TW202406926A

TW202406926A - 用於製備碳水化合物靶向部分及其中間體之方法

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Publication number: TW202406926A
Application number: TW112116325A
Authority: TW
Inventors: 凱爾Ｄ伯康; 卡羅琳蜜雪兒柯漢; 愛德華豪柏林; 海瑟克萊兒強森; 雪倫Ｅ米恰拉克; 菲利浦Ｃ盧森; 席雅Ｊ歐蘇立文; 雅曼達史黛爾; 潔妮Ｋ湯姆
Original assignee: 美商安進公司
Priority date: 2022-05-02
Filing date: 2023-05-02
Publication date: 2024-02-16
Also published as: WO2023215306A1

Abstract

本文提供了用於製備碳水化合物靶向部分及其中間體的改善之方法。

Description

用於製備碳水化合物靶向部分及其中間體之方法

本揭露關於用於製備碳水化合物靶向部分及其中間體的改善之方法，以及前述中任一種的組成物。碳水化合物靶向部分可用於與治療化合物軛合，以將療法引導至體內靶標。

為了使某些化合物具有治療效果（例如，在體內）或可用於診斷目的，需要將化合物遞送至特定位置，如靶細胞。將化合物有效地遞送至特定位置或靶標還可以減少或消除由投與化合物引起的非預期的結果（例如，脫靶效應）。靶向部分（例如，碳水化合物靶向部分）可以與這樣的化合物，如治療化合物（例如，寡聚化合物）連接，以將療法引導至體內靶標。寡聚化合物的實例係小干擾RNA（siRNA），它可以調節靶核酸的表現，導致靶核酸至蛋白質的翻譯改變。例如，siRNA可以調節靶基因的表現以抑制蛋白質翻譯或表現。

含有N-乙醯基半乳糖胺（GalNAc或NAG）（例如，三GalNAc或三觸角型GalNAc）的靶向部分經由與無唾液酸糖蛋白受體結合來促進將治療化合物遞送至肝細胞。美國專利案號10,246,709描述了用於將寡聚化合物遞送至肝臟的示例性含有GalNAc的靶向部分，其包括指定為NAG-25（或NAG25）的化合物。美國專利案號10,246,709揭露了一種製備具有以下結構的NAG-25之方法：，其中Ac係乙醯基（或-(C=O)CH ₃），並且i-Pr係異丙基（或1-甲基乙基）。

本文描述了用於製備NAG-25之方法，其源於對需要更有效，簡化，環境友好和/或經濟的NAG-25製造方法的認識，該等方法包括產生具有增加的純度和/或產率的NAG-25及其中間體之方法。這樣之方法不包含層析步驟，最大限度減少或預防雜質的形成，減少或排除反應性雜質，和/或改善中間體的分離點和物理特性。因此，本文描述了在不使用柱層析法的情況下由此製備NAG-25之方法。本文進一步描述了使用三酸中間體的結晶形式由此製備NAG-25之方法。本文進一步描述了另外的新的改善之方法。由於所述方法步驟，NAG-25中間體的分離和產率得到了改善，雜質減少，並且廢物減少。本文進一步描述了組成物，該等組成物包含NAG-25、或其中間體（例如，三級丁基核心、三酸或其鹽、醇-Z、NAG-Z、NAG-H或其鹽、三醇、未受保護的三醇、TGZ、TG胺或其鹽、TG PEG、和/或前述中任一種的鹽）之一，具有降低的雜質水平，如本文所述之雜質和雜質百分比。

本文揭露了用於製備三級丁基核心之方法三級丁基核心所述方法包括使GluZ： GluZ 與GluOtBu或其鹽： GluOtBu或其鹽反應，以產生三級丁基核心。在一些實施方式中，GluOtBu或其鹽係GluOtBu鹽酸鹽：。在一些實施方式中，反應在包含偶聯試劑、鹼和溶劑的存在下進行。在一些實施方式中，偶聯試劑係EDC/Oxyma、TFFH、PyOxim、CDI、PivCl、T3P、或COMU。在一些實施方式中，偶聯試劑係T3P或PivCl。在一些實施方式中，偶聯試劑係PivCl。在一些實施方式中，鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）。在一些實施方式中，溶劑係IPAc、MeTHF（也稱為2-MeTHF）、MIBK、或MTBE。在一些實施方式中，溶劑係MTBE。在一些實施方式中，反溶劑係庚烷。在一些實施方式中，溶劑係MTBE，並且反溶劑係庚烷。在一些實施方式中，將包含在溶劑中的GluZ和NMM的第一溶液添加至包含該溶劑和PivCl的第二溶液中。在一些實施方式中，PivCl係過量的。在一些實施方式中，GluOtBu係過量的。在一些實施方式中，基於GluZ的量，三級丁基核心的轉化率大於約90%。

本文揭露了用於製備三酸之方法：三酸所述方法包括使三級丁基核心與酸反應。在一些實施方式中，酸係磷酸（H ₃PO ₄）、TFA、HCl、苯磺酸、或對甲苯磺酸。在一些實施方式中，酸係磷酸（H ₃PO ₄）。在一些實施方式中，反應在選自以下的溶劑中進行：2-MeTHF、乙腈、THF、DMA、環丁碸、和DME。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF、THF、或乙腈。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF或THF。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF。在一些實施方式中，將三酸分離為結晶固體。在一些實施方式中，三酸具有大於或等於95%的純度，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，溶劑進一步包含水。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF和水的混合物。在一些實施方式中，使用了約3.0 - 4.0體積的2-MeTHF和約0.5 - 2體積的水。在一些實施方式中，反應在約40°C-60°C的溫度下進行。在一些實施方式中，反應在約45°C-55°C的溫度下進行。在一些實施方式中，反應在約50°C的溫度下進行。在一些實施方式中，該方法進一步包括用至少一種有機/水性洗滌液去除磷酸。在一些實施方式中，有機/水性洗滌液包含作為有機層的乙酸異丙酯（iPAC）和作為水層的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約8-18體積的iPAC和約3-7體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約10體積的iPAC和約5體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，該方法進一步包括使用丙酮/甲苯、2-MeTHF/IPAc/、2-MeTHF/CPME、丙酮/庚烷、或MeTHF/乙腈結晶三酸。在一些實施方式中，該方法進一步包括使用丙酮/甲苯結晶三酸。在一些實施方式中，丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、3 : 2、或1 : 2。在一些實施方式中，丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、或1 : 2。在一些實施方式中，該等方法產生呈結晶形式的三酸，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。

本文揭露了三酸的結晶形式I，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸的結晶形式I，其特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸的結晶形式I，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸的結晶形式II，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。

本文揭露了製備TGZ之方法，所述方法包括在偶聯試劑和鹼的存在下使三酸與NAG-H：、或其鹽反應。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H的TFA鹽：。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU、HATU或TCFH。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU。在一些實施方式中，鹼係DIPEA、NMI、NMM、或TMP。在一些實施方式中，鹼係NMI。在一些實施方式中，該方法進一步包括至少一種緩衝洗滌液。在一些實施方式中，緩衝洗滌液係磷酸鹽緩衝液。在一些實施方式中，緩衝洗滌液係約pH 5-7。在一些實施方式中，緩衝洗滌液係約pH 6。在一些實施方式中，該方法在選自以下的溶劑或其組合中進行：DCM、DMF、MeCN、和DMAc。在一些實施方式中，溶劑係DMAc。在一些實施方式中，該方法進一步包括將反溶劑添加至包含TGZ和溶劑的溶液中。在一些實施方式中，反溶劑係醚溶劑。在一些實施方式中，醚溶劑係DME、2-MeTHF、或MTBE。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係MTBE。在一些實施方式中，製備的TGZ雜質減少。在一些實施方式中，雜質副產物係去醯基。在一些實施方式中，該方法進一步包括從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑系統係DCM/MTBE。在一些實施方式中，在不使用柱層析法的情況下，獲得純度為至少95%的TGZ。在一些實施方式中，在不從先前反應中分離NAG-H、或其鹽的情況下，將NAG-H、或其鹽作為先前反應的溶液繼續用於與三酸反應。在一些實施方式中，NAG-H、或其鹽係在先前反應中製備，該先前反應包括在Pd/C催化劑和二甲基乙醯胺（DMAc）的存在下氫化NAG-Z。在一些實施方式中，DMAc係約3體積至約5體積。在一些實施方式中，DMAc係約4體積。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H TFA。在一些實施方式中，Pd/C催化劑係5% Pd/C。在一些實施方式中，NAG-H TFA係在包含在以下方案中的試劑的先前反應中製備的：

本文揭露了用於製備甲基核心：之方法，所述方法包括使z-L-Glu-OMe：與L-麩胺酸二甲酯（二(OMe)Glu）：反應以產生甲基核心。

在一些實施方式中，反應在鹼和偶聯試劑的存在下進行。在一些實施方式中，將鹼添加至z-L-GluOMe溶液中，然後將偶聯試劑和二(OMe)Glu添加至反應中。在一些實施方式中，將偶聯試劑添加至z-L-Glu-OMe和鹼的溶液中，然後將二(OMe)Glu添加至反應中。在一些實施方式中，反應進一步包含溶劑。在一些實施方式中，鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）或二異丙基乙胺。在一些實施方式中，偶聯試劑係氯甲酸異丁酯（IBCF）、TBTU、HATU、EDC、或DCC。在一些實施方式中，溶劑係THF或MeTHF。在一些實施方式中，在與偶聯試劑反應之前和期間，反應溫度係約-20°C至約-10°C。在一些實施方式中，反應溫度係約-18°C至約-13°C。在一些實施方式中，在添加二(OMe)Glu後，將反應溫度增加至約5°C至約15°C。在一些實施方式中，將反應溫度增加至約7°C至約12°C。在一些實施方式中，反應進一步包括另外充入偶聯試劑、鹼、和/或z-L-Glu-OMe。在一些實施方式中，反應進一步包括將反應用水性酸洗滌，然後將反應用水性鹼洗滌。在一些實施方式中，反應進一步包括藉由添加反溶劑進行結晶。在一些實施方式中，該方法包括以下方案中的試劑和條件：。

本文揭露了用於製備三醇之方法，，該方法包括使甲基核心與2-(2-胺基乙氧基)乙醇：反應，以產生三醇。在一些實施方式中，該方法係用純2-(2-胺基乙氧基)乙醇進行的。在一些實施方式中，反應溫度係約25°C至35°C。在一些實施方式中，反應溫度係約30°C。在一些實施方式中，反應進一步包括添加反溶劑以使三醇沈澱。在一些實施方式中，反溶劑係乙酸乙酯、甲基三級丁醚、或乙酸異丙酯。在一些實施方式中，該方法進一步包括添加三醇晶種。在一些實施方式中，該方法包括以下方案中的試劑和條件：。

揭露了用於製備TGZ的可替代之方法，該方法包括使三醇：與β-D-半乳糖胺五乙酸酯：反應，以產生TGZ。

在一些實施方式中，首先使β-D-半乳糖胺五乙酸酯與矽基三氟甲磺酸酯反應以產生㗁唑啉溶液。在一些實施方式中，矽基三氟甲磺酸酯係三甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TMSOTf）或三異丙基矽基三氟甲烷磺酸酯（TIPSOTf）。在一些實施方式中，反應進一步包含溶劑。在一些實施方式中，溶劑係二氯乙烷（DCE）或二氯甲烷（DCM）。在一些實施方式中，反應溫度係約35°C至約45°C。在一些實施方式中，反應溫度係約40°C。在一些實施方式中，將反應溫度降低至約20°C至約28°C。在一些實施方式中，反應溫度係約23°C。在一些實施方式中，將三醇與碳酸氫鈉（NaHCO ₃）混合以產生三醇和NaHCO ₃的漿液混合物，然後添加β-D-半乳糖胺五乙酸酯或其㗁唑啉溶液。在一些實施方式中，三醇和NaHCO ₃的漿液混合物進一步包含溶劑。在一些實施方式中，溶劑係二氯甲烷（DCM）、二氯乙烷、或乙腈。在一些實施方式中，將㗁唑啉溶液添加至三醇和NaHCO ₃的漿液混合物中。在一些實施方式中，反應溫度係約20°C至約30°C。在一些實施方式中，反應溫度係約25°C。在一些實施方式中，將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱。在一些實施方式中，將反溶劑添加至包含TGZ和溶劑的溶液中。在一些實施方式中，反溶劑係二甲氧基乙烷。在一些實施方式中，該方法包括以下方案中的試劑和條件：。

在一些實施方式中，反應進一步包括針對步驟A-2或A-1的請求項中的任一項。

本文揭露了化合物，其中R係H或Cbz保護基團，該化合物可用於製備如本文所述之TGZ。

本文揭露了用於製備NAG-25之方法，所述方法包括使用所述可替代之方法製備甲基核心或三醇的實施方式中的任一項。本文揭露了用於製備NAG-25的可替代之方法，所述方法包括三醇中間體。在一些實施方式中，可替代之方法進一步包括針對步驟4、步驟5、或步驟6的實施方式中的任一項。在一些實施方式中，可替代之方法包括使z-L-Glu-OMe與L-麩胺酸二甲酯反應以形成甲基核心，以及將甲基核心轉化為NAG-25。在一些實施方式中，可替代之方法包括使甲基核心與2-(2-胺基乙氧基)乙醇反應以形成三醇，以及將三醇轉化為NAG-25。在一些實施方式中，可替代之方法包括使三醇與β-D-半乳糖胺五乙酸酯反應以形成TGZ，以及將TGZ轉化為NAG-25。在一些實施方式中，將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱，如本文所述之。

本文揭露了製備TG胺、或其鹽之方法，所述方法包括用於對TGZ進行羧基苄基去保護以形成該TG胺或其鹽的高壓氫解。在一些實施方式中，該方法包括用於氫解的鈀源。在一些實施方式中，鈀源係鈀碳（Pd/C）催化劑。在一些實施方式中，鈀源係5% Pd/C.4d。在一些實施方式中，負載的催化劑小於約10%、9%、8%、7%、6% Pd/C。在一些實施方式中，使用的催化劑係5% Pd/C。在一些實施方式中，氫解在酸的存在下進行。在一些實施方式中，酸係TFA、草酸、HCl、AcOH、H ₃PO ₄、檸檬酸。在一些實施方式中，酸係TFA或草酸。在一些實施方式中，酸係TFA。在一些實施方式中，所述氫解在溶劑中進行，並且該溶劑係DCM、IPAc、或MeOH。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，該方法減少去醯基雜質的形成。在一些實施方式中，TG胺或其鹽係TG胺酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、或草酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽或草酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽。在一些實施方式中，該方法使得步驟5的TG PEG產物具有高純度，同時減少TG胺乙醯胺副產物的量。在一些實施方式中，TG胺或其鹽包含小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、或2%的乙醯胺副產物。在一些實施方式中，從改善的步驟4方法產生的TG胺或其鹽具有大於或等於約97%、98%、或99%的純度，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在不分離TG胺或其鹽的情況下，將TG胺或其鹽縮放進入（telescoped into）步驟5中。在一些實施方式中，該方法包括以下方案中的試劑：

本文揭露了製備TG PEG之方法，所述方法包括用TBTU處理TG胺和PEG酸的溶液。在一些實施方式中，溶液進一步包含鹼。在一些實施方式中，鹼係N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）。在一些實施方式中，將TBTU在約30 min至約1.5小時的時間段內添加。在一些實施方式中，將TBTU在約1-1.5小時的時間段內添加。在一些實施方式中，以大於或等於約90%的純度產生TG PEG，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，TG PEG二聚體雜質在反應結束時以小於10%的量存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，該方法包括以下方案中的試劑：。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括用活化劑和亞磷酸化試劑處理TG PEG。在一些實施方式中，活化劑係四唑、4,5-二氰基咪唑（DCI）、ETT、或苯并巰基四唑（BTT）。在一些實施方式中，活化劑係四唑、DCI、或ETT。在一些實施方式中，活化劑係四唑。在一些實施方式中，將四唑以約0.2當量至1.2當量添加。在一些實施方式中，活化劑係DCI。在一些實施方式中，將DCI以約0.02當量至1.0當量添加。在一些實施方式中，所述方法在鹼的存在下進行。在一些實施方式中，鹼係NMI。在一些實施方式中，亞磷酸化試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺或2-氰基乙基 N,N-二異丙基氯亞磷醯胺。在一些實施方式中，該方法進一步包括萃取、過濾、沈澱、和乾燥。在一些實施方式中，沈澱步驟包括從DCM/庚烷中沈澱NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，所述方法包括本文揭露的針對步驟1、2、3、3’、4、5、或6的實施方式中的任一項。在一些實施方式中，該方法包括藉由本文揭露的製備三級丁基核心的實施方式中的任一項來製備三級丁基核心以及將三級丁基核心轉化為NAG-25。在一些實施方式中，該方法包括藉由本文揭露的製備三酸的實施方式中的任一項來製備三酸以及將三酸轉化為NAG-25。在一些實施方式中，該方法包括藉由本文揭露的製備TGZ的實施方式中的任一項來製備TGZ以及將TGZ轉化為NAG-25。在一些實施方式中，該方法包括藉由本文揭露的製備TG胺的實施方式中的任一項來製備TG胺以及將TG胺轉化為NAG-25。在一些實施方式中，該方法包括藉由本文揭露的針對TG PEG的實施方式中的任一項來製備TG PEG以及將TG PEG轉化為NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括用TBTU處理TG胺和PEG酸的混合物以得到TG PEG ，以及將TG PEG轉化為NAG-25。關於用TBTU處理TG胺和PEG酸的混合物以得到TG PEG的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括用於對TGZ進行羧基苄基去保護以形成TG胺：、或其鹽的高壓氫解，以及將TG胺、或其鹽轉化為NAG-25。關於用於對TGZ進行羧基苄基去保護以形成TG胺的高壓氫解的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括在偶聯試劑和鹼的存在下使三酸與NAG-H或其鹽反應以形成TGZ，以及將TGZ轉化為NAG-25。在一些實施方式中，將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱。關於使三酸與NAG-H或其鹽反應的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括使三級丁基核心與酸反應以形成三酸，以及將三酸轉化為NAG-25。在一些實施方式中，三酸係結晶。在一些實施方式中，三酸係結晶形式I。關於使三級丁基核心與酸反應以形成三酸的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括使GluZ與GluOtBu或其鹽反應以形成三級丁基核心，以及將三級丁基核心轉化為NAG-25。關於包括使GluZ與GluOtBu或其鹽反應以形成三級丁基核心之方法的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，所述方法包括從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ。關於從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

本文揭露了製備NAG-25之方法，所述方法包括為結晶的三酸中間體。在一些實施方式中，結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。在一些實施方式中，結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，結晶三酸係三酸的結晶形式II，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。關於結晶三酸的前述實施方式以及本文所述之另外的實施方式中的任一項將可用於製備NAG-25。

根據以下詳細描述的綜述，結合附圖，其他方面及優勢對熟悉該項技術者將顯而易見。下文的描述包括特定實施方式，應理解，本揭露係說明性的，並且不旨在將本發明限於本文所述之特定實施方式。

以下討論關於所揭露之方法的各種示例性實施方式。然而，不應將所揭露的實施方式解釋為、或以其他方式使用為限制包括請求項在內的本揭露的範圍。此外，熟悉該項技術者將理解，以下描述具有廣泛的應用，並且對任何實施方式的討論僅意在示例性地討論該實施方式，並且包括請求項在內的本揭露的範圍不限於該實施方式。用於 NAG-25 及其中間體之方法

本文提供了用於製備NAG-25（其係碳水化合物靶向部分）、以及NAG-25的中間體（三級丁基核心、三酸、醇-Z、NAG-Z、NAG-H、三醇、甲基核心、TGZ、TG胺、TG PEG、和前述中任一種的鹽）之方法。本文所述之方法提供了具有降低的雜質副產物水平、減少的單元操作的數量和/或簡化的在多步驟NAG-25方法中使用的處理/分離的NAG-25和前述中間體。本文進一步提供了用於分離和/或結晶某些中間體（如三酸）之方法。

本文所述之方法、中間體、和產物可用於製備治療化合物，如與NAG-25軛合的siRNA分子，NAG-25係具有以下結構的碳水化合物靶向部分：。 NAG-25

如本文進一步描述的，NAG-25可以從本文描述的步驟中的任一個開始產生。如將進一步描述的，將化合物1-三級丁基 N-苄氧羰基-L-麩胺酸鹽（GluZ）以及L-麩胺酸二三級丁基酯（GluOtBu）或其鹽（例如GluOtBu鹽酸鹽）偶聯以獲得三級丁基核心（步驟1），然後可以進行三酯去保護以產生三酸（步驟2）。然後，三酸可以與三個單元的NAG-H或其鹽（例如，NAG-H TFA）偶聯，從而產生TGZ（步驟3）。可以藉由對Cbz基團進行還原去保護從NAG-Z合成NAG-H TFA（步驟3’）。可以藉由醇-Z與醯基GalNAc的直接糖基化合成NAG-Z（步驟2’）。可以視需要由胺基醇的胺基保護製備醇-Z，如本文所述之（步驟1’）。可以藉由對Cbz基團進行還原去保護從TGZ獲得TG胺或其鹽（步驟4）。TG胺或其鹽可以與PEG酸偶聯以產生TG PEG（步驟5）。最終，可以藉由從TG PEG形成亞磷醯胺來合成NAG-25（步驟6）。

如本文進一步描述的，可以使用可替代之方法產生TGZ來生產NAG-25。可替代之方法包括醯胺偶聯（步驟A-1）、胺解（步驟A-2）、和糖基化（步驟A-3）。在該可替代之方法中，使用三醇中間體製備TGZ，如本文進一步描述的。使用本文所述之可替代之方法分離TGZ後，可以使用如本文所述之步驟4、5、和/或6將TGZ轉化為NAG-25。

NAG-25方法包括本文所述之使一種或多種雜質和/或副產物減少、或沒有或基本上沒有的一個或多個步驟。

本文描述了包含NAG-25、或其中間體之一的組成物，該等組成物具有本文進一步描述的降低的一種或多種雜質水平。所揭露之方法提供了高化學純度的NAG-25。在各種實施方式中，如藉由液相層析法所測定的，根據所揭露之方法製備的NAG-25的化學純度係90%或更高。例如，在各種實施方式中，如藉由液相層析法所測定的，NAG-25的化學純度係至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%。

與美國專利案號10,246,709中描述的先前方法相比，本文揭露之方法包括在每個步驟處的改善，例如在步驟3結束時（其產生TGZ）避免對於大規模合成可能是昂貴的，浪費的和時間密集的柱層析法的選項，以及在步驟2結束時分離的三酸的新晶型，這有助於以更可控的方式排除或去除雜質。 用於製備 NAG-25 之方法

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括步驟1、步驟2、和/或步驟3方法。本文所述之步驟1、2、和3方法的組合導致總產率改善（例如，從約47%改善至約67%）和/或環境影響因素（E-因素）的減少（例如，從約1000減少至約540）。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括實現接近完全反應轉化的步驟1方法，視需要在沒有一種或多種試劑或起始材料的另外的量（或充入）（也稱為噴射充入）的情況下。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括產生新的結晶三酸（例如，三酸晶體形式I）的步驟2方法。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括在不使用柱層析法的情況下，使用從溶劑/反溶劑系統中的沈澱分離和純化TGZ的步驟3方法。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括產生NAG-Z的步驟2’方法，NAG-Z係NAG-25的起始材料之一。步驟2’方法可以在不分離㗁唑啉中間體的情況下進行，並且具有減少的雜質以及改善的產率。本文進一步揭露了產生具有更簡化之方法（更少的單元操作）、改善的產率和/或減少的雜質的醇-Z的步驟1’方法，醇-Z用作NAG-Z的起始材料。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括步驟A-1、步驟A-2、和/或步驟A-3以產生本文進一步描述的TGZ及其可替代的中間體（甲基核心和三醇）。進一步揭露了可用於製備TGZ的三醇中間體（苄基 ((10S,15S)-1,22-二羥基-10-((2-(2-羥基乙氧基)乙基)胺基甲醯基)-7,12,16-三側氧基-3,20-二氧雜-6,11,17-三氮雜二十二烷-15-基)胺基甲酸酯）。本文提供了包含三醇中間體以及未受保護的三醇的組成物。本文揭露了製備NAG-25之方法，其中該方法包括三醇中間體。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括步驟4、步驟5、和/或步驟6方法。本文所述之步驟4、5、和6方法的組合導致簡化的單元操作、減少的溶劑體積、和/或改善的純度。本文所述之改善包括改善的中間體的分離點和物理特性以及反應性雜質的減少或排除。本文所述之改善的步驟4-6方法導致減少的單元操作和溶劑體積。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括步驟5方法，其中在約1-1.5 hr的時間段內添加偶聯試劑（例如，TBTU）。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括本文進一步描述的步驟1、步驟2、步驟3’、步驟2’、步驟1’、步驟3、步驟4、步驟5、步驟6、和/或其實施方式中的任一個。

本文揭露了製備NAG-25之方法，該方法包括本文進一步描述的步驟A-1、步驟A-2、步驟A-3、步驟4、步驟5、步驟6、和/或其實施方式中的任一個。

總體而言，本文揭露的製備NAG-25的改善之方法包括改善的步驟1-6，其改善了NAG-25總產率（例如，提高了約6%）並且減少了E-因素（例如，E-因素減少了約24%）。本文所述之方法改善允許NAG-25更有效地在更大規模上製造。步驟 1 ：將 1- 三級丁基 N- 苄氧羰基 -L- 麩胺酸酯（ GluZ ）與 L- 麩胺酸二三級丁基酯（ GluOtBu ）偶聯以獲得三級丁基核心

先前步驟1方法存在挑戰，其包括：反應停止，這需要另外的試劑充入（噴射充入）以輔助完全轉化；以及從己烷中結晶，這可能對環境不友好。為了應對該等挑戰，進行了實驗以對進行以下研究：在不需要噴射充入的情況下實現更接近完全轉化的可替代的偶聯試劑，這在先前方法中使用；提高向三級丁基核心的轉化的試劑添加模式；以及簡化步驟1方法以及三級丁基核心的結晶（例如，藉由去除先前步驟1方法中使用的溶劑交換）之方法。

本文揭露了產生三級丁基核心的步驟1方法，該方法在使用試劑的單次充入的同時提供更高的反應轉化率和/或更高的分離的純度。改善的步驟1方法使用了不同的偶聯藥劑、溶劑、添加順序和試劑的量，導致改善的向三級丁基核心的反應轉化率，以及改善的三級丁基核心的純度。步驟1還包括試劑的反向添加，其（不受理論的約束）被認為促進混合酸酐中間體超過對稱酸酐中間體的形成。此外，藉由切換反應溶劑（從THF到例如MTBE），去除結晶中的溶劑交換步驟以及減少結晶的溶劑體積，使三級丁基核心產物的結晶變得更加簡化。

在步驟1的一個方面，用於製備三級丁基核心：之方法包括使GluZ：與GluOtBu：、或其鹽反應，以產生三級丁基核心。在一些實施方式中，過量使用GluOtBu或其鹽。在一些實施方式中，GluOtBu或其鹽係GluOtBu鹽。在一些實施方式中，GluOtBu鹽係鹽酸鹽。在步驟1的一些實施方式中，該方法包括使用偶聯試劑、鹼、和溶劑。

在一些實施方式中，偶聯試劑係1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）/氰基羥基亞胺基乙酸乙酯（Oxyma）（EDC/Oxyma）、四甲基氟代甲脒六氟磷酸酯（TFFH）、[乙基氰基(羥基亞胺基)乙酸基- O ²]三-1-吡咯啶基鏻六氟磷酸酯（PyOxim）、1,1’-羰二咪唑（CDI）、三甲基乙醯氯（PivCl）、1-丙烷膦酸酐溶液（T3P）、或(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基亞乙基胺基氧基)二甲基胺基-𠰌啉代-碳六氟磷酸鹽（COMU）。在一些實施方式中，偶聯試劑係T3P或PivCl。在一些實施方式中，偶聯試劑係PivCl。在一些實施方式中，過量添加PivCl。在一些實施方式中，鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）。在一些實施方式中，偶聯試劑係T3P或PivCl，並且鹼係NMM。在一些實施方式中，偶聯試劑係PivCl，並且鹼係NMM。

在一些實施方式中，溶劑係乙酸異丙酯（IPAc）、2-甲基四氫呋喃（MeTHF）、甲基異丁基酮（MIBK）、或三級丁基甲基醚（也稱為甲基三級丁基醚或MTBE）。在一些實施方式中，溶劑係MeTHF或MTBE。在一些實施方式中，溶劑係MTBE。在一些實施方式中，反溶劑用於誘導產物（三級丁基核心）的結晶。在一些實施方式中，反溶劑係庚烷。在一些實施方式中，反溶劑係1 : 2比率的IPA : 水。在一些實施方式中，溶劑係MTBE，並且反溶劑係庚烷。

步驟1方法可以使用GluZ到偶聯試劑的正常添加或反向添加。在正常添加下，將偶聯試劑在溶劑中的溶液添加至GluZ、鹼、和溶劑的溶液中。在一些實施方式中，步驟1方法包括正常添加，其中將偶聯試劑在溶劑中的溶液添加至GluZ和鹼在溶劑中的溶液中。在反向添加下，將GluZ、鹼、和溶劑的溶液添加至偶聯試劑在溶劑中的溶液中。不受理論的約束，反向添加形成混合酸酐，這有助於減少GluZ對稱酸酐的形成。在一些實施方式中，步驟1方法包括反向添加，其中將GluZ和鹼在溶劑中的溶液添加至偶聯試劑在溶劑中的另一溶液中。

製備GluZ和鹼在溶劑中的溶液並且將其添加至PivCl在溶劑中的溶液中。在一些實施方式中，溶劑係MTBE，並且將GluZ和NMM在MTBE中的溶液添加至MTBE和PivCl的溶液中。Gluz和NMM的這一添加發生在約至少50分鐘、50-70分鐘或60分鐘的時間段內。再攪拌約20-40分鐘後，約每10-20分鐘少量添加GluOtBu，並且將反應在0°C下進行約20-40分鐘（例如，30分鐘）。監測反應（例如，用LC），直到實現適當的轉化率。

在一些實施方式中，PivCl和GluOtBu或其鹽中的每一種以約1當量至約1.5當量獨立地使用。在一些實施方式中，使用的PivCl係約1.1、1.2、或1.3當量，並且使用的GluOtBu或其鹽係約1.2、1.3、或1.4當量。在一些實施方式中，使用的PivCl係約1.2當量，並且使用的GluOtBu或其鹽係約1.3當量。PivCl和GluOtBu或其鹽的當量（本文的「當量（eq）」或「當量（equiv）」）係相對於GluZ。

在一些實施方式中，使用的NMM係約3.0至約3.5當量。在一些實施方式中，使用的NMM係約3.3至約3.7當量。在一些實施方式中，使用的NMM係至少約3.0當量。在一些實施方式中，使用的NMM係至少約3.5當量。在一些實施方式中，使用的NMM係約3.5當量。

在一些實施方式中，PivCl係約1.1-1.4當量，GluOtBu係約1.1-1.5當量，並且NMM係約3.3-3.7當量。在一些實施方式中，PivCl係約1.2當量，GluOtBu係約1.3當量，並且NMM係約3.5當量。當量係相對於GluZ。

在一些實施方式中，用於製備三級丁基核心的步驟1方法包括在PivCl、NMM、和MTBE的存在下，使GluZ與GluOtBu或其鹽反應以產生三級丁基核心。在一些實施方式中，用於製備三級丁基核心的步驟1方法包括在PivCl（約1.1-1.4當量）、NMM（至少3.0當量）、和MTBE（約8 – 12體積）的存在下，使GluZ與GluOtBu或其鹽反應以產生三級丁基核心。

在一些實施方式中，步驟1方法包括： a) 將GluZ、鹼、和溶劑的第一溶液中與偶聯試劑和溶劑的第二溶液合併，以形成GluZ、鹼、溶劑、和偶聯試劑的第三溶液；以及 b) 將GluOtBu或其鹽添加至GluZ、鹼、溶劑、和偶聯試劑的第三溶液中。

在一些實施方式中，步驟1方法包括： a) 將GluZ、NMM、和MTBE的第一溶液與PivCl和MTBE的第二溶液合併以形成GluZ、NMM、MTBE、PivCl的第三溶液；以及 b) 將GluOtBu或其鹽添加至GluZ、NMM、MTBE、PivCl的第三溶液中。

在一些實施方式中，GluOtBu或其鹽係GluOtBu鹽酸鹽。

本文所述之改善的步驟1方法產生較少的雜質，如Piv-Glu-OH和三肽雜質，如下所示。

在一些實施方式中，步驟1產生的三級丁基核心的產率大於約85%或約90%。在一些實施方式中，步驟1產生的三級丁基核心的產率大於約91%、92%、93%、94%、95%、96%、或97%。

在一些實施方式中，步驟1產生的三級丁基核心的純度大於約95%，如藉由液相層析法（LC）測量的。在一些實施方式中，三級丁基核心的純度大於約96%、97%、98%、或99%，如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，用於製備三級丁基核心的步驟1方法顯示在以下方案中：，其中GluZ係在PivCl、鹼、MTBE的存在下與GluOtBu HCl反應的。在以上方案的一些實施方式中，PivCl係約1.2當量，NMM係約3.5當量，MTBE係約10體積。在以上方案的一些實施方式中，步驟1係在約0°C下進行。在一些實施方式中，反應包括將GluZ和NMM在MTBE中的溶液反向添加至PivCl在MTBE中的溶液中。

在一些實施方式中，一個、兩個或三個其他類型的烷基基團（例如，甲基、乙基、丙基和/或丁基）可以替代三級丁基核心、GluZ和GluOtBu的三級丁基基團中的一個、兩個或三個。

在步驟1的一些實施方式中，該方法進一步包括處理（例如，萃取洗滌）、蒸餾、結晶、過濾或沖洗、和/或乾燥。

在一些實施方式中，萃取處理步驟包括：添加鹽酸溶液（例如，0.5 M HCl），攪拌然後進行相分離，添加碳酸鈉溶液（例如，0.5 M碳酸鈉），攪拌然後進行相分離，添加鹽水溶液（5 wt%鹽水溶液），攪拌然後進行層分離。如果需要，可以將有機層用於結晶或保持在20°C下過夜。

本文進一步提供了用於三級丁基核心的結晶方法，該方法包括將三級丁基核心的種子以及將反溶劑添加至三級丁基核心在溶劑中的溶液中。在一些實施方式中，將反溶劑在至少約2、3、4、或5小時的時間段內；或約2-5、2-4、3-5、3-4、或2.5-3.5小時的時間段內；或約3、3.5、或4小時的時間段內添加。在一些實施方式中，添加反溶劑直到最終量係反溶劑的約30%、40%、50%、60%、70%、80%。在一些實施方式中，將反溶劑添加至三級丁基核心在溶劑中的溶液中，該溶液保持在約30°C-40°C、35°C-45°C、或33°C-37°C下。在一些實施方式中，在添加反溶劑後，將溶液溫度降低至約15°C-25°C、18°C-22°C、或20°C。在以上實施方式中的任一項中，溶劑係MTBE，並且反溶劑係庚烷。步驟 2 ：對三級丁基核心進行三酯去保護以產生三酸或其鹽

在先前步驟2方法中，使用甲酸以對三級丁基核心的三個三級丁基基團進行去保護。在完成反應後，在一系列溶劑交換/蒸餾操作後去除甲酸，並將三酸（如下所示）分離為油狀物。三酸

為了改善先前步驟2方法，進行了實驗以對以下進行研究：能夠使純度升級的固體三酸的分離；更有效的處理程序（例如，萃取洗滌）；以及使三酸的純度更高的反應條件（包括在反應中使用可替代的酸）的開發。

本文揭露了導致高純度三酸或其鹽的改善的步驟2方法。三酸鹽的實例包括磷酸鹽、鈉鹽、和鈣鹽。在步驟2的一個方面，用於製備三酸、或其鹽之方法包括使三級丁基核心與作為去保護試劑的酸反應。反應可以在溶劑或與水混合的溶劑的存在下進行。當與溶劑一起存在時，水充當三級丁基清除劑，並且以高產率從三級丁基核心中有效地產生三酸。

在一些實施方式中，酸係磷酸（H ₃PO ₄）、TFA、HCl、苯磺酸、或對甲苯磺酸。在一些實施方式中，酸係磷酸（H ₃PO ₄）、TFA、或HCl。在一些實施方式中，酸係磷酸（H ₃PO ₄）。在一些實施方式中，步驟2反應在選自以下的溶劑中進行：2-MeTHF、乙腈、THF、DMA、環丁碸、和DME。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF、THF、或乙腈。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF或THF。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF。在一些實施方式中，溶劑與水混合。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF，並且與水混合。在一些實施方式中，溶劑係約3.0-4.0體積的2-MeTHF，並且與約0.3-1、0.4-0.6、或0.5-2體積的水混合。在一些實施方式中，溶劑係約3.0-4.0體積的2-MeTHF，並且與約0.4-0.6體積的水混合。在一些實施方式中，改善的步驟2使用磷酸（H ₃PO ₄）作為酸以及使用2-MeTHF作為與水混合的溶劑。在一些實施方式中，改善的步驟2使用磷酸（H ₃PO ₄）作為酸以及使用2-MeTHF作為與水混合的溶劑，其中磷酸以約3體積存在，2-MeTHF以約3.5體積存在，並且水係約0.5體積。

在一些實施方式中，反應係在約40°C-60°C的溫度下進行。在一些實施方式中，溫度係約45°C-55°C。在一些實施方式中，溫度係約50°C。在一些實施方式中，反應持續約3-10小時、3-6小時、4-9小時、4-7小時、或4-5小時。

在一些實施方式中，一種製備三酸、或其鹽的步驟2方法，該方法包括： a) 將溶劑中的三級丁基核心與酸合併； b) 添加水；以及 c) 將該反應加熱至一定溫度。在一些實施方式中，溶劑係2-MeTHF，酸係H ₃PO ₄，並且溫度係約50°C。

在一些實施方式中，用於製備三酸、或其鹽的步驟2方法顯示在以下方案中：。

當二酸的量小於3%時反應完成，如藉由LC測量的。在步驟2的一些實施方式中，在反應完成後，該方法進一步包括處理（例如，萃取洗滌）、蒸餾、結晶、過濾、和/或乾燥。

在一些實施方式中，將酸（例如，磷酸）藉由水性處理有效去除，從而避免了冗長的甲酸蒸餾工序。在一些實施方式中，步驟2進一步包括用至少一種有機/水性洗滌液去除磷酸。在該水性處理步驟的一些實施方式中，將反應混合物用乙酸異丙酯稀釋，並且用20 wt%硫酸銨水溶液洗滌。在水性處理步驟的一些實施方式中，將反應混合物用2-甲基四氫呋喃稀釋，並且/或者用20 wt%硫酸銨水溶液洗滌。然後，將有機層用水洗滌。

在一些實施方式中，有機/水性洗滌液包含作為有機層的乙酸異丙酯（iPAc）和作為水層的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約8-18體積的iPAc和約3-8體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約9-11體積的iPAc和約4-6體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約10體積的iPAc和約5體積20 wt%的硫酸銨。

在一些實施方式中，有機/水性洗滌液包含作為有機層的2-甲基四氫呋喃（MeTHF）和作為水層的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約6-18體積的MeTHF和約3-20體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約8-10體積的MeTHF和約12-18體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，使用約9體積的MeTHF和約15體積20 wt%的硫酸銨。在一些實施方式中，本文所列的洗滌體積可以分為2-4（例如，3）個分開的較小洗滌步驟。洗滌後，可以使用視需要的水洗滌液（例如，1、2、或3體積）。

另外，在一些實施方式中，可以使用溶劑/反溶劑結晶系統以提供作為高純度結晶材料的最終產物。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係丙酮/甲苯、2-MeTHF/IPAc、2-MeTHF/CPME、丙酮/庚烷、或MeTHF/乙腈。在一些實施方式中，溶劑係任何所列的溶劑中一種或多種的組合。在一些實施方式中，溶劑係MeTHF和丙酮的組合。在一些實施方式中，溶劑係MeTHF和丙酮的組合，並且反溶劑係甲苯。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係丙酮/甲苯。在一些實施方式中，溶劑係約2-4體積的MeTHF和3-5體積的丙酮，並且甲苯係約13體積。在一些實施方式中，溶劑係約3體積的MeTHF和4體積丙酮，並且甲苯係約13體積。在一些實施方式中，甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、3 : 2、或1 : 2。在一些實施方式中，丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、或1 : 2。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係丙酮/甲苯。在一些實施方式中，丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、3 : 2、或1 : 2。在一些實施方式中，丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、或1 : 2。在一些實施方式中，甲苯係溶劑/反溶劑系統的總體積的約40%、50%、60%、70%或約40%-70%、40%-50%、45%-55%、50%-60%、55%-65%、或60%-70%，其中其餘的體積百分比係一種或多種溶劑。在一些實施方式中，一種或多種溶劑係與甲苯組合的丙酮或MeTHF。

在一些實施方式中，將三酸、或其鹽分離為結晶固體。在一些實施方式中，結晶三酸不是鹽。

在一些實施方式中，三酸、或其鹽的純度大於或等於約95%、96%、97%、98%、或99%，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，三酸、或其鹽的純度大於或等於約95%，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，從三級丁基核心製備三酸、或其鹽之方法包括使用係丙酮/甲苯、MeTHF/IPAc、MeTHF/CPME、丙酮/庚烷、或MeTHF/乙腈的溶劑/反溶劑系統結晶三酸、或其鹽。在一些實施方式中，從三級丁基核心製備三酸、或其鹽之方法包括用丙酮/甲苯結晶三酸、或其鹽。在一些實施方式中，結晶包括接種比率為約3 : 2、1 : 1、或5 : 6的丙酮/甲苯，並且進一步充入甲苯直到丙酮/甲苯的最終比率為約2 : 3、1 : 2、或1 : 3。可以用三酸種子（例如，1 wt%）來完成接種。在一些實施方式中，甲苯在丙酮/甲苯混合物中的最終體積百分比係約40%-70%甲苯。在一些實施方式中，甲苯在丙酮/甲苯混合物中的最終體積百分比係約55%-70%甲苯。前述實施方式中任一項都適用於三酸（即，不是鹽的游離三酸）。

在一些實施方式中，本文所述之步驟2實施方式中的任一項產生了結晶三酸，其特徵在於X射線粉末繞射圖，如以下實施方式中進一步描述的。

本文揭露了三酸的晶體形式。在一些實施方式中，步驟2方法產生了三酸結晶形式I。在一些實施方式中，步驟2方法產生了三酸結晶形式II。

在一些實施方式中，三酸結晶固體係晶體形式I。在一些實施方式中，三酸結晶形式I呈基本上純的形式。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於藉由X射線粉末繞射分析生成的X射線粉末繞射圖，其中入射光束為Cu Kα輻射。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在7.4 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在9.2 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在21.0 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在10.2 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在14.6 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在18.3 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在19.3 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在22.9 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在11.0 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在11.3 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵視需要進一步在於在以下2θ值處具有另外的信號的X射線粉末繞射圖：10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵視需要進一步在於在以下2θ值處具有另外的信號的X射線粉末繞射圖：11.0 ± 0.2或11.3 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的七個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的六個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的五個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的四個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的二個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的一個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的七個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的六個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的五個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的四個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的兩個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的一個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的七個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的六個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的五個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的四個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的兩個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的一個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、10.2 ± 0.2、11.3 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、19.3 ± 0.2、和22.9 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在選自以下的兩個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式I的特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。

在一些實施方式中，三酸結晶固體係晶體形式II。在一些實施方式中，三酸結晶形式II呈基本上純的形式。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於藉由X射線粉末繞射分析生成的X射線粉末繞射圖，其中入射光束為Cu Kα輻射。

在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在7.8 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在9.7 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在15.7 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在13.3 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在17.1 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在18.9 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在20.2 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在21.0 ± 0.2度2θ處具有信號的X射線粉末繞射圖。

在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、和15.7 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵視需要進一步在於在以下2θ值處具有另外的信號的X射線粉末繞射圖：13.3 ± 0.2、17.1± 0.2、和/或18.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵視需要進一步在於在以下2θ值處具有另外的信號的X射線粉末繞射圖：20.2 ± 0.2和/或21.0 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的七個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的六個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的五個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的四個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的兩個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的一個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2 ± 0.2和21.0 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在選自以下的兩個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、和15.7 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、和18.9 ± 0.2。在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7 ± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2和20.2 ± 0.2。

在一些實施方式中，三酸結晶形式II的特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。步驟 1’ ：醇 -Z

本文揭露了用於製備醇-Z的步驟1’方法，該方法包括在溶劑和鹼的存在下使氯甲酸苄酯（CbzCl）與胺基醇反應。非限制性溶劑包括極性非質子溶劑、非質子溶劑、和醚溶劑。在一些實施方式中，溶劑係二氯甲烷（DCM）、二氯乙烷、乙酸乙酯、或甲基THF。在一些實施方式中，溶劑係極性非質子溶劑。在一些實施方式中，溶劑係DCM或二氯乙烷。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，溶劑係乙酸乙酯或甲基THF。非限制性鹼包括三級胺鹼，如三乙胺（TEA）、DIPEA、N-甲基𠰌啉、1-甲基咪唑和吡啶。在一些實施方式中，鹼係三級胺鹼。在一些實施方式中，鹼係三乙胺（TEA）、DIPEA、N-甲基𠰌啉、1-甲基咪唑和吡啶。在一些實施方式中，鹼係TEA。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且鹼係TEA。在一些實施方式中，相對於氯甲酸苄酯，胺基醇以約1.0-1.2當量存在。在一些實施方式中，相對於氯甲酸苄酯，胺基醇以約1.1當量存在。在將胺基醇溶液（用溶劑和鹼）冷卻至約-5°C至5°C後，將CbzCl在一定時間段內添加至胺基醇溶液中。在一些實施方式中，將CbzCl在約50-70分鐘或60分鐘的時間段內添加至胺基醇中，視需要在以下溫度下進行，該溫度維持在約0°C-12°C、3°C-10°C、8°C-11°C、10°C、或5°C下。在添加CbzCl後，將反應溫度調節至約28°C-42°C。在一些實施方式中，將反應溫度調節至約30°C-40°C、33°C-37°C、或35°C。在一些實施方式中，反應溫度係約35°C。在一些實施方式中，相對於氯甲酸苄酯，胺基醇以約1.1當量存在，並且反應溫度係約20°C-30°C、30°C-40°C、33°C-37°C、或35°C。在一些實施方式中，相對於氯甲酸苄酯，胺基醇以約1.1當量存在，並且反應溫度係約34°C-36°C。在一些實施方式中，相對於氯甲酸苄酯，胺基醇以約1.1當量存在，並且將反應維持在約35°C下。

在一些實施方式中，用於製備醇-Z的步驟1’方法包括在作為溶劑的DCM和作為鹼的TEA的存在下使氯甲酸苄酯（CbzCl）與胺基醇反應。在約1小時的時間段內添加CbzCl後，將反應溫度從約3°C-12°C調節至約35°C。在一些實施方式中，DCM以約3-5體積存在。在一些實施方式中，TEA以約0.8-1.2當量存在。反應持續至少12小時，例如，約10-12小時。在一些實施方式中，用於製備醇-Z的步驟1’方法顯示在以下方案中：。

反應後，可以將醇-Z產物藉由冷卻至約室溫（例如，20°C-25°C）分離，淬滅（例如，用水）並且用溶劑（例如，DCM）萃取，並且視需要洗滌（例如，10% NaCl），然後蒸餾。

所述之醇-Z步驟1’方法還減少了一種或多種雜質，其包括苯甲醇、碳酸二苄酯、氯甲酸苄酯、和/或雙重保護的醇-Z，如下所示。在一些實施方式中，步驟1’產生的醇-Z的純度大於約95%，如藉由液相層析法（LC）測量的。在一些實施方式中，純度大於約96%、97%、98%、或99%，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在反應結束時雜質以小於或等於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。步驟 2’ ： NAG-Z

本文揭露了製備NAG-Z（步驟2’）之方法，該等方法關於醇-Z與醯基GalNAc（本文也稱為醯基GalNAc）的直接糖基化，其中㗁唑啉中間體係原位形成的，並且不需要分離㗁唑啉中間體的步驟，導致增加的產率以及減少的單元操作次數。製備NAG-Z（化學名稱：(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-(2-(2-(((苄氧基)羰基)胺基)乙氧基)乙氧基)四氫-2H-哌喃-3,4-二基二乙酸酯）之方法包括使醯基GalNAc（化學名稱：(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2,4,5-三基三乙酸酯）與醇-Z（化學名稱：苄基 (2-(2-羥基乙氧基)乙基)胺基甲酸酯）反應，以產生NAG-Z：。

本文提供了用於結晶NAG-Z之方法，該方法包括溶劑和反溶劑。在一些實施方式中，溶劑係乙腈，並且反溶劑係水、甲基三級丁基醚（MTBE）、甲苯、IPAc、或IPA。所述方法還減少了一種或多種雜質，其包括DGalOH和/或Ac-Z，如下所示：。在一些實施方式中，NAG-Z的純度大於約96%、97%、98%、或99%，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在反應結束時雜質以小於或等於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，NAG-Z反應在酸的存在下進行。在一些實施方式中，酸係路易士酸。在一些實施方式中，酸係TMSOTf。在一些實施方式中，酸不是TMSOTf。儘管TMSOTf常用於糖基化反應，但發現在某些條件下TMSOTf可以降解NAG-Z產物，導致NAG-Z的產率降低。酸的非限制性實例包括三氟甲磺酸（也稱為三氟甲烷磺酸鹽（CF ₃SO ₃）或三氟甲磺酸酯（Tf））、矽基三氟甲磺酸酯（例如，TBSOTf、或TIPSOTf）、金屬三氟甲磺酸鹽（例如，三氟甲磺酸鉍、三氟甲磺酸銦、三氟甲磺酸銅、三氟甲磺酸鈧、三氟甲磺酸釹、三氟甲磺酸鏑、三氟甲磺酸鐿、三氟甲磺酸釤、三氟甲磺酸鑭、三氟甲磺酸鉀、三氟甲磺酸鎂、或三氟甲磺酸鋁）、金屬氯化物（例如，FeCl ₃、AlCl ₃、InCl ₃、或BiCl ₃）、三氟乙酸（TFA）、和BF ₃OEt ₂。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟化硼醚合物（BF ₃OEt ₂）、三級丁基二甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TBSOTf）、三異丙基矽基三氟甲烷磺酸酯（TIPSOTf）、三氟甲烷磺酸銦（In(OTf) ₃）、或三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟甲烷磺酸銦（In(OTf) ₃）、三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）、或三級丁基二甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TBSOTf）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟甲烷磺酸銦（In(OTf) ₃）、或三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）或三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸銦（In(OTf) ₃）。在一些實施方式中，酸係三氟甲烷磺酸銦（In(OTf) ₃）或三氟甲烷磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。在一些實施方式中，酸係三級丁基二甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TBSOTf）。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約0.01-0.04、0.05-0.1、0.1-0.6、0.1-0.4、0.3-0.6、或0.5-0.7當量存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約0.1-0.2或0.13-0.17當量存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約0.15當量存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約0.01-0.04或0.02-0.03當量存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約0.025當量（或2.5 mol%）存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，酸以約1-4 mol%或2-3 mol%存在。

在一些實施方式中，反應在溶劑的存在下進行。可以使用的溶劑的非限制性實例包括乙腈、二氯乙烷、二氯甲烷、二甲基甲醯胺（DMF）、和DMSO。在一些實施方式中，溶劑係乙腈。在一些實施方式中，溶劑係二氯乙烷或二氯甲烷。本文所列的溶劑體積係相對於醇-Z的。在一些實施方式中，溶劑以總共約6-10或8-12體積存在。在一些實施方式中，溶劑以總共8體積存在。在一些實施方式中，溶劑以總共10體積存在。在一些實施方式中，將醯基GalNAc添加至反應混合物中作為包含醯基GalNAc、酸、和溶劑的醯基GalNAc溶液。在一些實施方式中，反應混合物已經含有從步驟1’結束時產生的Alc-Z。在一些實施方式中，醯基GalNAc溶液中的溶劑係約2-4或4-6體積。在一些實施方式中，醯基GalNAc溶液中的溶劑係約2-4或4-5體積或約2、3、4、或5體積。在一些實施方式中，將醇-Z作為包含乾燥的（例如，共沸乾燥或用乾燥劑乾燥）醇-Z和溶劑的醇-Z溶液添加至反應中。在一些實施方式中，醇-Z溶液中的溶劑係約5體積。

在一些實施方式中，相對於醇-Z，醯基GalNAc以約1.0-2.0當量、1.3-1.7當量、或1.4-1.6當量存在。在一些實施方式中，相對於醇-Z，醯基GalNAc以約1.5當量存在。

將醯基GalNAc、醇-Z、酸、和溶劑合併後，將反應溫度加熱至約55°C-65°C、65°C-75°C、或70°C-90°C。在一些實施方式中，反應溫度係約70 ^oC-90 ^oC。在一些實施方式中，反應溫度係約75°C-85°C。在一些實施方式中，反應溫度係約80 ^oC。在一些實施方式中，反應溫度係約58°C-62°C。在一些實施方式中，反應溫度係約60°C。在一些實施方式中，反應時間係約10-20小時。在一些實施方式中，反應時間係約12-18、10-14或16-20小時、或至少約12、14、16、或18小時。隨後，將反應冷卻至約室溫（例如，約20°C或15°C-25°C）用於過濾和木炭處理。在一些實施方式中，添加的木炭係約3-7重量（wt）%、5-10 wt%、8-15 wt%、13-25 wt%、20-35 wt%、30-50 wt%、40-60 wt%、或50-70 wt%。在一些實施方式中，添加的木炭係約3-7重量（wt）%、5-10 wt%、或8-15 wt%。在一些實施方式中，添加的木炭係約30-50 wt%、40-60 wt%、或50-70 wt%。在一些實施方式中，添加的木炭係約40 wt%、50 wt%、或60 wt%。

木炭處理NAG-Z溶液後，將木炭過濾，並且添加反溶劑。在一些實施方式中，反溶劑係MTBE、水、甲苯、IPAc、或IPA。在一些實施方式中，反溶劑係MTBE、水、或甲苯。在一些實施方式中，反溶劑係MTBE。在一些實施方式中，在約20-40分鐘或30分鐘的時間段內添加反溶劑。在一些實施方式中，在約50-70分鐘或60分鐘的時間段內添加反溶劑。視需要將NAG-Z的種子添加至溶液中，使其老化過夜，然後在約70-100分鐘或90分鐘的時間段內添加另外的反溶劑。將濕餅用另外的溶劑和反溶劑沖洗。

在一些實施方式中，用於製備NAG-Z的步驟2’方法顯示在以下方案中：。

在一些實施方式中，製備NAG-Z之方法顯示在以下方案中：。步驟 3’ ： NAG-H 或其鹽

本文揭露了從NAG-Z製造NAG-H、或其鹽的改善的步驟3’方法。該方法包括在Pd/C催化劑和溶劑（例如，二甲基乙醯胺）的存在下藉由氫化NAG-Z來合成NAG-H、或其鹽，並且將NAG-H、或其鹽作為溶液繼續用於以下描述的步驟3的醯胺偶聯反應。該改善之方法的優勢係避免將NAG-H、或其鹽分離為吸濕性和難以處理的固體。另外，與先前方法相比，該改善之方法中使用的溶劑體積減少。

在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H三氟乙酸（TFA）鹽、NAG-H草酸鹽、NAG-H酒石酸鹽、或NAG-H檸檬酸鹽。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H TFA（本文也稱為NAG-H TFA鹽）。

在一些實施方式中，步驟3’方法包括將NAG-Z與溶劑中的Pd/C催化劑合併，添加酸，並且用氫加壓。

在一些實施方式中，Pd/C催化劑係5%鈀/碳。

在一些實施方式中，溶劑係IPA、EtOH、DMAc、或DCM。在一些實施方式中，溶劑係DMAc。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，使用的溶劑體積係約3體積至約6體積。在一些實施方式中，使用的溶劑體積係約3體積至約5體積。在一些實施方式中，以約3體積至約5體積使用DMAc。在一些實施方式中，以約4體積使用DMAc。在一些實施方式中，以約3體積至約6體積使用DCM。在一些實施方式中，以約3-5或4-6體積使用DCM。

在一些實施方式中，酸係TFA、乙酸（AcOH）、三甲基乙酸（PivOH）。在一些實施方式中，酸係TFA。

在一些實施方式中，將反應以約40-50 psig用氫加壓。在一些實施方式中，將反應以約45 psig用氫加壓。

在一些實施方式中，步驟3’在約20°C至約25°C的溫度下進行。在一些實施方式中，溫度係約20°C至約24°C。在一些實施方式中，溫度係約20°C至約23°C。在一些實施方式中，溫度係約20°C至約22°C。步驟 3 ： TGZ

在步驟3的先前方法中，三-GalNAc-Cbz（TGZ）已經經由溶劑密集型和低產率層析步驟分離和純化。本文揭露了改善的步驟3，該方法包括藉由從溶劑中沈澱對TGZ中間體進行無層析分離和純化。TGZ係藉由經由同時醯胺偶聯將三個NAG-H單元偶聯至三酸來合成的。改善的步驟3的優勢係消除層析法，從而增加了TGZ產率，例如，大於約85%，並且節省時間和金錢，例如，藉由減少溶劑使用和/或避免專門的製造設備。

改善的TGZ純化方法另外提供了更有效的醯胺偶聯。改善的步驟3方法包括使用偶聯試劑且在給定溶劑（例如，二甲基乙醯胺中的TBTU）中將NAG-H偶聯至三酸，這使在反應中使用的NAG-H的當量降低（例如，從約3.5降低至約3-3.3或3.2）。改善的步驟3還包括溫和的緩衝洗滌液，其最大限度減少雜質副產物（例如，去醯基副產物）的形成。改善的步驟3使用溫和的緩衝液（例如，磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液）代替刺激的酸性/鹼性水性洗滌液。最終，從溶劑系統（例如，DCM/MTBE）中進行TGZ的單次沈澱，提供了對TGZ更有效和更高的產率（例如，大於約80%-90%的產率）的分離，使TGZ成為具有更高純度（例如，大於約95%的純度，如藉由LC測量的）的無定形固體。

在一些實施方式中，步驟3方法包括：使三酸與NAG-H或其鹽合併，其可以視需要在溶劑中，添加鹼，以及添加偶聯試劑。在步驟3的一些實施方式中，該方法進一步包括萃取/處理、蒸餾、結晶、沈澱、過濾、和/或乾燥。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H TFA。

在一些實施方式中，偶聯試劑係2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲銨四氟硼酸酯（TBTU）、N-[(二甲基胺基)-1H-1,2,3-***并-[4,5-b]吡啶-1-基亞甲基]-N-甲基甲銨六氟磷酸鹽 N-氧化物（HATU）、O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸酯（TATU）、O-(苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）、氯-N,N,N′,N′-四甲基甲脒六氟磷酸鹽（TCFH）、(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基亞乙基胺基氧基)二甲基胺基-𠰌啉代-碳六氟磷酸鹽（COMU）、(3-二甲基胺基-丙基)-乙基-碳二亞胺（EDC）、氰基(羥基亞胺基)乙酸乙酯（Oxyma）、1-羥基苯并***（HOBt）、[乙基氰基(羥基亞胺基)乙酸基-O2]三-1-吡咯啶基鏻六氟磷酸酯（PyOxim）、丙基膦酸酐（T3P）、雙(2-側氧基㗁唑啶)次磷醯氯（BOPCl）、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤（CDMT）、二環己基碳二亞胺（DCC）、二異丙基碳二亞胺（DIC）、7-氮雜苯并***-1-基氧基)三吡咯啶基鏻六氟磷酸酯（PyAOP）、O-[(乙氧基羰基)氰基亞甲基胺基]-N,N,N’N’-四甲基脲四氟硼酸酯（TOTU）、和N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀醯亞胺基)脲四氟硼酸酯（TSTU）。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU或HATU。在一些實施方式中，偶聯試劑係TCFH。在一些實施方式中，偶聯試劑係HATU。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU。

在一些實施方式中，鹼係三乙胺、二異丙基乙胺（DIPEA）、 N-甲基咪唑（NMI）、 N-甲基𠰌啉（NMM）、或2,2,6,6-四甲基哌啶（TMP）。在一些實施方式中，鹼係DIPEA、NMI、NMM。在一些實施方式中，鹼係NMI。

在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU，並且鹼係NMI。在一些實施方式中，偶聯試劑係TCFH，並且鹼係NMI。

在一些實施方式中，溶劑係二氯甲烷（DCM）、二甲基甲醯胺（DMF）、乙腈（MeCN）、二甲基乙醯胺（DMAc）、或其組合。在一些實施方式中，溶劑係DMF或DMAc。在一些實施方式中，溶劑係DCM或DMAc。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，溶劑係DMF。在一些實施方式中，溶劑係DMAc。

在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU，並且溶劑係DMF。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU，並且溶劑係DMAc。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU，並且溶劑係DCM。

在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係約3-4當量。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係約3-3.7當量。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係約3.1-3.3當量。在一些實施方式中，NAG-H或其鹽係NAG-H TFA。前述當量係相對於三酸。

在一些實施方式中，鹼當量係約6-15當量、8-12當量、或10-12當量。在一些實施方式中，鹼當量係約10-12當量。在一些實施方式中，鹼當量係約11.5-12.5當量。在一些實施方式中，鹼當量係約11-12當量。在一些實施方式中，鹼當量係約12當量。在鹼的前述實施方式的一些實施方式中，鹼係NMI。在鹼的前述實施方式的一些實施方式中，鹼係12當量的NMI。前述當量係相對於三酸。

在一些實施方式中，用於製備TGZ的步驟3方法包括使三酸與3.2當量的NAG-H或其鹽、3.5當量的TBTU、和12.0當量的NMI反應。前述當量係相對於三酸。

在一些實施方式中，用於製備TGZ的步驟3方法顯示在以下方案中：。

在一些實施方式中，本文所述之步驟3方法產生具有低百分比的去醯基雜質的高純度的TGZ。在一些實施方式中，TGZ的純度大於約93%、94%、95%。在一些實施方式中，所得TGZ包含小於約1%、0.5%、或0.2%的去醯基雜質。在一些實施方式中，所得TGZ包含小於約1%的去醯基雜質。

在一些實施方式中，步驟3方法進一步包括用酸洗滌至少一次、兩次、或三次，然後用鹼洗滌至少一次、兩次、或三次。在一些實施方式中，酸係HCl，並且鹼係NH ₄OH。在一些實施方式中，當偶聯藥劑係TCFH，鹼係NMI，並且溶劑係DCM時，使用HCl洗滌液和NH ₄OH洗滌液。

在一些實施方式中，步驟3方法進一步包括用緩衝液洗滌至少一次、兩次、或三次。在一些實施方式中，緩衝液係磷酸鹽緩衝液。在一些實施方式中，緩衝液的pH係約4至8。在一些實施方式中，緩衝液的pH係約5-7。在一些實施方式中，緩衝液的pH係約6。在一些實施方式中，進行至少2或3次pH 6磷酸鹽緩衝液洗滌。在一些實施方式中，進行3次pH 6磷酸鹽緩衝液洗滌。在一些實施方式中，緩衝液係磷酸鈉或磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係約20至550 mM磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係約25至500 mM磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係約40至60 mM磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係約50 mM磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係在約pH 5-7下的約50 mM磷酸鉀。在一些實施方式中，緩衝液係在約pH 6下的約50 mM磷酸鉀。

在一些實施方式中，步驟3方法包括用溶劑對有機相進行共沸蒸餾。在一些實施方式中，用於蒸餾的溶劑係DCM。

在一些實施方式中，步驟3方法進一步包括使用反溶劑從溶劑中沈澱TGZ。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係醚溶劑。在一些實施方式中，醚溶劑係二甲氧基乙烷（DME）、2-甲基四氫呋喃（MeTHF或2-MeTHF）、或甲基三級丁基醚（MTBE）。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係MTBE。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係乙酸異丙酯（IPAc）或乙酸乙酯（EtOAc）。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係DME。在一些實施方式中，溶劑係DMSO或二甲基乙醯胺（DMAc），並且反溶劑係2-MeTHF。在一些實施方式中，溶劑係DMF，並且反溶劑係乙酸異丙酯（IPAc）。在一些實施方式中，使用最終溶劑比率為約1 : 1比率的溶劑 : 反溶劑來沈澱TGZ。在一些實施方式中，使用最終溶劑比率為約1 : 1比率的DCM : MTBE來沈澱TGZ。在一些實施方式中，反溶劑（例如，MTBE）添加發生在約1.5-2.5、2-3、2.5-3.5、或3-4小時或約2、3、或4小時內。

在一些實施方式中，獲得產率為至少約88%、89%、90%的TGZ。在一些實施方式中，獲得純度為至少約95%的TGZ，如藉由LC（95 LCAP）測量的。在一些實施方式中，獲得純度為至少約96%、97%、98%的TGZ，如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，用於製備TGZ的步驟3方法包括三酸（1.0當量）、NAG-H TFA（3.5當量）、DMAc、NMI（12當量）、TBTU（4.0當量）。在一些實施方式中，步驟3方法進一步包括50 mM pH 6磷酸鹽緩衝洗滌液和DCM洗滌液。在一些實施方式中，步驟3進一步包括在將MTBE添加至包含DCM的溶液後沈澱TGZ。

改善的步驟3方法導致該方法的副產物的量減少、最少或無法檢測。該方法的副產物包括單-NAG、二-NAG、二-NAG-吖內酯、去醯基（也稱為去-乙酸酯（des-acetate））、二-NAG-OH、二-NAG-OAc、NAG-H胍、和NAG-H三氟乙醯胺，其中的每一個如下所示。

在一些實施方式中，步驟3方法導致TGZ具有小於約5%、3%、2%、1%、或0.5%的單-NAG、二-NAG、和/或二-NAG-吖內酯，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，步驟3方法導致TGZ具有小於約2%的NAG-H胍、小於約2%的二-NAG-OH、小於約1%的二-NAG、約小於1%的去醯基和小於約1%的二-NAG-OAc。揭露了包含TGZ的組成物，其中所述之雜質中的任一種小於或等於5%（例如，5%、4%、3%、2%、1%），如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，該方法導致最終TGZ產率大於約85%、86%、87%、88%、89%、或90%產率。在一些實施方式中，該方法導致最終TGZ產率大於約90%產率。 TGZ 的可替代之方法：步驟 A-1 、步驟 A-2 、步驟 A-3

步驟 A-1 ：步驟A-1產生以下所示的甲基核心（化學名稱：二甲基 ((S)-4-(((苄氧基)羰基)胺基)-5-甲氧基-5-側氧基戊醯基)-L-麩胺酸酯），並且包含Z-L-GluOMe（化學名稱：(S)-4-(((苄氧基)羰基)胺基)-5-甲氧基-5-側氧基戊酸）與二(OMe)Glu（化學名稱：二甲基 L-麩胺酸酯鹽酸鹽）之間的醯胺偶聯：。

在一些實施方式中，反應在鹼和偶聯試劑的存在下進行。在一些實施方式中，將鹼添加至z-L-GluOMe溶液中，然後將偶聯試劑和二(OMe)Glu添加至反應中。在一些實施方式中，鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）或二異丙基乙胺。在一些實施方式中，鹼係NMM。

在一些實施方式中，反應進一步包含溶劑。在一些實施方式中，溶劑係醚溶劑。在一些實施方式中，溶劑係THF或MeTHF。在一些實施方式中，溶劑係THF。在一些實施方式中，將溶劑在氮氣正壓下添加至反應中。

在一些實施方式中，偶聯試劑係氯甲酸異丁酯（IBCF）、TBTU、HATU、EDC、或DCC。在一些實施方式中，偶聯試劑係IBCF。

在一些實施方式中，在與偶聯試劑反應之前和期間，反應溫度係約-20°C至約-10°C。在一些實施方式中，反應溫度係約-18°C至約-13°C。在一些實施方式中，反應溫度係約-15°C。

在一些實施方式中，在達到該反應溫度後，將偶聯試劑添加至z-L-Glu-OMe和鹼的溶液中，然後將二(OMe)Glu添加至反應中。

在一些實施方式中，在二(OMe)Glu後的反應時間係約50-70分鐘。在一些實施方式中，反應時間係約60分鐘。

在一些實施方式中，將二(OMe)Glu添加至反應中。在一些實施方式中，將二(OMe)Glu的量以4-6等份添加。在一些實施方式中，將二(OMe)Glu的量以5等份添加。

在一些實施方式中，在添加二(OMe)Glu後，將反應溫度增加至約5°C至約15°C。在一些實施方式中，將反應溫度增加至約7°C至約12°C。在一些實施方式中，反應溫度在2小時的時間段內增加。

在一些實施方式中，反應時間係約12-24小時。在一些實施方式中，反應時間係約14-18小時。

在一些實施方式中，反應進一步包括另外充入偶聯試劑、鹼、和/或z-L-Glu-OMe。在一些實施方式中，反應進一步包括另外充入IBCF、NMM和Z-L-Glu-OMe。在一些實施方式中，另外的充入係約8-12 mol%。在一些實施方式中，另外的充入係約10 mol%。

在一些實施方式中，相對於z-L-GluOMe，二(OMe)Glu的當量係約0.8當量至約1.3當量，NMM的當量係約2.3當量至約2.7當量，並且IBCF的當量係約0.8當量至約1.3當量。在一些實施方式中，相對於z-L-GluOMe，二(OMe)Glu的當量係約1當量，NMM的當量係約2.5當量，並且IBCF的當量係約1當量。

完成後，將反應用有機溶劑稀釋，然後依次用水性酸洗滌，然後用水性鹼洗滌。在一些實施方式中，有機溶劑係乙酸酯溶劑。在一些實施方式中，有機溶劑係乙酸乙酯（EtOAc）。在一些實施方式中，水性酸係HCl。在一些實施方式中，水性鹼係NaOH。在一些實施方式中，水性洗滌進行約2至約4次。然後，在結晶前從有機溶液中去除殘留的水。

反溶劑添加結晶係藉由緩慢冷卻斜降至室溫進行的。在一些實施方式中，反溶劑係庚烷。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係EtOAc/庚烷。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係1 : 1、1 : 2、或1 : 3 EtOAc/庚烷。在一些實施方式中，溶劑/反溶劑係1 : 1 EtOAc/庚烷。將所得漿液過濾以分離甲基核心固體。將固體用有機溶劑洗滌，然後在氮氣下乾燥。

在一些實施方式中，用於製備甲基核心的步驟A-1方法顯示在以下方案中：。

步驟 A-2：本文揭露了三醇化合物（化學名稱：苄基 ((10S,15S)-1,22-二羥基-10-((2-(2-羥基乙氧基)乙基)胺基甲醯基)-7,12,16-三側氧基-3,20-二氧雜-6,11,17-三氮雜二十二烷-15-基)胺基甲酸酯）以及用於製備三醇之方法。本文還揭露了在-NH ₂上不具有CBz保護基團的未受保護的三醇。步驟A-2產生了以下所示的三醇，並且包括甲基核心（二甲基 ((S)-4-(((苄氧基)羰基)胺基)-5-甲氧基-5-側氧基戊醯基)-L-麩胺酸酯）與胺基醇（化學名稱：2-(2-胺基乙氧基)乙醇或2-(2-胺基乙氧基)乙-1-醇）之間的胺解：

在一些實施方式中，2-(2-胺基乙氧基)乙醇係純的，並且反應不使用溶劑。在一些實施方式中，使用溶劑添加劑。

在一些實施方式中，相對於甲基核心，2-(2-胺基乙氧基)乙醇係約25-30當量。

在一些實施方式中，反應溫度係約25°C至約35°C。在一些實施方式中，反應溫度係約30°C。在一些實施方式中，反應時間係約22-26小時。在一些實施方式中，反應時間係約24小時。

在一些實施方式中，步驟A-2不是酶介導的。在一些實施方式中，步驟A-2係酶介導的。在一些實施方式中，酶係Novozym 5103（液體）、Lipozyme CALB L（液體）、Resinase HT（液體）、Lipozyme TL（液體）、Novozym 435（固體支持物）、Novozym 40086（固體支持物）、Lipozyme TL（固體支持物）、木瓜蛋白酶（凍乾的）、胰蛋白酶（凍乾的）、Amano PS（粉末）、Novozym 5103（液體）、Lipozyme CALB L（液體）、Reinase HT（液體）、醛縮酶（凍乾的）、木瓜蛋白酶（凍乾的）、胰蛋白酶（凍乾的）、或Palatase（液體）。在一些實施方式中，酶係Lipozyme CALB L（液體）、Lipozyme TL（液體）、Novozym 435（固體支持物）、Lipozyme TL（固體支持物）。在一些實施方式中，酶係Lipozyme CALB L（液體）。在一些實施方式中，酶係Lipozyme TL（液體）。在一些實施方式中，酶係Novozym 435（固體支持物）。在一些實施方式中，酶係Lipozyme TL（固體支持物）。

在一些實施方式中，添加反溶劑以沈澱三醇。在一些實施方式中，反溶劑係乙酸乙酯、甲基三級丁醚、或乙酸異丙酯。在一些實施方式中，反溶劑係乙酸乙酯。

在一些實施方式中，視需要將三醇晶種添加至反應中。在一些實施方式中，添加約1-3重量百分比（wt%）的晶種。在一些實施方式中，添加約2重量百分比（wt%）的晶種。

將反應溫度降低至約室溫。在一些實施方式中，將反應溫度降低至約20°C至約25°C。使三醇的漿液老化約16-20小時或約18小時。

將漿液過濾，然後將粗產物固體用有機溶劑洗滌，然後重新溶解在有機溶劑中用於在一定溫度下重新漿化。將漿液過濾，並且將產物固體用有機溶劑洗滌，然後在氮氣下乾燥。在一些實施方式中，有機溶劑係乙酸乙酯。

在一些實施方式中，用於製備三醇的步驟A-2方法顯示在以下方案中：。

步驟 A-3：步驟A-3產生TGZ，並且包含三醇和B-D-半乳糖胺五乙酸酯之間的糖基化：。

將B-D-半乳糖胺五乙酸酯轉化為㗁唑啉溶液（即，B-D-半乳糖胺五乙酸酯的㗁唑啉衍生物），如下所示。

在一些實施方式中，將B-D-半乳糖胺五乙酸酯的㗁唑啉衍生物與三醇在同一反應容器中製備，而不是分開製備。

在一些實施方式中，將B-D-半乳糖胺五乙酸酯首先轉化為㗁唑啉溶液（即，B-D-半乳糖胺五乙酸酯的㗁唑啉衍生物），然後添加至三醇的溶液中。

㗁唑啉溶液藉由使B-D-半乳糖胺五乙酸酯與三甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TMSOTf）反應來產生。在一些實施方式中，TMSOTf係約1至約1.5當量。在一些實施方式中，將TMSOTf以約1.2當量使用。當量係相對於B-D-半乳糖胺五乙酸酯。在一些實施方式中，反應溫度係約35°C至約45°C。在一些實施方式中，反應溫度係約40°C。在一些實施方式中，反應時間係約70至約110分鐘。在一些實施方式中，反應時間係約90分鐘。

在一些實施方式中，製備㗁唑啉溶液的反應進一步包含溶劑。在一些實施方式中，溶劑係二氯乙烷（DCE）或二氯甲烷（DCM）。在一些實施方式中，溶劑係DCE。

在一些實施方式中，將㗁唑啉溶液的反應溫度降低至約20°C至約28°C。在一些實施方式中，這樣的反應溫度係約23°C。

在一些實施方式中，將三醇與碳酸氫鈉（NaHCO ₃）混合以產生三醇和NaHCO ₃的漿液混合物，然後添加β-D-半乳糖胺五乙酸酯或其㗁唑啉溶液。在一些實施方式中，三醇和NaHCO ₃的漿液混合物進一步包含溶劑。在一些實施方式中，漿液混合物的溶劑係二氯甲烷（DCM）、二氯乙烷、或乙腈。在一些實施方式中，漿液混合物的溶劑係二氯甲烷（DCM）。

在一些實施方式中，將㗁唑啉溶液添加至三醇和NaHCO3的漿液混合物中。在一些實施方式中，將㗁唑啉溶液以㗁唑啉溶液的約0.8至約1.2當量/小時高達至約4-5當量/小時的比率添加至三醇和NaHCO3的混合物中。在一些實施方式中，將㗁唑啉溶液以㗁唑啉溶液的約1.0當量/小時高達至約4.5當量/小時的比率添加至三醇和NaHCO ₃的混合物中。

隨後，將反應持續約18至約30小時或過夜。在一些實施方式中，反應持續約24小時。在一些實施方式中，反應溫度係約20°C至約30°C。在一些實施方式中，反應溫度係約25°C。

可以添加另外充入的重新定量的㗁唑啉溶液以幫助反應轉化。將反應用有機鹼淬滅，然後用水性鹼淬滅。在一些實施方式中，有機鹼係Et ₃N。在一些實施方式中，水性鹼係NaHCO ₃。

將有機相用溫和的酸性水性洗滌液洗滌。在一些實施方式中，酸係NH ₄Cl。將有機溶液乾燥以去除殘留的水。

將所得TGZ產物從溶劑/反溶劑系統中沈澱。在一些實施方式中，溶劑係DCM，並且反溶劑係二甲氧基乙烷（DME）。將TGZ漿液過濾，將產物固體用有機溶劑洗滌，並且在氮氣下乾燥。在一些實施方式中，有機溶劑係DCM/DME 1 : 1。為了達到更高的純度，可以將固體在一定溫度下在有機溶劑中重新漿化，過濾，用有機溶劑洗滌，然後在氮氣下乾燥。

在一些實施方式中，用於製備TGZ的步驟A-3方法顯示在以下方案中：。步驟 4 ：將 TGZ 氫解為 TG 胺或其鹽

步驟4方法係產生TG胺或其鹽的高壓氫解：

在先前步驟4方法中，將TGZ氫解為TG胺、或其鹽具有一些不希望的因素，例如高催化劑負載（例如，10%）的昂貴Pd源催化劑或易燃反應溶劑MeOH（暴露於氫氣時）。

本文揭露了改善的步驟4，用於對TGZ進行羧基苄基去保護以形成TG胺或其鹽的高壓氫解。關鍵的開發係使用DCM作為反應溶劑以消除分離並進行反應動力學分析來確定最佳的催化劑負載和攪拌速度。還將步驟4中間體（在不分離中間體的情況下）縮放進入接下來的步驟5反應中。

在一些實施方式中，步驟4方法包括：將TGZ與Pd/C催化劑合併，並且用氫加壓。在一些實施方式中，該方法進一步包括酸。在一些實施方式中，該方法包括以下步驟：將TGZ與溶劑合併，添加Pd/C催化劑，添加酸，並且用氫加壓。在一些實施方式中，步驟4方法包括：將TGZ與Pd/C催化劑合併，添加酸和溶劑，並且用氫加壓。在完成反應後，可以藉由過濾去除催化劑。在步驟4的一些實施方式中，該方法進一步包括過濾。

使用鈀源用於氫解。在一些實施方式中，鈀源係Pd/C催化劑。在一些實施方式中，使用的鈀碳（Pd/C）催化劑小於約10%、9%、8%、7%、6% Pd/C。在一些實施方式中，Pd/C催化劑係約4%-6% Pd/C。在一些實施方式中，Pd/C催化劑係5% Pd/C。

在一些實施方式中，該方法包括使用酸。在一些實施方式中，酸係TFA、草酸、HCl、AcOH、H ₃PO ₄、檸檬酸。在一些實施方式中，酸係TFA或草酸。在一些實施方式中，酸係TFA。在一些實施方式中，酸係草酸。

在一些實施方式中，溶劑係DCM、IPAc、或MeOH。在一些實施方式中，溶劑係DCM或IPAc。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，溶劑係IPAc。

在一些實施方式中，將反應維持在約20°C-25°C的溫度下。在一些實施方式中，將反應攪拌至少約15、16、17、或18小時。

在一些實施方式中，反應減少了一種或多種雜質（例如TG胺去醯基、TG胺二-NAG-OH、TG胺胍基、TG胺醯基、TG乙醯胺、和/或NAG-H胍，其中的每一個如下所示）的形成。

在一些實施方式中，NAG-H胍雜質以最小於或等於2%或1%存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，TG胺二-NAG-OH雜質以最小於或等於2%或1%存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，反應減少了TG胺去醯基雜質的形成。在一些實施方式中，TG胺去醯基雜質以最小於或等於5%、4%、3%、2%、1%存在，如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，TG胺或其鹽係TG胺酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、或草酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽或草酸鹽。在一些實施方式中，TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽。

改善的步驟4方法使得步驟5的TG PEG產物具有高純度，同時減少TG乙醯胺副產物的量。在一些實施方式中，TG胺或其鹽包含小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、或2%的乙醯胺副產物。在一些實施方式中，TG胺或其鹽包含小於約5%的乙醯胺副產物。在一些實施方式中，TG胺或其鹽包含小於約2%的乙醯胺副產物。

在一些實施方式中，從改善的步驟4方法產生的TG胺或其鹽具有大於或等於約97%、98%、或99%的純度，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，從改善的步驟4方法產生的TG胺或其鹽具有大於或等於約97%、98%、或99%的產率。

在一些實施方式中，用於製備TG胺TFA鹽的步驟4方法顯示在以下方案中：。

在一些實施方式中，用於製備TG胺TFA鹽的步驟4方法顯示在以下方案中：

反應和過濾後，將所得溶劑中的TG胺或其鹽直接縮放進入本文所述之步驟5方法中。優勢包括消除了關於蒸餾和沈澱的單元操作。在一些實施方式中，在不分離TG胺或其鹽的情況下，將TG胺或其鹽縮放進入步驟5中。步驟 5 ：將 TG 胺或其鹽與 PEG 酸偶聯以產生 TG PEG

本文揭露了製備TG PEG的改善的步驟5方法，該等方法在醯胺偶聯過程期間減少雜質，消除柱層析法，並且減少溶劑體積。改善之方法包括受控地添加偶聯試劑（例如，TBTU）。藉由控制偶聯試劑（例如，TBTU）添加到PEG酸中的比率，改善之方法減少了稱為TG PEG二聚體的PEG-二聚體雜質的形成。另外，改善的步驟5包括將TG PEG粗品萃取至水性水溶液中，然後進行反萃取以實現正交雜質的排除。

改善的步驟5方法包括在偶聯試劑的存在下使TG胺或其鹽與PEG酸反應。在一些實施方式中，該方法進一步包含鹼。在一些實施方式中，該方法進一步包含溶劑。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU或HATU。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU。在一些實施方式中，溶劑係DCM或DMF。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，偶聯試劑係TBTU，並且溶劑係DCM。在一些實施方式中，偶聯試劑係HATU，並且溶劑係DMF。

在一些實施方式中，步驟5方法包括將TBTU添加至包含TG胺或其鹽和PEG酸的溶液中。

在一些實施方式中，步驟5包括： a) 將TG胺或其鹽與PEG酸合併； b) 添加鹼；以及 c) 在一定時間段內添加TBTU。在一些實施方式中，TG胺或其鹽從步驟4結束時直接添加。在步驟5的一些實施方式中，該方法進一步包括萃取/處理、蒸餾、沈澱、過濾、和/或乾燥。

TBTU可以分批添加或使用漿料轉移添加。在一些實施方式中，將TBTU添加至PEG酸和TG胺或其鹽的溶液中的時間段係在1.5小時內。在一些實施方式中，將TBTU添加至PEG酸和TG胺或其鹽的溶液中的時間段係在1小時內。

在一些實施方式中，步驟5方法進一步包括使用鹼。在一些實施方式中，鹼係N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）、三乙胺、或N-甲基𠰌啉（NMM）。在一些實施方式中，鹼係N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）。

製備TG PEG的改善之方法減少了TG PEG二聚體雜質，如下所示。在NAG-25與寡核苷酸軛合期間，TG PEG二聚體雜質在亞磷酸化步驟中具有反應性，並且可以與寡核苷酸軛合。TG PEG二聚體如下所示：。

在一些實施方式中，步驟5方法產生TG PEG，該TG PEG包含小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的TG PEG二聚體。揭露了包含TG PEG的組成物，其中TG PEG二聚體小於或等於10%（例如，10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%），如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，TG胺或其鹽係TG胺TFA。在一些實施方式中，製備TG PEG的步驟5方法包括使TG胺TFA鹽與PEG酸、TBTU、和DIPEA在溶劑中反應。在一些實施方式中，溶劑係DCM、DMF、DMAc、和MeCN。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，溶劑係DMF。在一些實施方式中，步驟5方法在約-10°C至約5°C下開始，並且在反應的過程中增加至約17°C-27°C。在一些實施方式中，步驟5方法在約-10°C至約-4°C下開始，並且在反應的過程中增加至約17°C-27°C。在一些實施方式中，步驟5方法在約-8°C下開始，並且在反應的過程中增加至約17°C-27°C。在一些實施方式中，步驟5方法在約-8°C下開始，並且在反應的過程中增加至室溫。

在一些實施方式中，用於製備TG PEG的步驟5方法顯示在以下方案中：。在一些實施方式中，用於製備TG PEG的步驟5方法包括將TG胺與PEG酸合併。在一些實施方式中，該方法包含DCM作為溶劑。在一些實施方式中，將溫度維持在約20°C-25°C。在一些實施方式中，將溫度冷卻至-5°C至5°C，添加DIPEA，然後添加TBTU。在一些實施方式中，TBTU在約60-90分鐘的時間段內分批添加或作為漿料添加。在一些實施方式中，然後將反應溫度在約1小時的時間段內緩慢增加至約0°C-5°C。在一些實施方式中，將反應在0°C-5°C下進一步維持約1-5小時。在前述實施方式中，將PEG酸以約0.9-1.3當量添加，將TBTU以約1-1.5當量添加，將DIPEA以約2.5-3.5當量添加，其中的每一個相對於在溶液中的TG胺（來自步驟4）。在前述實施方式中，將PEG酸以約1.1當量添加，將TBTU以約1.3當量添加，將DIPEA以約3.0當量添加，其中的每一個相對於在溶液中的TG胺（來自步驟4）。可以視需要添加另外的量的PEG酸和TBTU以增加反應轉化率。

在完成反應後，將TG PEG粗品萃取至水性水溶液中，然後進行反萃取以去除一種或多種雜質。在步驟5的一些實施方式中，該方法進一步包括萃取/處理、蒸餾、沈澱、過濾、和/或乾燥。

在一些實施方式中，步驟5方法包括用於排除TG PEG二聚體雜質的水性萃取洗滌工序。在一些實施方式中，水性萃取洗滌工序包括水（例如，DI水）萃取，硫酸銨鹽析（例如，13 wt%硫酸銨），反萃取至溶劑中（例如，DCM反萃取），酸性緩衝洗滌液（例如，pH 4-6），以及鹼性緩衝洗滌液（例如，pH 7.5-9）。

在一些實施方式中，酸性緩衝洗滌液包含0.5 M單磷酸鈉（pH 6.0）和飽和鹽水的混合物。在一些實施方式中，NaH ₂PO ₄: 鹽水的比率係約4.5-5體積 : 3-3.5體積。在一些實施方式中，比率係約4.8體積 : 3.2體積。

在一些實施方式中，鹼性緩衝洗滌液包含飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水溶液的混合物。在一些實施方式中，NaHCO ₃: 鹽水的比率係約3.5-4.5體積 : 3.5-4.5體積。在一些實施方式中，比率係4.0體積 : 4.0體積。

在水性萃取洗滌工序後，TG PEG溶液包含純度至少為90%的TG PEG以及每種雜質小於1%的一種或多種雜質（例如TG PEG、去醯基、乙醯胺和/或胍）。

在一些實施方式中，步驟5方法包含用溶劑進行共沸蒸餾。在一些實施方式中，用於蒸餾的溶劑係DCM。

洗滌和蒸餾後，該方法另外包括藉由向混合物中添加反溶劑進行沈澱。在一些實施方式中，反溶劑係MTBE或IPAc。在一些實施方式中，反溶劑係MTBE。在一些實施方式中，在約-5°C-5°C的溫度下出現沈澱。

在一些實施方式中，步驟5方法產生純度大於或等於約90%或95%的TG PEG，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，步驟5方法產生產率大於或等於約80%、81%、82%、83%、84%、85%、或90%的TG PEG。步驟 6 ：從 TG PEG 合成 NAG-25 的磷醯胺形成

本文揭露了從TG PEG製備NAG-25的改善之方法（本文稱為步驟6），其中改變了沈澱溶劑，並且溶劑體積較先前方法大大減少（例如，從150體積減少至約30、20-30、25-35、30-50、40-60體積）。

在一些實施方式中，製備NAG-25之方法包括使TG PEG與活化劑反應。在一些實施方式中，活化劑係四唑、4,5-二氰基咪唑（DCI）、ETT、或苯并巰基四唑（BTT）。在一些實施方式中，活化劑係四唑、DCI、或ETT。在一些實施方式中，活化劑係四唑或DCI。

在一些實施方式中，活化劑係四唑。在一些實施方式中，以約0.2-1.2當量添加四唑。在一些實施方式中，以約0.4-0.8當量添加四唑。在一些實施方式中，以約0.6當量添加四唑。在前述實施方式中的四唑的當量係相對於TG PEG。

在一些實施方式中，活化劑係DCI。在一些實施方式中，以約0.01-0.05當量添加DCI。在一些實施方式中，以約0.02-0.04當量添加DCI。在一些實施方式中，以約0.02-0.03當量添加DCI。在前述實施方式中的DCI的當量係相對於TG PEG。

在一些實施方式中，步驟6反應進一步包含添加劑。在一些實施方式中，步驟6視需要包括將添加劑添加TG PEG中。在一些實施方式中，添加劑係N-甲基咪唑（NMI）。在一些實施方式中，步驟6反應不包含添加劑。

在一些實施方式中，反應進一步包含亞磷酸化試劑（「P-試劑」）。在一些實施方式中，亞磷酸化試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺或2-氰基乙基 N,N-二異丙基氯亞磷醯胺。在一些實施方式中，亞磷酸化試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺。

在一些實施方式中，以約0.75-2當量添加P-試劑。在一些實施方式中，以約1-1.5當量添加P-試劑。在前述實施方式中的當量係相對於TG PEG。

在一些實施方式中，將TG PEG在溶劑中的溶液（TG PEG溶液）添加至P-試劑與活化劑在溶劑中的另一溶液中。可以將TG PEG溶液在一定時間段內添加。在一些實施方式中，時間段係約3-7、3-5、4-5、4-6、或5-6小時或約3、4、5、6、7小時。反應可以在約35°C-45°C或約38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、或45°C的溫度下進行。反應可以持續約8-12、9-11、或10-14小時或至少8、9、10、11、12、13或14小時。在一些實施方式中，P-試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺。在一些實施方式中，活化劑係DCI。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，溶劑係無水DCM。當量P-試劑、活化劑的量已經在先前實施方式中描述。在一些實施方式中，將TG PEG在DCM中的溶液在4.5-5.5小時（例如，約5小時）時間段內添加至2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺與DCI在DCM（例如，無水DCM）中的另一溶液中，然後使其在35°C-45°C（例如，約40°C）下反應至少10小時。在一些實施方式中，該方法包括1-1.5當量的2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺、0.02-0.03當量的DCI，每種的當量皆為相對於TG PEG。

與其他NAG-25方法相比，改善的步驟6方法進一步包括鑒定，控制和/或減少反應雜質的能力。來自步驟6的雜質的實例包括NAG-25二聚體：； NAG-25 PEG二聚體：；氧化的NAG-25：；和/或 H-phos：。

在一些實施方式中，雜質係H-phos、氧化的NAG-25、NAG-25二聚體、和/或NAG-25 PEG二聚體。在一些實施方式中，在反應結束時H-phos、氧化的NAG-25、NAG-25二聚體、和/或NAG-25 PEG二聚體以小於或等於約15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在反應結束時H-phos、氧化的NAG-25、NAG-25二聚體、和/或NAG-25 PEG二聚體以小於或等於約8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在反應結束時NAG-25二聚體以小於或等於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，在反應結束時NAG-25二聚體以小於或等於約5%、4%、3%、2%、或1%的量存在，如藉由LC測量的。

揭露了包含NAG-25的組成物，其中所述之雜質中的任一種小於或等於10%（例如，10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%），如藉由LC測量的。揭露了包含NAG-25的組成物，其中NAG-25二聚體小於或等於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%，如藉由LC測量的。在一些實施方式中，組成物包含NAG-25，其中NAG-25二聚體小於或等於5%、4%、3%、2%、或1%，如藉由LC測量的。

在一些實施方式中，步驟6方法進一步包括萃取步驟、結晶步驟、過濾步驟、和/或乾燥步驟。

在一些實施方式中，將NAG-25使用反溶劑沈澱，該反溶劑係MTBE或庚烷。在一些實施方式中，將NAG-25的沈澱物使用反溶劑沈澱，該反溶劑係庚烷。

在一些實施方式中，將NAG-25從作為溶劑/反溶劑的DCM/庚烷中沈澱。

改善的步驟6方法還包括排除反應性磷相關的雜質。

在一些實施方式中，步驟6方法包括在二氯甲烷中的四唑和NMI的存在下使TG PEG與2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺反應。

在一些實施方式中，步驟6方法顯示在以下方案中：。在以上方案的一些實施方式中，DCM係約15 V，NMI係約0.2當量，四唑係約0.6當量，並且P-試劑係約1.25當量。

在步驟6的一些實施方式中，該方法進一步包括萃取/處理、結晶、沈澱、過濾、和/或乾燥。在步驟6的一些實施方式中，用水洗滌液進行NAG-25的萃取係視需要的。

在一些實施方式中，步驟6方法包括將TG PEG在溶劑中的溶液添加至P-試劑與活化劑在溶劑中的溶液中。在一些實施方式中，P-試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺。在一些實施方式中，該方法不包含添加劑。在一些實施方式中，溶劑係DCM。在一些實施方式中，活化劑係DCI。將TG PEG溶液在一定時間段內添加至P-試劑與活化劑溶液中。在一些實施方式中，時間段係約4-6小時、4.75-5.25小時、或4.5-5.5小時。在添加TG PEG溶液後，使兩種溶液反應至少8-12小時。在一些實施方式中，反應時間係約9-11小時。在一些實施方式中，反應在約35°C-45°C下進行。在一些實施方式中，反應在約38°C-42°C下進行。反應完成後，可以視需要用水進行水性萃取，並且將NAG-25共沸乾燥（例如，在真空下在25°C-35°C下），然後過濾。在一些實施方式中，將NAG-25在沒有水性萃取的情況下沈澱。為了沈澱，可以將NAG-25溶液在90分鐘內添加至無水反溶劑（例如，庚烷）中。將固體過濾，用反溶劑 : 溶劑（例如，無水庚烷 : DCM）洗滌兩次。在一些實施方式中，反溶劑 : 溶劑比率係約4 : 1、3 : 1、2 : 1、或1 : 1。在一些實施方式中，庚烷 : DCM比率係約4 : 1、3 : 1、2 : 1、或1 : 1。在一些實施方式中，庚烷 : DCM比率係約4 : 1或3 : 1。在一些實施方式中，溶劑在反溶劑 : 溶劑溶液中的體積百分比係約20%-50%、20%-30%、30%-40%、或40%-50%，其中剩餘的百分比由反溶劑體積百分比組成。在一些實施方式中，DCM的百分比係反溶劑/溶劑溶液的體積的約20%-50%或約20%、30%、40%、50%。 與寡聚化合物連接

NAG-25和含有NAG-25的化合物藉由與治療化合物（如寡聚化合物）連接可用作靶向配體。NAG-25促進將治療化合物靶向遞送到肝細胞，用於NAG-25軛合的治療化合物的內吞作用，其中治療化合物可以調節靶核酸的表現，導致靶核酸的翻譯改變。例如，治療化合物可以調節靶基因的表現以抑制蛋白質翻譯或表現。

在一些實施方式中，將靶向配體經由另外的連接子和/或可切割的部分與治療化合物連接，然後該另外的連接子和/或可切割的部分與治療化合物連接。在一些實施方式中，將靶向配體連接至治療化合物本身。

在一些實施方式中，治療化合物係抑制表現的寡聚化合物。在一些實施方式中，抑制表現的寡聚化合物係RNAi構建體。在一些實施方式中，抑制表現的寡聚化合物係雙股RNAi構建體。在一些實施方式中，抑制表現的寡聚化合物係單股寡核苷酸。抑制表現的寡聚化合物可以使用本領域常用之方法合成。

在一些實施方式中，將靶向配體直接或間接連接至雙股RNAi構建體的有義股的5’端。在一些實施方式中，將靶向配體直接或間接連接至雙股RNAi構建體的有義股的3’端。在一些實施方式中，將靶向配體直接或間接連接至雙股RNAi構建體的反義股的5’端或3’端。在一些實施方式中，將靶向配體直接或間接連接至單股RNAi構建體的5’端或3’端。

在一些實施方式中，將靶向配體經由磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯、或其他核苷間連接基團在雙股RNAi構建體的有義股的末端核苷的5’端處與雙股RNAi構建體連接。

在一些實施方式中，本文揭露的靶向配體包括可切割的部分。在一些實施方式中，可切割的部分包括可以被切割的磷酸酯或其他核苷間連接基團，或由其組成。在一些實施方式中，將靶向配體經由可切割的部分與治療化合物連接。

在一些實施方式中，將本文揭露的靶向配體連接至包括可切割的部分的另外的一個或多個基團。在一些實施方式中，將靶向配體連接至可切割的部分，然後將該可切割的部分連接至抑制表現的寡聚化合物。

在一些實施方式中，靶向配體係亞磷醯胺化合物（本文也稱為「含有亞磷醯胺的化合物」）。本文所述之包括靶向配體的亞磷醯胺化合物可以用於使用本領域通常已知的亞磷醯胺合成方法將靶向配體容易地附接至治療化合物或其他基團。在一些實施方式中，使用本領域通常已知之方法將包括靶向配體的亞磷醯胺化合物連接至抑制表現的寡聚化合物。在一些實施方式中，將含有靶向配體的亞磷醯胺連接至雙股RNAi構建體的有義股的5'端。

在一些實施方式中，與靶向配體連接的抑制表現的寡聚化合物包括單股寡核苷酸。在一些實施方式中，單股寡核苷酸係單股反義寡核苷酸。在一些實施方式中，將靶向配體直接連接至單股反義寡核苷酸。在一些實施方式中，在靶向配體與單股寡核苷酸之間***另外的基團。

在一些實施方式中，與本文揭露的靶向配體中的任一種連接的抑制表現的寡聚化合物包括RNAi構建體。在一些實施方式中，將本文揭露的靶向配體直接或間接連接至RNAi構建體。

在一些實施方式中，將本文揭露的靶向配體直接連接至RNAi構建體。在一些實施方式中，將本文揭露的靶向配體間接連接至RNAi構建體，因為在RNAi構建體與靶向配體的連接子之間***另外的一個或多個基團。在一些實施方式中，在連接子與治療化合物（例如，RNAi構建體）之間包括第二連接子。 其他實施方式

示例性實施方式的列表包括： 1. 一種用於製備三級丁基核心之方法，三級丁基核心所述方法包括使GluZ： GluZ 與GluOtBu或其鹽： GluOtBu 反應，以產生三級丁基核心。 2. 如實施方式1所述之方法，其中GluOtBu或其鹽係GluOtBu鹽酸鹽：。 3. 如實施方式1或2所述之方法，其中所述反應在偶聯試劑、鹼和溶劑的存在下進行。 4. 如實施方式1-3中任一項所述之方法，其中該偶聯試劑係EDC/Oxyma、TFFH、PyOxim、CDI、PivCl、T3P、或COMU。 5. 如實施方式1-4中任一項所述之方法，其中該偶聯試劑係T3P或PivCl。 6. 如實施方式1-5中任一項所述之方法，其中該偶聯試劑係PivCl。 7. 如實施方式1-6中任一項所述之方法，其中該鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）。 8. 如實施方式1-7中任一項所述之方法，其中該溶劑係IPAc、MeTHF、MIBK、或MTBE。 9. 如實施方式1-8中任一項所述之方法，其中該溶劑係MTBE。 10. 如實施方式1-9中任一項所述之方法，其中該反溶劑係庚烷。 11. 如實施方式1-10中任一項所述之方法，其中該溶劑係MTBE，並且該反溶劑係庚烷。 12. 如實施方式1-11中任一項所述之方法，其中將包含在溶劑中的GluZ和NMM的第一溶液添加至包含該溶劑和PivCl的第二溶液中。 13. 如實施方式1-12中任一項所述之方法，PivCl係過量的。 14. 如實施方式1-13中任一項所述之方法，其中GluOtBu係過量的。 15. 如實施方式1-14中任一項所述之方法，其中基於GluZ的量，三級丁基核心的轉化率大於約90%。 16. 一種製備三酸之方法：三酸所述方法包括使三級丁基核心與酸反應。 17. 如實施方式16所述之方法，其中該酸係磷酸（H ₃PO ₄）、TFA、HCl、苯磺酸、或對甲苯磺酸。 18. 如實施方式16所述之方法，其中該酸係磷酸（H ₃PO ₄）。 19. 如實施方式16-18中任一項所述之方法，其中該反應在選自以下的溶劑中進行：2-MeTHF、乙腈、THF、DMA、環丁碸、和DME。 20. 如實施方式19所述之方法，其中該溶劑係2-MeTHF、THF、或乙腈。 21. 如實施方式19所述之方法，其中該溶劑係2-MeTHF或THF。 22. 如實施方式19所述之方法，其中該溶劑係2-MeTHF。 23. 如實施方式16-22中任一項所述之方法，其中將該三酸分離為結晶固體。 24. 如實施方式16-23中任一項所述之方法，其中該三酸具有大於或等於95%的純度，如藉由LC測量的。 25. 如實施方式16-24中任一項所述之方法，其中該溶劑進一步包含水。 26. 如實施方式16-25中任一項所述之方法，其中該溶劑係2-MeTHF和水的混合物。 27. 如實施方式16-26中任一項所述之方法，其中使用了約3.0 - 4.0體積的2-MeTHF和約0.5 - 2體積的水。 28. 如實施方式16-27中任一項所述之方法，其中反應在約40°C-60°C的溫度下進行。 29. 如實施方式16-28中任一項所述之方法，其中反應在約45°C-55°C的溫度下進行。 30. 如實施方式16-29中任一項所述之方法，其中反應在約50°C的溫度下進行。 31. 如實施方式16-30中任一項所述之方法，該方法進一步包括用至少一種有機/水性洗滌液去除磷酸。 32. 如實施方式16-31中任一項所述之方法，其中該有機/水性洗滌液包含作為有機層的乙酸異丙酯（iPAC）和作為水層的硫酸銨。 33. 如實施方式16-32中任一項所述之方法，其中使用約8-18體積的iPAC和約3-7體積20 wt%的硫酸銨。 34. 如實施方式16-33中任一項所述之方法，其中使用約10體積的iPAC和約5體積20 wt%的硫酸銨。 35. 如實施方式16-34中任一項所述之方法，該方法進一步包括使用丙酮/甲苯、2-MeTHF/IPAc、2-MeTHF/CPME、丙酮/庚烷、或MeTHF/乙腈結晶三酸。 36. 如實施方式16-35中任一項所述之方法，該方法進一步包括使用丙酮/甲苯結晶三酸。 37. 如實施方式16-36中任一項所述之方法，其中該丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、3 : 2、或1 : 2。 38. 如實施方式16-37中任一項所述之方法，其中該丙酮/甲苯的比率係2 : 3、1 : 1、或1 : 2。 39. 如實施方式16-38中任一項所述之方法，其中該三酸以結晶形式獲得，該結晶形式的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。 40. 一種三酸的結晶形式I，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。 41. 一種三酸的結晶形式I，其特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。 42. 一種三酸的結晶形式I，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。 43. 一種三酸的結晶形式II，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。 44. 一種製備TGZ之方法，所述方法包括在偶聯試劑和鹼的存在下使三酸與NAG-H：、或其鹽 NAG-H 反應。 45. 如實施方式44所述之方法，其中該偶聯試劑係TBTU、HATU或TCFH。 46. 如實施方式45所述之方法，其中該偶聯試劑係TBTU。 47. 如實施方式44-46中任一項所述之方法，其中該鹼係DIPEA、NMI、NMM、或TMP。 48. 如實施方式47所述之方法，其中該鹼係NMI。 49. 如實施方式44-48中任一項所述之方法，該方法進一步包括至少一種緩衝洗滌液。 50. 如實施方式49所述之方法，其中該緩衝洗滌液係磷酸鹽緩衝液。 51. 如實施方式49或50所述之方法，其中該緩衝洗滌液係約pH 5-7。 52. 如實施方式51所述之方法，其中該緩衝洗滌液係約pH 6。 53. 如實施方式44-52中任一項所述之方法，其中所述反應在選自以下的溶劑或其組合中進行：DCM、DMF、MeCN、和DMAc。 54. 如實施方式53所述之方法，其中該溶劑係DMAc。 55. 如實施方式53或54所述之方法，該方法進一步包括將反溶劑添加至包含TGZ和該溶劑的溶液中。 56. 如實施方式55所述之方法，其中該反溶劑係醚溶劑。 57. 如實施方式56所述之方法，其中該醚溶劑係DME、2-MeTHF、或MTBE。 58. 如實施方式53-57中任一項所述之方法，其中該溶劑係DCM，並且該反溶劑係MTBE。 59. 如實施方式44-58中任一項所述之方法，其中製備的TGZ雜質減少。 60. 如實施方式59所述之方法，其中該雜質係去醯基。 61. 如實施方式44-60中任一項所述之方法，該方法進一步包括從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ。 62. 如實施方式61所述之方法，其中該溶劑/反溶劑系統係DCM/MTBE。 63. 如實施方式44-62中任一項所述之方法，其中在不使用柱層析法的情況下，獲得純度為至少95%的TGZ。 64. 如實施方式44-63中任一項所述之方法，其中在不從先前反應中分離NAG-H、或其鹽的情況下，將該NAG-H、或其鹽作為先前反應的溶液繼續用於與三酸反應。 65. 如實施方式64所述之方法，其中NAG-H、或其鹽係在先前反應中製備，該先前反應包括在Pd/C催化劑和二甲基乙醯胺（DMAc）的存在下氫化NAG-Z。 66. 如實施方式44-65中任一項所述之方法，其中該DMAc係約3體積至約5體積。 67. 如實施方式44-65中任一項所述之方法，其中該DMAc係約4體積。 68. 如實施方式44-67中任一項所述之方法，其中該NAG-H或其鹽係NAG-H TFA。 69. 如實施方式44-66中任一項所述之方法，其中該Pd/C催化劑係5% Pd/C。 70. 如實施方式44-69中任一項所述之方法，其中NAG-H TFA係在包含以下方案中的試劑的反應中製備的： 71. 一種用於製備NAG-Z之方法，所述方法包括使醯基GalNAc：與醇-Z：反應，以產生NAG-Z。 72. 如實施方式71所述之方法，其中該反應在酸的存在下進行。 73. 如實施方式72所述之方法，其中該酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟化硼醚合物（BF ₃OEt ₂）、三級丁基二甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TBSOTf）、三異丙基矽基三氟甲烷磺酸酯（TIPSOTf）、三氟甲磺酸銦（In(OTf) ₃）、或三氟甲磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。 74. 如實施方式73所述之方法，其中該酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟化硼醚合物（BF ₃OEt ₂）、三氟甲磺酸銦（In(OTf) ₃）、或三氟甲磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。 75. 如實施方式72-74中任一項所述之方法，其中相對於醇-Z，該酸以0.1-0.2當量存在。 76. 如實施方式72-74中任一項所述之方法，其中相對於醇-Z，該酸以0.13-0.17當量存在。 77. 如實施方式71-76中任一項所述之方法，其中該反應在選自乙腈、二氯甲烷、和二氯乙烷的溶劑的存在下進行。 78. 如實施方式77所述之方法，其中該溶劑以總共8-12體積存在。 79. 如實施方式71-78中任一項所述之方法，其中相對於醇-Z，該醯基GalNAc以1.0-2.0當量存在。 80. 如實施方式79所述之方法，其中相對於醇-Z，該醯基GalNAc以1.3-1.7當量存在。 81. 如實施方式71-80中任一項所述之方法，其中將該反應溫度加熱至約55°C-65°C或58°C-62°C。 82. 如實施方式71-81中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑和條件：。 83. 如實施方式71-82中任一項所述之方法，其中該醇-Z藉由在溶劑和鹼的存在下使氯甲酸苄酯與胺基醇反應來製備。 84. 如實施方式83所述之方法，其中該溶劑係二氯甲烷（DCM）。 85. 如實施方式83或84所述之方法，其中該鹼係三乙胺（TEA）。 86. 如實施方式83-85中任一項所述之方法，其中相對於氯甲酸苄酯，該胺基醇以1.1當量存在。 87. 如實施方式73-86中任一項所述之方法，其中該反應溫度係約30°C-40°C。 88. 如實施方式86所述之方法，其中該反應溫度係約33°C-37°C。 89. 如實施方式77-87中任一項所述之方法，其中該溶劑係乙腈，並且添加另外的水以結晶該NAG-Z。 90. 一種製備TG胺、或其鹽之方法，所述方法包括用於對TGZ進行羧基苄基去保護以形成該TG胺或其鹽的高壓氫解。 91. 如實施方式90所述之方法，該方法包括用於氫解的鈀源。 92. 如實施方式91所述之方法，其中該鈀源係鈀碳（Pd/C）催化劑。 93. 如實施方式92所述之方法，其中該鈀源係5% Pd/C.4d。如實施方式4a-4c中任一項所述之方法，其中該負載的催化劑小於約10%、9%、8%、7%、6% Pd/C。在一些實施方式中，使用的催化劑係5% Pd/C。 94. 如實施方式90-93中任一項所述之方法，其中所述氫解在酸的存在下進行。 95. 如實施方式94所述之方法，其中該酸係TFA、草酸、HCl、AcOH、H ₃PO ₄、檸檬酸。 96. 如實施方式94所述之方法，其中該酸係TFA或草酸。 97. 如實施方式94所述之方法，其中該酸係TFA。 98. 如實施方式90-97中任一項所述之方法，所述氫解在溶劑中進行，並且該溶劑係DCM、IPAc、或MeOH。 99. 如實施方式98所述之方法，其中該溶劑係DCM。 100. 如實施方式90-99中任一項所述之方法，其中該方法減少去醯基雜質的形成。 101. 如實施方式90-100中任一項所述之方法，其中該TG胺或其鹽係TG胺酸鹽。 102. 如實施方式90-101中任一項所述之方法，其中該TG胺酸鹽係磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、或草酸鹽。 103. 如實施方式90-102中任一項所述之方法，其中該TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽或草酸鹽。 104. 如實施方式103所述之方法，其中該TG胺酸鹽係三氟乙酸鹽。 105. 如實施方式90-104中任一項所述之方法，其中該方法使得步驟5的TG PEG產物具有高純度，同時減少TG胺乙醯胺副產物的量。 106. 如實施方式90-105中任一項所述之方法，其中該TG胺或其鹽包含小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、或2%的乙醯胺副產物。 107. 如實施方式90-106中任一項所述之方法，其中從改善的步驟4方法產生的該TG胺或其鹽具有大於或等於約97%、98%、或99%的純度，如藉由LC測量的。 108. 如實施方式90-107中任一項所述之方法，其中在不分離該TG胺或其鹽的情況下，將該TG胺或其鹽縮放進入步驟5中。 109. 如實施方式90-108中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑： 110. 一種用於製備TG PEG之方法，所述方法包括用TBTU處理TG胺和PEG酸的溶液。 111. 如實施方式110所述之方法，其中該溶液進一步包含鹼。 112. 如實施方式111所述之方法，其中該鹼係N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）。 113. 如實施方式110-112中任一項所述之方法，其中將該TBTU在約30 min至約1.5小時的時間段內添加。 114. 如實施方式110-112中任一項所述之方法，其中將該TBTU在約1-1.5小時的時間段內添加。 115. 如實施方式110-114中任一項所述之方法，其中以大於或等於約90%的純度產生該TG PEG，如藉由LC測量的。 116. 如實施方式110-115中任一項所述之方法，其中TG PEG二聚體雜質在反應結束時以小於10%的量存在，如藉由LC測量的。 117. 如實施方式110-116中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑： 118. 一種製備NAG-25之方法，該方法包括用活化劑和亞磷酸化試劑處理TG PEG。 119. 如實施方式118所述之方法，其中該活化劑係四唑、DCI、ETT、或苯并巰基四唑（BTT）。 120. 如實施方式118所述之方法，其中該活化劑係四唑、DCI、或ETT。 121. 如實施方式118所述之方法，其中該活化劑係四唑。 122. 如實施方式121所述之方法，其中將該四唑以約0.2當量至1.2當量添加。 123. 如實施方式118-122中任一項所述之方法，其中所述方法在鹼的存在下進行。 124. 如實施方式118-123中任一項所述之方法，其中該鹼係NMI。 125. 如實施方式118-124中任一項所述之方法，其中該亞磷酸化試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺或2-氰基乙基 N,N-二異丙基氯亞磷醯胺。 126. 如實施方式118-125中任一項所述之方法，該方法進一步包括萃取、過濾、沈澱、和乾燥。 127. 如實施方式126所述之方法，其中沈澱包括從DCM/庚烷中沈澱NAG-25。 128. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括針對步驟1、2、3、3’、2’、1’、4、5、或6的實施方式中的任一項。 129. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟1之方法製備三級丁基核心以及將該三級丁基核心轉化為NAG-25。 130. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟2之方法製備三酸以及將該三酸轉化為NAG-25。 131. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟3之方法製備TGZ以及將該TGZ轉化為NAG-25。 132. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟2’之方法製備NAG-Z以及將該NAG-Z轉化為NAG-25。 133. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟4之方法製備TG胺以及將該TG胺轉化為NAG-25。 134. 如實施方式128所述之方法，其中該方法包括藉由步驟5之方法製備TG PEG以及將該TG PEG轉化為NAG-25。 135. 一種用於製備NAG-25：之方法，該方法包括用TBTU處理TG胺和PEG酸的混合物以得到TG PEG ，以及將TG PEG轉化為NAG-25。 136. 一種用於製備NAG-25之方法，該方法包括用於對TGZ進行苄基去保護以形成該TG胺：、或其鹽的高壓氫解，以及將TG胺、或其鹽轉化為NAG-25。 137. 一種用於製備NAG-25之方法，該方法包括在偶聯試劑和鹼的存在下使三酸與NAG-H或其鹽反應以形成TGZ，以及將TGZ轉化為NAG-25。 138. 如實施方式137所述之方法，其中將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱。 139. 一種用於製備NAG-25之方法，該方法包括使三級丁基核心與酸反應以形成該三酸，以及將該三酸轉化為NAG-25。 140. 如實施方式139所述之方法，其中該三酸係結晶的。 141. 如實施方式140所述之方法，其中該三酸係結晶形式I。 142. 一種用於製備NAG-25之方法，該方法包括使GluZ與GluOtBu或其鹽反應以形成該三級丁基核心，以及將該三級丁基核心轉化為NAG-25。 143. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ。 144. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括為結晶的三酸中間體。 145. 如實施方式144所述之方法，其中該結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2。 146. 如實施方式144所述之方法，其中該結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於在以下2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、和21.0 ± 0.2。 147. 如實施方式144-166中任一項所述之方法，其中該結晶三酸係三酸的結晶形式I，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。 148. 如實施方式144-147中任一項所述之方法，其中該結晶三酸係三酸的結晶形式II，其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。 149. 一種用於製備甲基核心之方法，所述方法包括使z-L-Glu-OMe：與L-麩胺酸二甲酯（二(OMe)Glu）：反應以產生甲基核心。 150. 如實施方式149所述之方法，其中該反應在鹼和偶聯試劑的存在下進行。 151. 如實施方式150所述之方法，其中將該鹼添加至z-L-GluOMe溶液中，然後將該偶聯試劑和二(OMe)Glu添加至該反應中。 152. 如實施方式151所述之方法，其中將該偶聯試劑添加至z-L-Glu-OMe和鹼的溶液中，然後將二(OMe)Glu添加至該反應中。 153. 如實施方式149-152中任一項所述之方法，該方法進一步包括溶劑。 154. 如實施方式150-153中任一項所述之方法，其中該鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）或二異丙基乙胺。 155. 如實施方式150-154中任一項所述之方法，其中該偶聯試劑係氯甲酸異丁酯（IBCF）、TBTU、HATU、EDC、或DCC。 156. 如實施方式153-155中任一項所述之方法，其中該溶劑係THF或MeTHF。 157. 如實施方式149-156中任一項所述之方法，其中在與偶聯試劑反應之前和期間，反應溫度係約-20°C至約-10°C。 158. 如實施方式157所述之方法，其中該反應溫度係約-18°C至約-13°C。 159. 如實施方式157或158所述之方法，其中在添加二(OMe)Glu後，將該反應溫度增加至約5°C至約15°C。 160. 如實施方式159所述之方法，其中將該反應溫度增加至約7°C至約12°C。 161. 如實施方式149-160中任一項所述之方法，該方法進一步包括另外充入偶聯試劑、鹼、和/或z-L-Glu-OMe。 162. 如實施方式149-161中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該反應用水性酸洗滌，然後將該反應用水性鹼洗滌。 163. 如實施方式149-162中任一項所述之方法，該方法進一步包括藉由添加反溶劑進行結晶。 164. 如實施方式149-163中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑和條件：。 165. 一種用於製備三醇之方法，該方法包括使甲基核心與2-(2-胺基乙氧基)乙醇：反應，以產生三醇。 166. 如實施方式165所述之方法，其中該方法係用純2-(2-胺基乙氧基)乙醇進行的。 167. 如實施方式165或166所述之方法，其中該反應溫度係約25°C至35°C。 168. 如實施方式167所述之方法，其中該反應溫度係約30°C。 169. 如實施方式165-168中任一項所述之方法，該方法進一步包括添加反溶劑以使該三醇沈澱。 170. 如實施方式169所述之方法，其中該反溶劑係乙酸乙酯、甲基三級丁醚、或乙酸異丙酯。 171. 如實施方式165-170中任一項所述之方法，該方法進一步包括添加三醇晶種。 172. 如實施方式165-171中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑和條件：。 173. 一種用於製備TGZ之方法，該方法包括使三醇：與β-D-半乳糖胺五乙酸酯：反應，以產生TGZ。 174. 如實施方式173所述之方法，其中首先使β-D-半乳糖胺五乙酸酯與矽基三氟甲磺酸酯反應以產生㗁唑啉溶液。 175. 如實施方式174所述之方法，其中該矽基三氟甲磺酸酯係三甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TMSOTf）或三異丙基矽基三氟甲烷磺酸酯（TIPSOTf）。 176. 如實施方式175所述之方法，該方法進一步包括溶劑。 177. 如實施方式176所述之方法，其中該溶劑係二氯乙烷（DCE）或二氯甲烷（DCM）。 178. 如實施方式173-177中任一項所述之方法，其中該反應溫度係約35°C至約45°C。 179. 如實施方式178所述之方法，其中該反應溫度係約40°C。 180. 如實施方式178或179所述之方法，其中將該反應溫度降低至約20°C至約28°C。 181. 如實施方式180所述之方法，其中該反應溫度係約23°C。 182. 如實施方式173所述之方法，其中將該三醇與碳酸氫鈉（NaHCO ₃）混合以產生三醇和NaHCO ₃的漿液混合物，然後添加β-D-半乳糖胺五乙酸酯或其㗁唑啉溶液。 183. 如實施方式182所述之方法，其中三醇和NaHCO ₃的該漿液混合物進一步包含溶劑。 184. 如實施方式183所述之方法，其中該溶劑係二氯甲烷（DCM）、二氯乙烷、或乙腈。 185. 如實施方式173-184中任一項所述之方法，其中將該㗁唑啉溶液添加至三醇和NaHCO ₃的該漿液混合物中。 186. 如實施方式173或185所述之方法，其中該反應溫度係約20°C至約30°C。 187. 如實施方式186所述之方法，其中該反應溫度係約25°C。 188. 如實施方式173-187中任一項所述之方法，其中將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱。 189. 如實施方式173-188中任一項所述之方法，其中將反溶劑添加至包含TGZ和該溶劑的溶液中。 190. 如實施方式188或189中任一項所述之方法，其中該反溶劑係二甲氧基乙烷。 191. 如實施方式173-190中任一項所述之方法，該方法進一步包括實施方式129-144或145-152或實施方式149-164或165-172中的任一項。 192. 如實施方式173-191中任一項所述之方法，其中該方法包括以下方案中的試劑和條件：。 193. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括針對步驟A-1的實施方式149-164中的任一項、針對步驟A-2的實施方式165-172中的任一項、針對步驟A-3的實施方式173-192中的任一項、或針對步驟2’的實施方式71-89中的任一項。 194. 如實施方式193所述之方法，該方法進一步包括針對步驟4的實施方式90-109、針對步驟5的實施方式110-117、或針對步驟6的實施方式118-127中的任一項。 195. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括使z-L-Glu-OMe與L-麩胺酸二甲酯反應以形成該甲基核心，以及將該甲基核心轉化為NAG-25。 196. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括使甲基核心與2-(2-胺基乙氧基)乙醇反應以形成三醇，以及將該三醇轉化為NAG-25。 197. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括使三醇與β-D-半乳糖胺五乙酸酯反應以形成TGZ，以及將該TGZ轉化為NAG-25。 198. 如實施方式197所述之方法，其中將TGZ從溶劑/反溶劑系統中進一步沈澱。 199. 一種用於製備NAG-25之方法，所述方法包括三醇中間體。 200. 一種化合物，其中R係H或Cbz保護基團。

應理解，雖然本揭露結合其詳細描述來閱讀，但是前述描述旨在說明且不限制本揭露的範圍，該範圍藉由所附請求項的範圍來限定。其他方面、優點和修改在以下請求項的範圍內。例如，如以下實例所示，該等實例僅用於說明目的而提供，並且不應解釋為限制所附請求項的範圍。實例實例 1 ：步驟 1

如下製備GluZ溶液：將1.0當量的GluZ、3.5當量的NMM、和5體積的MTBE充入乾淨的惰性反應器1中。在0°C下向分開的乾淨的惰性反應器2中充入1.2當量的PivCl和5體積的MTBE。使用反向添加，將反應器1中的GluZ溶液在1小時內添加至反應器2中。形成白色漿液並將其攪拌至少30 min。然後每15 min分批充入1.3當量的GluOtBu鹽酸鹽（放熱）。隨後，將漿液在0°C下保持至少30 min。如果轉化率≤ 97%，則充入0.5當量的NMM、0.4當量的PivCl、和0.45當量的GluOtBu HCl。如果需要，可以將反應混合物在0°C下保持24 h。在0°C下將12.5體積的0.5N HCl緩慢添加至反應混合物中（放熱）並且攪拌30 min。使該等相靜置，然後將其分離。將有機層用10體積的1N 碳酸鈉洗滌。使該等相靜置，然後將其分離。將有機層用水（10體積）洗滌。使該等相靜置，然後將其分離。如果需要，可以將有機層在0°C下保持過夜。將有機層在35°C下濃縮至6 體積，並且在35°C下一次性充入庚烷（10體積）。將反應器的夾套溫度（Tj）設置為50°C並且攪拌直到完全溶解。然後將Tj設置為40°C，並且充入0.5 wt%的種子。可以如美國專利案號10,246,709中所述之或藉由熟悉該項技術者已知之方法製備可以用作種子的三級丁基核心。將漿液攪拌至少30 min。然後，在40°C下在3小時內充入15體積的庚烷。一旦庚烷添加完成，將Tj緩慢冷卻至20°C並保持過夜。將漿液在20°C下攪拌過夜。將漿液過濾，並且將濾餅用庚烷（3體積）洗滌兩次。在20°C下將三級丁基核心的固體在氮氣下乾燥過夜。

¹H NMR (500 MHz, DMSO- d6) δ ppm 1.40 (d, J=1.30 Hz, 27 H) 1.72 - 1.85 (m, 2 H) 1.89 - 2.02 (m, 2 H) 2.21 - 2.32 (m, 4 H) 4.14 - 4.19 (m, 1 H) 4.97 - 5.13 (m, 2 H) 7.29 - 7.43 (m, 8 H) 7.48 (d, J=7.27 Hz, 2 H) 7.53 (t, J=7.60 Hz, 2 H) 7.59 - 7.68 (m, 2 H) 8.01 (d, J=7.59 Hz, 2H)

當與2.4當量的NMM配對時，還產生了改善的反應轉化率。 PivCl 和 GluOtBu HCl 篩選

對PivCl和GluOtBu HCl進行了當量篩選，以進一步提高反應轉化率和產率。轉化率隨著更高當量的PivCl和GluOtBu HCl而增加。然而，雜質的水平也增加了。目標係找到使三級丁基核心轉化率增加同時不產生更高水平的雜質的PivCl量。最高的轉化率係用1.2當量的PivCl和1.3當量的GluOtBu HCl實現的。

下表提供了來自PivCl當量篩選的三級丁基核心的LCAP

反應	PivCl 當量	GluOtBu HCl 當量	LCAP 起始材料	LCAP 三級丁基核心	轉化為產物	LCAP 雜質
1	1.1	1.1	7.3	91.2	92.8	1.6
2	1.1	1.2	6.4	91.7	93.6	1.9
3	1.2	1.2	4.8	91.4	95.2	3.9
4	1.2	1.3	4.5	92.7	95.5	2.8
5	1.3	1.4	5.7	88.4	94.3	5.9

鹼當量篩選

使用1.2當量PivCl和1.3當量GluOtBu HCl，檢查了NMM的當量。實驗結果係在反應結束時仍然存在未反應的混合酸酐。NMM量的確定將使另外的GluOtBu HCl成為游離鹼並允許反應進行。具有過量的NMM（3-3.5當量）導致沒有殘留的混合酸酐。研究了更高的當量（4-5當量的NMM），但沒有導致進一步反應改善。

下表顯示了用於NMM當量篩選的三級丁基核心的LCAP

NMM （當量）	混合酸酐	GluZ （ LCAP ）	三級丁基核心（ LCAP ）
3.0	N.D.	3.7	96.3
3.5	N.D.	2.2	97.1

正常添加相對於反向添加的比較

由於假設正常添加具有對稱酸酐形成的可能性，因此進行了另一項比較正常添加相對於反向添加的研究。使用GluOtBu（1.3當量）、NMM（3.5當量）、PivCl（1.2當量）對正常添加和反向添加兩者進行了比較。在正常添加下，將PivCl在MTBE中的溶液添加至GluZ、NMM、MTBE的溶液中，並且將反應冷卻至0°C並保持30分鐘。隨後，每15分鐘分三份添加GluOtBu鹽酸鹽，然後將反應保持30分鐘，並在不同時間點取樣進行LC測量。

下表顯示了使用如下所示的條件的步驟1的反向添加與正常添加的比較：下表顯示了正常添加導致約88.7%的三級丁基核心轉化率，而反向添加證明約97.5%或96.1%的轉化率。

添加之方法	GluZZ 的 LCAP	三級丁基核心的 LCAP
正常添加	11.3	88.7%
反向添加	2.5	97.5
反向添加	4.0	96.1

用於結晶的溶劑 / 反溶劑的篩選

進行了高通量實驗（HTE）溶解度篩選，以確定用於結晶的溶劑/反溶劑組合，並將反應溶劑與結晶溶劑比對。對於2-MeTHF，MIBK和IPAc，發現三級丁基核心在80%至90%庚烷之間具有從50 mg/mL到10 mg/mL的陡峭的溶解度曲線（cliff），這在設計結晶時不是最佳的。溶解度篩選表明，MTBE/庚烷係最有希望用於結晶的溶劑混合物，因為它的溶解度曲線平緩。實例 2 ：步驟 2

以下顯示了步驟2的實例。

將3體積H ₃PO ₄添加至三級丁基核心（1當量）、2-MeTHF（3.5體積）和0.5體積水的混合物中，並且將混合物加熱至50°C持續4.5小時。藉由水性萃取有效地去除磷酸：將反應混合物用乙酸異丙酯（iPAC）（10體積）稀釋，並且用20 wt%硫酸銨（(NH ₄) ₂SO ₄）水溶液（5體積）洗滌。然後，將有機層用1.5體積水洗滌。共沸蒸餾後，充入丙酮（4體積）並且將混合物精細過濾以去除殘留的鹽。將丙酮（2體積）通過過濾器沖洗至反應器中。將混合物加熱至45°C，並且將甲苯（6體積）充入反應器中。在45°C下充入1 wt%三酸種子。將漿液在45°C下攪拌。保持6 – 18 h後，在2.5小時內充入甲苯（6體積），並且將溶液攪拌直到達到＜ 6 mg/ml母液濃度。將反應器冷卻至20°C並且攪拌不小於0.5 hr。將固體產物過濾並且用預混合的2 : 1 甲苯 : 丙酮（3體積）洗滌一次。將濾餅在20°C下在氮氣流下真空乾燥。對於以如上所述之類似方法製備的三酸，UPLC-MS的質譜為 m/z（ESI，正離子）：411.27 (M+H) ⁺。從該製備中分離的三酸係結晶形式I。

作為使用IPAc的替代方案，藉由用20 wt%硫酸銨（5體積）和水（2體積）洗滌粗反應混合物，用MeTHF進行水性萃取。添加MeTHF（6-10體積）後，將混合物蒸餾，並且再重複高達兩次MeTHF添加與蒸餾。如先前所述，接下來的步驟繼續用丙酮並且進行精濾。

在研究去保護步驟時，發現與作為唯一溶劑的MeTHF相比，添加水作為三級丁基受體提高了去保護反應的比率和轉化率（表1）（表1；條件 = 2體積H ₃PO ₄，60°C）。另外的實驗發現，在55°C或50°C下3體積H ₃PO ₄與0.5體積水提供了藉由液相層析法（LC）的純度為94%-95%，並且具有比2體積H ₃PO ₄/60°C系統更少的雜質的三酸。

[ 表 1] 水對去保護特徵的影響。

	5體積溶劑，2體積H ₃PO ₄，60 C
反應	溶劑	時間 / h	LCAP tBu 核心	LCAP 一酸	LCAP 二酸	LCAP 三酸
1	MeTHF 5 V	5	0.66	7.27	32.92	54.46
2	MeTHF 3.5 V + 水 1.5 V	5	0	0	1.92	92.43

三酸結晶形式 I 的製備以及 XRPD 表徵

在方法開發期間，經由高通量篩選發現丙酮/甲苯為結晶系統。在另外的實驗中，三酸結晶形式I藉由在45°C下接種49 : 51甲苯 : 丙酮混合物並使其在45°C下去飽和而生成，導致形成結晶三酸。圖1係結晶三酸形式I的實例。所得固體典型地以藉由LC的＞ 99%的純度形成。

晶體製備：三酸結晶形式I藉由將丙酮（4.9體積）充入蒸餾粗反應流（萃取處理、蒸餾以及兩次放入-取出丙酮後）而形成。將混合物加熱至48°C並且充入4.7體積甲苯。在45°C下，充入種子。在充入3.5體積另外的甲苯前，繼續在45°C下攪拌約20 h。將反應器在1 h內冷卻至20°C，將固體過濾並用3 : 2 甲苯 : 丙酮洗滌一次，然後在真空下乾燥。

X 射線粉末繞射：在具有RTMS檢測器的PANalytical X’Pert PRO X射線繞射系統上獲得X射線粉末繞射數據。在45 kV和40 mA下以0.0334°的步長以5-45°（2θ）的連續模式使用CuKα輻射（1.54 Å）掃描樣本。入射光束路徑配備有0.02弧度的索勒狹縫、15 mm掩模、4°固定防散射狹縫和可程式設計發散狹縫。繞射光束配備有0.02弧度的索勒狹縫、可程式設計防散射狹縫和0.02 mm鎳濾光片。在低背景樣本架上製備樣本並且將其放置於旋轉臺上，旋轉時間為2 s。三酸結晶形式I的甲苯/丙酮形式的XRPD圖譜在圖2中顯示，並且XRPD峰在下表2中列出。

[表2]：三酸晶體形式I的XRPD信號

位置[°2θ]	d-間距 [Å]
7.42	11.92
9.21	9.60
10.20	8.68
14.56	6.08
18.34	4.84
19.30	4.60
20.97	4.24
22.95	3.88

三酸晶體形式 II 的製備將2 g的三酸充入帶有攪拌棒的40 mL小瓶中。添加1 V（2 mL）2-MeTHF和1.5 V（3 mL）iPAc。將混合物伴隨攪拌加熱至50°C以溶解三酸。將13.5 V iPAc（27 mL）添加至混合物中。添加iPAc時，溶液渾濁並觀察到一些油狀物。將溫度增加直到達到50°C的內部溫度。在加熱和攪拌時，油狀物變成鬆散的固體。將漿液在50°C下保持15 min。母液樣本濃度測量為58 mg/ml三酸。將混合物冷卻至45°C，產生非常濃稠的漿液，然後將其冷卻至室溫。母液的濃度測量為5 mg/mL三酸。此時，將漿液轉移到過濾器中。充入10 V iPAc（20 mL）以松解小瓶中的殘留固體，並且還將混合物充入過濾器中。最終，將小瓶用2.5 V iPAc（5 mL）沖洗並且將混合物添加至過濾器中。將固體在真空下用氮氣流乾燥過夜。將1.55 g固體分離。定量NMR（使用馬來酸內標，d6-DMSO溶劑）指示材料係86 wt%三酸和11 wt% iPAc。三酸結晶形式II的XRPD圖譜在圖3中顯示。可以使用以上所述之步驟2實例將該所得三酸晶體形式II用作在一系列的結晶中的三酸種子，以產生三酸晶體形式I。實例 3 ：步驟 1’ 、步驟 2’ 、步驟 3’ 、和步驟 3

步驟 1’ ：以下顯示了步驟1’的實例。

將胺基醇（1.1當量）、TEA（1.0當量）、和DCM（4體積）的溶液冷卻至5°C。在一小時內添加CbzCl（1.0當量），並且一旦添加完成，將溶液加熱至35°C持續12小時。將溶液冷卻至20°C，並且藉由添加水（2體積）淬滅。收集水層並且將其用DCM（2體積）反萃取。將合併的有機層用10% NaCl（2體積）洗滌兩次，並且將溶劑交換至ACN（5體積）中。然後將醇-Z（縮寫：Alc-Z）產物分離為透明油狀物或儲存在ACN（5體積）中用於在接下來的步驟中使用。 ¹H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 3.41 (q, J=5.11 Hz, 2H) 3.53 - 3.60 (m, 4H) 3.69 - 3.76 (m, 2H), 5.11 (s, 2H), 5.35 (br s, 1H) 7.29 - 7.43 (m, 5H)。

步驟 2’ ：以下顯示了步驟2’的實例。

向惰性燒瓶中添加醯基GalNAc（1.5當量）、Bi(OTf) ₃（0.15當量）、和ACN（5體積）。將醇-Z（1.0當量）的溶液共沸乾燥並且添加至ACN（5體積）中的燒瓶中。將溶液加熱至60°C並攪拌18小時。在冷卻至20°C後，添加木炭（50重量%）並在室溫下攪拌12小時。然後將木炭濾出，並且將水（18.6體積）充入濾液中。將所得溶液用NAG-Z（0.5 wt%）接種並攪拌30分鐘。如果種子沒有保持，則重複接種方法直到它保持為止。如果種子確實保持，在一小時內添加水（38體積），並且將所得漿液攪拌12小時。將所得產物過濾，用水洗滌液（2體積）洗滌兩次，並且在氮氣流下真空乾燥。然後，獲得呈白色固體的NAG-Z產物（71.27%，調節的效力）。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.78 (d, J=9.20 Hz, 1H), 7.35-7.37 (m, 2H), 7.32-7.35 (m, 2H), 7.30-7.32 (m, 1H), 7.24 (br t, J=5.60 Hz, 1H), 5.21 (d, J=3.40 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 4.99 (dd, J=3.40, 11.20 Hz, 1H), 4.56 (d, J=8.40 Hz, 1H), 3.99-4.04 (m, 1H), 3.98-4.07 (m, 3H), 3.88 (ddd, J=8.40, 9.20, 11.10 Hz, 1H), 3.74-3.81 (m, 1H), 3.55-3.63 (m, 1H), 3.45-3.55 (m, 2H), 3.38-3.43 (m, 2H), 3.14 (q, J=5.70 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.77 (s, 3H)。

用於步驟 2’ 的路易士酸篩選：對於NAG-Z方法，通常用於糖基化反應的某些路易士酸的產率很低。路易士酸篩選在以下所述之條件下進行：。發現中等強度的路易士酸對NAG-Z的形成係有用的。一些路易士酸太弱而無法實現醇-Z的完全轉化，而另一些則太強並將所得NAG-Z分解成醯化和去醯化產物。兩個相關實驗的結果總結在下表中。柱A : NAG-Z LCAP顯示了在給定反應條件下在24小時後獲得的NAG-Z的LCAP，並且柱B : NAG-Z降解顯示了在將NAG-Z置於相應路易士酸持續24小時後觀察到的降解。

路易士酸	條件	A ： NAG-Z LCAP	B ： NAG-Z 降解
BiCl ₃	0.15當量，60°C	11.37	-
Fe(OTf) ₂	0.15當量，60°C	17.54	-
In(OTf) ₃	0.15當量，60°C	66.66	-
Cu(OTf) ₂	0.15當量，60°C	74.91	-
Bi(OTf) ₃	0.15當量，60°C	78.85	1.79%
BF ₃OEt ₂	1當量，室溫	46.57	5.43%
TBSOTf	1當量，室溫	66.98	8.75%
TIPSOTf	1當量，室溫	62.08	25.83%
TMSOTf	1.1當量，室溫	55.02	64.03%

用於步驟 2’ 的醯基 GalNAc 當量篩選：由於以下顯示的潛在水解機制，測試了醯基GalNAc的當量。由於鉍催化劑的吸濕性，水解難以藉由乾燥避免，因此使用醇-Z作為限制性試劑以提高轉化率，並且可以在NAG-Z結晶期間對水解雜質DGalOH進行吹掃。以下顯示了用於當量篩選的條件。以下總結了當量篩選的結果，以及發現的主要雜質（醯基GalNAc、DGalOH、醇-Z）。

醯基 GalNAc 當量	DGalOH LCAP	醯基 GalNAc LCAP	醇 -Z LCAP	NAG-Z LCAP
1.0	12.58	1.01	20.34	49.38
1.1	9.4	0.1	11.1	67.5
1.2	11.76	0.27	5.48	68.94
1.3	13.03	2.42	3.84	63.30
1.4	12.46	2.70	4.08	60.73
1.5	6.53	3.18	2.32	67.87
2.0	15.2	20.29	0.10	60.77
3.0	11.18	35.18	1.2	49.0

用於步驟 2’ 的 溶劑體積：溶劑的體積越低通常導致體積減少（從綠色化學/可持續性的角度來看更好），並且通常會導致較少的產物損失到母液中。因此，篩選幾種反應體積的乙腈。下表總結了醇-Z、NAG-Z、和Ac-Z雜質的LCAP：。

ACN 體積	醇 -Z LCAP	Ac-Z LCAP	NAG-Z LCAP
3.0	3.13	3.04	73.22
6.0	3.10	1.10	69.95
7.5	2.50	2.56	61.72
8.0	2.51	1.17	60.88
8.5	2.92	2.31	60.64
9.0	2.60	0.38	63.29
10.0	2.32	0.50	67.87
20.0	43.89	0	42.33

步驟 3’ ：以下顯示了步驟3’的實例。

向5-L壓力容器中充入NAG-Z（356.0 g；97.5 wt%；610.4 mmol），然後充入Pd/C（18.5 g；5 wt%）、DMAc（1.4 L；4V），最後充入TFA（47 mL；610.4 mmol）。將反應器密封並用氮氣吹掃。然後將頂部空間用氫氣吹掃並設置為46 psi（3.1巴）氫氣。在該等條件下，使反應在21.6 C下攪拌19 h。將催化劑經由過濾去除並用DMAc（350 ml；1V）洗滌。測定所得澄清溶液在97.1 LCAP下含有256.9 g NAG-H（96.7%產率）。

步驟 3 ：以下顯示了步驟3的實例。注意：所有當量/體積相對於三酸

向配備有氮氣入口和溫度探針的5 L夾套反應器中充入三酸（55.0 g，1.0當量）和NAG-H TFA溶液（DMAc中13.27 wt%，3.5當量）。將混合物攪拌10分鐘以溶解三酸，然後冷卻至Tj = 10°C。經由加料漏斗向冷卻的溶液中添加 N-甲基咪唑（115 mL，12.0當量），然後一次性添加固體TBTU（154 g，4.0當量）。將夾套溫度設置為20°C，並且使反應在1小時內加溫。然後，藉由緩慢添加50 mM磷酸鉀pH 6緩衝液（1100 mL，20 ml/g三酸）將反應淬滅。添加DCM（1100 mL，20 mL/g），並且將混合物攪拌至少10分鐘。將各相分離，並且將水相用另外的DCM（1100 mL，20 mL/g）萃取。將合併的有機層用50 mM pH 6磷酸鉀緩衝液（2x1100 mL）洗滌。將DCM溶液藉由共沸蒸餾乾燥至20 V，然後補充新鮮的DCM（1100 mL，20 mL/g）。將40 mL/g DCM中的反應流加熱至Tj = 30°C，然後在3小時內充入MTBE（2200 mL，40 mL/g）。將漿液冷卻至25°C，老化不超過4小時，並過濾。將濾餅用1 : 1 DCM : MTBE（2x1100 mL，5.0 mL/g TGZ）洗滌，並且在真空下乾燥以提供呈白色固體的TGZ（88%產率）。 ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆) δ ppm 7.91 (m, 3H), 7.80 (d, J=9.2 Hz, 4H), 7.36 (m, 5H), 7.31 (dt, J=8.4, 2.7 Hz, 1H), 5.22 (d, J=3.4 Hz, 3H), 5.02 (s, 2H), 4.99 (m, 3H), 4.56 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.55 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.18 (td, J=8.2, 5.4 Hz, 1H), 4.03 (m, 9H), 3.94 (td, J=8.3, 5.7 Hz, 1H), 3.88 (m, 3H), 3.78 (m, 3H), 3.58 (m, 3H), 3.50 (m, 6H), 3.39 (m, 6H), 3.21 (m, 3H), 3.17 (m, 3H), 2.18 (m, 2H), 2.10 (s, 11H), 1.99 (m, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.83 (m, 2H), 1.78 (s, 6H), 1.77 (s, 3H), 1.70 (m, 2H)。

進行篩選實驗以確定本文所述之反應條件的各種實施方式。篩選的一個實例的結果在下表中顯示。TBTU和HATU提供了高轉化率的TGZ產物（＞ 95 LCAP）。

條目	偶聯試劑	鹼	單 -NAG	二 -NAG + 去醯基的總和	TGZ （ LCAP ）
1	TBTU	DIPEA	--	0.37	96.1
2	TBTU	NMM	--	0.45	96.0
3	TBTU	NMI	--	0.15	96.4
4	HATU	DIPEA	--	0.33	95.4
5	HATU	NMM	--	0.45	95.1
6	HATU	NMI	--	0.19	95.8
7	TCFH	DIPEA	14.4	40.9	25.7
8	TCFH	NMM	3.15	34.5	39.2
9	TCFH	NMI	--	0.35	94.6

經過兩輪HTE篩選和命中驗證，DMF中的TBTU提供了中間體向TGZ的完全轉化，其中反應特徵清晰。雖然篩選中包括的所有鹼皆為有效的，但NMI提供了最高的LCAP TGZ（96.36 LCAP）和0.15 LCAP去醯基。該等條件隨後在克規模上進行了驗證，在1小時內提供了完全轉化。還證明了使用二甲基乙醯胺（DMAc）作為溶劑代替DMF的反應同樣良好。

還進行了另外的試劑當量篩選實驗。反應組分對反應比率的影響在下表中顯示。

條目	NAG-H當量	TBTU當量	NMI當量	時間（hr）	NAG-H胍鹽（LCAP）	二-NAG-OH（LCAP）	二-NAG/去醯基總和（LCAP）	TGZ（LCAP）	m/z 917 （LCAP）
1	3.5	4	12	1	2.6	2.5	0.7	91.7	0.32
2	3.3	4	12	1	2.5	2.5	0.75	91.9	0.31
3	3.15	4	12	1	2.2	2.5	0.8	92.1	0.31
4	3	4	12	4	2.2	2.4	0.88	92.1	0.28
5	3.5	3.5	12	1	2.4	2.6	0.88	91.7	0.31
6	3.5	3	12	3	2.3	2.4	7.5	85.6	0.16
7	3.15	3.5	12	1	1.9	2.5	0.76	92.6	0.25
8	3.15	3.5	10	1	2.0	2.5	0.86	92.3	0.3
9	3.15	3.5	8	3	2.1	2.5	0.75	91.9	0.35
10	3.15	3.5	6	3	1.8	2.5	1.9	89.4	1.47

實例 3 - 可替代的：步驟 A-1 、步驟 A-2 、步驟 A-3

步驟 A-1 ：醯胺偶聯以製備甲基核心。以下顯示了這一步驟的實例。

將z-L-Glu-OMe（50 g，1.0當量）通過粉末加料漏斗充入1 L反應器中。在氮氣正壓下充入THF（10體積），在＜ 3分鐘內完成溶解。將反應冷卻至–15°C。當反應冷卻時，將N-甲基𠰌啉（NMM）（41.8 mL，2.5當量）充入反應中。用0.5體積THF沖洗加料口，一旦反應溫度達到–15°C，充入氯甲酸異丁酯（IBCF）（22 mL，1.1當量），並且立即形成白色沈澱物。在添加期間維持＜–10°C的內部溫度。將反應在–15°C下老化1 h。以5等份（36.2 g）充入L-麩胺酸二甲酯（二(OMe)Glu）。將反應在2小時內加溫至10°C，在此處老化16 h。如果需要，可以添加IBCF、NMM和Z-L-Glu-OMe的另外的10 mol%充入。將反應再反應3 h。一旦反應達到完全轉化，藉由處理進行反應。

充入6體積的EtOAc，然後充入8體積的0.5 M HCl水溶液，將相分割，並且排出水。充入8體積的0.5 M NaOH水溶液，將相分割，並且排出水。充入8體積的飽和水性鹽水溶液，將相分割，並且排出水。排出渾濁有機層並且進行精濾。將有機流添加回乾淨的1 L反應器中。將有機溶液在真空下（45°C，170 mmHg）蒸餾至400 mL。用EtOAc進行兩個連續的共沸蒸餾，充入另外的300 mL（有機總體積約800 mL）並蒸餾至約400 mL（45°C，200 mmHg）。於40°C逐滴充入4體積的庚烷。充入2.0 wt%甲基核心種子並在緩慢冷卻至23°C前保持溫度30 min。逐滴充入另外的6體積的庚烷並使漿液老化過夜。

將漿液排至注射瓶中，並通過800 mL中等孔隙度燒結漏斗過濾。將濾餅用2 x 5體積EtOAc/庚烷（1 : 1）洗滌。將濾餅在氮氣/真空流下乾燥4 hr。

步驟 A-2 ：胺解以製備三醇。以下顯示了這一步驟的實例。

將甲基核心（97 w%，3.5 g，1.0當量）充入100 mL反應器中。將2-(2-胺基乙氧基)乙醇（6體積，21 mL）在氮氣正壓下充入燒瓶中。將溫度設置至30°C並且在該溫度下老化24 h。將20體積的乙酸乙酯（70 mL）在30°C下充入反應器燒瓶中。充入2 wt%三醇種子，檢查種子是否在該溫度下保持。將反應冷卻至23°C並使漿液老化18 h。將漿液在300 mL過濾器漏斗中過濾，將濾餅在穩定的氮氣流下保持。將濾餅用10體積乙酸乙酯（EtOAc）洗滌。收集三醇濾餅並添加回至用於重新漿化的乾淨且乾燥的100 mL反應器中。充入15體積的EtOAc並將漿液加溫至40°C；保持3 h；冷卻回23°C並再老化3 h。將漿液通過500 mL過濾器漏斗過濾。將濾餅用10體積EtOAc洗滌並在氮氣/真空袋下乾燥24 h。分離的三醇濾餅係2.75 g，55%產率。

步驟 A-2 ：初始水解酶篩選：使用10種不同脂肪酶、一種肽酶、一種蛋白酶、和一種醛縮酶進行基於水解酶的初步酶篩選。以50 mg規模建立反應，以甲基核心作為限制性試劑。酶的充入量基於試劑的物理狀態：無論單位數目如何，液體基酶以5 μL充入，凍乾酶以5 mg充入，並且固體支持的酶以50 mg充入。該等酶針對三種不同的溶劑系統進行了篩選：MeCN和THF（在20 V下）以及在胺基醇中純的（8當量）。以下顯示了酶篩選反應條件。。

在2 mL小瓶中建立反應並在45°C下在振盪器板上攪拌48 hr。然後將粗反應混合物藉由HPLC分析，不進行隨後處理或分離。酶反應性受反應介質影響顯著，一般情況下，反應結果呈以下趨勢：純條件＞ THF ＞ MeCN。對於在純條件下進行的所有反應，三醇係主要的粗反應組分，並且甲基核心和中間體單添加產物和二添加產物被完全消耗，儘管這可能是高反應濃度和較高胺基醇當量負載的固有結果。可替代地，MeCN被鑒定為生物催化胺解的不良溶劑，因為大多數反應導致複雜的混合物以及未反應的起始材料。THF中的反應顯示出起始材料和中間體的有效轉化，但轉化程度因酶而異（圖5）。應該注意的是，一些酶，特別是液體基變體，在THF中表現更好，而固體支持的酶在純條件下提供了最佳結果（表3）。該等固定化酶的優勢係它們不需要水性處理。三醇產物係水溶性的，並且如果需要水性洗滌液以去除有機產物中的酶殘餘物，則使所需的三醇損失到相同的水相中。在固體支持物上固定的酶將允許試劑從有機反應溶劑中過濾，並隨後再循環，從而提供最小的酶降解。另外，一旦從反應混合物中去除酶試劑，三醇就可以藉由沈澱從大多數有機溶劑（包括純反應條件）中分離。在THF和純條件之間最成功的反應中，三醇係在50%-65% LCAP範圍的較高端獲得的，其中Novozym 51032、Lipozyme CALB L、Resinase HT、Novozym 435和Lypozyme TL（固體支持和液體基兩者）成為用於轉化的熟練酶（表3）。該等結果指示，脂肪酶可能是最適合所需反應的水解酶的亞類。對於所有反應，二醇雜質通常以＜ 10%液相層析面積百分比（LCAP）形成，這支持我們的假設，即較低的反應溫度可以阻止二醇形成。在所有反應中形成的主要雜質（15% – 30% LCAP）未被分離或未被完全鑒定，藉由LCMS分析未知雜質具有與三醇產物相同的質量，並且被假定為三醇的立體異構物。

[表3]：來自THF條件和純條件酶篩選的一般結果：

溶劑	三醇的 LCAP （ 55% – 65% ）	三醇的 LCAP 45% – 55%	三醇的 LCAP ＜ 45%
THF	Novozym 5103（液體）、Lipozyme CALB L（液體）、Resinase HT（液體）、Lipozyme TL（液體）	Novozym 435（固體支持的）、Novozym 40086（固體支持的）、胃蛋白酶（凍乾的）、Lipozyme TL（固體支持的）、Palatase（液體）	醛縮酶（凍乾的）、木瓜蛋白酶（凍乾的）、Amano PS（粉末）、胰蛋白酶（凍乾的）
在胺基醇中純的	Novozym 435（固體支持的）、Novozym 40086（固體支持的）、Lipozyme TL（固體支持的）、木瓜蛋白酶（凍乾的）、胰蛋白酶（凍乾的）	Amano PS（粉末）、Novozym 5103（液體）、Lipozyme CALB L（液體）、Reinase HT（液體）、Lipozyme TL（液體）	Palatase（液體）、醛縮酶（凍乾的）

該等實驗證明了生物催化胺解反應獲得三醇的可行性。確定了使起始材料和中間體單醯胺和二醯胺完全轉化以給出作為主要反應產物的三醇的條件。

步驟 A-3 ：三重糖基化以製備 TGZ 。以下顯示了這一步驟的實例。

將β-D-半乳糖胺五乙酸酯（10.1 g）充入100 mL反應器燒瓶中。將DCE（37 mL，0.7 M）在氮氣正壓下充入燒瓶中。以防任何初始蒸氣釋放，首先緩慢充入TMSOTf（6.0 mL）。將反應加溫至40°C持續1.5 h；然後冷卻回23°C。同時，建立具有三醇的反應燒瓶。將三醇（95 w%，2.5 g，1.0當量）充入50 mL反應器中，然後充入固體NaHCO ₃（0.2當量）。用氮氣沖洗密封的燒瓶和惰性頂部空間。將DCM（6體積）充入三醇和NaHCO ₃混合物中。將㗁唑啉溶液在25°C下分批充入三醇/DCM漿液（1.0當量的㗁唑啉溶液/hr高達至4.5當量）中。將反應在25°C下老化過夜（24 h）。伴隨高攪拌，充入Et ₃N（3.0當量），並且將淬滅的反應老化20 min。

充入飽和（saturated/sat.）水性（aqueous/aq.）NaHCO ₃（10體積）；將相分離，排出DCM/DCE層，去除水性，重新充入DCM/DCE溶液；用2體積的DCM沖洗。充入飽和水性NH ₄Cl（10體積）；將相分離，排出DCM/DCE層，並且去除水性。將有機流經MgSO ₄乾燥，通過過濾器漏斗過濾；將乾燥固體用2體積DCM沖洗。將DCM/DCE有機溶液充入乾淨的100 mL反應器（約35 mL的有機溶液，14體積w.r.t起始材料）中。將DME（17體積，42 mL）在1 hr內逐滴充入至有機溶液中以給出1 : 1.2比率的溶劑 : 反溶劑。將沈澱老化過夜（20 h）。

通過中等孔隙度燒結漏斗過濾漿液；用5體積DCM/DME（1 : 1）沖洗反應器並洗滌濾餅。將濾餅在氮氣/真空流下乾燥2小時。收集固體並添加至100 mL反應器中。充入20體積（相對於起始材料）的DCM/DME溶液（1 : 1）。將漿液加溫至40°C；保持3 hr；然後冷卻至25°C並再老化2 hr。將漿液通過過濾器漏斗過濾；將濾餅用5體積（DCM/DME 1 : 1）洗滌。過濾母液中的分析的液體係3.5 mg/mL的TGZ。TGZ濾餅係92.6 LCAP。將濾餅在氮氣/真空袋下乾燥以給出呈固體的TGZ。實例 4 ：步驟 4

以下顯示了步驟4的實例。

將TGZ（1.0當量）充入高壓反應容器中，添加7% Pd/C催化劑（5 wt%負載）。充入DCM溶劑（10體積），然後充入TFA（1.0當量）。將反應器密封，用氮氣進行3 x反應器容器吹掃，在填充期間開始攪拌，在排放期間停止攪拌。在50或60 psi下用H2氣進行3 x反應器容器吹掃，無攪拌。將反應攪拌率設置為300 rpm，將夾套溫度設置為23°C，並且將H2壓力設置為45 psi。使反應老化過夜。在拆開蓋子前用氮氣吹掃頂部空間3x。將異質溶液通過0.45微米PTE過濾器過濾，將反應器用3體積DCM沖洗，將沖洗液添加至過濾器中。確保Pd/C濾餅不會變幹。測定溶液的TG胺的效力，將在DCM中的TG胺-TFA溶液在＜ 10°C下儲存。TG胺溶液純度 = 97.2% 質譜：預期質量 = 1525.64147，觀察的m/z：1525.63930。實例 5 ：步驟 5

以下顯示了步驟5的實例。

將DCM中的TG胺溶液調節為12體積的DCM，相對於TG胺的LC測定定量（1.0當量）。將反應器頂部空間用N2吹掃，並且將反應器設置在N2正壓下，將夾套溫度設置為-5°C並開始攪拌。添加PEG酸（1.1當量）（按質量測量），然後添加DIPEA（3.0當量）。將TBTU（1.3當量）固體在N2吹掃下在1小時內分批添加至反應器中。一旦TBTU固體完全溶解（約1 hr），將夾套溫度設置為在30分鐘內斜升至0°C。

將12體積DI水充入反應中，並且將內部溫度設置為10°C。將雙相混合物攪拌30 min，然後將各層分離，排出DCM廢物。使反應器內容物加溫至23°C。將13 wt% (NH4)2SO4（相對於水充入）添加至水性TG PEG溶液中，然後添加10體積的DCM。將各層在30 min內混合，然後使各層分離。將各層分離，並且將有機層用0.5 M單磷酸鈉（pH 6.0）和飽和鹽水（4.8體積 : 3.2體積）的混合物洗滌。使各層混合30 min，然後將各層分離。將有機層用飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水溶液（4.0體積 : 4.0體積）的混合物洗滌。使各層混合30 min，然後將各層分離。

將TG PEG/DCM溶液充入反應器中並蒸餾至5體積。添加另外的10體積的新鮮的DCM並第二次蒸餾至5體積。

排出濃縮TG PEG/DCM溶液，將反應器用0.5體積DCM沖洗。將20體積的MTBE添加至反應器中，並且將內部溫度設置為0°C。將TG PEG/DCM溶液在1小時內添加至冷MTBE中。一旦添加完成，將混合物過濾。將濾餅用3體積MTBE（x2）洗滌。然後將固體經氮氣吹掃乾燥至少24小時。

TG PEG分離的產率 = 79.8%調節的效力。HRMS: 精確質量 = 1861.81989，觀察的m/z：931.41 [M+2H]+

使用96孔板對反應條件進行高通量實驗。篩選條件的實例如下：1.0當量TG胺TFA 鹽、1.1當量PEG酸、3.0當量鹼、和1.1當量偶聯試劑。每種組合都在DCM、DMF和MeCN中進行了評估（參見圖4中的結果）。評估的鹼係DIPEA、NMI、NMM、和TMP。基於TG PEG的LCAP對結果進行評估。從這一篩選中，HATU和TBTU提供了＞ 75 LCAP的TG PEG，以及完全轉化的起始材料和中間體。還進行了添加順序實驗，其中最後添加該等組分（DIPEA、PEG酸、TG胺TFA溶液、TBTU）中的每一種，並且藉由LC測量雜質（例如，去醯基或TG PEG二聚體）的百分比。添加TBTU提供了最少的總雜質量（例如，TG PEG二聚體減少）以及最高的TG PEG產量。實例 6 ：步驟 6

以下顯示了步驟6的實例。

NAG-25由TG PEG使用類似於以上方案之方法描述製備，該方法描述在以下步驟中進一步描述。HRMS: 預期質量 = 2078.95400，觀察的m/z：2078.95428 [M+NH4]+

向反應器中添加TG PEG（1.0當量）、DCM（20 V），然後添加NMI（0.2當量），並且蒸餾以實現≤ 200 ppm水。然後使反應體積至15 V，然後冷卻至0°C - 5°C，然後添加四唑（0.6當量）和P-試劑2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺（1.25當量）。在0°C – 5°C下完成添加後，然後在取樣前，將反應加溫至20°C±5°C並老化2.5 h，以轉化起始TG PEG。完成後，將反應冷卻至10°C，然後用10 V DI水洗滌兩次。將有機溶液經分子篩乾燥並在氮氣保護下過濾。將所得濾液在20°C下濃縮至8 V，然後經由反向添加沈澱到30 V的庚烷中。將獲得的固體藉由過濾分離並用10 V庚烷洗滌兩次，然後在氮氣下真空乾燥。

從TG PEG製備NAG-25的可替代的實例如下。將TG PEG的溶液（24.87 g，13.36 mmol，1當量）在無水DCM（186.5 mL，0.07 M）中製備。將含有P-試劑2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺（5.57 g，16.70 mmol，1.25當量）和4,5-二氰基咪唑（0.039 g，0.33 mmol，0.025當量）的另一溶液在無水DCM（186.5 mL，0.07 M）中製備。將TG PEG溶液在5小時內充入P-試劑/DCI溶液中，並且使其在40°C下反應至少10小時。反應完成後，用DI水（3 x 248.7 mL）進行三次水性萃取。然後，在真空下將NAG-25溶液在30°C下共沸乾燥。在將溶液過濾後，將NAG-25溶液在90分鐘內添加至無水庚烷（745 mL）中。將固體過濾，用無水4 : 1庚烷 : DCM（198.9 mL庚烷/49.7 mL DCM）洗滌兩次，並且在真空/N ₂下乾燥過夜。

雖然本文提供了某些特定實施方式的實例，但熟悉該項技術者將清楚的是可以進行各種變化和修改。此類修改也旨在落入所附申請專利範圍的範圍內。

提供以上描述僅為了清楚理解，而不應理解為無必要的限制，因為本發明範疇內的修改方案對熟悉該項技術者係顯而易見的。

貫穿本說明書，在組成物描述為包括組分或材料時，除非另外描述，否則預期該等組成物也可基本上由或由所敘述的組分或材料的任何組合組成。同樣，在方法描述為包括特定步驟時，除非另外描述，否則預期該等方法也可基本上由或由所敘述的步驟的任何組合組成。本文中說明性地揭露的本發明可在不存在本文中未明確揭露的任何要素或步驟的情況下適當地實踐。

如在閱讀本揭露時對熟悉該項技術者清楚的，本文所述和說明的單獨實施方式中的每一個具有不同的組分和特徵，其可以容易地與其他若干實施方式中的任一個的特徵分離或組合而不脫離本揭露的範圍或精神。任何所述方法可以按敘述事件的順序或邏輯上可能的任何其他順序進行。

本文中所揭露之方法及其單個步驟的實踐可人工和/或在電子設備輔助或由其提供的自動化下進行。雖然已參考特定實施方式描述了諸多方法，但熟悉該項技術者應容易瞭解到，可使用執行與該等方法相關的動作的其他方式。例如，除非另外描述，否則可在不背離該方法的範疇或精神的情況下改變各步驟的順序。此外，一些單個步驟可組合、省略或進一步再分成另外的步驟。

無

[圖1]示出了在丙酮/甲苯結晶期間形成的三酸結晶形式I之晶體。

[圖2]示出了在甲苯/丙酮結晶後三酸結晶形式I之XRPD圖譜。

[圖3]示出了三酸結晶形式II之XRPD圖譜。

[圖4]示出了步驟5在不同條件下3種溶劑（DCM、DMF、MeCN）之間的TG PEG轉化率之結果。

[圖5]示出了酶篩選結果：(A) 來自在MeCN中的選定反應的HPLC結果；(B) 來自在THF中的選定反應的HPLC結果；(C) 來自在純條件下的選定反應的HPLC結果。定義

如本文所用，術語「包括（including）」和「包含/包括（comprising）」，以及變形（如「包括（include）」、「包括（includes）」、「包含/包括（comprise）」、或「包含/包括（comprises）」）以開放性的方式使用，並因此應解釋為意指「包括，但不限於…」。該等術語還將被理解為意味著包括所聲明的整數或步驟、或整數或步驟的組，但不排除任何其他的整數或步驟、或整數或步驟的組。

除非另有指示，否則本文的揭露內容的上下文中（尤其是在申請專利範圍的上下文中）術語「一個（種）（a/an）」、「該/該等（the）」及類似參考物的使用應解釋為涵蓋單數和複數兩者。除非本文另有指示，否則本文有關值的範圍的敘述僅旨在用作個別地提及在該範圍內的每個單獨值的簡寫方法，並且每個單獨值併入說明書中，就如同在本文個別地敘述該值一般。除非另有指示，否則本文所提供的任何和所有實例、或示例性語言（例如，「諸如」）的使用旨在更好地說明本文的揭露內容且並非對本文的揭露內容的範圍的限制。說明書中的語言不應當被解釋為指示任何未要求保護的要素為實踐本文的揭露內容所必需的。

如本文所用，術語「晶體形式」、「結晶形式」、和「形式」可互換地是指在晶格中具有特定分子堆積排列的晶體結構（或多晶型物）。可以藉由一種或多種表徵技術（包括，例如，X射線粉末繞射（XRPD），單晶X射線繞射，差示掃描量熱法（DSC），動態蒸汽吸附（DVS）和/或熱重分析（TGA））來鑒定和彼此區分結晶形式。因此，如本文所用，術語「結晶形式I」和「結晶形式II」係指可以藉由一種或多種表徵技術（包括，例如，X射線粉末繞射（XRPD），單晶X射線繞射，差示掃描量熱法（DSC），動態蒸汽吸附（DVS）和/或熱重分析（TGA））來鑒定和彼此區分的獨特的結晶形式。在一些實施方式中，新型結晶形式的特徵在於在一個或多個特定度數的2θ值（°2θ）處具有一個或多個信號的X射線粉末繞射圖。

如本文所用，術語「XRPD」係指X射線粉末繞射的分析表徵方法。XRPD圖譜可以在環境條件下使用繞射儀以透射或反射幾何形狀記錄。

如本文所用，術語「X射線粉末繞射圖」、「X射線粉末繞射圖譜」、「XRPD圖譜」可互換地是指繪製信號位置（在橫坐標上）相對於信號強度（在縱坐標上）的圖譜。對於無定形材料，X射線粉末繞射圖可以包括一個或多個寬信號。對於結晶材料，X射線粉末繞射圖可以包括描繪在X射線粉末繞射圖的橫坐標上的一個或多個信號，每個信號藉由其角度值來鑒定，如以度2θ（°2θ）測量的，其可以表示為「在……度2θ處的信號」「在……的一個或多個[a]2θ值處的一個或多個信號」和/或「在選自……的一個或多個……2θ值處的至少一個信號」。如本文所用，術語「在……2θ值處具有信號的X射線粉末繞射圖」係指在特定位置（°2θ）處含有一個或多個信號或一個或多個峰的XRPD圖譜。

如本文所用，「信號」或「峰」係指在XRPD圖譜以計數測量的強度處於局部最大值的點。熟悉該項技術者將認識到在XRPD圖譜中的一個或多個信號（或一個或多個峰）可以重疊，並且例如肉眼可能無法明顯看出。實際上，熟悉該項技術者將認識到一些領域公認之方法能夠並且適用於確定信號是否存在於圖譜中，例如Rietveld精修。

角度值的可重複性在±0.2° 2θ的範圍內，即角度值可以在所列舉的角度值 + 0.2度2θ、角度值 - 0.2度2θ，或這兩個端點（角度值 + 0.2度2θ與角度值 - 0.2度2θ）之間的任何值。

術語「信號強度」和「峰強度」可互換地是指給定X射線粉末繞射圖中的相對信號強度。可以影響相對信號或峰強度的因素包括樣本厚度和較佳的取向（例如，晶體顆粒不是隨機分佈的）。

如本文所用，當兩個繞射圖中至少90%（例如至少95%，至少98%、或至少99%）的信號在以度2θ表示的重疊位置處出現時，X射線粉末繞射圖「基本上類似於[特定]圖中的繞射圖」。在確定「基本上類似」時，即使對於相同的結晶形式，XRPD繞射圖中的強度和/或信號位置也可能有所不同。因此，XRPD繞射圖中的信號最大值（以本文所指的度2θ（°2θ）表示）通常意指報告為報告的值±0.2度2θ的值，這係領域公認的方差。

如本文所用，當化合物的結晶形式按重量計等於或大於90%的樣本中化合物的所有一種或多種固體形式的總和的量（如藉由根據本領域之方法（如定量XRPD）確定的）時，它係「基本上純的」。在一些實施方式中，當固體形式按重量計等於或大於95%的樣本中化合物的所有一種或多種固體形式的總和的量時，它係「基本上純的」。在一些實施方式中，當固體形式按重量計等於或大於99%的樣本中化合物的所有一種或多種固體形式的總和的量時，它係「基本上純的」。

如本文所用，術語「溶劑」係指化合物至少部分可溶解（例如，產物的溶解度＞ 1 g/L）於其中的任何液體。

如本文所用，術語「反溶劑」係指化合物不可溶或最難溶（例如，產物的溶解度＜ 1 mg/mL、＜ 2 mg/mL、＜ 3 mg/mL或＜ 0.01 mol/L）於其中的任何液體。

如本文所用，術語「總產率」係步驟的組合的累積產率。例如，為了獲得步驟1、2和3的總產率，將每個步驟的產率相乘。

如本文所用，環境影響因素（「E-因素」）係綠色化學的指標，並且測量相對於產物的總廢物。高E因素指示更多的廢物生成以及對環境的負面影響。

術語「約」和「大約」，當與數量或範圍一起使用時，包括該數量或範圍的值，並且包括由熟悉該項技術者認識到的數量或範圍，以提供等效於從該數量或範圍獲得的效果。在一些實施方式中，術語「約」藉由 + 或 - 10%來修改特定數字。在一些實施方式中，術語「約」藉由 + 或 - 5%來修改特定數字。在一些實施方式中，術語「約」藉由 + 或 - 2%來修改特定數字。在一些實施方式中，術語「約」藉由 + 或 - 1%來修改特定數字。

如本文所用，當「約」後跟一系列數字時，應當理解為「約」適用於後面的所有數字。類似地，當單位（例如，%，小時，當量）出現在一系列或一定範圍的數字的末尾時，該單位適用於該單位之前的所有系列或數字。例如，「約3%、4%、或5%」與「約3%、約4%、或約5%」相同；「約5-10當量」與「約5當量至約10當量」相同；「約3-10小時、3-6小時、4-9小時」與「約3-10小時、約3-6小時、約4-8小時」相同；或「約50-70分鐘或60分鐘」與「約50-70分鐘或約60分鐘」相同。

如本文所用，「寡聚化合物」係包含含有約10-100個核苷酸的至少一種寡核苷酸的化合物。在一些實施方式中，寡聚化合物具有與細胞內表現的靶核酸或靶基因中的編碼序列至少部分互補的核鹼基序列。在一些實施方式中，寡聚化合物在遞送到表現基因的細胞時，能夠抑制潛在基因的表現，並且在本文中稱為「抑制表現的寡聚化合物」。可以體外或體內抑制基因表現。「寡聚化合物」包括但不限於：寡核苷酸、單股寡核苷酸、單股反義寡核苷酸、短干擾RNA（siRNA）、雙股RNA（dsRNA）、微RNA（miRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、核酶、干擾RNA分子、和dicer底物。

如本文所用，術語「寡核苷酸」意指連接的核苷的聚合物，該等核苷中的每個核苷都可以獨立地經修飾或未經修飾。

如本文所用，術語「單股寡核苷酸」意指具有與靶mRNA至少部分互補的序列的單股寡聚化合物，該單股寡聚化合物能夠在哺乳動物生理條件（或體外相當的條件）下藉由氫鍵合或沃森-克裡克（Watson Crick）鹼基配對與靶mRNA雜交。在一些實施方式中，單股寡核苷酸係單股反義寡核苷酸。

如本文所用，「RNAi構建體」係指包含RNA或RNA樣（例如，化學修飾的RNA）寡核苷酸分子的藥劑，其能夠以序列特異性方式降解或抑制靶基因的信使RNA（mRNA）轉錄物的翻譯。如本文所用，RNAi構建體可以藉由RNA干擾機制（即，藉由與哺乳動物細胞的RNA干擾途徑機制（RNA誘導的緘默複合物或RISC）相互作用誘導RNA干擾）或藉由任何可替代的一種或多種機制或途徑起作用。RNAi構建體包括但不限於：單股寡核苷酸、單股反義寡核苷酸、短干擾RNA（siRNA）、雙股RNA（dsRNA）、微RNA（miRNA）、短髮夾RNA（shRNA）、和dicer底物。適合與本文所述之靶向配體（例如NAG-25）軛合的RNAi構建體由具有與被靶向的mRNA至少部分互補的股的寡核苷酸組成。在一些實施方式中，RNAi構建體係雙股的，並且由反義股和與反義股至少部分互補的有義股組成。RNAi構建體可以由經修飾的核苷酸和/或一個或多個非磷酸二酯鍵組成。在一些實施方式中，適合與本文所述之靶向配體（例如NAG-25）軛合的RNAi構建體係單股的。

如本文所用，「LCAP」（代表「液相層析面積百分比」）意指目的化合物的峰面積與峰總面積的百分比。

如本文所用，可以製備本文所述之化合物的鹽，例如，藉由使游離鹼形式的化合物與合適的有機酸或無機酸反應，並視需要分離這樣形成的鹽。本文描述的任何一種或多種化合物的合適鹽的非限制性實例包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基磺酸鹽及胺基酸鹽及諸如此類。

無

Claims

一種製備NAG-25之方法，該方法包括使TG PEG：與活化劑和亞磷酸化試劑反應。
如請求項1所述之方法，其中該活化劑係四唑、4,5-二氰基咪唑（DCI）、5-乙硫基-1H-四唑（ETT）、或苯并巰基四唑（BTT）；並且/或者其中該亞磷酸化試劑係2-氰基乙基-N, N, N’, N’-四異丙基亞磷醯二胺或2-氰基乙基 N,N-二異丙基氯亞磷醯胺。
如請求項1或2所述之方法，其中所述方法在鹼的存在下進行，視需要其中該鹼係N-甲基咪唑（NMI）。
如請求項1-3中任一項所述之方法，其中： a) 該TG PEG在溶液中，並且其中將活化劑和亞磷酸化試劑在另一溶液中合併；以及 b) 將TG PEG的該溶液在一定時間段內添加至活化劑和P-試劑的該溶液中，視需要其中該時間段係約4-6小時或者視需要其中使TG PEG的該溶液與P-試劑和活化劑的該溶液在約35°C-45°C下反應。
如請求項1-4中任一項所述之方法，其中沈澱包括從作為溶劑/反溶劑系統的二氯甲烷（DCM）/庚烷中沈澱NAG-25。
一種用於製備TG PEG之方法，所述方法包括使TG胺：或其鹽、和PEG酸的溶液與偶聯試劑反應。
如請求項6所述之方法，其中溶液進一步包含鹼，視需要其中該鹼係N,N-二異丙基乙胺（DIPEA）。
如請求項6-7中任一項所述之方法，其中將該偶聯試劑在約30 min至約1.5小時的時間段內添加至該溶液中，視需要其中該偶聯試劑係2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲銨四氟硼酸酯（TBTU）或N-[(二甲基胺基)-1H-1,2,3-***并-[4,5-b]吡啶-1-基亞甲基]-N-甲基甲銨六氟磷酸鹽 N-氧化物（HATU）。
如請求項6-8中任一項所述之方法，其中以大於或等於約90%純度產生該TG PEG，如藉由LC測量的，或者其中TG PEG二聚體雜質在反應結束時以小於10%的量存在，如藉由LC測量的。
如請求項6-9中任一項所述之方法，其中在不分離該TG胺或其鹽的情況下，TG胺或其鹽的該溶液繼續用於分開之方法，視需要其中該TG胺或其鹽係TG胺三氟乙酸鹽（TFA）。
如請求項6-10中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該TG PEG轉化為NAG-25。
一種製備TG胺：、或其鹽之方法，所述方法包括對TGZ進行高壓氫解，以形成該TG胺或其鹽。
如請求項12所述之方法，該方法包括用於氫解的鈀源，視需要其中該鈀源係鈀碳（Pd/C）催化劑，視需要其中該鈀源係5% Pd/C。
如請求項12-13中任一項所述之方法，其中所述氫解在酸的存在下進行，視需要其中該酸係三氟乙酸（TFA）、草酸、鹽酸（HCl）、乙酸（AcOH）、磷酸（H ₃PO ₄）、或檸檬酸。
如請求項12-14中任一項所述之方法，其中所述氫解在溶劑中進行，視需要其中該溶劑係DCM、乙酸異丙酯（IPAc）、或甲醇（MeOH）。
如請求項12-15中任一項所述之方法，其中該方法減少一種或多種雜質的形成，該一種或多種雜質係TG胺去醯基、TG胺二-NAG-OH、TG胺胍基、TG胺醯基、TG乙醯胺、和/或NAG-H胍。
如請求項12-16中任一項所述之方法，其中該TG胺或其鹽係TG胺酸鹽，視需要，磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、或草酸鹽。
如請求項12-17中任一項所述之方法，其中該TG胺或其鹽作為TG胺或其鹽的溶液繼續使用，並且在不將該TG胺或其鹽分離至製備TG PEG的另一方法中的情況下。
如請求項12-18中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該TG胺或其鹽轉化為NAG-25。
一種製備TGZ之方法，所述方法包括在偶聯試劑和鹼的存在下使三酸與NAG-H：、或其鹽反應。
如請求項20所述之方法，其中該偶聯試劑係TBTU、HATU或氯-N,N,N′,N′-四甲基甲脒六氟磷酸鹽（TCFH），視需要其中該偶聯試劑係TBTU。
如請求項20-21中任一項所述之方法，其中該鹼係二異丙基乙胺（DIPEA）、 N-甲基咪唑（NMI）、 N-甲基𠰌啉（NMM）、或2,2,6,6-四甲基哌啶（TMP），視需要其中該鹼係NMI。
如請求項20-22中任一項所述之方法，該方法進一步包括至少一種緩衝洗滌液，視需要其中該緩衝洗滌液係約pH-5-7。
如請求項20-23中任一項所述之方法，其中所述反應在選自以下的溶劑或其組合中進行：DCM、DMF、MeCN、和DMAc。
如請求項20-24中任一項所述之方法，該方法進一步包括從溶劑/反溶劑系統中沈澱TGZ。
如請求項24-25中任一項所述之方法，其中將反溶劑添加至包含TGZ和該溶劑的溶液中，視需要其中該反溶劑係醚溶劑，視需要其中該醚溶劑係DME、2-MeTHF、或MTBE。
如請求項20-26中任一項所述之方法，其中製備具有降低的一種或多種雜質水平的TGZ，其中該等雜質係單NAG、二-NAG、二-NAG-吖內酯、去醯基、二-NAG-OH、二-NAG-OAc、NAG-H胍、或NAG-H三氟乙醯胺。
如請求項20-27中任一項所述之方法，其中在不使用柱層析法的情況下，獲得純度為至少95%的TGZ。
如請求項20-28中任一項所述之方法，其中在不分離該NAG-H、或其鹽的情況下，該NAG-H、或其鹽係繼續用於另一方法的溶液。
如請求項20-29中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該TGZ轉化為NAG-25。
一種製備NAG-H、或其鹽之方法，該方法包括在Pd/C催化劑和溶劑的存在下氫化NAG-Z：，視需要其中該溶劑係二甲基乙醯胺（DMAc）或DCM。
如請求項31所述之方法，其中該DMAc或DCM係約3體積至約6體積。
如請求項31-32中任一項所述之方法，該方法進一步包括酸，視需要其中該酸係三氟乙酸（TFA）、乙酸（AcOH）、或三甲基乙酸（PivOH），視需要其中相對於醇-Z，該酸以0.01-0.04當量存在。
如請求項31-33中任一項所述之方法，其中該NAG-H或其鹽係NAG-H TFA：。
如請求項31-34中任一項所述之方法，其中該Pd/C催化劑係5% Pd/C。
如請求項31-35中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該NAG-H或其鹽轉化為NAG-25。
一種用於製備NAG-Z之方法，所述方法包括使醯基GalNAc：與醇-Z：反應，以產生NAG-Z。
如請求項37所述之方法，其中該反應係在酸的存在下進行的，視需要其中該酸係三氟甲烷磺酸鉍（Bi(OTf) ₃）、三氟化硼醚合物（BF ₃OEt ₂）、三級丁基二甲基矽基三氟甲烷磺酸酯（TBSOTf）、三異丙基矽基三氟甲烷磺酸酯（TIPSOTf）、三氟甲磺酸銦（In(OTf) ₃）、或三氟甲磺酸銅（Cu(OTf) ₂）。
如請求項37-38中任一項所述之方法，其中該反應在選自乙腈、二氯甲烷、和二氯乙烷的溶劑的存在下進行。
如請求項37-39中任一項所述之方法，其中相對於醇-Z，該醯基GalNAc以1.0-2.0當量存在。
如請求項37-40中任一項所述之方法，其中將該反應溫度加熱至約55°C-65°C或58°C-62°C。
如請求項37-41中任一項所述之方法，其中該溶劑係乙腈，並且添加另外的水或MTBE以結晶該NAG-Z。
如請求項37-42中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該NAG-Z轉化為NAG-25。
一種製備醇-Z之方法，所述方法包括在溶劑和鹼的存在下使氯甲酸苄酯與胺基醇反應。
如請求項43-44所述之方法，其中該溶劑係二氯甲烷（DCM），並且該鹼係三乙胺（TEA）。
如請求項43-45中任一項所述之方法，其中相對於氯甲酸苄酯，該胺基醇以約1.1當量存在，並且/或者該反應溫度係約30°C-40°C。
一種三酸的結晶形式I，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2，或者其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖2中的X射線粉末繞射圖。
一種三酸的結晶形式II，其特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2± 0.2、和21.0 ± 0.2，或者其特徵在於X射線粉末繞射圖基本上類似於圖3中的X射線粉末繞射圖。
一種製備三酸之方法，三酸，所述方法包括使三級丁基核心與酸反應。
如請求項49所述之方法，其中該酸係磷酸（H ₃PO ₄）、TFA、HCl、苯磺酸、或對甲苯磺酸。
如請求項49-50中任一項所述之方法，其中該反應在選自以下的溶劑中進行：2-MeTHF、乙腈、THF、DMA、環丁碸、和DME。
如請求項49-51中任一項所述之方法，其中將該溶劑與水混合，視需要其中該溶劑係2-MeTHF，並且視需要其中使用了約3.0 - 4.0體積的2-MeTHF以及約0.5 - 2體積的水。
如請求項49-52中任一項所述之方法，其中反應在約40°C-60°C的溫度下進行。
如請求項49-53中任一項所述之方法，其中將該三酸分離為結晶固體。
如請求項49-54中任一項所述之方法，該方法進一步包括使用丙酮/甲苯、2-MeTHF/IPAc、2-MeTHF/CPME、丙酮/庚烷、或MeTHF/乙腈結晶三酸。
如請求項49-55中任一項所述之方法，其中該三酸以結晶形式獲得，該結晶形式的特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.4 ± 0.2、9.2 ± 0.2、21.0 ± 0.2、14.6 ± 0.2、18.3 ± 0.2、和19.3 ± 0.2，或者特徵在於在選自以下的三個2θ值處具有至少一個信號的X射線粉末繞射圖：7.8 ± 0.2、9.7 ± 0.2、13.3 ± 0.2、15.7± 0.2、17.1 ± 0.2、18.9 ± 0.2、20.2± 0.2、和21.0 ± 0.2。
如請求項49-56中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該三酸轉化為NAG-25。
一種用於製備三級丁基核心之方法，三級丁基核心所述方法包括使GluZ： GluZ 與GluOtBu或其鹽： GluOtBu 反應，以產生三級丁基核心。
如請求項58所述之方法，其中GluOtBu或其鹽係GluOtBu鹽酸鹽：。
如請求項58或59所述之方法，其中所述反應在偶聯試劑、鹼和溶劑的存在下進行。
如請求項58-60中任一項所述之方法，其中該偶聯試劑係EDC/Oxyma、TFFH、PyOxim、CDI、PivCl、T3P、或COMU；該鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）；或者該溶劑係IPAc、MeTHF、MIBK、或MTBE；視需要其中添加反溶劑。
如請求項58-61中任一項所述之方法，其中將包含在溶劑中的GluZ和NMM的第一溶液添加至包含該溶劑和偶聯試劑的第二溶液中；視需要其中該溶劑係MTBE，並且視需要其中該偶聯試劑係PivCl。
如請求項58-62中任一項所述之方法，其中偶聯試劑係過量的並且/或者GluOtBu係過量的，視需要其中該偶聯試劑係PivCl。
如請求項58-63中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該三級丁基核心轉化為NAG-25。
一種用於製備甲基核心之方法，所述方法包括使z-L-Glu-OMe：與L-麩胺酸二甲酯（二(OMe)Glu）：反應，以產生甲基核心，視需要在鹼和偶聯試劑的存在下。
如請求項65所述之方法，其中：a) 將該鹼添加至z-L-GluOMe溶液中，然後將該偶聯試劑和二(OMe)Glu添加至該反應中；或者b) 其中將該偶聯試劑添加至z-L-Glu-OMe和鹼的溶液中，然後將二(OMe)Glu添加至該反應中。
如請求項65-66中任一項所述之方法，該方法進一步包括溶劑，視需要其中該溶劑係THF或MeTHF。
如請求項65-67中任一項所述之方法，其中該鹼係N-甲基𠰌啉（NMM）或二異丙基乙胺，並且/或者該偶聯試劑係氯甲酸異丁酯（IBCF）、TBTU、HATU、EDC、或DCC。
如請求項65-68中任一項所述之方法，該方法進一步包括將該甲基核心轉化為NAG-25。
一種化合物：，其中R係H（未受保護的三醇）或Cbz保護基團（三醇）。
一種用於製備三醇之方法，，該方法包括使甲基核心與2-(2-胺基乙氧基)乙醇：反應，以產生三醇，視需要其中將該三醇轉化為NAG-25。
一種用於製備TGZ之方法，該方法包括使受保護的三醇：與β-D-半乳糖胺五乙酸酯：反應，以產生TGZ，視需要其中將該TGZ轉化為NAG-25。
一種組成物，該組成物包含NAG-25、或其中間體（例如，三級丁基核心、三酸或其鹽、醇-Z、NAG-Z、NAG-H或其鹽、三醇、未受保護的三醇、TGZ、TG胺或其鹽、TG PEG、和/或前述中任一種的鹽）之一，具有降低的雜質水平，如本文所述之雜質和雜質百分比。