著識別。
此等結果指示例示性抗人類TNFα抗體或結合物之潛在用途，其係用於治療對針對其他TNFα治療劑(諸如阿達木單抗)之抗藥物抗體產生減弱之臨床反應或不良反應的個體。 實例 6 ：免疫原性評估
實例 6a.MHC 相關肽蛋白質體學 (MAPP) 分析法 ：MAPP概況為先前用例示性抗人類TNFα抗體處理之人類樹突狀細胞上之呈遞MHC-II的肽。使用標準方法將CD14+單核球自周邊血液單核細胞(PBMC)分離，培養且分化成未成熟樹突狀細胞(用IL-4及GM-CSF)。在第4天將例示性抗體添加至未成熟樹突狀細胞中，且在5小時培育之後更換含有LPS之新鮮培養基以使細胞轉型為成熟樹突狀細胞。第二天，成熟樹突狀細胞在具有蛋白酶抑制劑及DNA酶之RIPA緩衝液中溶解。使用與鏈黴抗生物素蛋白珠粒偶合之經生物素標記之抗MHC-II抗體來進行MHC-II複合物之免疫沈澱。溶離結合之複合物且過濾。藉由質譜儀分析經分離之MHC-II肽。肽鑑別係藉由內部蛋白質體學管線使用不具有針對牛/人類資料庫之酶搜尋參數的搜尋算法來生成，其中測試序列附接至資料庫。將自例示性抗體鑑別之肽與親本序列比對。
表12中之結果顯示，例示性抗人類TNFα抗體具有不同程度之MAPP呈遞。Ab1在10個測試供體中之3個中顯示具有1個非生殖系叢集之最低MAPP呈遞。 表 12. 例示性抗人類 TNF α 抗體之 MAPP 分析
所有供體之非生殖系叢集之數目 含有 ＞1 個叢集之供體數目
Ab1 1 3/10
Ab2 2 6/10
Ab3 2 5/10
Ab4 3 5/10
Ab5 3 8/10
T 細胞增殖分析法 ：評估例示性抗人類TNFα抗體MAPP衍生之肽叢集藉由誘導細胞增殖以活化CD4+ T細胞之能力。CD8+ T細胞自來自10個健康供體之低溫保藏PBMC中消耗且用1 µM羧基螢光素二乙酸酯丁二醯亞胺酯(CFSE)標記。以每孔每毫升4×10 6個細胞將CD8+ T細胞消耗之PBMC接種於具有5% CTS TM免疫細胞SR (Gibco，目錄號A2596101)之AIM-V培養基(Life Technologies，目錄號12055-083)中，且在2.0 mL含有不同測試分子之以下中重複進行測試三次：DMSO對照物、培養基對照物、匙孔血藍蛋白(KLH；陽性對照物)、PADRE-X肽(合成疫苗輔助肽，陽性肽對照物)或各別抗人類TNFα抗體MAPP衍生之肽叢集(各種肽10 μM)。培養細胞且在37℃及5% CO 2下培育7天。在第7天，樣品用以下細胞表面標記物染色：抗CD3、抗CD4、抗CD14、抗CD19及DAPI，從而使用配備高通量取樣器(High Throughput Sampler；HTS)之BD LSRFortessa TM藉由流式細胞分析技術偵測活力。使用FlowJo®軟體(FlowJo，LLC，TreeStar)分析資料，且計算細胞***指數(Cellular Division Index；CDI)。簡言之，藉由使來自肽刺激孔中增殖之CFSE dimCD4+ T細胞百分比除以未刺激孔中增殖之CFSE dimCD4+ T細胞百分比來計算各MAPP衍生之肽叢集的CDI。≥2.5之CDI被視為代表陽性反應。評估所有供體中之供體出現率百分比。
如表13a及表13b中之結果顯示，Ab2之LCDR1 (表13a)及HCDR3 (表13b)肽分別在約22.0%及25%之供體中誘導T細胞反應頻率，表明當與陽性對照物相比時，Ab2之免疫原性風險顯著降低。KLH陽性對照物誘導100%之供體中之T細胞反應，且PADRE-X (合成疫苗輔助肽)陽性對照物在兩個研究中分別在67%及62.5%之供體中誘導T細胞反應。此範圍屬於此分析法之預期範圍(48.1%+24.4陽性供體出現率)內。 表 13a . 由 MAPP 衍生之肽在健康供體中誘導之 CD4+ T 細胞反應之頻率。
所測試之分子 陽性供體% 中值CDI ( 陽性供體) 中值CDI ( 所有供體) 範圍 陽性供體之數目(CDI＞2.5)
高 低
KLH 100.0 190.8 190.8 1170.1 8.8 9/9
PADRE-X 67.0 4.0 3.1 17.8 0.5 6/9
Ab2 LCDR1 肽 22.0 5.5 1.1 6.0 0.6 2/9
表 13b . 由 MAPP 衍生之肽在健康供體中誘導之 CD4+ T 細胞反應之頻率。
所測試之分子 陽性供體% 中值CDI ( 陽性供體) 中值CDI ( 所有供體) 範圍 供體數目
高 低
KLH 100.0 230.2 230.2 3558.5 12.0 8/8
PADRE-X 62.5 15.3 7.5 45.5 0.3 5/8
Ab2 HCDR3 肽 25.0 7.2 1.3 7.7 0.1 2/8
實例 7. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之生物物理學特性
針對可發展性，評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之生物物理學特性。
實例 7a. 黏度 ：實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物之樣品在pH 6的常用調配緩衝液基質中濃縮至約50 mg/mL、100 mg/mL及150 mg/mL。在15℃下使用VROC® initium (RheoSense)用9次重複量測之平均值量測所有3種濃度之結合物之黏度。表15中之結果顯示，50 mg/mL (2 cP)、100 mg/mL (4.7 cP)及125 mg/mL (8.2 cP)下的實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物具有良好黏度概況。125 mg/mL (8.2 cP)之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之黏度類似於125 mg/mL (8.8 cP)的未結合之抗人類TNFα Ab1之黏度，指示將連接子-有效負載結合至例示性抗人類TNFα Ab1表面上的4個經工程改造之半胱胺酸並未負面地影響黏度。
實例 7b. 熱穩定性 ：將差示掃描熱量測定(Differential Scanning Calorimetry，DSC)用於評估實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物針對熱變性之穩定性。例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物在PBS，pH 7.2緩衝液；、乙酸鹽，pH 5及組胺酸，pH 6中之熔融起始點(T起始)及熱解鏈溫度(TM1、TM2及TM3)藉由資料擬合來獲得且列出於表14中。3種緩衝液組合物之熱分析圖描繪於圖5A、圖5B及圖5C中。各域之熱轉變經良好消退且表14中之結果顯示實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物具有良好熱穩定性。
實例 7c. 溫度應力下之聚集 ：在具有賦形劑之常用5 mM組胺酸pH 6.0緩衝液中在約100 mg/mL及50 mg/mL下評估實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物隨時間推移之溶液穩定性。樣品在5℃及35 ℃下培育28天之時段。在培育之後，使用尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography；SEC-HPLC)分析樣品之高分子量(%HMW)物種的百分比。表15中之結果顯示，實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物在5℃或35℃下在4-週時段內具有可接受之聚集概況。
實例 7d. 藥物動力學 ：發現實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物在食蟹獼猴中之PK概況具有可接受之可發展性概況。 表 14. 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之熱穩定性 ( ℃ )
緩衝液 T 起始 TM1 TM2 TM3
Ab1 GC 結合物 PBS, pH 7.2 57.3 61.9 75.5 84.7
乙酸鹽pH 5 52.7 57.0 75.4 84.0
組胺酸pH 6 54.7 59.1 75.5 84.1
表 15 ： 實例 1b 之例示性抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物之黏度及高濃度溫度保持穩定性
Ab1 GC 結合物
濃度 50 mg/mL 100 mg/mL
黏度(cP) 2 4.7
在5 ℃ 下培育4 週 之後的HMW% 0.04 0.2
在35 ℃ 下培育4 週 之後的HMW 變化% 1.4 2.9
實例 8. 實例 1b 、實例 1c 及實例 1d 之抗人類 TNF α Ab GC 結合物之活體內功能
實例 8a. 人類 TNFα 誘導之 CXCL1 細胞介素之活體內抑制 ：活體內評估實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα Ab1中和TNFα誘導之CXCL1。向C57/B6小鼠投與人類TNFα誘導小鼠血漿CXCL1含量之快速且短暫的增加。此允許對例示性抗人類TNFα Ab1及抗人類TNFα Ab1 GC結合物活體內之中和能力的探查。
簡言之，向C57/B6小鼠(N=8/組)皮下(SC)給與0.3 mg/kg或3 mg/kg的例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物或抗人類TNFα Ab1及3 mg/kg之非結合同型對照。在給藥後二十四小時，經由以每小鼠3 µg之劑量腹膜內注射人類TNFα來刺激小鼠。人類TNFα刺激後兩小時處死小鼠，收集血液且藉由離心使其澄清至血漿。根據製造商之說明書，使用商業MSD分析法(MesoScale Discovery, P/N. K152QTG-1)分析小鼠血漿之CXCL1濃度。
表16中之結果顯示相對於同型對照處理之小鼠，實例1b之例示性抗人類TNFα Ab1及抗人類TNFα Ab1 GC結合物顯著抑制活體內人類TNFα誘導之血漿CXCL1產生(p＜0.001，ANOVA接著杜凱氏多重比較檢驗)，分別在3 mg/kg下為約80.5%及81.6%，及在0.3 mg/kg下為約69.4%及58.9%。重要地是，在所測試之劑量下，抗人類TNFα Ab1 GC結合物與抗人類TNFα Ab1之間不存在顯著差異。此指示例示性抗人類TNFα Ab1活體內中和由人類TNFα誘導之生物效應且與GC之結合不影響此功能。 表 16 ： 實例 1b 之抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物活體內抑制人類 TNFα 誘導之 CXCL1 細胞介素產生
      血漿CXCL1 濃度
劑量mg/kg 平均值(pg/mL) ± SEM (pg/mL) 抑制% 相對於同型之 P 值
IgG1 同型對照 3 1058.70 170.84 0.0%   
Ab1 3 236.69 48.31 80.5% ＜0.0001
Ab1 0.3 350.57 82.52 69.4% 0.0001
Ab1 GC 結合物 3 226.14 37.48 81.6% ＜0.0001
Ab1 GC 結合物 0.3 457.12 89.21 58.9% 0.0013
正常的單向ANOVA 、杜凱氏測試、多重比較
實例 8b. 充分人源化小鼠模型之 IV 型 超敏反應中的活體內功效 ：使用接觸超敏反應之人源化小鼠模型測定實例1b及實例1c之抗人類TNFα Ab1 GC結合物及抗人類TNFα Ab1之活體內活性。
表現人類GM-CSF及人類IL-3以支持骨髓譜系發育之免疫缺乏NOG小鼠(huNOG-EXL，Taconic)在6週齡移植有自人類臍帶血分離之人類CD34+造血幹細胞。在幹細胞投與20至24週之後，評估小鼠之充分人類CD45移植(血液中＞25%)且經歷㗁唑酮誘導之接觸超敏反應方案。第0天，向根據體重分組之小鼠以1 mg/kg皮下(SC)給與實例1b之抗人類TNFα Ab1 GC結合物(n=7)、實例1c之TNFα Ab1 GC結合物(n=7)、抗人類TNFα Ab1 (n=7)、來自US2020338208之例示性抗人類TNFα Ab GC結合物(n=7)或對照人類IgG1抗體(n=7)。在第1天，用5%異氟醚使小鼠麻醉，對其腹部刮毛且將100 µL之含3%㗁唑酮之乙醇塗覆於刮毛區。在第7天再次以1 mg/kg SC向小鼠給藥，使其麻醉，且隨後在給藥後24小時用含2%㗁唑酮之乙醇在兩隻耳朵(10微升/側/耳)上刺激。每週重複劑量刺激範例；對於第2次刺激，測試劑之劑量增加至3 mg/kg且對於第3次刺激，增加至10 mg/kg。藉由使用Miltenyi Biotec電子測徑規在各刺激之前及之後24小時的耳朵厚度差異測定發炎性反應。各組之間的P值藉由單向ANOVA接著杜凱氏事後分析測試計算且在＜0.05 (GraphPad Prism)時視為顯著的。
表17及圖6A至圖6C中之結果顯示，相較於抗人類TNFα Ab1 (其僅在10 mg/kg第3次刺激劑量下減輕耳部腫脹)及來自US2020338208之例示性抗人類TNFα Ab GC結合物，實例1b及實例1c之抗人類TNFα Ab1 GC結合物在所有3次刺激(1、3及10 mg/kg)下的半抗原誘導之接觸超敏反應中誘發活體內發炎反應之明顯降低。此外，結果顯示抗人類TNFα Ab1與3或4個GC分子(DAR)之結合誘發類似功效。此等結果顯示，在人源化小鼠模型中，抗人類TNFα Ab1 GC結合物將糖皮質激素有效地遞送至發炎組織且糖皮質激素顯著消除與IV型超敏反應相關之生物效應，從而指示在人類個體中可誘發此反應。 表 17 ： 實例 1b 及實例 1c 之抗人類 TNFα Ab1 GC 結合物在 IV 型 超敏反應人源化小鼠模型中之活體內功效
   第1 次刺激 1 mg/kg 第2 次刺激 3 mg/kg 第3 次刺激 10 mg/kg
   Δ 耳朵厚度(mm) Δ 耳朵厚度(mm) Δ 耳朵厚度(mm)
   平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM
hIgG1 同型對照 0.058 0.005 0.107 0.014 0.145 0.021
Ab1 0.050 0.005 0.074 0.006 0.101* 0.004
Ab1 GC 結合物DAR 4 0.039* 0.003 0.052* 0.001 0.058* ^ 0.002
Ab1 GC 結合物DAR 3 0.036* 0.003 0.051* 0.007 0.069* 0.007
來自 US2020338208 之 例示性抗人類TNFα GC 結合物 0.050 0.003 0.063* 0.010 0.07* 0.002
* 相對於同型；ANOVA Tukey ，p＜0.05 ；^ 相對於Ab1 ；ANOVA Tukey ，p＜0.05
實例 8c. 人類 TNFα 基因轉殖小鼠多發性關節炎模型中之活體內功效 ：使用人類TNFα基因轉殖小鼠多發性關節炎模型(Taconic，#1006)評估實例1d之抗人類TNFα Ab2 GC結合物及抗人類TNFα Ab2之功效，作為在未經阿達木單抗治療之小鼠中之初步治療及經阿達木單抗治療之小鼠中之第二治療，其產生針對阿達木單抗之抗藥物抗體，且具有針對阿達木單抗之減弱或減輕反應，亦即阿達木單抗難治性小鼠。此小鼠模型經由CMV啟動子組成性地表現人類TNFα，其導致主要顯示於前爪及後爪中中之進行性關節發炎。用阿達木單抗治療減弱疾病惡化持續幾週；然而，由於中和抗藥物抗體之產生而使有益效應減弱。為消除阿達木單抗產生針對抗體之人類Fc部分之抗藥物抗體的潛力且因此影響實例1d之抗人類TNFα Ab2 GC結合物及抗人類TNFα Ab2之活性，產生作為嵌合物種之所有分子，其中抗體恆定域經小鼠IgG2a抗體之彼等恆定域置換。
在13週齡時，在所有小鼠之一或多個腳爪中展現中等發炎(評分4至9)後，將小鼠分為6個臨床評分匹配組，8隻小鼠/組。各組中之小鼠每週以3 mg/kg皮下(SC)給藥以下各者持續9週：mIgG2a同型對照、人類/小鼠嵌合抗人類TNFα Ab2 (在本文稱為「h/mAb2」)、人類/小鼠嵌合抗人類TNFα Ab2 GC結合物(在本文稱為「h/mAb2-GC」)、人類/小鼠嵌合阿達木單抗(在本文稱為「h/m-阿達木單抗」)，h/m-阿達木單抗持續2個劑量，接著切換為人類/小鼠嵌合阿達木單抗GC結合物(在本文稱為「h/m-阿達木單抗-GC」；製備有經工程改造之半胱胺酸且與GC-L結合，基本上如實例1b中所描述)持續研究之持續時間，且h/m-阿達木單抗持續2個劑量，接著切換為h/mAb2-GC持續研究之持續時間。各肢體之臨床評分之參數如下：0 = 無變形跡象；1 =輕微變形；2 = 中度變形；3 =嚴重變形/輕微腫脹；4 =嚴重變形/嚴重腫脹/功能缺失。每週兩次對小鼠進行評估且常規地稱重。在第10天收集血液以定量抗體暴露水準且測定抗藥物抗體產生之程度。在終止實驗後，用異氟醚使小鼠麻醉且收集血液及組織。
圖7中之結果顯示，h/mAb2-GC及h/mAb2在開始治療及持續9週治療之持續時間後完全停滯疾病惡化，如藉由相較於所有其他治療之臨床評分所量測。重要地是，此指示h/mAb2-GC及h/mAb2不產生顯著斷抗藥物抗體反應，使得其將中和及/或減弱結合物或抗體之功效。結果亦顯示，h/m-阿達木單抗能夠延遲疾病進展約2週；然而，截至9週治療的約第2週，與出現針對h/m-阿達木單抗之抗藥物抗體一致喪失功效。然而，重要地是，用h/m-阿達木單抗治療2週且隨後切換至用h/mAb2-GC治療的小鼠維持疾病惡化之顯著消除，而用h/m-阿達木單抗治療2週且隨後切換至用h/m-阿達木單抗-GC治療的小鼠顯示由僅h/m-阿達木單抗治療組反映的發炎性反應。此等結果指示抗人類TNFα Ab2 GC結合物與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。此等結果指示例示性抗人類TNFα Ab結合物之潛在用途，其係用於治療產生針對其他TNFα治療劑(諸如阿達木單抗)之抗藥物抗體且對該治療具有減弱之反應的個體。 序列表 Ab1 SEQ ID NO: 1 Ab1 、 Ab2 及 Ab6 之 HCDR1GYTFTGYYIH SEQ ID NO: 2 Ab1 、 Ab2 及 Ab6 之 HCDR2WINPYTGGTNYAQKFQG SEQ ID NO: 3 Ab1 之 HCDR3DLYGSSNYGGDV SEQ ID NO: 4 Ab1 及 Ab3 之 LCDR1QASQGISNYLN SEQ ID NO: 5 Ab1 、 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 、 Ab5 及 Ab6 之 LCDR2DASNLET SEQ ID NO: 6 Ab1 、 Ab3 及 Ab5 之 LCDR3QQYDKLPLT SEQ ID NO: 7 Ab1 之 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLYGSSNYGGDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 8 Ab1 及 Ab3 之 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDKLPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 9 Ab1 之 HCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLYGSSNYGGDVWGQGTTVTVSSASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDICVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 10 Ab1 及 Ab3 之 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDKLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 11 Ab1 之 HC 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之 HC DNACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTTACACCGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTCTATGGTTCGAGTAATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA SEQ ID NO: 21 Ab2 及 Ab4 之 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGGCATTCGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAACCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Ab3 SEQ ID NO: 22 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR1GYTFTGYYMH SEQ ID NO: 23 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR2WINPYTGGTKYAQKFQG SEQ ID NO: 13 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR3DLYGSSNYGMDV SEQ ID NO: 4 Ab1 及 Ab3 之 LCDR1QASQGISNYLN SEQ ID NO: 5 Ab1 、 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 、 Ab5 及 Ab6 之 LCDR2DASNLET SEQ ID NO: 6 Ab1 、 Ab3 及 Ab5 之 LCDR3QQYDKLPLT SEQ ID NO: 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DNACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTTACACCGGTGGCACAAAGTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTCTATGGTTCGAGTAATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA 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DNACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTTACACCGGTGGCACAAAGTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTCTATGGTTCGAGTAATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA SEQ ID NO: 21 Ab2 及 Ab4 之 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGGCATTCGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAACCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Ab5 SEQ ID NO: 22 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR1GYTFTGYYMH SEQ ID NO: 23 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR2WINPYTGGTKYAQKFQG SEQ ID NO: 13 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCDR3DLYGSSNYGMDV SEQ ID NO: 14 Ab2 、 Ab4 及 Ab5 之 LCDR1QASQGIRNYLN SEQ ID NO: 5 Ab1 、 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 、 Ab5 及 Ab6 之 LCDR2DASNLET SEQ ID NO: 6 Ab1 、 Ab3 及 Ab5 之 LCDR3QQYDKLPLT SEQ ID NO: 24 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLYGSSNYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 27 Ab5 之 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDKLPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 25 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLYGSSNYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPCVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDICVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 28 Ab5 之 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDKLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 26 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 之 HC DNACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTTACACCGGTGGCACAAAGTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTCTATGGTTCGAGTAATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCTGCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA SEQ ID NO: 29 Ab5 之 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGGCATTCGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAAGCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC Ab6 SEQ ID NO: 1 Ab1 、 Ab2 及 Ab6 之 HCDR1GYTFTGYYIH SEQ ID NO: 2 Ab1 、 Ab2 及 Ab6 之 HCDR2WINPYTGGTNYAQKFQG SEQ ID NO: 30 Ab6 之 HCDR3DIYGSSNYGGDV SEQ ID NO: 31 Ab6 之 LCDR1QASQDISNYLN SEQ ID NO: 5 Ab1 、 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 、 Ab5 及 Ab6 之 LCDR2DASNLET SEQ ID NO: 32 Ab6 之 LCDR3QQYDTLPLT SEQ ID NO: 33 Ab6 之 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDIYGSSNYGGDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 34 Ab6 之 VLDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDTLPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 35 Ab6 之 HCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDIYGSSNYGGDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 36 Ab6 之 LCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDTLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 37 Ab6 之 HC DNACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTTACACCGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATATCTATGGTTCGAGTAATTACGGTGGCGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAAGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGCAAA SEQ ID NO: 38 Ab6 之 LC DNAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATACCCTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC SEQ ID NO: 39 人類 TNF α 蛋白MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL SEQ ID NO: 40 恆河獼猴 TNF α 蛋白MSTESMIRDVELAEEALPRKTAGPQGSRRCWFLSLFSFLLVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPKDPSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELTDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSNHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINLPDYLDFAESGQVYFGIIAL SEQ ID NO: 41 犬 TNF α 蛋白MSTESMIRDVELAEEPLPKKAGGPPGSRRCFCLSLFSFLLVAGATTLFCLLHFGVIGPQREELPNGLQLISPLAQTVKSSSRTPSDKPVAHVVANPEAEGQLQWLSRRANALLANGVELTDNQLIVPSDGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRFAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGTEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINLPNYLDFAESGQVYFGIIAL SEQ ID NO: 42 食蟹獼猴 TNF α 蛋白MSTESMIQDVELAEEALPRKTAGPQGSRRCWFLSLFSFLLVAGAATLFCLLHFGVIGPQREEFPKDPSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALVANGVELTDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSNHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINLPDYLDFAESGQVYFGIIAL SEQ ID NO: 43 LCDR1 共通序列QASQGIXaa 7NYLN 其中Xaa7為絲胺酸或精胺酸 SEQ ID NO: 44 LCDR3 共通序列QQYDXaa 5LPLT 其中Xaa5為天冬醯胺或離胺酸 SEQ ID NO: 45 人類 TNFR1MGLSTVPDLLLPLVLLELLVGIYPSGVIGLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTTVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR SEQ ID NO: 46 人類 TNFR2MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS
圖 1展示例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之活體外ADCC活性。 圖 2展示例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物之活體外CDC活性。 圖 3展示例示性抗人類TNFα抗體Ab6與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有顯著弱結合，該等抗藥物抗體形成於用阿達木單抗高免疫之食蟹獼猴中。 圖 4展示例示性抗人類TNFα抗體Ab6與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有顯著弱結合，該等抗藥物抗體形成於用阿達木單抗治療之人類患者中。 圖 5A 至圖 5C展示PBS，pH 7.2 (5A)；乙酸鹽，pH 5 (5B)及組胺酸，pH 6 (5C)中之例示性抗人類TNFα Ab1 GC結合物的DSC熱分析圖。 圖 6A 至圖 6C展示在1 mg/kg (6A)、3 mg/kg (6B)及10 mg/kg (6C)下之人源化小鼠接觸超敏反應模型中，抗人類TNFα Ab1 GC結合物、抗人類TNFα Ab1及例示性抗人類TNFα抗體結合物之功效比較。 圖 7展示人類TNFα基因轉殖小鼠多發性關節炎模型中之抗人類TNFα Ab2 GC結合物使疾病惡化停滯，如藉由在未經阿達木單抗處理及經阿達木單抗處理之小鼠中之臨床評分所量測，從而展示抗人類TNFα Ab2 GC結合物並未產生顯著對抗藥物抗體反應，且與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。
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Claims (57)

  1. 一種結合物，其具有下式： 其中Ab為結合人類TNFα之抗體，其中Ab包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1或22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2或23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3、13或30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4、14、31或43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6、15、32或44； 其中 為： ， 或 ， 且n為1至5。
  2. 如請求項1之結合物，其中 為： ， 或 。
  3. 如請求項1之結合物，其中 為 ， 或 。
  4. 如請求項1之結合物，其中 為： ， 或 。
  5. 如請求項1之結合物，其中 為： ， 或 。
  6. 如請求項1之結合物，其中 為： 。
  7. 如請求項1之結合物，其中 為： 。
  8. 如請求項1之結合物，其中 為： 。
  9. 如請求項1之結合物，其中 為： 。
  10. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 3； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  11. 如請求項10之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 7且該VL包含SEQ ID NO: 8。
  12. 如請求項10至11中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 9且該LC包含SEQ ID NO: 10。
  13. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 14； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 15。
  14. 如請求項13之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 16且該VL包含SEQ ID NO: 17。
  15. 如請求項13至14中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 18且該LC包含SEQ ID NO: 19。
  16. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 4； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  17. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 14； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 15。
  18. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 14； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  19. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 43； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 6。
  20. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 22； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 23； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 13； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 14； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 44。
  21. 如請求項16至20之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 24且該VL包含SEQ ID NO: 8、17或27。
  22. 如請求項16至21中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 25且該LC包含SEQ ID NO: 10、19或28。
  23. 如請求項1至9中任一項之結合物，其中該結合人類TNFα之抗體包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO: 1； 該HCDR2包含SEQ ID NO: 2； 該HCDR3包含SEQ ID NO: 30； 該LCDR1包含SEQ ID NO: 31； 該LCDR2包含SEQ ID NO: 5；及 該LCDR3包含SEQ ID NO: 32。
  24. 如請求項23之結合物，其中該VH包含SEQ ID NO: 33且該VL包含SEQ ID NO: 34。
  25. 如請求項23至24中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC包含SEQ ID NO: 35且該LC包含SEQ ID NO: 36。
  26. 如請求項1至11、13至14、16至21、23至24中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含： 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸； 胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸；或 胺基酸殘基124 (EU編號)處之半胱胺酸及胺基酸殘基378 (EU編號)處之半胱胺酸。
  27. 如請求項1至11、13至14、16至21、23至24中任一項之結合物，其中該抗體包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，其中該HC為人類IgG1同型。
  28. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為2至5。
  29. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為3至5。
  30. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為3至4。
  31. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為約4。
  32. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為約3。
  33. 如請求項1至27中任一項之結合物，其中n為約2。
  34. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至33中任一項之結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  35. 一種治療有需要個體之自體免疫疾病或發炎性疾病之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1至33中任一項之結合物，或如請求項34之醫藥組合物。
  36. 如請求項35之方法，其中該自體免疫疾病或該發炎性疾病係選自類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis；RA)、幼年特發性關節炎(Juvenile Idiopathic Arthritis)、牛皮癬性關節炎(Psoriatic Arthritis；PsA)、僵直性脊椎炎(Ankylosing Spondylitis；AS)、克羅恩氏病(Crohn's Disease；CD)、潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis；UC)、斑塊型牛皮癬(Plaque Psoriasis；PS)、化膿性汗腺炎(Hidradenitis Suppurativa；HS)、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***(Behcet's Disease)或風濕性多肌痛(Polymyalgia Rheumatica；PMR)。
  37. 如請求項35之方法，其中投與該有效量之該結合物的該個體接受其他抗TNFα治療劑之先前治療，且其中該個體產生針對該其他抗TNFα治療劑之抗藥物抗體。
  38. 如請求項37之方法，其中該其他抗TNFα治療劑係選自阿達木單抗(Adalimumab)、英夫利昔單抗(Infliximab)、戈利木單抗(Golimumab)、賽妥珠單抗(Certolizumab)及依那西普(Etanercept)或其結合物。
  39. 如請求項38之方法，其中該結合物與針對阿達木單抗之抗藥物抗體具有低交叉反應至無交叉反應。
  40. 如請求項1至33中任一項之結合物或如請求項34之醫藥組合物，其用於療法中。
  41. 如請求項1至33中任一項之結合物或如請求項34之醫藥組合物，其用於治療自體免疫疾病或發炎性疾病。
  42. 如請求項41之供使用之結合物或醫藥組合物，其中該自體免疫疾病或該發炎性疾病係選自類風濕性關節炎(RA)、幼年特發性關節炎、牛皮癬性關節炎(PsA)、僵直性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬(PS)、化膿性汗腺炎、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***或風濕性多肌痛(PMR)。
  43. 一種如請求項1至33中任一項之結合物或如請求項34之醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療自體免疫疾病或發炎性疾病之藥劑。
  44. 如請求項43之用途，其中該自體免疫疾病或該發炎性疾病係選自類風濕性關節炎(RA)、幼年特發性關節炎、牛皮癬性關節炎(PsA)、僵直性脊椎炎(AS)、克羅恩氏病(CD)、潰瘍性結腸炎、斑塊型牛皮癬(PS)、化膿性汗腺炎、葡萄膜炎、非感染性中間葡萄膜炎、非感染性後葡萄膜炎、非感染性全葡萄膜炎、***或風濕性多肌痛(PMR)。
  45. 如請求項1至33中任一項之結合物，其中該抗體中和人類TNFα。
  46. 如請求項1至33中任一項之結合物，其中該抗體為內化抗體。
  47. 一種化合物，其具有下式： 。
  48. 如請求項47之化合物，其為： 。
  49. 如請求項47之化合物，其為： 。
  50. 如請求項48之化合物，其為： 。
  51. 如請求項49之化合物，其為： 。
  52. 一種化合物，其具有下式： 。
  53. 如請求項52之化合物，其中該結合物為： 。
  54. 一種產生結合物之方法，該方法包含使如請求項47之化合物與抗人類TNFα抗體接觸。
  55. 如請求項54之方法，其中該結合物包含如請求項1至33中任一項之結合物。
  56. 如請求項54之方法，其中該結合物遵循包含以下之步驟產生： (a)    用還原劑還原抗人類TNFα抗體，其中該抗人類TNFα抗體包含一或多種經工程改造之半胱胺酸殘基； (b)    用氧化劑氧化該抗人類TNFα抗體；及 (c)    使下式之化合物 與該抗人類TNFα抗體接觸以產生該結合物。
  57. 如請求項56之方法，其中該還原劑為二硫蘇糖醇且該氧化劑為去氫抗壞血酸。
TW112117699A 2022-05-13 2023-05-12 人類腫瘤壞死因子α抗體糖皮質激素結合物 TW202412852A (zh)

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