TW202408567A - 用於核酸疫苗之訊息序列 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一種核酸(例如，信使RNA)疫苗，其編碼至少一種抗原性原核多肽，所述抗原性原核多肽與病毒分泌訊息肽和跨膜結構域中的一個或兩個連接。還提供了用本文所述的核酸針對原核生物感染進行疫苗接種的方法。

Description

用於核酸疫苗之訊息序列
本文提供了一種核酸(例如，信使RNA)疫苗，其編碼至少一種抗原性原核多肽，所述抗原性原核多肽與病毒分泌訊息肽和跨膜結構域中的一個或兩個連接。還提供了用本文所述的核酸針對原核生物感染進行疫苗接種的方法。
原核生物感染(例如，細菌感染)代表了全球人類健康的重大威脅。估計每年有5百萬人死於抗生素耐藥性細菌感染，醫療系統的負擔隨之增加(Antimicrobial Resistance Collaborators. The Lancet. 399(10325): 629-655. 2022)。儘管存在針對原核生物感染的疫苗，但與更常見的抗病毒疫苗相比，它們在數量上更少。
基於核酸的疫苗，且更特別是mRNA疫苗，最近已成為具有快速、安全且成本有效的生產工藝的另外的疫苗類型，特別是針對病毒病原體。針對嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2(SARS CoV-2)的mRNA疫苗主要使用刺突病毒蛋白作為抗原。通常與遞送媒劑(諸如脂質奈米顆粒(LNP))組合，COVID-19 mRNA疫苗可以實現高功效。儘管如此，仍然需要更有效的針對原核生物感染的基於RNA的疫苗。
產生包含原核抗原(即，來源於原核細胞中的抗原的抗原)的基於核酸的疫苗(諸如基於RNA(例如，mRNA)的疫苗)存在挑戰，因為原核抗原不是由真核細胞天然表現的。特定地，原核細胞和真核細胞具有不同的分泌系統。在沒有適當工程化的情況下，這些疫苗中使用的原核抗原將在真核(例如，人)細胞的細胞內區室中積累，這可能降低這些疫苗的免疫原性。
本發明旨在通過改進通過基於核酸(例如，mRNA)的疫苗表現的原核抗原的免疫原性來解決這個問題。如本文所述，這通過添加分泌訊息以允許原核抗原在細胞外區室中分泌和/或添加跨膜結構域以允許在細胞表面處表現來實現。通過這樣做，免疫細胞可以更好地接近抗原，最終改進基於核酸(例如，mRNA)的疫苗的免疫原性。
本揭露提供了一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
於某些實施例，所述ORF進一步包含編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽來源於能夠感染人的病毒中的病毒序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽來源於選自以下的病毒序列：流感病毒分泌訊息肽序列，以及選自以下的非流感病毒分泌訊息肽序列：SARS CoV-2分泌訊息肽序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)分泌訊息肽序列、麻疹病毒分泌訊息肽序列、風疹病毒分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒分泌訊息肽序列、伊波拉病毒分泌訊息肽序列、天花病毒分泌訊息肽序列、和狂犬病病毒分泌訊息肽序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽選自：流感病毒血凝素(HA)分泌訊息肽序列、SARS CoV-2刺突分泌訊息肽序列、VZV gB分泌訊息肽序列、VZV gE分泌訊息肽序列、VZV gI分泌訊息肽序列、VZV gK分泌訊息肽序列、麻疹病毒F蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E1蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E2蛋白分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白分泌訊息肽序列、伊波拉病毒GP蛋白分泌訊息肽序列、天花病毒6kDa IC蛋白分泌訊息肽序列和狂犬病病毒G蛋白分泌訊息肽序列，優選地其中所述病毒分泌訊息肽包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA分泌訊息肽序列。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1X 2LX 3VX 4LX 5TFX 6X 7X 8X 9A(SEQ ID NO: 145)，其中X 1選自A和V；X 2選自I和K；X 3選自V和L；X 4選自L和M；X 5選自Y和C；X 6選自T和A；X 7選自T和A；X 8選自A和T；並且X 9選自N和Y。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 95-109的胺基酸序列。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1IIALSX 2ILCLVFX 3(SEQ ID NO: 146)，其中X 1選自T和A；X 2選自Y、N、C和H；並且X 3選自T和A。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 110-131的胺基酸序列。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKAIIVLLMVVTSX 1A(SEQ ID NO: 147)，其中X 1選自S和N。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MX 1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)，其中X 1選自K和E。
於某些實施例，所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 132-144的胺基酸序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽包含選自以下的胺基酸序列：MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)；MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO: 2)；MKTIIALSYILCLVFA(SEQ ID NO: 3)；MKAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 4)；MFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 5)；MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 6)；MSPCGYYSKWRNRDRPEYRRNLRFRRFFSSIHPNAAAGSGFNGPGVFITSVTGVWLCFLCIFSMFVTAVVS(SEQ ID NO: 7)；MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRA(SEQ ID NO: 8)；MFLIQCLISAVIFYIQVTNA(SEQ ID NO: 9)；MQALGIKTEHFIIMCLLSGHA(SEQ ID NO: 10)；MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTG(SEQ ID NO: 11)；MGAAAALTAVVLQGYNPPAYG(SEQ ID NO: 12)；MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA(SEQ ID NO: 13)；MKVFLVTCLGFAVFSSSVC(SEQ ID NO: 14)；MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS(SEQ ID NO: 15)；MRSLIIFLLFPSIIYS(SEQ ID NO: 16)；以及MVPQALLFVPLLVFPLCFG(SEQ ID NO: 184)。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽包含MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的N末端。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的C末端。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
於某些實施例，所述TMB：(a) 包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b) 包含至少50%的疏水性胺基酸殘基，所述疏水性胺基酸殘基優選選自：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c) 包含至少一個α螺旋。
於某些實施例，所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿(bitopic)膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
於某些實施例，所述TMB來源於非人類序列。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於原核跨膜蛋白，並且其中所述TMB是所述原核跨膜蛋白的TMB。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽不是來源於原核跨膜蛋白。
於某些實施例，所述TMB來源於病毒序列。
於某些實施例，所述TMB來源於選自以下的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
於某些實施例，所述TMB選自：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
於某些實施例，所述TMB包含選自以下的胺基酸序列：ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)；ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)；ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)；STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)；WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)；FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)；AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)；IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)；YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)；IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)；LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)；WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)；IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)；WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
於某些實施例，所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
於某些實施例，所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
於某些實施例，所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
於某些實施例，所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
在另一方面，本揭露提供了一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性多肽、優選抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列，其中所述TMB與所述抗原性多肽是異源的，
其中任選地，所述ORF進一步包含編碼至少一種分泌訊息肽、優選病毒分泌訊息肽、更優選如前述請求項中任一項所述的病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
在另一方面，本揭露提供了一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
於某些實施例，所述TMB：(a) 包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b) 包含至少50%的疏水性胺基酸殘基，所述疏水性胺基酸殘基優選選自：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c) 包含至少一個α螺旋。
於某些實施例，所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
於某些實施例，所述TMB來源於非人類序列。
於某些實施例，所述抗原性多肽不是來源於跨膜蛋白。
於某些實施例，所述TMB來源於病毒序列。
於某些實施例，所述TMB來源於選自以下的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
於某些實施例，所述TMB選自：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
於某些實施例，所述TMB包含選自以下的胺基酸序列：ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)；ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)；ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)；STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)；WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)；FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)；AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)；IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)；YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)；IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)；LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)；WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)；IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)；WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
於某些實施例，所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
於某些實施例，所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
於某些實施例，所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
於某些實施例，所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於選自以下的屬的細菌：醋桿菌屬( Acetobacter)、不動桿菌屬( Acinetobacter)、放線菌屬( Actinomyces)、氣球菌屬( Aerococcus)、土壤桿菌屬( Agrobacterium)、無形體屬( Anaplasma)、固氮根瘤菌屬( Azorhizobia)、固氮菌屬( Azotobacter)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、擬桿菌屬( Bacteroides)、巴爾通體屬( Bartonella)、鮑特菌屬( Bordetella)、疏螺旋體屬( Borrelia)、布魯氏菌屬( Brucella)、伯克霍爾德菌屬( Burkkolderia)、鞘桿菌屬( Calymmatobacterium)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、衣原體屬( Chlamydia)、嗜衣原體屬( Chlamydophila)、梭菌屬( Clostridium)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、柯克斯體屬( Coxiella)、丙酸桿菌屬( Cutibacterium)、埃立克體屬( Ehrlichia)、腸桿菌屬( Enterobacter)、腸球菌屬( Enterococcus)、埃希菌屬( Escherichia)、弗朗西絲菌屬( Francisella)、梭形桿菌屬( Fusobacterium)、加德納菌屬( Gardnerella)、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、螺桿菌屬( Helicobacter)、克雷伯菌屬( Klebsiella)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、軍團菌屬( Legionella)、李斯特菌屬( Listeria)、甲烷桿菌屬( Methanobacterium)、微桿菌屬( Microbacterium)、微球菌屬( Micrococcus)、莫拉菌屬( Moraxella)、分枝桿菌屬( Mycobacterium)、支原體屬( Mycoplasma)、奈瑟菌屬( Neisseria)、巴斯德菌屬( Pasteurella)、片球菌屬( Pediococcus)、消化鏈球菌屬( Peptostreptococcus)、卟啉單胞菌屬( Porphyromonas)、普雷沃菌屬( Prevotella)、丙酸桿菌屬( Propionibacterium)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、根瘤菌屬( Rhizobium)、立克次體屬( Rickettsia)、羅卡利馬體屬( Rochalimaea)、羅思氏菌屬( Rothia)、沙門菌屬( Salmonella)、沙雷菌屬( Serratia)、志賀菌屬( Shigella)、八疊球菌屬( Sarcina)、螺菌屬( Spirillum)、螺旋體屬( Spirochaetes)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、寡養單胞菌屬( Stenotrophomonas)、鏈桿菌屬( Streptobacillus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、四聯球菌屬( Tetragenococcus)、密螺旋體屬( Treponema)、弧菌屬( Vibrio)、 Viridans、沃爾巴克氏體屬( Walbachia)和耶爾森菌屬( Yersinia)，優選來自選自以下的物種的細菌：橙黃色醋桿菌( Acetobacter aurantius)、鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、以色列放線菌( Actinomyces israelii)、放射形土壤桿菌( Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤桿菌( Agrobacterium tumefaciens)、嗜吞噬細胞無形體( Anaplasma phagocytophilum)、莖瘤固氮根瘤菌( Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌( Azotobacter vinelandii)、炭疽芽孢桿菌( Bacillus anthracis)、短小芽孢桿菌( Bacillus brevis)、蠟狀芽孢桿菌( Bacillus cereus)、紡錘芽孢桿菌( Bacillus fusiformis)、地衣芽孢桿菌( Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌( Bacillus megaterium)、蕈狀芽孢桿菌( Bacillus mycoides)、嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、蘇雲金芽孢桿菌( Bacillus Thuringiensis)、脆弱擬桿菌( Bacteroides fragilis)、牙齦擬桿菌( Bacteroides gingivalis)、產黑色素擬桿菌( Bacteroides melaninogenicus)、漢賽巴爾通體( Bartonella henselae)、五日熱巴爾通體( Bartonella Quintana)、支氣管敗血鮑特菌( Bordetella bronchiseptica)、百日咳鮑特菌( Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋體( Borrelia burgdorferi)、流產布魯氏菌( Brucella abortus)、馬爾他布魯氏菌( Brucella melitensis)、豬種布魯氏菌( Brucella suis)、鼻疽伯克霍爾德菌( Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克霍爾德菌( Burkholderia pseudomallei)、洋蔥伯克霍爾德菌( Burkholderia cepacia)、肉芽腫鞘桿菌( Calymmatobacterium granulomatis)、大腸彎曲桿菌( Campylobacter coli)、胎兒彎曲桿菌( Campylobacter fetus)、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)、幽門彎曲桿菌( Campylobacter pylori)、沙眼衣原體( Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體( Chlamydophila pneumoniae)、鸚鵡嗜熱衣原體( Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌( Clostridium botulinum)、艱難梭菌( Clostridium difficile)、產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)、破傷風梭菌( Clostridium tetani)、白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒狀桿菌( Corynebacterium fusiforme)、貝納柯克斯體( Coxiella burnetii)、痤瘡丙酸桿菌( Cutibacterium acnes)、貪婪丙酸桿菌( Cutibacterium avidum)、顆粒丙酸桿菌( Cutibacterium granulosum)、納姆丙酸桿菌( Cutibacterium namnetense)、胡莫丙酸桿菌( Cutibacterium humerusii)、查菲埃立克體( Ehrlichia chaffeensis)、陰溝腸桿菌( Enterobacter cloacae)、鳥腸球菌( Enterococcus avium)、耐久腸球菌( Enterococcus durans)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、鶉雞腸球菌( Enterococcus galllinarum)、馬婁腸球菌( Enterococcus maloratus)、大腸桿菌( Escherichia coli)、土拉熱弗朗西絲菌( Francisella tularensis)、具核梭形桿菌( Fusobacterium nucleatum)、***加德納菌( Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血桿菌( Haemophilus ducreyi)、流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)、副流感嗜血桿菌( Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血桿菌( Haemophilus pertussis)、***嗜血桿菌( Haemophilus vaginalis)、幽門螺桿菌( Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus)、保加利亞乳桿菌( Lactobacillus bulgaricus)、乾酪乳桿菌( Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)、嗜肺軍團菌( Legionella pneumophila)、單核細胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes)、外部甲烷桿菌( Methanobacterium extroquens)、多形微桿菌( Microbacterium multiforme)、藤黃微球菌( Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌( Moraxella catarrhalis)、鳥分枝桿菌( Mycobacterium avium)、牛分枝桿菌( Mycobacterium bovis)、白喉分枝桿菌( Mycobacterium diphtheriae)、胞內分枝桿菌( Mycobacterium intracellulare)、麻風分枝桿菌( Mycobacterium leprae)、鼠麻風分枝桿菌( Mycobacterium lepraemurium)、草分枝桿菌( Mycobacterium phlei)、恥垢分枝桿菌( Mycobacterium smegmatis)、結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、發酵支原體( Mycoplasma fermentans)、生殖支原體( Mycoplasma genitalium)、人型支原體( Mycoplasma hominis)、穿透支原體( Mycoplasma penetrans)、肺炎支原體( Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌( Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌( Neisseria meningitidis)、多殺巴斯德菌( Pasteurella multocida)、土拉巴斯德菌( Pasteurella tularensis)、消化鏈球菌( Peptostreptococcus)、牙齦卟啉單胞菌( Porphyromonas gingivalis)、產黑色素普雷沃菌( Prevotella melaninogenica)、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)、放射形根瘤菌( Rhizobium radiobacter)、普氏立克次體( Rickettsia prowazekii)、鸚鵡熱立克次體( Rickettsia psittaci)、五日熱立克次體( Rickettsia quintana)、立氏立克次體( Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次體( Rickettsia trachomae)、漢賽羅卡利馬體( Rochalimaea henselae)、五日熱羅卡利馬體( Rochalimaea quintana)、齲齒羅思氏菌( Rothia dentocariosa)、腸炎沙門菌( Salmonella enteritidis)、傷寒沙門菌( Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌( Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌( Serratia marcescens)、痢疾志賀菌( Shigella dysenteriae)、迂回螺菌( Spirillum volutans)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)、嗜麥芽寡養單胞菌( Stenotrophomonas maltophilia)、無乳鏈球菌( Streptococcus agalactiae)、鳥鏈球菌( Streptococcus avium)、牛鏈球菌( Streptococcus bovis)、倉鼠鏈球菌( Streptococcus cricetus)、屎鏈球菌( Streptococcus faceium)、糞鏈球菌( Streptococcus faecalis)、野鼠鏈球菌( Streptococcus ferus)、雞鏈球菌( Streptococcus gallinarum)、乳酸鏈球菌( Streptococcus lactis)、輕型鏈球菌( Streptococcus mitior)、緩症鏈球菌( Streptococcus mitis)、變異鏈球菌( Streptococcus mutans)、口腔鏈球菌( Streptococcus oralis)、肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae)、化膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、大鼠鏈球菌( Streptococcus rattus)、唾液鏈球菌( Streptococcus salivarius)、血鏈球菌( Streptococcus sanguis)、遠緣鏈球菌( Streptococcus sobrinus)、梅毒密螺旋體( Treponema pallidum)、齒垢密螺旋體( Treponema denticola)、霍亂弧菌( Vibrio cholerae)、逗號弧菌( Vibrio comma)、副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)、創傷弧菌( Vibrio vulnificus)、草綠色鏈球菌( Viridans streptococci)、沃爾巴克氏體( Wolbachia)、小腸結腸炎耶爾森菌( Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森菌( Yersinia pestis)和假結核耶爾森菌( Yersinia pseudotuberculosis) 。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於疏螺旋體屬的細菌，優選選自以下物種：伯氏疏螺旋體( B. burgdorferi)、埃氏疏螺旋體( afzelii)、伽氏疏螺旋體( garinii)、巴伐利亞疏螺旋體( bavariensis)、馬約氏疏螺旋體( mayonii)、斯柏曼疏螺旋體( spielmanii)、葡萄牙疏螺旋體( lusitaniae)、比塞蒂疏螺旋體( bissetii)和/或法雷斯疏螺旋體( valaisiana)。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽是OspA或其片段或變體，其中所述OspA或其片段或變體包含至少5個胺基酸，優選地其中所述抗原性原核多肽包含：(a) 來源於OspA ST1的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK(SEQ ID NO: 31)；(b) 來源於OspA ST2的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO: 32)；(c) 來源於OspA ST3的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK(SEQ ID NO: 186)；(d) 來源於OspA ST4的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO: 187)；(e) 來源於OspA ST5的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGKAVEITTLEKLKDALK(SEQ ID NO: 188)；(f) 來源於OspA ST6的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK(SEQ ID NO: 189)；(g) 來源於OspA ST7的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK(SEQ ID NO: 190)；(h) (a)-(g) 的任何組合；(i) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列和根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列；或 (j) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列、根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列、根據 (c) 的來源於OspA ST3的序列、根據 (d) 的來源於OspA ST4的序列、根據 (e) 的來源於OspA ST5的序列、根據 (f) 的來源於OspA ST6的序列和根據 (g) 的來源於OspA ST7的序列。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽包含至少一個突變的醣基化位點，優選至少一個突變的N-連接的醣基化位點。
於某些實施例，所述核酸的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
於某些實施例，所述ORF的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
於某些實施例，編碼所述至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
於某些實施例，編碼所述至少一種TMB的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
於某些實施例，所述核酸是DNA。
於某些實施例，所述核酸是信使RNA(mRNA)，其中特定地，所述mRNA可以是非複製mRNA、自我複製mRNA或反式複製mRNA。
於某些實施例，所述mRNA包含至少一個5'非轉譯區(5' UTR)、至少一個3'非轉譯區(3' UTR)和/或至少一個多腺苷酸化(聚(A))序列。
於某些實施例，所述mRNA包含至少一個化學修飾。
於某些實施例，所述mRNA中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
於某些實施例，所述ORF中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
於某些實施例，所述化學修飾選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、和2'-O-甲基尿苷。
於某些實施例，所述化學修飾選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷、及其組合。
於某些實施例，所述化學修飾是N1-甲基假尿苷。
在一個方面，本揭露提供了一種組合物，所述組合物包含至少一種上述核酸。
於某些實施例，所述組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。於某些實施例，所述核酸被包封在所述LNP中。
於某些實施例，所述LNP包含至少一種陽離子脂質。於某些實施例，所述陽離子脂質是可生物降解的。於某些實施例，所述陽離子脂質不是可生物降解的。於某些實施例，所述陽離子脂質是可切割的。於某些實施例，所述陽離子脂質不是可切割的。於某些實施例，所述陽離子脂質選自OF-02、cKK-E10、OF-Deg-Lin、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、SM-102和ALC-0315。
於某些實施例，所述LNP進一步包含聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質、基於膽固醇的脂質和輔助脂質。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為35%至55%的陽離子脂質；- 莫耳比為0.25%至2.75%的聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質；- 莫耳比為20%至45%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為5%至35%的輔助脂質，其中所有莫耳比均是相對於所述LNP的總脂質含量。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為40%的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%的PEG化的脂質；- 莫耳比為28.5%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為30%的輔助脂質。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為45%至50%的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%至1.7%的PEG化的脂質；- 莫耳比為38%至43%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為9%至10%的輔助脂質。
於某些實施例，所述PEG化的脂質是二肉豆蔻醯基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
於某些實施例，所述基於膽固醇的脂質是膽固醇。
於某些實施例，所述輔助脂質是1,2-二油醯基-SN-甘油-3-磷醯乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為40%的選自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；- 莫耳比為28.5%的膽固醇；以及- 莫耳比為30%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為50%的SM-102；- 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；- 莫耳比為38.5%的膽固醇；以及- 莫耳比為10%的DSPC。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為46.3%的ALC-0315；- 莫耳比為1.6%的ALC-0159；- 莫耳比為42.7%的膽固醇；以及- 莫耳比為9.4%的DSPC。
於某些實施例，所述LNP包含：- 莫耳比為47.4%的ALC-0315；- 莫耳比為1.7%的ALC-0159；- 莫耳比為40.9%的膽固醇；以及- 莫耳比為10%的DSPC。
於某些實施例，所述LNP的平均直徑為30 nm至200 nm。
於某些實施例，所述LNP的平均直徑為80 nm至150 nm。
於某些實施例，所述組合物包含在1 mg/mL至10 mg/mL之間的所述LNP。
於某些實施例，所述LNP包含在1個與20個之間的核酸分子、優選mRNA分子。
於某些實施例，所述組合物經配製用於肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
於某些實施例，所述組合物包含磷酸鹽緩衝鹽水。
於某些實施例，所述組合物是醫藥組合物，例如免疫原性組合物或疫苗，特別是mRNA疫苗。
在另一方面，本揭露提供了一種用於在有需要的受試者中引發免疫反應的核酸或組合物。
在另一方面，本揭露提供了一種用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染的核酸或組合物。
在另一方面，本揭露提供了一種在宿主細胞中分泌抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予上述核酸或組合物。
在另一方面，本揭露提供了一種在宿主細胞的表面上展示抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予上述核酸或組合物。
在另一方面，本揭露提供了一種套組，所述套組包含容器，所述容器包含單次使用或多次使用劑量的上述核酸或組合物，任選地其中所述容器是小瓶或者預填充的注射筒或注射器。
本申請涉及2022年5月6日提交的歐洲優先權申請號22305680.5、2022年8月16日提交的歐洲優先權申請號22306227.4以及2023年3月2日提交的美國申請號63/449,573，將其各自的內容通過引用併入本文。
本揭露尤其涉及編碼與病毒分泌訊息肽序列和跨膜結構域(TMB)中的一個或兩個連接的抗原性原核多肽的核酸(例如，mRNA)組合物，以及用所述組合物進行疫苗接種的方法。 I. 定義
除非本文另外定義，否則結合本揭露所用的科學和技術術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下文描述了例示性方法和材料，但在本揭露的實踐或測試中也可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料。在矛盾的情況下，將以包括定義在內的本說明書為准。通常，本文所述的結合細胞和組織培養、分子生物學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、合成有機化學、醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸化學和雜交使用的命名法以及其技術是本領域熟知且常用的那些。根據製造商的說明書如本領域通常所實現的或如本文所述的那樣進行酶促反應和純化技術。進一步地，除非上下文另有要求，否則單數術語應當包括複數，並且複數術語應當包括單數。於整個本說明書和實施例，詞語“具有(have)”和“包含(comprise)”或變型如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應被理解為暗示包括所陳述的整數或整數組，但是不排除任何其他整數或整數組。將本文提及的所有出版物和其他參考文獻都通過引用以其整體併入。儘管本文引用了許多文檔，但是此引用並不意味著承認這些文檔中的任一個形成本領域的一般常識的一部分。
應注意，術語“一個/一種(a)”或“一個/一種(an)”實體是指一個/一種或多個/多種所述實體：例如，“一個核苷酸序列”應理解為代表一個或多個核苷酸序列。因此，術語“一個/一種(a)”(或“一個/一種(an)”)、“一個/一種或多個/多種”以及“至少一個/一種”在本文中可以互換使用。
此外，本文使用的“和/或”被視為兩個指定特徵或組分中的每一個與或不與其他特徵或組分的特定公開。因此，如在本文中以短語如“A和/或B”使用的術語“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)和“B”(單獨)。同樣，如以短語如“A、B和/或C”使用的術語“和/或”旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；以及C(單獨)。
應當理解，無論在本文中將多方面用語言“包含”來描述的情況如何，還提供了以“由……組成”和/或“基本上由……組成”措辭描述的其他類似方面。
除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本揭露所涉及領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第3版, 1999, Academic Press；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 修訂版, 2000, Oxford University Press可以為本領域技術人員提供本揭露中所用的許多術語的通用詞典。
單位、首碼和符號均以其國際單位制(SI)可接受的形式表示。數值範圍包括限定範圍的數字。除非另有指示，否則胺基酸序列以胺基至羧基方向從左至右書寫。本文提供的標題不是對本揭露的各個方面的限制。因此，通過從整體上參考說明書，可以更全面地定義下文緊接著定義的術語。
術語“大約”或“約”在本文中用於意指大約、大致、大概或在……左右。當術語“約”與數值範圍結合使用時，它通過擴展所述數值的上下邊界來修改該範圍。通常，術語“約”可以通過方差(例如，10%、向上或向下)將數值修飾為高於和低於所述值(更高或更低)。於一些實施例，所述術語指示與所指示數值的偏差為± 10%、± 5%、± 4%、±3%、± 2%、± 1%、± 0.9%、± 0.8%、± 0.7%、± 0.6%、± 0.5%、± 0.4%、± 0.3%、± 0.2%、± 0.1%、± 0.05%或± 0.01%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 10%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 5%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 4%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 3%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 2%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 1%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.9%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.8%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.7%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.6%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.5%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.4%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.3%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.1%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.05%。於一些實施例，“約”指示與所指示數值的偏差為± 0.01%。
如本文所用，術語“信使RNA”或“mRNA”是指編碼至少一種多肽的多核苷酸。如本文所用的mRNA涵蓋經修飾的RNA和未經修飾的RNA兩者。mRNA可以含有一個或多個編碼區和非編碼區。編碼區可替代地稱為開放閱讀框(ORF)。mRNA中的非編碼區包括5'帽、5'非轉譯區(UTR)、3' UTR和聚A尾。mRNA可以從天然來源中純化，使用重組表現系統(例如，體外轉錄)產生，以及任選地純化或化學合成。
如本文所用，術語“開放閱讀框”、“ORF”或“編碼區”是指以起始密碼子(例如ATG)開始並以終止密碼子(例如TAA、TAG或TGA)結束、其間沒有任何其他終止密碼子且編碼蛋白質(例如，抗原性原核多肽)的多核苷酸序列。
如本文所用，術語“病毒分泌訊息肽”或“SS”是指來源於病毒的胺基酸序列，其引導與其附接的多肽序列通過細胞分泌途徑。具有SS序列的多肽通過細胞中的一個或多個細胞器轉運，直到通過分泌小泡分泌到細胞外。
如本文所用，術語“跨膜結構域”或“TMB”是指具有細胞膜跨越特性的胺基酸序列。TMB觸發將與其附接的多肽錨定到細胞膜。
本揭露中還包括多肽的片段或變體及其任何組合。當提及本揭露的抗原性原核多肽時，術語“片段”或“變體”包括保留參考多肽的至少一些特性(例如，所述多肽的特異性抗原特性或多肽有助於誘導抗體結合的能力)的任何多肽。多肽的片段包括N末端和/或C末端截短的片段，例如C末端片段和N末端片段，以及缺失片段，但不包括天然存在的全長多肽(或成熟多肽)。缺失片段是指從全長多肽中缺失1個或多個內部胺基酸的多肽。多肽的變體包括如上所述的片段，以及由於胺基酸取代、缺失或***而具有改變的胺基酸序列的多肽。變體可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的變體可以使用本領域中已知的誘變技術來產生。變體多肽可以包含保守或非保守的胺基酸取代、缺失或添加。這樣的變異(即截短和/或胺基酸取代、缺失或***)可以在胺基酸水準上發生或相應地在核酸水準上發生。
“保守胺基酸取代”是其中胺基酸殘基被具有類似側鏈的胺基酸殘基替代的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族已經在本領域中進行了定義，包括鹼性側鏈(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天門冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如，蘇胺酸、擷胺酸、異白胺酸)以及芳族側鏈(例如，酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)。因此，如果多肽中的胺基酸被來自相同側鏈家族的另一種胺基酸替代，則所述取代被認為是保守的。於另一個實施例，胺基酸串可以用結構上類似但側鏈家族成員的順序和/或組成不同的串來保守地替代。
如本文所用的術語“連接”或“附接”是指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別與第二胺基酸序列或核苷酸序列共價或非共價接合(例如，分泌訊息胺基酸序列和/或跨膜結構域胺基酸序列與抗原性原核多肽胺基酸序列連接)。第一胺基酸或核苷酸序列可以與第二胺基酸或核苷酸序列直接接合或並置，或者可替代地，間插序列可以將第一序列共價接合至第二序列。術語“連接”不僅指第一胺基酸序列在C末端或N末端與第二胺基酸序列融合，還包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)***第二胺基酸序列(或相應地，第一胺基酸序列)中的任何兩個胺基酸中。於一實施例，第一胺基酸序列可以通過肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可以通過磷酸二酯鍵或連接子連接至第二核苷酸序列。連接子可以是肽或多肽(對於多肽鏈)或者核苷酸或核苷酸鏈(對於核苷酸鏈)或任何化學部分(對於多肽和多核苷酸鏈二者)。術語“連接”還通過連字號(-)來指示。
如本文所用，術語“醣基化”是指向蛋白質添加糖單元。
如本文所用，術語“N-聚糖”是指在蛋白質的N(天門冬醯胺酸)殘基的醯胺氮處附接至蛋白質的糖鏈。這樣，通過N-醣基化過程形成N-聚糖。此聚糖可以是多糖。
如本文所用，術語“免疫反應”是指免疫系統的細胞(諸如B細胞、T細胞、樹突細胞、巨噬細胞或多形核細胞)對刺激物(諸如抗原或疫苗)的反應。免疫反應可以包括身體的參與宿主防禦反應的任何細胞，包括例如分泌干擾素或細胞介素的上皮細胞。免疫反應包括但不限於先天性和/或適應性免疫反應。
如本文所用，“保護性免疫反應”是指保護受試者免受感染(例如，預防感染或預防患上與感染相關的疾病)的免疫反應。測量免疫反應的方法是本領域熟知的，並且包括例如通過測量淋巴細胞(諸如B或T細胞)的增殖和/或活性、細胞介素或趨化介素的分泌、發炎、抗體產生等。
如本文所用，“抗體反應”是產生抗體的免疫反應。
如本文所用，“抗原”是指引發免疫反應的因子；和/或當暴露或投予生物體時由T細胞受體結合的因子(例如，當由MHC分子呈遞時)或與抗體(例如，由B細胞產生)結合的因子。於一些實施例，抗原在生物體中引發體液反應(例如，包括抗原特異性抗體的產生)。可替代地或另外地，於一些實施例，抗原在生物體中引發細胞反應(例如，涉及其受體與抗原特異性相互作用的T細胞)。特定抗原可以在靶生物體(例如，小鼠、兔、靈長類動物、人)的一個或幾個成員中引發免疫反應，但是並非在靶生物體物種的所有成員中引發免疫反應。於一些實施例，抗原在靶生物體物種的至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的成員中引發免疫反應。於一些實施例，抗原與抗體和/或T細胞受體結合，並且在生物體中可能誘導或可能不誘導特定生理反應。於一些實施例，例如，抗原可以在體外與抗體和/或T細胞受體結合，無論在體內是否發生這種相互作用。於一些實施例，抗原與特定體液或細胞免疫的產物反應。抗原包括由如本文所述的mRNA編碼的原核抗原多肽(例如，OspA ST1和ST2)。“原核抗原”或“抗原性原核多肽”包括能夠引發免疫反應的來源於原核生物體的任何抗原性多肽。
如本文所用，“佐劑”是指增強對抗原的免疫反應的物質或媒劑。佐劑可以包括而不限於其上吸附有抗原的礦物質(例如，明礬、氫氧化鋁或磷酸鹽)的懸浮液；抗原溶液乳化在礦物油中或水中的油包水或水包油乳劑(例如，弗氏不完全佐劑)。有時包括死亡的分枝桿菌(例如，弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG模體)也可以用作佐劑(例如，參見美國專利號6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐劑還可以包括生物分子，諸如Toll樣受體(TLR)促效劑和共刺激分子。如本文所用，“受試者”是指動物界的任何成員。於一些實施例，“受試者”是指人類。於一些實施例，“受試者”是指非人類動物。於某些實施例，非人受試者是哺乳動物，例如，齧齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、美洲駝、馬、狗、貓、牛、綿羊、山羊、靈長類動物、豬。於一些實施例，當受試者是人時，術語“個體”或“患者”被使用並且旨在可與“受試者”互換。
如本文所用，術語“預防(prevent)”、“預防(preventing)”“預防(prevention)”或“預防(prophylaxis)”(及其語法變體)是指部分或完全抑制特定感染、疾病、障礙和/或病症的一種或多種症狀或特徵的發作。
如本文所用，術語“治療(treat)”、“治療(treating)”、“治療(treatment)”、“療法”或“治療性”(及其語法變體)是指部分或完全減輕、改善、改進、緩解、抑制感染、疾病、障礙和/或病症的一種或多種症狀或特徵的進展和/或降低其嚴重程度。
如本文所用，術語“有效量”是指足以實現有益或所需結果的量(例如，核酸或組合物的量)。有效量可以在一次或多次投予、應用或劑量中投予，並不旨在限於特定的配製品或投予途徑。
術語“有效量”包括例如“治療有效量”和/或“預防有效量”。
如本文所用的短語“治療有效量”是指在感染、疾病、障礙和/或病症的治療中以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比有效產生一些所需治療效果的量(例如，核酸或組合物的量)。
如本文所用的短語“預防有效量”是指在感染、疾病、障礙和/或病症的預防中以適用於任何醫學治療的合理收益/風險比有效產生一些所需預防效果的量(例如，核酸或組合物的量)。
如本文所用，術語“疫苗接種(vaccination)”或“疫苗接種(vaccinate)”是指組合物的投予，其旨在產生免疫反應，例如針對致病因子的免疫反應。疫苗接種可以在暴露於致病因子和/或發生一種或多種症狀之前、期間和/或之後投予，並且於一些實施例，在暴露於所述因子之前、期間和/或之後不久投予。於一些實施例，疫苗接種包括間隔適當時間多次投予疫苗組合物。
本揭露描述了分別與給定核酸序列或胺基酸序列(參考序列)具有一定同一性程度的核酸序列(例如，DNA和RNA序列)和胺基酸序列。
兩個核酸序列之間的“序列同一性”指示序列之間相同的核苷酸的百分比。兩個胺基酸序列之間的“序列同一性”指示序列之間相同的胺基酸的百分比。
術語“相同%”、“同一性%”或類似術語旨在特定地指在待比較的序列之間的最佳比對中相同的核苷酸或胺基酸的百分比。所述百分比是純粹統計學的，並且兩個序列之間的差異可以但不一定隨機分佈在待比較的序列的整個長度上。兩個序列的比較通常通過以下方式進行：在最佳比對之後，關於區段或“比較視窗”比較所述序列，以便鑒定相應序列的局部區域。用於比較的最佳比對可以人工或借助於以下進行：Smith和Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482的局部同源性演算法；Neddleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443的局部同源性演算法；Pearson和Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444的相似性搜索方法；或使用所述演算法的電腦程式(在威斯康辛遺傳學套裝軟體(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，遺傳學電腦課題組(Genetics Computer Group)，威斯康辛州麥迪森科學大道(Science Drive)575號)。
通過以下方式獲得同一性百分比：確定待比較的序列對應的相同位置的數量，用此數量除以所比較位置的數量(例如，參考序列中的位置的數量)，並且將此結果乘以100。
於一些實施例，同一性程度是針對區域給出的，所述區域是參考序列的整個長度的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。例如，如果參考核酸序列由200個核苷酸組成，則針對至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個核苷酸(於一些實施例為連續核苷酸)給出同一性程度。於一些實施例，針對參考序列的整個長度給出同一性程度。
分別具有與給定核酸序列或胺基酸序列的特定同一性程度的核酸序列或胺基酸序列可以具有所述給定序列的至少一種功能特性，例如並且在一些情況下，在功能上等同於所述給定序列。於一些實施例，具有與給定核酸序列或胺基酸序列的特定同一性程度的核酸序列或胺基酸序列在功能上等同於所述給定序列。
如本文所用，術語“套組”是指一組經包裝的相關組分，諸如一種或多種化合物或組合物和一種或多種相關材料，諸如溶劑、溶液、緩衝液、說明書或乾燥劑。 II. 分泌訊息序列
使用與抗原性原核多肽附接的病毒分泌訊息肽(SS)序列可以為疫苗接種提供許多優點。當從mRNA表現時，尤其是在真核細胞中，相對於不具有SS序列的原核抗原，SS-原核抗原融合蛋白可以具有增加的細胞外表現。增加的細胞外表現可以促進更高的免疫原性，並且通過擴展，促進更好的疫苗功效。
病毒SS序列可以在公眾可得的資料庫(例如，NCBI或UniProt資料庫)中找到，其包括注釋的病毒多肽序列並鑒定實驗驗證的SS的起始和終止位置。
於某些實施例，SS序列以及給定的已知輸入多肽序列的SS序列切割位點的位置可以通過使用SignalP演算法來預測。SignalP演算法(且更特定地，SignalP v6.0)進一步詳細描述於Armenteros等人(Nature Biotechnology. 37: 420-423. 2019)、Teufel等人(Nature Biotechnology. 40: 1023-1025. 2022)以及https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/中，將其中的每一個通過引用以其整體併入本文。預測的強度基於累積秩得分來評估，所述累積秩得分考慮了檢測訊息序列的規範特徵的似然性(SS似然性得分)和在切割位點處切割的概率(切割概率得分)。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽來源於能夠感染人的病毒中的病毒序列。短語“分泌訊息肽序列”之前的短語“流感病毒(influenza)”、“SARS CoV-2”、“水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)”、“麻疹病毒(measles)”、“風疹病毒(rubella)”、“狂犬病病毒(rabies)”、“伊波拉病毒(Ebola)”和“天花病毒(smallpox)”表明，所述分泌訊息肽來源於對應於該名稱的病毒。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽來源於選自以下的病毒序列：流感病毒分泌訊息肽序列、SARS CoV-2分泌訊息肽序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)分泌訊息肽序列、麻疹病毒分泌訊息肽序列、風疹病毒分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒分泌訊息肽序列、伊波拉病毒分泌訊息肽序列、狂犬病病毒分泌訊息肽序列、和天花病毒分泌訊息肽序列。這些特定的訊息肽來源於病毒中的病毒序列，所述病毒作為疫苗(活減毒的、滅活的或mRNA)投予人類，具有證實的強安全性特徵。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽選自：流感病毒血凝素(HA)分泌訊息肽序列、SARS CoV-2刺突分泌訊息肽序列、VZV gB分泌訊息肽序列、VZV gE分泌訊息肽序列、VZV gI分泌訊息肽序列、VZV gK分泌訊息肽序列、麻疹病毒F蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E1蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E2蛋白分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白分泌訊息肽序列、伊波拉病毒GP蛋白分泌訊息肽序列、狂犬病病毒糖蛋白(狂犬病G)分泌訊息肽序列、和天花病毒6kDa IC蛋白分泌訊息肽序列。
於某些實施例，所述病毒分泌訊息肽包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、優選來自A型流感病毒的HA分泌訊息肽序列。
本揭露的例示性病毒分泌訊息肽胺基酸序列示於下 表 1中。本揭露的來源於A型或B型流感病毒的例示性病毒分泌訊息肽胺基酸序列示於下 表 2中。 表 1- 病毒分泌訊息肽 (SS) 胺基酸序列
蛋白質的名稱 生物體 毒株 SS 的序列
HA(H1N1) 流感病毒 A/New Caledonia/20/1999 MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)
HA(H1N1pdm) 流感病毒 A/California/7/2009 MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO: 2)
HA(H3N2) 流感病毒 A/Moscow/10/1999 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 3)
HA B 流感病毒 B/Phuket/3073/2013 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 4)
刺突 SARS CoV-2 Wuhan-1 MFVFLVLLPLVS (SEQ ID NO: 5)
刺突 SARS CoV-2 Wuhan-1(長型) MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVS (SEQ ID NO: 6)
gB VZV Oka毒株 MSPCGYYSKWRNRDRPEYRRNLRFRRFFSSIHPNAAAGSGFNGPGVFITSVTGVWLCFLCIFSMFVTAVVS (SEQ ID NO: 7)
gE VZV Oka毒株 MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRA (SEQ ID NO: 8)
gI VZV Oka毒株 MFLIQCLISAVIFYIQVTNA (SEQ ID NO: 9)
gK VZV Oka毒株 MQALGIKTEHFIIMCLLSGHA (SEQ ID NO: 10)
F 麻疹病毒 Edmonston-Zagreb毒株 MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTG (SEQ ID NO: 11)
E1 風疹病毒 RA27/3毒株 MGAAAALTAVVLQGYNPPAYG (SEQ ID NO: 12)
E2 風疹病毒 RA27/3毒株 MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA (SEQ ID NO: 13)
F 流行性腮腺炎病毒 Miyahara毒株 MKVFLVTCLGFAVFSSSVC (SEQ ID NO: 14)
GP 伊波拉病毒 Mayinga-76毒株 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS (SEQ ID NO: 15)
6kDa IC 天花病毒 Germany 91-3毒株 MRSLIIFLLFPSIIYS (SEQ ID NO: 16)
狂犬病病毒G 狂犬病病毒 狂犬病病毒Pasteur毒株 MVPQALLFVPLLVFPLCFG (SEQ ID NO: 184)
表 2-A 型和 B 型流感病毒特異性病毒分泌訊息肽 (SS) 胺基酸序列
毒株名稱或 ID SS 的序列
A/Beijing/262/95(H1N1)樣病毒 MKAKLLVLLCTFTATYA (SEQ ID NO: 95)
A/Brisbane/02/2018(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVLLYTFTTANA (SEQ ID NO: 96)
A/Brisbane/59/2007(H1N1)樣病毒 MKVKLLVLLCTFTATYA (SEQ ID NO: 97)
A/California/7/2009(H1N1)樣病毒 MKAILVVLLYTFATANA (SEQ ID NO: 98)
A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVLLYTFTTANA (SEQ ID NO: 99)
A/Hawaii/70/2019(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVLLYTFTTANA (SEQ ID NO: 100)
A/Michigan/45/2015(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVLLYTFTTANA (SEQ ID NO: 101)
A/New Caledonia/20/99(H1N1)樣病毒 MKAKLLVLLCTFTATYA (SEQ ID NO: 102)
A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)樣病毒 MKVKLLVLLCTFTATYA (SEQ ID NO: 103)
A/Sydney/5/2021(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVMLYTFTTANA (SEQ ID NO: 104)
A/Victoria/2570/2019(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVMLYTFTTANA (SEQ ID NO: 105)
A/Victoria/4897/2022(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVMLYTFTTANA (SEQ ID NO: 106)
A/Wisconsin/588/2019(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVMLYTFTTANA (SEQ ID NO: 107)
A/Wisconsin/67/2022(H1N1)pdm09樣病毒 MKAILVVMLYTFTTANA (SEQ ID NO: 108)
H1N1共有序列#1(沒有取代) MKAILVVLLYTFTTANA (SEQ ID NO: 109)
A/Brisbane/10/2007(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFT (SEQ ID NO: 110)
A/California/7/2004(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 111)
A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 112)
A/Darwin/6/2021(H3N2)樣病毒 MKTIIALSNILCLVFA (SEQ ID NO: 113)
A/Darwin/9/2021(H3N2)樣病毒 MKTIIALSNILCLVFA (SEQ ID NO: 114)
A/Fujian/411/2002(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 115)
A/Hong Kong/2671/2019(H3N2)樣病毒 MKAIIALSNILCLVFA (SEQ ID NO: 116)
A/Hong Kong/45/2019(H3N2)樣病毒 MKAIIALSNILCLVFA (SEQ ID NO: 117)
A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 118)
A/Kansas/14/2017(H3N2)樣病毒 MKTIIALSCILCLVFA (SEQ ID NO: 119)
A/Moscow/10/99(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 120)
A/Perth/16/2009(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 121)
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 122)
A/South Australia/34/2019(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 123)
A/Switzerland/8060/2017(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 124)
A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 125)
A/Sydney/5/97(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 126)
A/Texas/50/2012(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 127)
A/Victoria/361/2011(H3N2)-樣病毒 MKTIIALSHILCLVFA (SEQ ID NO: 128)
A/Wellington/1/2004(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 129)
A/Wisconsin/67/2005(H3N2)樣病毒 MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 130)
H3N2共有序列#1(沒有取代) MKTIIALSYILCLVFA (SEQ ID NO: 131)
B/Austria/1359417/2021(B/Victoria譜系)-樣 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 132)
B/Brisbane/60/2008樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 134)
B/Colorado/06/2017樣病毒(B/Victoria/2/87譜系) MKAIIVLLMVVTSSA (SEQ ID NO: 135)
B/Hong Kong/330/2001樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 136)
B/Malaysia/2506/2004樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 137)
B/Washington/02/2019(B/Victoria譜系)樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 138)
B/Beijing/184/93樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 139)
B/Florida/4/2006樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 140)
B/Massachusetts/2/2012樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 141)
B/Phuket/3073/2013樣病毒 MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 142)
B/Sichuan/379/99樣病毒 MEAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 143)
B型流感病毒VICTORIA/YAMAGATA共有序列(沒有取代) MKAIIVLLMVVTSNA (SEQ ID NO: 144)
H1N1共有序列#2(有取代) MKX 1X 2LX 3VX 4LX 5TFX 6X 7X 8X 9A X 1選自A和V；X 2選自I和K；X 3選自V和L；X 4選自L和M；X 5選自Y和C；X 6選自T和A；X 7選自T和A；X 8選自A和T；並且X 9選自N和Y (SEQ ID NO: 145)
H3N2共有序列#2(有取代) MKX 1IIALSX 2ILCLVFX 3X 1選自T和A；X 2選自Y、N、C和H；並且X 3選自T和A (SEQ ID NO: 146)
B型流感病毒VICTORIA共有序列(有取代) MKAIIVLLMVVTSX 1A X 1選自S和N (SEQ ID NO: 147)
B型流感病毒YAMAGATA共有序列(有取代) MX 1AIIVLLMVVTSNA X 1選自K和E (SEQ ID NO: 148)
III. 跨膜結構域
在構築體(尤其是用作疫苗抗原的mRNA構築體)中包含跨膜結構域(TMB)的目的是通過將抗原錨定在膜上而將其定位在細胞表面，所述構築體還可以包含SS，從而產生SS-抗原-TMB融合蛋白(並且可能隨後在成熟蛋白中切割SS之後產生抗原-TMB蛋白)。這可以減少抗原細胞內定位，並且相對於不具有TMB序列的抗原，進一步促進更高的免疫原性。TMB的添加尤其可以允許增加針對抗原的體液(B細胞)反應。這對於原核抗原可能是有用的，但也可以用於其他抗原(例如，病毒抗原)。TMB的添加可以與來源於膜蛋白的抗原或來源於不是膜蛋白的蛋白質(例如，分泌型蛋白或細胞內蛋白)的抗原一起使用。如本文所述的任何更具特異性的TMB的添加對於來源於不是膜蛋白的蛋白質(即，並非天然含有TMB(或類似的)的蛋白質)的抗原可能是特別有用的。
TMB可以來自本領域中任何已知的TMB，包括但不限於來自真核跨膜蛋白(例如，哺乳動物跨膜蛋白，諸如人類跨膜蛋白)的TMB、來自原核跨膜蛋白的TMB以及來自病毒跨膜蛋白的TMB。TMB可以通過電腦預測演算法來進一步鑒定，例如在Krogh等人(J Mol Biol. 305(3): 567-580. 2001)和https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/中描述的TMHMM預測方法中，將其中的每一個通過引用以其整體併入本文。TMB的一些特徵進一步詳細描述於Albers等人(第2章-cell membrane structures and functions. Basic Neurochemistry第八版. 第26-39頁. 2012)中，將其通過引用併入本文。TMB典型地但不排他地主要由非極性(疏水性)胺基酸殘基構成，並且可以橫越脂質雙層一次或幾次。技術人員充分瞭解用於確定胺基酸的疏水性的方法。參見Simm等人 (2016), Biol Res., 49(1):31；Wimlet和White (1996), Nat Struct Biol., 3(10): 842-848；https://blanco.biomol.uci.edu/hydrophobicity_scales.html；以及https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/docs/UsersGuide/midas/hydrophob.html。
TMB通常包含α螺旋，每個螺旋含有18-21個胺基酸，其足以跨越脂質雙層。因此，於某些實施例，所述跨膜結構域包含一個或多個α螺旋。
於某些實施例，所述跨膜結構域來源於整合膜蛋白，如下文和在Albers等人中進一步定義，“整合膜蛋白”(也稱為內在膜蛋白)是永久性附接至脂質膜的膜蛋白。於某些實施例，所述跨膜結構域來源於整合多穿(polytopic)蛋白。整合多穿蛋白是跨越整個膜的蛋白質。於某些實施例，所述跨膜結構域來源於單程(跨)膜蛋白，更特別是二穿膜蛋白，例如I型或II型。單程膜蛋白僅跨膜一次(即，二穿膜蛋白)，而多程膜蛋白穿入穿出，幾次跨膜。單程膜蛋白可以分類為I型或II型，I型的定位使其羧基末端朝向胞質溶膠，II型的胺基末端朝向胞質溶膠。於某些實施例，所述跨膜結構域來源於整合單穿(monotopic)蛋白。整合單穿蛋白是僅從一側與膜締合而不完全跨越脂質雙層的蛋白質。
於某些實施例，所述跨膜結構域來源於非人類序列。於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於原核跨膜蛋白，並且所述跨膜結構域是所述原核跨膜蛋白的跨膜結構域。
於某些實施例，所述跨膜結構域來源於病毒序列。短語“跨膜結構域序列”之前的短語“流感病毒”、“SARS CoV-2”、“水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)”、“麻疹病毒”、“風疹病毒”、“狂犬病病毒”、“伊波拉病毒”和“天花病毒”表明，所述跨膜結構域序列來源於對應於該名稱的病毒。
於某些實施例，所述跨膜結構域來源於選自以下的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列、SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、狂犬病病毒跨膜結構域序列、和伊波拉病毒跨膜結構域序列。這些特定的跨膜結構域來源於病毒中的病毒序列，所述病毒作為疫苗(活減毒的、滅活的或mRNA)投予人，具有證實的強安全性特徵。
於某些實施例，所述跨膜結構域選自：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、狂犬病病毒糖蛋白(狂犬病G)跨膜結構域序列、和伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列。
於某些實施例，所述跨膜結構域包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
本揭露的例示性病毒跨膜結構域胺基酸序列示於下 表 3中。 表 3- 病毒跨膜結構域 (TMB) 訊息胺基酸序列
蛋白質的名稱 生物體 毒株 TMB 的序列
HA(H1N1) 流感病毒 A/New Caledonia/20/1999 ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF (SEQ ID NO: 17)
HA(H1N1pdm) 流感病毒 A/California/7/2009 ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF (SEQ ID NO: 18)
HA(H3N2) 流感病毒 A/Moscow/10/1999 ILWISFAISCFLLCVVLLGFI (SEQ ID NO: 19)
HA B 流感病毒 B/Phuket/3073/2013 STAASSLAVTLMLAIFIVYMV (SEQ ID NO: 20)
刺突 SARS CoV-2 Wuhan-1 WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML (SEQ ID NO: 21)
gB VZV Oka毒株 FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY (SEQ ID NO: 22)
gE VZV Oka毒株 AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC (SEQ ID NO: 23)
gI VZV Oka毒株 IIIPIVASVMILTAMVIVIVI (SEQ ID NO: 24)
gK VZV Oka毒株 YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL (SEQ ID NO: 25)
F 麻疹病毒 Edmonston-Zagreb毒株 IVYILIAVCLGGLIGIPALIC (SEQ ID NO: 26)
E1 風疹病毒 RA27/3毒株 LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC (SEQ ID NO: 27)
E2 風疹病毒 RA27/3毒株 WWQLTLGAICALLLAGLLACC (SEQ ID NO: 28)
F 流行性腮腺炎病毒 Miyahara毒株 IVAALVLSILSIIISLLFCCW (SEQ ID NO: 29)
GP 伊波拉病毒 Mayinga-76毒株 WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI (SEQ ID NO: 30)
狂犬病病毒G 狂犬病病毒 狂犬病病毒Pasteur毒株 VLLSAGALTALMLIIFLMTCW (SEQ ID NO: 185)
於某些實施例，所述SS序列位於所述抗原性原核多肽的N末端。
於某些實施例，所述SS序列位於所述抗原性原核多肽的C末端。
於某些實施例，所述TMB序列位於所述抗原性原核多肽的N末端。
於某些實施例，所述TMB序列位於所述抗原性原核多肽的C末端。
於某些實施例，所述SS胺基酸序列由密碼子優化的多核苷酸序列編碼。
於某些實施例，所述TMB胺基酸序列由密碼子優化的多核苷酸序列編碼。 IV. 連接子
於本揭露的某些實施例，所述病毒分泌訊息肽(SS)序列或跨膜結構域(TMB)與所述抗原性原核多肽直接融合(即，不存在將SS序列或TMB連接至抗原性原核多肽的連接子，諸如胺基酸連接子)。
於其他實施例，本揭露的SS序列和TMB任選地用連接子附接至抗原性原核多肽。於某些實施例，所述連接子是胺基酸連接子。於某些實施例，所述胺基酸連接子的長度為1-10個胺基酸(例如，所述胺基酸連接子的長度為1個胺基酸、2個胺基酸、3個胺基酸、4個胺基酸、5個胺基酸、6個胺基酸、7個胺基酸、8個胺基酸、9個胺基酸或10個胺基酸)。
連接子的說明性例子包括甘胺酸聚合物(Gly)n，其中n是至少一、二、三、四、五、六、七或八的整數；甘胺酸-絲胺酸聚合物(GlySer)n，其中n是至少一、二、三、四、五、六、七或八的整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；以及本領域已知的其他柔性連接子。
甘胺酸聚合物和甘胺酸-絲胺酸聚合物是相對非結構化的和柔性的，並且因此能夠充當在SS序列和/或TMB與抗原性原核多肽之間的中性系鏈。於某些實施例，所述連接子是SGS或GSG。
其他例示性連接子包括但不限於以下胺基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO: 81)；TGEKP(SEQ ID NO: 82)(Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5525-5530. 1997)；GGRR(SEQ ID NO: 92)；(GGGGS)n(SEQ ID NO: 93)，其中n = 1、2、3、4或5(Kim等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1156-1160. 1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO: 83)(Chaudhary等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 1066-1070. 1990)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO: 84)(Bird等人 Science. 242:423-426. 1988)；GGRRGGGS(SEQ ID NO: 85)；LRQRDGERP(SEQ ID NO: 86)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO: 87)；以及GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO: 88)(Cooper等人 Blood. 101(4): 1637-1644. 2003)。優選的連接子較短，例如由3、4或5個胺基酸組成。
連接子的另外例子在Chen等人(Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369. 2013)中提供，將其通過引用併入本文。 V. 抗原性原核多肽
本揭露的病毒分泌訊息肽(SS)和/或跨膜結構域(TMB)與抗原性原核多肽連接。 A. 原核生物屬
於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於選自以下的屬的細菌：醋桿菌屬、不動桿菌屬、放線菌屬、氣球菌屬、土壤桿菌屬、無形體屬、固氮根瘤菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、巴爾通體屬、鮑特菌屬、疏螺旋體屬、布魯氏菌屬、伯克霍爾德菌屬、鞘桿菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、嗜衣原體屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、柯克斯體屬、丙酸桿菌屬( Cutibacterium)、埃立克體屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、弗朗西絲菌屬、梭形桿菌屬、加德納菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、克雷伯菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、軍團菌屬、李斯特菌屬、甲烷桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、莫拉菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟菌屬、巴斯德菌屬、片球菌屬、消化鏈球菌屬、卟啉單胞菌屬、普雷沃菌屬、丙酸桿菌屬( Propionibacterium)、假單胞菌屬、根瘤菌屬、立克次體屬、羅卡利馬體屬、羅思氏菌屬、沙門菌屬、沙雷菌屬、志賀菌屬、八疊球菌屬、螺菌屬、螺旋體屬、葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬、鏈桿菌屬、鏈球菌屬、四聯球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬、 Viridans、沃爾巴克氏體屬和耶爾森菌屬。於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於選自以下的物種的細菌：橙黃色醋桿菌、鮑氏不動桿菌、以色列放線菌、放射形土壤桿菌、根癌土壤桿菌、嗜吞噬細胞無形體、莖瘤固氮根瘤菌、棕色固氮菌、炭疽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、紡錘芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌、脆弱擬桿菌、牙齦擬桿菌、產黑色素擬桿菌、漢賽巴爾通體、五日熱巴爾通體、支氣管敗血鮑特菌、百日咳鮑特菌、伯氏疏螺旋體、流產布魯氏菌、馬爾他布魯氏菌、豬種布魯氏菌、鼻疽伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、肉芽腫鞘桿菌、大腸彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、幽門彎曲桿菌、沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體、鸚鵡嗜熱衣原體、肉毒梭菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌、梭形棒狀桿菌、貝納柯克斯體、痤瘡丙酸桿菌( Cutibacterium acnes)、貪婪丙酸桿菌、顆粒丙酸桿菌、納姆丙酸桿菌、胡莫丙酸桿菌、查菲埃立克體、陰溝腸桿菌、鳥腸球菌、耐久腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、馬婁腸球菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲菌、具核梭形桿菌、***加德納菌、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、百日咳嗜血桿菌、***嗜血桿菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乾酪乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜肺軍團菌、單核細胞增生李斯特菌、外部甲烷桿菌、多形微桿菌、藤黃微球菌、卡他莫拉菌、鳥分枝桿菌、牛分枝桿菌、白喉分枝桿菌、胞內分枝桿菌、麻風分枝桿菌、鼠麻風分枝桿菌、草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、結核分枝桿菌、發酵支原體、生殖支原體、人型支原體、穿透支原體、肺炎支原體、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、多殺巴斯德菌、土拉巴斯德菌、消化鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、產黑色素普雷沃菌、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、銅綠假單胞菌、放射形根瘤菌、普氏立克次體、鸚鵡熱立克次體、五日熱立克次體、立氏立克次體、沙眼立克次體、漢賽羅卡利馬體、五日熱羅卡利馬體、齲齒羅思氏菌、腸炎沙門菌、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、黏質沙雷菌、痢疾志賀菌、迂回螺菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麥芽寡養單胞菌、無乳鏈球菌、鳥鏈球菌、牛鏈球菌、倉鼠鏈球菌、屎鏈球菌、糞鏈球菌、野鼠鏈球菌、雞鏈球菌、乳酸鏈球菌、輕型鏈球菌、緩症鏈球菌、變異鏈球菌、口腔鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、大鼠鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、遠緣鏈球菌、梅毒密螺旋體、齒垢密螺旋體、霍亂弧菌、逗號弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、草綠色鏈球菌、沃爾巴克氏體、小腸結腸炎耶爾森菌、鼠疫耶爾森菌和假結核耶爾森菌 。於某些實施例，所述抗原性原核多肽來源於疏螺旋體屬的細菌，優選選自物種伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、巴伐利亞疏螺旋體、馬約氏疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、葡萄牙疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體和/或法雷斯疏螺旋體。 B. 醣基化
醣基化可以發生在真核細胞中(但不發生在原核細胞中)。特定地，N-連接的醣基化是聚糖附接至蛋白質的天門冬醯胺酸(Asn；N)殘基的醯胺氮。附接過程產生醣基化蛋白。醣基化可以在蛋白質轉譯後發生於可被醣基化酶接近並識別的蛋白質中的任何天門冬醯胺酸殘基處，並且最常見於為NXS/T模體的一部分的可接近天門冬醯胺酸處，其中在天門冬醯胺酸之後的第一個胺基酸殘基(X)是除脯胺酸外的任何胺基酸，並且在天門冬醯胺酸之後的第二個胺基酸殘基是絲胺酸或蘇胺酸。非人醣基化模式可以使多肽在用於引發抗體時具有不期望的反應原性。另外，未正常醣基化的多肽(諸如抗原性原核多肽)的醣基化可以改變其免疫原性。例如，醣基化可以掩蔽蛋白質內重要的免疫原性表位。因此，為了減少或消除醣基化，可以對天門冬醯胺酸殘基或絲胺酸/蘇胺酸殘基進行修飾，例如通過取代為另一種胺基酸。
於某些實施例，所述抗原性原核多肽包含至少一個突變的醣基化位點，優選至少一個突變的N-連接的醣基化位點和/或至少一個O-連接的醣基化位點。於一些實施例，去除抗原性原核多肽中的一個或多個N-醣基化位點。於一些實施例，N-醣基化位點的去除降低了抗原性原核多肽的醣基化。於一些實施例，相對於天然抗原性原核多肽，所述抗原性原核多肽具有降低的醣基化。於一些實施例，N-醣基化位點的去除消除了抗原性原核多肽的N-醣基化。
於某些實施例，所述修飾包括NXS/T序列模體中N、S和T胺基酸中的一個或多個的取代，其中X對應於除脯胺酸(P)外的任何胺基酸。於一些實施例，N、S或T胺基酸被保守胺基酸取代取代。於某些實施例，編碼抗原性原核多肽的多核苷酸序列是經密碼子優化的。 C. OspA
於某些實施例，所述抗原性原核多肽是OspA(外表面蛋白A)。於某些實施例，所述OspA優選來源於OspA血清型(ST)1、2、3、4、5、6和/或7，更優選來源於血清型1的伯氏疏螺旋體菌株B31、血清型2的埃氏疏螺旋體菌株PKO、血清型3的伽氏疏螺旋體菌株PBr、血清型4的巴伐利亞疏螺旋體、血清型5的伽氏疏螺旋體、血清型6的伽氏疏螺旋體或血清型7的伽氏疏螺旋體。
編碼本揭露的OspA蛋白的例示性胺基酸序列示於下 表 4中。 D. CAMP2
於某些實施例，所述抗原性原核多肽是成孔毒素，優選CAMP2(Christie-Atkins-Munch-Peterson因子2)。
於某些實施例，所述CAMP2優選來源於丙酸桿菌屬的細菌，更優選來源於痤瘡丙酸桿菌物種(正式名稱為痤瘡丙酸桿菌)。
於某些實施例，所述CAMP2多肽包含胺基酸序列MVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA(SEQ ID NO: 149)。
編碼本揭露的痤瘡丙酸桿菌CAMP2因子蛋白的例示性胺基酸序列示於下 表 10中。 E. PITP
於某些實施例，所述抗原性原核多肽是推定的鐵轉運蛋白(PITP)。
於某些實施例，所述PITP優選來源於丙酸桿菌屬的細菌，更優選來源於痤瘡丙酸桿菌物種(正式名稱為痤瘡丙酸桿菌)。
於某些實施例，所述PITP多肽包含胺基酸序列MAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT(SEQ ID NO: 150)。
編碼本揭露的痤瘡丙酸桿菌PITP因子蛋白的例示性胺基酸序列示於下 表 10中。 VI. 脂質奈米顆粒 (LNP)
本揭露的LNP包含四類脂質：(i) 可電離的脂質(例如，陽離子脂質)；(ii) PEG化的脂質；(iii) 基於膽固醇的脂質；和 (iv) 輔助脂質。 A. 可電離的脂質
可電離的脂質促進mRNA包封，並且可以是陽離子脂質。陽離子脂質在低pH下提供帶正電荷的環境，以促進帶負電荷的mRNA藥物物質的有效包封。
於一些實施例，所述陽離子脂質是OF-02： 式 (I)
OF-02是OF-Deg-Lin的不可降解的結構類似物。OF-Deg-Lin含有可降解的酯連接以附接二酮哌𠯤核和雙不飽和尾，而OF-02含有不可降解的1,2-胺基-醇連接以附接相同的二酮哌𠯤核和雙不飽和尾(Fenton等人, Adv Mater.(2016) 28:2939；美國專利10,201,618)。本文的例示性LNP配製品脂質A含有OF-2。
於一些實施例，所述陽離子脂質是cKK-E10(Dong等人, PNAS(2014) 111(11):3955-60；美國專利9,512,073)： cKK-E10 式(II)
本文的例示性LNP配製品脂質B含有cKK-E10。
於一些實施例，所述陽離子脂質是GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(2-(4-(2-((3-(雙((Z)-2-羥基十八-9-烯-1-基)胺基)丙基)二硫烷基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基 4-(雙(2-羥基癸基)胺基)丁酸酯)，其是具有哌𠯤核的基於HEPES的二硫化物陽離子脂質，具有式III： 式 (III)
本文的例示性LNP配製品脂質C含有GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1。除了陽離子脂質中的差異之外，脂質C具有與脂質A或脂質B相同的組成。
於一些實施例，所述陽離子脂質是GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(2-(4-(2-((3-(雙(2-羥基癸基)胺基)丁基)二硫烷基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基 4-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)丁酸酯)，其是具有哌𠯤核的基於HEPES的二硫化物陽離子脂質，具有式IV： 式 (IV)
本文的例示性LNP配製品脂質D含有GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10。除了陽離子脂質中的差異之外，脂質D具有與脂質A或脂質B相同的組成。
於一些實施例，所述陽離子脂質是GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(2-(4-(2-((3-(雙(2-羥基十四烷基)胺基)丙基)二硫烷基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基 4-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)丁酸酯)，其是具有哌𠯤核的基於HEPES的二硫化物陽離子脂質，具有式V： 式 (V)
本文的例示性LNP配製品脂質E含有GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。除了陽離子脂質中的差異之外，脂質E具有與脂質A或脂質B相同的組成。
陽離子脂質GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1 (III)、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10 (IV) 和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14 (V) 可以根據方案1中所述的一般程式合成：
方案 1 ：式 (III) 、 (IV) 和 (V) 的脂質的一般合成方案
於一些實施例，所述陽離子脂質是MC3，具有式VI： 式 (VI)
於一些實施例，所述陽離子脂質是SM-102(8-{(2-羥基乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]胺基}辛酸9-十七烷基酯)，具有式VII： 式 (VII)
於一些實施例，所述陽離子脂質是ALC-0315 [(4-羥基丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)，具有式VIII： 式 (VIII)
於一些實施例，所述陽離子脂質是cOrn-EE1，具有式IX： 式 (IX)
於一些實施例，所述陽離子脂質可以選自cKK-E10；OF-02；[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基] 4-(二甲基胺基)丁酸酯(D-Lin-MC3-DMA)；2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)；1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DLin-DMA)；二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；8-{(2-羥乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]胺基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；[(4-羥丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；[3-(二甲基胺基)-2-[(Z)-十八碳-9-烯醯基]氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯(DODAP)；2,5-雙(3-胺基丙基胺基)-N-[2-[二(十七烷基)胺基]-2-氧代乙基]戊醯胺(DOGS)；[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚烷-2-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氫-1H-環戊二烯並[a]菲-3-基] N-[2-(二甲基胺基)乙基]胺基甲酸酯(DC-Chol)；四(8-甲基壬基)3,3',3'',3'''-(((甲基氮烷二基)雙(丙烷-3,1二基))雙(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)；(2-(二辛基銨基)乙基)磷酸癸酯(9A1P9)；5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氫-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18)；雙(2-(十二烷基二硫烷基)乙基)3,3'-((3-甲基-9-氧代-10-氧雜-13,14-二噻-3,6-二氮雜二十六基)氮烷二基)二丙酸酯(BAME-O16B)；1,1'-((2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基)氮烷二基)雙(十二烷-2-醇)(C12-200)；3,6-雙(4-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)丁基)哌𠯤-2,5-二酮(cKK-E12)；六(辛烷-3-基)9,9',9'',9''',9'''',9'''''-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))六壬酸酯(FTT5)；(((3,6-二氧代哌𠯤-2,5-二基)雙(丁烷-4,1-二基))雙(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9'Z,9''Z,9'''Z,12Z,12'Z,12''Z,12'''Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)；TT3；N 1,N 3,N 5-三(3-(雙十二烷基胺基)丙基)苯-1,3,5-三甲醯胺；N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲醯胺(MVL5)；8-((2-羥乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)胺基)辛酸十七烷-9-基酯(脂質5)；GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；及其組合。
於一些實施例，所述陽離子脂質是可生物降解的。
於一些實施例，所述陽離子脂質不是可生物降解的。
於一些實施例，所述陽離子脂質是可切割的。
於一些實施例，所述陽離子脂質不是可切割的。
陽離子脂質進一步詳細描述於Dong等人(PNAS. 111(11):3955-60. 2014)；Fenton等人(Adv Mater. 28:2939. 2016)；美國專利號9,512,073；以及美國專利號10,201,618中，將其中的每一個通過引用併入本文。 B. PEG 化的脂質
PEG化的脂質組分提供了對奈米顆粒的細微性和穩定性的控制。此類組分的添加可以防止複合物聚集，並且提供用於增加脂質-核酸醫藥組合物的循環壽命並且增加其向靶組織的遞送的手段(Klibanov等人 FEBS Letters 268(1):235-7. 1990)。可以選擇這些組分以在體內快速交換出醫藥組合物(參見例如，美國專利號5,885,613)。
所設想的PEG化的脂質包括但不限於長度長達5 kDa的聚乙二醇(PEG)鏈，其共價附接至具有C 6-C 20(例如，C 8、C 10、C 12、C 14、C 16或C 18)長度的一條或多條烷基鏈的脂質，如衍生化的神經醯胺(例如，N-辛醯基-鞘胺醇-1-[琥珀醯基(甲氧基聚乙二醇)](C8 PEG神經醯胺))。於一些實施例，所述PEG化的脂質是1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)；1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEG)；或1,2-二硬脂醯基-外消旋-甘油-聚乙二醇(DSG-PEG)，PEG-DAG；PEG-PE；PEG-S-DAG；PEG-S-DMG；PEG-cer；PEG-二烷氧基丙基胺基甲酸酯；2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)；及其組合。
於某些實施例，所述PEG具有高分子量，例如2000-2400 g/mol。於某些實施例，所述PEG是PEG2000(或PEG-2K)。於某些實施例，本文的PEG化的脂質是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DLPE-PEG2000、DSG-PEG2000、C8 PEG2000、或ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺)。於某些實施例，本文的PEG化的脂質是DMG-PEG2000。 C. 基於膽固醇的脂質
膽固醇組分為奈米顆粒內的脂質雙層結構提供了穩定性。於一些實施例，所述LNP包含一種或多種基於膽固醇的脂質。合適的基於膽固醇的脂質包括例如：DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲醯胺基膽固醇)、l,4-雙(3-N-油烯基胺基-丙基)哌𠯤(Gao等人, Biochem Biophys Res Comm. (1991) 179:280；Wolf等人, BioTechniques(1997) 23:139；美國專利5,744,335)、咪唑膽固醇酯(“ICE”；WO 2011/068810)、穀甾醇(22,23-二氫豆甾醇)、β-穀甾醇、穀甾烷醇、岩藻甾醇、豆甾醇(豆甾烷-5,22-二烯-3-醇)、麥角甾醇；鏈甾醇(3β-羥基-5,24-膽甾二烯)；羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)；7-脫氫膽固醇(Δ5,7-膽固醇)；二氫羊毛甾醇(24,25-二氫羊毛甾醇)；酵母甾醇(5α-膽甾-8,24-二烯-3β-醇)；膽甾烯醇(lathosterol)(5α-膽甾-7-烯-3β-醇)；薯蕷皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)；菜油甾醇(campesterol)(菜油甾-5-烯-3β-醇)；菜油甾烷醇(campestanol)(5a-菜油甾烷-3b-醇)；24-亞甲基膽固醇(5,24(28)-膽甾二烯-24-甲基烯-3β-醇)；十七烷酸膽甾醇酯(cholesteryl margarate)(十七烷酸膽甾-5-烯-3β-基酯)；油酸膽甾醇酯；硬脂酸膽甾醇酯和膽固醇的其他修飾形式。於一些實施例，在LNP中使用的基於膽固醇的脂質是膽固醇。 D. 輔助脂質
輔助脂質增強了LNP的結構穩定性，並且在內體逃逸中幫助LNP。它改進了mRNA藥物有效載荷的攝取和釋放。於一些實施例，所述輔助脂質是兩性離子脂質，其具有用於增強藥物有效載荷的攝取和釋放的促融合特性。輔助脂質的例子是1,2-二油醯基-SN-甘油-3-磷醯乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(DOPS)；1,2-二反油醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺(DEPE)；以及1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DPOC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、DMPC、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DLPC)、1,2-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)和1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷醯乙醇胺(DLPE)。
其他例示性輔助脂質是二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯磷醯乙醇胺(DMPE)、磷脂醯絲胺酸、鞘脂、鞘磷脂、神經醯胺、腦苷脂、神經節苷脂、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、或其組合。於某些實施例，所述輔助脂質是DOPE。於某些實施例，所述輔助脂質是DSPC。
於各種實施例，本發明的LNP包含 (i) 選自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、或GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的陽離子脂質；(ii) DMG-PEG2000；(iii) 膽固醇；和 (iv) DOPE。
於其他實施例，本發明的LNP包含 (i) SM-102；(ii) DMG-PEG2000；(iii) 膽固醇；和 (iv) DSPC。
另於其他實施例，本發明的LNP包含 (i) ALC-0315；(ii) ALC-0159；(iii) 膽固醇；和 (iv) DSPC。 E. 脂質組分的莫耳比
上述組分的莫耳比對於LNP在遞送mRNA中的有效性是重要的。陽離子脂質、PEG化的脂質、基於膽固醇的脂質和輔助脂質的莫耳比是A : B : C : D，其中A + B + C + D = 100%。於一些實施例，LNP中的陽離子脂質相對於總脂質的莫耳比(即，A)是35%-55%，諸如35%-50%(例如，38%-42%，諸如40%，或45%-50%)。於一些實施例，PEG化的脂質組分相對於總脂質的莫耳比(即，B)是0.25%-2.75%(例如，1%-2%，諸如1.5%)。於一些實施例，基於膽固醇的脂質相對於總脂質的莫耳比(即，C)是20%-50%(例如，27%-30%，諸如28.5%，或38%-43%)。於一些實施例，輔助脂質相對於總脂質的莫耳比(即，D)是5%-35%(例如，28%-32%，諸如30%，或8%-12%，諸如10%)。於一些實施例，(PEG化的脂質 + 膽固醇)組分具有與輔助脂質相同的莫耳量。於一些實施例，LNP所含的陽離子脂質與輔助脂質的莫耳比大於1。
於某些實施例，本揭露的LNP包含：
莫耳比為35%至55%或40%至50%的陽離子脂質(例如，莫耳比為35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%或55%的陽離子脂質)；
莫耳比為0.25%至2.75%或1.00%至2.00%的聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質(例如，莫耳比為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%或2.75%的PEG化的脂質)；
莫耳比為20%至50%、25%至45%或28.5%至43%的基於膽固醇的脂質(例如，莫耳比為20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%的基於膽固醇的脂質)；以及
莫耳比為5%至35%、8%至30%或10%至30%的輔助脂質(例如，莫耳比為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%的輔助脂質)，
其中所有莫耳比均相對於所述LNP的總脂質含量。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的陽離子脂質；莫耳比為1.5%的PEG化的脂質；莫耳比為28.5%的基於膽固醇的脂質；以及莫耳比為30%的輔助脂質。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為45%至50%的陽離子脂質；莫耳比為1.5%至1.7%的PEG化的脂質；莫耳比為38%至43%的基於膽固醇的脂質；以及莫耳比為9%至10%的輔助脂質。
於某些實施例，所述PEG化的脂質是二肉豆蔻醯基-PEG2000(DMG-PEG2000)。
於各種實施例，所述基於膽固醇的脂質是膽固醇。
於一些實施例，所述輔助脂質是1,2-二油醯基-SN-甘油-3-磷醯乙醇胺(DOPE)。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的OF-02；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的cKK-E10；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DOPE。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的SM-102；莫耳比為0.25%至2.75%的DMG-PEG2000；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DSPC。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為35%至55%的ALC-0315；莫耳比為0.25%至2.75%的ALC-0159；莫耳比為20%至50%的膽固醇；以及莫耳比為5%至35%的DSPC。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的OF-02；莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；莫耳比為28.5%的膽固醇；以及莫耳比為30%的DOPE。這種LNP配製品在本文中被指定為“脂質A”。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的cKK-E10；莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；莫耳比為28.5%的膽固醇；以及莫耳比為30%的DOPE。這種LNP配製品在本文中被指定為“脂質B”。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；莫耳比為28.5%的膽固醇；以及莫耳比為30%的DOPE。這種LNP配製品在本文中被指定為“脂質C”。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；莫耳比為28.5%的膽固醇；以及莫耳比為30%的DOPE。這種LNP配製品在本文中被指定為“脂質D”。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為40%的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；莫耳比為28.5%的膽固醇；以及莫耳比為30%的DOPE。這種LNP配製品在本文中被指定為“脂質E”。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為50%的8-{(2-羥乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]胺基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；莫耳比為10%的1,2-二硬脂醯基- sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)；莫耳比為38.5%的膽固醇；以及莫耳比為1.5%的1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為46.3%的(4-羥基丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；莫耳比為9.4%的1,2-二硬脂醯基- sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)；莫耳比為42.7%的膽固醇；以及莫耳比為1.6%的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
於某些實施例，所述LNP包含：莫耳比為47.4%的(4-羥基丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；莫耳比為10%的1,2-二硬脂醯基- sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)；莫耳比為40.9%的膽固醇；以及莫耳比為1.7%的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
為了計算待放入LNP配製品中的每種脂質的實際量，首先基於所需的N/P比確定陽離子脂質的莫耳量，其中N是陽離子脂質中氮原子的數量，並且P是待由LNP轉運的mRNA中的磷酸基團的數量。接下來，基於陽離子脂質的莫耳量和所選擇的莫耳比計算每種其他脂質的莫耳量。然後使用每種脂質的分子量將這些莫耳量轉化為重量。 F. LNP 的活性成分
本發明的LNP疫苗組合物的活性成分是編碼抗原性原核多肽的核酸(例如，mRNA)。
在所需的情況下，所述LNP可以是多價的。於一些實施例，所述LNP可以攜帶核酸，諸如mRNA，所述核酸編碼多於一種抗原性原核多肽，諸如兩種、三種、四種、五種、六種、七種或八種抗原。例如，所述LNP可以攜帶多種核酸(例如，mRNA)，每種編碼不同的抗原性原核多肽；或者攜帶可以轉譯成多於一種抗原性原核多肽的多順反子mRNA(例如，每個抗原編碼序列由編碼自我切割肽(諸如2A肽)的核苷酸連接子隔開)。攜帶不同核酸(例如，mRNA)的LNP典型地包含(包封)每種核酸的多個拷貝。例如，攜帶或包封兩種不同核酸的LNP典型地攜帶這兩種不同核酸中的每一種的多個拷貝。
於一些實施例，單一LNP配製品可以包含多個種類(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個種類的)LNP，每個種類攜帶不同的核酸(例如，mRNA)。
當所述核酸是mRNA時，所述mRNA可以是未經修飾的(即，僅含有由磷酸二酯鍵連接的天然核糖核苷酸A、U、C和/或G)，或者可以是經化學修飾的(例如，包括核苷酸類似物，諸如假尿苷(例如，N-1-甲基假尿苷)、2'-氟核糖核苷酸和2'-甲氧基核糖核苷酸；和/或硫代磷酸酯鍵)。mRNA分子可以包含5'帽和聚A尾。 G. 緩衝液和其他組分
為了穩定核酸和/或LNP(例如，為了延長疫苗產品的保質期)，為了促進LNP醫藥組合物的投予，和/或為了增強核酸的體內表現，可以將核酸和/或LNP與一種或多種載劑、靶向配體、穩定試劑(例如，防腐劑和抗氧化劑)和/或其他醫藥上可接受的賦形劑組合配製。此類賦形劑的例子是對羥基苯甲酸酯、硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞鈉(thiomersal)、氯丁醇、苯紮氯銨和螯合劑(例如，EDTA)。
本揭露的LNP組合物可以作為冷凍液體形式或凍乾形式提供。可以使用各種冷凍保護劑，包括而不限於蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、右旋糖等。冷凍保護劑可以構成LNP組合物的5%-30%(w/v)。於一些實施例，所述LNP組合物包含海藻糖，例如為5%-30%(例如，10%)(w/v)。一旦用冷凍保護劑配製，可以在-20ºC至-80ºC下冷凍(或凍乾和冷凍保存)LNP組合物。
可以將LNP組合物在水性緩衝溶液中提供給患者：如果先前冷凍，則解凍，或者如果先前凍乾，則在床邊在水性緩衝溶液中重構。所述緩衝溶液優選是等滲的，並且適用於例如肌內或皮內注射。於一些實施例，所述緩衝溶液是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。 VII.     RNA
本揭露的本發明的疫苗組合物可以包含編碼目的抗原(例如，抗原性原核多肽)的RNA分子(例如，mRNA)。本揭露的RNA分子可以包含至少一種包含編碼目的抗原的ORF的核糖核酸(RNA)。於某些實施例，所述RNA是包含編碼目的抗原的ORF的信使RNA(mRNA)。於某些實施例，所述RNA(例如，mRNA)進一步包含至少一個5' UTR、3' UTR、聚(A)尾和/或5'帽。 A. 5' 帽
mRNA 5'帽可以提供對大多數真核細胞中見到的核酸酶的抗性，並且促進轉譯效率。已知幾種類型的5'帽。7-甲基鳥苷帽(也稱為“m7G”或“帽-0”)包含通過5'-5'-三磷酸鍵與第一轉錄核苷酸連接的鳥苷。
典型地如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶從5'核苷酸去除一個末端磷酸基，留下兩個末端磷酸；然後經由鳥苷醯轉移酶將鳥苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸，產生5'5'5三磷酸連接；然後通過甲基轉移酶將鳥嘌呤的7-氮甲基化。帽結構的例子包括但不限於m7G(5')ppp、(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。另外的帽結構描述於美國公開號US 2016/0032356和美國公開號US 2018/0125989中，將其通過引用併入本文。
多核苷酸的5'加帽可以根據製造商的方案使用以下化學RNA帽類似物在體外轉錄反應期間伴隨完成，以產生5'-鳥苷帽結構：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU；m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(New England BioLabs, 麻塞諸塞州伊普斯威奇；TriLink Biotechnologies)。經修飾的RNA的5'加帽可以在轉錄後使用牛痘病毒加帽酶產生帽0結構：m7G(5')ppp(5')G來完成。帽1結構可以使用牛痘病毒加帽酶和2'-O甲基-轉移酶兩者產生m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基來產生。可以從帽1結構產生帽2結構，隨後使用2'-O甲基-轉移酶對5'-倒數第三個核苷酸進行2'-O-甲基化。可以從帽2結構產生帽3結構，隨後使用2'-O甲基-轉移酶對5'-倒數第四個核苷酸進行2'-O-甲基化。
於某些實施例，本揭露的mRNA包含選自以下的5'帽：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)、G(5')ppp(5')A、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')A、m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG。
於某些實施例，本揭露的mRNA包含以下的5'帽： 。 B. 非轉譯區 (UTR)
於一些實施例，本揭露的mRNA包含5'和/或3'非轉譯區(UTR)。在mRNA中，5' UTR在轉錄起始位點處開始並且繼續到起始密碼子，但是不包括起始密碼子。3' UTR緊接終止密碼子之後開始並且繼續直到轉錄終止訊息。
於一些實施例，本文公開的mRNA可以包含5' UTR，所述5' UTR包括影響mRNA的穩定性或轉譯的一個或多個元件。於一些實施例，5' UTR可以具有約10至5,000個核苷酸的長度。於一些實施例，5' UTR可以具有約50至500個核苷酸的長度。於一些實施例，5' UTR具有至少約10個核苷酸的長度、約20個核苷酸的長度、約30個核苷酸的長度、約40個核苷酸的長度、約50個核苷酸的長度、約100個核苷酸的長度、約150個核苷酸的長度、約200個核苷酸的長度、約250個核苷酸的長度、約300個核苷酸的長度、約350個核苷酸的長度、約400個核苷酸的長度、約450個核苷酸的長度、約500個核苷酸的長度、約550個核苷酸的長度、約600個核苷酸的長度、約650個核苷酸的長度、約700個核苷酸的長度、約750個核苷酸的長度、約800個核苷酸的長度、約850個核苷酸的長度、約900個核苷酸的長度、約950個核苷酸的長度、約1,000個核苷酸的長度、約1,500個核苷酸的長度、約2,000個核苷酸的長度、約2,500個核苷酸的長度、約3,000個核苷酸的長度、約3,500個核苷酸的長度、約4,000個核苷酸的長度、約4,500個核苷酸的長度或約5,000個核苷酸的長度。
於一些實施例，本文公開的mRNA可以包含3' UTR，所述3' UTR包含以下中的一個或多個：多腺苷酸化訊息、影響mRNA在細胞中的位置的穩定性的蛋白質的結合位點、或miRNA的一個或多個結合位點。於一些實施例，3' UTR可以具有50至5,000個核苷酸或更長的長度。於一些實施例，3' UTR可以具有50至1,000個核苷酸或更長的長度。於一些實施例，3' UTR具有至少約50個核苷酸的長度、約100個核苷酸的長度、約150個核苷酸的長度、約200個核苷酸的長度、約250個核苷酸的長度、約300個核苷酸的長度、約350個核苷酸的長度、約400個核苷酸的長度、約450個核苷酸的長度、約500個核苷酸的長度、約550個核苷酸的長度、約600個核苷酸的長度、約650個核苷酸的長度、約700個核苷酸的長度、約750個核苷酸的長度、約800個核苷酸的長度、約850個核苷酸的長度、約900個核苷酸的長度、約950個核苷酸的長度、約1,000個核苷酸的長度、約1,500個核苷酸的長度、約2,000個核苷酸的長度、約2,500個核苷酸的長度、約3,000個核苷酸的長度、約3,500個核苷酸的長度、約4,000個核苷酸的長度、約4,500個核苷酸的長度或約5,000個核苷酸的長度。
於一些實施例，本文公開的mRNA可以包含5'或3' UTR，其來源於與由mRNA轉錄物編碼的基因不同的基因(即，所述UTR是異源UTR)。
於某些實施例，5'和/或3' UTR序列可以來源於穩定的mRNA(例如，珠蛋白、肌動蛋白、GAPDH、微管蛋白、組蛋白或檸檬酸循環酶)，以增加mRNA的穩定性。例如，5' UTR序列可以包括CMV即刻早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以改進mRNA的核酸酶抗性和/或改進mRNA的半衰期。還設想了將編碼人生長激素(hGH)的序列或其片段包含到mRNA的3'端或非轉譯區。通常，相對於其未經修飾的對應物，這些修飾改進mRNA的穩定性和/或藥動學特性(例如，半衰期)，並且包括例如為改進mRNA對體內核酸酶消化的這種抗性而進行的修飾。
例示性5' UTR包括來源於CMV即刻早期1(IE1)基因的序列(美國公開號2014/0206753和2015/0157565，將其中的每一個通過引用併入本文)或序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO: 94)(美國公開號2016/0151409，將其通過引用併入本文)。
於各種實施例，5' UTR可以來源於TOP基因的5' UTR。TOP基因的特徵典型地在於5'末端寡嘧啶(TOP)束的存在。此外，大多數TOP基因的特徵在於生長相關的轉譯調節。然而，具有組織特異性轉譯調節的TOP基因也是已知的。於某些實施例，來源於TOP基因的5' UTR的5' UTR缺乏5' TOP模體(寡嘧啶束)(例如，美國公開號2017/0029847、2016/0304883、2016/0235864和2016/0166710，將其中的每一個通過引用併入本文)。
於某些實施例，5' UTR來源於核糖體蛋白大32(L32)基因(美國公開號2017/0029847，同上)。
於某些實施例，5' UTR來源於羥基類固醇(17-b)脫氫酶4基因(HSD17B4)的5' UTR(美國公開號2016/0166710，同上)。
於某些實施例，5' UTR來源於ATP5A1基因的5' UTR(美國公開號2016/0166710，同上)。
於一些實施例，使用內部核糖體進入位點(IRES)代替5' UTR。
於一些實施例，5'UTR包含SEQ ID NO: 89中所示並再現於下文中的核酸序列： GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQ ID NO: 89)。
於一些實施例，3'UTR包含SEQ ID NO: 90中所示並再現於下文中的核酸序列： CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQ ID NO: 90)。
5' UTR和3' UTR進一步詳細描述於WO2012/075040中，將其通過引用併入本文。 C. 多腺苷酸化的尾
如本文所用，術語“聚(A)序列”、“聚(A)尾”和“聚(A)區”是指mRNA分子的3'端處的腺苷核苷酸的序列。聚(A)尾可以為mRNA賦予穩定性，並且保護其免於外切核酸酶降解。聚(A)尾可以增強轉譯。於一些實施例，聚(A)尾是基本上同聚的。例如，100個腺苷核苷酸的聚(A)尾可以具有基本上100個核苷酸的長度。於某些實施例，聚(A)尾可以被至少一個與腺苷核苷酸不同的核苷酸(例如，不是腺苷核苷酸的核苷酸)中斷。例如，100個腺苷核苷酸的聚(A)尾可以具有超過100個核苷酸的長度(包含100個腺苷核苷酸和與腺苷核苷酸不同的至少一個核苷酸或一段核苷酸)。於某些實施例，聚(A)尾包含序列 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO: 91)。
如本文所用的“聚(A)尾”典型地涉及RNA。然而，在本揭露的上下文中，所述術語同樣涉及DNA分子中的相應序列(例如，“聚(T)序列”)。
聚(A)尾可以包含約10至約500個腺苷核苷酸、約10至約200個腺苷核苷酸、約40至約200個腺苷核苷酸或約40至約150個腺苷核苷酸。聚(A)尾的長度可以是至少約10、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500個腺苷核苷酸。
於核酸是RNA的一些實施例，所述核酸的聚(A)尾是在RNA體外轉錄期間從DNA範本獲得的。於某些實施例，在不從DNA範本轉錄的情況下，聚(A)尾是在體外通過常用的化學合成方法獲得的。於各種實施例，使用可商購的多腺苷酸化套組和相應的方案通過對RNA進行酶促多腺苷酸化(在RNA體外轉錄後)，或者可替代地，通過使用固定化的聚(A)聚合酶，例如使用如WO 2016/174271中所述的方法和手段，產生聚(A)尾。
所述核酸可以包含通過酶促多腺苷酸化獲得的聚(A)尾，其中大部分核酸分子包含約100(+/-20)至約500(+/-50)或約250(+/-20)個腺苷核苷酸。
於一些實施例，所述核酸可以包含來源於範本DNA的聚(A)尾，並且可以另外包含通過酶促多腺苷酸化產生的至少一個另外的聚(A)尾，例如，如WO2016/091391中所述。
於某些實施例，所述核酸包含至少一個多腺苷酸化訊息。
於各種實施例，所述核酸可以包含至少一個聚(C)序列。
如本文所用的術語“聚(C)序列”旨在是多達約200個胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸的序列。於一些實施例，所述聚(C)序列包含約10至約200個胞嘧啶核苷酸、約10至約100個胞嘧啶核苷酸、約20至約70個胞嘧啶核苷酸、約20至約60個胞嘧啶核苷酸或約10至約40個胞嘧啶核苷酸。於一些實施例，所述聚(C)序列包含約30個胞嘧啶核苷酸。 D. 化學修飾
本文公開的mRNA可以是經修飾的或未經修飾的。於一些實施例，所述mRNA可以包含至少一個化學修飾。於一些實施例，本文公開的mRNA可以含有一個或多個典型地增強RNA穩定性的修飾。例示性修飾可以包括骨架修飾、糖修飾或鹼基修飾。於一些實施例，所公開的mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸類似物(經修飾的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸類似物包括但不限於嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。於某些實施例，所公開的mRNA可以由嘌呤和嘧啶的經修飾的核苷酸類似物或衍生物合成，所述類似物或衍生物如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-異戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-異戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙醯基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-鳥嘌呤、2-甲基-鳥嘌呤、2,2-二甲基-鳥嘌呤、7-甲基-鳥嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氫-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羥基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基胺基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸 (v)、1-甲基-假尿嘧啶、辮苷、β-D-甘露糖基-辮苷、胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮鳥苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。
於一些實施例，所公開的mRNA可以包含至少一個化學修飾，所述化學修飾包括但不限於假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
於一些實施例，所述化學修飾選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其組合。
於一些實施例，所述化學修飾包括N1-甲基假尿苷。
於一些實施例，所述mRNA中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
於一些實施例，所述ORF中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
此類類似物的製備描述於例如美國專利號4,373,071、美國專利號4,401,796、美國專利號4,415,732、美國專利號4,458,066、美國專利號4,500,707、美國專利號4,668,777、美國專利號4,973,679、美國專利號5,047,524、美國專利號5,132,418、美國專利號5,153,319、美國專利號5,262,530和美國專利號5,700,642中。 E. mRNA 合成
本文公開的mRNA可以根據多種方法中的任一種合成。例如，根據本揭露的mRNA可以經由體外轉錄(IVT)合成。一些用於體外轉錄的方法描述於例如Geall等人 (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159；Brunelle等人 (2013) Methods Enzymol. 530:101-14中。簡而言之，典型地用以下進行IVT：含有啟動子的線性或環狀DNA範本、核糖核苷三磷酸庫、可以包括DTT和鎂離子的緩衝系統、適當的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制劑。確切的條件可以根據具體應用而變化。這些試劑的存在通常在最終mRNA產物中是不希望的，並且這些試劑可以被認為是雜質或污染物，可以將它們純化或去除以提供適合治療用途的清潔的和/或同質的mRNA。雖然於一些實施例從體外轉錄反應提供的mRNA可能是需要的，但根據本揭露可以使用其他mRNA來源，包括從細菌、真菌、植物和/或動物產生的野生型mRNA。 VIII. 用於製備本發明的 LNP 疫苗的方法
本發明的LNP可以通過本領域目前已知的各種技術製備。例如，可以根據常規技術製備多層囊泡(MLV)，如通過使所選擇的脂質沈積在合適的容器或器皿的內壁上(通過將脂質溶解在適當的溶劑中，然後蒸發溶劑以在器皿內部留下薄膜)或通過噴霧乾燥來製備。然後可以伴隨渦旋運動向器皿中添加水相，這導致MLV的形成。然後可以通過均質化、超聲處理或擠出多層囊泡來形成單層囊泡(ULV)。另外，可以通過洗滌劑去除技術形成單層囊泡。
各種方法描述於US 2011/0244026、US 2016/0038432、US 2018/0153822、US 2018/0125989和PCT/US2020/043223(2020年7月23日提交)中，並且可以用於實踐本揭露。一種例示性方法需要通過將其與脂質的混合物混合來包封mRNA，而無需首先將脂質預形成脂質奈米顆粒，如US 2016/0038432中所述。另一種例示性方法需要通過將預形成的LNP與mRNA混合來包封mRNA，如US 2018/0153822中所述。
於一些實施例，製備裝載mRNA的LNP的方法包括將一種或多種溶液加熱到高於環境溫度的溫度的步驟，所述一種或多種溶液是包含預形成的脂質奈米顆粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的混合溶液。於一些實施例，所述方法包括在混合步驟之前加熱mRNA溶液和預形成的LNP溶液中的一種或兩種的步驟。於一些實施例，所述方法包括在混合步驟期間加熱包含預形成的LNP的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的溶液中的一種或多種。於一些實施例，所述方法包括在混合步驟之後加熱LNP包封的mRNA的步驟。於一些實施例，一種或多種溶液被加熱到的溫度是或高於約30ºC、37ºC、40ºC、45ºC、50ºC、55ºC、60ºC、65ºC或70ºC。於一些實施例，一種或多種溶液被加熱到的溫度範圍為從約25ºC-70ºC、約30ºC-70ºC、約35ºC-70ºC、約40ºC-70ºC、約45ºC-70ºC、約50ºC-70ºC或約60ºC-70ºC。於一些實施例，溫度是約65ºC。
可以使用各種方法來製備適用於本揭露的mRNA溶液。於一些實施例，可以將mRNA直接溶解在本文所述的緩衝溶液中。於一些實施例，mRNA溶液可以通過將mRNA儲備溶液與緩衝溶液混合，之後與用於包封的脂質溶液混合來產生。於一些實施例，mRNA溶液可以通過將mRNA儲備溶液與緩衝溶液混合，之後立即與用於包封的脂質溶液混合來產生。於一些實施例，合適的mRNA儲備溶液可以在水或緩衝液中含有濃度為或大於約0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.5 mg/ml、或1.6 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml、3.0 mg/ml、3.5 mg/ml、4.0 mg/ml、4.5 mg/ml或5.0 mg/ml的mRNA。
於一些實施例，使用泵將mRNA儲備溶液與緩衝溶液混合。例示性泵包括但不限於齒輪泵、蠕動泵和離心泵。典型地，將緩衝溶液以大於mRNA儲備溶液的速率的速率混合。例如，緩衝溶液可以按mRNA儲備溶液的速率的至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率混合。於一些實施例，緩衝溶液以範圍在約100-6000 ml/分鐘之間(例如，約100-300 ml/分鐘、300-600 ml/分鐘、600-1200 ml/分鐘、1200-2400 ml/分鐘、2400-3600 ml/分鐘、3600-4800 ml/分鐘、4800-6000 ml/分鐘或60-420 ml/分鐘)的流速進行混合。於一些實施例，將緩衝溶液以為或大於約60 ml/分鐘、100 ml/分鐘、140 ml/分鐘、180 ml/分鐘、220 ml/分鐘、260 ml/分鐘、300 ml/分鐘、340 ml/分鐘、380 ml/分鐘、420 ml/分鐘、480 ml/分鐘、540 ml/分鐘、600 ml/分鐘、1200 ml/分鐘、2400 ml/分鐘、3600 ml/分鐘、4800 ml/分鐘或6000 ml/分鐘的流速混合。
於一些實施例，將mRNA儲備溶液以範圍在約10-600 ml/分鐘之間(例如，約5-50 ml/分鐘、約10-30 ml/分鐘、約30-60 ml/分鐘、約60-120 ml/分鐘、約120-240 ml/分鐘、約240-360 ml/分鐘、約360-480 ml/分鐘或約480-600 ml/分鐘)的流速混合。於一些實施例，將mRNA儲備溶液以為或大於約5 ml/分鐘、10 ml/分鐘、15 ml/分鐘、20 ml/分鐘、25 ml/分鐘、30 ml/分鐘、35 ml/分鐘、40 ml/分鐘、45 ml/分鐘、50 ml/分鐘、60 ml/分鐘、80 ml/分鐘、100 ml/分鐘、200 ml/分鐘、300 ml/分鐘、400 ml/分鐘、500 ml/分鐘或600 ml/分鐘的流速混合。
將所需mRNA摻入脂質奈米顆粒中的過程稱為“裝載”。例示性方法描述於Lasic等人, FEBS Lett.(1992) 312:255-8中。LNP摻入的核酸可以完全或部分位於脂質奈米顆粒的內部空間中，脂質奈米顆粒的雙層膜內，或與脂質奈米顆粒膜的外表面締合。將mRNA摻入脂質奈米顆粒中在本文中也稱為“包封”，其中核酸完全或基本上包含在脂質奈米顆粒的內部空間內。
合適的LNP可以按各種尺寸製備。於一些實施例，減小的脂質奈米顆粒尺寸與mRNA的更有效遞送相關。適當LNP尺寸的選擇可以考慮靶細胞或組織的部位以及在某種程度上考慮製備脂質奈米顆粒將用於的應用。
本領域已知的各種方法可用於改變脂質奈米顆粒群的尺寸。本文中優選的方法利用Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical)來測量LNP細微性。在一種方案中，將10 μl的LNP樣品與990 μl的10%海藻糖混合。將此溶液裝載到比色皿中，然後放入Zetasizer機器中。z-平均直徑(nm)或累積量平均值被認為是樣品中LNP的平均尺寸。Zetasizer機器還可以用於通過使用動態光散射(DLS)和自相關函數的累積量分析來測量多分散性指數(PDI)。可以通過對所形成的LNP進行超聲處理來減小平均LNP直徑。間歇式超聲處理循環可以與准彈性光散射(QELS)評估交替進行，以指導有效的脂質奈米顆粒合成。
於一些實施例，大部分純化的LNP(即，大於約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的LNP)的尺寸為約70-150 nm(例如，約145 nm、約140 nm、約135 nm、約130 nm、約125 nm、約120 nm、約115 nm、約110 nm、約105 nm、約100 nm、約95 nm、約90 nm、約85 nm或約80 nm)。於一些實施例，基本上所有(例如，大於80%或90%)的純化的脂質奈米顆粒的尺寸為約70-150 nm(例如，約145 nm、約140 nm、約135 nm、約130 nm、約125 nm、約120 nm、約115 nm、約110 nm、約105 nm、約100 nm、約95 nm、約90 nm、約85 nm或約80 nm)。
於一些實施例，本發明的組合物中的LNP的平均尺寸小於150 nm、小於120 nm、小於100 nm、小於90 nm、小於80 nm、小於70 nm、小於60 nm、小於50 nm、小於30 nm或小於20 nm。
於一些實施例，本發明的組合物中的大於約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的LNP的尺寸的範圍為從約40-90 nm(例如，約45-85 nm、約50-80 nm、約55-75 nm、約60-70 nm)或約50-70 nm(例如，55-65 nm)，這特別適合於經由霧化進行肺部遞送。
於一些實施例，本揭露提供的醫藥組合物中的LNP的分散性或分子尺寸異質性量度(PDI)小於約0.5。於一些實施例，LNP的PDI小於約0.5、小於約0.4、小於約0.3、小於約0.28、小於約0.25、小於約0.23、小於約0.20、小於約0.18、小於約0.16、小於約0.14、小於約0.12、小於約0.10或小於約0.08。PDI可以如上所述通過Zetasizer機器來測量。
於一些實施例，本文提供的醫藥組合物中大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的純化的LNP在每個單獨的顆粒內包封mRNA。於一些實施例，醫藥組合物中基本上所有(例如，大於80%或90%)的純化的脂質奈米顆粒在每個單獨的顆粒內包封mRNA。於一些實施例，脂質奈米顆粒的包封效率在50%與99%之間；或者大於約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%。典型地，用於在本文中使用的脂質奈米顆粒的包封效率為至少90(例如，至少91%、92%、93%、94%或95%)。
於一些實施例，LNP的N/P比在1與10之間。於一些實施例，脂質奈米顆粒的N/P比高於1、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7或約8。於進一步的實施例，本文的典型LNP的N/P比為4。
於一些實施例，根據本揭露的醫藥組合物含有至少約0.5 µg、1 µg、5 µg、10 µg、100 µg、500 µg或1000 µg包封mRNA。於一些實施例，醫藥組合物含有約0.1 µg至1000 µg、至少約0.5 µg、至少約0.8 µg、至少約1 µg、至少約5 µg、至少約8 µg、至少約10 µg、至少約50 µg、至少約100 µg、至少約500 µg或至少約1000 µg包封mRNA。
於一些實施例，mRNA可以通過化學合成或通過DNA範本的體外轉錄(IVT)來製備。用於製備和純化mRNA的例示性方法描述於實例1中。在此方法中，在IVT過程中，使用cDNA範本來產生mRNA轉錄物，並且通過DNA酶降解DNA範本。通過深度過濾和切向流過濾(TFF)純化轉錄物。通過添加帽和尾進一步修飾純化的轉錄物，並且通過深度過濾和TFF再次純化修飾的RNA。
然後在水性緩衝液中製備mRNA，並且將其與含有LNP的脂質組分的兩親溶液混合。用於溶解LNP的四種脂質組分的兩親溶液可以是醇溶液。於一些實施例，所述醇是乙醇。所述水性緩衝液可以是例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或琥珀酸鹽緩衝液，並且可以具有約3.0-7.0(例如，約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0或約6.5)的pH。所述緩衝液可以含有其他組分，諸如鹽(例如，鈉、鉀和/或鈣鹽)。於特定實施例，所述水性緩衝液具有1 mM檸檬酸鹽、150 mM NaCl，pH 4.5。
用於製備mRNA-LNP組合物的例示性的非限制性方法描述於實例1中。所述方法涉及將緩衝的mRNA溶液與脂質在乙醇中的溶液以受控的均勻方式混合，其中在整個混合過程中維持脂質 : mRNA的比率。在此說明性例子中，mRNA在含有檸檬酸一水合物、檸檬酸三鈉二水合物和氯化鈉的水性緩衝液中呈現。將mRNA溶液添加到溶液(1 mM檸檬酸鹽緩衝液、150 mM NaCl，pH 4.5)中。將四種脂質(例如，陽離子脂質、PEG化的脂質、基於膽固醇的脂質和輔助脂質)的脂質混合物溶解在乙醇中。將水性mRNA溶液和乙醇脂質溶液在具有幾乎“無脈衝”的泵系統的“T”混合器中以4 : 1的體積比混合。然後對所得混合物進行下游純化和緩衝液交換。可以使用透析盒或TFF系統實現緩衝液交換。可以在經由T混合過程形成之後立即使用TFF對所得的新生LNP進行濃縮和緩衝液交換。滲濾過程是連續操作，通過以與滲透物流相同的速率添加適當的緩衝液使體積保持不變。 IX.      mRNA-LNP 疫苗的包裝和使用
mRNA-LNP疫苗可以被配製或包裝用於腸胃外(例如，肌內、皮內或皮下)投予或鼻咽(例如，鼻內)投予。疫苗組合物可以呈即用配製品的形式，其中LNP組合物被凍乾並在即將使用前用生理緩衝液(例如，PBS)重構。疫苗組合物還可以以水溶液或冷凍水溶液的形式運送和提供，並且可以在不重構的情況下直接投予受試者(如果先前冷凍，則在解凍後投予)。
因此，本揭露提供了一種製品(諸如套組)，其在單個容器中提供mRNA-LNP疫苗，或者在一個容器中提供mRNA-LNP疫苗並且在另一個容器中提供用於重構的生理緩衝液。所述一個或多個容器可以含有單次使用劑量或多次使用劑量。所述容器可以是預處理的玻璃小瓶或安瓿。所述製品也可以包括使用說明書。
於某些實施例，提供mRNA-LNP疫苗用於肌內(IM)注射。可以將所述疫苗注射到受試者，例如注射於其上臂三角肌處。於一些實施例，所述疫苗在預填充的注射筒或注射器(例如，單室的或多室的)中提供。於一些實施例，提供所述疫苗用於吸入，並且在預填充的泵、霧化器或吸入器中提供。
可以將mRNA-LNP疫苗以預防有效量投予有需要的受試者，所述預防有效量即提供針對靶病原體的足夠免疫保護持續足夠量的時間(例如，一年、兩年、五年、十年或一生)的量。足夠的免疫保護可以是例如預防或減輕與病原體感染相關的症狀。於一些實施例，將多劑(例如，兩劑)的疫苗注射給有需要的受試者，以實現所需的預防效果。劑量(例如，初免劑量和加強劑量)可以隔開例如1周、2周、3周、4周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、一年、兩年、五年或十年的間隔。
於一些實施例，單次劑量的mRNA-LNP疫苗含有1-50 µg的mRNA(例如，單價的或多價的)。例如，單次劑量可以含有約2.5 µg、約5 µg、約7.5 µg、約10 µg、約12.5 µg或約15 µg的mRNA用於肌內(IM)注射。於進一步的實施例，多價單次劑量的LNP疫苗含有多個(例如，2、3或4個)種類的LNP，每個種類針對不同的抗原，並且每個種類的LNP具有例如2.5 µg、約5 µg、約7.5 µg、約10 µg、約12.5 µg或約15 µg的mRNA量。
除非本文另外定義，否則結合本揭露所用的科學和技術術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下文描述了例示性方法和材料，但在本揭露的實踐或測試中也可以使用與本文所述的那些方法和材料類似或等效的方法和材料。在矛盾的情況下，將以包括定義在內的本說明書為准。通常，本文所述的結合細胞和組織培養、分子生物學、病毒學、免疫學、微生物學、遺傳學、分析化學、合成有機化學、醫學和藥物化學以及蛋白質和核酸化學和雜交使用的命名法以及其技術是本領域熟知且常用的那些。根據製造商的說明書如本領域通常所實現的或如本文所述的那樣進行酶促反應和純化技術。進一步地，除非上下文另有要求，否則單數術語應當包括複數，並且複數術語應當包括單數。於整個本說明書和實施例，詞語“具有(have)”和“包含(comprise)”或變型如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”應被理解為暗示包括所陳述的整數或整數組，但是不排除任何其他整數或整數組。將本文提及的所有出版物和其他參考文獻都通過引用以其整體併入。儘管本文引用了許多文檔，但是此引用並不意味著承認這些文檔中的任一個形成本領域的一般常識的一部分。如本文所用，如應用於一個或多個目的值的術語“大約”或“約”是指與所述的參考值類似的值。於某些實施例，除非另有說明或另外從上下文顯而易見，所述術語是指落入所陳述的參考值的任一方向(大於或小於)的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少內的值的範圍。 X. 載體
在一方面，本文公開了包含本文公開的mRNA組合物的載體。可以將編碼目的蛋白質的RNA序列(例如，編碼抗原性原核多肽的mRNA)選殖到許多類型的載體中。例如，可以將核酸選殖到載體中，所述載體包括但不限於質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特別感興趣的載體可以包括表現載體、複製載體、探針產生載體、測序載體和為體外轉錄而優化的載體。
於某些實施例，所述載體可以用於在宿主細胞中表現mRNA。於各種實施例，所述載體可以用作IVT的範本。適合治療用途的最佳轉譯的IVT mRNA的構築詳細披露於Sahin等人 (2014). Nat. Rev. Drug Discov. 13, 759-780；Weissman (2015). Expert Rev. Vaccines 14, 265-281中。
於一些實施例，本文公開的載體可以從5'至3'包括至少以下：RNA聚合酶啟動子；編碼5' UTR的多核苷酸序列；編碼ORF的多核苷酸序列；編碼3' UTR的多核苷酸序列；以及編碼至少一種RNA適體的多核苷酸序列。於一些實施例，本文公開的載體可以包含編碼聚(A)序列和/或多腺苷酸化訊息的多核苷酸序列。
已知多種RNA聚合酶啟動子。於一些實施例，所述啟動子可以是T7 RNA聚合酶啟動子。其他有用的啟動子可以包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。用於T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列是已知的。
本文還公開了包含本文公開的載體或RNA組合物的宿主細胞(例如，哺乳動物細胞，例如，人類細胞)。
可以使用多種不同方法(例如，可商購的方法)中的任一種將多核苷酸導入靶細胞，中，所述方法包括但不限於電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，德國科隆))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments，麻塞諸塞州波士頓)或Gene Pulser II(BioRad，科羅拉多州丹佛)、Multiporator(Eppendorf，德國漢堡)、使用脂質轉染的陽離子脂質體介導的轉染、聚合物包封、肽介導的轉染、生物射彈顆粒遞送系統諸如“基因槍”(參見例如，Nishikawa等人 (2001). Hum Gene Ther. 12(8):861-70或TransIT-RNA轉染套組(Mirus，威斯康辛州麥迪森)。
用於將多核苷酸引入宿主細胞中的化學手段包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠和基於脂質的系統(包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體)。用作體外和體內遞送媒劑的例示性膠體系統是脂質體(例如，人造膜囊)。
不管使用何種方法將外源核酸引入宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露於本揭露的抑制劑，為了證實宿主細胞中mRNA序列的存在，可以進行多種測定。 XI. 自我複製 RNA 、反式複製 RNA 和非複製 RNA
自我複製RNA：
可以通過使用來源於例如α病毒的複製元件並且用編碼目的蛋白(例如，抗原性原核多肽)的核苷酸序列取代結構病毒蛋白來產生自我複製(或自我擴增)RNA。自我複製RNA典型地是在遞送到細胞後可以直接轉譯的正股分子，並且這種轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，所述RNA聚合酶然後從遞送的RNA產生反義轉錄物和有義轉錄物兩者。因此，遞送的RNA導致產生多個子RNA。這些子RNA以及共線亞基因體轉錄物可以自身轉譯以提供編碼抗原的原位表現，或者可以被轉錄以提供與遞送的RNA具有相同意義的進一步轉錄物，所述轉錄物被轉譯以提供抗原的原位表現。此系列轉錄的總體結果是引入的複製子RNA的數量大量擴增，並且編碼的抗原因此成為所述細胞的主要多肽產物。
一種以這種方式實現自我複製的合適的系統是使用基於α病毒的複製子。這些複製子是正股(正義股)RNA，其在遞送至細胞後導致複製酶(或複製酶-轉錄酶)的轉譯。複製酶被轉譯成多聚蛋白，所述多聚蛋白自動切割以提供複製複合物，所述複合物產生正股遞送RNA的基因體股拷貝。這些負(-)股轉錄物本身可以被轉錄以產生正股親本RNA的進一步拷貝，並且也產生編碼抗原的亞基因體轉錄物。因此，亞基因體轉錄物的轉譯導致被感染細胞對所述抗原的原位表現。合適的α病毒複製子可以使用來自辛德比斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、東方馬腦炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)等的複製酶。可以使用突變體或野生型病毒序列，例如，VEEV的減毒TC83突變體已經用於複製子中，參見以下參考文獻：WO 2005/113782，將其通過引用併入本文。
於一實施例，本文所述的每種自我複製RNA編碼 (i) RNA依賴性RNA聚合酶，其可以從自我複製RNA分子轉錄RNA，和 (ii) 蛋白抗原。所述聚合酶可以是α病毒複製酶，例如，包含α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一種或多種。除了非結構複製酶多聚蛋白之外，天然α病毒基因體還編碼結構病毒體蛋白，而於某些實施例，自我複製RNA分子不編碼α病毒結構蛋白。因此，自我複製RNA可能導致細胞中自身基因體RNA拷貝的產生，但不導致含RNA病毒體的產生。無法產生這些病毒體意味著，與野生型α病毒不同，自我複製RNA分子無法以感染性形式使自身永存。在野生型病毒中永存所必需的α病毒結構蛋白不存在本揭露的自我複製RNA，並且它們的位置被一個或多個編碼目的免疫原的基因所佔據，使得亞基因體轉錄物編碼免疫原，而不是α病毒結構病毒體蛋白。自我複製RNA進一步詳細描述在WO 2011005799中，將其通過引用併入本文。
反式複製RNA：
反式複製(或反式擴增)RNA具有與上述自我複製RNA相似的元件。然而，對於反式複製RNA，使用兩個單獨的RNA分子。第一RNA分子編碼上述RNA複製酶(例如，α病毒複製酶)，並且第二RNA分子編碼目的蛋白(例如，抗原性原核多肽)。RNA複製酶可以複製第一RNA分子和第二RNA分子中的一個或兩個，從而大大增加編碼目的蛋白的RNA分子的拷貝數。反式複製RNA進一步詳細描述於WO 2017162265中，將其通過引用併入本文。
非複製RNA：
非複製(或非擴增)RNA是沒有複製本身的能力的RNA。 XI. 醫藥組合物
根據本揭露的醫藥組合物典型地包含核酸，特別是RNA，且更特別是mRNA，以及醫藥上可接受的載劑，或醫藥上可接受的賦形劑或醫藥上可接受的稀釋劑，它們使得所述組合物尤其適合於治療用途。短語“醫藥上可接受的”在本文中用於指在合理的醫學判斷範圍內適用於與人和動物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理的收益/風險比相稱的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。
所述醫藥組合物可以例如是免疫原性組合物，即當投予受試者時引發免疫反應的組合物。應當理解，術語“免疫原性組合物”、“疫苗組合物”和“疫苗”在本文中可互換使用並且因此意在具有同等含義。
本揭露的醫藥組合物還可以包含一種或多種另外的組分，諸如小分子免疫增強劑(例如，TLR促效劑)。本揭露的醫藥組合物還可以包含用於RNA的遞送系統，諸如脂質體、水包油乳劑或微粒。於一些實施例，所述醫藥組合物包含脂質奈米顆粒(LNP)。於某些實施例，所述組合物包含包封在LNP內的編碼抗原的核酸分子。 XII. 疫苗接種的方法
可以將本文公開的核酸(例如，mRNA)疫苗投予受試者以誘導針對抗原性原核多肽的免疫反應，其中相對於沒有用本文公開的核酸疫苗進行疫苗接種的受試者中的抗抗原抗體力價，或相對於針對原核多肽的替代性疫苗，在疫苗接種後所述受試者中的抗抗原抗體力價有所增加。“抗抗原抗體”是與抗原特異性結合的血清抗體。
在一個方面，本揭露提供了一種在有需要的受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括向所述受試者投予有效量的本文所述的核酸(例如，mRNA)疫苗，任選地肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
在另一方面，本揭露提供了一種治療或預防有需要的受試者的原核生物感染的方法，所述方法包括向所述受試者投予有效量的本文所述的核酸疫苗，任選地肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
在另一方面，本揭露提供了本文所述的核酸疫苗用於製造用於在有需要的受試者中引發免疫反應的藥物的用途。
在另一方面，本揭露提供了本文所述的核酸疫苗用於製造用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染的藥物的用途。
在另一方面，本揭露提供了本文所述的核酸疫苗，其用於在有需要的受試者中引發免疫反應。
在另一方面，本揭露提供了本文所述的核酸疫苗，其用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染。
在一個方面，本揭露提供了在宿主細胞中分泌抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予本文所述的核酸疫苗。
在另一方面，本揭露提供了在宿主細胞的表面上展示抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予本文所述的核酸疫苗。
本發明包括以下實施例：
實施例1.       一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
實施例2.       根據實施例1所述的核酸，其中所述ORF進一步包含編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
實施例3.       根據實施例1或2所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽來源於能夠感染人的病毒中的病毒序列。
實施例4.       根據實施例1-3中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽來源於選自以下的病毒序列：流感病毒分泌訊息肽序列，以及選自以下的非流感病毒分泌訊息肽序列：SARS CoV-2分泌訊息肽序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)分泌訊息肽序列、麻疹病毒分泌訊息肽序列、風疹病毒分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒分泌訊息肽序列、伊波拉病毒分泌訊息肽序列、天花病毒分泌訊息肽序列和狂犬病病毒分泌訊息肽序列。
實施例5.       根據實施例1-4中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽選自：流感病毒血凝素(HA)分泌訊息肽序列、SARS CoV-2刺突分泌訊息肽序列、VZV gB分泌訊息肽序列、VZV gE分泌訊息肽序列、VZV gI分泌訊息肽序列、VZV gK分泌訊息肽序列、麻疹病毒F蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E1蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E2蛋白分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白分泌訊息肽序列、伊波拉病毒GP蛋白分泌訊息肽序列、天花病毒6kDa IC蛋白分泌訊息肽序列和狂犬病病毒G蛋白分泌訊息肽序列，優選地其中所述病毒分泌訊息肽包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA分泌訊息肽序列。
實施例6.       根據實施例5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1X 2LX 3VX 4LX 5TFX 6X 7X 8X 9A(SEQ ID NO: 145)，其中X 1選自A和V；X 2選自I和K；X 3選自V和L；X 4選自L和M；X 5選自Y和C；X 6選自T和A；X 7選自T和A；X 8選自A和T；並且X 9選自N和Y。
實施例7.       根據實施例5或6所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 95-109的胺基酸序列。
實施例8.       根據實施例5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1IIALSX 2ILCLVFX 3(SEQ ID NO: 146)，其中X 1選自T和A；X 2選自Y、N、C和H；並且X 3選自T和A。
實施例9.       根據實施例8所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 110-131的胺基酸序列。
實施例10.     根據實施例5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKAIIVLLMVVTSX 1A(SEQ ID NO: 147)，其中X 1選自S和N。
實施例11.     根據實施例5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MX 1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)，其中X 1選自K和E。
實施例12.     根據實施例10或11所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 132-144的胺基酸序列。
實施例13.     根據實施例1-12中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽序列包含選自以下的胺基酸序列：MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)；MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO: 2)；MKTIIALSYILCLVFA(SEQ ID NO: 3)；MKAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 4)；MFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 5)；MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 6)；MSPCGYYSKWRNRDRPEYRRNLRFRRFFSSIHPNAAAGSGFNGPGVFITSVTGVWLCFLCIFSMFVTAVVS(SEQ ID NO: 7)；MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRA(SEQ ID NO: 8)；MFLIQCLISAVIFYIQVTNA(SEQ ID NO: 9)；MQALGIKTEHFIIMCLLSGHA(SEQ ID NO: 10)；MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTG(SEQ ID NO: 11)；MGAAAALTAVVLQGYNPPAYG(SEQ ID NO: 12)；MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA(SEQ ID NO: 13)；MKVFLVTCLGFAVFSSSVC(SEQ ID NO: 14)；MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS(SEQ ID NO: 15)；MRSLIIFLLFPSIIYS(SEQ ID NO: 16)；以及MVPQALLFVPLLVFPLCFG(SEQ ID NO: 184)。
實施例14.     根據實施例13所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽包含MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列。
實施例15.     根據實施例1-14中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的N末端。
實施例16.     根據實施例1-14中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的C末端。
實施例17.     根據實施例1-16中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
實施例18.     根據實施例1-17中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽具有至少0.8、至少0.85、至少0.90或至少0.95的SignalP切割概率得分，如使用SignalP 6.0確定的。
實施例19.     根據實施例1-18中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽具有至少0.8、至少0.85、至少0.90或至少0.95的SignalP訊息肽似然性得分，如使用SignalP 6.0確定的。
實施例20.     根據實施例2-19中任一項所述的核酸，其中所述TMB：(a) 包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b) 包含至少50%、至少55%或至少60%的疏水性胺基酸殘基，所述疏水性胺基酸殘基優選選自：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c) 包含至少一個α螺旋。
實施例21.     根據實施例2-20中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
實施例22.     根據實施例2-11中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於非人類序列。
實施例23.     根據實施例18-22中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於原核跨膜蛋白，並且其中所述TMB是所述原核跨膜蛋白的TMB。
實施例24.     根據實施例18-23中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽不是來源於原核跨膜蛋白。
實施例25.     根據實施例24所述的核酸，其中所述TMB來源於病毒序列。
實施例26.     根據實施例25所述的核酸，其中所述TMB來源於選自以下的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
實施例27.     根據實施例26所述的核酸，其中所述TMB選自：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
實施例28.     根據實施例18-22和24-27中任一項所述的核酸，其中所述TMB包含選自以下的胺基酸序列：ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)；ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)；ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)；STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)；WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)；FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)；AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)；IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)；YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)；IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)；LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)；WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)；IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)；WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
實施例29.     根據實施例28所述的核酸，其中所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
實施例30.     根據實施例2和18-29所述的核酸，其中所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
實施例31.     根據實施例2和18-30中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
實施例32.     根據實施例2和18-30中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
實施例33.一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性多肽、優選抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列，其中所述TMB與所述抗原性多肽是異源的，其中任選地，所述ORF進一步包含編碼至少一種分泌訊息肽、優選病毒分泌訊息肽、更優選如前述請求項中任一項所述的病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
實施例34.     一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含：- 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及- 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
實施例35.     根據實施例34所述的核酸，其中所述TMB：(a) 包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b) 包含至少50%、至少55%或至少60%的疏水性胺基酸殘基，所述疏水性胺基酸殘基優選選自：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c) 包含至少一個α螺旋。
實施例36.根據實施例34或35所述的核酸，其中所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
實施例37.     根據實施例36所述的核酸，其中所述TMB來源於非人類序列。
實施例38.     根據實施例1-32中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於原核跨膜蛋白，並且其中所述TMB是所述異源原核跨膜蛋白的跨膜結構域。
實施例39.根據實施例35-38中任一項所述的核酸，其中所述抗原性多肽不是來源於跨膜蛋白。
實施例40.     根據實施例35-37和39中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於病毒序列。
實施例41.     根據實施例33-35、39和40所述的核酸，其中所述TMB來源於選自以下的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
實施例42.     根據請求項41所述的核酸，其中所述TMB選自：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
實施例43.     根據實施例42所述的核酸，其中所述TMB包含選自以下的胺基酸序列： ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)；ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)；ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)；STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)；WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)；FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)；AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)；IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)；YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)；IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)；LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)；WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)；IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)；WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及 VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
實施例44.     根據實施例43所述的核酸，其中所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
實施例45.     根據實施例34-44中任一項所述的核酸，其中所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
實施例46.     根據實施例34-44中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
實施例47.     根據實施例34-44中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
實施例48.     根據實施例34-47中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於選自以下的屬的細菌：醋桿菌屬、不動桿菌屬、放線菌屬、氣球菌屬、土壤桿菌屬、無形體屬、固氮根瘤菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、巴爾通體屬、鮑特菌屬、疏螺旋體屬、布魯氏菌屬、伯克霍爾德菌屬、鞘桿菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、嗜衣原體屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、柯克斯體屬、丙酸桿菌屬( Cutibacterium)、埃立克體屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、埃希菌屬、弗朗西絲菌屬、梭形桿菌屬、加德納菌屬、嗜血桿菌屬、螺桿菌屬、克雷伯菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、軍團菌屬、李斯特菌屬、甲烷桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、莫拉菌屬、分枝桿菌屬、支原體屬、奈瑟菌屬、巴斯德菌屬、片球菌屬、消化鏈球菌屬、卟啉單胞菌屬、普雷沃菌屬、丙酸桿菌屬( Propionibacterium)、假單胞菌屬、根瘤菌屬、立克次體屬、羅卡利馬體屬、羅思氏菌屬、沙門菌屬、沙雷菌屬、志賀菌屬、八疊球菌屬、螺菌屬、螺旋體屬、葡萄球菌屬、寡養單胞菌屬、鏈桿菌屬、鏈球菌屬、四聯球菌屬、密螺旋體屬、弧菌屬、 Viridans、沃爾巴克氏體屬和耶爾森菌屬，優選來自選自以下的物種的細菌：橙黃色醋桿菌、鮑氏不動桿菌、以色列放線菌、放射形土壤桿菌、根癌土壤桿菌、嗜吞噬細胞無形體、莖瘤固氮根瘤菌、棕色固氮菌、炭疽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、紡錘芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇雲金芽孢桿菌、脆弱擬桿菌、牙齦擬桿菌、產黑色素擬桿菌、漢賽巴爾通體、五日熱巴爾通體、支氣管敗血鮑特菌、百日咳鮑特菌、伯氏疏螺旋體、流產布魯氏菌、馬爾他布魯氏菌、豬種布魯氏菌、鼻疽伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、肉芽腫鞘桿菌、大腸彎曲桿菌、胎兒彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、幽門彎曲桿菌、沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體、鸚鵡嗜熱衣原體、肉毒梭菌、艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、白喉棒狀桿菌、梭形棒狀桿菌、貝納柯克斯體、痤瘡丙酸桿菌( Cutibacterium acnes)、貪婪丙酸桿菌、顆粒丙酸桿菌、納姆丙酸桿菌、胡莫丙酸桿菌、查菲埃立克體、陰溝腸桿菌、鳥腸球菌、耐久腸球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌、馬婁腸球菌、大腸桿菌、土拉熱弗朗西絲菌、具核梭形桿菌、***加德納菌、杜克雷嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、百日咳嗜血桿菌、***嗜血桿菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乾酪乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜肺軍團菌、單核細胞增生李斯特菌、外部甲烷桿菌、多形微桿菌、藤黃微球菌、卡他莫拉菌、鳥分枝桿菌、牛分枝桿菌、白喉分枝桿菌、胞內分枝桿菌、麻風分枝桿菌、鼠麻風分枝桿菌、草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、結核分枝桿菌、發酵支原體、生殖支原體、人型支原體、穿透支原體、肺炎支原體、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、多殺巴斯德菌、土拉巴斯德菌、消化鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、產黑色素普雷沃菌、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、銅綠假單胞菌、放射形根瘤菌、普氏立克次體、鸚鵡熱立克次體、五日熱立克次體、立氏立克次體、沙眼立克次體、漢賽羅卡利馬體、五日熱羅卡利馬體、齲齒羅思氏菌、腸炎沙門菌、傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、黏質沙雷菌、痢疾志賀菌、迂回螺菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麥芽寡養單胞菌、無乳鏈球菌、鳥鏈球菌、牛鏈球菌、倉鼠鏈球菌、屎鏈球菌、糞鏈球菌、野鼠鏈球菌、雞鏈球菌、乳酸鏈球菌、輕型鏈球菌、緩症鏈球菌、變異鏈球菌、口腔鏈球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、大鼠鏈球菌、唾液鏈球菌、血鏈球菌、遠緣鏈球菌、梅毒密螺旋體、齒垢密螺旋體、霍亂弧菌、逗號弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、草綠色鏈球菌、沃爾巴克氏體、小腸結腸炎耶爾森菌、鼠疫耶爾森菌和假結核耶爾森菌。
實施例49.     根據實施例1-48中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於疏螺旋體屬的細菌，優選選自物種伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、巴伐利亞疏螺旋體、馬約氏疏螺旋體、斯柏曼疏螺旋體、葡萄牙疏螺旋體、比塞蒂疏螺旋體和/或法雷斯疏螺旋體。
實施例50.     根據實施例49所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽是OspA ST1、OspA ST2、OspA ST3、OspA ST4、OspA ST5、OspA ST6、OspA ST7或其片段。
實施例51.     根據實施例50所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽是OspA或其片段或變體，其中所述OspA或其片段或變體包含至少5、至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250個胺基酸，優選地其中所述抗原性原核多肽包含：(a) 來源於OspA ST1的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK(SEQ ID NO: 31)；(b) 來源於OspA ST2的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO: 32)；(c) 來源於OspA ST3的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK(SEQ ID NO: 186)；(d) 來源於OspA ST4的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO: 187)；(e) 來源於OspA ST5的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGKAVEITTLEKLKDALK(SEQ ID NO: 188)；(f) 來源於OspA ST6的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK(SEQ ID NO: 189)；(g) 來源於OspA ST7的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK(SEQ ID NO: 190)；(h) (a)-(g) 的任何組合；(i) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列和根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列；或 (j) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列、根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列、根據 (c) 的來源於OspA ST3的序列、根據 (d) 的來源於OspA ST4的序列、根據 (e) 的來源於OspA ST5的序列、根據 (f) 的來源於OspA ST6的序列和根據 (g) 的來源於OspA ST7的序列。
實施例52.     根據實施例1-48中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於丙酸桿菌屬的細菌，優選選自物種痤瘡丙酸桿菌、貪婪丙酸桿菌、顆粒丙酸桿菌、 namnetense丙酸桿菌和/或肱丙酸桿菌。
實施例53.     根據實施例52所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽是CAMP2。
實施例54.     根據實施例53所述的核酸，其中編碼所述CAMP2或其片段的胺基酸序列與包含SEQ ID NO: 149或SEQ ID NO: 162-172的胺基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
實施例55.     根據實施例52所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽是PITP。
實施例56.     根據實施例54所述的核酸，其中編碼所述PITP或其片段的胺基酸序列與包含SEQ ID NO: 150或SEQ ID NO: 173-183的胺基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
實施例57.     根據實施例1-56中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽包含至少一個突變的醣基化位點，優選至少一個突變的N-連接的醣基化位點。
實施例58.     根據實施例1-57中任一項所述的核酸，其中所述核酸的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
實施例59.     根據實施例1-58中任一項所述的核酸，其中所述ORF的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
實施例60.     根據實施例1-59中任一項所述的核酸，其中編碼所述至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
實施例61.     根據實施例20-60中任一項所述的核酸，其中編碼所述至少一個TMB的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
實施例62.     根據實施例1-61中任一項所述的核酸，其中所述核酸是DNA。
實施例63.     根據實施例1-61中任一項所述的核酸，其中所述核酸是信使RNA(mRNA)，其中特定地，所述mRNA可以是非複製mRNA、自我複製mRNA或反式複製mRNA。
實施例64.     根據實施例63所述的核酸，其中所述mRNA包含至少一個5'非轉譯區(5' UTR)、至少一個3'非轉譯區(3' UTR)和/或至少一個多腺苷酸化(聚(A))序列。
實施例65.     根據實施例63或64所述的核酸，其中所述mRNA包含至少一個化學修飾。
實施例66.     根據實施例63-65中任一項所述的核酸，其中所述mRNA中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
實施例67.     根據實施例63-66中任一項所述的核酸，其中所述ORF中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
實施例68.     根據實施例65-67中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。
實施例69.     根據實施例65-68中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其組合。
實施例70.     根據實施例65-69中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾是N1-甲基假尿苷。
實施例71.     一種組合物，所述組合物包含至少一種根據實施例1-70中任一項所述的核酸。
實施例72.     根據實施例71所述的組合物，所述組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。
實施例73.     根據實施例72所述的組合物，其中所述核酸被包封在所述LNP中。
實施例74.     根據實施例72或73所述的組合物，其中所述LNP包含至少一種陽離子脂質。
實施例75.     根據實施例74所述的組合物，其中所述陽離子脂質是可生物降解的。
實施例76.     根據實施例74所述的組合物，其中所述陽離子脂質不是可生物降解的。
實施例77.     根據實施例74-76中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質是可切割的。
實施例78.     根據實施例74-76中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質不是可切割的。
實施例79.     根據實施例74-78中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質選自OF-02、cKK-E10、OF-Deg-Lin、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、SM-102和ALC-0315
實施例80.     根據實施例74-79中任一項所述的組合物，其中所述LNP進一步包含聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質、基於膽固醇的脂質和輔助脂質。
實施例81.     根據實施例72-80中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為35%至55%的陽離子脂質；- 莫耳比為0.25%至2.75%的聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質；- 莫耳比為20%至45%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為5%至35%的輔助脂質，其中所有莫耳比均是相對於所述LNP的總脂質含量。
實施例82.     根據實施例72-81中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為40%的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%的PEG化的脂質；- 莫耳比為28.5%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為30%的輔助脂質。
實施例83.     根據實施例72-82中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為45%至50%的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%至1.7%的PEG化的脂質；- 莫耳比為38%至43%的基於膽固醇的脂質；以及- 莫耳比為9%至10%的輔助脂質。
實施例84.     根據實施例80-83中任一項所述的組合物，其中所述PEG化的脂質是二肉豆蔻醯基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
實施例85.     根據實施例80-84中任一項所述的組合物，其中所述基於膽固醇的脂質是膽固醇。
實施例86.     根據實施例80-85中任一項所述的組合物，其中所述輔助脂質是1,2-二油醯基-SN-甘油-3-磷醯乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)。
實施例87.     根據實施例72-82和84-86中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為40%的選自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的陽離子脂質；- 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；- 莫耳比為28.5%的膽固醇；以及- 莫耳比為30%的DOPE。
實施例88.     根據實施例72-81和83-86中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為50%的SM-102；- 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000；- 莫耳比為38.5%的膽固醇；以及- 莫耳比為10%的DSPC。
實施例89.     根據實施例72-81和83-86中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為46.3%的ALC-0315；- 莫耳比為1.6%的ALC-0159；- 莫耳比為42.7%的膽固醇；以及- 莫耳比為9.4%的DSPC。
實施例90.     根據實施例72-81和83-86中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含：- 莫耳比為47.4%的ALC-0315；- 莫耳比為1.7%的ALC-0159；- 莫耳比為40.9%的膽固醇；以及- 莫耳比為10%的DSPC。
實施例91.     根據實施例72-90中任一項所述的組合物，其中所述LNP的平均直徑為30 nm至200 nm。
實施例92.     根據實施例72-91中任一項所述的組合物，其中所述LNP的平均直徑為80 nm至150 nm。
實施例93.     根據實施例72-92中任一項所述的組合物，所述組合物包含在1 mg/mL至10 mg/mL之間的所述LNP。
實施例94.     根據實施例72-93中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含在1個與20個之間的核酸分子、優選mRNA分子。
實施例95.     根據實施例71-94中任一項所述的組合物，所述組合物經配製用於肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
實施例96.     根據實施例71-95中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含磷酸鹽緩衝鹽水。
實施例97.     根據實施例71-96中任一項所述的組合物，其中所述組合物是醫藥組合物，例如免疫原性組合物或疫苗，特別是mRNA疫苗。
實施例98.     根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物，其用於在有需要的受試者中引發免疫反應。
實施例99.     一種在有需要的受試者中引發免疫反應的方法，所述方法包括向所述受試者投予有效量的根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物，任選地肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
實施例100.   根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物用於製造用於在有需要的受試者中引發免疫反應的藥物的用途。
實施例101.   根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物，其用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染。
實施例102.   一種治療或預防有需要的受試者的原核生物感染的方法，所述方法包括向所述受試者投予有效量的根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物，任選地肌內、鼻內、靜脈內、皮下或皮內投予。
實施例103.   根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物用於製造用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染的藥物的用途。
實施例104.   一種在宿主細胞中分泌抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物。
實施例105.   一種在宿主細胞的表面上展示抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主投予根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物。
實施例106.   一種套組，所述套組包含容器，所述容器包含單次使用或多次使用劑量的根據實施例1-70中任一項所述的核酸或根據實施例71-97中任一項所述的組合物，任選地其中所述容器是小瓶或者預填充的注射筒或注射器。
為了可以更好地理解本揭露，闡述了以下實例。這些實例僅用於說明目的，並不應被解釋為以任何方式限制本揭露的範圍。 實例 實例 1 ：材料和方法
mRNA產生
如先前所公開產生mRNA(Kalnin等人 (2021), NPJ Vaccines 6(1):61以及WO 2021226436)。簡而言之，通過使用未經修飾的核苷酸利用RNA聚合酶以編碼所需基因的質體DNA範本進行體外轉錄來合成摻入含有OspA ST1或ST2的編碼序列的mRNA。如通過凝膠電泳確定的，經由酶促添加長度為大約200個核苷酸的5'帽結構(帽1)和3'聚(A)尾使所得純化的前體mRNA進一步反應。
對於mRNA/脂質奈米顆粒(LNP)配製品的製備，在固定的脂質和mRNA比率下，將脂質(陽離子/可電離的脂質、磷脂醯乙醇胺、膽固醇和聚乙二醇-脂質)的混合物的乙醇溶液與靶mRNA的水性緩衝溶液在受控的條件下在酸性pH下合併，以得到均勻LNP的懸浮液。在超濾和滲濾到合適的稀釋劑系統中後，將所得奈米顆粒懸浮液稀釋至最終濃度，過濾，並且在-80ºC下冷凍儲存直到使用。
用作基準比較物的抗原的產生
根據先前公開的材料和方法(Kamp等人 (2020), NPJ Vaccines 5(1):33)由美國麻塞諸塞州劍橋的Sanofi Breakthrough Lab產生OspA-鐵蛋白ST1和ST2抗原。
對於OspA融合ST1-ST2，將允許表現OspA融合ST1-ST2 C末端結構域的內部質體pSP401+LPP-嵌合體OspA ST1-OspA ST2引入大腸桿菌表現菌株 C43-(DE3)(Lucigen)中。在豐富培養基中在37ºC下生長2至3小時之後，通過添加誘導物誘導目的蛋白的表現，並且在誘導後3小時停止培養。在處理細菌團塊之後，在考馬斯藍染色的SDS-Page凝膠上或通過使用特異性抗體進行的蛋白質印跡使蛋白質視覺化。在最佳表現條件下進行規模放大以產生純化所需的足夠生物量。用溶菌酶處理細菌團塊以提取膜蛋白。然後用尿素2M + Triton X114 2%提取OspA ST1-OspA ST2融合蛋白。在37ºC下進行三次培育-離心步驟之後，收集下層相並在Zwittergent 3.14洗滌劑(0.5%)的存在下進行Q瓊脂糖層析。對用400 mM NaCl洗脫的級分進行陶瓷羥基磷灰石層析。用Tween 0,05% PO4 NaNa2 180 mM pH 6,7緩衝液洗脫OspA ST1-OspA ST2融合蛋白，並替代為作為最終緩衝液的PBS + Tween 20 0.05% pH 7.3。
HEK細胞的轉染
用1 µg/µL的與等體積的TransIT-mRNA試劑和mRNA加強試劑-TransIT-mRNA轉染套組Mirus(Ref MIR 2250)混合的5 µg裸mRNA轉染懸浮的HEK293T細胞(5 mL，2 x 10 6個細胞/mL-搖床125 mL)2-5分鐘。將混合物逐滴添加到細胞中，並在37ºC、100 rpm、8% CO 2下培育48至72小時。
mRNA轉染的細胞的蛋白質印跡分析
轉染之後，收集細胞和培養基，並且離心(500 x g)以收集上清液。使用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液-Lucigen ref R1804M)+ Benzonase(Sigma-ref E1014)+ 蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-ref P8340)在20ºC下在800 rpm下裂解細胞團塊10分鐘。然後離心(11,000 x g)細胞團塊裂解物以收集上清液和粗萃物。
通過使用4%-12% Bis-Tris/MES凝膠(Invitrogen)進行變性(95ºC)PAGE以及蛋白質印跡來分析來自mRNA轉染的HEK293T細胞的提取物。使用半乾轉移系統(Trans-Blot渦輪轉移系統，Bio-Rad)進行向硝酸纖維素膜(Bio-Rad)的轉移。用識別OspA的多株(兔)抗體(抗OspA多株/兔-Abcam，ref ab10608-1 : 2000)和二抗(抗兔IgG山羊抗體DyLight 800-Rockland，ref 611-145-002-1 : 2000)檢測印跡的蛋白質。用Odyssey紅外成像儀-LICOR使印跡成像。
通過用功能性單株抗體(mAb)的夾心ELISA表徵mRNA OspA ST1或ST2抗原性
用ST1特異性功能性mAb LA-2表徵
將mAb 857-2(R&D Biotech，內部訂購)以2.5 µg/mL在PBS溶液中塗布於微量滴定板(Greiner Bio-One)上。將板在4ºC下培育隔夜，然後用PBS-Tween 0.05%-乳5%在室溫下封閉1小時。
將轉染上清液在稀釋緩衝液(PBS-Tween 0.05%-乳1%)中連續稀釋2倍，並在室溫下培育1.5小時。在PBS-0.05% Tween洗滌之後，通過與以1 : 1000的mAb LA-2(Absolute Antibody，目錄號Ab01070-3.0-BT)在室溫下一起培育1.5小時，然後與山羊抗小鼠IgG HRP(Jackson Laboratories)一起培育來進行對附接至塗層的蛋白質的檢測。洗滌之後，使用3,3,5,5-四甲基聯苯胺(Tebu-bio，目錄號TMB100-1000)使板顯色，並且用1 N HCl(VWR ProLabo)終止。在450 nm-650 nm處讀取光密度(OD)。
用交叉特異性功能性mAb 857-2或221-7表徵
將mAb 221-7或857-2(Wang等人 J. Infect Dis. 214(2): 205-211. 2016)以5 µg/mL在PBS溶液中塗布於微量滴定板(Greiner Bio-one，目錄號655061)上。將板在4ºC下培育隔夜，然後用PBS-Tween 0.05%-乳5%在室溫下封閉1小時。
將轉染上清液在稀釋緩衝液(PBS-Tween 0.05%-乳1%)中連續稀釋2倍，並且在室溫下培育1.5小時。在PBS-0.05% Tween洗滌之後，通過在室溫下培育抗OspA小鼠多株血清(內部)1.5小時來進行對附接至塗層的蛋白質的檢測。將板洗滌並與山羊抗小鼠IgG HRP(Jackson Laboratories，目錄號115-036-062)在室溫下一起培育1.5小時。洗滌之後，使用3,3,5,5-四甲基聯苯胺(Tebu-bio，目錄號TMB100-1000)在室溫下在黑暗中使板顯色30分鐘。用1 N HCl(VWR Prolabo，目錄號30024290)終止比色反應。在450 nm-650 nm處讀取光密度(OD)。
抗原和小鼠免疫
將OF-1小鼠(Charles River)隨機分到各有八隻動物的免疫組中。在第0天(D0)(第1劑)和第21天(D21)(第2劑)肌內(50 µL)投予四種不同劑量的mRNA-OspA-LNP：0.2 µg、1 µg、5 µg或10 µg。在基線(D0)、在第2劑之前的第19天(D19)以及第35天(D35)採集血清。
測試了以下mRNA-OspA序列：mRNA-OspA-ST1-天然、mRNA-HA-SS-OspA-ST1-天然、mRNA-HA-SS-OspA-ST1-Gly(-)、mRNA-TMB-OspA-ST1-天然、mRNA-TMB-OspA-ST1-Gly(-)。具有TMB的mRNA序列還含有HA SS，如圖1中所示。
將那些mRNA配製品與基準Lyme犬疫苗Recombitek®(Merial)1 µg/劑(50 µL)、重組融合OspA ST1-ST2(2 µg/劑)+ AlOOH佐劑以及OspA-鐵蛋白(ST1和ST2)1.7 µg/劑 + AF03佐劑進行比較。
OspA特異性IgG ELISA
通過ELISA確定小鼠中的抗體反應。簡而言之，將384孔微量滴定板(Perkin Elmer #6007509)用在PBS中稀釋的1 µg/mL OspA ST1-His塗布，並且在4ºC下培育隔夜。去除OspA ST1-His並且用溶解於PBS-tween中的5%脫脂乳封閉板。去除封閉試劑之後，在1%脫脂乳-PBS-Tween中連續稀釋2倍之後添加原始血清樣品。在室溫下與原始血清樣品一起培育1.5小時之後，將板用PBS-Tween洗滌，並且與山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson 115-036-062)在室溫下一起培育1.5小時。抽吸並洗滌二抗，並且將板與TMB底物(TEBU - TMB100-1000)一起培育，隨後與等體積的終止溶液(HCl 1 N)一起培育。在450 nm-650 nm處測量吸光度。通過內部抗OspA小鼠血清參照物來定量OspA特異性IgG力價。這種參照物的力價預先計算為稀釋度的倒數以獲得為1的OD。
統計分析
進行以疫苗劑量及其相互作用作為因子的雙因素ANOVA(每個時間點一個模型)。必要時，考慮組內異質性。
OspA胺基酸和mRNA序列
實例中使用的OspA胺基酸序列和mRNA序列記敘在下表中。 表 4-OspA 蛋白的胺基酸序列
SEQ ID NO/ 描述 胺基酸序列
SEQ ID NO: 31 OspA ST1天然 MKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 32 OspA ST2天然 MKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 33 SS-HA-OspA ST1天然 SS粗體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 34 SS-HA-OspA ST2天然 SS粗體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 35 SS-HA-OspA ST1天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK SGSILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF GSG
SEQ ID NO: 36 SS-HA-OspA ST2天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK SGSILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF GSG
SEQ ID NO: 37 SS-HA-OspA ST1 Gly(-) SS粗體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVGSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNIDKSGEVSVELDDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSAGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO:38 SS-HA-OspA ST2 Gly(-) SS粗體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVGSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDDGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTREDGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKHFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALKDTSTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 39 SS-HA-OspA ST1 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVGSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNIDKSGEVSVELDDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSAGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK SGSILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF GSG
SEQ ID NO: 40 SS-HA-OspA ST2 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 MKAKLLVLLCTFTATYA KQNVGSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDDGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTREDGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKHFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALKDTSTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK SGSILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF GSG
SEQ ID NO: 186 OspA ST3天然 KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 187 OspA ST4天然 KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 188 OspA ST5天然 KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGKAVEITTLEKLKDALK
SEQ ID NO: 189 OspA ST6天然 KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 190 OspA ST7天然 KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK
表 5-OspA mRNA 的 mRNA 序列，包括 5' UTR 和 3' UTR
SEQ ID NO/ 描述 核苷酸序列
SEQ ID NO: 41 OspA ST1天然 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAAGCAAAAUGUGAGUAGUCUGGACGAGAAAAAUAGCGUGAGUGUGGAUCUGCCAGGAGAGAUGAAGGUGCUGGUGUCUAAAGAGAAAAACAAGGACGGAAAGUACGACCUGAUCGCCACUGUGGACAAGCUGGAGCUGAAAGGCACCUCUGAUAAGAACAAUGGCUCUGGCGUGCUGGAAGGGGUGAAGGCAGACAAGAGCAAAGUGAAGCUGACUAUCUCUGACGACCUGGGGCAAACCACACUGGAGGUCUUCAAGGAAGACGGCAAAACACUGGUCUCUAAGAAAGUCACCAGCAAGGAUAAGUCCUCCACAGAGGAGAAAUUCAACGAGAAAGGCGAAGUGUCUGAGAAGAUCAUCACCAGGGCCGACGGAACCAGGCUGGAGUACACCGGCAUCAAAAGCGACGGGUCAGGGAAGGCUAAGGAAGUGCUGAAAGGAUACGAUCUGAAAGGAGAGCUGUCCUCCGAGAAGACAACUCUGGUGGUGAAAGAGGGAACCGUUACACUGUCUAAGAACAUCUCCAAGUCUGGGGAAGUCAGCGUGGAGCUGAACGACACCGACAGCUCUGCUGCUACAAAGAAGACUGCUGCUUGGAACAGCGGCACCUCUACCCUGACAAUCACCGUGAAUUCUAAGAAGACCAAGGACCUGGUGUUCACUAAGGAGAAUACCAUUACUGUCCAGCAGUAUGAUUCCAAUGGGACUAAACUGGAAGGAUCCGCCGUGGAGAUUACUAAGCUGGACGAGAUCAAGAAUGCCCUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 42 OspA ST1天然 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAAGCAAAACGUGUCCAGCCUGGACGAGAAGAAUUCCGUUAGCGUGGAUCUGCCAGGGGAGAUGAAAGUGCUGGUGUCCAAGGAAAAGAACAAAGAUGGCAAGUAUGACCUGAUUGCAACUGUGGACAAACUGGAGCUGAAGGGCACUUCUGAUAAAAAUAACGGCAGCGGCGUUCUGGAGGGCGUUAAGGCCGACAAGUCCAAGGUGAAGCUGACAAUCUCCGACGACCUGGGGCAGACCACACUGGAGGUGUUUAAAGAGGAUGGCAAGACCCUGGUCUCUAAAAAAGUGACUUCCAAAGACAAGUCCAGCACAGAAGAGAAAUUCAAUGAAAAGGGAGAGGUGUCCGAGAAGAUCAUCACUCGGGCCGACGGGACUAGGCUGGAGUACACCGGGAUCAAGAGCGACGGCUCCGGAAAGGCAAAGGAGGUGCUGAAAGGCUAUGACCUGAAAGGCGAGCUGAGCAGCGAGAAAACUACCCUGGUGGUGAAGGAAGGCACAGUGACUCUGUCAAAAAAUAUCUCUAAGUCCGGCGAGGUGAGCGUGGAACUGAAUGACACUGACAGCUCCGCUGCAACUAAGAAAACAGCCGCUUGGAACUCUGGCACAUCUACUCUCACUAUUACCGUGAACUCCAAGAAAACCAAGGACCUGGUGUUUACCAAGGAGAAUACAAUCACAGUGCAACAGUACGACAGCAACGGCACUAAGCUGGAGGGCUCCGCCGUUGAGAUUACUAAGCUCGACGAGAUCAAAAACGCCCUGAAAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 43 OspA ST2天然 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAAACAGAACGUGUCUUCCCUGGACGAGAAAAAUUCUGCAAGCGUGGACCUGCCUGGCGAAAUGAAGGUGCUGGUGAGCAAGGAAAAAGACAAGGACGGCAAGUAUUCUCUGAAGGCAACAGUGGAUAAGAUUGAACUGAAGGGAACAUCUGACAAGGAUAAUGGCAGUGGGGUGCUGGAAGGGACUAAGGACGACAAGUCUAAGGCCAAGCUGACCAUCGCAGAUGACCUGUCCAAGACAACCUUUGAGCUUUUUAAAGAGGACGGCAAGACCCUGGUGAGCCGGAAAGUGUCUUCUAAGGACAAGACAUCUACUGACGAGAUGUUCAAUGAAAAAGGGGAGCUGAGCGCCAAGACAAUGACCAGAGAGAACGGAACAAAGCUGGAGUACACUGAGAUGAAGUCCGACGGGACCGGAAAAGCUAAGGAAGUCCUGAAGAAUUUCACUCUGGAGGGCAAGGUUGCCAACGAUAAGGUGACACUGGAGGUGAAAGAGGGAACAGUGACCCUGUCCAAGGAAAUUGCCAAGAGUGGCGAAGUGACCGUGGCUCUGAACGAUACCAAUACAACUCAGGCCACAAAGAAGACCGGAGCAUGGGACUCCAAAACAUCCACCCUGACCAUUAGCGUUAAUUCAAAGAAAACCACCCAGCUGGUGUUUACUAAGCAGGACACCAUCACCGUGCAGAAGUAUGAUUCCGCAGGCACUAAUCUGGAAGGGACAGCUGUGGAGAUCAAGACCCUGGAUGAGCUGAAAAAUGCCCUGAAAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 44 OspA ST2天然 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAAGCAGAACGUGAGUAGCCUGGAUGAAAAGAAUAGCGCCUCUGUGGACCUGCCCGGGGAGAUGAAGGUGCUGGUCUCUAAAGAGAAAGAUAAGGAUGGAAAAUACAGCCUGAAGGCAACAGUGGACAAAAUCGAGCUCAAAGGAACAUCCGAUAAGGAUAACGGGAGCGGAGUCCUGGAGGGCACCAAAGACGACAAGAGCAAGGCCAAGCUGACAAUCGCCGAUGAUCUGAGUAAGACAACUUUCGAGCUCUUUAAGGAGGACGGCAAGACCCUCGUGAGCAGAAAGGUGAGCAGCAAAGACAAGACCUCUACCGACGAGAUGUUCAAUGAGAAGGGGGAACUCUCUGCUAAGACAAUGACACGGGAGAAUGGAACUAAACUGGAGUACACAGAAAUGAAGUCUGACGGCACUGGGAAGGCAAAAGAGGUGCUGAAGAAUUUCACACUGGAAGGGAAGGUGGCUAACGAUAAAGUGACACUGGAGGUUAAGGAGGGAACCGUGACUCUGUCUAAGGAGAUUGCAAAAAGCGGAGAGGUGACAGUCGCCCUGAACGACACUAACACCACCCAGGCCACUAAGAAGACAGGAGCCUGGGACAGUAAAACCUCCACACUGACCAUUUCCGUGAACAGCAAGAAGACAACCCAGCUGGUCUUCACUAAACAGGAUACUAUCACAGUCCAGAAGUACGACUCCGCCGGAACCAAUCUGGAGGGAACUGCCGUGGAGAUCAAAACCCUGGACGAGCUCAAAAACGCCCUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 45 SS-HA-OspA ST1天然 SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCCAAGCUGCUGGUCCUGCUCUGUACCUUUACAGCCACUUACGCC AAGCAGAACGUGUCUUCCCUGGACGAAAAGAACAGCGUCUCUGUGGACCUGCCUGGAGAGAUGAAGGUCCUGGUGUCUAAAGAGAAGAAUAAGGACGGCAAGUACGACCUCAUUGCAACUGUGGACAAGCUGGAGCUGAAGGGAACAUCCGACAAGAAUAAUGGCAGCGGCGUUCUGGAGGGCGUGAAGGCCGACAAAAGCAAAGUGAAGCUGACUAUCUCUGAUGACCUGGGGCAAACUACACUGGAAGUGUUCAAGGAGGAUGGGAAGACACUGGUGAGCAAAAAAGUGACCAGCAAGGACAAAUCCUCUACAGAGGAAAAGUUUAAUGAGAAAGGCGAGGUGUCUGAAAAGAUCAUCACUCGCGCCGACGGGACUCGGCUGGAGUAUACCGGGAUCAAGAGCGACGGGUCCGGGAAAGCCAAGGAGGUGCUGAAAGGAUAUGAUCUGAAGGGAGAGCUCUCUUCCGAGAAGACAACACUGGUGGUCAAGGAGGGAACAGUUACCCUGUCCAAAAACAUCAGCAAGUCCGGGGAGGUCUCCGUCGAACUGAAUGACACCGACUCCUCUGCCGCCACCAAGAAGACCGCCGCAUGGAACUCUGGAACAAGCACACUGACAAUCACAGUGAAUUCCAAGAAGACUAAGGACCUCGUGUUCACAAAGGAGAACACAAUCACAGUGCAGCAGUACGACAGCAACGGAACCAAACUGGAGGGCUCCGCAGUGGAAAUCACAAAACUGGACGAGAUUAAGAACGCUCUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 46 SS-HA-OspA ST1天然 SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCCAAACUGCUCGUGCUCUUAUGCACAUUCACAGCAACCUACGCC AAACAGAAUGUCAGUUCCCUCGAUGAGAAGAAUUCCGUGAGCGUGGACCUGCCAGGCGAGAUGAAGGUGCUGGUGUCCAAGGAGAAGAACAAAGACGGGAAAUACGACCUGAUCGCCACCGUGGAUAAGCUGGAGCUGAAAGGCACAAGCGACAAGAAUAACGGAUCCGGCGUGCUGGAGGGAGUCAAGGCCGAUAAGAGCAAGGUGAAGCUGACCAUCAGCGACGAUCUGGGGCAGACUACCCUGGAAGUCUUUAAGGAGGACGGGAAAACACUGGUGUCAAAAAAGGUGACAUCCAAAGAUAAAUCCAGCACCGAAGAGAAGUUUAACGAGAAGGGGGAGGUCUCCGAGAAGAUUAUUACACGCGCAGACGGCACAAGGCUGGAGUAUACCGGAAUCAAGUCCGAUGGAUCCGGCAAAGCUAAGGAGGUGCUGAAGGGAUACGAUCUGAAAGGAGAGCUGUCUUCUGAGAAGACUACUCUGGUGGUGAAAGAAGGCACUGUGACUCUGUCUAAGAACAUCUCCAAGUCCGGCGAAGUUUCCGUGGAACUUAACGACACAGAUUCAUCCGCCGCCACAAAGAAGACCGCCGCCUGGAAUUCCGGCACUAGUACACUGACCAUUACCGUCAACAGCAAGAAGACAAAGGAUCUCGUGUUCACCAAAGAAAAUACAAUUACCGUGCAGCAGUACGACUCCAAUGGCACAAAGCUGGAGGGCUCUGCAGUGGAGAUCACUAAGCUGGACGAGAUCAAAAAUGCCCUGAAAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 47 SS-HA-OspA ST2天然 SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCAAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGUACCUUCACUGCCACCUACGCC AAGCAGAACGUCUCCAGCCUGGACGAGAAGAAUUCUGCCUCCGUCGACCUGCCCGGCGAAAUGAAGGUCCUGGUGAGCAAGGAAAAAGACAAAGACGGCAAGUAUUCCCUGAAGGCCACAGUGGACAAAAUCGAACUGAAAGGGACCUCUGAUAAGGAUAACGGAAGCGGAGUGCUGGAAGGAACUAAGGAUGAUAAGAGCAAAGCCAAGCUGACUAUUGCUGAUGAUCUCUCUAAGACCACCUUUGAACUCUUCAAGGAGGACGGCAAGACACUGGUGUCAAGAAAGGUGUCCAGCAAGGACAAGACUUCUACUGAUGAAAUGUUUAAUGAGAAGGGAGAACUGUCCGCUAAGACCAUGACACGGGAGAACGGCACUAAGCUGGAGUAUACCGAGAUGAAAAGCGAUGGCACUGGAAAGGCCAAGGAGGUGCUGAAAAAUUUUACCCUGGAAGGAAAAGUGGCCAAUGAUAAGGUGACACUGGAGGUGAAGGAGGGCACAGUCACUCUGUCCAAAGAGAUCGCCAAGUCCGGCGAAGUGACCGUGGCUCUCAAUGACACCAACACAACUCAAGCCACAAAAAAGACCGGAGCAUGGGAUUCUAAAACAUCCACUCUGACCAUUAGCGUUAACUCCAAGAAGACAACCCAGCUGGUCUUUACAAAACAGGACACUAUCACUGUGCAGAAGUAUGAUUCUGCCGGAACCAAUCUCGAGGGCACAGCCGUGGAAAUCAAGACCCUGGACGAGCUGAAGAACGCCCUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 48 SS-HA-OspA ST1天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCCAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGUACAUUCACAGCAACCUAUGCC AAGCAGAACGUGUCUAGCCUGGAUGAGAAGAACAGCGUGUCCGUGGACCUCCCAGGAGAGAUGAAGGUUCUGGUGUCUAAGGAGAAGAACAAGGAUGGGAAGUACGACCUGAUUGCAACCGUCGACAAGCUGGAGCUGAAGGGAACCAGCGACAAAAACAAUGGAAGCGGAGUGCUGGAGGGAGUCAAAGCAGACAAAAGCAAGGUUAAACUGACCAUCAGCGACGACCUGGGACAGACCACACUGGAGGUCUUUAAGGAAGAUGGAAAAACACUCGUGAGCAAAAAGGUGACCUCCAAGGAUAAGAGCUCUACAGAGGAGAAGUUCAAUGAAAAGGGAGAGGUCUCCGAGAAGAUUAUCACAAGAGCCGACGGCACAAGACUGGAGUAUACCGGCAUUAAGUCCGACGGCUCUGGGAAGGCCAAAGAGGUCCUGAAGGGAUAUGACCUGAAGGGCGAACUGUCCUCCGAAAAGACAACCCUGGUGGUGAAAGAGGGGACCGUGACCCUGAGCAAGAACAUCUCAAAAUCUGGGGAGGUGUCCGUGGAGCUGAACGACACUGACUCUUCUGCCGCUACUAAGAAGACCGCAGCAUGGAAUUCCGGCACCAGCACUCUGACCAUCACCGUGAACAGCAAGAAGACUAAGGACCUGGUGUUUACUAAGGAAAAUACUAUCACCGUCCAGCAGUACGACAGCAACGGGACCAAGCUGGAGGGCUCCGCAGUGGAAAUCACUAAGCUGGACGAGAUCAAAAACGCUCUGAAG UCCGGGAGCAUCCUGGCAAUCUAUAGCACAGUCGCCAGCUCCCUGGUUCUCCUGGUGAGCCUGGGGGCAAUUUCCUUC GGAUCUGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 49 SS-HA-OspA ST1天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAAGCAAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGCACAUUCACCGCAACAUACGCC AAACAGAAUGUGUCUUCCCUGGACGAGAAAAAUUCCGUCUCUGUGGACCUGCCCGGCGAAAUGAAGGUCCUGGUGUCUAAGGAAAAGAACAAAGACGGGAAGUACGACCUGAUCGCAACCGUGGAUAAGCUGGAACUGAAGGGGACUAGCGACAAGAAUAAUGGAUCCGGCGUGCUGGAAGGGGUGAAAGCUGACAAGUCCAAGGUCAAGCUGACCAUUUCUGACGACCUGGGGCAGACAACCCUGGAGGUCUUCAAAGAGGACGGAAAGACACUGGUGAGCAAGAAGGUGACAUCCAAGGAUAAGUCUUCCACCGAAGAAAAAUUCAAUGAGAAAGGGGAAGUGUCCGAGAAAAUCAUUACUCGGGCCGAUGGCACAAGACUGGAGUACACAGGCAUCAAAUCCGACGGAAGCGGGAAGGCCAAGGAGGUUCUGAAGGGCUACGACCUGAAAGGGGAGCUGUCCAGCGAAAAGACAACACUGGUGGUGAAAGAAGGAACUGUCACACUGUCUAAGAAUAUCAGCAAGUCAGGCGAGGUGAGCGUGGAGCUGAACGACACCGACUCCUCCGCUGCAACAAAAAAGACCGCCGCUUGGAACUCCGGAACUAGCACCCUGACUAUUACUGUGAAUUCCAAAAAGACCAAAGACCUGGUGUUUACUAAGGAGAACACCAUUACCGUCCAGCAGUAUGAUAGCAAUGGCACCAAACUGGAAGGAAGCGCAGUUGAGAUCACCAAACUGGACGAGAUCAAGAACGCACUGAAA UCCGGAUCCAUCCUGGCCAUCUAUAGCACCGUCGCCAGCUCUCUGGUGCUGCUGGUGUCCCUCGGGGCUAUCUCAUUC GGGUCCGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 50 SS-HA-OspA ST2天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCUAAACUGCUGGUCCUGCUGUGUACCUUCACCGCUACAUACGCC AAGCAGAAUGUGAGCUCCCUGGACGAGAAAAAUUCCGCUUCCGUGGACCUGCCCGGGGAGAUGAAGGUGCUGGUGUCCAAGGAGAAGGAUAAGGACGGAAAGUACAGUCUGAAGGCCACUGUGGACAAGAUCGAGCUGAAGGGGACAUCUGACAAAGAUAAUGGAUCAGGAGUGCUGGAAGGGACAAAGGAUGACAAGAGCAAAGCCAAGCUGACCAUUGCCGACGACCUGAGCAAAACUACUUUUGAACUCUUCAAAGAAGACGGGAAGACCCUGGUCAGCCGCAAGGUGUCCUCUAAGGACAAGACUAGCACUGAUGAGAUGUUCAACGAGAAGGGGGAGCUGUCUGCAAAGACAAUGACAAGGGAGAACGGGACAAAGCUGGAGUACACUGAGAUGAAGUCCGACGGCACAGGGAAAGCAAAAGAGGUUCUGAAGAACUUCACCCUGGAAGGCAAAGUGGCAAACGACAAGGUGACACUGGAGGUGAAGGAGGGAACAGUGACUCUGUCCAAGGAGAUCGCUAAAAGCGGCGAGGUGACUGUGGCUCUGAAUGACACUAAUACAACCCAGGCUACAAAGAAGACCGGAGCUUGGGAUUCUAAGACUAGCACUCUGACUAUCUCCGUGAAUUCUAAAAAGACAACCCAGCUGGUGUUCACCAAGCAGGAUACCAUUACAGUGCAGAAGUACGAUUCCGCCGGCACUAAUCUGGAGGGGACUGCUGUGGAGAUCAAGACCCUGGACGAACUGAAGAACGCACUCAAG UCCGGAUCAAUCCUGGCUAUCUAUAGCACUGUGGCUUCCUCUCUGGUGCUGCUGGUUUCCCUGGGGGCCAUUUCCUUC GGCAGUGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 51 SS-HA-OspA ST2天然-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCAAAACUGCUGGUGCUGCUGUGUACAUUCACAGCUACUUAUGCA AAGCAGAACGUGUCCUCUCUGGACGAGAAGAACUCCGCCUCCGUCGAUCUCCCAGGAGAGAUGAAAGUUCUUGUGAGCAAGGAGAAGGACAAGGAUGGCAAAUAUAGCCUGAAGGCCACCGUGGACAAGAUCGAGCUGAAAGGCACCUCCGACAAGGACAAUGGCUCCGGAGUGCUGGAAGGAACCAAGGACGAUAAGUCUAAGGCUAAGCUGACCAUCGCUGACGACCUGAGCAAGACUACAUUUGAACUCUUCAAGGAGGACGGCAAGACACUGGUGUCCAGAAAGGUGAGCUCUAAGGACAAGACUAGCACUGACGAAAUGUUCAAUGAGAAGGGGGAGCUGAGCGCUAAGACAAUGACUCGCGAGAAUGGCACAAAGCUCGAAUAUACAGAGAUGAAGUCCGACGGGACUGGCAAGGCCAAGGAAGUGCUGAAGAACUUUACUCUGGAAGGGAAAGUCGCUAAUGACAAGGUGACACUCGAGGUGAAGGAGGGCACAGUGACCCUGUCUAAAGAGAUCGCUAAGUCCGGGGAGGUGACCGUCGCCCUGAACGAUACAAACACAACCCAGGCCACAAAGAAAACCGGCGCAUGGGAUAGCAAGACAUCCACUCUGACAAUUUCUGUGAACAGCAAGAAGACAACCCAGCUGGUCUUUACCAAGCAGGAUACAAUCACAGUCCAGAAAUAUGACUCUGCCGGAACUAAUCUGGAGGGAACUGCAGUGGAGAUCAAGACACUCGAUGAACUGAAGAAUGCACUGAAG UCCGGGAGCAUCCUGGCUAUCUAUAGCACCGUCGCCUCCAGCCUCGUUCUGCUGGUGAGCCUGGGCGCCAUUUCCUUC GGCAGCGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 52 SS-HA-OspA ST1 Gly(-) SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCUAAGCUGCUGGUUCUGCUGUGUACUUUUACCGCCACAUACGCU AAGCAGAACGUGGGAAGCCUGGACGAGAAAAACUCCGUGUCUGUGGAUCUGCCUGGGGAGAUGAAGGUGCUCGUUAGCAAGGAGAAGAAUAAGGACGGGAAGUAUGACCUCAUUGCCACAGUGGACAAGCUGGAGCUGAAAGGCACCAGCGAUAAGAAUAACGGCUCCGGCGUGCUGGAGGGGGUCAAAGCCGACAAGUCCAAGGUGAAACUGACAAUUUCUGACGACCUGGGGCAGACCACUCUGGAGGUCUUUAAAGAGGACGGCAAGACACUCGUGUCCAAGAAAGUGACCUCUAAAGAUAAGUCCUCCACUGAGGAGAAGUUUAAUGAAAAGGGGGAAGUUAGCGAGAAGAUUAUUACAAGAGCUGAUGGGACUCGCCUGGAGUAUACCGGCAUCAAGUCCGACGGCUCUGGCAAAGCAAAGGAGGUGCUGAAAGGCUAUGAUCUGAAGGGAGAGCUGUCUUCCGAGAAGACCACACUGGUGGUGAAAGAGGGCACCGUGACACUGAGUAAGAACAUUGACAAGUCCGGCGAAGUGAGCGUCGAACUGGACGACACUGAUAGCUCCGCCGCCACCAAGAAAACAGCCGCAUGGAAUAGCGGGACAAGCACUCUGACCAUCACAGUUAACUCUAAAAAGACAAAGGACCUGGUUUUUACUAAAGAGAAUACCAUUACCGUUCAGCAGUAUGACAGCGCCGGAACCAAGCUGGAGGGAAGCGCAGUGGAAAUCACUAAGCUGGACGAGAUUAAGAACGCACUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 53 SS-HA-OspA ST1 Gly(-) SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCCAAACUCCUGGUGCUCCUGUGUACCUUCACCGCUACCUACGCC AAGCAGAACGUGGGAAGCCUGGACGAAAAGAAUUCCGUGAGCGUCGACCUGCCCGGCGAAAUGAAGGUGCUCGUGUCCAAGGAGAAGAAUAAGGAUGGAAAGUAUGACCUGAUUGCCACUGUCGAUAAGCUGGAACUGAAGGGGACCUCCGACAAGAAUAACGGCUCAGGCGUGCUGGAGGGCGUUAAGGCAGAUAAGAGCAAAGUGAAGCUGACAAUUUCUGAUGAUCUGGGACAGACUACACUCGAGGUCUUUAAGGAAGACGGCAAGACCCUGGUGAGCAAGAAAGUGACUAGCAAGGAUAAGUCCUCCACAGAGGAGAAAUUCAACGAAAAAGGAGAGGUGUCUGAAAAAAUUAUUACACGGGCUGAUGGAACCAGGCUGGAGUACACAGGGAUUAAGUCCGACGGGUCUGGAAAGGCUAAAGAGGUGCUGAAAGGAUAUGACCUGAAGGGGGAACUGUCUUCCGAAAAGACCACACUGGUCGUGAAGGAGGGCACAGUGACACUGUCUAAAAACAUCGACAAGAGCGGGGAGGUGAGUGUCGAGCUGGACGACACUGAUUCUUCCGCUGCCACAAAGAAGACCGCAGCCUGGAAUAGCGGGACCUCCACACUGACUAUCACCGUGAACUCUAAGAAGACAAAGGACCUGGUGUUUACAAAGGAGAAUACCAUCACUGUGCAGCAGUACGAUUCCGCCGGCACUAAGCUGGAGGGAUCCGCAGUGGAAAUCACAAAGCUGGAUGAGAUCAAGAAUGCACUAAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 54 SS-HA-OspA ST2 Gly(-) SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCCAAACUGCUGGUGCUGCUGUGCACUUUCACUGCAACUUACGCC AAGCAGAACGUGGGAUCUCUGGAUGAAAAGAAUUCUGCAAGCGUGGAUCUGCCAGGCGAGAUGAAGGUUCUGGUCUCCAAGGAGAAGGACAAGGACGGCAAAUAUUCUCUGAAAGCCACAGUGGAUAAGAUUGAGCUGAAGGGCACAUCCGAUAAGGACGACGGCUCUGGGGUGCUGGAGGGAACCAAGGACGACAAAAGCAAGGCCAAGCUGACAAUCGCCGACGACCUGUCUAAAACUACUUUCGAACUCUUUAAGGAGGAUGGCAAAACCCUGGUGUCCAGGAAAGUGUCCUCCAAAGACAAGACCUCUACAGAUGAGAUGUUCAAUGAAAAGGGGGAGCUGUCCGCCAAAACCAUGACCAGAGAGGACGGAACCAAGCUGGAAUAUACCGAAAUGAAGUCCGACGGCACCGGAAAAGCCAAGGAGGUCCUGAAACACUUCACACUGGAGGGGAAGGUGGCCAAUGACAAGGUGACACUGGAGGUGAAAGAGGGCACAGUGACUCUGAGCAAAGAGAUCGCCAAAUCUGGCGAGGUUACUGUGGCACUGAAGGAUACAAGCACCACACAGGCCACCAAGAAAACAGGCGCCUGGGAUAGCAAGACAUCCACUCUGACAAUUUCCGUCAAUUCUAAGAAGACCACCCAGCUCGUGUUCACUAAGCAGGACACUAUCACCGUGCAGAAGUAUGACUCUGCAGGAACAAACCUGGAAGGCACAGCUGUGGAAAUCAAAACUCUGGAUGAACUGAAAAACGCCCUGAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 55 SS-HA-OspA ST2 Gly(-) SS粗體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAAGCCAAACUUCUGGUCCUGCUCUGUACCUUCACUGCAACCUACGCC AAGCAGAACGUGGGCUCUCUGGACGAGAAGAACAGUGCUAGCGUCGACCUGCCAGGGGAAAUGAAGGUGCUGGUCUCUAAAGAGAAGGACAAAGACGGCAAGUAUAGCCUGAAGGCCACAGUGGACAAGAUUGAACUGAAGGGAACUUCCGACAAGGACGACGGGAGCGGCGUCCUGGAAGGCACAAAGGAUGACAAGUCCAAAGCCAAGCUGACCAUUGCUGACGACCUGUCUAAGACCACCUUCGAACUCUUCAAGGAAGAUGGAAAGACACUGGUGAGCAGGAAGGUGUCUAGCAAGGACAAGACCUCAACAGACGAAAUGUUUAAUGAAAAAGGCGAGCUGUCUGCCAAGACGAUGACCCGCGAGGACGGAACCAAGCUGGAAUACACCGAAAUGAAGUCCGAUGGGACUGGCAAGGCCAAGGAGGUCCUGAAGCACUUCACACUGGAGGGGAAGGUGGCCAAUGAUAAGGUGACUCUCGAGGUCAAGGAGGGCACAGUUACCCUGUCUAAGGAGAUCGCCAAAUCCGGCGAGGUGACCGUGGCACUGAAGGAUACAAGCACUACUCAGGCAACUAAGAAGACAGGCGCUUGGGACUCUAAGACAAGCACACUGACUAUCUCUGUGAAUUCCAAAAAGACAACUCAGCUGGUGUUCACAAAGCAGGAUACAAUUACCGUGCAGAAGUAUGAUUCCGCUGGAACAAAUCUGGAGGGAACAGCCGUGGAGAUUAAGACACUGGACGAGCUGAAGAAUGCUCUGAAAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 56 SS-HA-OspA ST1 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAAGCAAAGCUGCUGGUCCUGCUGUGUACUUUCACAGCAACUUAUGCA AAACAGAAUGUGGGCUCUCUGGACGAGAAAAACAGCGUGUCCGUGGACCUGCCCGGAGAGAUGAAAGUGCUGGUGUCCAAGGAGAAGAACAAGGAUGGGAAGUACGACCUGAUCGCUACCGUUGACAAGCUGGAGCUGAAGGGGACUAGCGAUAAAAACAACGGCUCCGGCGUCCUGGAAGGAGUGAAGGCCGACAAGAGCAAGGUGAAACUGACUAUUUCCGACGAUCUGGGACAGACAACUCUGGAAGUGUUUAAGGAAGACGGAAAAACUCUCGUUUCCAAGAAGGUGACAUCCAAGGACAAGUCCUCCACCGAGGAGAAGUUCAAUGAGAAGGGAGAGGUUUCCGAGAAGAUCAUCACAAGAGCAGACGGCACCAGACUGGAGUACACCGGAAUCAAGAGCGACGGCUCUGGCAAGGCCAAAGAGGUGCUGAAGGGCUAUGACCUGAAGGGGGAACUGUCCUCUGAGAAAACCACUCUGGUGGUGAAAGAGGGCACAGUGACACUGUCCAAAAACAUCGACAAGAGUGGGGAGGUGUCCGUGGAGCUGGACGAUACAGACAGCUCCGCCGCAACCAAAAAGACUGCAGCCUGGAACUCCGGAACAUCUACCCUGACUAUCACUGUUAACUCCAAGAAAACUAAGGACCUGGUGUUUACUAAGGAGAAUACAAUCACAGUGCAGCAGUAUGAUAGCGCCGGAACCAAGCUGGAGGGCUCCGCCGUGGAGAUCACAAAGCUGGAUGAGAUUAAGAACGCCCUGAAG UCUGGGUCCAUUCUGGCAAUCUACAGCACAGUGGCCUCUUCUCUGGUGCUGCUGGUUUCCCUGGGCGCCAUUAGUUUU GGCUCUGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 57 SS-HA-OspA ST1 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAAGCCAAGCUCCUGGUGCUCCUGUGCACAUUCACUGCAACUUACGCC AAGCAGAACGUGGGAAGCCUGGACGAGAAGAACAGCGUGAGCGUGGAUCUGCCCGGAGAGAUGAAGGUCCUGGUGUCCAAGGAGAAGAAUAAGGACGGAAAAUACGACCUCAUUGCUACCGUCGAUAAACUGGAGCUGAAGGGAACCAGCGAUAAGAACAAUGGAUCUGGAGUGCUGGAGGGGGUCAAGGCUGAUAAGUCAAAGGUGAAACUGACAAUCAGUGAUGACCUGGGCCAGACAACCCUGGAGGUGUUCAAGGAAGACGGGAAAACUCUGGUGAGUAAGAAGGUCACCUCCAAAGAUAAGAGCAGCACAGAAGAGAAGUUCAACGAAAAGGGAGAGGUGAGCGAGAAGAUCAUCACACGCGCUGACGGCACCCGCCUGGAGUAUACCGGCAUCAAGUCCGACGGGUCCGGCAAAGCUAAAGAGGUGCUGAAAGGCUACGAUCUGAAGGGAGAGCUGAGCUCCGAGAAAACUACCCUGGUGGUGAAGGAGGGAACAGUGACACUGUCCAAAAACAUCGAUAAGAGUGGGGAGGUGAGCGUUGAGCUGGACGACACAGACAGCAGCGCAGCCACAAAGAAGACAGCCGCAUGGAAUAGCGGGACCAGCACACUGACCAUCACAGUGAAUUCUAAAAAGACUAAAGACCUCGUCUUUACUAAAGAAAACACUAUUACUGUCCAGCAAUACGACUCUGCCGGAACUAAGCUGGAGGGAUCUGCCGUGGAGAUUACCAAGCUGGACGAGAUCAAGAACGCCCUGAAG UCCGGCAGCAUCCUCGCCAUCUACUCCACCGUGGCCUCUAGCCUGGUUCUGCUGGUGAGCCUGGGCGCCAUUUCUUUU GGGAGCGGA UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 58 SS-HA-OspA ST2 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCUAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGCACCUUCACUGCAACCUACGCC AAGCAAAAUGUCGGCUCCCUGGAUGAAAAGAAUAGCGCCUCCGUGGACCUGCCUGGGGAGAUGAAAGUGCUGGUGUCCAAGGAAAAAGACAAAGACGGGAAGUACAGCCUGAAGGCCACUGUGGACAAGAUUGAGCUGAAAGGGACAAGCGACAAGGAUGACGGGUCUGGAGUGCUGGAGGGCACUAAGGACGAUAAGAGCAAGGCUAAGCUGACUAUCGCCGAUGACCUGAGCAAGACCACUUUUGAACUCUUCAAGGAAGACGGCAAAACACUGGUAUCCCGCAAGGUGUCUAGCAAGGAUAAGACAUCCACAGACGAGAUGUUCAAUGAGAAAGGAGAACUGAGCGCCAAGACCAUGACCAGGGAAGAUGGAACCAAGCUGGAAUACACCGAGAUGAAGUCUGACGGCACCGGCAAGGCCAAGGAGGUGCUGAAGCACUUUACUUUGGAGGGCAAAGUGGCCAACGACAAGGUGACACUGGAGGUGAAAGAGGGGACCGUGACCCUGUCUAAAGAGAUUGCAAAGUCCGGCGAAGUGACCGUGGCCCUCAAGGACACUUCUACCACCCAGGCUACAAAGAAGACCGGCGCUUGGGAUUCCAAAACUUCUACCCUGACUAUCUCCGUGAAUUCUAAGAAGACAACCCAGCUGGUGUUUACCAAGCAGGAUACCAUUACCGUGCAGAAAUAUGAUAGCGCCGGCACUAAUCUGGAGGGCACCGCUGUGGAGAUUAAGACCCUGGACGAGCUGAAAAACGCACUGAAA UCCGGCUCUAUUCUGGCAAUCUACUCCACAGUGGCUUCAAGCCUGGUGCUGCUCGUGUCCCUCGGGGCAAUCUCCUUC GGAUCUGGG UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
SEQ ID NO: 59 SS-HA-OspA ST2 Gly(-)-HA-TMB SS粗體/加底線 TMB粗體/斜體 連接子粗體/斜體/加底線 GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG AUGAAGGCAAAGCUGCUGGUGCUCCUGUGCACCUUUACAGCUACAUACGCA AAACAGAACGUGGGCAGCCUGGACGAGAAGAAUAGCGCCAGCGUGGAUCUGCCAGGCGAGAUGAAGGUGCUGGUGAGCAAAGAGAAGGAUAAAGAUGGGAAGUACAGCCUGAAGGCUACUGUGGACAAGAUCGAACUGAAGGGAACUAGCGAUAAAGACGAUGGAAGCGGCGUGCUGGAGGGAACUAAGGACGAUAAAAGCAAAGCCAAGCUGACAAUUGCCGACGACCUGUCCAAAACUACAUUUGAACUCUUUAAGGAGGAUGGAAAAACACUGGUGAGCAGAAAGGUGUCUUCUAAGGACAAGACCUCCACCGAUGAGAUGUUCAACGAGAAGGGCGAGCUGUCUGCAAAAACUAUGACACGCGAGGACGGAACAAAGCUGGAGUAUACUGAGAUGAAGUCUGACGGCACCGGGAAGGCCAAAGAGGUGCUGAAACACUUCACCCUGGAGGGGAAGGUGGCUAACGAUAAGGUUACCCUGGAGGUCAAGGAGGGAACUGUGACUCUGAGCAAGGAGAUCGCCAAGUCUGGCGAGGUCACAGUGGCCCUCAAGGACACAAGCACCACCCAGGCUACAAAGAAGACAGGCGCCUGGGAUUCUAAAACAAGCACCCUGACUAUCAGUGUCAACUCCAAGAAGACAACCCAGCUGGUGUUCACCAAGCAGGACACCAUCACCGUGCAGAAAUAUGACUCUGCUGGAACAAACCUGGAAGGGACCGCUGUCGAAAUCAAGACUCUGGACGAACUGAAGAAUGCCCUGAAG UCCGGGAGCAUCCUGGCAAUCUACUCUACAGUGGCUUCCUCCCUUGUUCUGCUGGUCAGCCUGGGCGCCAUCAGCUUU GGCUCUGGC UGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
下列mRNA序列是編碼相同病毒分泌訊息肽MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)的變體： AUGAAGGCCAAGCUGCUGGUCCUGCUCUGUACCUUUACAGCCACUUACGCC (SEQ ID NO: 60)； AUGAAGGCCAAACUGCUCGUGCUCUUAUGCACAUUCACAGCAACCUACGCC (SEQ ID NO: 61)； AUGAAGGCUAAGCUGCUGGUUCUGCUGUGUACUUUUACCGCCACAUACGCU (SEQ ID NO: 62)； AUGAAGGCCAAACUCCUGGUGCUCCUGUGUACCUUCACCGCUACCUACGCC (SEQ ID NO: 63)； AUGAAGGCAAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGUACCUUCACUGCCACCUACGCC (SEQ ID NO: 64)； AUGAAGGCCAAACUGCUGGUGCUGCUGUGCACUUUCACUGCAACUUACGCC (SEQ ID NO: 65)； AUGAAAGCCAAACUUCUGGUCCUGCUCUGUACCUUCACUGCAACCUACGCC (SEQ ID NO: 66)； AUGAAGGCCAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGUACAUUCACAGCAACCUAUGCC (SEQ ID NO: 67)； AUGAAAGCAAAGCUGCUGGUGCUGCUGUGCACAUUCACCGCAACAUACGCC (SEQ ID NO: 68)； AUGAAAGCAAAGCUGCUGGUCCUGCUGUGUACUUUCACAGCAACUUAUGCA (SEQ ID NO: 69)； AUGAAAGCCAAGCUCCUGGUGCUCCUGUGCACAUUCACUGCAACUUACGCC (SEQ ID NO: 70)； AUGAAGGCUAAACUGCUGGUCCUGCUGUGUACCUUCACCGCUACAUACGCC (SEQ ID NO: 71)； AUGAAGGCAAAACUGCUGGUGCUGCUGUGUACAUUCACAGCUACUUAUGCA (SEQ ID NO: 72)。
下列mRNA序列是編碼相同跨膜結構域ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的變體： AUCCUGGCAAUCUAUAGCACAGUCGCCAGCUCCCUGGUUCUCCUGGUGAGCCUGGGGGCAAUUUCCUUC(SEQ ID NO: 73)； AUCCUGGCCAUCUAUAGCACCGUCGCCAGCUCUCUGGUGCUGCUGGUGUCCCUCGGGGCUAUCUCAUUC(SEQ ID NO: 74)； AUUCUGGCAAUCUACAGCACAGUGGCCUCUUCUCUGGUGCUGCUGGUUUCCCUGGGCGCCAUUAGUUUU(SEQ ID NO: 75)； AUCCUCGCCAUCUACUCCACCGUGGCCUCUAGCCUGGUUCUGCUGGUGAGCCUGGGCGCCAUUUCUUUU(SEQ ID NO: 76)； AUCCUGGCUAUCUAUAGCACUGUGGCUUCCUCUCUGGUGCUGCUGGUUUCCCUGGGGGCCAUUUCCUUC(SEQ ID NO: 77)； AUCCUGGCUAUCUAUAGCACCGUCGCCUCCAGCCUCGUUCUGCUGGUGAGCCUGGGCGCCAUUUCCUUC(SEQ ID NO: 78)； AUUCUGGCAAUCUACUCCACAGUGGCUUCAAGCCUGGUGCUGCUCGUGUCCCUCGGGGCAAUCUCCUUC(SEQ ID NO: 79)；或 AUCCUGGCAAUCUACUCUACAGUGGCUUCCUCCCUUGUUCUGCUGGUCAGCCUGGGCGCCAUCAGCUUU(SEQ ID NO: 80)。 實例 2 ：含訊息序列的抗原性原核多肽的體外 mRNA 表現和抗原性
使用疏螺旋體屬蛋白質外表面蛋白A(OspA)作為例示性抗原性原核多肽，以測試將血凝素分泌訊息(HA1 SS)和HA跨膜結構域(TMB)中的一個或兩個與OspA連接的作用。使用OspA血清型1(ST1)和血清型2(ST2)。
設計表現OspA ST1或ST2的mRNA。使用OspA序列，設計不同的mRNA序列以引導OspA在細胞內表現、分泌或跨膜，所述OspA序列與血凝素分泌訊息(HA1 SS)和/或HA跨膜結構域(TMB)不融合或融合。HA1 SS引起OspA分泌，TMB將OspA引導至膜，並且不具有HA1 SS或TMB的OspA存在於細胞內。
在對小鼠進行疫苗接種之前，在體外證實通過mRNA遞送的OspA ST1和ST2抗原的表現和抗原性。mRNA的轉染和表現的方法描述於上文實例1中。
如 圖 2A和 圖 2B中所示，實現了在HEK293T細胞上清液中OspA ST1和ST2 mRNA的體外表現。測試了不具有或具有HA分泌訊息以及不具有或具有醣基化位點突變的mRNA-OspA ST1和mRNA-OspA ST2。還使用了陰性對照(緩衝液)和陽性對照(重組OspA)。用每種mRNA轉染HEK293T細胞，並且48小時之後，收集上清液並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。結果證實添加分泌訊息增加了OspA的細胞外表現。醣基化位點的突變有效地避免了OspA的醣基化，其中存在Gly(-) 的單一點代替天然(醣基化)蛋白的多個點。
如 圖 3A- 圖 3C中所示，實現了在HEK293T細胞中mRNA-TMB-OspA ST1的體外表現。測試了細胞上清液、粗萃物和細胞內區室的OspA ST1表現。48-72小時之後，收集上清液和細胞並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。結果證實，添加跨膜結構域誘導OspA ST1定位於細胞膜處，並減少分泌和細胞內定位。醣基化位點的突變有效地避免了OspA ST1的醣基化。
如 圖 4A- 圖 4C中所示，實現了在HEK293T細胞中mRNA-TMB-OspA ST2的體外表現。測試了細胞上清液、粗萃物和細胞內區室的OspA ST2表現。48-72小時之後，收集上清液和細胞並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。與OspA ST1一樣，結果證實，添加跨膜結構域誘導OspA ST2定位於細胞膜處，並減少分泌和細胞內定位。醣基化位點的突變有效地避免了OspA ST2的醣基化。
如 圖 5中所示，示出了在HEK293T細胞中通過mRNA遞送的OspA ST1抗原的抗原性。使用轉染的細胞上清液以用功能性單株抗體LA-2、857-2和221-7進行夾心ELISA。
mAb LA-2僅靶向OspA ST1的C末端，並且在臨床研究中已經表明與保護作用相關(Van Hoecke，同上；Steere，同上；Embers，同上)。基於在小鼠中針對蜱蟲介導的伯氏疏螺旋體傳播的殺疏螺旋體活性和保護作用，選擇Mab 221-7和857-2作為主要候選物，如Wang等人，同上所示。
由mRNA產生的分泌型OspA ST1(HA-SS-OspA ST1)被3種功能性mAb正確地識別，表明所述抗原在人類細胞(HEK293T)中體外表現後呈正確構型。
醣基化位點的突變抑制mAb LA-2的結合，可能是由於在C末端表位中誘導錯誤構型所致。這在使用221-7和857-2抗體的情況下沒有觀察到。
如 圖 6中所示，示出了在HEK293T細胞中通過mRNA遞送的OspA ST2抗原的抗原性。使用轉染的細胞上清液以用功能性單株抗體857-2和221-7進行夾心ELISA。mAb LA-2不與OspA ST2一起使用，因為它僅識別OspA ST1。
由mRNA產生的分泌型OspA ST2(HA-SS-OspA ST2)被功能性mAb 221-7和857-2正確地識別，表明所述抗原在人類細胞中體外表現後呈正確構型。醣基化位點的突變改進了兩種mAb的結合，可能是由於降低醣基化對表位的掩蔽所致。 實例 3 ：編碼 OspA 蛋白的 mRNA 在小鼠中的免疫原性
通過測量針對OspA的IgG力價來測試各種表現OspA的mRNA在小鼠中的相對免疫原性，如上文在實例1中所述。將每種mRNA包封到由40%陽離子脂質cKK-E10、30%磷脂DOPE、1.5% PEG化的脂質DMGPEG2000和28.5%膽固醇構成的LNP中。可替代地，所述LNP脂質可以按比率記述，其中陽離子脂質 : PEG化的脂質 : 膽固醇 : 磷脂是40 : 1.5 : 28.5 : 30。
將每種LNP-mRNA組合物以0.2 µg、1 µg、5 µg或10 µg的劑量投予小鼠。總共使用4組，每組8隻小鼠。
使用三種基準組合物：具有AlOOH佐劑的OspA融合物(“OspA融合ST1-ST2”)(2 µg(按血清型1 µg)/劑)；Lyme犬疫苗RECOMBITEK®(Merial)(1 µg劑量)；以及具有AF03佐劑的OspA-鐵蛋白融合物(ST1或ST2)(1.7 µg(其中，1 µg OspA + 0.7 µg鐵蛋白)/劑)。OspA-鐵蛋白融合物進一步描述於US20210017238A1中，將其通過引用併入本文。
如 圖 7A中所示，在第1劑後(第19天)，抗OspA ST1 IgG力價升高。觀察到HA-SS有增加IgG力價的趨勢。此外，添加TMB結構域顯著增加了IgG力價。
如 圖 7B中所示，在第2劑後(第35天)，抗OspA ST1 IgG力價進一步升高。如表6中可見，添加HA-SS和/或TMB結構域顯著改進了免疫原性(p ＜ 0.05)。 表 6- 第 2 劑後 ( 第 35 天 ) 所有劑量組合的統計分析
比較組 倍數 P 值
SS-天然 = SS-gly(-) - P ＞ 0.05
SS-天然 = TMB-天然 - P ＞ 0.05
天然＜SS-gly(-) X7.9 0.0102
天然＜SS-天然 X8 0.0088
天然＜TMB-gly(-) X66.5 P ＜ 0.001
天然＜TMB-天然 X19.8 P ＜ 0.001
SS-gly(-)＜TMB-gly(-) X8.4 P ＜ 0.001
SS-天然＜TMB-gly(-) X8.3 P ＜ 0.001
TMB-天然＜TMB-gly(-) X3.4 0.0454
小鼠研究的結論：
具有HA-SS或TMB中的一個或兩個的編碼OspA ST1的mRNA具有免疫原性，並且在小鼠中在第1劑後和第2劑後都誘導強抗OspA IgG力價。發現與不具有HA-SS或TMB中的任一者的mRNA OspA相比，添加分泌訊息(HA-SS)或TMB結構域顯著改進了免疫原性(p ＜ 0.05)。觀察到劑量效應(即，隨著劑量增加，IgG力價增加)。 實例 4 ：擴展的 mRNA 設計組套
在實例3中，證實了添加血凝素分泌訊息(HA-SS)和/或HA跨膜結構域(HA-TMB)增強了OspA ST1靶抗原的免疫原性。基於這些結果，設計了更全面的mRNA構築體組套，其將來自各種病毒家族的糖蛋白的分泌訊息(SS)和跨膜結構域(TMB)與不同的靶抗原連接。這種擴展mRNA組套中包括的元件的示意圖提供在 圖 8中。所述組套由三種不同的原核抗原組成：OspA ST1、CAMP2和PITP(後兩者來源於痤瘡醋酸桿菌)。另外對編碼這些抗原的mRNA序列進行工程化，以引導抗原定位於細胞內，將其分泌到細胞外，或者將其暴露在細胞膜處。這是通過將抗原序列與或不與SS融合以及與或不與TMB融合來實現，所述SS和TMB來源於不同病毒家族的糖蛋白，所述病毒家族諸如流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒。
使用SignalP 6.0對五十七種不同的構築體進行電腦分析，以確定它們的訊息肽的強度。SignalP是用於訊息序列預測的演算法並且進一步詳細描述於Armenteros等人(Nature Biotechnology. 37: 420-423. 2019)、Teufel等人(Nature Biotechnology. 40: 1023-1025. 2022)以及https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/中，將其中的每一個通過引用以其整體併入本文。所述強度基於累積秩得分來評估，所述累積秩得分考慮了檢測訊息序列的規範特徵的似然性(SS似然性得分，也稱為SP似然性得分)和在切割位點處切割的概率(切割概率得分)。用於此分析的序列展示於 表 7中，並且此分析的結果呈現在下 表 8中。 表 7- 在 SignalP 6.0 中分析的序列
名稱 序列
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 MKAKLLVLLCTFTATYAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 MKAILVVLLYTFATANAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 MKTIIALSYILCLVFAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 MKAIIVLLMVVTSNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS-刺突_CoV2_短 MFVFLVLLPLVSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS-刺突_CoV2_長 MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 MVPQALLFVPLLVFPLCFGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 MQALGIKTEHFIIMCLLSGHAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 MGAAAALTAVVLQGYNPPAYGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 MKVFLVTCLGFAVFSSSVCKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞OspA ST1_SS_VSV-G_Indiana MRSLIIFLLFPSIIYSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 MKAKLLVLLCTFTATYAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 MKAILVVLLYTFATANAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 MKTIIALSYILCLVFAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 MKAIIVLLMVVTSNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS-刺突_CoV2_短 MFVFLVLLPLVSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS-刺突_CoV2_長 MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 MVPQALLFVPLLVFPLCFGVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 MQALGIKTEHFIIMCLLSGHAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 MGAAAALTAVVLQGYNPPAYGVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 MKVFLVTCLGFAVFSSSVCVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞Camp2_SS_VSV-G_Indiana MRSLIIFLLFPSIIYSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
＞PITP_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 MKAKLLVLLCTFTATYAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 MKAILVVLLYTFATANAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 MKTIIALSYILCLVFAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 MKAIIVLLMVVTSNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS-刺突_CoV2_短 MFVFLVLLPLVSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS-刺突_CoV2_長 MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 MVPQALLFVPLLVFPLCFGAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 MQALGIKTEHFIIMCLLSGHAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 MGAAAALTAVVLQGYNPPAYGAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 MKVFLVTCLGFAVFSSSVCAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
＞PITP_SS_VSV-G_Indiana MRSLIIFLLFPSIIYSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
表 8- 來自表 7 中展示的所有測試序列的 SignalP 6.0 分析的結果
名稱 長度 SS長度 SS似然性 切割後 切割概率 [E]x[G] 秩
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 273 17 0.9998 17 0.9838 0.984 2
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 273 17 0.9998 17 0.9823 0.982 6
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 272 16 0.9997 22 0.4879 0.488 13
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 271 15 0.9998 15 0.9687 0.969 9
＞OspA ST1_SS-刺突_CoV2_短 268 12 0.6664 16 0.4985 0.332 15
＞OspA ST1_SS-刺突_CoV2_長 277 21 1 21 0.9895 0.99 1
＞OspA ST1_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 275 19 0.9998 19 0.9831 0.983 3
＞OspA ST1_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 286 30 0.8323 30 0.6537 0.544 12
＞OspA ST1_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 276 20 0.9998 20 0.9831 0.983 3
＞OspA ST1_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 277 21 0.5 19 0.4973 0.249 16
＞OspA ST1_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 279 23 0.9891 27 0.3741 0.37 14
＞OspA ST1_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 277 21 1 14 0.9695 0.97 8
＞OspA ST1_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 279 23 0.9998 23 0.9828 0.983 5
＞OspA ST1_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 275 19 0.9999 20 0.8131 0.813 10
＞OspA ST1_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 288 32 0.832 32 0.8105 0.674 11
＞OspA ST1_SS_VSV-G_Indiana 272 16 0.9998 16 0.9749 0.975 7
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 256 17 0.9998 17 0.9888 0.989 1
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 256 17 0.9998 17 0.9857 0.986 4
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 255 16 0.9998 16 0.9722 0.972 12
＞Camp2_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 254 15 0.9998 15 0.9852 0.985 6
＞Camp2_SS-刺突_CoV2_短 251 12 0.9998 13 0.9855 0.985 5
＞Camp2_SS-刺突_CoV2_長 260 21 0.9998 24 0.7542 0.754 13
＞Camp2_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 258 19 0.9998 19 0.9872 0.987 2
＞Camp2_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 269 30 0.9997 30 0.9743 0.974 11
＞Camp2_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 259 20 0.9998 20 0.984 0.984 7
＞Camp2_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 260 21 0.3334 0 0 0 16
＞Camp2_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 262 23 0.9998 26 0.9802 0.98 9
＞Camp2_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 260 21 0.6661 21 0.4954 0.33 15
＞Camp2_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 262 23 0.9998 23 0.9805 0.98 8
＞Camp2_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 258 19 0.9998 20 0.6496 0.649 14
＞Camp2_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 271 32 0.9996 32 0.9769 0.977 10
＞Camp2_SS_VSV-G_Indiana 255 16 0.9998 16 0.9858 0.986 3
＞PITP_SS_Flu-HA_A/New Caledonia/20/1999 416 17 0.9999 17 0.9859 0.986 1
＞PITP_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 416 17 0.9999 17 0.9834 0.983 5
＞PITP_SS_Flu-HA_A/Moscow/10/1999 415 16 0.9998 16 0.9769 0.977 14
＞PITP_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 414 15 0.9999 15 0.9845 0.984 4
＞PITP_SS-刺突_CoV2_短 411 12 0.9999 13 0.9811 0.981 11
＞PITP_SS-刺突_CoV2_長 420 21 0.9999 22 0.9832 0.983 8
＞PITP_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 418 19 0.9999 19 0.9851 0.985 2
＞PITP_SS_VZV-gE_Oka-疫苗 429 30 0.9998 30 0.9772 0.977 13
＞PITP_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 419 20 0.9998 20 0.9846 0.984 3
＞PITP_SS_VZV-gK_Oka-疫苗 420 21 0.9999 22 0.5427 0.543 16
＞PITP_SS_麻疹病毒-F_Edmonston-Zagreb-疫苗 422 23 0.9999 24 0.9826 0.983 9
＞PITP_SS_風疹病毒-E1_RA27/3-疫苗 420 21 0.9944 21 0.7335 0.729 15
＞PITP_SS_風疹病毒-E2_RA27/3-疫苗 422 23 0.9998 23 0.9825 0.982 10
＞PITP_SS_流行性腮腺炎病毒F_Miyahara-疫苗 418 19 0.9998 20 0.9833 0.983 6
＞PITP_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 431 32 0.9987 32 0.9817 0.98 12
＞PITP_SS_VSV-G_Indiana 415 16 0.9998 16 0.9833 0.983 6
另外，訊息肽及其切割位點不如蛋白質的成熟區域保守(Nielsen等人 (2019), The Protein Journal, 38:200-216)。因此，為了瞭解訊息序列在物種和亞型水準上的差異，分析了幾種血凝素訊息序列的同源性。 表 2展示了對於A型流感病毒(H1N1和H3N2亞型)和B型流感病毒(Victoria和Yamagata譜系)測試的幾種毒株，並且所得共有血凝素訊息序列示於 表 2中。
基於這些電腦結果，將所述組套縮窄到選擇用於下游測試的構築體。選擇的訊息序列和抗原的最終組合伴隨每種構築體的相應SignalP 6.0得分示於 表 8和 表 9中。對應於此mRNA組套設計的胺基酸序列示於 表 7中。在 表 7中，構築體識別名稱提供了關於抗原的資訊，以及病毒糖蛋白訊息序列的簡要表示，以及是否摻入跨膜結構域的指示(記為“TMB”)。
隨後，由 表 7中展示的構築體產生mRNA。mRNA產生方法與實例1中所述的方法相同。確定了從此組套中的構築體產生的mRNA的參數，包括加帽反應的效率和聚(A)尾的長度。所有mRNA都被充分加帽並加聚A尾。 表 9- 所選訊息序列的 SignalP 6.0 分析的結果
名稱 長度 SS長度 SS似然性 切割後 切割概率 [E]x[G] 秩
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 273 17 0.9998 17 0.9823 0.9821 9
＞OspA ST1_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 271 15 0.9998 15 0.9687 0.9685 12
＞OspA ST1_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 275 19 0.9998 19 0.9831 0.9829 6
＞OspA ST1_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 276 20 0.9998 20 0.9831 0.9829 6
＞OspA ST1_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 288 32 0.832 32 0.8105 0.6743 14
＞Camp2_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 256 17 0.9998 17 0.9857 0.9855 6
＞Camp2_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 254 15 0.9998 15 0.9852 0.9850 8
＞Camp2_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 258 19 0.9998 19 0.9872 0.9870 3
＞Camp2_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 259 20 0.9998 20 0.984 0.9838 9
＞Camp2_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 271 32 0.9996 32 0.9769 0.9765 13
＞PITP_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 416 17 0.9999 17 0.9834 0.9833 8
＞PITP_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 414 15 0.9999 15 0.9845 0.9844 6
＞PITP_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 418 19 0.9999 19 0.9851 0.9850 2
＞PITP_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 419 20 0.9998 20 0.9846 0.9844 5
＞PITP_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 431 32 0.9987 32 0.9817 0.9804 15
表 10- 擴展 mRNA 設計組套的胺基酸序列設計
SEQ ID NO/ 描述 胺基酸序列
OspA ST1 SEQ ID NO: 151 MKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 SEQ ID NO: 152 MKAILVVLLYTFATANAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 SEQ ID NO: 153 MKAIIVLLMVVTSNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 SEQ ID NO: 154 MVPQALLFVPLLVFPLCFGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 SEQ ID NO: 155 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 SEQ ID NO: 156 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
OspA ST1_SS_Flu-HA_A/California/7/2009_TMB SEQ ID NO: 157 MKAILVVLLYTFATANAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKSGSILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFGSG
OspA ST1_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013_TMB SEQ ID NO: 158 MKAIIVLLMVVTSNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKSGSSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVGSG
OspA ST1_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗_TMB SEQ ID NO: 159 MVPQALLFVPLLVFPLCFGKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKSGSVLLSAGALTALMLIIFLMTCWGSG
OspA ST1_SS_VZV-gI_Oka-疫苗_TMB SEQ ID NO: 160 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKSGSIIIPIVASVMILTAMVIVIVIGSG
OspA ST1_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76_TMB SEQ ID NO: 161 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKSNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKSGSWIPAGIGVTGVIIAVIALFCIGSG
Camp2 SEQ ID NO: 162 MVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 SEQ ID NO: 163 MKAILVVLLYTFATANAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 SEQ ID NO: 164 MKAIIVLLMVVTSNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 SEQ ID NO: 165 MVPQALLFVPLLVFPLCFGVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 SEQ ID NO: 166 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 SEQ ID NO: 167 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAA
Camp2_SS_Flu-HA_A/California/7/2009_TMB SEQ ID NO: 168 MKAILVVLLYTFATANAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAASGSILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFGSG
Camp2_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013_TMB SEQ ID NO: 169 MKAIIVLLMVVTSNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAASGSSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVGSG
Camp2_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗_TMB SEQ ID NO: 170 MVPQALLFVPLLVFPLCFGVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAASGSVLLSAGALTALMLIIFLMTCWGSG
Camp2_SS_VZV-gI_Oka-疫苗_TMB SEQ ID NO: 171 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAASGSIIIPIVASVMILTAMVIVIVIGSG
Camp2_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76_TMB SEQ ID NO: 172 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSVEPTTTISATSTHELSASDARNSIQLLNAHIATLQSVQKSVPGSDYSDQIRDLLKAAFDLRGLIETLAHGGIPFYDPSTIMPRIKLVATTIDTIHTATTTLQNKVRPAHVELGLEVTKAVLLTANPASTAKELDAEGAALKARLEKVSQYPDLTPNDVATVYVRTNFSKTIWQVRANRDRYILGHKSAAVYKTLNHAITKAVGVRLNPKTTVGNIQAARTELLAAYQTAFNSPDVKKAASGSWIPAGIGVTGVIIAVIALFCIGSG
PITP SEQ ID NO: 173 MAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_Flu-HA_A/California/7/2009 SEQ ID NO: 174 MKAILVVLLYTFATANAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013 SEQ ID NO: 175 MKAIIVLLMVVTSNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗 SEQ ID NO: 176 MVPQALLFVPLLVFPLCFGAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_VZV-gI_Oka-疫苗 SEQ ID NO: 177 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76 SEQ ID NO: 178 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVT
PITP_SS_Flu-HA_A/California/7/2009_TMB SEQ ID NO: 179 MKAILVVLLYTFATANAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVTSGSILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFGSG
PITP_SS_Flu-HA_B/Phuket/3073/2013_TMB SEQ ID NO: 180 MKAIIVLLMVVTSNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVTSGSSTAASSLAVTLMLAIFIVYMVGSG
PITP_SS_狂犬病病毒-G_Pasteur-疫苗_TMB SEQ ID NO: 181 MVPQALLFVPLLVFPLCFGAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVTSGSVLLSAGALTALMLIIFLMTCWGSG
PITP_SS_VZV-gI_Oka-疫苗_TMB SEQ ID NO: 182 MFLIQCLISAVIFYIQVTNAAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVTSGSIIIPIVASVMILTAMVIVIVIGSG
PITP_SS_伊波拉病毒-GP_Mayinga-76_TMB SEQ ID NO: 183 MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSAGPTVTVIPVGREGGDITISGKGFSTTGFGVYVAVAPASVPEFYGNSDKFYGYDPSKDTTESPSTIWVYTPSQKAIGSRFAQGRPMNNDGSFTITMKAPPFEQGKDFVVLTTKAHGVGKTDHSDDTRTPVTYREATPAPTGPKTPIAPSKQPSKQAAPSKQVKPSKQAGPNKQSTTPQQKTAEHRSQTPAAHRTMTKQVCTIGASKVTSGSLTWGIRTSFTSYLRGPIANGSWKLSGGANWNGSAFTFPLTSGSFDPATKSGSLKYSGSVHMTGHHGILDMTLAEPSLQIKGSTGHLYLDVKSSSMDGKKTNYGRVDFATFGVSVSGNAAIKGSPVKLTATGAKAFAGFYRAGEPMNPLSTNLTLSAEKVCHNVTVDAVTGKVIGDDSGKGAGRGLPVTSGSWIPAGIGVTGVIIAVIALFCIGSG
實例 5 ：來自擴展 mRNA 設計組套的體外抗原表現
本實例概述了在將mRNA組套(描述於實例4中)轉染到HEK293T細胞中之後對細胞活力、蛋白質表現和定位的分析。轉染和蛋白質印跡分析先前描述於實例1中。所分析的蛋白質印跡中的抗原是OspA ST1、CAMP2和PITP。
測量轉染後用mRNA構築體組套進行兩次表現測試所得的HEK Expi293F細胞計數和細胞活力百分比。所有細胞活力值在轉染後24小時和48小時均超過80%，表明狀況是正常的，並且沒有mRNA構築體產生脫靶細胞毒性。 OspA
如 圖 9中所示，在轉染後48小時，在HEK Expi293F細胞中實現了與來源於A型流感病毒、B型流感病毒、狂犬病病毒、VZV和伊波拉病毒糖蛋白的訊息序列(在凝膠上標記為“SS”)融合的OspA ST1的體外表現，所述OspA ST1具有或不具有它們相應的跨膜結構域(“TMB”)。使用1 : 2000稀釋度的針對OspA的兔多株抗體(ABCAM ab106081)檢測OspA ST1(預期尺寸約28-34 kDa)。對照包括不具有任何SS或任何脂化序列的OspA ST1構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組OspA ST1(所有凝膠上的最後一個泳道)。關於測試OspA定位，從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品中收集樣品。這些結果證實，添加跨膜結構域誘導OspA ST1定位於細胞膜處，並減少分泌和細胞內定位。
此外，由於 圖 9中上清液級分的代表性凝膠展現出微弱的訊息(圖中最後一列)，將上清液OspA級分濃縮7倍，並且將所得體積的一半去醣基化(在凝膠上用“D”表示)，以在酶促處理之前和之後通過蛋白質印跡分析蛋白質，如 圖 10中所示。對於所測試的所有OspA構築體，OspA ST1存在於上清液級分中，但表現水準不同。例如，與伊波拉病毒糖蛋白SS融合的OspA ST1構築體(與其他構築體相比也具有較低的SignalP切割得分)在上清液級分中具有相對於其他OspA構築體降低的表現(參見 圖 10，第二凝膠，第5和第6泳道)。另外，使構築體與跨膜結構域融合降低了(但沒有完全消除)一些樣品中的OspA上清液檢測。 CAMP2
如 圖 11中所示，在轉染後48小時，在HEK Expi293F細胞中實現了與來源於A型流感病毒、B型流感病毒、狂犬病病毒、VZV和伊波拉病毒糖蛋白的訊息序列(在凝膠上標記為“SS”)融合的CAMP2的體外表現，所述CAMP2具有或不具有它們相應的跨膜結構域(“TMB”)。使用1 : 1500稀釋度的針對CAMP2的兔多株抗體(內部產生)檢測CAMP2(預期尺寸約26-32 kDa)。對照包括不具有任何SS的CAMP2構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組CAMP2(所有凝膠上的最後一個泳道)。關於測試CAMP2定位，從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品收集樣品。這些結果證實，添加跨膜結構域誘導CAMP2定位於細胞膜處，並減少分泌和細胞內定位(與具有或不具有跨膜結構域的構築體相比，在最後一列中標記為“上清液”)。蛋白質印跡分析證實，根據分泌訊息肽或跨膜結構域的存在，CAMP2表現良好並定位於預期級分中。 PITP
如 圖 12中所示，在轉染後48小時，在HEK Expi293F細胞中實現了與來源於A型流感病毒、B型流感病毒、狂犬病病毒、VZV和伊波拉病毒糖蛋白的訊息序列(在凝膠上標記為“SS”)融合的PITP的體外表現，所述PITP具有或不具有它們相應的跨膜結構域(“TMB”)。使用1 : 1000稀釋度的針對PITP的小鼠多株抗體(內部產生)檢測PITP(預期尺寸約42-48 kDa)。對照包括不具有任何SS或任何TMB的PITP構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組PITP(所有凝膠上的最後一個泳道)。關於測試PITP定位，從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品收集樣品。像OspA和CAMP2抗原定位分析一樣，這些結果證實，添加跨膜結構域誘導PITP定位於細胞膜處，並減少分泌和細胞內定位(與具有或不具有跨膜結構域的構築體相比，在最後一列中標記為“上清液”)。儘管如此，含PITP跨膜的構築體的確顯示有一些逃逸到上清液級分中。
此蛋白質印跡分析證實，根據分泌訊息肽或跨膜結構域的存在，PITP表現良好並定位於預期級分中。 總結
為了比較OspA ST1、CAMP2和PITP的蛋白質印跡分析，將蛋白質表現和定位結果製表，如 圖 13中所示。通常，與含CAMP2或PITP的構築體相比，含OspA ST1抗原的構築體表現不良。所有三種蛋白抗原都在它們的預期位置表現，但表現程度不同，並且當引入跨膜結構域時展示以不同的程度有一些逃逸到上清液中。SignalP切割得分低的構築體OspA ST1_SS-伊波拉病毒-GP在上清液級分中顯示出較低的表現，表明它可能在細胞內級分中積累。
考慮到本文公開的說明書和實踐，本揭露的其他實施例對於本領域技術人員而言是清楚的。所述說明書和實例旨在僅被視為例示性的，所附申請專利範圍指示了本揭露的真實範圍和精神。
將本文引用的所有專利和出版物都通過引用以其整體併入本文。
圖 1描繪了外表面蛋白A(OspA)血清型1(ST1)和血清型2(ST2)mRNA構築體的結構。使用OspA序列，設計不同的mRNA序列以引導OspA在細胞內表現、分泌、或跨膜，所述OspA序列與血凝素分泌訊息(HA SS)和/或HA跨膜結構域(HA TMB)不融合或融合。使用OspA天然序列以及具有醣基化位點突變(Gly-)以避免由mRNA編碼的蛋白質的醣基化的序列。
圖 2A- 圖 2B描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了在HEK293T細胞上清液中OspA ST1和ST2 mRNA的體外表現。描繪了不具有或具有HA分泌訊息以及不具有或具有醣基化位點突變的mRNA-OspA ST1(圖2A)和mRNA-OspA ST2(圖2B)。還使用了陰性對照(緩衝液)和陽性對照(重組OspA)。用疫苗mRNA轉染HEK293細胞。48小時之後，收集上清液並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。
圖 3A- 圖 3C描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了在HEK293細胞中含有HA SS和HA TMB以及不具有或具有醣基化位點突變的OspA ST1 mRNA的體外表現。示出了細胞上清液(圖3A)、粗萃物(圖3B)和細胞內區室(圖3C)。48小時或72小時之後，收集上清液和細胞並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。
圖 4A- 圖 4C描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了在HEK293細胞中含有HA SS和HA TMB以及不具有或具有醣基化位點突變的OspA ST2 mRNA的體外表現。示出了細胞上清液(圖4A)、粗萃物(圖4B)和細胞內區室(圖4C)。48小時或72小時之後，收集上清液和細胞並進行蛋白質印跡。用識別OspA的多株兔抗體檢測印跡的蛋白質。
圖 5描繪了在HEK293細胞中通過mRNA遞送的OspA ST1抗原的抗原性。使用轉染的細胞上清液以用功能性單株抗體LA-2、857-2和221-7進行夾心ELISA。
圖 6描繪了在HEK293細胞中通過mRNA遞送的OspA ST2抗原的抗原性。使用轉染的細胞上清液以用功能性單株抗體857-2和221-7進行夾心ELISA。
圖 7A- 圖 7B描繪了來自第1劑後(第20天)(圖7A)和第2劑後(第35天)(圖7B)的抗OspA ST1 IgG ELISA的IgG力價值。HA-SS = 分泌訊息血凝素；TMB = 跨膜結構域；Gly(-) = 醣基化位點突變；虛線 = 定量限。
圖 8是mRNA構築體的擴展組套(panel)中包括的元件的示意圖。所述組套由三種不同的原核抗原組成：如示意圖左側所展示的OspA ST1、CAMP2和PITP。示意圖的右側顯示抗原與來源於以下病毒家族的糖蛋白的訊息序列(標記為“SS”)融合：流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒。一些組套構築體進一步含有相應的糖蛋白跨膜結構域(標記為“TMB”)。“Flu”代表“流感”病毒。
圖 9描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了轉染後在HEK Expi293F細胞中含有來自來源於流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒的糖蛋白的SS且具有或不具有它們相應的糖蛋白TMB結構域的OspA ST1 mRNA的體外蛋白質表現。使用1 : 2000稀釋度的針對OspA的兔多株抗體(ABCAM ab106081)檢測OspA ST1(預期尺寸約28-34 kDa)。對照包括不具有任何SS或任何脂化序列的OspA ST1構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組OspA ST1(所有凝膠上的最後一個泳道)。在48小時時間點從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品收集樣品。
圖 10描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了轉染後在HEK Expi293F細胞中含有來自來源於流感病毒(A型或B型亞型)和狂犬病病毒(左側凝膠)以及水痘病毒(VZV)和伊波拉病毒(右側凝膠)的糖蛋白的SS且具有或不具有它們相應的糖蛋白TMB結構域的OspA ST1 mRNA的體外蛋白質表現。在48小時時間點收集細胞上清液並濃縮7倍。將所得樣品體積的一半去醣基化(在凝膠上用“D”表示)，以在酶促處理之前和之後通過蛋白質印跡分析蛋白質。使用1 : 2000稀釋度的針對OspA的兔多株抗體(ABCAM ab106081)檢測OspA ST1(預期尺寸約28-34 kDa)。對照包括轉染對照(沒有用mRNA轉染的細胞)、不具有任何SS的OspA ST1構築體(標記為“無SS”)以及重組OspA ST1(所有凝膠上的最後一個泳道)。
圖 11描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了轉染後在HEK Expi293F細胞中含有來自來源於流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒的糖蛋白的SS且具有或不具有它們相應的糖蛋白TMB結構域的CAMP2 mRNA的體外蛋白質表現。使用1 : 1500稀釋度的針對CAMP2的兔多株抗體檢測CAMP2(預期尺寸約26-32 kDa)。對照包括不具有任何SS的CAMP2構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組CAMP2(所有凝膠上的最後一個泳道)。在48小時時間點從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品收集樣品。
圖 12描繪了蛋白質印跡圖像，其示出了轉染後在HEK Expi293F細胞中含有來自來源於流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒的糖蛋白的SS且具有或不具有它們相應的糖蛋白TMB結構域的PITP mRNA的體外蛋白質表現。使用1 : 1000稀釋度的針對PITP的小鼠多株抗體檢測PITP(預期尺寸約42-48 kDa)。對照包括不具有任何SS或任何TMB的PITP構築體(所有凝膠上的第一個泳道，標記為“無SS”)以及重組PITP(所有凝膠上的最後一個泳道)。在48小時時間點從粗萃物(總裂解物)、細胞上清液和含有細胞內區室或跨膜區室的分級分離的細胞樣品收集樣品。
圖 13表的左側匯總了轉染後在HEK Expi293F細胞中含有來自來源於流感病毒(A型或B型亞型)、狂犬病病毒、水痘病毒(VZV)或伊波拉病毒的糖蛋白的SS且具有或不具有它們相應的糖蛋白TMB結構域的OspA ST1、CAMP2和PITP mRNA構築體的蛋白質表現和定位的蛋白質印跡分析。 圖 13表的右側是來源於SignalP的電腦訊息序列預測得分。

Claims (93)

  1. 一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含： - 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及 - 編碼至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
  2. 如請求項1所述的核酸，其中所述ORF進一步包含編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽來源於能夠感染人的病毒中的病毒序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽來源於選自以下的病毒序列：流感病毒分泌訊息肽序列，以及選自以下組成之群組的非流感病毒分泌訊息肽序列：SARS CoV-2分泌訊息肽序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)分泌訊息肽序列、麻疹病毒分泌訊息肽序列、風疹病毒分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒分泌訊息肽序列、伊波拉病毒分泌訊息肽序列、天花病毒分泌訊息肽序列、和狂犬病病毒分泌訊息肽序列。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽選自以下組成之群組：流感病毒血凝素(HA)分泌訊息肽序列、SARS CoV-2刺突分泌訊息肽序列、VZV gB分泌訊息肽序列、VZV gE分泌訊息肽序列、VZV gI分泌訊息肽序列、VZV gK分泌訊息肽序列、麻疹病毒F蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E1蛋白分泌訊息肽序列、風疹病毒E2蛋白分泌訊息肽序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白分泌訊息肽序列、伊波拉病毒GP蛋白分泌訊息肽序列、天花病毒6kDa IC蛋白分泌訊息肽序列和狂犬病病毒G蛋白分泌訊息肽序列，優選地其中所述病毒分泌訊息肽包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA分泌訊息肽序列。
  6. 如請求項5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1X 2LX 3VX 4LX 5TFX 6X 7X 8X 9A(SEQ ID NO: 145)，其中 X 1選自A和V； X 2選自I和K； X 3選自V和L； X 4選自L和M； X 5選自Y和C； X 6選自T和A； X 7選自T和A； X 8選自A和T；並且 X 9選自N和Y。
  7. 如請求項5或6所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 95-109的胺基酸序列。
  8. 如請求項5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKX 1IIALSX 2ILCLVFX 3(SEQ ID NO: 146)，其中 X 1選自T和A； X 2選自Y、N、C和H；並且 X 3選自T和A。
  9. 如請求項8所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 110-131的胺基酸序列。
  10. 如請求項5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MKAIIVLLMVVTSX 1A(SEQ ID NO: 147)，其中 X 1選自S和N。
  11. 如請求項5所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含胺基酸序列MX 1AIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 148)，其中 X 1選自K和E。
  12. 如請求項10或11所述的核酸，其中所述HA分泌訊息肽序列包含選自SEQ ID NO: 132-144的胺基酸序列。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽包含選自以下組成之群組的胺基酸序列： MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)； MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO: 2)； MKTIIALSYILCLVFA(SEQ ID NO: 3)； MKAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO: 4)； MFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 5)； MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO: 6)； MSPCGYYSKWRNRDRPEYRRNLRFRRFFSSIHPNAAAGSGFNGPGVFITSVTGVWLCFLCIFSMFVTAVVS(SEQ ID NO: 7)； MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRA(SEQ ID NO: 8)； MFLIQCLISAVIFYIQVTNA(SEQ ID NO: 9)； MQALGIKTEHFIIMCLLSGHA(SEQ ID NO: 10)； MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTG(SEQ ID NO: 11)； MGAAAALTAVVLQGYNPPAYG(SEQ ID NO: 12)； MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA(SEQ ID NO: 13)； MKVFLVTCLGFAVFSSSVC(SEQ ID NO: 14)； MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS(SEQ ID NO: 15)； MRSLIIFLLFPSIIYS(SEQ ID NO: 16)；以及 MVPQALLFVPLLVFPLCFG(SEQ ID NO: 184)。
  14. 如請求項13所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽包含MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的N末端。
  16. 如請求項1-14中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽位於所述抗原性原核多肽的C末端。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的核酸，其中所述病毒分泌訊息肽用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
  18. 如請求項2-17中任一項所述的核酸，其中所述TMB： (a)   包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b)   包含至少50%的疏水性胺基酸殘基，優選選自以下組成之群組：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c)   包含至少一個α螺旋。
  19. 如請求項2-18中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
  20. 如請求項2-19中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於非人類序列。
  21. 如請求項18-20中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於原核跨膜蛋白，並且其中所述TMB是所述原核跨膜蛋白的TMB。
  22. 如請求項18-20中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽不是來源於原核跨膜蛋白。
  23. 如請求項22所述的核酸，其中所述TMB來源於病毒序列。
  24. 如請求項23所述的核酸，其中所述TMB來源於選自以下組成之群組的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
  25. 如請求項24所述的核酸，其中所述TMB選自以下組成之群組：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
  26. 如請求項18-20和22-25中任一項所述的核酸，其中所述TMB包含選自以下組成之群組的胺基酸序列： ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)； ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)； ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)； STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)； WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)； FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)； AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)； IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)； YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)； IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)； LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)； WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)； IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)； WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及 VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
  27. 如請求項16所述的核酸，其中所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
  28. 如請求項2和18-27中任一項所述的核酸，其中所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
  29. 如請求項2和18-28中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
  30. 如請求項2和18-28中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
  31. 一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含： - 編碼至少一種抗原性多肽、優選抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及 - 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列，其中所述TMB與所述抗原性多肽是異源的， 其中任選地，所述ORF進一步包含編碼至少一種分泌訊息肽、優選病毒分泌訊息肽、更優選如前述請求項中任一項所述的病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列。
  32. 一種包含開放閱讀框(ORF)的核酸，其中所述ORF包含： - 編碼至少一種抗原性原核多肽的多核苷酸序列，以及 - 編碼至少一種跨膜結構域(TMB)的多核苷酸序列。
  33. 如請求項32所述的核酸，其中所述TMB： (a)   包含15至50個胺基酸殘基、優選15至30個胺基酸殘基、更優選18至25個胺基酸殘基或由其組成；和/或 (b)   包含至少50%的疏水性胺基酸殘基，所述疏水性胺基酸殘基優選選自以下組成之群組：丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、擷胺酸、***酸、色胺酸和酪胺酸；和/或 (c)   包含至少一個α螺旋。
  34. 如請求項32或33所述的核酸，其中所述TMB來源於整合膜蛋白，優選來源於單程膜蛋白，更優選來源於二穿膜蛋白，甚至更優選來源於I型二穿膜蛋白。
  35. 如請求項34所述的核酸，其中所述TMB來源於非人類序列。
  36. 如請求項33-35中任一項所述的核酸，其中所述抗原性多肽不是來源於跨膜蛋白。
  37. 如請求項33-36中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於病毒序列。
  38. 如請求項33-37中任一項所述的核酸，其中所述TMB來源於選自以下組成之群組的病毒跨膜結構域序列：流感病毒跨膜結構域序列，以及選自以下的非流感病毒跨膜結構域序列：SARS CoV-2跨膜結構域序列、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)跨膜結構域序列、麻疹病毒跨膜結構域序列、風疹病毒跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒跨膜結構域序列、伊波拉病毒跨膜結構域序列、和狂犬病病毒跨膜結構域序列。
  39. 如請求項38所述的核酸，其中所述TMB選自以下組成之群組：流感病毒血凝素(HA)跨膜結構域序列、SARS CoV-2刺突跨膜結構域序列、VZV gB跨膜結構域序列、VZV gE跨膜結構域序列、VZV gI跨膜結構域序列、VZV gK跨膜結構域序列、麻疹病毒F蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E1蛋白跨膜結構域序列、風疹病毒E2蛋白跨膜結構域序列、流行性腮腺炎病毒F蛋白跨膜結構域序列、伊波拉病毒GP蛋白跨膜結構域序列和狂犬病病毒G蛋白跨膜結構域序列，優選地其中所述TMB包含來自A型流感病毒或B型流感病毒、更優選來自A型流感病毒的HA跨膜結構域序列。
  40. 如請求項39所述的核酸，其中所述TMB包含選自以下的胺基酸序列： ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)； ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO: 18)； ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO: 19)； STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO: 20)； WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO: 21)； FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO: 22)； AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO: 23)； IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO: 24)； YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO: 25)； IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO: 26)； LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO: 27)； WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO: 28)； IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO: 29)； WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO: 30)；以及 VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO: 185)。
  41. 如請求項40所述的核酸，其中所述TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO: 17)的胺基酸序列。
  42. 如請求項32-41中任一項所述的核酸，其中所述TMB用連接子附接至所述抗原性原核多肽。
  43. 如請求項32-42中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的N末端。
  44. 如請求項32-42中任一項所述的核酸，其中所述TMB位於所述抗原性原核多肽的C末端。
  45. 如請求項32-44中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於選自以下組成之群組的屬的細菌：醋桿菌屬( Acetobacter)、不動桿菌屬( Acinetobacter)、放線菌屬( Actinomyces)、氣球菌屬( Aerococcus)、土壤桿菌屬( Agrobacterium)、無形體屬( Anaplasma)、固氮根瘤菌屬( Azorhizobia)、固氮菌屬( Azotobacter)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、擬桿菌屬( Bacteroides)、巴爾通體屬( Bartonella)、鮑特菌屬( Bordetella)、疏螺旋體屬( Borrelia)、布魯氏菌屬( Brucella)、伯克霍爾德菌屬( Burkkolderia)、鞘桿菌屬( Calymmatobacterium)、彎曲桿菌屬( Campylobacter)、衣原體屬( Chlamydia)、嗜衣原體屬( Chlamydophila)、梭菌屬( Clostridium)、棒狀桿菌屬( Corynebacterium)、柯克斯體屬( Coxiella)、丙酸桿菌屬( Cutibacterium)、埃立克體屬( Ehrlichia)、腸桿菌屬( Enterobacter)、腸球菌屬( Enterococcus)、埃希菌屬( Escherichia)、弗朗西絲菌屬( Francisella)、梭形桿菌屬( Fusobacterium)、加德納菌屬( Gardnerella)、嗜血桿菌屬( Haemophilus)、螺桿菌屬( Helicobacter)、克雷伯菌屬( Klebsiella)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、軍團菌屬( Legionella)、李斯特菌屬( Listeria)、甲烷桿菌屬( Methanobacterium)、微桿菌屬( Microbacterium)、微球菌屬( Micrococcus)、莫拉菌屬( Moraxella)、分枝桿菌屬( Mycobacterium)、支原體屬( Mycoplasma)、奈瑟菌屬( Neisseria)、巴斯德菌屬( Pasteurella)、片球菌屬( Pediococcus)、消化鏈球菌屬( Peptostreptococcus)、卟啉單胞菌屬( Porphyromonas)、普雷沃菌屬( Prevotella)、丙酸桿菌屬( Propionibacterium)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、根瘤菌屬( Rhizobium)、立克次體屬( Rickettsia)、羅卡利馬體屬( Rochalimaea)、羅思氏菌屬( Rothia)、沙門菌屬( Salmonella)、沙雷菌屬( Serratia)、志賀菌屬( Shigella)、八疊球菌屬( Sarcina)、螺菌屬( Spirillum)、螺旋體屬( Spirochaetes)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)、寡養單胞菌屬( Stenotrophomonas)、鏈桿菌屬( Streptobacillus)、鏈球菌屬( Streptococcus)、四聯球菌屬( Tetragenococcus)、密螺旋體屬( Treponema)、弧菌屬( Vibrio)、 Viridans、沃爾巴克氏體屬( Walbachia)和耶爾森菌屬( Yersinia)，優選來自選自以下組成之群組的物種的細菌：橙黃色醋桿菌( Acetobacter aurantius)、鮑氏不動桿菌( Acinetobacter baumannii)、以色列放線菌( Actinomyces israelii)、放射形土壤桿菌( Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤桿菌( Agrobacterium tumefaciens)、嗜吞噬細胞無形體( Anaplasma phagocytophilum)、莖瘤固氮根瘤菌( Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌( Azotobacter vinelandii)、炭疽芽孢桿菌( Bacillus anthracis)、短小芽孢桿菌( Bacillus brevis)、蠟狀芽孢桿菌( Bacillus cereus)、紡錘芽孢桿菌( Bacillus fusiformis)、地衣芽孢桿菌( Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌( Bacillus megaterium)、蕈狀芽孢桿菌( Bacillus mycoides)、嗜熱脂肪芽孢桿菌( Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、蘇雲金芽孢桿菌( Bacillus Thuringiensis)、脆弱擬桿菌( Bacteroides fragilis)、牙齦擬桿菌( Bacteroides gingivalis)、產黑色素擬桿菌( Bacteroides melaninogenicus)、漢賽巴爾通體( Bartonella henselae)、五日熱巴爾通體( Bartonella Quintana)、支氣管敗血鮑特菌( Bordetella bronchiseptica)、百日咳鮑特菌( Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋體( Borrelia burgdorferi)、流產布魯氏菌( Brucella abortus)、馬爾他布魯氏菌( Brucella melitensis)、豬種布魯氏菌( Brucella suis)、鼻疽伯克霍爾德菌( Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克霍爾德菌( Burkholderia pseudomallei)、洋蔥伯克霍爾德菌( Burkholderia cepacia)、肉芽腫鞘桿菌( Calymmatobacterium granulomatis)、大腸彎曲桿菌( Campylobacter coli)、胎兒彎曲桿菌( Campylobacter fetus)、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)、幽門彎曲桿菌( Campylobacter pylori)、沙眼衣原體( Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體( Chlamydophila pneumoniae)、鸚鵡嗜熱衣原體( Chlamydophila psittaci)、肉毒梭菌( Clostridium botulinum)、艱難梭菌( Clostridium difficile)、產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)、破傷風梭菌( Clostridium tetani)、白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒狀桿菌( Corynebacterium fusiforme)、貝納柯克斯體( Coxiella burnetii)、痤瘡丙酸桿菌( Cutibacterium acnes)、貪婪丙酸桿菌( Cutibacterium avidum)、顆粒丙酸桿菌( Cutibacterium granulosum)、納姆丙酸桿菌( Cutibacterium namnetense)、胡莫丙酸桿菌( Cutibacterium humerusii)、查菲埃立克體( Ehrlichia chaffeensis)、陰溝腸桿菌( Enterobacter cloacae)、鳥腸球菌( Enterococcus avium)、耐久腸球菌( Enterococcus durans)、糞腸球菌( Enterococcus faecalis)、屎腸球菌( Enterococcus faecium)、鶉雞腸球菌( Enterococcus galllinarum)、馬婁腸球菌( Enterococcus maloratus)、大腸桿菌( Escherichia coli)、土拉熱弗朗西絲菌( Francisella tularensis)、具核梭形桿菌( Fusobacterium nucleatum)、***加德納菌( Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血桿菌( Haemophilus ducreyi)、流感嗜血桿菌( Haemophilus influenzae)、副流感嗜血桿菌( Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血桿菌( Haemophilus pertussis)、***嗜血桿菌( Haemophilus vaginalis)、幽門螺桿菌( Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae)、嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus)、保加利亞乳桿菌( Lactobacillus bulgaricus)、乾酪乳桿菌( Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)、嗜肺軍團菌( Legionella pneumophila)、單核細胞增生李斯特菌( Listeria monocytogenes)、外部甲烷桿菌( Methanobacterium extroquens)、多形微桿菌( Microbacterium multiforme)、藤黃微球菌( Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌( Moraxella catarrhalis)、鳥分枝桿菌( Mycobacterium avium)、牛分枝桿菌( Mycobacterium bovis)、白喉分枝桿菌( Mycobacterium diphtheriae)、胞內分枝桿菌( Mycobacterium intracellulare)、麻風分枝桿菌( Mycobacterium leprae)、鼠麻風分枝桿菌( Mycobacterium lepraemurium)、草分枝桿菌( Mycobacterium phlei)、恥垢分枝桿菌( Mycobacterium smegmatis)、結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、發酵支原體( Mycoplasma fermentans)、生殖支原體( Mycoplasma genitalium)、人型支原體( Mycoplasma hominis)、穿透支原體( Mycoplasma penetrans)、肺炎支原體( Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌( Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌( Neisseria meningitidis)、多殺巴斯德菌( Pasteurella multocida)、土拉巴斯德菌( Pasteurella tularensis)、消化鏈球菌( Peptostreptococcus)、牙齦卟啉單胞菌( Porphyromonas gingivalis)、產黑色素普雷沃菌( Prevotella melaninogenica)、痤瘡丙酸桿菌( Propionibacterium acnes)、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)、放射形根瘤菌( Rhizobium radiobacter)、普氏立克次體( Rickettsia prowazekii)、鸚鵡熱立克次體( Rickettsia psittaci)、五日熱立克次體( Rickettsia quintana)、立氏立克次體( Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次體( Rickettsia trachomae)、漢賽羅卡利馬體( Rochalimaea henselae)、五日熱羅卡利馬體( Rochalimaea quintana)、齲齒羅思氏菌( Rothia dentocariosa)、腸炎沙門菌( Salmonella enteritidis)、傷寒沙門菌( Salmonella typhi)、鼠傷寒沙門菌( Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌( Serratia marcescens)、痢疾志賀菌( Shigella dysenteriae)、迂回螺菌( Spirillum volutans)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)、嗜麥芽寡養單胞菌( Stenotrophomonas maltophilia)、無乳鏈球菌( Streptococcus agalactiae)、鳥鏈球菌( Streptococcus avium)、牛鏈球菌( Streptococcus bovis)、倉鼠鏈球菌( Streptococcus cricetus)、屎鏈球菌( Streptococcus faceium)、糞鏈球菌( Streptococcus faecalis)、野鼠鏈球菌( Streptococcus ferus)、雞鏈球菌( Streptococcus gallinarum)、乳酸鏈球菌( Streptococcus lactis)、輕型鏈球菌( Streptococcus mitior)、緩症鏈球菌( Streptococcus mitis)、變異鏈球菌( Streptococcus mutans)、口腔鏈球菌( Streptococcus oralis)、肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae)、化膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、大鼠鏈球菌( Streptococcus rattus)、唾液鏈球菌( Streptococcus salivarius)、血鏈球菌( Streptococcus sanguis)、遠緣鏈球菌( Streptococcus sobrinus)、梅毒密螺旋體( Treponema pallidum)、齒垢密螺旋體( Treponema denticola)、霍亂弧菌( Vibrio cholerae)、逗號弧菌( Vibrio comma)、副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)、創傷弧菌( Vibrio vulnificus)、草綠色鏈球菌( Viridans streptococci)、沃爾巴克氏體( Wolbachia)、小腸結腸炎耶爾森菌( Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森菌( Yersinia pestis)和假結核耶爾森菌( Yersinia pseudotuberculosis) 。
  46. 如請求項1-45中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽來源於疏螺旋體屬的細菌，優選選自物種伯氏疏螺旋體( B. burgdorferi)、埃氏疏螺旋體( B. afzelii)、伽氏疏螺旋體( B. garinii)、巴伐利亞疏螺旋體( B. bavariensis)、馬約氏疏螺旋體( B. mayonii)、斯柏曼疏螺旋體( B. spielmanii)、葡萄牙疏螺旋體( B. lusitaniae)、比塞蒂疏螺旋體( B. bissettii)和/或法雷斯疏螺旋體( B. valaisiana)。
  47. 如請求項1-46中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽是OspA或其片段或變體，其中所述OspA或其片段或變體包含至少5個胺基酸，優選地其中所述抗原性原核多肽包含： (a) 來源於OspA ST1的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKGYDLKGELSSEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK(SEQ ID NO : 31)； (b) 來源於OspA ST2的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGTKDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO : 32)； (c) 來源於OspA ST3的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEGEKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK(SEQ ID NO: 186)； (d) 來源於OspA ST4的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEGEKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK(SEQ ID NO: 187)； (e) 來源於OspA ST5的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGKAVEITTLEKLKDALK(SEQ ID NO: 188)； (f) 來源於OspA ST6的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEGEKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK(SEQ ID NO: 189)； (g) 來源於OspA ST7的胺基酸序列，其優選與以下序列具有至少85%同一性：KQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK(SEQ ID NO: 190)； (h) (a)-(g) 的任何組合； (i) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列和根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列；或 (j) 根據 (a) 的來源於OspA ST1的序列、根據 (b) 的來源於OspA ST2的序列、根據 (c) 的來源於OspA ST3的序列、根據 (d) 的來源於OspA ST4的序列、根據 (e) 的來源於OspA ST5的序列、根據 (f) 的來源於OspA ST6的序列和根據 (g) 的來源於OspA ST7的序列。
  48. 如請求項1-47中任一項所述的核酸，其中所述抗原性原核多肽包含至少一個突變的醣基化位點，優選至少一個突變的N-連接的醣基化位點。
  49. 如請求項1-48中任一項所述的核酸，其中所述核酸的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
  50. 如請求項1-49中任一項所述的核酸，其中所述ORF的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
  51. 如請求項1-31中任一項所述的核酸，其中編碼所述至少一種病毒分泌訊息肽的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
  52. 如請求項18-51中任一項所述的核酸，其中編碼所述至少一種TMB的多核苷酸序列是經密碼子優化的。
  53. 如請求項1-52中任一項所述的核酸，其中所述核酸是DNA。
  54. 如請求項1-52中任一項所述的核酸，其中所述核酸是信使RNA(mRNA)，其中特定地，所述mRNA能夠是非複製mRNA、自我複製mRNA或反式複製mRNA。
  55. 如請求項54所述的核酸，其中所述mRNA包含至少一個5'非轉譯區(5' UTR)、至少一個3'非轉譯區(3' UTR)和/或至少一個多腺苷酸化(聚(A))序列。
  56. 如請求項54或55所述的核酸，其中所述mRNA包含至少一個化學修飾。
  57. 如請求項54-56中任一項所述的核酸，其中所述mRNA中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
  58. 如請求項54-57中任一項所述的核酸，其中所述ORF中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的尿嘧啶核苷酸是經化學修飾的。
  59. 如請求項56-58中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾選自以下組成之群組：假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、和2'-O-甲基尿苷。
  60. 如請求項56-59中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾選自以下組成之群組：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷、及其組合。
  61. 如請求項56-60中任一項所述的核酸，其中所述化學修飾是N1-甲基假尿苷。
  62. 一種組合物，所述組合物包含至少一種如請求項1-61中任一項所述的核酸。
  63. 如請求項62所述的組合物，所述組合物進一步包含脂質奈米顆粒(LNP)。
  64. 如請求項63所述的組合物，其中所述核酸被包封在所述LNP中。
  65. 如請求項63或64所述的組合物，其中所述LNP包含至少一種陽離子脂質。
  66. 如請求項65所述的組合物，其中所述陽離子脂質是可生物降解的。
  67. 如請求項65所述的組合物，其中所述陽離子脂質不是可生物降解的。
  68. 如請求項65-67中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質是可切割的。
  69. 如請求項65-67中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質不是可切割的。
  70. 如請求項65-69中任一項所述的組合物，其中所述陽離子脂質選自以下組成之群組：OF-02、cKK-E10、OF-Deg-Lin、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、SM-102、和ALC-0315。
  71. 如請求項65-70中任一項所述的組合物，其中所述LNP進一步包含聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質、基於膽固醇的脂質、和輔助脂質。
  72. 如請求項63-71中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為35%至55%的陽離子脂質； - 莫耳比為0.25%至2.75%的聚乙二醇(PEG)接合的(PEG化的)脂質； - 莫耳比為20%至45%的基於膽固醇的脂質；以及 - 莫耳比為5%至35%的輔助脂質， 其中所有莫耳比均相對於所述LNP的總脂質含量。
  73. 如請求項63-72中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為40%的陽離子脂質； - 莫耳比為1.5%的PEG化的脂質； - 莫耳比為28.5%的基於膽固醇的脂質；以及 - 莫耳比為30%的輔助脂質。
  74. 如請求項63-73中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為45%至50%的陽離子脂質； - 莫耳比為1.5%至1.7%的PEG化的脂質； - 莫耳比為38%至43%的基於膽固醇的脂質；以及 - 莫耳比為9%至10%的輔助脂質。
  75. 如請求項71-74中任一項所述的組合物，其中所述PEG化的脂質是二肉豆蔻醯基-PEG2000(DMG-PEG2000)或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
  76. 如請求項71-75中任一項所述的組合物，其中所述基於膽固醇的脂質是膽固醇。
  77. 如請求項71-76中任一項所述的組合物，其中所述輔助脂質是1,2-二油醯基-SN-甘油-3-磷醯乙醇胺(DOPE)或1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷醯膽鹼(DSPC)。
  78. 如請求項63-73和75-77中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為40%的選自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14的陽離子脂質； - 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000； - 莫耳比為28.5%的膽固醇；以及 - 莫耳比為30%的DOPE。
  79. 如請求項63-72和74-77中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為50%的SM-102； - 莫耳比為1.5%的DMG-PEG2000； - 莫耳比為38.5%的膽固醇；以及 - 莫耳比為10%的DSPC。
  80. 如請求項63-72和74-77中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為46.3%的ALC-0315； - 莫耳比為1.6%的ALC-0159； - 莫耳比為42.7%的膽固醇；以及 - 莫耳比為9.4%的DSPC。
  81. 如請求項63-72和74-77中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含： - 莫耳比為47.4%的ALC-0315； - 莫耳比為1.7%的ALC-0159； - 莫耳比為40.9%的膽固醇；以及 - 莫耳比為10%的DSPC。
  82. 如請求項63-81中任一項所述的組合物，其中所述LNP的平均直徑為30 nm至200 nm。
  83. 如請求項63-82中任一項所述的組合物，其中所述LNP的平均直徑為80 nm至150 nm。
  84. 如請求項63-83中任一項所述的組合物，所述組合物包含在1 mg/mL至10 mg/mL之間的所述LNP。
  85. 如請求項63-84中任一項所述的組合物，其中所述LNP包含在1個與20個之間的核酸分子、優選mRNA分子。
  86. 如請求項62-85中任一項所述的組合物，所述組合物經配製用於肌內、鼻內、靜脈內、皮下、或皮內投予。
  87. 如請求項62-86中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含磷酸鹽緩衝鹽水。
  88. 如請求項62-87中任一項所述的組合物，其中所述組合物是醫藥組合物，例如免疫原性組合物或疫苗，特別是mRNA疫苗。
  89. 如請求項1-61中任一項所述的核酸或如請求項62-88中任一項所述的組合物，其用於在有需要的受試者中引發免疫反應。
  90. 如請求項1-61中任一項所述的核酸或如請求項62-88中任一項所述的組合物，其用於治療或預防有需要的受試者的原核生物感染。
  91. 一種在宿主細胞中分泌抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主細胞投予如請求項1-61中任一項所述的核酸或如請求項62-88中任一項所述的組合物。
  92. 一種在宿主細胞的表面上展示抗原性原核多肽的方法，所述方法包括向所述宿主投予如請求項1-61中任一項所述的核酸或如請求項62-88中任一項所述的組合物。
  93. 一種套組，所述套組包含容器，所述容器包含單次使用或多次使用劑量的如請求項1-61中任一項所述的核酸或如請求項62-88中任一項所述的組合物，任選地其中所述容器是小瓶或者預填充的注射筒或注射器。
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