TW202406562A - 波森莓、蘋果及黑醋栗組成物及其製備方法與用途 - Google Patents

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Abstract

本說明書包括由波森莓及蘋果製備之組成物以及由波森莓、蘋果及黑醋栗製備之組成物。也包括製備此等組成物之方法及使用此等組成物之方法，尤其係用於治療或預防呼吸系統疾病之方法，該疾病包括：發炎，哮喘，慢性阻塞性肺病，過敏性氣道發炎，反應性氣道疾病，氣道纖維化及氣道重塑。

Description

波森莓、蘋果及黑醋栗組成物及其製備方法與用途
此申請案主張2017年8月8日提出之紐西蘭專利申請第734440號之權益，其全部內容藉由引用併入本文中。
本說明書係關於由波森莓及蘋果製成之組成物，及由波森莓、蘋果及黑醋栗製成之組成物。本發明也關於製備該組成物之方法及該組成物之用途，其包含治療或預防呼吸道病症之方法，該呼吸道病症諸如呼吸道炎症(包含哮喘、慢性阻塞性肺病、過敏性氣道發炎、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑)及導致此等病況之生理條件。
已知氣道重塑係因慢性發炎過程所導致之漸進及不可逆之氣道功能下降，該慢性發炎過程會使氣道壁結構改變(參考文獻67)。氣道重塑可能涉及氣道壁所有層體且可能發生在呼吸道中任何地方，由大至小之氣道。重塑會導致上皮組織有關鍵改變(參考文獻68)。受損之上皮細胞會釋出促纖維化細胞介素(profibrotic cytokines)(含EGF及TGF-β)，其導致纖維母細胞(fibroblast)增生、肌纖維母細胞(myofibroblast)活化，最終導致形成上皮細胞下纖維化(subepithelial fibrosis)(參考文獻69)。氣道平滑肌肥厚及增生導致氣道壁厚度增加。因而導致肺功能加速變差及不可逆或僅部分可逆之氣流阻塞。
引起氣道發炎之急性病症包含哮喘及COPD。據估計全世界有1.5億人受到哮喘影響，兒童患病率為5-15%患病率(61)。估計COPD患病率在15-20%間，且估計每年造成275萬人死亡(86)。在慢性哮喘之情況下證據表明有累積性組織重塑、纖維化及隨之而來之肺功能喪失(45, 59)。纖維化及重塑也與COPD有關。重塑會使以下症狀逐漸加重，諸如呼吸困難和支氣管擴張劑反應性之相應降低(67)。現有之哮喘治療旨在控管發炎及減輕哮喘發作之症狀與嚴重程度(30, 43)。COPD治療也旨在控制發炎及改善氣流。然而，沒有哮喘或COPD藥物可防止氣道重塑(70-74)，且目前沒有可用於防止異常(aberrant)重塑之治療方式。
哮喘致病機制及肺組織重塑與肺之促纖維化(profibrotic)、精氨酸酶陽性(arginase-positive)、另類活化巨噬細胞(alternatively activated macrophages)(AAMs)之增加有關(27, 29, 34)。然而，在博萊黴素(bleomycin)誘導之肺纖維化模型中，巨噬細胞群體之暫時耗盡(depletion)說明肺巨噬細胞也可能發展出有助於解決纖維化之纖維分解(fibrolytic)之功能(14)。
組織重塑之媒介物(mediators)(例如基質金屬蛋白酶(MMPs))在調節纖維化中有重要作用(5, 7, 8, 10, 38)。其中， MMP-9被廣泛報導在肺部發炎及纖維化之病況中會增加且與哮喘患者症狀改善有關(25, 32, 33)。MMP-9與其他MMPs一樣具有纖維分解活性，其導致能緩和不適當肺重塑之變性(denatured)膠原蛋白分解(5, 60)。因此，MMP-9可能代表一可能之治療標靶，以限制慢性哮喘中之肺損傷及其他肺部疾病。
大型流行病學研究發現，水果蔬菜攝取量之增加與哮喘症狀之減少有關(39, 46, 47)。此等總體研究(population studies)已確定富含多酚之食物(諸如蘋果、梨(13, 51, 62)、胡蘿蔔、蕃茄(46-48)及柑橘(11))與報導之哮喘症狀(尤其在喘息(wheeze)及咳嗽症狀(11, 13, 46, 47))之頻率及嚴重程度呈現逆相關。然而，富含多酚之水果對肺纖維化及組織重塑之影響尚不清楚。迄今為止，尚未建立用於防止氣道重塑之普遍成功方法。
鑑於總體中呼吸系統病症(包含與哮喘、COPD、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑有關之過敏性氣道發炎)之發生，需要能恢復及維持呼吸系統健康之新組成物，尤其為天然來源之組成物。
在一態樣中，本發明包括治療或預防呼吸道發炎之方法，其包括：給予個體一組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物(concentrate)或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，藉此治療或預防個體之呼吸道發炎。
還包括用於治療或預防個體呼吸道發炎之一組成物，例如一營養品組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物。
在另一態樣中，本發明包括治療或預防哮喘之方法，其包括：給予個體一組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，藉此治療或預防個體之哮喘。
還包括用於治療或預防個體哮喘之一組成物，例如一營養品組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物。
在又另一態樣中，本發明包括治療或預防慢性阻塞性肺病之方法，其包括：給予個體一組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，藉此治療或預防個體之慢性阻塞性肺病。
還包括用於治療或預防個體之慢性阻塞性肺病之一組成物，例如一營養品組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物。
在還另一態樣中，本發明包括治療或預防呼吸道中異常之膠原蛋白沉積或纖維化之方法，其包括：給予個體一組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，藉此治療或預防個體呼吸道中異常之膠原蛋白沉積或纖維化。
還包括用於治療或預防個體異常之膠原蛋白沉積或纖維化之一組成物，例如一營養品組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物。
在甚至另一態樣中，本發明包括治療或預防氣道重塑之方法，其包括：給予個體一組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，藉此治療或預防個體之氣道重塑。
還包括用於治療或預防個體氣道重塑之一組成物，例如一營養品組成物，其包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物。
在各種態樣中：
該組成物包括波森莓汁濃縮物、波森莓泥(puree)或波森莓粉(powder)。
該組成物包括蘋果汁濃縮物、蘋果泥或蘋果粉。
該組成物包括黑醋栗汁濃縮物、黑醋栗泥或黑醋栗粉。
該組成物包括一劑量單位，其包括約5至約500 mg花青苷 (anthocyanins)總量。
用於包括該波森莓及蘋果濃縮物之該營養品組成物，該組成物包括一劑量單位，其包括約5至約500 mg波森莓花青苷總量。
用於包括該波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物之該營養品組成物，該組成物包括一劑量單位，其包括約5至約500 mg波森莓及黑醋栗花青苷總量。
該組成物被調配用於腸內給藥。
該組成物被調配用於口服給藥。
該組成物被調配成糖漿或滴劑。
該組成物被調配成凝膠或果凍。
該組成物被調配成片劑或膠囊。
該組成物被調配用於以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg花青苷總量/個體體重之劑量給藥。
於包括該波森莓及蘋果濃縮物之該營養品組成物，該組成物被調配以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg波森莓花青苷總量/個體體重之劑量給藥。
於包括該波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物之該營養品組成物，該組成物被調配以約0.1 mg/kg至約10 mg/kg波森莓及黑醋栗花青苷總量/個體體重之劑量給藥。
該組成物被調配用於以每天約10 mg至約1000 mg花青苷總量之劑量給藥。
用於包括該波森莓及蘋果濃縮物之該營養品組成物，該組成物被調配用於以每天約10 mg至約1000 mg波森莓花青苷總量之劑量給藥。
用於包括該波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物之該營養品組成物，該組成物被調配用於以每天約10 mg至約1000 mg波森莓及黑醋栗花青苷總量之劑量給藥。
可擇地，該劑量為每天約10 mg至約200 mg花青苷總量，或每天約50 mg花青苷總量。
用於包括該波森莓及蘋果濃縮物之該營養品組成物，該劑量為每天約10 mg至約200 mg波森莓花青苷總量，或每天約50 mg波森莓花青苷總量。
用於包括該波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物之該營養品組成物，該劑量為每天約10 mg至約200 mg波森莓及黑醋栗花青苷總量，或每天約50 mg波森莓及黑醋栗花青苷總量。
該組成物包括被加入之多酚。
該組成物被調配用於與另外之呼吸輔助物(respiratory aid)共給藥。
該組成物被調配用於與一或多慢性呼吸系統病症之治療方式共給藥。
該發炎與慢性呼吸系統病症有關。
該發炎與一或多以下者有關：哮喘，慢性阻塞性肺病，過敏性氣道發炎，反應性氣道疾病，氣道纖維化，及氣道重塑。
該哮喘係特應性(atopic)或非特應性(non-atopic)。
該哮喘與氣道纖維化或氣道重塑有關。
該慢性阻塞性肺病與吸煙(smoking)或污染(pollution)有關。
該慢性阻塞性肺病與氣道纖維化或氣道重塑有關。
該異常膠原蛋白沉積或該纖維化與慢性呼吸系統病症有關。
該異常膠原蛋白沉積或該纖維化與哮喘或慢性阻塞性肺病有關。
該氣道重塑與慢性呼吸系統病症有關。
該氣道重塑與一或多以下者有關：哮喘及慢性阻塞性肺病。
在還另一態樣中，本發明包括一組成物用於製備一營養品組成物之用途，該組成物包括波森莓及蘋果濃縮物或波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物，該用途包括以下： (i) 治療或預防個體呼吸道發炎； (ii) 治療或預防個體哮喘； (iii) 治療或預防個體慢性阻塞性肺病； (iv) 治療或預防個體過敏性氣道發炎； (v) 治療或預防個體反應性氣道疾病； (vi) 治療或預防個體異常膠原蛋白沉積； (vii) 治療或預防個體呼吸道纖維化； (viii) 治療或預防個體氣道重塑。
如上所述，在各種態樣中該治療用途所採用之該組成物、劑量及配方且係與該各種病況相關。
前文之簡短摘要廣義地描述本發明某些具體實施例之特徵及技術優點。在本發明之詳細描述及隨後之實施例中將描述其他技術優點。
結合任一附圖及實施例考慮本發明之詳細描述，將能更好地理解本發明被認為特徵所在之新穎特徵。然而，本文提供之附圖及實施例旨在幫助說明本發明或幫助對本發明之理解而非旨在限制本發明範圍。
以下描述闡述眾多例示性配置、參數等。然而應認識到，如此描述非旨在限制本發明之範圍，而是供作例示性具體實施例之描述。
本說明書中所引用之全部參考文獻(包括專利及專利申請案)均藉由引用而併入本文中。不承認任何參考文獻構成先前技術。即使對任一參考文獻進行討論，也不承認該參考文獻構成紐西蘭或任何其他國家本領域中通常知識之一部分。 定義
在本文每一實例中，在本發明之描述、具體實施例及實施例中，該術語「包括(comprising)」、「包含(including)」等被擴張地理解而不受限制。因此，在整個說明書及申請專利範圍中，除非上下文另有明確要求，應以包容的方式解釋為非排他性意義之單詞「包括(comprise)」、「包括(comprising)」等，意即「包括但不限於」。
本文使用之術語「基本上由...組成(consisting essentially of)」可能指一組成物中有濃縮物存在。例如， 該濃縮物可能為該組成物至少80重量%，或至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%，或該組成物至少99.9重量%(% w/w)。於液體，該濃縮物可能為該組成物體積之至少80體積%，或至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%，或該組成物體積之至少99.9體積% (%v/v)。
本說明書文章中「一(a)」及「一(an)」係用於指示本文之語法標的之一或多於一(即至少一)者。舉例來說，「一元素」可被認為係指一元素或多於一元素。
在整個說明書中，該術語「約(about)」係用於指示一數值包含用於確定該數值之方法之誤差之標準偏差，例如，如本文詳述之化合物量(levels of compounds)或劑量(dosage levels)。尤其該術語「約(about)」包括規定之值或範圍內10%至15%偏差(正及負)，尤其規定之值或範圍內10%偏差(正及負)。
「氣道重塑」， 也稱為組織或肺重塑，係指氣道壁特定結構變化之發展。此可能包含如氣道(例如肺中)內壁纖維結締組織之重塑。氣道重塑可包含一或多上皮下細胞纖維化、肌纖維母細胞聚積、氣道平滑肌增生及肥大、黏液腺及杯狀細胞增生及上皮破裂(epithelial disruption)。症狀可能包含氣道擴張性降低 (即僵直氣道(stiffer airways))，彈性回彈變小，FEV1(用力呼氣量1)及FVC(用力肺活量)逐漸下降，肺功能加速下降，不可逆或僅部分可逆之氣流阻塞，呼吸困難，及呼吸治療(例如哮喘或COPD治療)反應性下降。
「哮喘」 係指肺氣道發炎病症，其特徵在於可變及再發之呼吸障礙，包含氣流阻塞及支氣管痙攣。氣流阻塞可被定義為減少FEV1及/或減少FEV1/ VC比。無論是否使用藥物，哮喘中之氣流阻塞係可逆。哮喘症狀可能包括喘息、咳嗽、胸悶或疼痛、及呼吸短促之一或多者。本文包括特應性(例如過敏原或抗原誘導)及非特應性形式哮喘，以及運動引起之哮喘、職業性哮喘、阿司匹靈引起之哮喘、及酒精引起之哮喘。
一「呼吸輔助物」係一組成物，其有助於呼吸道功能或呼吸系統其他方面，例如藥物、草藥組成物、精油及各種用於吸入之組成物。
「氣道」、「呼吸道」及「呼吸系統」係指任何涉及氣體交換(即呼吸)之器官、組織或細胞組分。此包含上呼吸道、氣管、支氣管、小支氣管、肺泡、肺、胸膜和胸膜腔，及呼吸神經及肌肉。可理解為「氣道」描述各種結構組分(例如細胞組分、組織及器官)以及氣體交換發生之空間。
本文使用之「蘋果」包括蘋果屬( Malus)之任一果實及其任一雜交種、變種及遺傳衍生種。尤其包含西洋蘋果( Malus pumila)及以下之特殊栽培種：‘Gala’ ‘Golden Supreme’ ‘McIntosh’ ‘Transparent’ ‘Primate’ ‘Sweet Bough’ ‘Duchess’ ‘Fuji’ ‘Jonagold’ ‘Golden Delicious’ ‘Red Delicious’ ‘Chenango’ ‘Gravenstein’ ‘McIntosh’ ‘Snow’ ‘Blenheim’ ‘Winesap’ ‘Granny Smith’ ‘King’ ‘Wagener’ ‘Swayzie’ ‘Greening’及‘Tolman Sweet’。也包含以下之栽培種：‘Alice’ ‘Ambrosia’ ‘Ananasrenette’ ‘Aroma’ ‘Discovery’ ‘Envy’ ‘Braeburn’ ‘Bramley’ ‘Arkansas Black’ ‘Dougherty’/‘Red Dougherty’ ‘Goldrenette’/‘Reinette’ ‘Jazz’ ‘Jonagold’ ‘James Grieve’ ‘Yellow Transparent’ ‘Pacific rose’ ‘Lobo’ ‘Sampion’/‘Shampion’ ‘Sonya’ ‘Splendour’/‘Splendor’ ‘Summerred’ ‘Pink Lady’ ‘Belle de Boskoop’ ‘Cox Pomona’ ‘Cox's Orange Pippin’ ‘Kidd's Orange Red’及‘SugarBee’。進一步包含以下之栽培種：‘Haralson’ ‘Wealthy’ ‘Honeygold’及‘Honeycrisp’。亦包含野蘋果(crabapples)、蘋果-野蘋果雜交種及料理用蘋果(cooking apples)。
本文使用之「黑醋栗」包括任何茶藨子科之黑/深色醋栗屬( Ribes)之果實，其包含但不限於 Ribes nigrum( 黑茶藨子 )、 Ribes nigrum L.、 Ribes americanum、 Ribes hudsonianum、 Ribes laxiflorum及 Ribes x nidigrolaria。此等任何雜交種、變種及遺傳衍生種也包含在內。包含其中適合之黑醋栗栽培種為：‘Andega’、‘Ben Ard’、‘Ben Alder’、‘Ben Dorain’、‘Ben Gairn’、‘Ben Hope’、 ‘Ben Lomand’、‘Ben More’、‘Ben Rua’、‘Ben Sarek’、‘Ben Tirran’、‘Blackadder’、‘Black Down’、‘Burga’、‘Orcs’、‘Magnus’、‘Murchison’、‘Sefton’、‘Wellington’、‘Invigo’、‘Titania’、‘Consort’、‘Crusader’、‘Geant de Boskoop’、‘Noir de Bourgogne’、‘Royal de Naples’、‘Boskoop Giant’、‘Tenah’、‘Tiben’、‘Tines’、‘Tisel’及‘Willoughby’。
本文使用之「波森莓」包括懸鉤子屬( Rubus)雜交漿果，其包含但不限於由被確定為以下之植物所獲得之漿果： Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry、 Rubus ursinus x Rubus idaeus 、 Rubus loganbaccus x baileyanusBritt及 Rubus idaeus x Rubus ulmifolius。一般而言，波森莓可能衍生自覆盆子(raspberry)及黑莓植物間或覆盆子、黑莓及羅甘莓植物間之雜交(cross)。包含各種波森莓雜交種、變種及其遺傳衍生種。本文所指之波森莓為漿果或更廣泛地為果實。
「慢性阻塞性肺病」(或COPD)係指與氣道逐漸阻塞及氣流不暢有關之肺部病症。氣流阻塞可能被定義為FEV1減少及/或FEV1/VC比減少。慢性阻塞性肺病中之氣流阻塞可能為不完全可逆。症狀包含但不限於呼吸短促、咳嗽及痰液(sputum)生成(即痰(phlegm))。COPD可能與吸煙、空氣污染、烹飪通風不良(poorly ventilated cooking)或取暖用火(heating fires)有關。遺傳組分也可能參與COPD。該病症在其他已知術語中也被稱為慢性阻塞性肺疾病(COLD)、慢性阻塞性氣道疾病(COAD)、慢性支氣管炎、肺氣腫。
「濃縮物」，例如與波森莓、蘋果或黑醋栗濃縮物或者其任意組成物相關者，係指其中液體組分(例如果汁)已被部分或實質上除去之一組成物。可能藉由蒸發或任何其他方式除去液體組分。一濃縮物可能製成例如泥、糊或粉，或可能由波森莓、蘋果或黑醋栗汁或其任意組成物製成，例如製成果汁濃縮物。
本文所述之呼吸道「病症」包含影響任何涉及氣體交換(即呼吸)器官、組織或細胞組分之疾病或其他病況。該病症可能為急性或慢性病況，諸如發炎及與發炎有關之病況。特別關注之病症包含哮喘、慢性阻塞性肺病、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑。其他病症係如本文詳述。
一植物之「遺傳衍生種」係指由該親代植株(parent stock)獲得之後代、突變(sports)或其他栽培種。此包含與該親代之遺傳雜交獲得之後代，例如F1子代或F2子代。該術語「遺傳衍生種」可能指該衍生出之植物、本身、或指其果實。
「纖維化」(在氣道中或肺纖維化)係指呼吸道中膠原蛋白及其他胞外基質組分之調節遭受破壞。病患纖維化之氣道中胞外基質沉積可能增加，諸如在網狀基底膜區域、固有層、及/或黏膜下層中。瘢痕形成及多餘纖維結締組織之聚積導致氣道壁增厚。症狀可能包含供氧量減少、呼吸短促、慢性咳嗽、疲勞及/或虛弱、胸部不適(包括胸痛)、食慾不振及體重減輕。包含氣道纖維化之原發形式以及與吸煙、空氣污染、結締組織疾病(如類風濕性關節炎、類肉瘤病等)、感染、藥物治療(如胺甲喋呤、博萊黴素等)及放射線治療有關之氣道纖維化。
「發炎」 係指一病況，其特徵在於以下一或多者：血管舒張(vasodilation)，發熱(heat)，發紅(redness)，不適(discomfort)，腫脹(swelling)，水腫(edema)，病變(lesions)，裂隙(fissures)，潰瘍(ulcerations)，白血球外滲(leukocyte extravasation)，及功能喪失(loss of function)。包含急性及慢性形式發炎，諸如急性氣道發炎，及其他發炎病症，例如自體免疫疾病或過敏性病況。特別包含哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道纖維化、反應性氣道疾病及氣道重塑。其他發炎病症在本文其他地方描述。
本文所述之術語「凍乾(lyophilising)」及「凍乾(freeze drying)」係作為同義詞使用。可理解該術語「凍乾(freeze drying)」/「凍乾(lyophilising)」未排除使用較高溫度(即高於結冰溫度)。例如，較高溫度可能用於在二級(secondary)乾燥階段期間進行凍乾(lyophilisation )/凍乾(freeze drying)過程除去殘餘濕氣。
一「營養品」係指用於個體給藥之一標準化組成物。其可能為一醫藥級組成物，且可能維持或改善個體健康，或可能治療或預防個體一或多病症。
「反應性氣道疾病」係指一發炎氣道病症，其特徵在於之氣道因外部刺激而可逆縮小。該術語可包括其他已知病症，諸如哮喘、慢性阻塞性肺病、上呼吸道感染等，或可指與此等病症相似但未被直接診斷出來之病況，諸如與似哮喘症候群或似哮喘症狀。有反應性氣道疾病之個體暴露在特定刺激(例如煙、蒸氣、煙霧或其他刺激物)下時可能顯示出一或多咳嗽、喘息或呼吸短促之症狀。
本文使用之「個體(subject)」可能為人類或非人類動物，特別為哺乳動物，包含牛(cattle)、羊(sheep)、山羊(goats)、豬(pigs)、馬(horses)及其他家畜(包含如狗、貓及其他馴養寵物)。在特別之態樣中，該個體為人類。
本文使用之「治療(treating)」意指減少、改善或療癒一病症，例如呼吸系統病症(諸如呼吸系統疾病或其他病況)。治療將導致該病症一或多症狀之減輕、改善或消除。
本文使用之「預防(Preventing)」意指停止或延遲病症發作，例如一呼吸系統病症，諸如呼吸系統疾病或其他病況。預防性措施將導致病症之一或多症狀之停止或延遲，或如果病症出現症狀會減輕。可理解該術語「治療或預防」未排除任何指定個體獲得病症之治療及預防二者(例如同時或不同時)之可能性。相同地 「哮喘或纖維化」之治療未排除二病症皆獲得治療(例如同時或不同時)之可能性。 包括波森莓之組成物及與此等組成物相關之生物活性
本案發明人發現攝取波森莓組成物在哮喘慢性模型中會減少過敏原引起之肺重塑。於此等實驗，在過敏氣道發炎慢性模型中對肺纖維化、肺巨噬細胞表型及MMP-9表現測試攝取波森莓之影響。結果證明口服波森莓處理維持肺巨噬細胞之發展，該肺巨噬細胞表現出具有改善纖維化及促進平衡肺修復能力之混合抗纖維化AAM(另類活化巨噬細胞)表型(74；藉引用使整體併入本文中)。此外，本案發明人發現波森莓及蘋果組成物之組合給藥及波森莓、蘋果及黑醋栗組成物之組合給藥可用於減少與氣道發炎相關之免疫細胞數。此可包括一或多嗜酸性球、嗜中性球、單核球及抗原呈現細胞。令人驚訝且有利地，該組合之波森莓及蘋果組成物在低劑量下有效。
已知波森莓富含維生素C及纖維並含有高量花青苷(120-160 mg/100 g)，此使波森莓呈深暗色。波森莓中之ORAC(氧自由基吸收能力，即抗氧化力)為42 µmoles/TE/g，其幾乎為眾所周知之抗氧化食品藍莓之雙倍。波森莓含有顯著量之鞣花酸(ellagic acid)(一種酚類化合物)。波森莓中之鞣花酸量為乾重之5.98 mg/g。波森莓之游離鞣花酸與鞣花單寧比例也很高。本案發明人已測試濃縮物以確認生物活性。
如實施例2中所述，此方法包含：波森莓 10(波森莓汁液)，6.7%，波森莓 1 (波森莓汁液)，0.67%，蘋果 10 (蘋果汁液)，18.7%，蘋果 1 (蘋果汁液)，波森莓及蘋果 10 (BerriQi™波森莓與蘋果；組合果汁液)，6.7%/18.7%，波森莓及蘋果 1 (BerriQi™波森莓與蘋果；組合果汁液)，0.67%/1.87%。其他口服組成物係如實施例3-5中所述，其包含100%、50%或25%濃度之BerriQi™波森莓與蘋果組成物，及100%濃度之BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗組成物。該100% BerriQi™波森莓與蘋果組成物包含27%波森莓汁濃縮物及73%蘋果汁濃縮物。該100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗組成物包含13.5%波森莓汁濃縮物、7%蘋果汁濃縮物及13.5%黑醋栗汁濃縮物。其他細節提供於以下實施例段落。
從本案發明人結果可證實波森莓及蘋果與波森莓、蘋果及黑醋栗可能被用於治療或預防呼吸道發炎、治療或預防哮喘、治療或預防慢性阻塞性肺病、治療或預防過敏性氣道發炎、治療或預防呼吸道纖維化或治療或預防氣道重塑之組成物中。尤其對於氣道重塑，本發明組成物可能被用於治療或預防一或多以下者：肺泡壁增厚，氣道中膠原纖維增多，膠原纖維擴散到氣道組織，氣域塌陷或閉合。此外，本發明之組成物可能被用於減少會導致氣道重塑之組織發炎及膠原蛋白沉積。
此外，由本文所示結果可理解波森莓及蘋果組成物及波森莓、蘋果及黑醋栗組成物可能被用於恢復、改善或維持呼吸系統之健康，例如於一或多以下活動中：減少膠原蛋白沉積，消除異常膠原蛋白沉積，減少氣道中細胞浸潤， 減少因細胞浸潤所致氣道損傷，減少肺液(lung fluid)中細胞(如發炎細胞)，減少黏液生長，減少黏液陽性細胞，減少羥脯胺酸量，增加基質金屬蛋白酶表現量(如蛋白質量)，增加MMP-9 表現量(如蛋白質量)，增加TGFβ 表現量(如蛋白質量)，減少TIMP-1/MMP-9比值(如蛋白質比值)，減少發炎細胞之活化作用及數目，增加另類活化巨噬細胞之數目或活性，增加精胺酸酶+巨噬細胞之數目或活性，增加CD68+/CD206+/精胺酸酶+巨噬細胞之之數目或活性，或減少iNOS表現量(如蛋白質量)。本文詳述此等組成物之進一步用途。 產生包括波森莓及蘋果之組成物，以及包括波森莓、蘋果及黑醋栗之組成物之方法
本發明通常關於一由波森莓及蘋果製成之組成物，以及一由波森莓、蘋果及黑醋栗製成之組成物。雖然本文描述波森莓及蘋果與波森莓、蘋果及黑醋栗之特定組合，應理解本發明之組成物可包含波森莓、蘋果及黑醋栗之任意組合。在一態樣中，該組成物係由 Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry製成。在另一態樣中，可使用一或多此波森莓植物之遺傳衍生種。例如，可能需要使用含波森莓植物親代植株之遺傳雜交之F1或F2後代。或者可使用從親代獲得之任何突變或其他栽培種。可能需要從紐西蘭或者從智利獲得波森莓。
該組成物較佳地被製備成波森莓濃縮物，例如波森莓泥、波森莓渣、波森莓糊、波森莓粉、波森莓汁濃縮物。該波森莓及蘋果組成物可能包括一蘋果濃縮物，例如蘋果泥、蘋果渣、蘋果糊、蘋果粉或蘋果汁濃縮物。若使用一蘋果汁濃縮物，其可能源自於混濁之蘋果汁或清蘋果汁。該波森莓、蘋果及黑醋栗組成物可能包括一黑醋栗濃縮物，例如黑醋栗泥、黑醋栗渣、黑醋栗糊、黑醋栗粉、黑醋栗汁濃縮物。可了解尤其可能使用之波森莓、蘋果或黑醋栗渣包含榨汁後果實之固體殘餘物。該渣可能包含一或多果實之果皮、果肉、種子及蒂。此外，可能包含此處所述組成物中之一或多波森莓汁、蘋果汁及黑醋栗汁。
據此，該組成物可能製成液狀或粉狀，例如凍乾粉末或任何其他適合之劑型。該組成物可能被配製成補劑(tonic)、萃取物(extract)、酏劑(elixir)、舔劑(linctus)、濃縮物(concentrate)、糖漿(syrup)、溶液劑(solution)、懸液劑(suspension)、乳劑(emulsion)、飲劑(draught)、泥(puree)、糊(paste)或滴劑(drops)。在其他態樣中，該組成物可能被配製成膠劑(gel)或果凍劑(jelly)，或膠囊(capsule)，例如含有液體或半液體成分。該組成物可能以小袋(sachet)形式提供，例如粉末袋、或凝膠或果凍袋。也包括含細條或含固體之膠囊用以與食品或飲品混合之配方。也可能為下文所述之其他配方。
在某些態樣中，需要可能將波森莓及蘋果組成物(例如波森莓及蘋果汁濃縮物或泥)或該波森莓、蘋果及黑醋栗組成物(例如波森莓、蘋果及黑醋栗汁濃縮物或泥)配製成粉末。作為具體範例，蘋果粉可能包括蘋果渣粉或蘋果果膠粉。如本文所述，商售之波森莓、蘋果及黑醋栗粉已知且可取得。該粉末可能被配製成片劑(tablets)(含快速溶解片劑)或膠囊(capsules)(含延長釋放膠囊)。該片劑可能為帶刻痕片劑(scored tablets)、咀嚼片劑(chewable tablets)、發泡片劑(effervescent tablets)、口腔崩解片劑(orally disintegrating tablets)或用於形成懸浮液之片劑。該膠囊可能為凝膠膠囊(gel capsules)，例如且可能包含粉狀成分。此包含由單片凝膠封裝及二片凝膠封裝製成之凝膠膠囊。還包括非明膠膠囊以及膠囊型錠劑(caplets)。該粉末可能以自由流動形式或作為固體餅(cake)提供。該組成物可能用以下形式提供：用於形成懸浮液之粉末，用於形成溶液之粉末，散裝口服顆粒劑(granules)，或散裝口服粉末。
本發明之組成物可能由一或多商購來之波森莓、蘋果或黑醋栗汁濃縮物或泥製成。例如，商購來紐西蘭波森莓產品包含Boysenberries New Zealand Ltd, Nelson及Tasman Bay Berries, Nelson。商購取得之產品包含單獨快速冷凍之漿果、波森莓泥、塊狀冷凍漿果，波森莓汁濃縮物及波森莓粉。商購來源之紐西蘭蘋果及黑醋栗產品包含來自以下者：EnzaFoods New Zealand Ltd, Hastings, New Zealand，以及Juice Products New Zealand, Timaru, New Zealand, NZ Blackcurrant Co-operative Ltd, Nelson, New Zealand, Fruit Solutions, FSL Foods, Nelson, New Zealand及Reso, Auckland, New Zealand，且包括混濁蘋果汁濃縮物、清蘋果汁濃縮物、蘋果渣、蘋果泥、黑醋栗汁濃縮物及黑醋栗泥。此外，蘋果及黑醋栗粉可能由TreeTop®、FutureCeuticals、Nutradry、Sujon、Viberi™、Zeaberry™、Waitaki Biosciences及其他供應商商購獲得。如本文所述，蘋果及黑醋栗汁濃縮物之特定供應商包含Infruit Ltd, Auckland, New Zealand及RD2 International Ltd, Auckland, New Zealand，而製造商包含Profruit (2006) Ltd, Hastings, 4175, New Zealand。
該果汁濃縮物或泥(例如該組合波森莓及蘋果汁濃縮物與組合波森莓、蘋果及黑醋栗汁濃縮物)之pH值可能範圍係自3.2至3.8；或 3.0至4.0；或 3.1至3.9；或可能約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、或約4.0。於該用以製造該組合濃縮物之蘋果汁濃縮物，其pH值可能範圍係自2.8至4.4；2.9至4.3；3.0至4.2；或 3.1至4.0；或可能約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、或約4.5。於該用以製造該組合濃縮物之黑醋栗汁濃縮物，其pH值可能範圍係自1.0至5.0；2.0至4.0；1.5至3.5；2.1至3.4；或 2.3至3.3；或可能為約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、或約4.0。
該波森莓汁濃縮物之酸度(% w/w無水檸檬酸)可能為約1至約20、約1.5至約15、約2至約12、約5至約10、約6至約9、約10、約9、約8.5、約8.3、約8.2、約8.17、約8.1、約8、約7、約6、或約5。該蘋果汁濃縮物之酸度(% w/w蘋果酸)可能為約0.5至約4.5、約0.8至約4.2、約1.0至約4.0、約1.2至約3.5、或約0.5、約0.7、約0.9、約1、約1.2、約1.5、約1.7、約1.9、約2、約2.2、約2.5、約2.7、約2.9、約3、約3.2、約3.5、約3.7、約3.9、約4、約4.2、或約4.5。該黑醋栗汁濃縮物之酸度(檸檬酸g/100 g)可能為約5至約20、約8至約18、約7至約17、或約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、或約25。
在某些情況下，可能需要調整泥或最終組成物之pH值至近似生理之程度。特別地，獲得pH值之範圍自6.0至8.0；或 6.5至7.5；或 6.8至7.2；或 pH值約6.5、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、或約7.5可能有益。
在某些態樣中，本發明之組成物可能藉由「軟性製漿(soft pulping)」技術製得，其係於紐西蘭專利號235972(藉引用併入本文)中提到，其可被用以產生「軟」波森莓、蘋果或黑醋栗泥。在製備泥時將種子除去可能有益。製備約1 mm或更小篩孔尺寸之泥也可能有益。
果汁濃縮物可被製備成天然糖溶液，其係由果皮及果肉中提取或榨取並過濾，且可能包含種子。該溶液可能在真空下進行去除果膠、過濾及蒸發至特定之Brix程度。例如，該果汁濃縮物可能被濃縮至該原始Brix值之約二至約七倍。特別地，該濃縮物可被濃縮該原始Brix值之約二倍、約三倍、約四倍、約五倍、約六倍、或約七倍。
在某些態樣中，該波森莓汁濃縮物可能為由完好(sound)成熟之分級(graded)波森莓(e.g., Rubus ursinus var loganobaccus cv Boysenberry)製成。在特定態樣中，該波森莓汁濃縮物之最終糖度範圍可能自55°至75° Brix；或 59°至69° Brix；或 61°至66° Brix；或約60°、約61°、約62°、約63°、約64°、約65°、約65.4°、約65.5°、約65.6°、約66°、約67°、約68°、約69°、約70°、或約71° Brix。在各種態樣中，該組合波森莓及蘋果汁濃縮物及該組合波森莓、蘋果及黑醋栗汁濃縮物之Brix值可能如直接在上文所述。相似地，用以製造該組合濃縮物之蘋果汁濃縮物及黑醋栗汁濃縮物若未校正酸度，可能具有如上文所述之Brix值。
該果汁濃縮物可能由碾磨(milling)、壓泥(mashing)及壓榨(pressing)產生一倍濃度(single strength)果汁，其係經離心、殺菌、去除果膠、過濾而後在標準製程中蒸發濃縮同時回收香氣成分(aroma)。然後使該標準濃縮物經衛生填裝頭包裝成所需包裝類型而無需進一步熱處理。該濃縮物可被檢驗是否符合純果汁定義，例如FSANZ-Food Standards Australia New Zealand所定義。
預期波森莓汁濃縮物將富含著色劑。例如，該波森莓汁濃縮物之色比(colour ratio)(吸光度520 nm/ 吸光度430 nm)約1.5至約3.0、約1.8至約2.8、約1.9至約2.2、或約1.9、約2、約2.01、約2.05、約2.1、或約2.2。此外，該果汁濃縮物之色度(colour intensity)(使用色差儀(Chroma meter))約15至約30、約20至約28、約21至約25、約22至約24、或約22、約23、約23.2、約23.5、約23.7、約24、或約25。該果汁濃縮物也被預期外觀相對清澈，例如，清澈程度約0.01至約0.1、約0.02至約0.08、約0.03至約0.06、約0.04至約0.05、或約0.03、約0.04、約0.045、約0.047、約0.048、約0.05、或約0.06。
用以製造該組合濃縮物之黑醋栗濃縮物也將具有深色。例如，該黑醋栗濃縮物可能之色比(pH 3之吸光度520 nm/ 吸光度430 nm)為：約1.5至約4.0、約1.8至約3.8、或約2.0至約3.0；或具有以下色比：約1.8、或約1.9、或約2.0、或約2.1、或約2.2、或約2.3、或約2.4、或約2.5、或約2.6、或約2.7、或約2.9、或約3.0、或約3.2、或約3.3、或約3.4、或約3.5。
相反地，用以製造該組合濃縮物之蘋果汁濃縮物可能相對較無顏色，例如，小於0.35 abs(於420 nm 12 Bx)，或至少小於0.45 abs(於420 nm 12 Bx)。於蘋果汁濃縮物，此也可以表示為約0.15至約0.45 abs、約0.10至約50 abs或約0.19至約45之一般範圍(於440 nm及11.5°Brix)。該蘋果汁濃縮物可能用作清澈濃縮物，如沒有霧狀物(haze)。各種果汁之比重可能為約1.2至約1.4、約1.29至約1.39、或約1.32至約1.36、或約1.2、約1.3、約1.31、約1.32、約1.33、約1.35、約1.36、約1.37、約1.38、約1.39、或約1.4 (於20°C)。在本領域中已知各種測量方法(例如色比、清澈度等)，且可能在例如AIJN code of practice in the International Fruit Juice Federation Handbook of Analysis, 1996, International Fruchtsaft-Union, Zug, Switzerland中找到。
在初始準備階段，該波森莓、蘋果或黑醋栗可能經歷預處理過程，其可能包括漿果/果實之熟化、檢查、分級及/或分選之眾所周知步驟。於熟化方面，當生產本發明之組成物較佳使用熟成(ripe)或成熟(mature)之波森莓、蘋果或黑醋栗；然而，較佳為避免腐壞或蛀蝕之材料。可使用本領域廣泛已知且使用之方法評估成熟度。可在採摘或加工波森莓、蘋果或黑醋栗前測量成熟度。如本文所述，尤其可使用Brix系統測量成熟度。過熟或正在發酵之波森莓、蘋果或黑醋栗可能不會產生理想之組成物。可於使用前以人工方式使Brix程度較理想低之波森莓、蘋果或黑醋栗成熟。
作為加工之一部分，該波森莓、蘋果或黑醋栗可能經滅菌。該果實可能通過具有一或多個滾刷之組件以去除任何黏附之異物。然後可採用習知之洗滌技術。例如可能使用一系列噴嘴清洗該波森莓、蘋果或黑醋栗。根據當地法規及要求，可採用有助於清潔或減少波森莓、蘋果或黑醋栗細菌數量之洗滌添加劑。例如，可藉由氯洗及/或臭氧浸漬水洗而後以淡水沖洗來洗滌該波森莓、蘋果或黑醋栗。
然後將該經滅菌之波森莓、蘋果或黑醋栗輸送到料斗中。此可逐漸變細形成漏斗以將漿果或果實導引至壓榨總成(pressing assembly)。該壓榨總成可能適於進行製漿(pulping)或粉碎(comminution)過程。與習知果實漿狀物技術相比，如此製程相對輕柔(mild)且溫和(gentle)(「軟性製漿」）。使用軟性製漿，果實細胞或組分不會有明顯之崩解(disintegration)或裂解(lysis)。較佳地，藉此製程僅小部分(通常小於5-10％)之種子破碎。
在一具體實施例中，該壓榨總成藉由在雙收斂帶壓力機(twin converging belt press)間之壓搾進行該波森莓、蘋果或黑醋栗之軟性製漿。該壓榨帶(press belt)可能為圍繞一系列帶輪(pulleys)之多環路(multiple loops)。該壓榨帶之分隔距離在波森莓、蘋果或黑醋栗之行進方向上可能會減小。於此方式，可對波森莓、蘋果或黑醋栗施加增強之力量，當其沿著該壓榨總成之長度行進。如此可產生漿狀物而不會對其種子造成顯著之損傷。如此反又能防止種子污染該漿狀物。
由該壓榨總成產生之漿狀物可用於篩選(screening)程序，以便將種子與漿狀物分離。尤其使用一軟機械篩選技術使該漿狀物與種子分離。例如使用打漿機(pulp finisher)。此包含一旋轉彈性葉輪，其在具有預定大小孔洞之錐形篩網內旋轉。在特殊態樣中，選定之孔洞大小能讓漿狀物及果汁通過該篩網同時將大部分(若非全部)之種子留在該篩網界定出之內腔中。
在某些態樣中，較佳為使用波森莓、蘋果或黑醋栗之糊狀物而非泥狀物。糊狀物可被製成濃縮物。例如，該果實可能被加熱數小時、過濾及減少而成為黏稠之濃縮形式。該果實可能在去除果皮後或在製漿或泥之程序後加熱。該果實可被逐漸加熱然後保持在適宜溫度邊加熱邊攪拌。在增稠時，該糊狀物可被鋪在平板上或轉移至封裝物，例如袋、管、罐、瓶或其他容器。該糊狀物可能被無菌轉移，如此使其適於供人類攝取。可能需要製備該糊狀形式成熟之漿果/果實。該糊狀物可能由被漿化之果實製成。該糊狀物可能為一平滑之製劑。
該該漿狀物(例如糊或泥之形式)或果汁濃縮物可能經以冷凍步驟加工。然後可為乾燥步驟或與乾燥步驟一起進行。在一替代性具體實施例中，使該漿狀物乾燥並加工成粉末，而未***一冷凍步驟。例如，可使用涉及滾筒乾燥之方法。在滾筒乾燥程序中，泥狀物或糊狀物可能在相對低溫下在生產滾筒乾燥產品之轉動型高容量滾筒中乾燥。在某些態樣中，可使用添加劑以加速或以其他方式幫助乾燥過程。例如，可使用豌豆澱粉或其他乾燥助劑。然後該乾燥產物可被研磨成薄片或粉末形式。有利地，滾筒乾燥技術可用於產生會保留其重要組分(例如酚類化合物)之乾燥組成物且可使用液體輕易還原。例如，可將滾筒乾燥產品製成能溶於冷水。於其他替代方式，可使用帶式乾燥或對流乾燥。本領域中已廣泛地知悉並使用此乾燥方法。
若使用冷凍，較佳在該該漿狀物或果汁濃縮物生產後儘快冷凍以保持新鮮度。然而，如果需要冷凍可能會進行24或48小時。冷凍方法眾所周知，不需在本文詳述。急速冷凍法(Blast freezing)特佳用於本發明。該漿狀物或果汁濃縮物可能被凍成標準尺寸柵欄(pales)，其用於收集加工後之新鮮漿狀物/濃縮物。該漿狀物或果汁濃縮物可被冷凍保存(例如於-18°C)直到需要使用。
該冷凍漿狀物或果汁濃縮物可能被冷凍乾燥，即凍乾。冷凍乾燥技術廣為人知且常用。該冷凍乾燥循環可能約48小時；或範圍自40至56小時；或 12至36小時；或 36至60小時；或約40小時、約42小時、約44小時、約46小時、約48小時、約50小時、約52小時或約54小時。較長之冷凍乾燥循環(例如至少48小時 (「溫和冷凍乾燥」))可能被用於保留最大活性。在特定態樣中，可對其進行該程序以避免形成水，並在加工過程中使水分含量最小化。
可能需要使用一特定凍乾製程用於獲得該乾燥產品。例如，一凍乾法乾燥程序可作為一自動乾燥系統之一部分。該凍乾製程可能包含多個乾燥步驟，例如逐步增加及降低溫度。較佳地，初級乾燥設置(settings)係被用於昇華作用，之後為一或多個次級乾燥設置用於去除殘餘水分。在特定態樣中，該凍乾製程之最高溫度不超過70℃。在其他態樣中，該凍乾製程之溫度範圍在-10℃至70℃之間。在另一態樣中，使用長達48小時之凍乾法。
然後可將所得乾燥產物研磨成粉末，而後可適當地使用。研磨方法係眾所周知且在本領域中廣泛使用。可使用標準篩孔尺寸產生該粉末，例如可使用US 20、US 23、US 30、US 35、US 40、US 45、或US 50篩孔尺寸。用於該粉末之篩目孔徑之範圍可能自1.0至0.3 mm；或 0.84至0.4 mm；或 0.71至0.5 mm；或可能為約1.0 mm、約0.84 mm、約0.71 mm、約0.59 mm、約0.5 mm、約0.47 mm、約0.465 mm、約0.437 mm、約0.4 mm、約0.355 mm或約0.3 mm。
為了確保成分降解程度最小化，該製備程序係在低於40℃之溫度下進行。在各種具體實施例中，該程序係在以下範圍之溫度下進行：自-4°C至40°C；或自-1°C至10°C；或自1°C至6°C；或於約0°C、約1°C、約2°C、約3°C、約4°C、約5°C、或約6°C。在整個製備過程中保持此等溫度，其包含整個果實在被破開之前之儲存及在製漿/製泥程序期間。為了獲得最佳結果，至少由果實被破開之時保持此等溫度。使用如此之溫度以避免果實氧化及使用還原劑。在某些情況下可能獲得有機認證。
較佳之加工方法係能預防或至少最小化對果實中活性物質有任何損害或影響。為了確保最佳生產方法，可監測所得組成物之活性，例如花青苷量、多酚量及/或抗氧化活性。
多酚之檢驗法係為本領域所熟知，且已於下文中描述。特別地，可測量五倍子酸當量(GAE)以確定多酚總含量。例如，可使用Folin-Ciocalteu法(採用Folin-Ciocalteu試劑，也稱為Folin's酚試劑或Folin-Denis試劑)於酚類化合物之比色體外檢定(75)。預期波森莓汁濃縮物之多酚總含量將相對較高，例如約500至約5000 mg GAE/100 g FW、約1000至約3000 mg GAE/100 g FW、約1500至約2500 mg GAE/100 g FW、約3000、約2500、約2000、約1500、或約1000 mg GAE/100 g FW。應注意FW表示果汁濃縮物之鮮重。
可藉HPLC定量花青苷。此可用於分解各化合物並表示為花青苷3-葡萄糖苷當量(76)。例如，可於530 nm監測HPLC洗析組分之花青苷。使用花青苷-3-葡萄糖苷標準(例如Extrasynthese)及花青苷總含量製備基於此計算之一標準曲線。其他含酚物也可藉由HPLC分析，例如於250-700 nm。可運用之標準範圍包含五倍子酸、鞣花酸、槲皮素、芸香苷及兒茶素(catchin)。使該等標準之吸光譜及滯留時間與HPLC徑跡(traces)中未知者相比較。此分析可包含鞣花酸之測量值。作為非限制性實施例，波森莓汁濃縮物之花青苷總含量(以花青苷3-葡萄糖苷當量表示)可能為約1000至約10,000 mg/100 g FW、約2000至約8000 mg/100 g FW、約4000至約7000 mg/100 g FW、約5500至約6500 mg/100 g FW、或約8000、約7000、約6500、約6800、約6000、約5000、約4000、或約3000 mg/100 g FW。
於組合波森莓及蘋果組成物，預期該花青苷總量可能為此等組成物中存在之多酚總含量之約40-50%，或為此等組成物中存在之多酚總含量之至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、或至少55%。於該組合及波森莓、蘋果及黑醋栗組成物，預期該花青苷總量可能於此等組成物中存在之多酚總含量之約70-80%，或為此等組成物中存在之多酚總含量之至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、或至少80%。
此外，於該組合波森莓及蘋果組成物及該波森莓、蘋果及黑醋栗組成物，預期該多酚(含花青苷)總量可能為此等組成物中存在之多酚總含量之約80-90%，或為此等組成物中存在之多酚總含量之至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%。
除此之外，於該組合波森莓及蘋果組成物及該波森莓、蘋果及黑醋栗組成物，預期該可水解單寧將佔該組成物中多酚總量之約25%至約35%。於該波森莓、蘋果及黑醋栗組成物，預期該可水解單寧將佔該組成物中多酚總量之約8%至約12%。測量可水解單寧之一例示方法為LC-MS(液相層析-質譜)分析，如下文所述。
抗氧化能力可藉ORAC及/或DPPH檢驗法測定。該氧自由基吸光能力檢驗法係最廣泛使用測定之一用以測試食品之抗氧化潛能。該ORAC檢驗法測定過氧自由基誘導氧化(peroxyl radical-induced oxidation)之抗氧化抑制性(77, 78, 84)。Trolox(維生素E之水溶性類似物)可能被用作控制標準。在一額外檢驗中， DPPH(2,2-二苯基-1-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl))可能被用於顯示作為自由基清除劑之多酚之動力學行為。抗氧化活性愈高，DPPH•濃度降低愈多。當用抗氧化劑淬滅時，DPPH基團之甲醇(methanolic)溶液從紫色變成無色。於515nm根據標準曲線測量DPPH•減少，例如Trolox及DPPH•(79, 80)。
於特殊範例，該波森莓汁濃縮物之抗氧化劑能力可能為約10,000至約100,000 ORAC值 (µmol Trolox/100 g FW)、約20,000至約80,000 ORAC值、約30,000至約70,000 ORAC值、約40,000至約50,000 ORAC值、或約80,000、約70,000、約60,000、約50,000、約40,000、約30,000、或約20,000 ORAC值。於其他特殊範例，該波森莓汁濃縮物之抗氧化能力可能經以DPPH檢定測定(於100% MeOH)約1000至約6000 µmol TEAC/100 g FW、約2000至約5000 µmol TEAC/100 g FW、約2500至約2900 µmol TEAC/100 g FW，或約5000、約4000、約3000、約2800、約2500、約2000或約1000 µmol TEAC/100 g FW。
可選地或另外地，該組成物可被測試其他組分，例如糖、葉酸鹽及維生素C 。相應檢驗法係眾所周知。例如，可使用標準方法測定該波森莓汁濃縮物之葉酸鹽量(參見例如83)，及可能為約20 µg/100 g FW、約30 µg/100 g FW、約40 µg/100 g FW、或約50 µg/100 g FW、約60 µg/100 g FW、約70 µg/100 g FW、或約80 µg/100 g FW、或約10至約100 µg/100 g FW、約20至約80 µg/100 g FW、約30至約70 µg/100 g FW、約20至約50 µg/100 g FW、或約50至約70 µg/100 g FW。
可知其他已知檢驗法也可用於分析所揭露之組成物(參見例如85)，且本發明不限於生物活性化合物(含含酚物、花青苷、抗氧化劑、維生素、碳水化合物等)之一特定檢驗法。亦可知本文鑑定之果汁濃縮物量可很容易地推論至粉末形式以及泥及糊狀物形式。
在某些情況下，可能使用植物遺傳衍生物以獲得本發明之組成物。預期由該衍生物獲得之組成物將與由原始親株獲得之組成物具有相同之一或多特徵。例示性特徵包括：多酚量及多酚分佈(profiles)(包含花青苷(anthocyanidin)含量及分佈)，維生素量，及OVA誘導發炎減少，如上所述並在本文詳細揭露。關於果實本身，預期由遺傳衍生物獲得之果實將與親代果實具有相似之組成構造(makeup)。 包括波森莓及蘋果之組成物及包括波森莓、蘋果及黑醋栗之組成物
本案發明人發現波森莓組成物含有對維持呼吸系統健康及治療及預防呼吸系統問題有用之有益成分。本案發明人表明波森莓濃縮物對減少氣道發炎及纖維化特別有效。如本文所述，波森莓及蘋果濃縮物及組合波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物係同樣有效。因此，本文所揭露之該波森莓組成物(含組合波森莓及蘋果組成物及組合波森莓、蘋果及黑醋栗組成物)可被用於維持或改善整體呼吸系統健康及/或用於治療或預防各種病症或其他呼吸道之病況，其包含發炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道纖維化及氣道重塑。以此方式，該揭露之組成物被理解為抗發炎組成物、抗-哮喘組成物以及對慢性阻塞性肺病、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑有效之組成物。
所本文所述，波森莓組成物可能包括由波森莓製成之果汁濃縮物或粉濃縮物。該組成物可能進一步包括由蘋果製成之果汁濃縮物或粉末濃縮物，或進一步包括由黑醋栗製成之果汁濃縮物或粉末濃縮物。作為各種替代物，該組成物可能由以下所組成或可能基本上由以下組成：由波森莓製成之果汁濃縮物或粉末濃縮物及由蘋果製成之果汁濃縮物或粉末濃縮物，或由波森莓製成果汁濃縮物或粉末濃縮物及由黑醋栗製成之果汁濃縮物或粉末濃縮物。
一般而言，該波森莓及蘋果濃縮物了可能包含各種波森莓濃縮物與蘋果濃縮物比例。作為例證，該波森莓濃縮物與蘋果濃縮物之百分比(具100% v/v之組合百分比)可能包含約17%波森莓濃縮物與約83%蘋果濃縮物、約18%波森莓濃縮物與約82%蘋果濃縮物、約19%波森莓濃縮物與約81%蘋果濃縮物、約20%波森莓濃縮物與約80%蘋果濃縮物、約21%波森莓濃縮物與約79%蘋果濃縮物、約22%波森莓濃縮物與約78%蘋果濃縮物、約23%波森莓濃縮物與約77%蘋果濃縮物、約24%波森莓濃縮物與約76%蘋果濃縮物、約25%波森莓濃縮物與約75%蘋果濃縮物、約26%波森莓濃縮物與約74%蘋果濃縮物、約27%波森莓濃縮物與約73%蘋果濃縮物、約28%波森莓濃縮物與約72%蘋果濃縮物、約29%波森莓濃縮物與約71%蘋果濃縮物、約30%波森莓濃縮物與約70%蘋果濃縮物、約31%波森莓濃縮物與約69%蘋果濃縮物、約32%波森莓濃縮物與約68%蘋果濃縮物、約33%波森莓濃縮物與約67%蘋果濃縮物、或約34%波森莓濃縮物與約66%蘋果濃縮物，此等百分比以v/v值表示。
於相同方式，波森莓及黑醋栗濃縮物與蘋果濃縮物之百分比(具100％ v/v之組合百分比)可能包括約17%波森莓及黑醋栗濃縮物與約83%蘋果濃縮物、約18%波森莓及黑醋栗濃縮物與約82%蘋果濃縮物、約19%波森莓及黑醋栗濃縮物與約81%蘋果濃縮物、約20%波森莓及黑醋栗濃縮物與約80%蘋果濃縮物、約21%波森莓及黑醋栗濃縮物與約79%蘋果濃縮物、約22%波森莓及黑醋栗濃縮物與約78%蘋果濃縮物、約23%波森莓及黑醋栗濃縮物與約77%蘋果濃縮物、約24%波森莓及黑醋栗濃縮物與約76%蘋果濃縮物、約25%波森莓及黑醋栗濃縮物與約75%蘋果濃縮物、約26%波森莓及黑醋栗濃縮物與約74%蘋果濃縮物、約27%波森莓及黑醋栗濃縮物與約73%蘋果濃縮物、約28%波森莓及黑醋栗濃縮物與約72%蘋果濃縮物、約29%波森莓及黑醋栗濃縮物與約71%蘋果濃縮物、約30%波森莓及黑醋栗濃縮物與約70%蘋果濃縮物、約31%波森莓及黑醋栗濃縮物與約69%蘋果濃縮物、約32%波森莓及黑醋栗濃縮物與約68%蘋果濃縮物、約33%波森莓及黑醋栗濃縮物與約67%蘋果濃縮物、或約34%波森莓及黑醋栗濃縮物與約66%蘋果濃縮物，此等百分比以v/v值表示。
作為非限制性實施例，在組合波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物中之黑醋栗濃縮物可能為約5%至約20%、或約8%至約18%、或約10%至約15%、或約5%、約8%、約10%、約13.5%、約15%、約18%、或約20%之百分比，此等百分比以v/v值表示。在特別態樣中，在組合波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物中之該黑醋栗濃縮物之百分比與波森莓濃縮物之百分比相同或實質上相同。
該波森莓及蘋果濃縮物及該波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物(具100％ w/v之組合百分比)可能包含小於1%之防腐劑，例如，約0.005%至約0.5%、或約0.05%至約0.15%、或可能包含 約0.04%、約0.06%、約0.08%、約0.1%、約0.12%、約0.14%、約0.16%、約0.18%、或約0.2%之防腐劑，此等百分比係以100% w/v表示。實用之防腐劑包括但不限於：山梨酸(sorbic acid)，山梨酸鈉(sodium sorbate)，山梨酸鉀(potassium sorbate)，檸檬酸(citric acid)，抗壞血酸(ascorbic acid)，蘋果酸(malic acid)，酒石酸(tartaric acid)，丙酸(propionic acid)及苯甲酸(benzoic acid)，例如以其鈉鹽形式，例如苯甲酸鈉(sodium benzoate)。
該組成物可能被配製成口服液體，如果汁濃縮物、糖漿、懸浮液或補劑(tonic)或腸內給藥之溶液。可擇地，該組成物可能被配製成待封裝或壓成片或加入或併入其他產品之粉末。特別包括延遲釋放配方、延長釋放配方及快速分解配方。特別包括膠囊(如凝膠膠囊)及小袋(sachets)及咀嚼片(chewable tablets)。另外還包括組合配方，其包含與其他有益物質混合之本發明粉末，例如一或多呼吸輔助物。在多種態樣中，該組成物可能被製成一營養品組成物、一醫藥組成物、一功能性食品或飲料、一天然成分(如天然添加劑)或一天然補充物(如膳食補充劑)。
預期該波森莓組成物(含該組合波森莓及蘋果組成物及該組合波森莓、蘋果及黑醋栗組成物)將包含高量花青苷。例如，該組成物可能包含約2至約50,000 mg/ml花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量、或約20至約40,000 mg/ml、約25至約35,000 mg/ml、約30至約30,000 mg/ml、約40至約25,000 mg/ml、約50至約20,000 mg/ml、約60至約15,000 mg/ml、約70至約10,000 mg/ml、約80至約8000 mg/ml、約90至約6000 mg/ml、約100至約5000 mg/ml、約10至約1000 mg/ml、約20至約800 mg/ml、約30至約600 mg/ml、約50至約200 mg/ml、或約50,000、約40,000、約35,000、約25,000、約20,000、約15,000、約12,000、約10,000、約8000、約7500、約5000、約2500、約2000、約1000、約1500、約1200、約1000、約750、約500、約250 mg/ml、約200 mg/ml、約150 mg/ml、約100 mg/ml、約75 mg/ml、約50 mg/ml、約25 mg/ml、約20 mg/ml、或約10 mg/ml花青苷總量、或波森莓及黑醋栗花青苷總量或其乾重當量。
在具體態樣中，該波森莓組成物(含該組合波森莓及蘋果組成物及該組合波森莓、蘋果及黑醋栗組成物)可能用以下劑量單位給藥：約1 mg至約20,000 mg花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量，或約1 mg至約2000 mg花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量，或約5 mg至約5000 mg、約10 mg至約3000 mg、約10至約1000、約15 mg至約1500 mg、約20 mg至約1000 mg、約25 mg至約850 mg、約30 mg至約600 mg、約35 mg至約550 mg、約50至約500 mg、約5至約500、約10 mg至約200 mg、約1至約400 mg、約1至約200 mg、約40 mg至約400 mg、約40至約200 mg、約20 mg至約80 mg、約30 mg至約60 mg、約45 mg至約55 mg、或約20,000 mg、約15,000 mg、約12,000 mg、約10,000 mg、約7500 mg、約5000 mg、約4000 mg、約3000 mg、約2000 mg、約1500 mg、約1200 mg、約1000 mg、或約500 mg、約400 mg、約300 mg、約200 mg、約100 mg、約90 mg、約95 mg、約80 mg、約75 mg、約70 mg、約65 mg、約60 mg、約55 mg、約50 mg、約45 mg、約40 mg、約35 mg、約30 mg、約25 mg、約20 mg、或約10 mg花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量。在特別態樣中，該劑量單位可能為約50 mg至約500 mg花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量。
根據需要如上所述之劑量單位之給藥可每天一次、每天二次或每天三次或如更多次。例示性且非限制性之日劑量可能為約10mg至約1000mg花青苷總量或波森莓及黑醋栗花青苷總量。該劑量可根據需要調整用於兒科、老年人、超重者、體重不足者或其他患者。
若一波森莓果汁、蘋果汁或黑醋栗汁濃縮物係依據標準商業製造方法(大或小規模)製成或由商業來源獲得，該果汁濃縮物(含該組合波森莓及蘋果汁濃縮物及該組合波森莓、蘋果及黑醋栗汁濃縮物)可能依以下劑量單位給藥： 約0.5至約50 ml、約0.5至約20 ml、約0.5至約10 ml、約1至約9 ml、約2至約8 ml、約3至約7 ml、約4至約6 ml、或約50、約40、約30、約20、約15、約12.5、約10、約9、約8、約7、約6、約5、約4、約3、約2、約1、或約0.5 ml果汁濃縮物。在特別態樣中，該劑量單位可能為約5 ml果汁濃縮物。根據所需各種劑量單位之給藥可能為每天一次、每天兩次或每天三次或更多次。劑量可根據已知方法依病患大小及年齡調整。
各波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物將會是富含酚物、花青苷及其他有益組分之來源。例如，黑醋栗汁濃縮物預計將包含花青苷總量(g/100 g)至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、或至少1.5。於例示花青苷定量法，參見(98)及(99)。該黑醋栗汁濃縮物預計還將含有維生素C(抗壞血酸；mg/100 g)量至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少780、至少800、至少850、或至少900。該黑醋栗汁濃縮物將進一步預期包含含酚物總質量(g/100 g)至少3.0、至少3.2、至少3.4、至少3.6、至少3.8、至少4.0、至少4.2、至少4.4、至少4.6、至少4.8、或至少5.0。對於例示含酚物定量法，參見(100)。
在某些情況下，可能需要從由所用果實中分離或濃化多酚。尤其有利於使用波森莓、蘋果或黑醋栗獲得多酚濃化之組成物、含酚濃縮物或包括分離出之含酚物(如分離出之花青苷)之組成物。例如，本發明組成物之多酚係經濃化，以提高其相對於該果實之其他組分(如糖分)之濃度。在特別態樣中，本發明之組成物可能包含已從果實其他組分中分離出(例如由其純化出)之多酚。本文詳述用於分離或濃化之特定多酚。
濃化及萃取多酚之方法在本領域中廣為人知(例如81, 82)。所得之組成物可能包含相較於未經多酚濃化或分離步驟所製備之組成物之至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍多酚量。該多酚濃化組成物、含酚濃縮物及包括分離出之含酚物之組成物可能被乾燥成粉末並依本發明使用。
該劑型可能含有賦形劑，例如一或多抗黏著劑(anti-adherents)、黏合劑(binder)、塗料(coatings)、崩散劑(disintegrants)、香料(flavours)、色素(colours)、甜味劑(sweeteners)、潤滑劑(lubricants)、助滑劑(glidants)、流動劑(flow agents)、抗結塊劑(anti-caking agents)、吸附劑(sorbents)或防腐劑(preservatives)。實用之賦形劑包含但不限於：硬脂(stearin)，硬脂酸鎂(magnesium stearate)及硬脂酸(stearic acid)；醣類及其衍生物，例如雙醣(蔗糖、乳糖)；多醣及其衍生物，例如澱粉、纖維素或修飾纖維素(如微晶纖維素及纖維素醚(如羥丙基纖維素))；糖醇，如異麥芽酮糖醇(isomalt)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇(sorbitol)及麥芽糖醇(maltitol)；蛋白質，如明膠；合成聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、聚乙二醇；脂肪酸、蠟、蟲膠、塑料及植物纖維，例如玉米蛋白(Corn protein)、玉米醇溶蛋白(Zein)；羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose)；交聯聚合物，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮(crospovidone)，以及交聯鈉羧甲基纖維素(croscarmellose sodium)；羥甲基澱粉鈉(sodium starch glycolate)；二氧化矽(silicon dioxide)，氣相氧化矽(fumed silica)，滑石及碳酸鎂。
預期本文揭露之波森莓組成物將包括各種組分，例如碳水化合物及多酚，尤其花青素。令人感興趣之花青素包含矢車菊素(cyanidins)及芸香糖苷(rutinosides)，諸如矢車菊素-3-O-槐糖苷(cyanidin-3-O-sophoroside)、矢車菊素-3-O-糖苷(cyanidin-3-O-glucoside)、表兒茶素(epicatechin)、矢車菊素-3-O-萄糖基芸香糖苷(cyanidin-3-O-glucosylrutinoside)、矢車菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin-3-O-rutinoside)、矢車菊素-3-(6’-p-香豆基)糖苷-5-糖苷(cyanidin-3-(6’-p-coumaryl)glycoside-5-glycoside)、矢車菊素-3-O-糖苷(cyanidin-3-O-glycoside)、矢車菊素-3,5-二糖苷(cyanidin-3,5-diglycoside)及矢車菊素-3-O-2G-萄糖基芸香糖苷(cyanidin-3-O-2G-glucosylrutinoside)。同樣令人感興趣者為可水解單寧，例如鞣花單寧(ellagitannins)及鞣花酸。本發明之波森莓組成物還包括各種碳水化合物，尤其各種糖類(含中性糖類)。至於中性糖，該波森莓組成物可包括一或多果糖、葡萄糖及蔗糖。
相似地，本文所揭露之蘋果組成物將包括各種組分，其包含各種碳水化合物及多酚。令人感興趣者為含酚化合物，諸如類黃酮及肉桂酸及苯甲酸衍生物。包括兒茶素、前矢車菊素(procyanidins)及羥基肉桂酸酯(hydroxycinnamates)，更尤其包括3-羥基類黃酮(3-hydroxy flavonoids)，諸如花青苷、黃烷醇(flavanols)及黃烷-3-醇(flavan-3-ols)。關鍵之個別化合物包含表兒茶素、兒茶素、前矢車菊素二聚體B2、5-咖啡醯金雞納酸(5-caffeoylquinic acid)及槲皮素糖苷(quercetin glycosides)。特別包括二氫查耳酮(dihydrochalcone)(諸如根皮苷 )作為蘋果中之類黃酮前體。蘋果皮可被用以獲得高量多酚及類黃酮，諸如槲皮素糖苷及矢車菊素。蘋果肉及核可被用以獲得高量綠原酸。特殊栽培種可被用以最大化多酚量。尤其釀酒用蘋果(cider apples)可被用以最大化使其具有澀味(astringency)及苦味(bitterness)之前矢車菊素。本發明之蘋果組成物也可包含各種碳水化合物，尤其各種糖類(含中性糖類)。至於中性糖，該蘋果組成物可包括一或多果糖、葡萄糖及蔗糖。
如本文所揭露，本發明之黑醋栗組成物將包含各種組分，其包含糖類及多酚。特別被注意者為羥基肉桂酸酯(hydroxycinnamates)，諸如綠原(chlorogenic)及p-香豆醯基金雞納酸(p-coumaroylquinic acids)，以及花青苷及黃酮醇糖苷(flavonol glycosides)。特別令人感興趣者為多酚化合物，諸如飛燕草素3-O-葡萄糖苷(delphinidin 3-O-glucoside)；飛燕草素3-O-芸香糖苷(delphinidin 3-O-rutinoside)；飛燕草素飛燕草素-3-O-(6 -p-香豆醯基)葡萄糖苷(delphinidin-3-O-(6-p-coumaroyl)glucoside)；矢車菊素 3-O-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-glucoside)；矢車菊素 3-O-芸香糖苷(cyanidin 3-O-rutinoside)；矢車菊素 3-O-葡萄糖苷-6-p-香豆基 (cyanidin 3-O-glucoside-6-p-coumaryl)；芍藥素3-O- 芸香糖苷(peonidin 3-O-rutinoside)；丁香素 3-O- 芸香糖苷(malvidin 3-O- rutinoside)；新綠原酸(neochlorogenic acid)；p-香豆酸葡萄糖苷(p-coumaric acid glucoside)；楊梅黃酮衍生物(myricetin derivatives)；槲皮素 3-O-芸香糖苷(quercetin 3-O-rutinoside)；槲皮素 3-O-半乳糖苷(quercetin 3-O-galactoside)；及槲皮素 3-O-葡萄糖苷(quercetin 3-O-glucoside)。例如，果皮可能被用於獲得高量花青苷。本發明之黑醋栗組成物也可包含各種碳水化合物，尤其各種糖類(含中性糖類)。至於中性糖，本發明之組成物可包括一或多果糖、葡萄糖及蔗糖。 使用含波森莓及蘋果之組成物及含波森莓、蘋果及黑醋栗之組成物之方法
如上所述，本文揭露之波森莓組成物(其含有包括波森莓及蘋果之組成物及包括波森莓、蘋果及黑醋栗之組成物)可被用於維持或改善整體呼吸系統健康及/或用於治療或預防各種呼吸道病況(含發炎)及與發炎有關之呼吸系統病症(諸如哮喘、慢性阻塞性肺病、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑)。其他與呼吸道發炎有關之病況包含：過敏或過敏性病症(allergy or allergic disorders)，肺氣腫(emphysema)，支氣管炎(bronchitis) ，呼吸性支氣管炎(respiratory bronchiolitis)，間質性肺病(interstitial lung disease)，發炎性氣道疾病(inflammatory airway disease)，纖維化肺泡炎(fibrosing alveolitis)，內源性肺泡炎(intrinsic alveolitis)，肺嗜酸性球增多症(pulmonary eosinophilia)，肺血管炎(pulmonary vasculitis)，肺炎(pneumonia)，間質性肺炎(interstitial pneumonia)，脫屑性間質性肺炎(desquamative interstitial pneumonia)，淋巴樣間質性肺炎(lymphoid interstitial pneumonia)，非特異性間質性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia)，嗜酸性球性肺炎(eosinophilic pneumonia)，肺發炎反應(pneumonitis)，胸膜炎(pleurisy)(pleuritus)，胸膜積水(pleural effusion)，囊腫纖維化(cystic fibrosis)，先天性纖毛運動異常症(primary ciliary dyskinesia)，急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，類肉瘤病(sarcoidosis)，皮肌炎(dermatomyositis)，蛔蟲症(toxocariasis)，華格納氏肉芽病(Wegener's granulomatosis)，蘭格罕氏細胞組織球增生症(Langerhans cell histiocytosis)，薛格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)，卡塔格氏症候群 (Kartagener syndrome)，聲帶功能異常(vocal cord dysfunction)，痙攣性哮吼(spasmodic croup)，自體免疫疾病(如狼瘡)，反射性血管舒縮疾病(reflexive vasomotor disease)，及自主性病症(autonomic disorders)。呼吸道中與發炎相關之其他因素包含：吸煙，空氣污染，過敏原，感染(如病毒或細菌)，某些藥物(如化療藥劑)，放射治療，醫療裝置(如呼吸器)及手術。
本發明之組成物找到關於治療或預防呼吸道發炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道纖維化、氣道重塑、或本文所述其他病況之用途。如例示劑量，該組成物可能給藥之劑量係與患者體重相關之以下量之花青苷總量或波森莓花青苷總量：約0.1至約200 mg/kg、約0.2至約180 mg/kg、約0.25至約150 mg/kg、約0.5至約125 mg/kg、約0.6至約100 mg/kg、約0.7至約90 mg/kg、約0.1至約50 mg/kg、約0.1至約20 kg/mg、約0.1至約10 mg/kg、約0.1至約5 mg/kg、約0.1至約1 mg/kg、約1至約20 mg/kg、約1至約10 mg/kg, 1至約5 mg/kg、或約200 mg/kg、約100 mg/kg、約90 mg/kg、約80 mg/kg、約70 mg/kg、約60 mg/kg、約50 mg/kg、約40 mg/kg、約30 mg/kg、約20 mg/kg、約10 mg/kg、約9 mg/kg、約8 mg/kg、約7 mg/kg、約6 mg/kg、約5 mg/kg、約4 mg/kg、約3 mg/kg、約2 mg/kg、約1 mg/kg、約0.9 mg/kg、約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg、約0.6 mg/kg、約0.5 mg/kg、約0.4 mg/kg、約0.3 mg/kg、約0.2 mg/kg、或約0.1 mg/kg。在特定態樣中，該劑量可能為約0.1 mg/kg至約10 mg/kg。根據所需上述劑量之給藥可能每天一次、每天二次、每天三次或更多次。可能在用餐時或在餐前給藥。本領域技術人員將能容易地決定適當之劑量及劑型。
用於該組成物之可能給藥之不同途徑包含腸内給藥及口服給藥。口服給藥可能利用片劑、膠囊、小袋(sachet)、滴劑、酏劑、舔劑、溶液、乳劑、懸浮液、飲劑、泥狀物、糊狀物、糖漿、凝膠、果凍、補劑或其他已知方式。腸內給藥可能藉由十二指腸管(duodenal tubing)或胃管(gastric tubing)(含鼻胃管(nasogastric tubing))。不同方式給藥係本領域已知且可被技術人員利用。本文揭露之組成物不受限於特定形式給藥。
添加一或多含酚化合物至本發明組成物可能有用，其係用以補充其中之含酚物活性。例示化合物包含但不限於：含酚物衍生物，諸如酚酸(phenolic acid)；及類黃酮，諸如木質素(lignins)、前花青素(proanthocyanidins)、花青苷(anthocyanins)、花青素(anthocyanidins)、異黃酮素、兒茶素、單寧、槲皮素、柚皮素(naringenin)及橙皮苷(hesperidin)。本文描述令人感興趣之特定花青苷化合物。特別包括由一或多以下萃取之含酚化合物：茶、可可、葡萄酒(wine)、大豆、鳳梨番石榴(feijoa)、柑橘類(citrus fruits)、蘋果、梨、葡萄、漿果類(berries)及奇異果。特別之含酚物包含但不限於：鞣花酸、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、山柰酚(kaemferol)、E-咖啡醯-3-葡萄糖苷、E-咖啡醯-4-葡萄糖苷、新綠原酸、根皮苷、前矢車菊素 B1及B2、槲皮素、槲皮素鼠李糖苷(quercetin rhamnoside)及槲皮素芸香糖苷。
作為其他態樣，本發明之組成物可能與一或多呼吸輔助物共給藥。呼吸輔助物可能為藥物(處方或非處方)或替代治療(如草藥或精油，例如用於蒸發及/或吸入)。特別感興趣者為本發明組成物在其他呼吸治療方式期間及/或之後作為呼吸系統治療方式之用途。例如，該組成物可能與一或多藥物或替代治療配成組合劑型。可擇地，該波森莓組成物可能以單獨劑型與一或多藥物或替代治療給藥。呼吸輔助物可能具有一或多生理效應，例如抗發炎、抗痙攣、支氣管擴張及/或肌肉鬆弛效應。任一呼吸輔助物可能為長或短效，且可能針對特定病症，如哮喘、慢性阻塞性肺病等。
範例藥物包含但不限於支氣管擴張劑，其包含：短效支氣管擴張劑，諸如：沙丁胺醇(albuterol)(例如Vospire ER)，左旋沙丁胺醇(levalbuterol)(例如Xopenex)、異丙托溴銨(ipratropium)(例如Atrovent)、沙丁胺醇/異丙托溴銨(albuterol/ipratropium)(例如Combivent)；皮質類固醇，諸如氟替卡松(fluticasone)(例如Flovent, Flovent Diskus, Flovent HFA)、布***(budesonide)(例如Pulmicort, Pulmicort Flexhaler)、莫美他松(mometasone)(例如Asmanex)、貝克每松(beclomethasone)(例如QVAR)、氟尼縮松(flunisolide)(例如Aerospan)、去氫皮質醇(prednisolone)、甲基去氫皮質醇(methylprednisolone)及氫皮質酮(hydrocortisone)；甲基黃嘌呤，諸如茶鹼(例如Theochron, Theo-24, Elixophyllin)；長效支氣管擴張劑諸如阿地溴銨(aclidinium)(例如Tudorza)、阿福莫特羅(arformoterol)(例如Brovana)、福莫特羅(formoterol)(例如Foradil, Perforomist)、格隆溴銨(glycopyrrolate)(例如Seebri Neohaler)、茚達特羅(indacaterol)(例如Arcapta)、奧達特羅(olodaterol)(例如Striverdi Respimat)、沙美特羅(salmeterol)(例如Serevent)、噻托溴銨(tiotropium)(例如Spiriva)及蕪地溴銨(umeclidinium)(例如Incruse Ellipta)；二或多長效支氣管擴張劑之組合，諸如格隆溴銨/福莫特羅(例如Bevespi Aerosphere)、格隆溴銨/茚達特羅(例如Utibron Neohaler)、噻托溴銨/奧達特羅(tiotropium/olodaterol)(例如Stiolto Respimat)、蕪地溴銨/維蘭特羅(umeclidinium/vilanterol)(例如Anoro Ellipta)。
其他範例藥物包括但不限於：吸入性皮質類固醇與長效支氣管擴張劑之組合，諸如：布***/福莫特羅(budesonide/formoterol) (例如Symbicort)，氟替卡松/沙美特羅(fluticasone/salmeterol)(例如Advair，Advair Diskus)及氟替卡松/維蘭特羅(fluticasone/vilanterol) (例如Breo Ellipta)；磷酸二酯酶-4抑制劑(phosphodiesterase-4 inhibitors)，諸如羅氟司特(roflumilast)(例如Daliresp)，β促效劑(其包含短效β促效劑，諸如沙丁胺醇(例如ProAir HFA，Ventolin HFA) 及左旋沙丁胺醇(例如Xopenex HFA)；抗膽鹼劑，諸如異丙托溴銨 (例如Atrovent HFA)，長效β促效劑(LABAs)，諸如福莫特羅(Perforomist)及沙美特羅(例如Serevent Diskus))，白三烯調節劑，諸如孟魯司特(montelukast)(Singulair))，扎魯司特(zafirlukast)(Accolate)，及齊留通(zileuton)(例如Zyflo，Zyflo CR)，免疫調節劑諸如美泊利單抗(mepolizumab) (Nucala)，奧馬珠單抗(omalizumab)(例如Xolair)，瑞利珠單抗(reslizumab)(例如Cinqair)，支氣管擴張劑諸如腎上腺素(例如Primatene Mist，Bronkaid，Asthmahaler)，麻黃鹼(ephedrine)，及茶鹼-麻黃鹼(theophylline-ephedrine)(例如Primatene tablets)。 實施例
本文所述之實施例係供用於說明本發明特定具體實施例，在任何方面皆非有意限制本發明。 實施例 1 ： OVA 誘導慢性氣道發炎及波森莓口服治療 概述
慢性哮喘中肺纖維化對肺功能有負面影響，且與原纖維巨噬細胞表現型之發展有關。流行病學研究發現，多攝取富含多酚之水果有益肺功能。然而，先前之研究尚未對波森莓組成物或對氣道系統中之纖維化或重塑之影響進行研究。
本案發明人研究攝取波森莓之影響，於慢性抗原誘導氣道發炎之小鼠模型中之治療及預防治療策略中使用波森莓之影響。隨著肺組織中CD68+CD206+ 精胺酸酶另類活化巨噬細胞增加攝取波森莓可減少膠原蛋白沉積及改善組織重塑。組織重塑之減少與全部肺組織中促纖維分解基質金屬蛋白酶-9蛋白(profibrolytic matrix metalloproteinase-9 protein)之表現增加有關。
本案發明人確認小鼠另類活化巨噬細胞，其攝取波森莓作為基質金屬蛋白酶-9之來源。本案發明人假設口服波森莓處理能緩和慢性組織重塑，藉由維持促纖維分解性另類活化巨噬細胞(表現基質金屬蛋白酶-9)之發展。因此規律地攝取波森莓能夠緩和哮喘及其他慢性肺病之慢性肺重塑及纖維化。 材料
抗-肌動蛋白(clone AC-15)、卵白蛋白 (OVA)、4% 福馬林、土溫乳化劑(Tween) 20、trans-羥脯胺酸、3,3’-二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)(DAB)基質(substrate)、***/甲苯噻嗪(ketamine/xylazine)及所有其他化學品均來自Sigma (Auckland, NZ)。明礬來自Serya (Heidelberg, Germany)。波森莓汁來自New Zealand 65 Brix 波森莓汁濃縮物，由Berryfruit Export NZ提供，現以Boysenberries New Zealand Ltd (Nelson, New Zealand)銷售。來自Berryfruit Export NZ之65 Brix 波森莓汁濃縮物係在無菌水中稀釋以獲得100 mg/ml花青苷總量之濃度。由此製備進一步之稀釋液以獲得10mg/kg花青苷總劑量。此進一步之稀釋液被稱為波森莓溶液。
抗-小鼠多株誘導型一氧化氮合成酶(iNOS) (ab3523)、精胺酸酶、TIMP-1 (ab38978)及MMP-9 (ab38898)係由Abcam(Cambridge, UK)獲得。抗小鼠CD68 (clone FA-11) CD3e、CD8a、CD4、CD11b、CD11c及Gr-1抗體係由BioLegend (San Diego, CA)獲得，而抗-CD206 (clone MR5D3)係由AbDSerotec (Oxford, UK)獲得。抗-小鼠SiglecF、MHCII及CD45係來自BD Biosciences (San Jose, CA)。
TGFβ ELISA套組係由R&D Systems (Minneapolis, MN)獲得。Vectastain Elite ABC染色套組來自Vector Laboratories (Burlingame, CA)。對IL-4、IL-5、IL-6、IL-13及IFNγ之Bio-Plex多重細胞介素檢定、DC Lowry蛋白質檢定套組及PVDF膜係來自Bio-Rad (Hercules, CA)。BSA、NuPage 4-12%膠、MES電泳緩衝液(running buffer)、加樣緩衝液(sample loading buffer)、Novex sharp prestained及MagicMark XP蛋白質標準及所有其他緩衝液係來自Life Technologies (Auckland, NZ)。 動物
在紐西蘭威靈頓Malaghan醫學研究所(Malaghan Institute of Medical Research, Wellington, New Zealand)一特定無病原體動物設施中於具有過濾器頂部之傳統聚碳酸酯籠中繁殖及分群圈養(每籠5隻) C57BL/6J 雄性小鼠。所有實驗程序均獲得惠靈頓維多利亞大學動物倫理委員會(Victoria University of Wellington Animal Ethics Committee)批准(批准號2011R3M)。
使小鼠維持在12-h光暗循環、21 ± 2°C環境溫度中，可自由取得幅射標準實驗室囓齒動物食料(Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia)及酸化水。 OVA 誘導慢性氣道發炎及經口之波森莓處理
六週齡小鼠被隨機分配至實驗組(每組n = 10)並於第0天於腹腔以100 µg OVA及200 µl 明礬佐劑致敏(i.p.)。第+7天於鼻內以100 µg OVA或PBS刺激(i.n.)小鼠。
為了建立慢性疾病每週重覆該i.n.刺激(圖1A及6A)。最後一次i.n.後四天安樂死OVA刺激小鼠(***/甲苯噻嗪過量)，收集支氣管-肺泡灌洗液(BALF)、血清、縱膈淋巴結及肺組織。
於該治療研究使小鼠在經口以胃管灌食250 µl波森莓溶液(見上文)前禁食整晚；劑量為10 mg/kg花青苷總量)或無菌水，於OVA刺激當天及OVA刺激後2天再次灌食(圖1A及6A)。 肺巨噬細胞氯膦酸脂質體耗盡及組織分析
依先前所述方式製備氯膦酸脂質體(58)。持續5週建立慢性OVA誘導組織損傷。然後在每次經口以胃管灌食250μl波森莓溶液前一天以100 µl 氯膦酸脂質體處理小鼠鼻內(見上文；劑量為10 mg/kg花青苷總量)或無菌水(圖6A)。最後一次經口以胃管灌食後2天安樂死小鼠(***/甲苯噻嗪過量)並收集BALF、血清、縱膈淋巴結及肺組織。
對由BALF分離出細胞之關鍵表面標記物(key surface markers)進行染色以鑑定單核球/巨噬細胞(CD45+/CD11b+/Cd11c+/MHCIIlow)及嗜酸性球 (CD45+/CD11b+/siglecF+)，藉由如前所述之流式細胞儀(52)。按照製造商說明對肺組織上清液進行TGFβ ELISA及Bio-Plex多重細胞介素檢定。肺組織係經以用4％福馬林固定、切片及以蘇木色素及曙紅(H&E)、Masson’s三色染或阿新藍-過碘酸-Schiff(AB-PAS)染劑染色(Dept. of Pathology, Wellington School of Medicine, University of Otago, Wellington, NZ)。
切割其他切片用於免疫標記(immunological labelling)。肺切片係與生物素-結合(conjugated)MMP-9一起溫育(incubated)，然後以DAB標記並用蘇木色素對比染色(counter-stained)。其他組織切片係與螢光標記CD68 (31)、CD206 (57)及精胺酸酶或MMP-9 (44)一起溫育，然後與含DAPI之封固劑(mounting medium)對比標記(counterlabelled)。
所有切片係經以Olympus BX51複式顯微鏡成像並使用cellSens (Olympus NZ)軟體截取，亮色代表彩色而灰階代表螢光。於Pixelmator影像軟體 (Vilnius, Lithuania)加工螢光影像(裁剪、假色上色(false coloured)及合併)。螢光標記細胞經四個獨立盲測者加以量化。來自多個動物隨機區域之細胞被計數並分為CD68、CD206、精胺酸酶或MMP-9陰性、單陽性或雙陽性。以計數細胞總數百分率表示數據。 生物化學及分子生物組織分析及統計分析
生物化學及分子生物組織。快速冷凍肺組織並儲存在-70°C。用羥脯胺酸檢定定量肺膠原蛋白，如前所述(2)。於西方墨點法，在蛋白質裂解緩衝液(Tris·HCl, NaCl, 10% Nonidet P-40, 10%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate), 100 nM EDTA, pH 7.4 與蛋白酶及磷酸酶抑制劑)中均質化組織。按照製造商說明用Lowry 蛋白質檢定定量蛋白質濃度。
在還原狀態下用SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品 (30 µg 蛋白質)並經其轉移到PVDF膜片上。用3％BSA(10 mM PBS及 0.2% Tween 20)阻斷非特異性蛋白質結合並用對iNOS(64)、精胺酸酶(53)、MMP-9 (44)及TIMP-1 (55)或β-肌動蛋白(12) 加載對照組 (4°C)具特異相之初級抗體對該膜片探測隔夜。洗滌膜片，與山葵過氧化酶-結合之第二抗體一起溫育，並在Carestream Gel Logic Pro 6000成像儀上透過化學發光視覺化。用ImageJ’s Gel分析工具光密度定量蛋白質表現並對β-肌動蛋白進行標準化(50)。在Pixelmator影像軟體中加工及裁切影像。
如圖所示，用單尾學生t檢定或單因子ANOVA (用於兩組間之比較)或用Tukey’s 事後比較檢定(用於三或多組間之比較)來分析數據(Prism, GraphPad, San Diego, CA)。P ＜ 0.05或更小時被認為具有統計學意義。 結論 - 波森莓攝取改善 OVA 誘導慢性氣道發炎
為了研究波森莓對於已確立之肺重塑之治療影響，以鼻內之 OVA逐週刺激小鼠持續5週，然後以OVA逐週刺激另外5週同時逐週用波森莓口服治療(圖1A)。
如圖1B所示，OVA刺激小鼠之肺組織表現出細胞浸潤增加且肺結構喪失。波森莓處理小鼠之OVA誘導細胞浸潤及肺損傷減少(圖1B)。染色肺組織黏液生成鑑別出相較於只用OVA刺激之小鼠，得到波森莓處理之OVA刺激小鼠較少黏液陽性細胞(圖1C)。單獨之波森莓處理不會影響細胞浸潤、肺結構或黏液生成。 結論 - 波森莓處理增加 OVA 刺激小鼠肺中之 AAMs
H&E-染色之肺組織切片顯示相較於OVA小鼠，在OVA/波森莓-處理小鼠中有更多巨噬細胞(圖2A)。肺組織免疫墨點分析鑑定出相較於單獨之OVA 刺激，OVA/波森莓-處理小鼠肺組織中之iNOS表現減少(圖2B及C)。同時，OVA刺激小鼠中可發現精胺酸酶表現量增加(圖2B及D)。用波森莓處理之OVA刺激小鼠進一步增強此一作用。單獨之波森莓處理不會影響精胺酸酶表現。
表現精胺酸酶之AAMs與肺重塑密切相關(29)。為了確定觀察到之肺巨噬細胞是否被活化，用巨噬細胞標記CD68及AAM標記CD20及精胺酸酶螢光標記抗體染色肺組織。
OVA/波森莓-處理小鼠之肺組織顯示較OVA刺激小鼠增加之 CD68+CD206+精胺酸酶+巨噬細胞(圖3)。CD68+CD206+精胺酸酶+巨噬細胞之定量分析進一步證實，相較於OVA刺激小鼠，OVA/波森莓-處理小鼠肺組織中之CD68+CD206+精胺酸酶+巨噬細胞百分比顯著增加(60.00 ± 3.54%，相較於23.47 ± 5.61%，P ＜ 0.001，單尾學生t檢定)。此等數據一起鑑定出得到波森莓處理之OVA刺激小鼠中表達另類活化表型之肺巨噬細胞數目有增加。 結論 - 波森莓處理減少 OVA 誘導膠原蛋白沉積並增加肺中 MMP-9 表現
AAMs及精胺酸酶表現之增加通常與組織纖維化有關(14, 27, 66)；因此研究波森莓處理對於肺中OVA誘導膠原蛋白沉積之影響。在此之後，肺組織中測定之羥脯胺酸量可當作膠原蛋白沉積之替代標記(surrogate marker) (2, 63)。
單獨之OVA 刺激造成氣道中異常膠原蛋白沉積，其在整個肺組織中有膠原蛋白入侵之跡象(signs)，而其在OVA/波森莓-處理小鼠之肺中卻被消除(圖4)。此外，用波森莓處理之OVA刺激小鼠肺中之羥脯胺酸量顯著地下降，證實波森莓處理改善OVA誘導膠原蛋白沉積(圖4B)。波森莓恢復OVA誘導而使肺中TGFβ減少之量(圖4C)但未影響IL-4、IL-5、IL-6、IL-13或IFNγ之量(數據未顯示)。
為了確定波森莓處理如何緩和肺纖維化，用免疫墨點測定肺組織中之MMP-9表現。
相較於單獨以OVA刺激之小鼠，以波森莓處理之OVA刺激小鼠中MMP-9 表現確定有增加(圖4D)。單獨之波森莓處理不會影響肺中MMP-9量。基質金屬蛋白酶-1組織抑制劑(TIMP-1)係 MMP-9內源性抑制劑(49)。慢性OVA刺激小鼠肺組織中TIMP-1/MMP-9表現之比值顯著增加，而此增加與用波森莓處理者相反(圖4E)。此等結論指出波森莓-介導之膠原蛋白沉積及組織重塑之減少係與纖維分解MMP-9之產量提高及TIMP-1/MMP-9比值隨後重新平衡有關。 結論 - 另類活化巨噬細胞 OVA/ 波森莓 - 處理小鼠肺中之 MMP-9 蛋白質之來源
肺組織玻片(slides)係經分析以鑑定MMP-9潛在細胞來源。DAB-MMP-9染色鑑定出高度MMP+細胞，相較於OVA-治療控制組，其在OVA/波森莓-處理小鼠表現出巨噬細胞形態(圖5A)。螢光免疫染色(圖5B)及肺組織定量分析證實相較於單獨以OVA刺激者，OVA/波森莓-處理之肺中有較多MMP-9+/CD206+/CD68+細胞存在(39.30 ± 6.39 vs. 21.07 ± 5.82%；P ＜ 0.05，單尾學生t檢定)。此等結論確定CD206+/CD68+ AAMs係MMP-9 蛋白質量增加之來源。 結論 - 在確立之慢性肺發炎中肺巨噬細胞耗盡會減少攝取波森莓對組織重塑之有益影響
其次，本案發明人研究耗盡肺巨噬細胞對於波森莓對慢性肺發炎有益影響之影響。在建立慢性肺發炎及重塑後，以及各波森莓處理組給藥前，給予氯膦酸脂質體(clodronate liposomes)使巨噬細胞耗盡(圖6A)。用流式細胞儀證實肺巨噬細胞顯著耗盡 (圖6B)而此與以波森莓處理之OVA刺激小鼠肺中之羥脯胺酸量顯著減少有關(圖6C)。此等數據指出波森莓需要巨噬細胞來中介對肺組織重塑之有益影響。 結論 - 波森莓處理預防性防止 OVA 誘導氣道發炎
最後，使用預防性給藥方案(regimen)測試波森莓處理影響(圖7A)。 再次，波森莓處理造成OVA誘導組織重塑之消除(abrogation)且顯著地減少肺灌洗液中之細胞(圖7, B-D)。此與肺組織中較低之羥脯氨酸量及TIMP-1/MMP-9表現之比值降低有關(圖7, E-G)。 討論
攝取水果與哮喘患者中改善之肺功能及實驗模型中急性氣道發炎之改善有關(16, 19, 40)。然而，尚未於與波森莓組成物、氣道纖維化或氣道重塑相關之研究確立任何發現，而眾人皆知其他已知之哮喘治療方式無法解決氣道重塑問題。
本文證明攝取波森莓組成物可於治療及預防二方面緩和慢性肺重塑及纖維化。此外，該數據指出巨噬細胞在波森莓-介導保護作用中舉足輕重且此保護作用可能由AAMs調節及MMP-9活性增加所導致。
精胺酸酶活性(26, 27, 41)及AAMs (4, 9)二者之增加通常與哮喘發病機制有關。然而，有證據表明AAMs之存在並未特別強化過敏性哮喘之發展(37)，其表示AAMs可能扮演另一個角色。
如本文所示，該波森莓處理使慢性OVA刺激小鼠肺組織中精胺酸酶-陽性AAMs 群族增加同時使 iNOS表現降低。精胺酸酶及iNOS在調節肺發炎及修復方面有交互作用(34, 35, 66)。在iNOS活性與活躍性(active)發炎有關之處，有精胺酸酶表現表示已轉為炎症消退(inflammatory resolution)(35, 63)。因此攝取波森莓似乎能重新平衡肺環境，藉由調節肺中AAMs之功能表型使炎症消退。
AAMs之存在與肺發炎中減少之Th-2細胞介素生成有關(36, 42)。然而，確定OVA刺激後有攝取波森莓之Th-2細胞介素IL-4、IL-5及1IL-13之量沒有變化。此表示AAMs對促炎性(proinflammatory)Th-2細胞介素生成之抑制作用對波森莓處理之保護影響沒有幫助。
臨床及動物數據表示MMP-9在哮喘之作用係具多面性(multifaceted)。在實驗及臨床環境中識別產生MMP-9之肺巨噬細胞(1, 5, 49)。相較於健康控制組，在患有哮喘患者之血漿及痰樣品中發現活性MMP-9量升高(3, 23)。增加之MMP-9 表現與急性哮喘加劇(exacerbation)有關，其包含增加之肺嗜酸性球增多症(6, 23)。相反地，MMP-9量之增加與氣道疾病中肺功能改善有關(25, 65)。MMP-9過度表現也被證明在肺纖維化模型中會有有益影響(5)。相反地，MMP-9基因剔除(knockout)小鼠數據顯示哮喘症狀發展之部分減緩及減少之重塑，但在某些情況下缺乏MMP-9已被證明會加重疾病(15, 24, 32)。
MMP-9對不同免疫參數(包含促炎及抗炎細胞介素之活化)發揮許多下游作用(15)。然而，本文所示數據表明，經由產生纖維分解AAM(其產生MMP-9)部分地協調(orchestrated)波森莓-誘導保護使肺組織免為慢性膠原蛋白沉積及纖維化。與此一致，數據顯示攝取波森莓使發炎痊癒階段時巨噬細胞耗盡會導致膠原蛋白沉積增加。在博萊黴素(bleomycin)-誘導之肺纖維化中已說明巨噬細胞有類似之促進痊癒作用(14)。
基質金屬蛋白酶受其天然抑制劑TIMPs調節，提出較高之TIMP-1/MMP-9比例有利於膠原蛋白沉積及肺重塑(21, 28, 38)。於此觀察到慢性OVA刺激小鼠肺組織中TIMP-1/MMP-9表現比例顯著增加，而此被波森莓處理逆轉。波森莓-處理小鼠中TIMP-1/MMP-9比例下降代表膠原蛋白沉積及分解之調節中潛在有益之重新調整(re-adjustment)。
TGFβ藉由其在胞外基質生成之作用而與正常(20)及病理(17, 22, 56)組織修復過程有關。在此研究中，觀察到慢性OVA刺激導致TGFβ量降低，其因波森莓之攝取而逆轉。證據表明TGFβ降低TIMP-1/MMP-9比例，從而有利於更多纖維分解之環境(18, 54, 56)。如此，在波森莓處理後在OVA刺激小鼠肺中觀察到之TGFβ量增加可藉由降低TIMP-1/MMP-9比例來限制肺修復期間過多組織纖維化及不適當之重塑。還已知TGFβ會刺激用於正常組織修復之纖維母細胞收縮(20)，其同樣有助於波森莓處理之有益影響。如此，TGFβ升高有可能藉由多種機制促進肺中抗發炎、促分解之環境。
此等研究結果表示波森莓給藥在治療及預防環境中均對於慢性肺纖維化具有有益影響。此指出攝取波森莓可能有助於在哮喘控制不良及控制良好之情況下皆可避免不適當之纖維重塑。最後，此等發現提供第一個證據，該證據為波森莓之攝取可被應用在維持具調節哮喘及其他具纖維病變肺病況之適當肺重塑潛力之纖維分解AAMs發展。
總之，此等發現表示在呼吸道中波森莓組成物可能被用於減少發炎及異常膠原蛋白沉積，藉此找到用於治療及預防各種氣道病症之用途，包括哮喘、慢性阻塞性肺病、反應性氣道疾病、氣道纖維化及氣道重塑。 實施例 2:  OVA 誘導急性氣道發炎及波森莓及蘋果之口服治療 材料及方法
如上文所述及以下修改以實施例1方式處理並評估六週齡小鼠。該測試溶液包含：波森莓1及波森莓 10(分別為0.67%及6.7%)，蘋果1及蘋果10(分別為1.87%及18.7%)，BerriQi™波森莓與蘋果1及 BerriQi™波森莓與蘋果 10(分別為0.67%/1.87%及6.7%/18.7%)。商購之波森莓汁濃縮物係獲自如實施例1所述。蘋果汁濃縮物係由Infruit Ltd (Titirangi, Auckland, New Zealand)提供，由 Profruit (2006) Ltd (Hastings, New Zealand)製造。
於該18.7%溶液，在100 g水中稀釋18.7 g果汁濃縮物。於該6.7%溶液，在100 g水中稀釋6.7 g果汁濃縮物 。於該1.87%溶液，在100 g水中稀釋1.87 g果汁濃縮物。於該0.67%溶液，在100 g水中稀釋0.67 g果汁濃縮物。於該組合之6.7%/18.7%溶液，在100 g水中稀釋分別為6.7 g及18.7 g之果汁濃縮物。於該組合之0.67%/1.87%溶液，在100 g水中稀釋分別為0.67 g及1.87 g之果汁濃縮物。參考該組合之溶液，該波森莓與蘋果之百分比為27%至73%。在用以測試抗發炎活性去活性化之給藥前於80℃下加熱8小時同時製備BerriQi™波森莓與蘋果測試溶液。
用於測試波森莓與蘋果給藥之組合給藥實驗計劃(protocol)係基於先前已公開用於誘導過敏性氣道發炎之方法(52)。該用於急性發炎實驗計劃使用11天模型。為評估波森莓、蘋果、組合波森莓及蘋果給藥之療效且為確定稀釋10倍處理之影響，以下處理組係經測試：1) 基準控制組(無疾病)；2) 疾病控制組；3) 蘋果10 (18.7%) + 疾病；4) 蘋果1 (1.87%) + 疾病；5) 波森莓10 (6.7%) + 疾病；6) 波森莓 1 (0.67%) + 疾病；7) BerriQi™波森莓與蘋果10 (6.7/18.7%) + 疾病；8) BerriQi™波森莓與蘋果1 (0.67/1.87%) + 疾病；9) ‘經烹煮’ BerriQi™波森莓與蘋果 (6.7/18.7%) + 疾病。每一組包含10隻動物。實驗重複三次。統計分析係如實施例1所述方式進行。
根據此模型先前之運用，使用以下劑量/刺激方案。在刺激前7天致敏小鼠引發過敏性氣道發炎，於刺激後4天收集樣品。於第0天及第+2天以250 µl所述處理或水(控制組)施予(處理)小鼠(見下文)。於該波森莓10測試溶液(波森莓10及BerriQi™波森莓與蘋果10)，施予該劑量以提供4.87 mg/kg花青苷總量。於該波森莓1測試溶液(波森莓1及BerriQi™波森莓與蘋果1)，施予該劑量以提供0.487 mg/kg花青苷總量。
收集以下樣品：1) 肺沖洗液(lung wash)；2) 肺組織；3) 縱膈淋巴結；4) 血液。根據(52)所述方法分析此等樣品之以下者：1)細胞總數(及細胞組成物)：  肺沖洗液、肺組織及淋巴結；2) 產生之細胞介素及趨化介素(其包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、CCL11、IFNγ)：肺沖洗液、肺組織及血液；3) IgE、IgG1：僅血液。根據製造商之說明使用BioLegend LEGENDplex™多分析物流動檢定套組測試細胞介素量。 結論
圖8顯示測試示意圖。由所獲得之結果，卵白蛋白刺激增加肺中發炎細胞之出現。特殊處理使此增加減少而回到空白之程度，即未添加OVA。
該結果說明鼻內以過敏源OVA刺激之小鼠中全部免疫細胞浸潤至肺中(圖9)。單獨以蘋果處理不會減少該細胞浸潤。BerriQi™波森莓與蘋果於二種測試濃度均能減少該細胞浸潤，而當該BerriQi™波森莓與蘋果被加熱至80°C經8小時則結果相反(reversed)。
結果顯示單獨以蘋果處理對於嗜酸性球數目、嗜中性球、單核球、或抗原呈現細胞(APCs)影響不大(圖10、14-16)。與此相反，低劑量之組合BerriQi™波森莓與蘋果之處理實質上減少嗜酸性球、嗜中性球及單核球數目(圖10、14、15)。在處理前加熱該BerriQi™波森莓與蘋果溶液會逆轉此影響(圖10、14、15)。組合BerriQi™波森莓與蘋果之處理也會減少APCs數目(圖16)。加熱會逆轉此影響(圖16)。
蘇木色素及曙紅染色顯示該卵白蛋白刺激造成組織腫脹及免疫細胞浸潤，然而相較於單獨之OVA，組合BerriQi™波森莓與蘋果之處理似乎能減少組織腫脹(圖13)。
AB-PAS染色顯示不同處理間黏液生成情況有所不同(圖17-19)。雖然在最低果實濃度下觀察到更多會產生黏液之細胞，卻沒有任何一種處理使黏液生成更嚴重，也沒有任何一種處理能預防黏液生成增加(圖17-19)。此等結果被歸因於對急性試驗模型給藥之持續時間短且次數少(二次)。此與較長試驗測試期及上述之實施例1提到之額外給藥形成對比。建議給予較長測試時間及額外劑量能更好地觀察對黏液生成之影響。
Masson’s三色染染色顯示急性OVA 刺激不會實質上地增加纖維化。肺組織內膠原蛋白沉積沒有增加(圖20-22)。此組織學結果指出處理對纖維化之影響無法在這個急性試驗模型中進行測試。此證實急性試驗模型之短持續時間無法提供足夠時間來了解對長期症狀(如黏液生成及膠原蛋白沉積)之影響。
評估由測試及控制組動物獲得之肺液(lung fluid)之細胞介素量，其包含顆粒性白血球-巨噬細胞群體刺激因子量(GM-CSF)、IFNγ、IFNβ、IL-1α、IL-1β、TNFα、IL-12(p40)、IL-10、IL-6、IL-27、CXCL1及CCL2。單獨之波森莓處理會減少 GM-CSF量(圖23)，然而蘋果處理及組合BerriQi™波森莓與蘋果處理不會減少GM-CSF量(圖23)。CCL11量似乎未受顯著影響(圖24)。IFNγ、IFNβ、IL-1α、IL-1β、TNFα、IL-12(p40)、IL-10、IL-6、IL-27、CXCL1及CCL2未在受測樣品中測得(數據未顯示)。基於此，推測BerriQi™波森莓與蘋果處理之作用並非經由CCL11之分泌介導。 討論
由該等結果總結出組合BerriQi™波森莓與蘋果處理於標準或較低劑量皆能減少嗜酸性球浸潤數目。此影響取決於BerriQi™波森莓與蘋果組成物之溫度敏感成分。單獨使用蘋果之處理對於嗜中性球、單核球或APCs數目影響不大。組合BerriQi™波森莓與蘋果之較低劑量處理能減少嗜中性球及單核球數目，而於標準及較低劑量能減少APCs數目。此影響取決於溫度敏感成分。顯然地波森莓及蘋果組成物組合給藥可被用於減少與過敏性氣道發炎相關之免疫細胞數目。
於相異處理間對黏液生成之評估會有所不同，得出之結論為黏液抑制作用之其他或替代措施(諸如IL-13、IL-9生成)可能提供進一步澄清。用以鑑定促發炎細胞介素變化之肺組織上清液分析顯示CCL11量並未受BerriQi™波森莓與蘋果處理影響，表示嗜酸性球之減少並非藉由CCL11之抑制作用介導。其他分析可能被用於鑑定涉及此過程之特殊試劑。
總體而言，此急性研究之結果為正向，顯示BerriQi™波森莓與蘋果處理於二種測試濃度皆會減少細胞浸潤，而單獨之蘋果於任何測試濃度皆不會。單獨之波森莓也會減少細胞浸潤，此與本文所述先前研究中之發現相類似(參見例如實施例1及(74))。尤其本研究中使用之過敏性氣道發炎急性模型並沒有充分地促進組織纖維化之發展，因此無法確定BerriQi™波森莓與蘋果之處理能否促進抗纖維化巨噬細胞之發展及預防組織損傷。為確定此影響之存在，有必要對慢性過敏性氣道發炎進行進一步之研究。 實施例 3:  OVA 誘導慢性氣道發炎及波森莓及蘋果之口服治療 概述
雖然已研究攝取某些水果及蔬菜會與有益健康之影響有關(87, 88, 91-94)，但本文所述實驗係首次顯示出特定波森莓組成物之實質有益影響。參見實施例1及2，以及(74)。實施例1研究之主要發現包含：1) 攝取波森莓顯著地經由減少細胞浸潤及增加抗發炎蛋白質產生來減少過敏原引起氣道發炎；2) 波森莓減少膠原蛋白沉積且藉由協助纖維溶解巨噬細胞(一種免疫細胞)發展幫助損傷組織修復；及3) 波森莓處理預防性地防止卵白蛋白(OVA)-誘導之氣道發炎。
已對相異蘋果品種對過敏性氣道疾病關鍵細胞介素之影響進行研究(96)，且已為在過敏性哮喘誘發細胞培養模型之蘋果品種建立細胞介素抑制能力。該抑制能力係與前矢車菊素多酚(procyanidin polyphenols)之存在有關(96)，且已表明在分離時此等化合物係關鍵過敏性趨化介素CCL11(90)及CCL26(89)之有效抑制劑。目前標的之目標係評估在一慢性OVA誘導過敏性氣道發炎動物模型中BerriQi™波森莓與蘋果之處理(一種新穎之波森莓及蘋果汁濃縮物與水之組合)。 材料及方法
為了進行此研究，如實施例1使用先前建立之小鼠模型及慢性OVA誘導過敏性氣道發炎之口服給藥策略(亦見(52), (97))。簡言之，於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠(i.p.)然後7天後於鼻內以OVA刺激(i.n.)。每週進行此等i.n.刺激持續10週。OVA刺激5週後，開始BerriQi TM之干預措施。為了此等干預措施，小鼠在經口以胃管灌食以下前禁食4小時：水(疾病及載體控制組)、100%、50% 或25% BerriQi™ 波森莓與蘋果(於i.n. OVA 刺激前2天、前1小時及OVA刺激後2天)。
該干預措施組係：1) 空白(基準控制組)；2) +OVA(疾病及水載體控制組)；3) +OVA+BerriQi™ 100% (疾病+ 100% BerriQi™ 波森莓與蘋果)，其含有來自New Zealand 70°Brix 蘋果汁濃縮物及來自New Zealand 65°Brix 波森莓汁濃縮物；4) +OVA+BerriQi™ 50% (疾病+50% BerriQi™ 波森莓與蘋果)，其含有來自New Zealand 70°Brix 蘋果汁濃縮物及來自New Zealand 65°Brix 波森莓汁濃縮物；及5) +OVA+BerriQi™ 25% (疾病+25% BerriQi™ 波森莓與蘋果)，其含有來自New Zealand 70°Brix 蘋果汁濃縮物及來自New Zealand 65°Brix 波森莓汁濃縮物。該波森莓汁濃縮物獲自Boysenberry NZ (Nelson, New Zealand)。該蘋果汁濃縮物係由RD2 International (Auckland, New Zealand)提供，由Profruit (Hastings, New Zealand)製造。
BerriQi™ 波森莓與蘋果中之波森莓濃度係經計算得到對一70 kg人類可給予0.73 mg/kg波森莓花青苷，此相當於在小鼠中之10 mg/kg。該劑量係基於先前研究選擇(見實施例1及 (52))，其確定攝取10 mg/kg 波森莓花青苷造成慢性過敏性氣道發炎小鼠模型中發炎及組織纖維化減少。100% BerriQi™波森莓與蘋果為一25g小鼠提供10mg/kg波森莓花青苷總量；50%及25% BerriQi™波森莓與蘋果分別為一25g小鼠提供5 mg/kg及2.5 mg/kg波森莓花青苷總量。於以下實施例5中提供劑量之細節。
在i.n. OVA刺激後4天對小鼠實施安樂死。如實施例1中所述測量以下參數：1) 細胞浸潤：嗜酸性球、嗜中性球、單核球及抗原呈現細胞 (APCs)；2) 組織變化：蘇木色素及曙紅(H&E)，阿新藍及過碘酸-Schiff (AB-PAS)，Masson’s三色染染色；及3)膠原蛋白生成，其使用羥脯胺酸檢定。使用商購比色套組(AbCam ab222941)進行羥脯胺酸檢定。 結論
結果顯示i.n.過敏原OVA刺激小鼠中有增加之免疫細胞總數浸潤至肺中(圖25)。BerriQi™波森莓與蘋果在測試之50%及25%濃度處理下顯著地減少該細胞浸潤(圖25)。100%濃度BerriQi™波森莓與蘋果處理似乎對肺中OVA誘導免疫細胞之增加沒有影響。此被假定為顯示BerriQi™波森莓與蘋果處理之治療範圍。
免疫細胞被鑑定為嗜酸性球(圖26)、抗原呈現細胞(圖27)及單核球(圖28)。該嗜酸性球數目在OVA刺激小鼠中有顯著增加(圖26)。50% BerriQi™ 波森莓及蘋果處理得到嗜酸性球數目之減少(圖26)。抗原呈現細胞隨著OVA刺激顯著增加，而50%及25%BerriQi™波森莓及蘋果處理得到APC數目減少(圖27)。OVA刺激小鼠單核球數目增加，而50%及25%BerriQi™波森莓及蘋果處理得到單核球數目減少(圖28)。
蘇木色素及曙紅染色顯示該卵白蛋白刺激造成組織腫脹並確認免疫細胞浸潤，其係因BerriQi™ 波森莓及蘋果處理而減少(圖29)。AB-PAS染色顯示該卵白蛋白刺激造成黏液生成增加，其係藉BerriQi™ 波森莓及蘋果處理以劑量依賴方式減少(圖30)。
Masson’s三色染染色顯示重複之OVA刺激造成氣道中膠原蛋白纖維之擴散性藍色之染色(圖31)。BerriQi™波森莓及蘋果處理減少肺中此等藍色膠原蛋白纖維之出現(圖31)。
以羥脯胺酸檢定定量膠原蛋白量顯示OVA刺激不會增加膠原蛋白(圖32)，此與先前結果相反。以100%或50% BerriQi™ 波森莓及蘋果處理沒有發現膠原蛋白量顯著變化(圖32)。然而，以25% BerriQi™ 波森莓及蘋果處理看到膠原蛋白量顯著增加(圖32)。在下文中進行更詳細地討論。 討論
該i.n. OVA 刺激造成肺中發炎細胞增加之現象，而其被50%及25% BerriQi™波森莓與蘋果處理減少。相較於OVA刺激小鼠，該100% BerriQi™波森莓與蘋果處理對浸潤性免疫細胞數目沒有影響，表示此處理可能存在最佳濃度。
BerriQi™波森莓與蘋果處理以劑量依賴方式減少黏液生成，用25% BerriQi™波森莓與蘋果處理中介黏液生成最大幅度減少。
用以量化膠原蛋白總量變化之肺組織分析顯示OVA刺激後膠原蛋白數量沒有變化，此與原始羥脯胺酸檢定之結果不一致(參見例如實施例1及(74))。與原始檢定相比，於此實施例使用之檢定採用由替代來源獲得之測量試劑。
特別地，Masson’s三色染染色指出OVA刺激造成膠原蛋白浸潤進氣道中，而 BerriQi™ 波森莓及蘋果處理幫助扭轉此浸潤。因此，組織學方法確定該膠原蛋白在組織周圍之位置被OVA改變，而此可藉由BerriQi TM波森莓及蘋果處理來解決(addressed)。
需要進一步研究以完全闡明本發明羥脯胺酸檢定結果之含義。如上所述，一種可能解釋係檢定偏差(differences)。此外，雖然OVA刺激中膠原蛋白總量沒有變化，有可能該膠原蛋白之位置已被改變，而此係用BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理來解決。膠原蛋白量之增加以及氣道內膠原蛋白染色之減少(如25% BerriQi™ 波森莓及蘋果處理所見)也可能為炎症痊癒時發生之組織重塑結果。 實施例 4 ： OVA 誘導慢性氣道發炎及波森莓、蘋果及黑醋栗之口服治療 材料及方法
為了進行此研究，在實施例1中使用該小鼠模型及慢性OVA誘導過敏性氣道發炎之口服策略。亦參見(52), (97)。簡言之，於腹腔(i.p)以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內(i.n)以OVA刺激，每週進行此i.n 刺激持續10週。OVA刺激5週後，開始該干預措施。於該干預措施，在用以下經口以胃管灌食前小鼠禁食4小時：水(疾病及載體控制組)，或100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗(於i.n. OVA 刺激前2天、前1小時及OVA刺激後2天)。
該干預措施組係：1) 空白(基準控制組)；2) +OVA(疾病及水載體控制組)；3) +OVA+BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗 100% (疾病+100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗)，其含有來自New Zealand 70 Brix 蘋果汁濃縮物、來自New Zealand之黑醋栗汁及來自New Zealand 65 Brix 波森莓汁濃縮物。該波森莓汁濃縮物係獲自Boysenberry NZ (Nelson, New Zealand)。該蘋果汁濃縮物係由RD2 International (Auckland, New Zealand)提供，由Profruit (Hastings, New Zealand)製造。該黑醋栗汁濃縮物係獲自New Zealand Blackcurrant Co-operative Ltd (Nelson, New Zealand)。
BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗口服組成物中之波森莓濃度係經計算得到對一70  kg人類可給予0.73 mg/kg花青苷總量，此相當於在小鼠中之10 mg/kg。該劑量係基於先前研究選擇(見實施例1及 (52))，其確定攝取10 mg/kg 波森莓花青苷造成慢性過敏性氣道發炎小鼠模型中發炎及組織纖維化減少。該100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗口服組成物為一25g小鼠提供10 mg/kg花青苷總量。於以下實施例5中提供劑量之細節。
因此，於此研究中，藉由用等量黑醋栗汁濃縮物補充波森莓汁濃縮物而使花青苷總濃度達到10 mg/kg，來測試是否可使用濃度減少之波森莓花青苷。
於i.n. OVA刺激後4天對小鼠實施安樂死。如實施例1中所述方式測量以下參數：1) 細胞浸潤：嗜酸性球、嗜中性球、單核球及抗原呈現細胞(APCs)；2) 組織變化：蘇木色素及曙紅(H&E)，阿新藍及過碘酸-Schiff (AB-PAS)，及Masson’s三色染染色；及3)膠原蛋白生成，其使用羥脯胺酸檢定。使用商購比色套組(AbCam ab222941)進行羥脯胺酸檢定。 結論
結果顯示i.n.過敏原OVA刺激小鼠中有增加之免疫細胞總數浸潤至肺中(圖33)。在該等測試濃度下BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理顯著地減少該細胞浸潤(圖33)。
該浸潤細胞係由嗜酸性球 (圖34)、抗原呈現細胞 (圖35)及單核球(圖36)組成。該嗜酸性球數目在OVA刺激小鼠中有增加，但此增加並非受BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理影響(圖34)。該抗原呈現細胞數目係因OVA刺激而顯著增加，而該APC數目係因BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理而顯著減少(圖35)。單核球於OVA刺激小鼠中有增加數目之傾向，而該單核球數目係因BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理而減少(圖36)。
蘇木色素及曙紅染色顯示該卵白蛋白刺激造成組織組織腫脹及免疫細胞浸潤，其係因 BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理而減少(圖37)。AB-PAS染色顯示該卵白蛋白刺激造成黏液生成增加，其未受BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理影響(圖38)。
Masson’s三色染染色顯示重複之OVA刺激造成氣道中膠原蛋白纖維之擴散性藍色之染色(圖39)。BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理減少肺中此等藍色膠原蛋白纖維之出現(圖39)。
該羥脯胺酸檢定顯示OVA刺激不會造成膠原蛋白總量增加(圖40)，此與先前之發現相反。相較於其他組，於此檢定中該100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理使膠原蛋白數量顯著增加(圖40)。在下文中進行更詳細地討論。 討論
該i.n. OVA 刺激造成肺中發炎細胞增加之現象。肺中之嗜酸性球數目不會受BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理影響，但APCs數目因BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理而有顯著減少。單核球因OVA刺激有增加之傾向，而因BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理有減少之傾向。
用以量化膠原蛋白變化之肺組織分析顯示OVA刺激後膠原蛋白總量沒有變化，此與原始檢定之發現不一致(參見例如實施例1及(74))。然而，Masson’s三色染染色指出OVA刺激造成膠原蛋白浸潤至氣道中，其被100% BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理抵消(counteracted)。
該羥脯胺酸檢定結果之差異可能肇因於此等檢定之偏差，如前所述。此外，雖然OVA刺激之膠原蛋白總量沒有變化，但是該膠原蛋白之位置可能有改變，而此係藉BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理來解決。對此BerriQi™波森莓與蘋果及黑醋栗處理(包含膠原蛋白數量增加，加上氣道內膠原蛋白染色現象減少)進行觀察之結果，也可能為炎症逐漸痊癒時組織重塑之結果。 實施例 5 ：口服治療劑量計算
口服治療劑量實施例3及4係根據以下資訊計算。 表 1 ：慢性刺激小鼠研究之劑量計算 四種處理組：
樣品及描述 小鼠劑量率 (mg/kg花青苷總量 TAC) 人類等效劑量* (mg/kg)
1 BerriQi™濃縮物 (1) (波森莓 + 蘋果) 見實施例3 100% 10 † 0.729
2 50% 5 0.364
3 25% 2.5 0.182
4 BerriQi™濃縮物 (2) (波森莓 + 黑醋栗 + 蘋果) 見實施例4 100% 10 0.729
以200 µL為基礎給予BerriQi™濃縮物，用於一25 g小鼠(相當於一70公斤的人類)(以花青苷總量計) †見實施例1及(74) *HED             = 動物劑量mg/kg x (動物重量kg /人類重量kg) 0.33例如：           = 10 mg/kg小鼠劑量x (0.025 kg小鼠/ 70 kg人類) 0.33= 0.73 mg/kg花青苷總量(用於70 kg人類) 表2:  起始濃縮物及其組成物
樣品 描述 組成物
樣品 (1) BerriQi™濃縮物 (1) (波森莓 + 蘋果) 27% 波森莓汁濃縮物65 Brix (Boysenberries NZ Ltd); 72.88% 蘋果汁濃縮物(清澈) 70 Brix (RD2 International); 0.12% 山梨酸鉀
樣品 (2) BerriQi™濃縮物 (2)  (波森莓 + 黑醋栗 + 蘋果) 13.5% 波森莓汁濃縮物65 Brix (Boysenberries NZ Ltd); 13.5% 黑醋栗汁濃縮物65 Brix (NZ 黑醋栗 Co-op); 72.88% 蘋果汁濃縮物(清澈) 70 Brix (RD2 International); 0.12% 山梨酸鉀
表3:  計算花青苷濃度
樣品 描述 花青苷總量 (矢車菊素-3-葡萄糖苷) 計算
樣品 (1) BerriQi™濃縮物 (1)  (波森莓 + 蘋果) 145 mg/100 g果汁濃縮物 比重 = 1.34 g/ml 1 g果汁濃縮物 = 0.746 ml 1 ml果汁濃縮物 = 1.34 g 因此: 1,450 µg/g (1.45 mg/g) 或 1,943 µg/ml 果汁濃縮物
樣品 (2) BerriQi™濃縮物 (2) (波森莓 + 黑醋栗 + 蘋果) 236 mg/100 g果汁濃縮物 比重 = 1.34 g/ml 1 g果汁濃縮物 = 0.746 ml 1 ml果汁濃縮物 = 1.34 g 因此: 2,360 µg/g (2.36 mg/g) 或 3,162 µg/ml 果汁濃縮物
表4:  以花青苷濃度為基礎之劑量計算
樣品 描述 小鼠中之劑量率 (mg/kg花青苷總量 TAC) 200 µL劑量所需BerriQi™濃縮物體積(µL)
1 BerriQi™濃縮物 (1) (波森莓 + 蘋果) 100% 10 129
2 50% 5 連續稀釋
3 25% 2.5 連續稀釋
4 BerriQi™濃縮物 (2) (波森莓 + 黑醋栗 + 蘋果) 100% 10 79
實施例3(波森莓與蘋果)使用之表1中100% BerriQi™濃縮物(1)劑量詳細計算： 計算確定小鼠劑量 用於25g小鼠之希望劑量為10 mg 花青苷/kg (實施例1及(74)) - 100% 用於25g小鼠10 mg 花青苷/kg 劑量需要0.25 mg花青苷 因此：           0.172 g  BerriQi™ 濃縮物 (1) 需要提供0.25 mg劑量之花青苷 = 0.129 mL  BerriQi™ 濃縮物 (1) 需要提供0.25 mg劑量之花青苷 = 128.667 µL  BerriQi™ 濃縮物 (1) 需要提供0.25 mg劑量之花青苷 Sp比重     1.34 g/ml 製備小鼠試驗之口服組成物 取128.667 µL  BerriQi™ 濃縮物 (1)用H 2O使其達到200 µL 現在200 µL小鼠劑量中有0.25 mg花青苷，10 mg/kg用於一 25 g小鼠
實施例4(波森莓與蘋果及黑醋栗)使用之表1中100% BerriQi™濃縮物(2)之劑量詳細計算： 計算以確定小鼠劑量 用於25g小鼠之希望劑量為10mg花青苷/ kg (實施例1及(74)) - 100% 用於25g小鼠10 mg 花青苷/kg 劑量需要0.25 mg花青苷 因此：      0.106 g  BerriQi™ 濃縮物 (2)需要提供0.25 mg劑量之花青苷 = 0.079 mL  BerriQi™ 濃縮物 (2)需要提供0.25 mg劑量之花青苷 = 79.054 µL  BerriQi™ 濃縮物 (2)需要提供0.25 mg劑量之花青苷 Sp 比重   1.340 g/ml 製備小鼠試驗之口服組成物 取79.054 µL  BerriQi™ 濃縮物 (2)用H 2O使其達到200 µL 現在200 µL小鼠劑量中有0.25 mg花青苷，10 mg/kg用於一 25 g小鼠
BerriQi™濃縮物 (1) (波森莓 + 蘋果)之替代劑量計算細節 小鼠重25 g 劑量(花青苷總量) 10 mg/kg (或0.1 mg/10 g) 因此：    劑量=每一小鼠 0.25 mg BerriQi™ (波森莓 + 蘋果)花青苷總量 145 mg/100 g (或1.45 mg/g) 重量產物(Weight product)需要0.25 mg/1.45 mg = 0.172 g BerriQi™ 能夠在水中秤重因為已知比重 特定比重1.34 kg/L (或1.34 g/mL) 體積需要0.172 g /1.34 g = 0.128.66 mL 這相當於每隻小鼠129μL加上71μL水 (200 µl減去129 µl) 實施例 6: 治療配方組成分析
BerriQi™液體配方係經化學分析用以確定花青苷及含酚組成物。 該經測試配方包含：樣品1，BerriQi™與蘋果濃縮物1(BB + AP)；樣品2， BerriQi™與蘋果加黑醋栗濃縮物2(BB + BC + AP)。參見實施例5。將稱重之樣品等分試樣以10% 甲酸 aq稀釋5倍用於超高壓液相層析法(UHPLC)分析。用液相層析-質譜法(LC-MS)分析其他含酚物，以0.1%甲酸 aq稀釋10倍樣品。確定樣品密度並採集樣品用於乾物產量計算。
UHPLC分析花青苷：測定花青苷濃度，使用Dionex UltiMate 3000 Series UHPLC (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA)於520 nm以PDA (光二極體陣列) 偵測器。使用Synergi 4µ hydro-RP 80A column, 4.6 x 250 mm (Phenomenex, Torrance, CA, USA)維持在40°C進行化合物分離。溶劑係(A) 5:5:90之乙腈：甲酸：水v/v/v及(B) 5:95 v/v之甲酸：乙腈且流速係1 mL/min。初始移動相，100% A持續1分鐘，然後在16分鐘內線性斜移至84% A，繼之以5% A管柱沖洗(在其被重置為原始狀態之前)。樣品注射體積為0.5 µL。檢測到之花青苷係經使用純度標準之矢車菊素 3-O-葡萄糖苷之UHPLC定量，而個別及全體花青苷之所有結果係以矢車菊素 3-O-葡萄糖苷當量表示。
LC-MS確認：LC-MS採用LTQ線性離子阱質譜儀(linear ion trap mass spectrometer)，其配有ESI接口(interface)(ThermoFisher Scientific, San Jose, CA, USA)，與Ultimate 3000 UHPLC及PDA探測器耦接 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)。
花青苷確認：花青苷化合物分離係使用維持在70°C之Poroshell 120 SB-C18管柱2.7 µ 2.1 x 150 mm (Agilent, Torrance, CA, USA)來達成。溶劑係(A) 5:3:92乙腈：甲酸：水v/v/v及(B) 乙腈 + 0.1%甲酸，流速為200 µL/min。初始移動相，100% A進行2分鐘(在第14分鐘線性斜移至84%之前)，第15分鐘5% A 進行4分鐘(在其被重置為原始狀態之前)。樣品注射體積為10 µL。使用數據依賴性LC-MS 3方法以正模式獲得MS數據。此方法分離並片斷化最強母離子以產生MS 2數據(子離子)，然後分離並片斷化該最強子離子(MS 3數據)。
其他含酚物：使用Hypersil GOLD aQ 1.9µ C18 175Å (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts USA) 150 × 2.1 mm 管柱維持在45°C進行其他含酚物化合物之分離。溶劑係(A) 水+ 0.1% 甲酸及(B) 乙腈 + 0.1% 甲酸，流速為200 µl/min。初始移動相，第10分鐘95% A/ 5% B線性斜移至85% A持續3.75分鐘，然後在第18分鐘線性斜移至75% A，在第25分鐘至67.2% A，第28分鐘至50% A，第29分鐘至3% A持續4分鐘(在其被重置為原始狀態之前)。該樣品之注射體積為4 µL。於200-600 nm吸光計進行UV-vis偵測。使用三種數據依賴性LC-MS 3方法用ESI電離以負及正模式獲得MS數據，第一種使用質量範圍[m/z 150-900]優化用於檢測低分子量含酚化合物，第二種使用質量範圍[m/z 150-2000]優化用於檢測鞣花單寧，及第三種使用質量範圍[m/z 150-4000]優化用於檢測較高分子量之可溶性單寧。也用APCI電離以負及正模式二者獲得MS數據。
使用此等化合物之純度標準藉LC-MS定量酚酸、五倍子酸、原兒茶酸、綠原酸(3-咖啡醯金雞納酸(3-caffeoylquinic acid))、咖啡酸。使用p-香豆酸藉LC-MS定量經檢測之香豆酸衍生物，並表示為p-香豆酸當量。使用此等化合物之純度標準藉LC-MS定量該黃烷-3-醇、表-兒茶素及兒茶素、及前矢車菊素B2。使用表-兒茶素藉LC-MS定量未知 m/z563及 m/z579，並表示為表-兒茶素當量。使用之前被分離之Sanguiin H6之純度標準(藉LC-MS＞98%純度)藉LC-MS定量可水解單寧。其他經檢測之單寧及未知 m/z639係被 LC-MS 定量為Sanguiin H6當量。使用鞣花酸標準藉LC-MS定量鞣花酸。使用槲皮素 3-O-葡萄糖苷純度標準藉LC-MS定量經檢測之黃酮醇糖苷，並表示為槲皮素 3-O-葡萄糖苷當量。使用此等化合物純度標準藉LC-MS定量未糖基化黃烷醇類(槲皮素及楊梅黃酮)及查爾酮類(根皮素及根皮素-2-O-葡萄糖苷)。使用此化合物之純度標準藉LC-MS定量防腐劑山梨酸。
分析的結果如下所示。 表 5. BerriQi™ 樣品之密度及乾物產量數據
樣品 描述 密度 (g/mL) 乾物產量(%)
1 BerriQi™濃縮物 (1) BB + AP 1.346 70.24
2 BerriQi™濃縮物 (2) BB + BC + AP 1.351 71.37
表 6. BerriQi™ 樣品 1 及 2 中檢出含酚物之定量總結，以 µg/mL 及 µg/g 乾重表示 (DW)
樣品1 樣品2
化合物 µg/mL µg/g DW µg/mL µg/g DW
花青苷
飛燕草素3-O-葡萄糖苷 nd Nd 120 125
矢車菊素 3-O-槐糖苷 925 978 306 317
飛燕草素3-O-芸香糖苷 nd Nd 868 900
矢車菊素 3-O-葡萄糖苷 597 631 248 258
矢車菊素 3-O-接骨木二糖苷(sambubioside) 26 28 8 8
矢車菊素 3-O-(2-葡糖基芸香糖苷) 431 456 146 152
矢車菊素 3-O-芸香糖苷 69 73 913 947
矢車菊素 3-O-xylosyl芸香糖苷 18 19 5 5
酚 酸
五倍子酸 162 171 33 35
原兒茶酸(Protocatechuric acid) 41 43 17 18
綠原酸 74 78 60 63
咖啡酸 6 6 6 6
4-p-香豆醯基金雞納酸 20 21 33 35
5-p-香豆醯基金雞納酸 3 3 8 9
黃烷 -3- 醇及前矢車菊素
前矢車菊素 B2 5 5 6 7
兒茶素 3 3 5 5
表-兒茶素 17 18 11 12
可水解單寧
Sanguiin H10異構物1 13 13 6 7
Sangui山梨酸二內酯 234 248 51 52
Galloyl-SH6 79 84 24 25
Sanguiin H10異構物2 79 84 44 45
Lambertian C (減鞣花酸) 13 14 9 9
Lambertian C 27 29 9 10
Sanguiin H6 257 271 99 103
鞣花酸 626 662 96 100
黃 烷 醇
槲皮素 3-O-芸香糖苷 8 8 62 64
槲皮素 3-O-半乳糖苷 18 19 26 27
槲皮素 3-O-葡萄糖醛酸苷 42 45 3 3
槲皮素 3-O-葡萄糖苷 13 14 36 37
槲皮素 3-O-戊糖苷 1 9 10 12 12
槲皮素 3-O-戊糖苷 2 11 12 14 15
槲皮素 3-O-戊糖苷 3 6 7 3 4
槲皮素 3-O-鼠李糖苷 14 13 15 13
槲皮素 33 35 37 38
楊梅黃酮-3-O-芸香糖苷 nd Nd 81 84
楊梅黃酮-3-O-葡萄糖苷 nd Nd 33 35
楊梅黃酮-丙二醯基葡萄糖苷 nd Nd 4 4
楊梅黃酮 nd Nd 7 7
金魚草素(Aureusidin)-葡萄糖苷 nd Nd 3 3
山柰酚-3-O-芸香糖苷 nd Nd 8 8
山柰酚-3-O-葡萄糖苷 nd Nd 5 5
查耳酮
根皮素 2-O-xylo-葡萄糖苷 10 11 9 10
根皮素 2-O-葡萄糖苷 76 80 95 99
未知
未知m/z 563# 10 11 4 4
未知m/z 639 65 69 54 56
未知m/z 579 3 3 3 3
總計 4043  4275 3645 3784
nd = 未測到 # = 測定為[M+甲酸酯]-加成物
普通技術人士可利用本文揭露內容及教示無需過多實驗而產生其他具體實施例及變化。所有此等具體實施例及變化都被認為係本發明之一部分。
據此，本領域普通技術人士將可由本揭露內容容易地理解到，根據本發明該等相關實施例可使用與本文所述具體實施例執行實質上相同功能或實現實質上相同結果之後續修改、替換及/或變化。因此，本發明旨在其範圍內包括本文揭露之製程、製品、組成物質、化合物、手段、方法及/或步驟之修改、替換及變化。
本文描述內容可能包含落在所請之發明範圍外之標的。此標的係被包括用以幫助理解本發明。
在本說明書中，其中引用外部資訊來源(包含專利說明書及其他文獻)之情況通常係在為討論本發明特徵提供脈絡(context)。除非另有說明，否則在任何司法管轄領域中不應將對該等資訊來源之引用解釋成承認該等資訊來源係先前技術或構成本領域通常知識之一部分。
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無
圖1A-D。治療性口服波森莓處理可降低OVA誘導之慢性肺發炎。A: 6週齡雄性C57Bl/6小鼠(每組n = 10)在腹腔内(i.p.)經以OVA/明礬致敏(primed)(第0天)然後每7日在鼻內(i.n.)經以OVA刺激(challenged)持續10週。第6至10週在每一次i.n. OVA刺激之前1小時及後2天經口給予(胃管灌食)波森莓汁。B: 小鼠肺組織之代表性H&E染色，來自：空白(naive)；10週僅受OVA刺激(OVA)；10週受OVA刺激與用治療性波森莓(OVA BoysB)處理；及單用波森莓(BoysB)處理。箭頭及*指出免疫細胞浸潤(infiltrate)。放大倍率X4(上)及X10(下)。C: 肺組織之代表性AB-PAS染色。箭頭指出深紫色黏液陽性(mucus-positive)小支氣管。放大倍率X4 (上)及X20 (下)。D: 在最終OVA刺激後每ml BALF中細胞總數及流式細胞儀定量BALF中嗜酸性粒細胞百分比。**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001 (每組n = 10)單因子ANOVA 及Tukey’s事後比較檢定(post hoc test)比較空白及OVA刺激與治療性波森莓處理及僅用波森莓處理之小鼠。 圖2A-D。在OVA誘導之慢性肺發炎中波森莓處理會增加精氨酸酶表現及肺組織中巨噬細胞聚積。A: 10週OVA刺激小鼠之肺組織代表性H&E染色，有使用或未使用波森莓處理。箭頭指出巨噬細胞。放大倍率X100，比例尺200 µm。B: 代表性西方墨點法分析肺組織中iNOS (135 kDa)及精胺酸酶(37 kDa)之表現。顯示來自同一西方墨點法之不連續條帶。C及D: iNOS及精胺酸酶西方墨點法訊號之量化係按β-肌動蛋白訊號進行標準化。**P ＜ 0.01 (每組n = 10)單因子ANOVA及Tukey’s 事後比較檢定。 圖3A-B。在OVA誘導慢性肺發炎中波森莓處理增加精胺酸酶+另類活化巨噬細胞之聚積。肺組織之代表性免疫螢光標記，其係來自10週受OVA刺激之小鼠，使用及未使用波森莓處理。A: 以*識別CD68+CD206+巨噬細胞。B: 以*識別CD206+精胺酸酶+巨噬細胞。DAPI核染劑(深藍色)。放大倍率X40，比例尺200 µm。 圖4A-E。波森莓處理在OVA誘導慢性肺發炎期間於肺組織中減少膠原蛋白沉積及增加MMP-9蛋白質表現。A: 代表性Masson’s三色染。放大倍率X40，比例尺200 µm。B: 羥脯胺酸量(mg/g 肺組織)；***P ＜ 0.001 (n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。C: 以ELISA確定肺TGFβ濃度；*P＜ 0.05 (每組n =10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。D: 肺組織中西方墨點法分析MMP-9 (前體105 kDa；活性92 kDa)及TIMP-1 (29 kDa)表現(所示為來自於同一西方墨點法之不連續條帶)，其來自於10週OVA刺激小鼠，有或沒有波森莓處理。E: TIMP-1/MMP-9蛋白質表現之比值，其係經以β-肌動蛋白加載對照組(loading control)標準化；**P ＜ 0.01 (n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定 ，其係與空白及OVA加波森莓處理。 圖5A-B。波森莓處理在OVA誘導慢性肺發炎期間增加肺組織中MMP-9 表現，其係藉由另類活化巨噬細胞。A: DAB標記MMP-9+ 巨噬細胞 (箭頭)。B: 免疫螢光標記CD206+MMP-9+巨噬細胞 (*)。DAPI核染劑(深藍色)。放大倍率X40，比例尺200 µm。 圖6A-B。肺巨噬細胞之消耗減少口服波森莓處理對OVA誘導慢性肺發炎之影響。A: 6週齡雄性C57Bl/6小鼠(每組n = 10)每7日在腹腔内(i.p.)以OVA/明礬致敏 (第0天)然後在鼻內(i.n.)以OVA刺激經5週。 自第6至7週在口服波森莓汁(胃管灌食)之前一日使用氯膦酸脂質體(clodronate liposomes)(CloLip)使巨噬細胞耗盡。B: 在最終氯膦酸耗盡後流式細胞儀定量BALF中巨嗜細胞百分比；*P ＜ 0.05 (每組n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。C: 肺中羥脯胺酸量(mg/g 肺組織)；*P ＜ 0.05 (每組n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。 圖7A-G。預防性口服波森莓處理減少OVA誘導慢性肺發炎及膠原蛋白沉積。A: 6週齡雄性C57Bl/6小鼠(每組n = 10)每7日在腹膜内(i.p.)以OVA/明礬致敏然後在鼻內(i.n.)以OVA刺激經5週。在每一鼻內(i.n.)OVA刺激前1 h及2日後口服波森莓汁(胃管灌食)。B:肺組織被染色，在最終OVA刺激後每 ml BALF中細胞總數及流式細胞儀定量BALF中嗜酸性粒細胞之百分比；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01 (每組n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。C: AB-PAS，深紫色黏液陽性小支氣管(箭頭)；放大倍率X20，比例尺200 µm。D: Masson’s三色染；放大倍率X40，比例尺200 µm。E: 肺中羥脯胺酸量(mg/g 肺組織)。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 (每組n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。F: 西方墨點法分析iNOS、精胺酸酶、MMP-9及TIMP-1 肺組織。所示為同一西方墨點法之不連續條帶。G: TIMP-1/MMP-9蛋白質量之比值，其經以β-肌動蛋白加載對照組標準化。*P ＜ 0.05，(每組n = 10)單因子ANOVA與Tukey’s 事後比較檢定。 圖8。急性過敏性氣道發炎模型中測試波森莓處理組合實驗之示意圖。 圖9。急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓與蘋果給藥處理可減少免疫細胞數。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後全部細胞浸潤至肺中。在OVA刺激(每一干預組n=10)後4天測定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞總數。 圖10。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理可減少嗜酸性球數目。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後嗜酸性球浸潤至肺中。在OVA刺激(每一干預組n=10)後4天測定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)嗜酸性球細胞總數。BerriQi™ 濃縮物及其他濃縮物係如下文實施例2中所述。 圖11。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。蘋果處理後以蘇木色素(Haematoxylin)及曙紅(曙紅)染色肺組織。 圖12。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。波森莓處理後以蘇木色素及曙紅染色肺組織。 圖13。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。BerriQi™波森莓與蘋果處理後以蘇木色素及曙紅染色肺組織。代表性10X (A–D)及20X (E–H)影像 (A, E)空白、 (B, F) OVA、(C, G) BerriQi™ 波森莓與蘋果 10、及 (D, H) BerriQi™ 波森莓與蘋果 1。免疫細胞顯現為深粉紅/紫色群落。 圖14。在急性過敏性氣道發炎模型中，使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理可減少嗜中性球數目。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後嗜中性球浸潤至肺中。在OVA刺激(每一干預組n=10)後4天測定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)嗜中性球細胞總數。 圖15。在急性過敏性氣道發炎模型中，使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理可減少單核球數目。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後單核球浸潤至肺中。在OVA刺激(每一干預組n=10)後4天測定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)單核球細胞總數。 圖16。在急性過敏性氣道發炎模型中，使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理可減少抗原呈現細胞。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後抗原呈現細胞 (APC)浸潤至肺中。在OVA刺激(每一干預組n=10)後4天測定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)APC總數。 圖17。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。蘋果處理後以阿新藍(Alcian blue)/過碘酸Schiff澱粉酶(periodic acid Schiff diastase)染色肺組織。 圖18。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。波森莓處理後以阿新藍/過碘酸Schiff澱粉酶染色肺組織。 圖19。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。BerriQi™ 波森莓與蘋果處理後以阿新藍/過碘酸Schiff澱粉酶染色肺組織。代表性10X (A–D)及20X (E–H)影像，(A, E)空白、(B, F) OVA、(C, G) BerriQi™ 波森莓與蘋果 10、及 (D, H) BerriQi™ 波森莓與蘋果 1。黏液陽性杯狀細胞呈深紫色。 圖20。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。蘋果處理後以Masson’s三色染染色肺組織。 圖21。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。波森莓處理後以Masson’s三色染染色肺組織。 圖22。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。BerriQi™ 波森莓與蘋果處理後以Masson’s三色染染色肺組織。代表性10X (A–D)及20X (E–H)影像，(A, E)空白、(B, F) OVA、(C, G) BerriQi™ 波森莓與蘋果 10及(D, H) BerriQi™ 波森莓與蘋果 1。 圖23。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。波森莓、蘋果及BerriQi™ 波森莓與蘋果處理後顆粒性白血球-巨噬細胞群體刺激因子量(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor levels)。 圖24。在急性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果給藥處理。波森莓、蘋果及BerriQi™ 波森莓與蘋果處理後CCL11量。 圖25。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理可減少免疫細胞數。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後全部細胞浸潤至肺中。最終OVA刺激後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞總數。數據為平均值± SEM (每一干預組n=20)。相較於OVA之P＜0.05、P＜0.001；相較於空白P＜0.01。 圖26。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理可減少嗜酸性球數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後嗜酸性球浸潤至肺中。最終OVA刺激後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中嗜酸性球數目。數據為平均值± SEM (每一干預組n=20)。相較於空白P＜0.001。 圖27。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理可減少抗原呈現細胞數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤抗原呈現細胞 (APC)浸潤至肺中。最終OVA刺激後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中APCs數目。數據為平均值± SEM (每一干預組n=20)。相較於空白P＜0.01。 圖28。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理可減少單核球數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤單核球浸潤至肺中。最終OVA刺激後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中單核球數目。數據為平均值± SEM (每一干預組n=20)。 圖29。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓與蘋果(BA)給藥處理。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後肺組織切片以蘇木色素及曙紅染色法染色之顯微照片。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(A – 空白) 水 (B – OVA控制組) 100% (C) 50% (D) 或25% (E) BerriQi™ 波森莓與蘋果(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖30。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後以阿新藍及過碘酸-Schiff染肺組織染色之肺組織切片顯微照片。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(A – 空白) 水 (B – OVA控制組) 100% (C) 50% (D) 或25% (E) BerriQi™ 波森莓與蘋果(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖31。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後肺組織切片以Masson’s三色染染色肺組織之顯微照片。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(A – 空白) 水 (B – OVA控制組) 100% (C) 50% (D) 或25% (E) BerriQi™ 波森莓與蘋果(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖32。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓與蘋果(BA)給藥處理。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後定量肺中之膠原蛋白。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(空白)、水(OVA控制組)、100%、50%或25% BerriQi™波森莓與蘋果(BA)(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。最終OVA刺激後4天使用羥脯胺酸檢定確定膠原蛋白。數據為平均值± SEM (每一干預組n=20)。相較於所有其他處理組P＜0.001。 圖33。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理可減少免疫細胞數。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後全部細胞浸潤至肺中。最終OVA 刺激(每一干預組n=20)後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞總數 。 圖34。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™ 波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理可減少嗜酸性球數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後嗜酸性球浸潤至肺中。最終OVA 刺激(每一干預組n=20)後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中嗜酸性球數目。相較於空白P＜0.001。 圖35。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理可減少抗原呈現細胞數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後抗原呈現細胞 (APC)浸潤至肺中。最終OVA 刺激(每一干預組n=20)後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中APCs數目。相較於OVA P＜0.001、P＜0.01。 圖36。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理可減少單核球數目。慢性卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後單核球浸潤至肺中。最終OVA 刺激(每一干預組n=20)後4天確定支氣管-肺泡灌洗液(BALF)細胞中單核球數目。 圖37。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後以蘇木色素及曙紅染色肺組織。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(空白) 水(OVA控制組) 或100% BerriQi™ 波森莓、蘋果及黑醋栗(OVA + 100%)(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖38。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後以阿新藍及過碘酸-Schiff染色肺組織。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(空白) 水(OVA控制組) 或100% BerriQi™ 波森莓、蘋果及黑醋栗(OVA + 100%)(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖39。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後以Masson’s三色染染色肺組織。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食，不灌食(空白) 水(OVA控制組) 或100% BerriQi™ 波森莓、蘋果及黑醋栗(OVA + 100%)(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。 圖40。在慢性過敏性氣道發炎模型中使用BerriQi™波森莓、黑醋栗及蘋果(BBA)給藥處理。卵白蛋白(OVA)-誘導過敏性氣道浸潤後定量肺中之膠原蛋白。於腹腔以OVA/明礬致敏小鼠然後7天後於鼻內以OVA刺激經10週。5週後小鼠經口以胃管灌食100% BerriQi™ 波森莓、蘋果及黑醋栗(100% BBA)(於OVA 刺激前2天、前1小時及刺激後2天再次進行灌食，經5週)。OVA 刺激(每一干預組n=20)後4天使用羥脯胺酸檢定確定膠原蛋白。

Claims (18)

  1. 一種以一波森莓及蘋果濃縮物或一波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物作為製備治療或預防個體之急性過敏性呼吸道發炎或慢性過敏性呼吸道發炎之藥物的用途，其該藥物包含： (i) 一包含波森莓及蘋果濃縮物的組合中包含至少27%的波森莓濃縮物，其中波森莓及蘋果濃縮物包含至少91μg/g歸因於蘋果濃縮物的查耳酮含量，其中波森莓及蘋果濃縮物包含至少145mg/100g的花青苷含量，其中波森莓及蘋果濃縮物中的花青苷佔波森莓和蘋果濃縮物的總多酚含量的至少40%；或 (ii) 一包含波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物的組合中包含至少13.5%的波森莓濃縮物以及至少10%的黑醋栗濃縮物，其中波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物包含至少91μg/g歸因於蘋果濃縮物的查耳酮含量，其中波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物包含至少236mg/100g花青苷含量，其中波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物中的花青苷佔波森莓、蘋果及黑醋栗濃縮物中的總多酚含量的至少65%。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該藥物包括選自以下一或多者：波森莓果汁濃縮物、波森莓粉末、蘋果果汁濃縮物、蘋果粉末、黑醋栗果汁濃縮物及黑醋栗粉末。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該藥物包含外加的多酚。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該藥物包括進一步的呼吸輔助物。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該呼吸輔助物為一藥物、一草藥或一精油。
  6. 如請求項4所述之用途，其中該呼吸輔助物的作用以下一或多者：抗發炎、抗痙攣、支氣管擴張及肌肉鬆弛。
  7. 如請求項1所述之用途，其中該藥物包括一劑量單位，其包括5至500 mg花青苷總量。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物被配置用於腸內或口服投藥。
  9. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物被配置成糖漿、滴劑、凝膠、果凍、片劑或膠囊。
  10. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物被配置為獲得以下劑量： (i) 0.1 mg/kg至10 mg/kg花青苷總量/個體體重；或 (ii) 0.1 mg/kg至5 mg/kg花青苷總量/個體體重。
  11. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物被配置為獲得以下劑量： (i) 每日10 mg至約1000 mg花青苷總量； (ii) 每日10 mg至約200 mg波森莓花青苷總量；或 (iii) 每日10 mg至約200 mg波森莓及黑醋栗花青苷總量。
  12. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物被配置為每天給藥一次、每天兩次或每天三次。
  13. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該個體有慢性呼吸道的一種或多種症狀。
  14. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該個體有氣道重塑、氣道纖維化、哮喘、及慢性阻塞性肺病的一種或多種症狀。
  15. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該個體在肺組織中有免疫細胞浸潤。
  16. 如請求項15所述之用途，其中該免疫細胞是嗜酸性粒細胞或單核細胞。
  17. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該個體在肺組織中有膠原纖維的聚集。
  18. 如請求項1至7中任一項所述之用途，其中該藥物中的果汁濃縮物體積調整為包含小於1%v/v的防腐劑。
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